JP5950278B2 - Cell separation chip manufacturing method and cell separation chip - Google Patents

Description

本発明は、測定対象の細胞を他の細胞から分離する細胞分離チップの製造方法及び細胞分離チップに関する。   The present invention relates to a method for manufacturing a cell separation chip that separates cells to be measured from other cells, and a cell separation chip.

近年、食物アレルギー等の即時型アレルギーが社会問題化している。即時型アレルギーは、社会生活を妨げ、場合によっては命に関わるものとなる。そこで、即時型アレルギーの診断の簡略化や、信頼性の向上が望まれている。   In recent years, immediate allergies such as food allergies have become a social problem. Immediate allergies interfere with social life and in some cases are life threatening. Therefore, simplification of immediate allergy diagnosis and improvement of reliability are desired.

当初、即時型アレルギー診断では、原因食物の摂取等により、症状の誘発を確認する負荷試験や、患者の血液や皮膚を用いた検査が行われるのが一般的であった。しかしながら、これらの方法は、被験者への負担が大きかったり、多くの血液が必要となったり、偽陽性、偽陰性の割合が高いなどの不都合があった。   Initially, in the immediate type allergy diagnosis, a load test for confirming the induction of symptoms by ingestion of causal food or the like, and a test using blood or skin of a patient were generally performed. However, these methods have disadvantages such as a heavy burden on the subject, a lot of blood required, and a high ratio of false positives and false negatives.

最近では、細胞レベルでの分析により、即時型アレルギー診断が行われるようになってきている。細胞レベルでの即時型アレルギー診断では、遠心分離やフィルタ分離などによって、血液サンプルの中から、測定対象となる細胞を抽出する必要がある。そこで、血液サンプル中における測定に不必要な細胞（例えば、測定対象をＩ型アレルギーの原因細胞である好塩基球細胞とするならば、好塩基球細胞以外の細胞）を磁気修飾し、磁気ビーズ法を用いて除去する装置等が開示されている（例えば、特許文献１参照）。磁気ビーズは、測定対象の細胞又はそれ以外の細胞に特異的な抗体を結合させ、細胞を磁気標識するものである。   Recently, an immediate allergy diagnosis has been performed by analysis at the cellular level. In immediate allergy diagnosis at the cell level, it is necessary to extract cells to be measured from a blood sample by centrifugation or filter separation. Therefore, cells that are unnecessary for measurement in a blood sample (for example, cells other than basophil cells if the measurement target is basophil cells that cause type I allergy) are magnetically modified, and magnetic beads An apparatus or the like for removal using a method is disclosed (for example, see Patent Document 1). A magnetic bead binds an antibody specific to a cell to be measured or other cells and magnetically labels the cell.

また、カラムの中に、直径約５００μｍの磁性粒子を敷き詰め、そのカラム内に血液を流すことにより、磁気修飾細胞を除去する装置も開示されている。このような装置で分離された好塩基球細胞は、抗原で刺激され、細胞から分泌されるヒスタミンの測定等に用いられる。   An apparatus for removing magnetically modified cells by spreading magnetic particles having a diameter of about 500 μm in a column and flowing blood through the column is also disclosed. Basophil cells separated by such an apparatus are stimulated with an antigen and used for measurement of histamine secreted from the cells.

上述した装置で血液から細胞を取り出すには、多くの血液サンプル、例えば１検査に数ｍｌ（例えば２〜３ｍｌ以上）程度の血液サンプルが必要となるため、検査回数が増えると患者の負担も大きくなる。また、上述した装置は、何度も使用されるので、コンタミネーションにより診断の信頼性が低下するおそれがある。   In order to extract cells from blood with the above-described apparatus, a lot of blood samples, for example, a blood sample of about several ml (for example, 2 to 3 ml or more) is required for one test. Become. Moreover, since the apparatus mentioned above is used many times, there exists a possibility that the reliability of a diagnosis may fall by contamination.

そこで、サンプル量を少なくしつつ、信頼性の高い診断が可能となる細胞分離チップが開発されている。この細胞分離チップは、基板にＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を貼りあわせることによって形成される。この細胞分離チップでは、基板とＰＤＭＳとの間に設けられたマイクロリッターオーダの容積を有する微細流路が設けられている。微細流路の内壁を構成するＰＤＭＳには、磁気修飾細胞の流れを妨げる磁場勾配を発生させる磁性粒子を含有している。   Therefore, a cell separation chip has been developed that enables highly reliable diagnosis while reducing the amount of sample. This cell separation chip is formed by bonding PDMS (polydimethylsiloxane) to a substrate. In this cell separation chip, a microchannel having a microliter order volume provided between the substrate and PDMS is provided. PDMS that forms the inner wall of the microchannel contains magnetic particles that generate a magnetic field gradient that hinders the flow of magnetically modified cells.

特開２００６−００６１６６号公報JP 2006-006166 A

しかしながら、磁性粒子を含有するＰＤＭＳは、焼き固める際に反りかえる性質がある。このため、上記細胞分離チップを製造するのが困難になる。   However, PDMS containing magnetic particles has the property of warping when baked. For this reason, it becomes difficult to manufacture the cell separation chip.

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、製造が容易で、かつ信頼性の高い診断が可能な細胞分離チップの製造方法及び細胞分離チップを提供することを目的とする。   The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a method for manufacturing a cell separation chip and a cell separation chip that can be easily manufactured and can be diagnosed with high reliability.

上記目的を達成するために、本発明の第１の観点に係る細胞分離チップの製造方法は、
微細流路を有する細胞分離チップの製造方法であって、
基板上に流路パターンを形成する第１の工程と、
流路パターンが形成された基板上に、スピンコート法を用いて、磁性粒子を含有する部材の原液を塗布する第２の工程と、
前記基板上に塗布された原液を固化する第３の工程と、
形成された部材の上に、磁性粒子を含有しない部材の原液を塗布して固化する第４の工程と、
固化した部材を前記基板から取り外す第５の工程と、
前記微細流路が形成されるように、固化した部材にガラス基板を貼り合わせる第６の工程と、
を含む。 In order to achieve the above object, a method for producing a cell separation chip according to the first aspect of the present invention comprises:
A method for producing a cell separation chip having a fine channel,
A first step of forming a flow path pattern on the substrate;
A second step of applying a stock solution of a member containing magnetic particles on a substrate on which a flow path pattern is formed using a spin coating method;
A third step of solidifying the stock solution applied on the substrate;
A fourth step of applying and solidifying a stock solution of a member not containing magnetic particles on the formed member;
A fifth step of removing the solidified member from the substrate;
A sixth step of attaching a glass substrate to the solidified member so that the fine channel is formed;
including.

本発明の第２の観点に係る細胞分離チップは、
流路パターンが形成された基板上にスピンコート法を用いて磁性粒子を含む原液を塗布し固化して形成され、前記磁性粒子が均一に配置されたミクロンオーダの厚みを有する部材と、
前記流路パターンに対応するマイクロリッターオーダーの微細流路が形成されるように、前記部材の前記基板が取り外された側に貼り合わされたガラス基板と、
を備える。 The cell separation chip according to the second aspect of the present invention comprises:
A member having a thickness of micron order in which a magnetic solution containing magnetic particles is applied and solidified on a substrate on which a flow path pattern is formed using a spin coating method, and the magnetic particles are uniformly arranged;
A glass substrate bonded to the side of the member from which the substrate has been removed so that a microchannel of microliter order corresponding to the channel pattern is formed;
Is provided.

この場合、前記磁性粒子を含有する前記部材と前記ガラス基板とで形成された前記微細流路を流れる溶液が出力される溶液出力部を備え、
前記溶液出力部では、
測定対象の細胞がスポッティングされる金属薄膜が前記ガラス基板上に設けられている、
こととしてもよい。 In this case, it includes a solution output unit which solution flowing through the fine flow path formed by the said member containing said magnetic particles and said glass substrate is output,
In the solution output part,
A metal thin film on which cells to be measured are spotted is provided on the glass substrate.
It is good as well.

