JP5951953B2 - Novel dipeptide synthase and method for producing dipeptide using the same - Google Patents
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Description
本発明は、N末端側がβ−ＡｌａでありＣ末端側がＬ−Ｈｉｓであるジペプチド（以下、カルノシンと略記）合成活性を有する蛋白質、カルノシン合成活性を有する蛋白質を用いたカルノシンの製造法、カルノシン合成活性を有する蛋白質を生産する微生物または形質転換体を用いたカルノシンの製造法に関する。 The present invention relates to a protein having a dipeptide (hereinafter abbreviated as carnosine) synthesis activity in which the N-terminal side is β-Ala and the C-terminal side is L-His, a method for producing carnosine using a protein having carnosine synthesis activity, and carnosine synthesis The present invention relates to a method for producing carnosine using a microorganism or a transformant that produces a protein having activity.
バチルス属に属する微生物が、ＡＴＰと２分子のＬ−アミノ酸からα位カルボキシル基でペプチド結合したジペプチドを生成する酵素、Ｌ−アミノ酸αリガーゼを持つことが報告されている(特許文献１、非特許文献１)。Ｌ−アミノ酸リガーゼ(以下ＬＡＬと略記)はアミノ酸の修飾や特殊な補酵素を必要せずにジペプチドを合成できるので、効率的なジペプチド合成に極めて有用である。 It has been reported that a microorganism belonging to the genus Bacillus has an L-amino acid α ligase, an enzyme that generates a dipeptide in which an ATP and two molecules of L-amino acid are peptide-bonded at the α-position carboxyl group (Patent Document 1, non-patent document). Reference 1). Since L-amino acid ligase (hereinafter abbreviated as LAL) can synthesize dipeptides without the need for amino acid modification or special coenzymes, it is extremely useful for efficient dipeptide synthesis.
ＬＡＬは比較的広い基質特異性を持ち様々なジペプチドを合成できるが、すべての種類のジペプチドを効率よく合成できるわけではない。β−ＡｌａやＬ−Ｈｉｓを基質とした場合、ジペプチド合成活性は極端に悪くなることが明らかになっている(特許文献１、非特許文献１)。従ってＬＡＬを用いたとしても、カルノシンを効率よく合成する方法が求められていた。 LAL has a relatively wide substrate specificity and can synthesize various dipeptides, but not all types of dipeptides can be synthesized efficiently. It has been clarified that when β-Ala or L-His is used as a substrate, dipeptide synthesis activity is extremely deteriorated (Patent Document 1, Non-Patent Document 1). Therefore, even if LAL is used, a method for efficiently synthesizing carnosine has been demanded.
本発明の目的は、カルノシンを高効率に生成する蛋白質、および該蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いたカルノシンの製造法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a protein for producing carnosine with high efficiency, and a method for producing carnosine using the protein or a microorganism having an ability to produce the protein.
本発明は、以下の［１］〜［９］に関する。
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１１２番目および３７８番目より選ばれる１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質のホモログ蛋白質（以下、ＹｗｆＥホモログ蛋白質という。）のアミノ酸配列において、ＹｗｆＥホモログ蛋白質のアミノ酸配列と配列番号１で表されるアミノ酸配列とをアライメントしたときに、ＹｗｆＥホモログ蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号１の１１２番目および３７８番目より選ばれるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のうち、一つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
［３］他のアミノ酸残基が、１１２番目はＶａｌおよび３７８番目はＡｒｇである［１］または［２］記載の蛋白質。
［４］１１２番目のアミノ酸残基がＶａｌであり、かつ３７８番目のアミノ酸残基がＡｒｇであるアミノ酸配列からなる［１］または［２］に記載の蛋白質。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
［６］［５］記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
［７］［６］記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
［８］［１］〜［４］のいずれか記載の蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する宿主細胞の培養物若しくは該培養物の処理物、1種または2種のＬ−アミノ酸またはβアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法。
［９］［１］〜［４］のいずれか記載の蛋白質を生産する能力を有する宿主細胞を培地に培養し、培養物中にジペプチドを生成、蓄積せしめ、該培養物から該ジペプチドを採取することを特徴とする、ジペプチドの製造法。
The present invention relates to the following [1] to [9].
[1] A protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues selected from the 112th and 378th amino acids are substituted with other amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[2] In the amino acid sequence of a protein homologous protein (hereinafter referred to as YwfE homologous protein) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of YwfE homologous protein and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 When aligned, in the amino acid sequence of the YwfE homolog protein, one or more amino acid residues corresponding to amino acid residues selected from the 112th and 378th amino acid residues of SEQ ID NO: 1 are other amino acid residues. A protein comprising an amino acid sequence substituted with.
[3] The protein according to [1] or [2], wherein the other amino acid residue is Val at position 112 and Arg at position 378.
[4] The protein according to [1] or [2], comprising an amino acid sequence in which the 112th amino acid residue is Val and the 378th amino acid residue is Arg.
[5] DNA encoding the protein according to any one of [1] to [4].
[6] A recombinant DNA containing the DNA according to [5].
[7] A transformant obtained by transforming a host cell with the recombinant DNA according to [6].
[8] The protein according to any one of [1] to [4], a culture of a host cell having the ability to produce the protein, or a processed product of the culture, one or two L-amino acids or β-amino acids Is produced in an aqueous medium, a dipeptide is produced and accumulated in the medium, and the dipeptide is collected from the medium.
[9] Host cells having the ability to produce the protein according to any one of [1] to [4] are cultured in a medium, a dipeptide is produced and accumulated in the culture, and the dipeptide is collected from the culture. A method for producing a dipeptide, characterized in that
本発明によれば、カルノシンを高効率に生成する蛋白質、および該蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いたカルノシンの製造法を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the manufacturing method of carnosine using the protein which produces | generates carnosine highly efficiently, and the microorganisms which have the capability to produce this protein can be provided.
１．本発明の蛋白質
本発明の蛋白質としては、以下の（１）〜（３）記載のいずれかの蛋白質をあげることができる。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１１２番目および３７８番目より選ばれる１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
（２）ＹｗｆＥホモログ蛋白質のアミノ酸配列において、ＹｗｆＥホモログ蛋白質のアミノ酸配列と配列番号１で表されるアミノ酸配列とをアライメントしたときに、ＹｗｆＥホモログ蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号１の１１２番目および３７８番目より選ばれるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のうち、一つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
（３）他のアミノ酸残基が、１１２番目はＶａｌおよび３７８番目はＡｒｇである（１）または（２）記載の蛋白質。
1. Protein of the present invention As the protein of the present invention, any one of the following proteins (1) to (3) can be mentioned.
(1) A protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues selected from the 112th and 378th amino acids are substituted with other amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(2) In the amino acid sequence of YwfE homolog protein, when the amino acid sequence of YwfE homolog protein and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are aligned, the 112th and 378th positions of SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence of YwfE homolog protein A protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are substituted with other amino acid residues among amino acid residues corresponding to the amino acid residues selected from the second position.
(3) The protein according to (1) or (2), wherein the other amino acid residue is Val at 112th and Arg at 378th.
ＹｗｆＥホモログ蛋白質とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチド合成酵素活性を有する蛋白質をいう。
配列番号１で表されるアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を有するとは、配列番号１で表されるアミノ酸配列とＹｗｆＥホモログ蛋白質のアミノ酸配列とが、少なくとも80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、最も好ましくは98%以上の同一性を有することをいう。
The YwfE homolog protein refers to a protein comprising an amino acid sequence having high identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having dipeptide synthase activity.
