JP5944187B2 - ハナサナギタケ由来抽出物と、これを含有するアストロサイト増殖促進剤およびアストロサイト増殖促進剤の製造方法 - Google Patents
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Description
一方、広義の解釈では、このような昆虫の成虫や幼虫に寄生する菌全体を冬虫夏草と呼ばれてもいる。
<1>以下の工程:
(1)ハナサナギタケ(P.tenuipes)をカイコの蛹に感染させ培養した子実体と宿主蛹の乾燥粉末を熱水抽出して得た熱水抽出液を乾燥させて熱水抽出物を得る工程;
(2)前記工程(1)で得られた熱水抽出物を含む水溶液と有機溶媒とによる二層分配を行って水抽出画分と有機溶媒抽出画分とに分離させ、水抽出画分の乾燥体を得る工程;および
(3)前記工程(2)で得られた水抽出画分の乾燥体を含む溶液を担体にチャージした後、この担体に、水と有機溶媒の混合液を接触させて固相抽出することで抽出液を得る工程
を含み、
前記工程(2)における有機溶媒は、n−ヘキサンまたは酢酸エチルであり、
前記工程(3)における混合液中の有機溶媒は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、イソプロピルアルコールのうちのいずれかであり、かつ、濃度が20〜80%である抽出方法によって得られた抽出物。
<2>前記<1>の抽出物を含有するアストロサイト増殖促進剤。
<3>(1)ハナサナギタケ(P.tenuipes)をカイコの蛹に感染させ培養した子実体と宿主蛹の乾燥粉末を熱水抽出して得た熱水抽出液を乾燥させて熱水抽出物を得る工程;
(2)前記工程(1)で得られた熱水抽出物を含む水溶液と有機溶媒とによる二層分配を行って水抽出画分と有機溶媒抽出画分とに分離させ、水抽出画分の乾燥体を得る工程;および
(3)前記工程(2)で得られた水抽出画分の乾燥体を含む溶液を担体にチャージした後、この担体に、水と有機溶媒の混合液を接触させて固相抽出することで抽出液を得る工程
を含み、
前記工程(2)における有機溶媒は、n−ヘキサンまたは酢酸エチルであり、
前記工程(3)における混合液中の有機溶媒は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、イソプロピルアルコールのうちのいずれかであり、かつ、濃度が20〜80%である
ことを特徴とするアストロサイト増殖促進剤の製造方法。
<4>前記工程(3)において、水と有機溶媒の混合液による固相抽出の前に、前記工程(2)で得られた水抽出画分の乾燥体を含む溶液がチャージされた担体と水とによる固相抽出を行う工程を含むことを特徴とする<3>のアストロサイト増殖促進剤の製造方法。
(1)ハナサナギタケ(P.tenuipes)の熱水抽出液を乾燥させて熱水抽出物を得る工程;
(2)前記工程(1)で得られた熱水抽出物を含む水溶液と有機溶媒とによる二層分配を行って水抽出画分と有機溶媒抽出画分とに分離させ、水抽出画分の乾燥体を得る工程;および
(3)前記工程(2)で得られた水抽出画分の乾燥体を含む溶液を担体にチャージ(添加)した後、この担体に、水と有機溶媒の混合液を接触させて固相抽出することで抽出液を得る工程、を含む。
1.供試試料
供試試料である冬虫夏草として、ハナサナギタケ P. tenuipes粉末を実験に用いた。ハナサナギタケP. tenuipesは、福島県や茨城県にまたがる八溝山で採取したものを、特許文献1(特許第2676502号)に記載の方法と同様の方法により培養した。なお、この菌株は、微生物識別表示名Paecilomyces tenuipes, IU070255、受託番号FERM P−22011として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