また、前記金属薄膜が形成された前記ガラス基板の反対側の面から、全反射条件を満たす入射角でＰ偏光を前記金属薄膜に入射させる入射手段と、
前記金属薄膜に入射した前記Ｐ偏光の反射光の強度に関する情報を検出する検出手段と、
をさらに備える、
こととしてもよい。 Further, an incident means for causing P-polarized light to be incident on the metal thin film at an incident angle satisfying a total reflection condition from the opposite surface of the glass substrate on which the metal thin film is formed,
Detecting means for detecting information on the intensity of the reflected light of the P-polarized light incident on the metal thin film;
Further comprising
It is good as well.

また、前記検出手段は、
前記金属薄膜に入射した前記Ｐ偏光の反射光の２次元強度分布に相当する強度像を撮像する、
こととしてもよい。 The detection means includes
Capturing an intensity image corresponding to a two-dimensional intensity distribution of the P-polarized reflected light incident on the metal thin film;
It is good as well.

また、付着した前記測定対象の細胞の変化に伴って変化する前記金属薄膜のインピーダンスの変化を検出する検出手段をさらに備える、
こととしてもよい。 In addition, it further comprises a detection means for detecting a change in impedance of the metal thin film that changes in accordance with a change in the attached cell to be measured.
It is good as well.

また、前記金属薄膜への入射光と反射光との偏光状態の変化を検出する検出手段をさらに備える、
こととしてもよい。 In addition, it further comprises detection means for detecting a change in the polarization state of incident light and reflected light on the metal thin film,
It is good as well.

本発明によれば、スピンコート法を用いて基板上に磁性粒子を含有する部材を薄く塗布することができるので、製造後の部材の反りを防止することができる。このため、製造が容易で、かつ信頼性の高い診断が可能な細胞分離チップを製造することができる。   According to the present invention, since the member containing magnetic particles can be thinly applied onto the substrate using the spin coating method, the warp of the member after manufacture can be prevented. For this reason, it is possible to manufacture a cell separation chip that is easy to manufacture and capable of highly reliable diagnosis.

図１（Ａ）は、本発明の実施の形態に係る細胞分離測定チップの斜視図である。図１（Ｂ）は、その細胞分離測定チップの側面図である。FIG. 1A is a perspective view of a cell separation measurement chip according to an embodiment of the present invention. FIG. 1B is a side view of the cell separation measurement chip. 微細流路に生じる磁界を模式的に示す図である。It is a figure which shows typically the magnetic field produced in a fine flow path. 細胞分離測定チップの製造方法のフローチャートである。It is a flowchart of the manufacturing method of a cell separation measuring chip. 図４（Ａ）乃至図４（Ｅ）は、微細流路の製造過程を示す図である。4 (A) to 4 (E) are diagrams showing a manufacturing process of the fine channel. 図５（Ａ）は、本実施の形態に係る細胞分離測定チップの微細流路における細胞の捕捉状況を示す図であり、図５（Ｂ）は、従来の方法で製造された微細流路における細胞の捕捉状況を示す図である。FIG. 5 (A) is a diagram showing a state of capturing cells in the microchannel of the cell separation measurement chip according to the present embodiment, and FIG. 5 (B) is a diagram of the microchannel manufactured by a conventional method. It is a figure which shows the capture condition of a cell. 図１（Ｂ）の光学測定部の詳細な構成を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the detailed structure of the optical measurement part of FIG. 1 (B). 反射光の強度の入射角度依存性の一例を示すグラフである。It is a graph which shows an example of the incident angle dependence of the intensity | strength of reflected light. 図８（Ａ）乃至図８（Ｃ）は、生細胞を刺激しない場合の反射強度像の画像の時間変化の一例である。FIGS. 8A to 8C are examples of temporal changes in the image of the reflection intensity image when the living cells are not stimulated. 図９（Ａ）乃至図９（Ｃ）は、生細胞を刺激した場合の反射強度像の画像の時間変化の一例である。FIG. 9A to FIG. 9C are examples of temporal changes in the image of the reflection intensity image when a living cell is stimulated. 図１（Ａ）の細胞分離測定チップを用いた細胞測定動作のフローチャートである。It is a flowchart of the cell measurement operation | movement using the cell separation measurement chip | tip of FIG. 1 (A).

この発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。   Embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.

（実施の形態１）
まず、この発明の実施の形態１について説明する。 (Embodiment 1)
First, a first embodiment of the present invention will be described.

図１（Ａ）には、本実施形態に係る細胞分離チップとしての細胞分離測定チップ１００の斜視図が示され、図１（Ｂ）には、細胞分離測定チップ１００の側面図が示されている。   FIG. 1A shows a perspective view of a cell separation measurement chip 100 as a cell separation chip according to this embodiment, and FIG. 1B shows a side view of the cell separation measurement chip 100. Yes.

図１（Ａ）、図１（Ｂ）に示すように、細胞分離測定チップ１００は、基板１と、部材２とを貼りあわせることによって形成されている。   As shown in FIGS. 1A and 1B, the cell separation measurement chip 100 is formed by bonding a substrate 1 and a member 2 together.

基板１は、ガラス基板（プレパラート）である。このガラス基板としては、例えば、Ｓ−ＬＡＬ−１０ガラスが採用される。このガラスの屈折率は１．７２である。   The substrate 1 is a glass substrate (preparation). As this glass substrate, for example, S-LAL-10 glass is employed. The refractive index of this glass is 1.72.

部材２は、例えば、シリコン樹脂としてのＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）で形成されている。基板１と部材２との間には、空隙が設けられている。この空隙は全体でも、マイクロリッターオーダの容積を有している。   The member 2 is made of, for example, PDMS (polydimethylsiloxane) as a silicon resin. A gap is provided between the substrate 1 and the member 2. This void as a whole has a volume of microliter order.

この空隙は、溶液投入部３と、溶液出力部としての測定部４Ａ、４Ｂと、微細流路５とに分けることができる。   This void can be divided into a solution charging unit 3, measurement units 4 </ b> A and 4 </ b> B as solution output units, and a fine flow path 5.

溶液投入部３は、測定対象の細胞とそれ以外の磁気修飾細胞とを含む溶液の投入口が部材２上に設けられている。溶液投入部３は、部材２の上面から下面を貫通している。溶液投入部３の最下部は、チャンバー構造となっており、そこに液溜りが形成されている。   The solution inlet 3 is provided with an inlet of a solution containing cells to be measured and other magnetically modified cells on the member 2. The solution charging part 3 penetrates the lower surface from the upper surface of the member 2. The lowermost part of the solution charging part 3 has a chamber structure in which a liquid pool is formed.

測定部４Ａ、４Ｂは、溶液投入部３と、微細流路５を介して連通している。測定部４Ａ、４Ｂでは、測定対象の細胞がスポッティングされる金属薄膜６が、基板１上に設けられている。金属薄膜６については、後述する。   The measurement units 4A and 4B communicate with the solution input unit 3 through the fine flow path 5. In the measurement units 4A and 4B, a metal thin film 6 on which cells to be measured are spotted is provided on the substrate 1. The metal thin film 6 will be described later.

測定部４Ａ、４Ｂでは、微細流路５に連通する大気開放部が部材２上に形成されている。この大気開放部は、測定対象の細胞に対する刺激物質を投入する投入口である。大気開放部から投入された刺激物質は、そのまま金属薄膜６に付着した測定対象の細胞を刺激する。   In the measurement units 4 </ b> A and 4 </ b> B, an air release portion communicating with the fine flow path 5 is formed on the member 2. This atmosphere opening part is an inlet for introducing a stimulating substance for the cell to be measured. The stimulating substance put in from the atmosphere opening part stimulates the cell to be measured attached to the metal thin film 6 as it is.

微細流路５は、溶液投入部３と測定部４Ａ、４Ｂとを連通する。微細流路５は、測定対象の細胞と磁気修飾細胞とを分離する機能性流路である。この細胞分離測定チップ１００では、微細流路５が複数本設けられている。各微細流路５は、毛細管力により溶液を測定部４Ａ、４Ｂに送液するように形成されている。すなわち、溶液投入部３に溶液が投入されると、その溶液は、微細流路５の毛細管力により、微細流路５内を測定部４Ａ、４Ｂまで送液される。なお、各微細流路５の長さは同一である。このようにすれば、一方の測定部に早めに溶液が到達して、他方の測定部に溶液が送液されなくなるのを防ぐことができる。   The fine channel 5 communicates the solution charging unit 3 with the measuring units 4A and 4B. The fine channel 5 is a functional channel that separates cells to be measured and magnetically modified cells. In this cell separation measurement chip 100, a plurality of fine flow paths 5 are provided. Each fine channel 5 is formed so as to send the solution to the measurement units 4A and 4B by capillary force. That is, when a solution is introduced into the solution introduction unit 3, the solution is sent to the measurement units 4 </ b> A and 4 </ b> B through the microchannel 5 by the capillary force of the microchannel 5. In addition, the length of each fine channel 5 is the same. In this way, it is possible to prevent the solution from reaching one measurement unit early and the solution from being delivered to the other measurement unit.