Having an amino acid sequence having high identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 means that the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of the YwfE homolog protein are at least 80% or more, preferably 85% More than 90%, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and most preferably 98% or more.
ＹｗｆＥホモログ蛋白質の具体例としては、配列番号２で表されるBacillus subtilisのＢａｃＤ、配列番号３で表される Bacillus amyloliquefaciens FZB42のＢａｃＤ、配列番号４で表される Bacillus amyloliquefaciens のＢａｃＤ、配列番号５で表されるBacillus pumilus ATCC 7061のＢａｃＤ、配列番号６で表されるBacillus pumilus SAFR-032のＢａｃＤ等をあげることができる。 Specific examples of the YwfE homolog protein include BacD of Bacillus subtilis represented by SEQ ID NO: 2, BacD of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 represented by SEQ ID NO: 3, BacD of Bacillus amyloliquefaciens represented by SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 5. Examples thereof include BacD of Bacillus pumilus ATCC 7061 represented, BacD of Bacillus pumilus SAFR-032 represented by SEQ ID NO: 6, and the like.
配列番号１で表されるアミノ酸配列と、ＹｗｆＥホモログ蛋白質のアミノ酸配列とのアライメントは、公知のアライメントプログラムClustalW[Nucelic Acids Research 22, 4673, (1994)]を用いて作成することができる。ClustalWは、http://www.ebi.ac.uk/clustalw/(European Bioinformatics Institute)より利用することができる。ClustalWを用いてアライメントを作成する際のパラメータは、例えばデフォルトの値を用いる。 The alignment between the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of the YwfE homolog protein can be prepared using a known alignment program ClustalW [Nucelic Acids Research 22 , 4673, (1994)]. ClustalW can be used from http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ (European Bioinformatics Institute). For example, default values are used as parameters for creating alignment using ClustalW.
本発明の蛋白質としてより好ましくは、上記（１）〜（３）記載の蛋白質のアミノ酸配列において、１１２番目のアミノ酸残基がＶａｌであり、かつ、３７８番目のアミノ酸残基がＡｒｇであるアミノ酸配列からなる蛋白質を挙げることができる。
２．本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡとしては、上記１に記載の本発明の蛋白質をコードするDNAをあげることができる。
３．本発明の形質転換体
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体としては、上記２のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを用い、宿主細胞を公知の方法で形質転換して得られる形質転換体をあげることができる。宿主細胞としては、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌等の原核生物、より好ましくはエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物をあげることができる。
４．本発明のＤＮＡの調製
（１）ジペプチド合成酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの取得
ジペプチド合成酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡまたはＹｗｆＥホモログ蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づき設計することができるプローブを用い、Bacillus subtilis 168またはＹｗｆＥホモログ蛋白質をコードするＤＮＡを有する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションにより、または配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡもしくはＹｗｆＥホモログ蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、Bacillus subtilis 168もしくはＹｗｆＥホモログ蛋白質をコードするＤＮＡを有する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたPCR[PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得することができる。
More preferably, the protein of the present invention is an amino acid sequence in which the 112th amino acid residue is Val and the 378th amino acid residue is Arg in the amino acid sequences of the proteins described in (1) to (3) above. The protein which consists of can be mentioned.
2. DNA of the present invention
Examples of the DNA of the present invention include DNA encoding the protein of the present invention described in 1 above.
3. Transformant of the present invention A transformant transformed with the DNA encoding the protein of the present invention is obtained by transforming a host cell by a known method using a recombinant DNA containing the above DNA 2. The transformant obtained can be mentioned. The host cell may be any of prokaryotes, yeast, animal cells, insect cells, plant cells, etc., but preferably prokaryotes such as bacteria, more preferably Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium. Examples include microorganisms belonging to the genus Ummus, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, and the like.
4). Preparation of DNA of the Present Invention (1) Acquisition of DNA Encoding Protein Having Dipeptide Synthetase Activity The DNA encoding a protein having dipeptide synthetase activity encodes a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, for example. By Southern hybridization to a chromosomal DNA library of a microorganism having a DNA encoding Bacillus subtilis 168 or YwfE homolog protein using a probe that can be designed based on the nucleotide sequence of DNA encoding YwfE homolog protein or using DNA primers can be designed based on the nucleotide sequence of the DNA encoding the DNA or YwfE homolog protein encoding the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, Bacillus subtilis 168 or Y fE homologue proteins chromosomal DNA of a microorganism having a DNA encoding a PCR [PCR Protocols, Academic Press (1990)] which was used as a template can be obtained by.
ＹｗｆＥホモログ蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列は、上記１のYwfEホモログ蛋白質のアミノ酸配列をもとに、またはそれらのGenBank Accession Numberをもとにデータベースを検索し、容易に取得することができる。
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号1で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、最も好ましくは98%以上の同一性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法によりＹｗｆＥホモログ蛋白質をコードするＤＮＡを取得することもできる。
The base sequence of the DNA encoding the YwfE homolog protein can be easily obtained by searching a database based on the amino acid sequence of the YwfE homolog protein of 1 above or based on their GenBank Accession Number.
Also, at least 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% of the nucleotide sequence of DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 with respect to various gene sequence databases As described above, most preferably, a sequence having 98% or more identity is searched, and based on the base sequence obtained by the search, YwfE homolog is obtained from the chromosomal DNA, cDNA library, etc. of the organism having the base sequence by the method described above. A DNA encoding a protein can also be obtained.
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]、あるいはABI3700DNAアナライザー（アプライド・バイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。 The obtained DNA is cleaved as it is or with an appropriate restriction enzyme, and incorporated into a vector by a conventional method. After the obtained recombinant DNA is introduced into a host cell, a commonly used nucleotide sequence analysis method such as the dideoxy method [ Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)] or ABI3700 DNA analyzer (Applied Biosystems) and other base sequence analyzers are used to analyze the base sequence of the DNA. Can be determined.
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
If the obtained DNA has a partial length as a result of determining the base sequence, the full-length DNA can be obtained by Southern hybridization or the like for a chromosomal DNA library using the partial length DNA as a probe. .
Furthermore, based on the determined DNA base sequence, the target DNA can be prepared by chemical synthesis using a 8905 type DNA synthesizer manufactured by Perceptive Biosystems.
上記において、YwfEホモログ蛋白質をコードするDNAとしては、好ましくは配列番号７で表される Bacillus amyloliquefaciens のｂａｃＤで表される塩基配列からなるDNAをあげることができる。
（２）本発明のＤＮＡの調製
本発明のＤＮＡは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、該アミノ酸配列の１１２番目または３７８番目のアミノ酸残基のうち、１つ以上のアミノ酸残基をコードする部分の塩基配列に、例えばモレキュラー・クローニング第３版およびカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された部位特異的変異導入法により変異を導入し、他のアミノ酸をコードする塩基配列に置換することにより取得することができる。また、同様の方法により、ＹｗｆＥのホモログ蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、配列番号１で表されるアミノ酸配列と、ＹｗｆＥのホモログ蛋白質とを上記１の方法によってアライメントしたときに、ＹｗｆＥのホモログ蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号１の１１２番目または３７８番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のうち、１つ以上のアミノ酸残基をコードする部分の塩基配列に変異を導入することにより取得することができる。
In the above, the DNA encoding the YwfE homolog protein is preferably a DNA consisting of a base sequence represented by bacD of Bacillus amyloliquefaciens represented by SEQ ID NO: 7.
