JP5926731B2 - 変異cftrタンパク質の修飾因子としての化合物及びcftrタンパク質異常に関連する病気の治療へのその使用 - Google Patents
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Description
そのE及びZ幾何異性体、鏡像異性体やジアステレオ異性体を含む光学活性体、及びそれらのラセミ体又は立体異性体の混合物又はその薬学的に許容可能な塩又はその錯体に関し、
ここで、Z1 は、分岐状又は非分岐状でnが1から5までの整数である−CnH(2n)−、非置換又は置換、分岐状又は非分岐状でnが2から5までの整数であるE又はZ幾何異性体の−CnH(2n−2) −からなる群から独立に選択され、嚢胞性線維症を治療するための薬物を製造するために使用される。
ここで、E1、E2、E3、E4、E5は、任意の置換基を表し、−CF3、−CHF2、−CH2F、−NH2 、−F、−Cl、−Br、−I、分岐状又は非分岐状でnが1から5までの整数である−CnH2nRC 、分岐状又は非分岐状でnが2から5までの整数であるE又はZ幾何異性体の−CnH(2n−2)RC 、分岐状又は非分岐状でnが2から5までの整数である−CnH(2n−4)RC、−PO3H2、−OPO3H2から選択され、
ここで、RCは、−H、低級アルキル基、−CN、−CF3、−CHF2、−CH2F、−CH2Cl、−CH2Br、−CH2I、−F、−Cl、−Br、−I、−NH2からなる群から独立に選択される。
材料及び方法
抗体
以下の抗体を使用した。すなわちMAB25031(クローン24−1、R&D systems、米国)及びMM13−4(Upstate)、CFTR検出用モノクローナル抗体(mAb)である。蛍光二次抗体Alexa 594及び488はMolecular Probes(Cergy Pontoise、フランス)から購入した。
安定トランスフェクトHeLa細胞(コントロールとしてのpTracerプラスミド(pTracer)のみ、又は発現したWT−CFTR(spTCF−WT)、ΔF508−CFTRs(pTCF−F508del)を有する)はPascale Fanen(Inserm U.468、クレテイユ(Creteil)、フランス)から提供され、他(16)で説明の通りに培養した。簡潔に言うと、HeLa細胞を10%の熱不活化したFCS、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン及び250μg/mlのゼオシンを追加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で培養した。培養は37℃、5%CO2の加湿インキュベータ内で行った。これらの細胞中のWT−CFTR及びΔF508−CFTRの発現は、研究中、常に免疫沈降反応及び免疫細胞化学法によって検証した。75%コンフルーエンスに到達した細胞について、(1及び10μMの)様々な分子及び溶媒で処理を実行した。
75cm2のフラスコ中で培養した細胞を氷冷PBSで2回洗浄し、2mlのPBS中でかき集め、600gで5分間遠心分離した。ペレットを300μlのRIPA緩衝剤(50mMのトリスHCl、150mMのNaCl、1%のトリトンX−100、1%のNaデオキシコレート、0.1%のSDS、pH7.5)中、4℃で30分間攪拌して懸濁させた。15000gで30分間遠心分離した後、上澄みを、上述(18)をわずかに変更して免疫ブロット実験用に処理した。
ガラスカバースリップ上で培養したHeLa細胞を上述の通り、及びLipecka他(20)で説明の通りに処理した。細胞を4%のホルムアルデヒドで固定し、PBS中の0.1%のトリトンで透過化処理した。細胞をPBS/トリトン中の1%のウシ血清アルブミンでブロッキングし、一次抗体24−1(1:300)と共に4℃で一晩インキュベートした。洗浄し、5%の正常ヤギ血清でブロッキングした後、細胞を二次抗体と共にインキュベートした。ガラスカバースリップはVectashield封入剤(Vector Laboratories)を使用して封入し、共焦点レーザー顕微鏡(Zeiss、LSM510)で検査した。
