JP5939781B2 - 高耐圧フローセル、フローセルアッセンブリ、蛍光検出器および超臨界流体クロマトグラフ - Google Patents
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Description
主に二酸化炭素(CO2)を移動相に用いた超臨界流体クロマトグラフ(Supercritical fluid chromatograph: SFC)や亜臨界流体クロマトグラフ(Subcritical fluid chromatograph)は、有機溶媒を用いる液体クロマトグラフ(Liquid chromatograph: LC)の代わりに利用できる分離分析・分離精製装置として注目されている。SFCでは、移動相として用いる流体の粘度が低く、高い拡散係数という物性により、カラム効率を低下させることなく流速を上げて短時間で分析することが可能である。
chromatograph: GC)で培われた技術を応用したものである。充填カラムを用いたSFCは、LCから発展した装置であり、その扱いやすさと分離技術の拡張性により、種々の試料の分析に利用され、応用分野が拡大している。特に、光学異性体の分離、高分子オリゴマーの重合単位での分離で使用され、環境に優しく、ランニングコストが安価である。溶媒除去のための後工程も少なく、酸化しやすい物質や熱に不安定な物質にも適している。最近の研究では、アキラル物質の分離にSFCが応用されるなど、SFCが広く使用されるようになった。
超臨界流体クロマトグラフ(SFC)に使用される検出器には、紫外可視吸光度検出器(UV/VIS)、蒸発光散乱検出器(ELSD)、質量分析計(MS)などが存在する。紫外可視吸光度検出器など光学フローセルを要する検出器をSFCで使用する場合は、10MPa以上の圧力をセル内にかけて使用するため、高耐圧の光学フローセルが必要になる。
光学フローセルを要する検出器としては、上記の他に、励起された試料成分の蛍光(燐光を含む)を検出する蛍光検出器(FLD)もあり、液体クロマトグラフ(LC)で使用されている。従来の蛍光検出器は、例えば石英ガラス製の角型フローセルを有し、LCのカラムで分離された試料成分を順次、移動相とともにフローセルに導入する。例えば、角型フローセルの下方から試料成分を導入し、セル内の流路を通って上方から導出する。励起光は、フローセルの一側面からセル流路内の試料成分を照射する。そして、試料成分に蛍光が生じたら、励起光の照射方向に垂直な方向からこの蛍光を検出する。
高圧流体のための直線状に貫通した流路を有する光透過材料製のセル本体を備え、
前記セル本体は、
前記流路の長手方向に直交する断面の大きさが0.1mm2以上、5mm2以下になるように形成され、かつ、
前記流路の壁厚t(mm)と前記流路の幅寸法d(mm)との比(t/d)が次式(1)を満たすように形成されていることを特徴とする高耐圧蛍光フローセル。
さらに、前記セル本体の材質としては、前記流路内で発生する蛍光が紫外可視領域のものであれば、前記セル本体を石英ガラスまたはサファイア製とし、前記流路内で発生する蛍光が可視領域のものであれば、前記セル本体をBK7製とする。ここで、紫外可視領域の蛍光を検出する場合には、光透過材料として、通常は石英ガラスが用いられるが、サファイアのような結晶構造の光透過材料を用いることによって、より高い耐圧のセル本体を提供できる。
すなわち、フローセルアッセンブリは、
前記高耐圧蛍光フローセルと、
前記フローセルへ前記高圧流体を導入する導入孔を有し、該導入孔が前記フローセルの前記流路の一方の開口に連通するように配置された入側セル押えと、
前記フローセルからの前記高圧流体を導出する導出孔を有し、該導出孔が前記フローセルの前記流路の他方の開口と連通するように配置された出側セル押えと、
前記入側セル押えおよび前記出側セル押えのうちの一方を保持する保持手段と、
前記入側セル押えおよび前記出側セル押えのうちの他の一方を前記フローセルに向けて押圧する押圧手段と、を備える。
前記押圧手段の押圧力により前記一対のセル押えの間で前記フローセルが挟持されて、
前記導入孔から前記フローセルの前記流路を通って前記導出孔までの前記高圧流体の経路が形成されている。
このように、フローセルを挟持する一対のセル押えが流路の入出側に設けられているので、流路に対して垂直に励起光を高圧流体に照射し、この励起光の照射方向および高圧流体の流路の両方向に垂直な方向から蛍光を検出するという光学系を容易に構成することができる。
前記窓板を有する前記セル押えには、さらに、前記窓板の内側部分において前記孔に連通する連絡孔が設けられ、
前記窓板を介して光を前記流路の長手方向に入射または出射可能になっており、
前記連絡孔を通じて前記セル押えの外部との間で前記高圧流体を授受できることが好ましい。