(2) Preparation of DNA of the Present Invention The DNA of the present invention uses DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and comprises the amino acid residue at the 112th or 378th amino acid sequence. Mutation in the base sequence of a portion encoding one or more amino acid residues by site-directed mutagenesis described in, for example, Molecular Cloning 3rd Edition and Current Protocols in Molecular Biology It can be obtained by introduction and substitution with a base sequence encoding another amino acid. Further, when the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the YwfE homolog protein were aligned by the above method 1 using DNA encoding the YwfE homolog protein in the same manner, the YwfE homolog protein Is obtained by introducing a mutation into the base sequence of the portion encoding one or more amino acid residues among the amino acid residues corresponding to the 112th or 378th amino acid residue of SEQ ID NO: 1. be able to.
上記のようにして取得されるＤＮＡとしては、例えば、pQE60ywfE、pQM99E11等が有するジペプチド合成酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをあげることができる。
５．本発明の形質転換体の製造
本発明の形質転換体としては、本発明のＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体をあげることができる。
Examples of the DNA obtained as described above include DNA encoding a protein having dipeptide synthase activity possessed by pQE60ywfE, pQM99E11, and the like.
5). Production of the transformant of the present invention The transformant of the present invention includes a transformant obtained by introducing a recombinant DNA obtained by incorporating the DNA of the present invention into a vector DNA into a host cell. .
本発明のＤＮＡを組み込むベクターとしては、pBluescriptII KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）、pCR-TRAP（ジーンハンター社製）、pQE-60（キアゲン社製）等をあげることができる。
宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などをあげることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ XL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ DH5α、エシェリヒア・コリ MC1000、エシェリヒア・コリ ATCC 12435、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ MP347、エシェリヒア・コリ NM522、エシェリヒア・コリ BL21、エシェリヒア・コリ ME8415等をあげることができる。
As vectors incorporating the DNA of the present invention, pBluescriptII KS (+) (Stratagene), pDIRECT [Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)], pCR-Script Amp SK (+) (Stratagene) ), PT7Blue (Novagen), pCR II (Invitrogen), pCR-TRAP (Gen Hunter), pQE-60 (Qiagen), and the like.
Examples of host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia. Examples of microorganisms belonging to the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli DH5α, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli ATCC 12435, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli MP347, Escherichia coli NM522, Escherichia coli BL21, Escherichia coli BL84, Escherichia coli ME8415, etc. Can do.
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
上記方法によって得られる本発明の形質転換体としては、例えば、リプレッサー蛋白LacIを発現するプラスミドpREP4(キアゲン社製)を有するエシェリヒア・コリDH5α/pREP4をpQE60ywfE、pQM99E11等を用いて形質転換して得られる形質転換体をあげることができる。
６.本発明の蛋白質の製造法
（１）本発明の蛋白質を生産する形質転換体の製造
本発明のＤＮＡをもとにして、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産効率が向上した形質転換体を取得することができる。
As a method for introducing recombinant DNA, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell, for example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], protoplast method (JP-A 63-248394), electroporation method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] and the like.
As the transformant of the present invention obtained by the above method, for example, Escherichia coli DH5α / pREP4 having the plasmid pREP4 (manufactured by Qiagen) expressing the repressor protein LacI is transformed with pQE60ywfE, pQM99E11, etc. The transformant obtained can be mentioned.
6. Production method of the protein of the present invention (1) Production of transformant producing the protein of the present invention Based on the DNA of the present invention, if necessary, suitable containing the portion encoding the protein of the present invention Prepare a DNA fragment of sufficient length. Moreover, a transformant with improved production efficiency of the protein can be obtained by substituting the base in the base sequence of the protein-encoding portion so as to be an optimal codon for host expression.
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
A transformant producing the protein of the present invention can be obtained by introducing the recombinant DNA into a host cell suitable for the expression vector.
Any host cell can be used as long as it can express the gene of interest, such as bacteria, yeast, animal cells, insect cells, and plant cells.
As the expression vector, one that can autonomously replicate in the host cell or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position where the DNA of the present invention can be transcribed is used.
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、pColdI(タカラバイオ社製)、pCDF-1b、pRSF-1b（いずれもノバジェン社製）、pMAL-c2x（ニューイングランドバイオラブス社製）、pGEX-4T-1（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、pTrcHis（インビトロジェン社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（キアゲン社製）、pQE-60（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、pTrS32 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製]、pPAC31 (WO98/12343)、pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）、pGHA2〔エシェリヒア・コリ IGHA2（FERM B-400）より調製、特開昭60-221091〕、pGKA2〔エシェリヒア・コリ IGKA2（FERM BP-6798）より調製、特開昭60-221091〕、pTerm2（US4686191、US4939094、US5160735）、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)〕、pCG1（特開昭57-134500）、pCG2（特開昭58-35197）、pCG4（特開昭57-183799）、pCG11（特開昭57-134500）、pCG116、pCE54、pCB101（いずれも特開昭58-105999）、pRI109（再表2000-44886）、pCE51、pCE52、pCE53［いずれもMolecular and General Genetics, 196, 175 (1984)］等をあげることができる。
When a prokaryotic organism such as a bacterium is used as a host cell, the recombinant DNA having the DNA of the present invention can autonomously replicate in the prokaryotic organism, and at the same time, a promoter, ribosome binding sequence, DNA of the present invention, transcription termination It is preferably a recombinant DNA composed of a sequence. A gene that controls the promoter may also be included.
Expression vectors include pColdI (Takara Bio), pCDF-1b, pRSF-1b (Novagen), pMAL-c2x (New England Biolabs), pGEX-4T-1 (GE Healthcare Bio) Science), pTrcHis (Invitrogen), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE-30 (Qiagen), pQE-60 (Qiagen), pET-3 ( Novagen), pKYP10 (JP 58-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)], pBluescriptII SK (+), pBluescript II KS (-) (Stratagene), pTrS30 [Escherichia coli JM109 / pTrS30 (FERM BP -5407)], pTrS32 [Escherichia coli JM109 / pTrS32 (FERM BP-5408)], pPAC31 (WO98 / 12343), pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pSTV28 (manufactured by Takara Bio Inc.) ), PUC1 18 (manufactured by Takara Bio Inc.), pPA1 (JP 63-233798), pGHA2 [Escherichia coli IGHA2 (FERM B-400), JP 60-221091], pGKA2 [Escherichia coli IGKA2 (FERM BP -6798), JP 60-221091], pTerm2 (US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400 [J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)], pCG1 (JP 57-134500), pCG2 (Japanese Patent Laid-Open No. 58-35197), pCG4 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-183799), pCG11 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-134500), pCG116, pCE54, pCB101 (all of which are Japanese Patent Laid-Open No. 58-105999) ), PRI109 (reviewed 2000-44886), pCE51, pCE52, pCE53 [all are Molecular and General Genetics, 196, 175 (1984)].
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrp ×２）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。 Any promoter may be used as long as it functions in host cells such as E. coli. For example, promoters derived from Escherichia coli or phage, such as trp promoter (Ptrp), lac promoter (Plac), PL promoter, PR promoter, PSE promoter, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, and the like can be mentioned. In addition, artificially designed and modified promoters such as a promoter in which two Ptrps are connected in series (Ptrp × 2), a tac promoter, a lacT7 promoter, and a let I promoter can be used.