CFTR塩化物チャンネルの活性を、以前の説明(21)通りに形質転換されたCHO細胞からのヨウ化物(125I)流出を測定することによって測定した。96ウェルのプレートで4日間培養した細胞を、137mMのNaCl、5.36mMのKCl、0.4mMのNa2HPO4、0.8mMのMgCl2、1.8mMのCaCl2、5.5mMのグルコース、及び10mMのHEPESを含むpH7.4の改変アール塩溶液2mlで2回洗浄した。次に、1mMのKIを含む同じ培地(1mCiのNa125I/ml、NEN Life Science Products)と共に37℃で30分細胞をインキュベートした。洗浄後、細胞を1mlの改変アール塩溶液と共にインキュベートした。1分後、培地を取り出してカウントし、1mlの同じ媒質と素早く交換した。この手順を1分毎に8分間繰り返した。最初の3つのアリコートを使用して、流出緩衝剤のみの安定したベースラインを確定した。CFTR塩化物チャンネルを活性化させるために、次のアリコートでは細胞内cAMPの増加を目的とするカクテル(10μMのフォースコリン及び30μMのゲニステイン)を含む培地を使用した。インキュベーションの最後に培地を回収し、細胞を1NのNaOH中で可溶化した。ガイガーカウンター(LKB)を使用して放射性を測定した。時間0における125I(cpm)の総カウントは、1分毎のサンプルでカウントしたcpmとNaOH画分のcpmとの合計として計算した。各時点で失われた当初の細胞内125Iの画分を求め、125I流出の時間依存係数をBecq他(22)に従って下式から計算した。
ln(125It1/125It2)/(t1−t2)
ここで、
125Itは、時間tにおける細胞内125Iであり、
t1及びt2は、連続する時点である。
全細胞構成のパッチクランプ記録法の技術は、他(23,24)で説明されている。安定トランスフェクト細胞を、倒立顕微鏡のステージに装着した35mmの細胞培養プラスチックペトリ皿に播種した。パッチクランプ実験は、ディジットデータ1440(digitdata 1440)インタフェース(Axon Intruments、米国)を介してコンピュータによって制御されたAxopatch 200A増幅器で室温にて実施した。Setterマイクロピペットプラーを使用して硬質ガラス(Kimax 51)からピペットを引き出し、その先端を熱加工した。ナイスタチン穿孔パッチクランプ構成を使用して、電流記録を実施した。ナイスタチン原液(50mg/ml)は、DMSO中で毎日調製した。原液を内部溶液で希釈し(1:250)、次にこれを1分間超音波処理した。内部溶液は、131mMのNaCl、2mMのMgCl2、及び10mMのHepes−Na+を含み、NaOHでpH7.3に調整した。浴液は150mMのNaCl、1mMのCaCl2、1mMのMgCl2、35mMの蔗糖及び10mMのHepes−Na+を含み、NaOHでpH7.3に調整した。
鼻電位測定法は、発明者らが幼児のために開発した技術(25)を採用し、小型化したものである。ケタミン(133mg/kg;IMALGENE 1000、MERIAL、フランス)及びキシラジン(13.3mg/kg;Rompun 2%、BayerPharma、フランス)を腹腔内投与して、マウスに麻酔をかけた。マウスを45°傾斜した板上に位置決めし、マウスの殺傷を回避するために鼻の下に紙パッドを配置した。皮下注射針を寒天ブリッジでAg+/AgCl基準電極に接続した。二腔管ポリエチレンカテーテル(直径0.5mm)を一方の鼻孔に深さ4mmで挿入した。リンゲル液(140mMのNaCl、6mMのKCl、10mMのHEPES、10mMの蔗糖、1mMのMgCl2、2mMのCaCl2で、NaOHでpH7.4に調整)を0.15mL/時で灌流した一方の腔管を、測定用Ag+/AgCl電極に接続した。2つのAg+/AgCl電極を高インピーダンス電圧計(LOGAN research Ltd、英国)に接続した。第2の腔管は以下のシーケンスで溶液を灌流した。すなわち(1)リンゲル液、(2)アミロライド(Na+コンダクタンスの阻害剤、100μM)を含むリンゲル液、(3)Cl−コンダクタンスを明らかにする低塩化物リンゲル液(140mMのグルコン酸ナトリウム、6mMのグルコン酸カリウム、10mMのHepes、10mMの蔗糖、1mMのMgCl2、6mMのグルコン酸カルシウムで、NaOHでpH7.4に調整)、(4)CFTRの関与を評価するCFTR阻害剤−172(5μM、Calbiochem、ドイツ)を含む低塩化物リンゲル液である。各溶液は少なくとも3分間灌流し、灌流を切り換える前に30秒間安定させる必要があった。定常状態の経上皮電位VTE、ΔVTEAmil(アミロライド含有溶液の灌流後に記録したVTEと経上皮電位との差)、ΔVTEamilLowCl(低Cl−含有溶液とアミロライド含有溶液で灌流した後に記録したVTEと経上皮電位との差)、及びΔVTEamilLowClInh−172(VTEと以前の溶液にCFTR阻害剤を添加した後との差)は、安定中に記録した30の値の平均であった。