部材２は、砂鉄やフェライト等の磁性粒子７を複数包含する。磁性粒子７の直径は、例えば５０μｍ程度となっている。磁性粒子７は、微細流路５の近傍に配置されている。   The member 2 includes a plurality of magnetic particles 7 such as iron sand and ferrite. The diameter of the magnetic particle 7 is, for example, about 50 μm. The magnetic particles 7 are arranged in the vicinity of the fine flow path 5.

ここで、細胞分離測定チップ１００が、図２に示すように、微細流路５の流路方向に垂直な方向の磁石８による磁界の中に置かれた場合について考える。この状態で、微細流路５内を直径約５０ｎｍの磁気ビーズで修飾された磁気修飾細胞が流れると、その磁気修飾細胞は、その磁界の影響を受けて、流れを妨げられ、微細流路５内の内壁等に付着する。   Here, consider a case where the cell separation measurement chip 100 is placed in a magnetic field by a magnet 8 in a direction perpendicular to the flow path direction of the fine flow path 5, as shown in FIG. In this state, when a magnetically modified cell modified with a magnetic bead having a diameter of about 50 nm flows through the microchannel 5, the magnetically modified cell is affected by the magnetic field and is prevented from flowing. It adheres to the inner wall of the inside.

この磁気修飾細胞が磁界より受ける力Ｆは、次式のようになる。

部材２内に包含される磁性粒子７は、上記式（１）のうち、次式で示される磁場勾配の部分を大きくする。

これにより、磁気修飾細胞が磁界から受ける力は大きくなる。 The force F received by the magnetically modified cell from the magnetic field is as follows.

The magnetic particle 7 included in the member 2 enlarges the magnetic field gradient portion represented by the following expression in the above expression (1).

Thereby, the force which a magnetic modification cell receives from a magnetic field becomes large.

次に、細胞分離測定チップ１００の製造方法、特に、微細流路５の製造方法について説明する。図３には、この製造方法の処理の流れが示されている。   Next, a method for manufacturing the cell separation measuring chip 100, particularly a method for manufacturing the microchannel 5, will be described. FIG. 3 shows a processing flow of this manufacturing method.

図３に示すように、まず、ウエハ２０上に微細流路５のパターンを形成する（ステップＳ１１）。より具体的には、露光装置を用いて、フォトレジストが塗布されたウエハに、レチクル上に形成された微細流路５の流路パターンを転写する。例えば、フォトレジストとしては、ＳＵ−８レジストが用いられる。フォトレジストの高さは、約３５μｍ程度とすることができ、幅は約５０μｍ〜３００μｍである。しかしながら、これらのサイズには限定されない。   As shown in FIG. 3, first, the pattern of the fine flow path 5 is formed on the wafer 20 (step S11). More specifically, the flow path pattern of the fine flow path 5 formed on the reticle is transferred to a wafer coated with photoresist using an exposure apparatus. For example, SU-8 resist is used as the photoresist. The height of the photoresist can be about 35 μm and the width is about 50 μm to 300 μm. However, it is not limited to these sizes.

流路パターンが転写されたウエハ２０はエッチングされる。これにより、図４（Ａ）に示すように、ウエハ２０上には微細流路５に相当する部分のフォトレジスト２１のみが残る。   The wafer 20 to which the flow path pattern has been transferred is etched. As a result, as shown in FIG. 4A, only a portion of the photoresist 21 corresponding to the fine flow path 5 remains on the wafer 20.

続いて、流路パターンが形成されたウエハ２０上に、スピンコート法を用いて、すなわちスピンコータを用いて、磁性粒子７を含有するＰＤＭＳ２Ａを塗布する（ステップＳ１２）。ＰＤＭＳ２Ａと磁性粒子７との質量比は、１：１である。磁性粒子７は、３２５ｍｅｓｈを通る粒子であり、前述のとおり、例えば直径が５０μｍ程度の鉄粉である。なお、図４（Ｂ）乃至図４（Ｅ）では、図を分かり易くするために、実際よりも磁性粒子７の大きさを小さく描いている。   Subsequently, PDMS 2A containing the magnetic particles 7 is applied onto the wafer 20 on which the flow path pattern is formed by using a spin coating method, that is, by using a spin coater (step S12). The mass ratio of PDMS2A and magnetic particles 7 is 1: 1. The magnetic particle 7 is a particle that passes through 325 mesh, and is iron powder having a diameter of, for example, about 50 μm as described above. In FIGS. 4B to 4E, the size of the magnetic particles 7 is drawn smaller than the actual size for easy understanding of the drawings.

スピンコート法とは、ウエハ２０の表面の中央部に液状の磁性粒子７を含有する液状のＰＤＭＳ２Ａを滴下し、ウエハ２０を高速回転させることで生じる遠心力によって磁性粒子７を含有するＰＤＭＳ２Ａの原液をウエハ２０の外周部へ向けて広げる方法である。ウエハ２０の回転数は、例えば１５００ｒｐｍである。この回転塗布は４０秒ほど継続される。   In the spin coating method, a liquid PDMS 2A containing liquid magnetic particles 7 is dropped onto the center of the surface of the wafer 20, and the stock solution of PDMS 2A containing magnetic particles 7 is generated by centrifugal force generated by rotating the wafer 20 at high speed. Is spread toward the outer periphery of the wafer 20. The rotation speed of the wafer 20 is, for example, 1500 rpm. This spin coating is continued for about 40 seconds.

スピンコート法を用いることにより、フォトレジストを基板１の表面全体に均一に薄く塗布することができる。図４（Ｂ）には、ウエハ２０上に形成された磁性粒子７を含有するＰＤＭＳ２Ａが示されている。磁性粒子７を含有するＰＤＭＳ２Ａの高さは、例えば５０μｍ程度である。   By using the spin coating method, the photoresist can be uniformly and thinly applied to the entire surface of the substrate 1. FIG. 4B shows a PDMS 2 </ b> A containing magnetic particles 7 formed on the wafer 20. The height of PDMS 2A containing magnetic particles 7 is, for example, about 50 μm.

続いて、ウエハ２０上に塗布された磁性粒子７を含有するＰＤＭＳ２Ａを固化する（ステップＳ１３）。ＰＤＭＳ２Ａは８０℃ほどに加熱され、焼固められる。   Subsequently, the PDMS 2A containing the magnetic particles 7 applied on the wafer 20 is solidified (step S13). PDMS2A is heated to about 80 ° C. and baked.

続いて、磁性粒子７を含有するＰＤＭＳ２Ａの上にＰＤＭＳ層２Ｂを追加形成する（ステップＳ１４）。以下では、ＰＤＭＳ層２Ｂを単にＰＤＭＳ２Ｂと呼ぶ。ＰＤＭＳ２Ｂの高さは、例えば５ｍｍ程度とすることができる。ＰＤＭＳ２Ｂは、スピンコート法以外の方法で塗布され、ＰＤＭＳ２Ｂは８０℃ほどに加熱され焼固められる。図４（Ｃ）には、磁性粒子７を含有するＰＤＭＳ２Ａとその上層のＰＤＭＳ２Ｂから成る部材２が示されている。スピンコート法以外の方法で塗布するのは、細胞分離測定チップ１００の強度を考慮して、ＰＤＭＳ２Ｂを厚く形成する必要があるためである。   Subsequently, the PDMS layer 2B is additionally formed on the PDMS 2A containing the magnetic particles 7 (step S14). Hereinafter, the PDMS layer 2B is simply referred to as PDMS 2B. The height of the PDMS 2B can be set to about 5 mm, for example. PDMS2B is applied by a method other than spin coating, and PDMS2B is heated to about 80 ° C. and baked. FIG. 4C shows a member 2 composed of PDMS 2A containing magnetic particles 7 and PDMS 2B as an upper layer thereof. The reason why it is applied by a method other than the spin coating method is that it is necessary to form the PDMS 2B thick in consideration of the strength of the cell separation measurement chip 100.