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。組換え体ＤＮＡには、本発明のＤＮＡの発現に転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えば、pQE60ywfE、pQM99E11等をあげることができる。原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア（Serratia）属、バチルス（Bacillus）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリ XL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ DH5α、エシェリヒア・コリ NM522、エシェリヒア・コリ MC1000、エシェリヒア・コリ KY3276、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）、セラチア・フォンティコラ（Serratia fonticola）、セラチア・リケファシエンス（Serratia liquefaciens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、バチルス・サチラス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）ATCC14068、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）ATCC14066、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC14067、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）ATCC13870、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）ATCC15354、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.） D-0110等をあげることができるが、好ましくはエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物、より好ましくはエシェリヒア・コリ XL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ DH5α、エシェリヒア・コリ MC1000、エシェリヒア・コリ MM294、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ GI698、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC6872、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC21170、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC21171等をあげることができる。
It is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases). In the recombinant DNA, a transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the DNA of the present invention, but it is preferable to arrange the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
Examples of such recombinant DNA include pQE60ywfE and pQM99E11. Prokaryotes include Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc. For example, Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli DH5α, Escherichia coli NM522, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens S uefaciens), Serratia marcescens, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacterium immariophilum ATCC 14068, Brevibacterium saccharity Camellia (Brevibacterium saccharolyticum) ATCC14066, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCC14067, Corynebacterium glutamicum ATCC13869, Corynebacterium acetoacidophile Lam (Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354, Pseudomonas sp. D-011 Preferably, microorganisms belonging to the genus Escherichia or Corynebacterium, more preferably Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli DH5α, Escherichia・ Coli MC1000, Escherichia coli MM294, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli GI698, Corynebacterium coli Ammonia Genes ATCC6872, Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCC21171 and the like.
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭57-186492、特開昭57-18649）、電気穿孔法［例えば、Journal of Bacteriology, 175, 4096 (1993)、Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541 (1999)］、Gene, 17, 107 (1982)およびMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。 As a method for introducing a recombinant vector, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the above host cell. For example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 ( 1972)], protoplast method (JP 57-186492, JP 57-18649), electroporation [for example, Journal of Bacteriology, 175, 4096 (1993), Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541 ( 1999)], Gene, 17, 107 (1982) and Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を用いることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
When using a yeast strain as a host cell, YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 etc. can be used as an expression vector, for example.
Any promoter may be used as long as it functions in yeast strains. For example, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal 1 promoter, gal 10 promoter, heat shock polypeptide promoter And promoters such as MFα1 promoter and CUP 1 promoter.
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、キャンディダ属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シワニオマイセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）、キャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）等をあげることができる。 Examples of host cells include yeast strains belonging to the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Siwaniomyces, Pichia, Candida, and the like. Specifically, Saccharomyces cerevisiae ( Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces arpius Examples include Candida utilis.
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Methods Enzymol., 194, 182 (1990)）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)）、酢酸リチウム法（J. Bacteriol., 153, 163 (1983)）等をあげることができる。
（２）本発明の蛋白質の製造法
上記（１）の方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物から採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
As a method for introducing recombinant DNA, any method for introducing DNA into yeast can be used. For example, electroporation (Methods Enzymol., 194, 182 (1990)), spheroplast method (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)), lithium acetate method (J. Bacteriol., 153, 163 (1983)) and the like.
(2) Method for producing the protein of the present invention The transformant obtained by the method of (1) above is cultured in a medium, the protein of the present invention is produced and accumulated in the culture, and collected from the culture. The protein can be produced.
本発明の蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌等の原核生物、より好ましくはエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物をあげることができる。 The host of the transformant for producing the protein of the present invention may be any of prokaryotes, yeast, animal cells, insect cells, plant cells, etc., but preferably prokaryotes such as bacteria. Preferred examples include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, and the like.
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
エシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
When expressed in yeast, animal cells, insect cells, or plant cells, a protein with a sugar or sugar chain added can be obtained.
The method of culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
As a medium for culturing a transformant obtained by using a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host, the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the organism, Either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium can efficiently culture the transformant.
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
The carbon source may be anything that can be assimilated by the organism, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, ethanol, Alcohols such as propanol can be used.
Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids such as ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein A hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented cells, digests thereof, and the like can be used.
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜11に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
As the inorganic salt, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
The culture is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture. The culture temperature is preferably 15 to 40 ° C., and the culture time is usually 5 hours to 7 days. During the culture, the pH is maintained at 3.0-11. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
Moreover, you may add antibiotics, such as an ampicillin and a tetracycline, to a culture medium as needed during culture | cultivation.
When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside is used when cultivating a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter, and indole acrylic is used when a microorganism transformed with an expression vector using the trp promoter is cultured. An acid or the like may be added to the medium.
培養は、通常pH6〜8、25〜40℃、5％ＣＯ2存在下等の条件下で1〜7日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方法に応じて、生産させる蛋白質の構造を変えることができる。
The culture is usually performed for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 25 to 40 ° C., and the presence of 5% CO 2.
Moreover, you may add antibiotics, such as kanamycin, penicillin, streptomycin, to a culture medium as needed during culture | cultivation.
Examples of the method for producing the protein of the present invention include a method for producing in the host cell, a method for secreting it outside the host cell, and a method for producing it on the outer cell membrane of the host cell. The structure can be changed.
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法[J. Biol. Chem.，264, 17619 (1989)]、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)]、または特開平05-336963、WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。 When the protein of the present invention is produced in the host cell or on the outer membrane of the host cell, the method of Paulson et al. [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], the method of Rowe et al. [Proc. Natl. Acad Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], or JP-A 05-336963, WO94 / 23021, etc. It can be actively secreted extracellularly.
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
That is, by using a gene recombination technique, a protein containing the active site of the protein of the present invention can be produced in a form in which a signal peptide is added before the protein to actively secrete the protein outside the host cell. it can.
Further, in accordance with the method described in JP-A-2-27075, the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
本発明の形質転換体により製造された蛋白質を単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用いることができる。
例えば本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化学社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（アマシャムバイオサイエンス社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
In order to isolate and purify the protein produced by the transformant of the present invention, an ordinary enzyme isolation and purification method can be used.
For example, when the protein of the present invention is expressed in a cell in a dissolved state, the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, a French press, a Manton Gaurin homogenizer. Then, the cells are disrupted with dynomill or the like to obtain a cell-free extract. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, an ordinary enzyme isolation and purification method, that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylamino Anion exchange chromatography using a resin such as ethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical), and cation exchange using a resin such as S-Sepharose FF (Amersham Biosciences) Chromatographic methods, hydrophobic chromatography methods using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration methods using molecular sieves, affinity chromatography methods, electrophoresis methods such as chromatofocusing methods, isoelectric focusing etc. A purified sample can be obtained by using the methods alone or in combination.
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として蛋白質の不溶体を回収する。回収した蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該蛋白質を正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該蛋白質の精製標品を得ることができる。 When the protein is expressed by forming an insoluble substance in the cell, the cell is similarly collected, crushed, and centrifuged to recover the protein insoluble substance as a precipitate fraction. The recovered insoluble matter of the protein is solubilized with a protein denaturant. The protein is returned to a normal three-dimensional structure by diluting or dialyzing the solubilized solution and reducing the concentration of the protein denaturing agent in the solubilized solution. After the operation, a purified sample of the protein can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
本発明の蛋白質、あるいは該蛋白質に糖鎖の付加された蛋白質等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質あるいは該蛋白質の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。 When the protein of the present invention or a derivative such as a protein having a sugar chain added to the protein is secreted outside the cell, the protein or the protein derivative can be recovered in the culture supernatant. That is, the culture supernatant is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation as described above, and a purified sample is obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above. Can be obtained.
このようにして取得される蛋白質として、上記１に記載の蛋白質をあげることができる。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 （1990)]、特開平5-336963、WO94/23021に記載の方法に準じて、本発明の蛋白質をプロテインＡとの融合蛋白質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
Examples of the protein thus obtained include the protein described in 1 above.