細胞生存度を測定するために、典型的なMTTアッセイを用いた。HeLa細胞を96ウェルのプレートで培養し、様々な濃度の本発明の化合物に24時間曝露した。洗浄後、次いでMTT溶液及び培地を導入した。インキュベーション後、その結果のホルマザン結晶をジメチルスルホキシド中で溶解させ、マイクロプレートリーダーで570nmの吸収強度を測定した。
ヒット源として仮想スクリーニングプロセスでは低分子量化合物のデータベースを使用した。分子ドッキングプログラムDock6.1を使用して、タンパク質表面上の2つの有望な結合部位内にある小分子の配座空間を検査した。その後、選択した全リガンド及び全錯体を分子力場中で十分に極小化した。各ステップで、有望な錯体の評価のために一組のスコアリング関数を使用し、適切な分子を実験用に選択した。
ヨウ化物(I−)流出に対する薬剤の効果
ΔF508−CFTRの輸送及び機能の薬剤補正を検査するために、I−流出技術を使用したロボットのセルベースの方法を使用した肉眼アッセイでハロゲン化物の透過性を評価した。第一系列の実験では、ΔF508−CFTRHeLa細胞を24時間、1μMの全化合物で前処理し、その後にcAMP依存性放射標識ヨウ化物流出を測定することによって、電位補正剤の効果を検査した。ポケット1の化合物130813及び118208、及びポケット2の73100及び407882で処理すると、cAMPで刺激された放射標識ヨウ化物流出が大幅に増加し(図1a)、407882が最も有効である。この低い用量(1μM)では、cAMPで刺激された流出の増加は、既知の補正剤ミグルスタット(27)を100μM使用して観察した増加量よりも少なかった。4つの活性化合物のそれぞれで処理した後のI−流出刺激の例を図1bに示す。CFTRチャンネルブロッカーCFTRinh−172の存在下で実験を実施した場合、cAMPで刺激されたI−流出は完全に阻止された。
ΔF508−CFTR輸送の補正剤としての4つの化合物の有効性を、免疫ブロットでさらに確認した。十分にグリコシル化したバンドCが検出された場合、これがΔF508−CFTRの適切なプロセッシングを示唆すると仮定した。代表的な免疫ブロットを図4aに示す。抗CFTR抗体がWT−CFTR細胞に由来するタンパク質の2つのバンド(図4aのWT−CFTRの列)を検出する。約170kDaの拡散バンド(バンドC)は、ゴルジ装置を通してプロセッシングされた十分にグリコシル化した成熟タンパク質に相当する。約145kDaより下のバンドは、小胞体中に局在する中心がグリコシル化した未成熟のタンパク質に相当する。ΔF508−CFTR発現細胞では、未成熟タンパク質のみが検出可能である(図4aのΔF508の列)。バンドCは、未処理細胞と比較して1μMの化合物407882で処理した細胞で明白に検出可能であり、170kDaの信号は、1μMの化合物118208又は130813で処理した細胞のDMSO処理との違いがなかった、又は1μMの化合物73100で処理した細胞で非常にわずかに増加した。化合物はいずれもタンパク質の総発現量を変化させなかった。バンドC+バンドBに対するバンドCの比率として表現される成熟CFTRの相対的存在量を図4bに示す。化合物407882のみが、成熟CFTRの相対的存在量を大幅に増加させた。
図4cは、WT−CFTR発現HeLa細胞の細胞膜における典型的なCFTR染色を示し、ΔF508−CFTRは細胞質全体に見られた。1μMの407882で細胞を24時間処理した結果、細胞膜で、又はその付近でCFTRが明白に染色され、ΔF508−CFTR輸送の救済が免疫ブロット実験と合致することを示す。細胞を3つの他の化合物118208、73100又は130813のそれぞれで処理した場合、図4cの化合物118208で示すように、細胞のごく一部分で細胞膜が点々状に断続的に染色されていることが観察された。
2つの化合物が同じタンパク質配座であるが異なる表面腔に結合することによってΔF508−CFTRを補正することができる場合、その効果は相加的又は相乗的になり得る。2つの独立型のアッセイ、すなわちヨウ化物流出とパッチクランプによって、この仮説を検査した。ヨウ化物透過性検査の結果(図5)は、それぞれ1μMの化合物118208と407882(図5a)又は118208と73100(図5b)で細胞を複合処理すると、いずれかの分子のみで観察された結果よりcAMP依存性陰イオン流出が多くなることを示した。この系列の実験では、コントロールとして化合物37173(図5c)を使用した。何故なら、同じ濃度でcAMPで刺激したヨウ化物流出を全く誘導しなかったからである。図5cに示すように、ΔF508−CFTRHeLa細胞を37173と407882で同時処理すると、407882処理のみと同様の振幅でcAMPで刺激したヨウ化物流出を誘導した。対照的に、化合物118208及び407882での同時処理は、各化合物によって誘導された流出の合計に等しい振幅のヨウ化物流出を誘導するが、118208と73100で処理した後は、わずかな相乗効果が観察された。