続いて、図４（Ｄ）に示すように、固化したＰＤＭＳ２Ａ、２Ｂ、すなわち部材２をウエハ２０から取り外す（ステップＳ１５）。このとき、ウエハ２０上のフォトレジストもウエハ２０と同じように取り外される。   Subsequently, as shown in FIG. 4D, the solidified PDMS 2A, 2B, that is, the member 2 is removed from the wafer 20 (step S15). At this time, the photoresist on the wafer 20 is also removed in the same manner as the wafer 20.

続いて、微細流路５が形成されるように、固化したＰＤＭＳ２Ａ、２Ｂ、すなわち部材２にガラス基板（プレパラート）を貼り合わせる（ステップＳ１６）。これにより、図４（Ｅ）に示すように、微細流路５が形成される。   Subsequently, a glass substrate (preparation) is bonded to the solidified PDMS 2A, 2B, that is, the member 2 so that the fine flow path 5 is formed (step S16). Thereby, as shown in FIG.4 (E), the microchannel 5 is formed.

このように、本実施の形態によれば、磁性粒子７を含有するＰＤＭＳ２Ａを、薄く形成することができる。これにより、部材２の反りを少なくすることができる。また、スピンコート法により、磁性粒子７を微細流路５の周辺に均一に配置することができる。   Thus, according to this Embodiment, PDMS2A containing the magnetic particle 7 can be formed thinly. Thereby, the curvature of the member 2 can be decreased. Further, the magnetic particles 7 can be uniformly arranged around the fine flow path 5 by spin coating.

図５（Ａ）には、上述の製造方法により製造された微細流路５における細胞の捕捉状況が示されている。また、図５（Ｂ）には、従来のランダムな手法で、磁性粒子７を部材２に混入させることにより生成された微細流路５における細胞の捕捉状況が示されている。図５（Ａ）と図５（Ｂ）とを比較するとわかるように、上述の製造方法により製造された微細流路５では、磁性粒子７が微細流路５の周辺に均一に分散しているので、細胞が均等に捕捉されているのがわかる。このように磁性粒子７を均等に配置することにより、捕捉可能な細胞の数を１倍〜１０倍とすることができる。   FIG. 5A shows the state of cell capture in the microchannel 5 manufactured by the above-described manufacturing method. FIG. 5B shows a state of capturing cells in the microchannel 5 generated by mixing the magnetic particles 7 into the member 2 by a conventional random method. As can be seen by comparing FIG. 5A and FIG. 5B, in the fine channel 5 manufactured by the above-described manufacturing method, the magnetic particles 7 are uniformly dispersed around the fine channel 5. So you can see that the cells are evenly captured. Thus, by arranging the magnetic particles 7 uniformly, the number of cells that can be captured can be made 1 to 10 times.

このように製造された部材２では、微細流路５の近傍に磁性粒子７が配置され、流れるサンプルに磁場勾配の影響が生じやすくなっている。   In the member 2 manufactured in this way, the magnetic particles 7 are arranged in the vicinity of the fine flow path 5, and the influence of the magnetic field gradient is likely to occur on the flowing sample.

磁性粒子７としては、現在直径５０μｍ程度のものを用いているが、異なるサイズであっても機能を十分に発揮することが予想される。磁性粒子７のサイズは、微細流路５の断面積や長さなどに応じて適宜調整することができる。   As the magnetic particles 7, particles having a diameter of about 50 μm are currently used. The size of the magnetic particle 7 can be appropriately adjusted according to the cross-sectional area and length of the fine channel 5.

図１（Ｂ）に示すように、この細胞分離測定チップ１００は、光学測定部１０をさらに備える。光学測定部１０は、光源１１と、偏光板１２と、プリズム１３と、対物レンズ１４と、撮像部１５と、を備える。   As shown in FIG. 1B, the cell separation measurement chip 100 further includes an optical measurement unit 10. The optical measurement unit 10 includes a light source 11, a polarizing plate 12, a prism 13, an objective lens 14, and an imaging unit 15.

この光学測定部１０は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を利用したセンサである。ＳＰＲ現象は、金属薄膜６に全反射条件で光を入射すると、ある角度（共鳴角）でその光が金属表面のプラズモンと共鳴現象を起こし、反射光の減衰が起きる現象をいう。共鳴角は、金属薄膜６上の物質の屈折率に非常に敏感であり、共鳴角の変化を検出することで、金属薄膜６上の屈折率の変化を知ることが可能となる。   The optical measurement unit 10 is a sensor that utilizes a surface plasmon resonance (SPR) phenomenon. The SPR phenomenon is a phenomenon in which when light is incident on the metal thin film 6 under a total reflection condition, the light causes a resonance phenomenon with a plasmon on the metal surface at a certain angle (resonance angle), and the reflected light is attenuated. The resonance angle is very sensitive to the refractive index of the substance on the metal thin film 6, and the change in the refractive index on the metal thin film 6 can be known by detecting the change in the resonance angle.

図６には、光学測定部１０の詳細な構成が示されている。   FIG. 6 shows a detailed configuration of the optical measurement unit 10.

光源１１は、例えば半導体レーザである。この半導体レーザは、例えば波長が６３０ｎｍのレーザ光を発振出力する。光源１１から出力されたレーザ光は、不図示のコリメータレンズ等により平行光束に変換されて、偏光板１２に入射する。なお、光源１１として、赤色、白色ＬＥＤ（Light Emitting Diode）等を用いてもよい。   The light source 11 is a semiconductor laser, for example. This semiconductor laser oscillates and outputs laser light having a wavelength of, for example, 630 nm. The laser light output from the light source 11 is converted into a parallel light beam by a collimator lens (not shown) or the like and enters the polarizing plate 12. As the light source 11, a red or white LED (Light Emitting Diode) or the like may be used.

偏光板１２は、入射したレーザ光を直線偏光の平行光束に変換して出射する。この直線偏光は、後述する基板１と金属薄膜６との間の界面Ｆに対してＰ偏光となる。この光源１１と偏光板１２とが、入射手段に対応する。   The polarizing plate 12 converts the incident laser light into a linearly polarized parallel light beam and emits it. This linearly polarized light becomes P polarized light with respect to an interface F between the substrate 1 and the metal thin film 6 described later. The light source 11 and the polarizing plate 12 correspond to the incident means.

プリズム１３は、偏光板１２によりＰ偏光となった平行光束を入射する。プリズム１３としては、基板１と同様に、例えばＳ−ＬＡＬ−１０ガラスが採用される。すなわち、基板１とプリズム１３とは、屈折率が同じである。基板１とプリズム１３は、当接しているため、プリズム１３に入射したレーザ光（Ｐ偏光）は、基板１に入射し、そのまま直進する。   The prism 13 receives the parallel light flux that has been changed to P-polarized light by the polarizing plate 12. As the prism 13, for example, S-LAL-10 glass is employed in the same manner as the substrate 1. That is, the substrate 1 and the prism 13 have the same refractive index. Since the substrate 1 and the prism 13 are in contact with each other, the laser light (P-polarized light) incident on the prism 13 enters the substrate 1 and travels straight.

金属薄膜６は、例えば金膜である。この他、Ａｇ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｋなどの薄膜も、金属薄膜６として用いることができる。金属薄膜６の厚みは、例えば５０ｎｍであり、センシングサイズは、例えば約１ｍｍ角である。金属薄膜６は、基板１上に例えば蒸着により成膜されている。基板１に入射したレーザ光は、基板１と金属薄膜６との間の界面Ｆに、例えば、全反射条件を満たし表面プラズモン共鳴現象を発生させる入射角θ＝５６°で入射する。仮に金属薄膜６が設置されていない状態であれば、このレーザ光は、界面Ｆで全反射する。   The metal thin film 6 is, for example, a gold film. In addition, thin films such as Ag, Cu, Zn, Al, and K can also be used as the metal thin film 6. The thickness of the metal thin film 6 is, for example, 50 nm, and the sensing size is, for example, about 1 mm square. The metal thin film 6 is formed on the substrate 1 by vapor deposition, for example. The laser light incident on the substrate 1 is incident on the interface F between the substrate 1 and the metal thin film 6 at an incident angle θ = 56 ° that satisfies the total reflection condition and causes the surface plasmon resonance phenomenon, for example. If the metal thin film 6 is not installed, the laser light is totally reflected at the interface F.