In addition, the protein of the present invention can be produced as a fusion protein with another protein, and purified using affinity chromatography using a substance having affinity for the fused protein. For example, the method described in Law et al. [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], JP-A-5-336963, WO94 / 23021 According to the above, the protein of the present invention can be produced as a fusion protein with protein A and purified by affinity chromatography using immunoglobulin G.
また、本発明の蛋白質をＦｌａｇペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)]や、ポリヒスチジンとの融合蛋白質として生産し、ポリヒスチジンと高親和性を有する金属配位レジンを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製することもできる。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。 In addition, the protein of the present invention is produced as a fusion protein with a Flag peptide and affinity chromatography using an anti-Flag antibody [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], and can also be purified by affinity chromatography using a metal coordination resin produced as a fusion protein with polyhistidine and having high affinity with polyhistidine. Furthermore, it can also be purified by affinity chromatography using an antibody against the protein itself.
上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、Advanced ChemTech社、パーキン・エルマー社、Pharmacia社、Protein Technology Instrument社、Synthecell-Vega社、アプライドバイオシステムズ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
７．本発明のジペプチドの製造法
上記３の微生物または形質転換体の培養物もしくは該培養物の処理物、または上記１の本発明の蛋白質と１種以上、好ましくは２種のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取することにより、ジペプチドを製造することができる。
（１）本発明の蛋白質を酵素源として用いるジペプチドの製造法
本発明の製造法において、酵素源として本発明の蛋白質を用いる場合、基質に用いられるアミノ酸としては、Ｌ-アラニン（L-Ala）、L-グルタミン（L-Gln）、L-グルタミン酸（L-Glu）、L-バリン（L-Val）、L-ロイシン(L-Leu)、L-イソロイシン(L-Ile)、L-プロリン（L-Pro）、L-フェニルアラニン(L-Phe)、L-トリプトファン（L-Trp）、L-メチオニン（L-Met）、L-セリン（L-Ser）、L-スレオニン（L-Thr）、L-システイン（L-Cys）、L-アスパラギン（L-Asn）、L-チロシン（L-Tyr）、L-リジン（L-Lys）、L-アルギニン（L-Arg）、L-ヒスチジン（L-His）、L-アスパラギン酸（L-Asp）、L-α-Aminobutyric acid、L- Azaserine、L-theanine、L-4-Hydroxyproline、L-3- Hydroxyproline、L-Ornithine、L-Citrulline、L-6-diazo-5-oxo-norleucine、グリシン（Gly）およびβ−アラニン（β-Ala）からなる群より選ばれる１種または２種のアミノ酸の組み合わせを挙げることができる。
上記製造法に用いられる、より好ましいアミノ酸としては、β-AlaとGly、L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-HisおよびL-Aspからなる群より選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、特に好ましくは、β-AlaとL-Hisの組み合わせをあげることができる。
Based on the amino acid sequence information of the protein obtained above, the protein of the present invention is produced by chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method) and the like. be able to. Alternatively, chemical synthesis can be performed using peptide synthesizers such as Advanced ChemTech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, Applied Biosystems, Shimadzu Corporation.
7). Production method of the dipeptide of the present invention The culture of the microorganism or transformant described above or a processed product of the culture, or the protein of the present invention described above and one or more, preferably two amino acids, in an aqueous medium The dipeptide can be produced by being present, producing and accumulating the dipeptide in the medium, and collecting the dipeptide from the medium.
(1) Dipeptide production method using the protein of the present invention as an enzyme source In the production method of the present invention, when the protein of the present invention is used as an enzyme source, an amino acid used as a substrate is L-alanine (L-Ala). , L-glutamine (L-Gln), L-glutamic acid (L-Glu), L-valine (L-Val), L-leucine (L-Leu), L-isoleucine (L-Ile), L-proline ( L-Pro), L-phenylalanine (L-Phe), L-tryptophan (L-Trp), L-methionine (L-Met), L-serine (L-Ser), L-threonine (L-Thr), L-cysteine (L-Cys), L-asparagine (L-Asn), L-tyrosine (L-Tyr), L-lysine (L-Lys), L-arginine (L-Arg), L-histidine (L -His), L-aspartic acid (L-Asp), L-α-Aminobutyric acid, L-Azaserine, L-theanine, L-4-Hydroxyproline, L-3-Hydroxyproline, L-Ornithine, L-Citrulline, L -6-diazo-5-oxo-norleucine, glycine (Gly) and β -The combination of 1 type or 2 types of amino acids chosen from the group which consists of alanine ((beta) -Ala) can be mentioned.
More preferable amino acids used in the above production method include β-Ala and Gly, L-Ala, L-Gln, L-Glu, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, and L-Phe. , L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His and L-Asp A combination of one kind of amino acid, particularly preferably a combination of β-Ala and L-His can be mentioned.
上記製造法において、本発明の蛋白質は、基質として用いるアミノ酸1mgあたり0.01〜100mg、好ましくは0.1mg〜10mg添加する。
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸は、0.1〜500g/L、好ましくは0.2〜200g/Lの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
上記製造法において、エネルギー源としてＡＴＰを用いることができ、ＡＴＰは、0.5mmol〜10mol/Lの濃度で用いる。
In the above production method, the protein of the present invention is added in an amount of 0.01 to 100 mg, preferably 0.1 to 10 mg, per 1 mg of amino acid used as a substrate.
In the above production method, the amino acid used as the substrate is added to the aqueous medium at the beginning or in the middle of the reaction so as to have a concentration of 0.1 to 500 g / L, preferably 0.2 to 200 g / L.
In the above production method, ATP can be used as an energy source, and ATP is used at a concentration of 0.5 mmol to 10 mol / L.
上記製造法で用いられる水性媒体としては、ジペプチドの生成反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類を含有していてもよい。 The aqueous medium used in the above production method may be an aqueous medium of any component and composition as long as it does not inhibit the dipeptide formation reaction. For example, water, phosphate, carbonate, acetate, borate, Examples thereof include buffers such as citrate and Tris. Further, it may contain alcohols such as methanol and ethanol, esters such as ethyl acetate, ketones such as acetone, and amides such as acetamide.
ジペプチドの生成反応は水性媒体中、pH5〜11、好ましくはpH6〜10、20〜50℃、好ましくは25〜45℃の条件で2〜150時間、好ましくは6〜120時間行う。
上記方法で製造されるジペプチドとしては、式（Ｉ）
R1-R2 （Ｉ）
（ただしR1はL-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-Aminobutyric acid、L-Azaserine、L-theanine、L-4-Hydroxyproline、L-3-Hydroxyproline、L-Ornithine、L-Citrulline、L-6-diazo-5-oxo-norleucine、Glyおよびβ-Alaからなる群より選ばれる１種であり、R2はL-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-Aminobutyric acid、L-Azaserine、L-theanine、L-4-Hydroxyproline、L-3-Hydroxyproline、L-Ornithine、L-Citrulline、L-6-diazo-5-oxo-norleucine、Glyおよびβ-Alaからなる群より選ばれる１種である）で表される２つのアミノ酸が連結したジペプチド、より好ましくは、式（Ｉ）（ただしR1はβ-Alaであり、R2はL-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-AspおよびGlyからなる群より選ばれる１種である）で表される２つのアミノ酸またはその誘導体が連結したジペプチドまたはその誘導体、特に好ましくは、式（Ｉ）（ただし、R1はβ-Alaであり、R2はL-Hisである）で表される２つのアミノ酸が連結したジペプチドをあげることができる。
（２）微生物または形質転換体の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いるジペプチドの製造法
本発明の製造法において酵素源として用いられる微生物または形質転換体の培養物としては、該微生物または形質転換体を上記６の培養方法で培養して得られる培養物をあげることができる。微生物または形質転換体の培養物の処理物としては、該培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、および当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物などをあげることができる。
The dipeptide production reaction is carried out in an aqueous medium at pH 5-11, preferably pH 6-10, 20-50 ° C, preferably 25-45 ° C, for 2-150 hours, preferably 6-120 hours.