P. tenuipes粉末(80 g) に8倍量(W/V)(640 ml)の超純水(以下、MQと記載する)を加え、105℃、60 minオートクレーブ(BS-245,トミー精工)で加熱することで熱水抽出物を得た。抽出液を10,000 x g 4℃,10 min遠心分離し、上清を定性濾紙(No.2 ADVANTEC)で濾過し回収した。残渣に再び8倍量のMQを添加し、同条件で二回目の抽出をおこなった。上清を回収し、1回目の抽出で得られた上清と混合し、吸引濾過でろ液を回収した。これを凍結乾燥器(EYELA FDU-2100,東京理化器械)で凍結乾燥することで得られた粉末をP. tenuipes 熱水抽出物(以下、PTEと記載する)とし、使用するまで-80℃の超低温槽で保存した)。
ビーカー中でPTE(10.1273 g)にMQを加え溶解し、溶液を200 ml容の分液漏斗に移した。分液漏斗を振とうすることでPTEの濃度勾配を均一にし、そこに酢酸エチル100 mlを加えた。その後、振とうとガス抜きを5 min繰り返した後、分液漏斗を15 min静置し、完全に透明な二液層に分離させた。下層のMQ層(MQ-1)を回収し、分液漏斗に新たにMQを100 ml加え、同様の操作を繰り返した。
上記3.で得られた二層分配抽出物MQ層をさらに精製するため、逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーをおこなった。カラムは乾式充填法により作製した。担体であるシリカゲル(Wakosil 40C18、和光純薬工業)を、カラム体積が100 cm3になるようクロマト管に10 cmの高さまで入れ、メタノールにより膨潤させた後、最初の展開溶媒であるMQをクロマト管上部まで入れ、ポンプ(HIBLOW AIR POMP、型式 SPP-6EBS、テクノ高規株式会社)加圧により溶媒と担体内の気泡を押し出して置換した。
1. 実験動物
妊娠ICR♀マウスを日本SLCより購入し、妊娠16 daysの段階におけるマウス胎児を以下の実験に使用した。
(1)大脳神経細胞の調製
妊娠16 daysのICR♀マウスをジエチルエーテルによる麻酔後、頸椎脱臼により安楽死させた。マウスを開腹し子宮ごと胎児を摘出し、70%エタノールで十分に消毒した後、細胞培養用シャーレ(直径100 mm、Orange Scientific)内のPBS(-)30 mlに浸し、クリーンベンチ内に運び込んだ。以後の操作は、すべてクリーンベンチ内でおこなった。
(1)で調製した細胞液中の細胞数を細胞計数板を用いて計数し、 5.0 × 105 cells/mlになるようにHG-D-MEM(10% FBS)で濃度を調整した。24 well Poly-D-Lysine Coated Plate (BD FalconTM)に1 well当たり500 μlずつ播種した。5%CO2、37℃湿潤条件下で72 h培養し、培地交換と同時に、サンプルとして実施例1で得たF1〜F7をそれぞれ0.5 μlずつ添加した後、更に48 h同条件下で培養した。また、コントロールとしてサンプル溶解に用いたPBS(-)とDMSOを使用し、ポジティブコントロールとして、神経細胞増殖効果があることが知られているレスベラトロール(Res. 終濃度10μM)を使用した。1サンプルにつき4 wellずつ添加した。
統計解析用ソフトウェアとして、JMP 8(登録商標)(SAS Institue Inc.)を用いた。上記2.(2)で計測した大脳神経細胞の合計突起長について分散分析(ANOVA)をおこなった。その結果、有意差が認められた場合のみ、Tukey-Kramerの方法を用いて事後検定(Past-hoc test)をおこなった。P <0.05の場合、統計的に有意であるとした。
神経細胞の免疫染色により把握した形態的特徴を基にして位相差顕微鏡での観察・計測をおこなった。サンプル添加前である播種後72 hにおける大脳神経細胞の合計突起長の数値はすべての群において横並びであったが、サンプル添加後48 hにおいてはF1〜F7を添加した群において、いずれも播種後72 hと比較して数値が有意に増大していた(図1)。
(1)新生児マウス大脳神経細胞初代培養