界面Ｆで反射したレーザ光は、基板１及びプリズム１３から出射して、対物レンズ１４に入射する。対物レンズ１４は、レーザ光を屈折させて出射する。対物レンズ１４では、前側焦点距離よりも後側焦点距離の方が長いものが使用されている。したがって、この対物レンズ１４は、物体像を所定の倍率で拡大して像面上に結像させる。対物レンズ１４から出射されたレーザ光は、撮像部１５の撮像面に到達する。   The laser light reflected by the interface F is emitted from the substrate 1 and the prism 13 and enters the objective lens 14. The objective lens 14 refracts and emits laser light. For the objective lens 14, a lens having a longer rear focal length than a front focal length is used. Therefore, the objective lens 14 enlarges the object image at a predetermined magnification and forms an image on the image plane. The laser light emitted from the objective lens 14 reaches the imaging surface of the imaging unit 15.

撮像部１５は、例えばＣＣＤ（Charge Coupled Device）イメージセンサ又はＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサである。撮像部１５は、界面Ｆで反射されたレーザ光を受光する。撮像部１５の撮像面と界面Ｆとは共役の関係にある。したがって、撮像部１５の撮像面に、プリズム１３の界面Ｆに入射した平行光束の反射光の２次元強度分布に相当する強度像、すなわち反射強度像が結像する。   The imaging unit 15 is, for example, a CCD (Charge Coupled Device) image sensor or a CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) image sensor. The imaging unit 15 receives the laser light reflected by the interface F. The imaging surface of the imaging unit 15 and the interface F are in a conjugate relationship. Therefore, an intensity image corresponding to the two-dimensional intensity distribution of the reflected light of the parallel light beam incident on the interface F of the prism 13, that is, a reflection intensity image is formed on the imaging surface of the imaging unit 15.

この反射強度像は、対物レンズ１４により、例えば、２倍乃至４０倍に拡大されている。撮像部１５は、その反射強度像を撮像する。撮像部１５は、その反射強度像に相当する画像信号を出力する。   This reflected intensity image is magnified by, for example, 2 to 40 times by the objective lens 14. The imaging unit 15 captures the reflection intensity image. The imaging unit 15 outputs an image signal corresponding to the reflected intensity image.

撮像部１５から出力された画像信号は、コンピュータ（不図示）に入力される。コンピュータは、画像信号を表示し、又は画像信号に基づいて細胞の解析を行う。   The image signal output from the imaging unit 15 is input to a computer (not shown). The computer displays an image signal or analyzes a cell based on the image signal.

光学測定部１０は、屈折率の異なる物質ごとの共鳴角の違いを利用して、金属薄膜６上の屈折率の相対的な強度分布を可視化する。金属薄膜６上で生細胞Ｃ１、Ｃ２を培養すると、生細胞Ｃ１、Ｃ２が接着している部分としていない部分とでは、屈折率が異なる。   The optical measurement unit 10 visualizes the relative intensity distribution of the refractive index on the metal thin film 6 by using the difference in the resonance angle for each substance having a different refractive index. When the living cells C1 and C2 are cultured on the metal thin film 6, the refractive index is different from the portion where the living cells C1 and C2 are not attached.

図７のグラフには、撮像部１５で受光される反射光の強度の入射角依存性の一例が示されている。このグラフでは、横軸が界面Ｆへの平行光束の入射角θを示しており、縦軸が、その入射角θにおける反射光の強度を示している。図７には、３本の特性曲線（ａ）乃至（ｃ）が示されている。   The graph of FIG. 7 shows an example of the incident angle dependence of the intensity of the reflected light received by the imaging unit 15. In this graph, the horizontal axis indicates the incident angle θ of the parallel light flux to the interface F, and the vertical axis indicates the intensity of the reflected light at the incident angle θ. FIG. 7 shows three characteristic curves (a) to (c).

特性曲線（ａ）は、金属薄膜６に何も置かれていない状態（生細胞Ｃ１、Ｃ２がない状態）での反射光の強度の入射角依存性を示す曲線である。これによれば、表面プラズモン共鳴現象により、入射角５６°において反射光の強度が最も減衰している。この入射角５６°を、共鳴角という。本実施形態では、生細胞Ｃ１、Ｃ２が接していない場合の反射光の強度が最も暗くなるように、界面Ｆへのレーザ光の入射角度を５６°に設定している。   The characteristic curve (a) is a curve showing the incident angle dependence of the intensity of the reflected light in a state where nothing is placed on the metal thin film 6 (a state where there are no living cells C1 and C2). According to this, the intensity of reflected light is most attenuated at an incident angle of 56 ° due to the surface plasmon resonance phenomenon. This incident angle of 56 ° is called a resonance angle. In the present embodiment, the incident angle of the laser beam to the interface F is set to 56 ° so that the intensity of the reflected light when the living cells C1 and C2 are not in contact is the darkest.

特性曲線（ｂ）は、生細胞Ｃ１、Ｃ２が金属薄膜６にセットされ、生細胞Ｃ１、Ｃ２がまだ刺激されていない状態での反射光強度の入射角依存性を示す曲線である。生細胞Ｃ１、Ｃ２は、誘電体であるため、生細胞Ｃ１、Ｃ２が当接する金属薄膜６の周辺では、誘電率（屈折率）が変化し、反射光強度の入射角依存性が特性曲線（ａ）から特性曲線（ｂ）へシフトし、共鳴角も５６°からθ１へシフトする。   The characteristic curve (b) is a curve showing the incident angle dependence of the reflected light intensity when the living cells C1 and C2 are set on the metal thin film 6 and the living cells C1 and C2 are not yet stimulated. Since the living cells C1 and C2 are dielectrics, the dielectric constant (refractive index) changes around the metal thin film 6 with which the living cells C1 and C2 abut, and the incident angle dependence of the reflected light intensity is a characteristic curve ( The characteristic curve (b) is shifted from a), and the resonance angle is also shifted from 56 ° to θ1.

特性曲線（ｃ）は、生細胞Ｃ１、Ｃ２が、金属薄膜６にセットされ、測定部４Ａ、４Ｂに到達した液体に含まれる抗原等により、生細胞Ｃ１、Ｃ２が刺激され、その刺激に反応した状態での反射光強度の入射角依存性を示す曲線である。生細胞Ｃ１、Ｃ２が刺激され、その刺激に反応すると、生細胞Ｃ１、Ｃ２の誘電率（屈折率）はさらに変化するため、反射光の強度の入射角依存性が特性曲線（ｂ）から特性曲線（ｃ）へシフトし、共鳴角もθ１からθ２へシフトする。   The characteristic curve (c) shows that the living cells C1 and C2 are set on the metal thin film 6, and the living cells C1 and C2 are stimulated by the antigen contained in the liquid that has reached the measurement units 4A and 4B, and respond to the stimulation. It is a curve which shows the incident angle dependence of the reflected light intensity in the state which carried out. When the living cells C1 and C2 are stimulated and respond to the stimulation, the dielectric constant (refractive index) of the living cells C1 and C2 further changes, and the incident angle dependence of the intensity of the reflected light is characteristic from the characteristic curve (b). The curve (c) is shifted and the resonance angle is also shifted from θ1 to θ2.

本実施形態では、平行光束の界面Ｆへの入射角が５６°に固定されている。そこで、入射角５６°に着目すると、金属薄膜６に生細胞Ｃ１、Ｃ２が接していない状態では、反射光の強度はＩ１となり最も暗くなっている。また、生細胞Ｃ１、Ｃ２が金属薄膜６に付着すると反射光の強度はＩ２となり、Ｉ１よりもΔＩ１だけ強くなっている。さらに、金属薄膜６に付着した生細胞Ｃ１、Ｃ２が抗原等により刺激され、その刺激に反応すると、反射光の強度はＩ２からΔＩ２だけ増えてＩ３となり、さらに強くなる。   In this embodiment, the incident angle of the parallel light flux on the interface F is fixed at 56 °. Therefore, focusing on the incident angle of 56 °, the intensity of the reflected light is I1 and is the darkest when the living cells C1 and C2 are not in contact with the metal thin film 6. Further, when the living cells C1 and C2 adhere to the metal thin film 6, the intensity of the reflected light becomes I2, which is higher than I1 by ΔI1. Furthermore, when the living cells C1 and C2 attached to the metal thin film 6 are stimulated by an antigen or the like and respond to the stimulation, the intensity of the reflected light increases from I2 by ΔI2 to I3, and becomes stronger.