このフローセルアッセンブリの構成によれば、例えば、窓板を介してフローセルの流路の長手方向に励起光を高圧流体に照射して、流路に垂直な方向から蛍光を検出するという光学系を採用することができるし、逆に、流路に垂直な方向から励起光を高圧流体に照射して流路の長手方向から窓板を介して、蛍光を検出するという光学系も採用することができる。
前記フローセルアッセンブリと、
前記フローセルアッセンブリの前記セル本体に励起光を入射させる励起光学系と、
前記セル本体内の高圧流体から発生した蛍光を受光する受光光学系と、
を備える。
前記蛍光検出器を用いて10MPa以上の高圧流体の蛍光検出を行なうことにより蛍光に関するクロマトグラムを取得する。
先ず、本発明の蛍光検出器に係る実施形態について、図1に基づいて説明する。同図にて、蛍光検出器10は、フローセルアッセンブリ1と、光源2と、励起光分光器4と、蛍光分光器6と、光検出器7とから構成される。
なお、本発明に係る蛍光検出器は、このような構成に限られるものではなく、少なくとも励起光学系、フローセルアッセンブリ、および高圧流体から発生した蛍光を受光する受光光学系を備えた構成のものを含む。
フローセルアッセンブリ
次に、蛍光検出器の構成要素であるフローセルアッセンブリ1について図2〜図4に基づいて詳しく説明する。図2にて、第1実施形態に係るフローセルアッセンブリ1は、高耐圧蛍光フローセルを保持するU字型保持部本体12と、フローセルにカラムからの高圧流体を導入する入側流路14と、高圧流体をフローセルから排出する出側流路16とを備える。
本実施形態に用いる高耐圧蛍光フローセル(以降、単にフローセル18とも呼ぶ)は、図5(A)に示すように、石英ガラス(アモルファス構造)などの光透過材料からなる円筒体のセル本体42Aで構成される。セル本体42Aは、直線状のセル流路(貫通孔)32Aを有する。セル本体42Aは、円柱体の石英ガラスブロックに、セル流路32Aを円柱形にくり貫いて形成されている。セル流路32Aの両端の入側開口および出側開口は、それぞれ円筒体の上下面(入側面44および出側面46と呼ぶ)に形成される。入側面44と出側面46は平行である。
同図(C)のセル本体42Cは、四角柱体の石英ガラスブロックに、円柱形のセル流路32Cをくり貫いて形成されている。同図(D)のセル本体42Dのように、円柱体の石英ガラスブロックに、角柱形のセル流路32Dをくり貫いて形成してもよい。
これらのセル本体42A〜42Fでは、セル流路の壁厚を十分に大きくすることにより、要求される耐圧が確保される。一般的に、ガラス管の壁厚と耐圧には、次式の関係がある。
σは、引張応力(MPa)であり、
石英ガラスの場合は47MPa、
サファイアの場合は2250MPaであり、
dは、光透過材内径(mm)、
Dは、光透過材外径(mm)である。
セル本体の外径Dは、セル流路の内径dおよび壁厚t(mm)を用いて、D=d+2tで表わされる。式(2)から壁厚と内径の比(t/d)を示す次式が導かれる。
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
耐圧P(MPa) t/d
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
(石英ガラス) 10 0.120593
15 0.195971
20 0.287636
25 0.404534
30 0.564121
35 0.807032
40 1.262709
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
(サファイア) 10 0.002227
15 0.003345
20 0.004464
25 0.005587
30 0.006712
35 0.007839
40 0.008969
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
セル流路の内径d(mm) 断面積(mm2)
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
0.1 0.007854
0.3 0.070686
0.6 0.282743
1.0 0.785398
1.5 1.767146
2.0 3.141593
2.5 4.908739
5.0 19.63495
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
まず、実用上の耐圧については、超臨界流体クロマトグラフ(SFC)や亜臨界流体クロマトグラフ(Subcritical fluid chromatograph)の場合に、10〜40MPa程度と考えられるので、耐圧Pを40Mpa程度に設定する場合があり得る。
次に、材質に関しては、紫外光の透過率は石英ガラスの方が高く、できるだけ石英ガラスを使用したいが、必要な耐圧を確保することが難しい場合は、サファイアを使用する。