次に、少量の内在性ΔF508−CFTRを発現しているΔF508−CF患者(CF−KM4)由来の上皮漿液細胞株中のCFTR依存ヨウ化物流出に対するHeLa細胞中で活性の4つの分子の効果を検査した。これらの上皮細胞では、化合物407882及び118208がなお大量のcAMP依存ヨウ化物流出を誘導することができた(図7)。しかし、HeLa細胞中でΔF508−CFTRを補正する2つの分子(130813及び73100)は、この細胞株では活性でなかったことに留意されたい。
細胞での結果は、別々のポケットに作用する分子対が追加の補正効果を示すことを示唆している。これらの分子が生体内で活性であるか否かを検査するために、リポソームに(5:1で)組み込んだ30μlの73100と118208(それぞれ、0.1μモル)で、又はリポソームのみで24時間鼻腔内処理したΔF508/ΔF508マウスで、鼻電位差(ΔVTE)を観察した(25)。得られた結果を図8にまとめた。ΔF508マウスでは、ベースのVTE値、及び100μMのアミロライドで鼻上皮を灌流することによって誘導されたΔVTEの変化ΔVTEamilが、2種類の分子で、又はリポソームのみで処理したマウスと同様であった。対照的に、マウス5匹中3匹での低Cl−溶液の灌流は、VTEを2mV(ΔVTEamil−lowCl)、すなわち処理の有意の効果として発明者らが規定した閾値より大きく過分極化した(原稿は準備中)。CFTR阻害剤IInh172によって明らかとなったCFTR関連電流は、(ΔVTEamil−lowCl)の約30%を表す(データは開示せず)。
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Claims (8)
- 一般式(I)の化合物、
ここで、Z1は、分岐状又は非分岐状でnが1から5までの整数である−CnH(2n)−、分岐状又は非分岐状でnが2から5までの整数であるE又はZ幾何異性体の−CnH(2n−2)−からなる群から独立に選択され、
ここで、R1及びR2は、芳香族環又は複素芳香族環からなる群から独立に選択され、
嚢胞性線維症を治療するための薬物を製造するために使用される、変異CFTRタンパク質の修飾剤。 - R1及びR2は、部分式(Ia)の群から独立に選択され、
ここで、E1、E2、E3、E4、E5は、任意の置換基を表し、−CF3、−CHF2、−CH2F、−NH2、−F、Cl、−Br、−I、−PO3H2、−OPO3H2、分岐状又は非分岐状でnが1から5までの整数である−CnH2nRC、分岐状又は非分岐状でnが2から5までの整数であるE又はZ幾何異性体の−CnH(2n−2)RC、分岐状又は非分岐状でnが2から5までの整数である−CnH(2n−4)RCから選択され、
ここで、RCは、−H、低級アルキル基、−CN、−CF3、−CHF2、−CH2F、−CH2Cl、−CH2Br、−CH2I、−F、−Cl、−Br、−I、−NH2からなる群から独立に選択される、請求項1に記載の修飾剤。 - 前記化合物は、以下の構造
- 変異CFTRタンパク質に影響を及ぼし、ここで、前記CFTR変異は、ΔF508−CFTR変異、又はクラスIIの別の変異であり、ΔF508−CFTR変異、又はクラスIIの別の変異は、CFTRタンパク質機能不全に関与する、請求項1又は2又は3に記載の修飾剤。
- CFTRタンパク質機能不全に関連する前記病気は、嚢胞性線維症である、請求項4に記載の修飾剤。
- 細胞膜を横断するCFTR依存性イオン輸送に影響を与え、及び/又は前記細胞表面に到達する変異CFTRタンパク質の数を増加する能力を有する、請求項1に記載の修飾剤。
- 前記変異CFTRタンパク質の前記構造に対する安定効果を有し、及び/又は変異CFTRの成熟前分解に関与する細胞タンパク質との相互作用を遮断する、請求項1に記載の修飾剤。
- 変異CFTRタンパク質に影響を及ぼし、ここで、前記CFTR変異は、ΔF508−CFTR変異、又はクラスIIの別の変異である、請求項1に記載の修飾剤。
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