このように、撮像部１５によって撮像される反射強度像の画像では、生細胞Ｃ１、Ｃ２が存在していない場所は暗くなり、細胞が存在している場所は明るくなり、生細胞Ｃ１、Ｃ２が活性化している場所は、さらに明るくなる。   As described above, in the image of the reflection intensity image captured by the imaging unit 15, the place where the living cells C1 and C2 do not exist becomes dark, the place where the cells exist becomes bright, and the living cells C1 and C2 become bright. The activated area becomes brighter.

なお、生細胞Ｃ１、Ｃ２が存在している箇所と生細胞Ｃ１、Ｃ２が存在していない箇所とのコントラストが最も大きいのは、入射角θ＝５６°となる。このことは、図７において、生細胞Ｃ１、Ｃ２が存在していないときの共鳴角が５６°で、反射光が最も減衰していることからも明らかである。すなわち、入射角を共鳴角と同じθ＝５６°とすると、Δｌ１を最大とすることができるので、画像のコントラストが増すのである。   In addition, the angle of incidence θ = 56 ° has the greatest contrast between the location where the live cells C1 and C2 exist and the location where the live cells C1 and C2 do not exist. This is apparent from the fact that in FIG. 7, the resonance angle is 56 ° when the living cells C1 and C2 are not present, and the reflected light is most attenuated. That is, if the incident angle is the same as the resonance angle θ = 56 °, Δl1 can be maximized, and the contrast of the image is increased.

図８（Ａ）乃至図８（Ｃ）には、生細胞Ｃ１、Ｃ２を抗原で刺激していない状態における０分後、１０分後、２０分後の反射強度像の画像の変化が示されている。また、図９（Ａ）乃至図９（Ｃ）には、生細胞Ｃ１、Ｃ２を抗原で刺激した後における０分後、１０分後、２０分後の反射強度像の画像の変化が示されている。図８（Ａ）乃至図８（Ｃ）と図９（Ａ）乃至図９（Ｃ）を比較すると明らかなように、外部刺激に対して生細胞Ｃ１、Ｃ２が反応すると、生細胞Ｃ１、Ｃ２に相当する箇所の輝度が変化しているのがわかる。   FIGS. 8A to 8C show changes in the image of the reflection intensity image after 0 minutes, 10 minutes, and 20 minutes in a state where the living cells C1 and C2 are not stimulated with the antigen. ing. FIGS. 9A to 9C show changes in the images of the reflection intensity images after 0 minutes, 10 minutes, and 20 minutes after the living cells C1 and C2 were stimulated with the antigen. ing. 8A to 8C and FIGS. 9A to 9C, it is clear that when the living cells C1 and C2 react to an external stimulus, the living cells C1 and C2 It can be seen that the luminance of the portion corresponding to is changing.

この光学測定部１０を用いれば、細胞１つ１つの刺激応答（屈折率変化）を観察することができる。   By using this optical measuring unit 10, it is possible to observe the stimulation response (refractive index change) for each cell.

なお、光学測定部１０は、測定部４Ａ、４Ｂにそれぞれ対応して、２つ設けられていることとしてもよい。   Two optical measuring units 10 may be provided corresponding to the measuring units 4A and 4B, respectively.

次に、本実施形態に係る細胞分離測定チップ１００の動作について説明する。ここでは、好塩基球細胞を測定対象の細胞とする場合の動作について説明する。好塩基球細胞は、ヒト白血球に、０．５％前後含まれている。その直径は１０μｍ程度である。   Next, the operation of the cell separation measurement chip 100 according to this embodiment will be described. Here, the operation in the case of using basophil cells as cells to be measured will be described. Basophil cells are contained in human leukocytes at around 0.5%. Its diameter is about 10 μm.

図１０には、この細胞分離測定チップ１００を用いた細胞測定動作のフローチャートが示されている。   FIG. 10 shows a flowchart of a cell measurement operation using the cell separation measurement chip 100.

まず、血液サンプルに対する前処理を行う（ステップＳ１）。より具体的には、血液サンプルから赤血球を分離除去した後、血液サンプル中の好塩基球細胞以外の白血球細胞を磁気ビーズで修飾する（ステップＳ１）。ここでは、好塩基球細胞になく、血液中の他の細胞に存在する表面抗原に結びつく磁気ビーズが用いられる。   First, pretreatment is performed on a blood sample (step S1). More specifically, after separating and removing red blood cells from the blood sample, white blood cells other than basophil cells in the blood sample are modified with magnetic beads (step S1). Here, magnetic beads are used that bind to surface antigens present in other cells in the blood rather than basophil cells.

続いて、細胞分離測定チップ１００を所定の位置に設置する（ステップＳ２）。これにより、図２に示すように、微細流路５内には、下向きの磁界が発生するようになり、光学測定部１０が、図１（Ｂ）に示すような位置に設定される。磁性粒子７により、微細流路５内の磁場勾配はより大きくなっている。   Subsequently, the cell separation measurement chip 100 is installed at a predetermined position (step S2). As a result, as shown in FIG. 2, a downward magnetic field is generated in the fine flow path 5, and the optical measurement unit 10 is set to a position as shown in FIG. Due to the magnetic particles 7, the magnetic field gradient in the fine flow path 5 becomes larger.

この状態で、溶液投入部３の投入口から、ステップＳ１で磁気修飾された血液サンプルを、ピペット等を用いて投入する（ステップＳ３）。溶液投入部３へ投入された血液サンプルは、溶液投入部３の液溜りを経て微細流路５に進入し、微細流路５に生じる毛細管力により、微細流路５を進む。   In this state, the blood sample magnetically modified in step S1 is input from the input port of the solution input unit 3 using a pipette or the like (step S3). The blood sample input into the solution input unit 3 enters the fine flow channel 5 through the liquid reservoir of the solution input unit 3, and advances through the fine flow channel 5 by the capillary force generated in the fine flow channel 5.

微細流路５を進む間、血液サンプルは、図２に示す磁場を受ける。これにより、好塩基球細胞以外の磁気修飾細胞は、上向きの力を受け、微細流路５上面の磁性粒子７の下に留まるようになり、好塩基球細胞だけが、測定部４Ａ、４Ｂに到達する。測定部４Ａ、４Ｂに到達した好塩基球細胞は毛細管力から開放されて沈下し、金属薄膜６上に付着する。この結果、金属薄膜６に固定される細胞の大部分（望ましくは８０％以上）は、好塩基球細胞となる。   While traveling through the microchannel 5, the blood sample receives the magnetic field shown in FIG. As a result, the magnetically modified cells other than basophil cells receive an upward force and stay under the magnetic particles 7 on the upper surface of the fine channel 5, and only the basophil cells are present in the measurement units 4A and 4B. To reach. The basophil cells that have reached the measurement parts 4A, 4B are released from the capillary force and settle down, and adhere to the metal thin film 6. As a result, most of cells (preferably 80% or more) fixed to the metal thin film 6 are basophil cells.

続いて、測定部４Ａ、４Ｂの大気開放部から、刺激物質、すなわち抗原を投入する（ステップＳ４）。これにより、投入された抗原は、金属薄膜６に付着した好塩基球細胞の表面抗体と結びついて、抗原抗体反応を起こす。   Subsequently, a stimulating substance, that is, an antigen is introduced from the atmosphere opening parts of the measurement parts 4A and 4B (step S4). Thereby, the input antigen is combined with the surface antibody of basophil cells attached to the metal thin film 6 to cause an antigen-antibody reaction.