セル本体の直径:10.0mm径
セル流路の直径: 1.8mm径
セル流路の長さ: 7.5mm長
になる。このようなセル流路32Aの寸法形状であれば、十分な光量の励起光を入射できる。セル本体の直径は、耐圧の計算式(1)を用いておよそ40MPaの耐圧を持つように算出した寸法である。この寸法例では、セル流路の壁厚(t=4.1mm)は、セル流路の直径(d=1.8mm)の約2.3倍になっている。
なお、本実施形態では、石英ガラスブロックにセル流路を穴加工してセル本体42A〜Fを形成する場合を説明したが、その他のセル本体の製造方法として、石英ガラス製の管材を伸張加工することによる方法もある。
なお、滑り材として使用するリング状シート40の材質には、PCTFEに限らず、フッ素樹脂やポリエーテル・エーテル・ケトン樹脂(PEEK)を採用してもよい。
第1実施形態に係るフローセルアッセンブリ1を用いて蛍光測定を行なう場合、図8(A)に示すように、セル流路32の中心軸に対して垂直(Y方向)に励起光を入射して、蛍光もセル流路32の中心軸に対して垂直(X方向)に取り出す。入射方向(Y方向)と出射方向(X方向)は、セル流路32に垂直な平面上となり、かつ、互いに直交している。同図(A)では、フローセル18に対する入射光と出射光が互いに直角になるので、出射光に入射光が入り込み難くなり、感度向上の点で効果がある。
なお、入側セル押えについては、第1実施形態の入側セル押えを使用してもよく、必ずしも本実施形態のように窓板60を有するセル押えを使用する必要はない。
なお、本実施形態においては、光ファイバーによる励起光の導光手段を用いなくても、通常の光学系による導光手段によって励起光分光器4からの励起光3を窓板60まで導光してもよい。
超臨界流体クロマトグラフ(SFC)のカラムへ下記の分離条件でアントラセンを注入し、カラムの後段に設けた本発明に係る蛍光検出器によって蛍光検出を行ってクロマトグラムを取得した。また、カラムの後段に紫外可視吸光度検出器を設けて、同じ分離条件でアントラセンの吸光度検出を行ってクロマトグラムを取得した。各検出器により得られたクロマトグラムを図12(A),(B)に示す。また、このクロマトグラムのピークの面積値・高さ値・S/N比(シグナル/ノイズ比)を表1に示す。従来のSFCでは、紫外可視吸光度検出器によるクロマトグラムしか得ることができなかったが、本発明のフローセルを使用することで蛍光検出器によるクロマトグラムを取得できるようになった。そして、図12及び表1に示すように、試料の注入開始からたった2.5〜3.0minでアントラセンのピークが検出された。また、ピーク高さは245861μVとなり、紫外可視吸光度検出器によるピーク高さの25倍以上になった。ピーク面積については従来の18倍以上、S/N比については従来の54倍以上の数値が得られた。このようにSFCによって短時間の分析が可能となり、かつ、蛍光検出によって検出感度が大きく向上したことを確認した。なお、本実施例のである。
CO2: 3 mL/min
温度: 40 ℃
圧力: 15 MPa
カラム: シリカゲル (I.D. 4.6 mm x 長さ 250 mm)
注入量: 5 μL
試料: アントラセン 1.1 μg/mL
蛍光検出: 励起光330 nm、蛍光400
nm
紫外可視検出: 240 nm
多環芳香族炭化水素(PAHs:Polycyclic Aromatic
Hydrocarbons)は、排気ガス等に含まれている強い発ガン性を持つ有害物質であり、様々な国において規制の対象となっている。そのため、PAHsを微量分析する手段の提供が強く要求されている。PAHsは強い蛍光を持っているので、蛍光検出による分析を適用できる。従って、超臨界流体クロマトグラフ(SFC)による分離と、本発明のフローセルを用いた蛍光検出とを組み合わせることで、PAHsの微量分析が可能となる。
CO2: 3 mL/min
温度: 40 ℃
圧力: 20 MPa
カラム: ODSカラム (I.D. 4.6 mm x 長さ 250 mm)
注入量: 5 μL
試料: ナフタレン, フルオレン, アントラセン, フェナントレン,
ピレン, 1,2-ベンゾアントラセン, トリフェニレン, クリセン,
ベンゾピレン
蛍光検出: 試料成分の蛍光検出においては、成分毎に単一波長の励起光を入射して、同じく単一波長の蛍光を測光するのが一般的である。励起光および蛍光の波長を成分毎に示すと以下のようになる。
励起光270 nm、蛍光330 nm (ナフタレン,フルオレン)
励起光250 nm、蛍光370 nm (アントラセン,フェナントレン)
励起光335 nm、蛍光390 nm (ピレン)
励起光280 nm、蛍光380 nm (ベンゾアントラセン, トリフェニレン, クリセン)
励起光290 nm、蛍光440 nm (ベンゾピレン)