ICRマウス新生児(生後0日目)を70%エタノールで十分に消毒した後、細胞培養用100 mm dish(直径100 mm、Orange Scientific)内のPBS(-) 30 mlに浸し、クリーンベンチ内に運び、仔マウスに頸椎脱臼をおこない、安楽死させた。仔マウスを開頭し脳全体を摘出し、それらを高グルコースダルベッコ変法イーグル培地(HG-D-MEM、和光純薬) 15 mlが入った細胞培養用100 mm dishに移し、ピンセットを用いて培地中で嗅球、正中***、髄膜を取り除き海馬を含む大脳のみとした後、さらにHG-D-MEM 10 mlが入った細胞培養用100 mm dishに移し、メスを用いて1 mm四方ほどの大きさに細かくカットした。カットした大脳を培地ごと50 mlコニカルチューブ(TPP)に移し、2 min静置した後、上清を取り除いた。新しくHG-D-MEM 4 mlを加え、さらに2.5%トリプシン(SIGMA)400μl,1% DNase I(SIGMA)40μlを加えた後37℃ウォーターバスにて、時々撹拌しながら10 min インキュベートをおこなった。インキュベート後、コニカルチューブにHG-D-MEM(10%FBS)を10 ml 加え、トリプシンの反応を停止させた後、遠心分離機(H-9R、コクサン)で1,000 × gで3 min 遠心分離した。電動ピペッターで上清を吸い取り、HG-D-MEM(10%FBS) を10 ml 加え、滅菌ピペットで細胞塊が見えなくなるまで、数回ピペッティングした。余分な細胞塊を取り除くため、細胞液をセルストレイナー(孔径100 μm ,BD FalconTM)に通した後、細胞計数板で細胞数を計数し、6.0 × 105 cells/mlになるようにHG-D-MEM(10% FBS)で調整した。細胞数を調整後、Poly-D-Lysine Cellware 100 mm Dish(PDL 100 mm dish,BD FalconTM)に7 mlずつ細胞液を播いた。また、播種後96 h後にアスピレーターで培地を一度除去し、PBS(-)10 mlでPDL 100 mm dish内を軽く洗浄し、HG-D-MEM 7 mlを新しく加えて培地の交換をおこなった。
培地交換から72 h後に細胞液を播種したPDL 100 mm dishをインキュベーター内から取り出し、パラフィルムを用いて蓋を密閉し、3〜4 dishを重ねて固定した。これを、37℃、100 rpm、20 hの条件でバイオシェイカー(BR-40LF、TAITEC)で振盪培養し、神経細胞や細胞片、死細胞等を遊離させた。振盪後、PDL 100 mm dishをクリーンベンチ内に移し、アスピレーターで上清を取り除き、PBS(-)10mlで洗浄し、パスツールピペットで2.5%トリプシン(SIGMA)を適量加え、インキュベーター内で10 min静置した。PDL 100 mm dishを再びクリーンベンチ内に戻し、ダルベッコ変法イーグル培地(D-MEM、和光純薬)(10% FBS)を10 ml加え、トリプシンの反応を止め、細胞液を50 mlコニカルチューブに集めた。その後、細胞計数板で細胞数を計数し、6.0 × 105 cells/mlになるようにD-MEM(10% FBS)で調整した。これをアストロサイト細胞液とする。
(3)培養アストロサイトの継代
上記(2)で調整した培養アストロサイトは、播種後96 hで培地交換をおこない、さらに72 h後でも培地交換をおこなった。操作は上記(1)の実験での培地交換と同様だが、2回の培地交換のいずれも、培地としてD-MEM(10% FBS)を使用した。また、PDL 100 mm dish内における、培養アストロサイトがコンフルエントに達するまで上記の手順で培地交換をおこなった。10〜14 Days後、バイオシェーカーにおける振盪培養はおこなわず、その後は(2)の調整方法に従って、培養アストロサイトの細胞数を調整し、継代をおこなった。以下の実験では、継代後の培養アストロサイト(2代目)を使用した。