続いて、光学測定部１０を用いて、測定を行う（ステップＳ５）。測定は、ステップＳ４で抗原を投入する前から開始するようにしてもよい。光源１１からレーザ光の照射が開始され、撮像部１５で、界面Ｆでの反射光に基づく金属薄膜６に付着した生細胞の２次元画像が撮像される。この２次元画像は、不図示のコンピュータで表示され、あるいは、解析され、その解析結果に基づいて、好塩基球細胞の特性を解析することが可能となる。   Subsequently, measurement is performed using the optical measurement unit 10 (step S5). The measurement may be started before the antigen is introduced in step S4. Laser light irradiation is started from the light source 11, and the imaging unit 15 captures a two-dimensional image of living cells attached to the metal thin film 6 based on the reflected light at the interface F. This two-dimensional image is displayed or analyzed by a computer (not shown), and the characteristics of basophil cells can be analyzed based on the analysis result.

このように、本実施の形態に係る細胞分離測定チップ１００を用いれば、血液サンプルが微細流路５を送液される間に、測定対象となる好塩基球細胞を他の磁気修飾細胞から分離抽出することができるので、小量の血液サンプルから測定対象の細胞を抽出することができる。本発明者は、５μｌの血液中に含まれる好塩基球細胞を使っても十分に診断可能であることを確認している。   As described above, when the cell separation measurement chip 100 according to the present embodiment is used, the basophil cells to be measured are separated from other magnetically modified cells while the blood sample is fed through the fine channel 5. Since extraction is possible, cells to be measured can be extracted from a small amount of blood sample. The present inventor has confirmed that sufficient diagnosis is possible using basophil cells contained in 5 μl of blood.

また、この細胞分離測定チップ１００を用いれば、細胞の分離→固定→測定までを同一のチップ内で行うことができるので、その間のコンタミネーションを防止して、信頼性の高い計測を行うことができる。また、細胞分離測定チップ１００自体を使い捨てとすることができるので、コンタミネーションを防止して、信頼性の高い診断を行うことができる。   Further, if this cell separation measurement chip 100 is used, cell separation → fixation → measurement can be performed in the same chip, so that contamination can be prevented and highly reliable measurement can be performed. it can. In addition, since the cell separation measuring chip 100 itself can be made disposable, contamination can be prevented and a highly reliable diagnosis can be performed.

また、本実施の形態によれば、測定部４Ａ、４Ｂには、微細流路５に連通する大気開放部が部材２上に形成されている。また、微細流路５は、毛細管力により血液サンプルを測定部４Ａ、４Ｂに送液するように形成されている。このようにすれば、細胞を分離抽出してスポッティングするための外部ポンプが不要となるので、短時間な測定が可能となるうえ、アレルギー診断などに要するコストを低減することができるようになる。   In addition, according to the present embodiment, the measurement unit 4A, 4B is formed with the atmosphere opening portion communicating with the fine flow path 5 on the member 2. The fine channel 5 is formed so as to send a blood sample to the measurement units 4A and 4B by capillary force. This eliminates the need for an external pump for separating and spotting cells and spotting them, thereby enabling a short-time measurement and reducing the cost required for allergy diagnosis and the like.

また、本実施の形態によれば、２次元ＳＰＲ測定装置を用いて測定を行うので、信頼性が高く、かつ、迅速な診断が可能となる。   Further, according to the present embodiment, since the measurement is performed using the two-dimensional SPR measurement device, the diagnosis is highly reliable and quick.

このような細胞分離測定チップ１００は、小型であるうえ、血液サンプルを滴下するだけで、細胞の分離から測定まで行えるので、簡便で使いやすくなるため、臨床現場での実用が容易になる。   Such a cell separation measurement chip 100 is small in size, and can perform from cell separation to measurement by simply dropping a blood sample. Therefore, the cell separation measurement chip 100 is simple and easy to use, so that it can be practically used in a clinical field.

また、本実施の形態によれば、磁場勾配発生手段として、部材２内に含有され外部磁場の磁場勾配を大きくする磁性粒子７が用いられる。磁性粒子７として、例えば、砂鉄やフェライト等を用いることができるので、細胞分離測定チップ１００の製造コストを低減することができる。   Moreover, according to this Embodiment, the magnetic particle 7 contained in the member 2 and which enlarges the magnetic field gradient of an external magnetic field is used as a magnetic field gradient generation means. For example, iron sand or ferrite can be used as the magnetic particles 7, so that the manufacturing cost of the cell separation measurement chip 100 can be reduced.

また、本実施の形態によれば、同一の長さを有する微細流路５が複数設けられている。また、１つの溶液投入部３と、各微細流路５を介して連通する測定部４Ａ、４Ｂが複数設けられている。このようにすれば、同一の測定対象の細胞に対して、異なる刺激を同時に与えることができるようになるので、診断に要する時間を短くすることができる。   Further, according to the present embodiment, a plurality of fine channels 5 having the same length are provided. In addition, a plurality of measurement units 4A and 4B communicating with one solution charging unit 3 through each fine channel 5 are provided. In this way, different stimuli can be simultaneously applied to the same measurement target cell, so that the time required for diagnosis can be shortened.

以上詳細に説明したように、本実施の形態によれば、スピンコート法を用いて磁性粒子７を含有するＰＤＭＳ２Ａを薄く形成することができるので、部材２の反りを防止することができる。このため、製造が容易で、かつ信頼性の高い診断が可能な細胞分離測定チップ１００を製造することができる。   As described above in detail, according to the present embodiment, the PDMS 2A containing the magnetic particles 7 can be thinly formed by using the spin coating method, so that the warpage of the member 2 can be prevented. For this reason, it is possible to manufacture the cell separation measurement chip 100 that is easy to manufacture and capable of highly reliable diagnosis.

測定部の数は、３個以上であってもよい。測定部の数は、多ければ多いほどよい。このように、微細加工技術を用いることで、測定部を複数設けるなど、マルチチャンネル化が容易となる。   The number of measurement units may be three or more. The larger the number of measurement units, the better. In this way, by using the microfabrication technique, it becomes easy to make a multichannel such as providing a plurality of measurement units.

なお、上記実施の形態では、部材２がＰＤＭＳで形成されているものとしたが、本発明はこれには限られない。例えば、アクリル樹脂等の樹脂やガラスで部材２を形成するようにしてもよい。要は、磁性粒子７等を含有することができる物質であればよい。   In the above embodiment, the member 2 is formed of PDMS, but the present invention is not limited to this. For example, the member 2 may be formed of a resin such as an acrylic resin or glass. In short, any substance that can contain the magnetic particles 7 and the like may be used.

また、上記実施の形態では、光学測定部１０が、細胞の２次元画像を撮像したが、本発明はこれには限られない。例えば、界面Ｆへの反射光の強度を検出するだけでもよい。   Moreover, in the said embodiment, although the optical measurement part 10 imaged the two-dimensional image of the cell, this invention is not limited to this. For example, it is sufficient to detect the intensity of reflected light to the interface F.

また、上記実施の形態では、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）現象を利用して、測定対象の細胞の特性を検出したが、本発明はこれには限られない。例えば、細胞の変化に伴って変化する金属薄膜６のインピーダンスの変化を検出するようにしてもよいし、細胞の変化に伴って変化する金属薄膜６の屈折率を、金属薄膜６への入射光と反射光との偏光状態の変化を検出するエリプソメトリを用いて測定するようにしてもよい。   In the above embodiment, the characteristics of the measurement target cell are detected using the SPR (surface plasmon resonance) phenomenon, but the present invention is not limited to this. For example, a change in impedance of the metal thin film 6 that changes with changes in cells may be detected, or the refractive index of the metal thin film 6 that changes with changes in cells changes the incident light to the metal thin film 6. Alternatively, measurement may be performed using ellipsometry that detects a change in the polarization state between the reflected light and the reflected light.

また、測定対象の細胞も、好塩基球細胞に限られない。例えば、単球、リンパ球、好中球、好酸球など、血液中の他の細胞であってもよいし、血液以外に存在する細胞であってもよい。   In addition, the cells to be measured are not limited to basophil cells. For example, it may be other cells in the blood such as monocytes, lymphocytes, neutrophils, eosinophils, or may be cells other than blood.