検出器に対して十分な応答を示さない試料(脂肪酸等)であっても、化学反応などにより強い応答を示す物質へ変換させてから検出を行なうことによって、検出感度を堅守できる場合がある。このような手法は誘導体化法と呼ばれる。プレカラム誘導体化法を適用した超臨界流体クロマトグラフ(SFC)で下記の分離条件により遊離脂肪酸を分離した結果を図14に示す。従来のSFCでは、高価な質量分析計を使用しないと遊離脂肪酸の分析をすることができなかったが、本発明により蛍光検出器での分析が可能となった。誘導体化法は遊離脂肪酸に限られず様々な種類の試料に対して有効な方法であり、SFCの汎用性を高めることができる。
CO2: 2.8 mL/min
アセトニトリル:0.2 mL/min
温度: 40 ℃
圧力: 15 MPa
カラム: ODSカラム (I.D. 4.6 mm x 長さ 250 mm)
注入量: 5 μL
試料: Caprylic acid (C8), Capric acid (C10), Lauric acid (C12),
Linolenic acid (C18:3), Myristic acid
(C14),
Linolenic acid (C18:2), Palmitic acid (C16),
Oleic acid (C18:1), Stearic acid (C18),
Arachidic acid (C20), Behenic acid (C22)
蛍光検出: 励起光365nm、蛍光412nm
2 光源
4 励起光分光器
6 蛍光分光器
7 光検出器
10 蛍光検出器
12 U字型保持部本体(保持手段)
14 入側流路
16 出側流路
18,118 高耐圧蛍光フローセル
20,120 入側セル押え
22,122 出側セル押え
24,124 入側ガスケット
26,126 出側ガスケット
28 導入孔
30 入側流路接続部
32,132 セル流路
34 導出孔
36 出側流路接続部
38 セル押えナット
40 リング状シート
42A〜42F,142 セル本体
60 窓板
66 窓板押え
68 出側連絡孔
70 入側連絡孔
Claims (7)
- 請求項1記載の高耐圧フローセルにおいて、
前記直線状流路の壁厚と前記直線状流路の幅寸法との比が特にt/d≧1.8を満たしていることを特徴とする高耐圧フローセル。 - 請求項1または2記載の高耐圧フローセルの前記直線状流路の前後に前記高圧流体の導入孔および導出孔を形成するフローセルアッセンブリにおいて、
前記高耐圧フローセルと、
前記高耐圧フローセルへ前記高圧流体を導入する導入孔を有し、該導入孔が前記高耐圧フローセルの前記直線状流路の一方の開口に連通するように配置された入側セル押えと、
前記高耐圧フローセルからの前記高圧流体を導出する導出孔を有し、該導出孔が前記高耐圧フローセルの前記直線状流路の他方の開口と連通するように配置された出側セル押えと、
前記入側セル押えおよび前記出側セル押えのうちの一方を保持する保持手段と、
前記入側セル押えおよび前記出側セル押えのうちの他の一方を前記高耐圧フローセルに向けて押圧する押圧手段と、を備え、
前記押圧手段の押圧力により前記一対のセル押えの間で前記高耐圧フローセルが挟持されて、
前記入側セル押えの前記導入孔から前記高耐圧フローセルの前記直線状流路を通って前記出側セル押えの前記導出孔までの前記高圧流体の経路が形成されていて、
前記入側セル押えの前記導入孔および前記出側セル押えの前記導出孔の少なくとも一方の孔は、前記高耐圧フローセルの前記直線状流路と同一直線上に形成され、かつ、前記孔の端部は、光透過材料の窓板によって塞がれており、
前記窓板を有する前記セル押えには、さらに、前記窓板の内側部分において前記孔に連通する連絡孔が設けられ、
前記窓板を介して光を前記直線状流路の長手方向に入射または出射可能になっており、
前記連絡孔を通じて前記セル押えの外部との間で前記高圧流体を授受できることを特徴とするフローセルアッセンブリ。 - 請求項3記載のフローセルアッセンブリにおいて、前記いずれか一方のセル押えと前記押圧手段との間に低摩擦のシートが介在することを特徴とするフローセルアッセンブリ。
- 請求項4記載のフローセルアッセンブリにおいて、前記シートの材質は、フッ素樹脂またはポリエーテル・エーテル・ケトン樹脂(PEEK)であることを特徴とするフローセルアッセンブリ。
- 請求項3から5のいずれかに記載のフローセルアッセンブリと、
前記フローセルアッセンブリの前記セル本体に励起光を入射させる励起光学系と、
前記セル本体内の高圧流体から発生した蛍光を受光する受光光学系と、
を備えていることを特徴とする蛍光検出器。 - 請求項6記載の蛍光検出器を用いて10MPa以上の高圧流体の蛍光検出を行なうことにより蛍光に関するクロマトグラムを取得することを特徴とする超臨界流体クロマトグラフ。
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