Examples of the dipeptide produced by the above method include those represented by the formula (I)
R 1 -R 2 (I)
(However, R 1 is L-Ala, L-Gln, L-Glu, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L -Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, L-α-Aminobutyric acid, L-Azaserine, L-theanine, L-4- Hydroxyproline, L-3-Hydroxyproline, L-Ornithine, L-Citrulline, L-6-diazo-5-oxo-norleucine, Gly and β-Ala, R 2 is L-Ala , L-Gln, L-Glu, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L -Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, L-α-Aminobutyric acid, L-Azaserine, L-theanine, L-4-Hydroxyproline, L-3-Hydroxyproline, A dipeptide in which two amino acids represented by L-Ornithine, L-Citrulline, L-6-diazo-5-oxo-norleucine, Gly and β-Ala) are linked. Is the formula (I) (wherein R 1 is β-Ala and R 2 is L-Ala, L-Gln, L-Glu, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L- Phe, L-Trp, L-Met, LS er, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp and Gly. Dipeptide or derivative thereof in which two amino acids or derivatives thereof are linked, particularly preferably two amino acids represented by the formula (I) (wherein R 1 is β-Ala and R 2 is L-His) Can be mentioned.
(2) Dipeptide production method using culture or treated product of microorganism or transformant as enzyme source The microorganism or transformant culture used as the enzyme source in the production method of the present invention includes the microorganism Or the culture obtained by culture | cultivating a transformant with said 6 culture methods can be mention | raise | lifted. The treated product of the culture of the microorganism or transformant includes the concentrate of the culture, the dried product of the culture, the cells obtained by centrifuging or filtering the culture, the drying of the cells. , A lyophilized product of the microbial cell, a surfactant-treated product of the microbial cell, a solvent-treated product of the microbial cell, an enzyme-treated product of the microbial cell, and an immobilized product of the microbial cell. Containing viable cells that retain the same function as the product, ultrasonically treated product of the cell, mechanically ground product of the cell, and crude enzyme extraction obtained from the treated cell You can give things.
形質転換体または微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いる場合、基質に用いられる１種以上のアミノ酸としては、上記（１）と同様のアミノ酸をあげることができる。
該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用いるアミノ酸1mgあたり湿菌体重量として5〜1000mg、好ましくは10〜400mg添加する。
In the case of using a transformant or a culture of microorganisms or a processed product of the microorganism as an enzyme source, examples of the one or more amino acids used for the substrate include the same amino acids as in (1) above.
The amount of the enzyme source varies depending on the specific activity of the enzyme source or the like, but for example, 5 to 1000 mg, preferably 10 to 400 mg is added as wet cell weight per 1 mg of amino acid used as a substrate.
基質として用いるアミノ酸は、上記（１）と同じように水性媒体中に添加することができる。上記（１）と同様、ＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、エネルギー源として用いることができる。
水性媒体としては、上記（１）の媒体を用いることができ、加えて酵素源に使用する微生物または形質転換体の培養物の培養上清も水性媒体として用いることもできる。
The amino acid used as a substrate can be added to the aqueous medium in the same manner as (1) above. Similar to (1) above, ATP can be present in an aqueous medium and used as an energy source.
As the aqueous medium, the above medium (1) can be used. In addition, the culture supernatant of the microorganism or transformant culture used for the enzyme source can also be used as the aqueous medium.
ジペプチドの生成反応の反応条件は、上記（１）と同様の条件をあげることができる。
上記方法で製造されるジペプチドとしては、上記（１）と同様のジペプチドをあげることができる。
上記（１）および（２）の製造法において、水性媒体中に生成、蓄積したジペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
（３）発酵法によるジペプチドの製造法
上記４の方法により得られる組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中にジペプチドを生成、蓄積させ、該培養物からジペプチドを採取することにより、ジペプチドを製造することができる。
The reaction conditions for the dipeptide production reaction can be the same as those described in (1) above.
Examples of the dipeptide produced by the above method include the same dipeptide as in the above (1).
In the production methods of (1) and (2) above, the dipeptide produced and accumulated in the aqueous medium can be collected by an ordinary method using activated carbon, ion exchange resin or the like, or extraction with organic solvent, crystallization, thin layer chromatography. Can be carried out by chromatography, high performance liquid chromatography and the like.
(3) Dipeptide production method by fermentation method Transformants obtained by transforming host cells with the recombinant DNA obtained by the above method 4 are cultured in a medium, and the dipeptide is produced and accumulated in the culture. The dipeptide can be produced by collecting the dipeptide from the culture.
宿主細胞は、L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-Aminobutyric acid、L-Azaserine、L-theanine、L-4-Hydroxyproline、L-3-Hydroxyproline、L-Ornithine、L-Citrulline、L-6-diazo-5-oxo-norleucine、Glyおよびβ-Alaからなる群より選ばれる１種または２種のアミノ酸を生産する能力を有する微生物であればいずれの微生物を用いてもよいが、より好ましくは、β-AlaとL-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-AspおよびGlyから選ばれる１種のアミノ酸を生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物を、特に好ましくは、β-AlaとL-Hisを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物を用いることができる。
ただし、本願発明の製造法により、２種の異なるアミノ酸からなるジペプチドを製造する場合であって、用いられる形質転換体が該ジペプチドを構成するアミノ酸うちの１種のアミノ酸を生産する能力しか有していない場合、本発明で用いられる培地に、該形質転換体が生産することができない残りの１種のアミノ酸を添加してもよい。このとき添加するアミノ酸の量は、通常０．５ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは２ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌである。
Host cells are L-Ala, L-Gln, L-Glu, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L- Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, L-α-Aminobutyric acid, L-Azaserine, L-theanine, L-4-Hydroxyproline Ability to produce one or two amino acids selected from the group consisting of L-3-Hydroxyproline, L-Ornithine, L-Citrulline, L-6-diazo-5-oxo-norleucine, Gly and β-Ala Any microorganism can be used as long as it has microorganisms, but more preferably β-Ala and L-Ala, L-Gln, L-Glu, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro , L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp and Gly A microorganism belonging to the genus Escherichia having the ability to produce one kind of amino acid selected from the above, and particularly preferably, a microorganism belonging to the genus Escherichia having the ability to produce β-Ala and L-His can be used.
However, in the case of producing a dipeptide consisting of two different amino acids by the production method of the present invention, the transformant used only has the ability to produce one amino acid out of the amino acids constituting the dipeptide. If not, the remaining one amino acid that cannot be produced by the transformant may be added to the medium used in the present invention. The amount of amino acid added at this time is usually 0.5 g / L to 100 g / L, preferably 2 g / L to 50 g / L.
該形質転換体を培地に培養する方法は、微形質転換体の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
すなわち、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれも用いることができる。
The method of culturing the transformant in a medium can be carried out according to the usual method used for culturing microtransformants.
That is, any natural or synthetic medium can be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated by the transformant and can efficiently culture the transformant. .
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
Any carbon source may be used as long as the transformant can assimilate, glucose, fructose, sucrose, molasses having these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, ethanol Alcohols such as propanol can be used.
Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids such as ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein A hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented cells, digests thereof, and the like can be used.
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
As the inorganic salt, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
The culture is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture. The culture temperature is preferably 15 to 40 ° C., and the culture time is usually 5 hours to 7 days. During the culture, the pH is maintained at 3.0 to 9.0. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
Moreover, you may add antibiotics, such as an ampicillin and a tetracycline, to a culture medium as needed during culture | cultivation.
When cultivating a transformant transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, when a transformant transformed with an expression vector using the lac promoter is cultured, a transformant transformed with isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside or the like and an expression vector using the trp promoter is cultured. When doing so, indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
上記方法で製造されるジペプチドまたはその誘導体としては、上記（１）と同様のジペプチドまたはその誘導体をあげることができる。
培養物中に生成、蓄積したジペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
Examples of the dipeptide or derivative thereof produced by the above method include the same dipeptide or derivative thereof as in (1) above.
The dipeptide produced and accumulated in the culture can be collected by a normal method using activated carbon, an ion exchange resin, or the like, or extraction with an organic solvent, crystallization, thin layer chromatography, high performance liquid chromatography, or the like.
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Examples are shown below, but the present invention is not limited to the following examples.
バチルス・サチリス168株由来のアミノ酸リガーゼをコードするＤＮＡ（ｙｗｆＥ）のクローニング
バチルス・サチリス168株(ATCC23857)をLB培地[10g/Lバクトトリプトン(ディフコ社製)、5g/Lイーストエキス（ディフコ社製）、5g/L塩化ナトリウム、20g/Lバクトアガー]に植菌し30℃で一晩静置培養した。培養後、常法に従い、該微生物の染色体ＤＮＡを単離した。
配列番号８および９で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、バチルス・サチリス168株の染色体ＤＮＡを鋳型として、PCRを行った。PCRはpyrobest ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、添付のプロトコルに従って行った。
上記PCRにより、ｙｗｆＥに相当する約1.4kbpの断片を取得し、常法に従ってこれを発現ベクターpQE60(キアゲン社製)と連結させ、リプレッサー蛋白LacIを発現するプラスミドpREP4(キアゲン社製)を有するエシェリヒア・コリDH5α/pREP4を形質転換した。
得られた形質転換体はpQE60にywfE断片が挿入された構造を有するプラスミドを保持しており、当該プラスミドをpQE60ywfEと命名した。
Cloning of DNA (ywfE) encoding an amino acid ligase derived from Bacillus subtilis 168 strain Bacillus subtilis 168 strain (ATCC23857) was prepared from LB medium [10 g / L bactotryptone (Difco), 5 g / L yeast extract (Difco) Manufactured), 5 g / L sodium chloride, 20 g / L bacto agar] and statically cultured overnight at 30 ° C. After culturing, the chromosomal DNA of the microorganism was isolated according to a conventional method.
PCR was performed using the synthetic DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 8 and 9 as a primer set and the chromosomal DNA of Bacillus subtilis 168 strain as a template. PCR was performed by using a probest DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) according to the attached protocol.
By the PCR, a fragment of about 1.4 kbp corresponding to ywfE is obtained, and ligated with an expression vector pQE60 (Qiagen) according to a conventional method, and has a plasmid pREP4 (Qiagen) expressing the repressor protein LacI. Escherichia coli DH5α / pREP4 was transformed.
The obtained transformant retained a plasmid having a structure in which the ywfE fragment was inserted into pQE60, and the plasmid was named pQE60ywfE.
変異体酵素の調製
実施例１で得られたプラスミドpQE60ywfEを鋳型とし、配列番号１０および１１で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、エラープローンPCRを行った。
PCRは0.1μgのプラスミドDNA、0.5μmol/Lの各プライマーＤＮＡ、5.0unitのtaq ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、5μLのtaq ＤＮＡポリメラーゼ用X10緩衝液、50μMのMnCl2、200μmol/Lの各NTPを含む反応液50μLを調製し、96℃で10秒、56℃で30秒、72℃で2分の工程を30回繰り返すことにより行った。
上記ＰＣＲにより、ｙｗｆＥに相当する約1.4kbpの断片を取得し、これをpQE60と連結させ、エシェリヒア・コリDH5α/pREP4を形質転換した後、得られた形質転換体を100μg/Lのアンピシリン、および50μg/Lのカナマイシンを含む0.1mlのLB培地の入った96穴マルチウェルプレートに接種し30℃で20時間培養した。該培養液に30%グリセロール溶液を0.05mlずつ添加し、よく混合して-80℃で凍結させこれを保存菌株とした。
上記の保存菌株を解凍して100μg/Lのアンピシリン、および50μg/Lのカナマイシン、0.25mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を含む0.5mlのLB培地の入った96穴マルチウェルプレートに接種し30℃で20時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得し、該湿菌体をバグバスター（ノバジェン社製）0.15ｍｌで懸濁し10分間処理し、該処理液から遠心分離により菌体を除去し、蛋白質の漏出した上清を得た。
Preparation of Mutant Enzyme Error-prone PCR was performed using the plasmid pQE60ywfE obtained in Example 1 as a template and the synthetic DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 10 and 11 as a primer set.
PCR is 0.1 μg of plasmid DNA, 0.5 μmol / L of each primer DNA, 5.0 unit of taq DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.), 5 μL of taq DNA polymerase X10 buffer, 50 μM MnCl 2 , 200 μmol / L each 50 μL of a reaction solution containing NTP was prepared, and the process was repeated 30 times at 96 ° C. for 10 seconds, 56 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 2 minutes.
By the PCR, a fragment of about 1.4 kbp corresponding to ywfE was obtained, ligated with pQE60, and transformed with Escherichia coli DH5α / pREP4, and the resulting transformant was treated with 100 μg / L ampicillin, and A 96-well multiwell plate containing 0.1 ml of LB medium containing 50 μg / L kanamycin was inoculated and cultured at 30 ° C. for 20 hours. 0.05 ml of a 30% glycerol solution was added to the culture solution, mixed well, and frozen at −80 ° C. to obtain a stock strain.
96 wells containing 100 ml / L ampicillin and 50 ml / L kanamycin, 0.5 ml LB medium containing 0.25 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) A multiwell plate was inoculated and cultured at 30 ° C. for 20 hours. Centrifugation of the culture broth to obtain wet cells, the wet cells are suspended in 0.15 ml of bagbuster (manufactured by Novagen) and treated for 10 minutes, and the cells are removed from the treatment solution by centrifugation. A supernatant with protein leakage was obtained.
0.1 M硫酸ニッケルで前処理したキレートレジンChelating SepharoseTM Fast Flow（アマシャム・バイオサイエンス）の懸濁液を96穴フィルタープレート（MultiScreen-DV MADVN6510 ミリポア社製）に1wellあたり100μLずつ分注したものを用い、以下のような手順でHisタグ付加組換え酵素を精製した。
まず、上記で得た菌体抽出液100μLを、レジンを分注したフィルタープレートに通し、各ウェルを200μLの水で2回洗浄した。次に50mMのMOPS(pH6.2)、300mMのNaCl、100mMのイミダゾールを含む溶液を100μL×3回通し、レジンに吸着した夾雑蛋白質を除いた。最後に50mMのMOPS(pH6.2)、300mMのNaCl、350mMのイミダゾールを含む溶液を50μL×2回通してHisタグ融合蛋白質を96穴マイクロプレート上に溶出した。
得られた酵素溶液の蛋白質量はプロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を用い、添付の説明書の方法に従って測定した。上記の方法で0.1-0.4mg/ml程度の変異型酵素溶液を各々約100μＬずつ得ることができた。
Use a suspension of Chelating Resin Chelating Sepharose ™ Fast Flow (Amersham Bioscience) pretreated with 0.1 M nickel sulfate in a 96-well filter plate (MultiScreen-DV MADVN6510 Millipore) at 100 μL per well. The His-tagged recombinant enzyme was purified by the following procedure.