また、溶液投入部３の数も、複数設けることができる。このように、微細加工技術より、１つのチップに、溶液投入部や測定部を複数設けることができるので、マルチチャンネル化が容易となり、複数検体の同時検査も可能となる。通常、人体の主たるアレルギーは１０種類程度であり、１０個の測定部を設ければ、１０種類のアレルギーを一度に調べることが可能となり、診断時間が著しく短縮される。   Also, a plurality of solution charging portions 3 can be provided. As described above, since a plurality of solution input parts and measurement parts can be provided on one chip by the microfabrication technique, multichanneling is facilitated, and a plurality of samples can be simultaneously examined. Usually, there are about 10 types of main allergies in the human body, and if 10 measuring units are provided, 10 types of allergies can be examined at once, and the diagnosis time is significantly shortened.

また、上記実施の形態では、微細流路５が、毛細管力により溶液を測定部４Ａ、４Ｂに送液したが、本発明はこれには限られない。溶液投入部３に外部ポンプを接続して、外部ポンプを動作させて、溶液を測定部４Ａ、４Ｂに送液するようにしてもよい。   Moreover, in the said embodiment, although the microchannel 5 sent the solution to measurement part 4A, 4B with capillary force, this invention is not limited to this. An external pump may be connected to the solution charging unit 3 and the external pump may be operated to send the solution to the measurement units 4A and 4B.

なお、本明細書において使用される「細胞」とは、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、どのような種類・動物の細胞でも構わない。また、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞または遺伝子改変細胞）であってもよい。「生細胞」とは、このうち生きた細胞を示す。最も好ましくは、ヒト（Homo sapience）由来の生細胞を示す。   The “cell” used in the present specification is defined in the same way as the broadest meaning used in the field, and may be any kind of cell of an animal. Moreover, it may be a naturally occurring cell or an artificially modified cell (for example, a fused cell or a genetically modified cell). “Live cell” refers to a living cell. Most preferably, it represents a living cell derived from a human (Homo sapience).

また、「刺激」とは、細胞表面の受容体に対するリガンドの結合、温度もしくはｐＨ等の環境変化、機械的刺激または電気的刺激等を意味し、細胞の活性（例えば、細胞内の情報伝達系の賦活等）に対して作用する全ての刺激を包含している。   “Stimulation” means binding of a ligand to a cell surface receptor, environmental change such as temperature or pH, mechanical stimulation, electrical stimulation, etc., and cell activity (for example, intracellular signal transduction system) All stimuli that act on the activation of

要は、本発明は、即時型アレルギー診断だけでなく、広く細胞の解析に有用である。   In short, the present invention is useful not only for immediate allergy diagnosis but also for cell analysis widely.

また、「磁性粒子」とは、磁場中に置く事で磁化され磁石の性質を持つ鉄や砂鉄のような物質を指す。   “Magnetic particles” refer to substances such as iron and sand iron that are magnetized by being placed in a magnetic field and have the properties of a magnet.

本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。   Various embodiments and modifications can be made to the present invention without departing from the broad spirit and scope of the present invention. The above-described embodiments are for explaining the present invention and do not limit the scope of the present invention. In other words, the scope of the present invention is shown not by the embodiments but by the claims. Various modifications within the scope of the claims and within the scope of the equivalent invention are considered to be within the scope of the present invention.

本発明は、即時型アレルギー診断を行う細胞分離チップの製造に好適である。   The present invention is suitable for manufacturing a cell separation chip for performing an immediate allergy diagnosis.

１ 基板
２ 部材
２Ａ ＰＤＭＳ
２Ｂ ＰＤＭＳ（層）
３ 溶液投入部
４Ａ、４Ｂ 測定部
５ 微細流路
６ 金属薄膜
７ 磁性粒子
８ 磁石
１０ 光学測定部
１１ 光源
１２ 偏光板
１３ プリズム
１４ 対物レンズ
１５ 撮像部
２０ ウエハ
２１ フォトレジスト
１００ 細胞分離測定チップ
Ｃ１、Ｃ２ 生細胞 1 Substrate 2 Member 2A PDMS
2B PDMS (layer)
DESCRIPTION OF SYMBOLS 3 Solution injection part 4A, 4B Measuring part 5 Fine flow path 6 Metal thin film 7 Magnetic particle 8 Magnet 10 Optical measuring part 11 Light source 12 Polarizing plate 13 Prism 14 Objective lens 15 Imaging part 20 Wafer 21 Photoresist 100 Cell separation measuring chip C1, C2 live cells

Claims (7)

微細流路を有する細胞分離チップの製造方法であって、
基板上に流路パターンを形成する第１の工程と、
流路パターンが形成された基板上に、スピンコート法を用いて、磁性粒子を含有する部材の原液を塗布する第２の工程と、
前記基板上に塗布された原液を固化する第３の工程と、
形成された部材の上に、磁性粒子を含有しない部材の原液を塗布して固化する第４の工程と、
固化した部材を前記基板から取り外す第５の工程と、
前記微細流路が形成されるように、固化した部材にガラス基板を貼り合わせる第６の工程と、
を含む細胞分離チップの製造方法。 A method for producing a cell separation chip having a fine channel,
A first step of forming a flow path pattern on the substrate;
A second step of applying a stock solution of a member containing magnetic particles on a substrate on which a flow path pattern is formed using a spin coating method;
A third step of solidifying the stock solution applied on the substrate;
A fourth step of applying and solidifying a stock solution of a member not containing magnetic particles on the formed member;
A fifth step of removing the solidified member from the substrate;
A sixth step of attaching a glass substrate to the solidified member so that the fine channel is formed;
A method for producing a cell separation chip comprising: 流路パターンが形成された基板上にスピンコート法を用いて磁性粒子を含む原液を塗布し固化して形成され、前記磁性粒子が均一に配置されたミクロンオーダの厚みを有する部材と、A member having a thickness of micron order in which a magnetic solution containing magnetic particles is applied and solidified on a substrate on which a flow path pattern is formed using a spin coating method, and the magnetic particles are uniformly arranged;
前記流路パターンに対応するマイクロリッターオーダーの微細流路が形成されるように、前記部材の前記基板が取り外された側に貼り合わされたガラス基板と、A glass substrate bonded to the side of the member from which the substrate has been removed so that a microchannel of microliter order corresponding to the channel pattern is formed;
を備える細胞分離チップ。A cell separation chip comprising: 前記磁性粒子を含有する前記部材と前記ガラス基板とで形成された前記微細流路を流れる溶液が出力される溶液出力部を備え、
前記溶液出力部では、
測定対象の細胞がスポッティングされる金属薄膜が前記ガラス基板上に設けられている、
ことを特徴とする請求項２に記載の細胞分離チップ。 With the solution output unit which solution flowing through the fine flow path formed by the said member and the glass substrate containing the magnetic particles is output,
In the solution output part,
A metal thin film on which cells to be measured are spotted is provided on the glass substrate.
The cell separation chip according to claim 2. 前記金属薄膜が形成された前記ガラス基板の反対側の面から、全反射条件を満たす入射角でＰ偏光を前記金属薄膜に入射させる入射手段と、
前記金属薄膜に入射した前記Ｐ偏光の反射光の強度に関する情報を検出する検出手段と、
をさらに備える、
ことを特徴とする請求項３に記載の細胞分離チップ。 Incident means for causing P-polarized light to be incident on the metal thin film at an incident angle satisfying a total reflection condition from the opposite surface of the glass substrate on which the metal thin film is formed;
Detecting means for detecting information on the intensity of the reflected light of the P-polarized light incident on the metal thin film;
Further comprising
The cell separation chip according to claim 3. 前記検出手段は、
前記金属薄膜に入射した前記Ｐ偏光の反射光の２次元強度分布に相当する強度像を撮像する、
ことを特徴とする請求項４に記載の細胞分離チップ。 The detection means includes
Capturing an intensity image corresponding to a two-dimensional intensity distribution of the P-polarized reflected light incident on the metal thin film;
The cell separation chip according to claim 4. 付着した前記測定対象の細胞の変化に伴って変化する前記金属薄膜のインピーダンスの変化を検出する検出手段をさらに備える、
ことを特徴とする請求項３に記載の細胞分離チップ。 It further comprises a detecting means for detecting a change in impedance of the metal thin film that changes in accordance with a change in the attached cell to be measured.
The cell separation chip according to claim 3. 前記金属薄膜への入射光と反射光との偏光状態の変化を検出する検出手段をさらに備える、
ことを特徴とする請求項３に記載の細胞分離チップ。 It further comprises detection means for detecting a change in polarization state between incident light and reflected light on the metal thin film,
The cell separation chip according to claim 3.