培養アストロサイト(2代目)から(2)の手順でアストロサイト細胞液を調整し、剥離防止コートスライドグラス(MAS-GP typeA、MATSUNAMI、Size 76×26 mm、Thickness 0.9〜1.2 mm)を5枚ずつ敷いた角シャーレ(滅菌2号角シャーレ、Size 140 × 100 mm、Height 14.5 mm、栄研器材株式会社)2枚にアストロサイト細胞液を40 mlずつ播種し、培養アストロサイトが十分に定着した96 h後に細胞培養用100 mm dishにスライドグラスを1枚ずつ移し、D-MEM(10% FBS)を10 ml加え、インキュベーター内で培養した。
観察は、位相差顕微鏡(ECLIPSE Ti-S,Nikon)を用い、140×140 mm2の3つの視野を無作為に決定し、視野内のアストロサイトの細胞核数を計数し、その値をアストロサイトの細胞数とした。また、計数には画像解析用ソフトウェアであるNIS-Elements Ar 3.0(Nikon)を用いた。
統計解析用ソフトウェアとして、JMP 8(登録商標)(SAS Institue Inc.)を用いた。上記(5)で計数した細胞数について分散分析(ANOVA)をおこなった。その結果、有意差が認められた場合のみDunnettの方法を用いて事後検定(Past-hoc test)をおこなった。P < 0.05の場合、統計的に有意であるとした。
図3に示したように、サンプル添加後48h後、F1〜F7でアストロサイトの増殖が確認された。なかでも、F4、F5において有意にアストロサイト増殖促進活性が確認され、特に、F5において最も顕著なアストロサイト増殖促進活性が確認された。
Claims (4)
- 以下の工程:
(1)ハナサナギタケ(P.tenuipes)をカイコの蛹に感染させ培養した子実体と宿主蛹の乾燥粉末を熱水抽出して得た熱水抽出液を乾燥させて熱水抽出物を得る工程;
(2)前記工程(1)で得られた熱水抽出物を含む水溶液と有機溶媒とによる二層分配を行って水抽出画分と有機溶媒抽出画分とに分離させ、水抽出画分の乾燥体を得る工程;および
(3)前記工程(2)で得られた水抽出画分の乾燥体を含む溶液を担体にチャージした後、この担体に、水と有機溶媒の混合液を接触させて固相抽出することで抽出液を得る工程
を含み、
前記工程(2)における有機溶媒は、n−ヘキサンまたは酢酸エチルであり、
前記工程(3)における混合液中の有機溶媒は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、イソプロピルアルコールのうちのいずれかであり、かつ、濃度が20〜80%である抽出方法によって得られた抽出物。 - 請求項1の抽出物を含有することを特徴とするアストロサイト増殖促進剤。
- 以下の工程:
(1)ハナサナギタケ(P.tenuipes)をカイコの蛹に感染させ培養した子実体と宿主蛹の乾燥粉末を熱水抽出して得た熱水抽出液を乾燥させて熱水抽出物を得る工程;
(2)前記工程(1)で得られた熱水抽出物を含む水溶液と有機溶媒とによる二層分配を行って水抽出画分と有機溶媒抽出画分とに分離させ、水抽出画分の乾燥体を得る工程;および
(3)前記工程(2)で得られた水抽出画分の乾燥体を含む溶液を担体にチャージした後、この担体に、水と有機溶媒の混合液を接触させて固相抽出することで抽出液を得る工程
を含み、
前記工程(2)における有機溶媒は、n−ヘキサンまたは酢酸エチルであり、
前記工程(3)における混合液中の有機溶媒は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、イソプロピルアルコールのうちのいずれかであり、かつ、濃度が20〜80%である
ことを特徴とするアストロサイト増殖促進剤の製造方法。 - 前記工程(3)において、水と有機溶媒の混合液による固相抽出の前に、前記工程(2)で得られた水抽出画分の乾燥体を含む溶液がチャージされた担体と水とによる固相抽出を行う工程を含むことを特徴とする請求項3のアストロサイト増殖促進剤の製造方法。
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