First, 100 μL of the bacterial cell extract obtained above was passed through a filter plate into which resin was dispensed, and each well was washed twice with 200 μL of water. Next, a solution containing 50 mM MOPS (pH 6.2), 300 mM NaCl, and 100 mM imidazole was passed through 100 μL × 3 times to remove contaminating proteins adsorbed on the resin. Finally, a His tag fusion protein was eluted on a 96-well microplate by passing 50 μL × 2 a solution containing 50 mM MOPS (pH 6.2), 300 mM NaCl, and 350 mM imidazole.
The protein mass of the obtained enzyme solution was measured using a protein assay kit (manufactured by Bio-Rad) according to the method described in the attached instructions. About 100 μL each of the mutant enzyme solution of about 0.1-0.4 mg / ml could be obtained by the above method.
野生型酵素より反応性が高まった変異型酵素の取得
実施例２で調製した変異酵素ライブラリーを用い、以下のようにして基質特異性が変化した酵素を探索した。
各125mMのβ-AlaおよびL-Hisを含む溶液8μＬ、10mMのATP・２Na、100mMのMgSO4、200mMのTris-HCl（pＨ8.5）を含む溶液10μＬ、精製酵素溶液2μＬを混合して反応液を調製し、37℃で2時間ジペプチド合成反応を行った。反応後、リン酸定量試薬（ホスファC-テストワコー；和光純薬社製）150μＬを加え、37℃、20分発色反応を行い、750nmにおける吸光度をマイクロプレート・リーダーModel3550(バイオラッド社製)によって測定した。吸光度をもとに、反応によって生成したリン酸量を計算し、蛋白質量あたりのリン生成量が野生型酵素に比べ大幅に高い酵素を探索した。その結果、野生型酵素では酵素1μgあたり0.005(μmol/μg/2hr)のリン酸が生成したのに対し、3300の変異酵素の中の１つでは酵素1μgあたり0.037(μmol/μg/2hr)のリン酸が生成し、大幅なジペプチド合成活性の向上が認められた。
該変異酵素を99E11と、99E11を発現するプラスミドをpQM99E11と命名した。
Obtaining a Mutant Enzyme with More Reactivity than the Wild-Type Enzyme Using the mutant enzyme library prepared in Example 2, an enzyme with altered substrate specificity was searched for as follows.
8 μL of each solution containing 125 mM β-Ala and L-His, 10 μL of 10 mM ATP · 2Na, 100 mM MgSO 4, 10 μL of 200 mM Tris-HCl (pH 8.5), and 2 μL of purified enzyme solution were mixed to form a reaction solution And a dipeptide synthesis reaction was performed at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction, add 150 μL of phosphate quantification reagent (Phospha C-Test Wako; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), perform color reaction at 37 ° C. for 20 minutes, and absorb the absorbance at 750 nm with a microplate reader Model 3550 (Bio-Rad). It was measured. Based on the absorbance, the amount of phosphoric acid produced by the reaction was calculated, and an enzyme with a significantly higher amount of phosphorus produced per protein mass than the wild-type enzyme was searched for. As a result, the wild-type enzyme produced 0.005 (μmol / μg / 2hr) of phosphate per μg of enzyme, whereas one of 3300 mutant enzymes produced 0.037 (μmol / μg / 2hr) per μg of enzyme. Phosphoric acid was produced, and a significant improvement in dipeptide synthesis activity was observed.
The mutant enzyme was named 99E11, and the plasmid expressing 99E11 was named pQM99E11.
pQM99E11を用いてエシェリヒア・コリDH5α/pREP4を形質転換して得られる、変異酵素99E11を高発現するエシェリヒア・コリDH5α/pREP4/pQM99E11をＬＢ培地に塗布し30℃で一晩生育させた後に、これを0.25ｍＭのIPTG、100μｇ/ Lのアンピシリン、50μg/Lのカナマイシンを含むＴB培地[12g/Lバクトトリプトン(ディフコ社製)、24g/Lイーストエキス（ディフコ社製）、4ｍＬ/Lグリセロール、17mM KH2PO4、72mM K2HPO4]に植菌し３０℃で２０時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得し、該湿菌体から、HisTrap（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いて、添付の説明書に従いHisタグ付加組換え型酵素を精製した。
精製したHisタグ付加型組換え酵素10μｇ、100mmol/LのTris-HCl(pH8.0)、30mmol/LのMgSO4、10mmol/LのATP・2ナトリウム、各30mmol/Lのβ-AlaおよびL-Hisからなる0.2ｍＬの反応液を調製し、３７℃で２時間ジペプチド合成反応を行った。反応後、生成したカルノシンの蓄積量をＢａｎｋらの方法［Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４０，１６７（１９９６）]に従って高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を表1に示す。
After applying Escherichia coli DH5α / pREP4 / pQM99E11, which is obtained by transforming Escherichia coli DH5α / pREP4 with pQM99E11, and highly expressing the mutant enzyme 99E11 to LB medium and growing at 30 ° C. overnight, TB medium containing 0.25 mM IPTG, 100 μg / L ampicillin, 50 μg / L kanamycin [12 g / L bactotryptone (Difco), 24 g / L yeast extract (Difco), 4 mL / L glycerol, 17 mM KH 2 PO 4 , 72 mM K 2 HPO 4 ] was inoculated and cultured at 30 ° C. for 20 hours. The culture broth was centrifuged to obtain wet cells, and His-tagged recombinant enzyme was purified from the wet cells using HisTrap (Amersham Biosciences) according to the attached instructions.
10 μg of purified His-tagged recombinant enzyme, 100 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 30 mmol / L MgSO 4 , 10 mmol / L ATP · disodium, 30 mmol / L β-Ala and L each A 0.2 mL reaction solution comprising -His was prepared, and a dipeptide synthesis reaction was performed at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction, the accumulated amount of carnosine produced was determined by the method of Bank et al. [Anal. Biochem. , 240, 167 (1996)] and quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The results are shown in Table 1.
上記の表１に示すとおり、変異酵素９９E１１はβ-AlaとL-Hisの組み合わせを基質とするカルノシン生成反応において、野生型酵素より高い活性を示すことがわかった。
また、ｐQM99E11が有するDNA断片について塩基配列を決定したところ、変異酵素９９E１１のアミノ酸配列には、野生型酵素のアミノ酸配列において１１２番目のIle残基がVal残基に、３７８番目のHis残基がArg残基に置換されていることがわかった。
As shown in Table 1 above, it was found that the mutant enzyme 99E11 exhibits higher activity than the wild-type enzyme in the carnosine production reaction using a combination of β-Ala and L-His as a substrate.
Further, when the nucleotide sequence of the DNA fragment possessed by pQM99E11 was determined, the amino acid sequence of the mutant enzyme 99E11 includes the 112th Ile residue as the Val residue and the 378th His residue in the amino acid sequence of the wild-type enzyme. It was found that the Arg residue was substituted.
本発明により、カルノシンを高効率に生成する蛋白質、および該蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いたカルノシンの製造法が提供される。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a protein that generates carnosine with high efficiency and a method for producing carnosine using the protein or a microorganism that has the ability to produce the protein are provided.
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
SEQ ID NO: 8-Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 9—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 10—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 11—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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