JP5926731B2 - 変異cftrタンパク質の修飾因子としての化合物及びcftrタンパク質異常に関連する病気の治療へのその使用 - Google Patents

変異cftrタンパク質の修飾因子としての化合物及びcftrタンパク質異常に関連する病気の治療へのその使用 Download PDF

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Description

本発明は、変異CFTRタンパク質の機能を変質させることができる新規の修飾因子、及びCFTRタンパク質異常に関連する病気の治療へのその使用に関する。本発明は、変異CFTRタンパク質の細胞変質を補正する組成物、製剤及び方法を提供し、ここで、CFTR変異はΔF508−CFTR変異又はクラスIIの別の変異である。
嚢胞性線維症(CF又は膵臓線維症としても知られる)はヒトの致命的遺伝病の中で最も多い病気の一つである。CFは生産児2500人当たり約1人を襲う遺伝的な常染色体性劣性遺伝病である(1)。CFは、上皮塩化物イオンチャンネルとしての活性を有する嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTRタンパク質)をコードするCFTR遺伝子の変異によって引き起こされる(2、3)。このタンパク質の機能が損なわれた結果は、呼吸器系及び消化器系さらに***系に関連する重篤な症状として現れる(4)。これまでにCFTR遺伝子には1600を超える変異が特定され、報告されている(5)。
CFTR遺伝子変異は、CFTRタンパク質の機能不全につながる分子のメカニズムに基づいて5つのクラスに分類されている(6、7)。クラスI変異は、長さが不完全なタンパク質の形成の一因となり、通常はその活性が完全に失われている(例えばG542X)。クラスIIの変異は小胞体及びゴルジ装置におけるタンパク質の成熟異常につながる。これらの変異の影響は、タンパク質の成熟前の分解である。したがってCFTRは、その機能を発現すべき細胞膜に到達しない(例えばΔF508、ΔI507、S549R)(8)。クラスIIIの変異を有する遺伝子産物は適切に合成され、細胞膜へと輸送されて取り込まれるが、タンパク質の制御異常によって活性低下が引き起こされる。
これらの変異はヌクレオチド結合ドメインの一つ(例えばG551D/S)内に位置することが多い。クラスIVの変異は膜貫通タンパク質の構造に異常を引き起こし、それにより塩化物チャンネルの伝導を低下させる(例えば、R117H、R334W)。mRNAの安定性を変更する変異は、CFTR遺伝子の変異のクラスVである(3849+10kbC−>T,5T)。
患者の約90%の少なくとも1つの対立遺伝子中に存在する最も一般的な変異(9)は、CFTRアミノ酸配列の508位のフェニルアラニンの欠失である(ΔF508CFTR)。これは、タンパク質の成熟前分解を引き起こすクラスII変異の古典的な例である(8、10)。この変異は(特に細胞膜を介した細胞からの塩化物陰イオン流出(11)と細胞内へのナトリウムイオンの移動(12)との)水−電解質異常を伴い、その結果、病理学的症状が現れる。最も重篤な症状の幾つかは、上下気道の鬱血及び粘液粘度上昇であり、肺の損傷につながる。これらの症状は、例えば緑膿菌などによって引き起こされる細菌感染の発症にとって好ましい環境を生じる。さらに、CFTRタンパク質の機能不全は、外分泌膵管の閉塞及び関連する消化系障害につながる(13)。
CFTRは1480アミノ酸を有する糖タンパク質であり、ABC(ATP結合カセット)輸送体に分類される。このタンパク質は5つのドメインで構成される。2つのヌクレオチド結合ドメイン(NBD1及びNBD2)、1つの調節ドメイン(RD)及び2つの膜貫通ドメイン(TMD1及びTMD2)がある。タンパク質活性は、調節ドメイン(RD)の燐酸化を触媒するcAMP依存タンパク質キナーゼ(PKA)によって、また、2つのATP分子がNBD1及びNBD2ドメインに結合することによっても調節される(14)。
国際公開第WO2005/120497号(米国特許出願公開第2008/0319008号)では、変異CFTRタンパク質の活性(イオン輸送)を増加させる化合物、及びその使用が説明されている。この発明は、嚢胞性線維症(CF)の治療に有用である変異CFTRタンパク質、すなわちΔF508CFTR、G551D−CFTR、G1349D−CFTR又はD1152H−CFTRのイオン輸送活性を増加させる組成物、製剤及び方法も提供している。この発明の組成物及び製剤は、1つ又は複数のフェニルグリシン含有化合物又はスルホンアミド含有化合物又はその類似体又は誘導体を含むことがある。
国際公開第WO2009/051910号では、変異CFTRタンパク質のイオン輸送活性を増加させる化合物、及びその使用が説明されている。この発明は、変異CFTRの活性を増加させる組成物、製剤及び方法を提供している。この組成物、製剤及び方法は、嚢胞性線維症のような変異CFTRに関連する障害の研究及び治療に有用である。この発明の組成物及び製剤は、1つ又は複数のフェニルグリシン含有化合物、又はその類似体又は誘導体を含むことがある。
米国特許第5948814号は、CF治療のためのゲニステイン化合物の使用について説明している。変異CFTRを含む細胞内にCFTRの機能を生成することによって嚢胞性線維症を治療する方法、及び治療用の治療組成物が説明されている。治療法は、有効量のゲニステイン又はゲニステイン類似体及び誘導体を嚢胞性線維症に悩む患者に投与することを含む。
米国特許出願公開第2004/0006127号では、塩化物を活性化する方法が説明されている。フルオレセイン及び誘導体がヒトを含む動物生体の症状の治療に使用されており、その病気はCFTR塩化物チャンネルの活性化に反応するものであり、例えば嚢胞性線維症、播種性気管支拡張症、肺感染症、慢性膵臓炎、男性不妊症及びQT延長症候群である。
国際公開第WO2006/101740号(米国特許出願公開第2008/0318984号)では、変異CFTRタンパク質の細胞変質を補正する化合物及びその使用が説明されている。この発明は、嚢胞性線維症の治療に有用である変異CFTRタンパク質(例えばΔF508CFTR)の細胞プロセッシングを補正する組成物、製剤及び方法を提供している。この発明の組成物及び製剤は、1つ又は複数のアミノベンゾチアゾール含有化合物、アミノアリルチアゾール含有化合物、キナゾリニルアミノピリミジノン含有化合物、ビスアミノメチルビチアゾール含有化合物、又はフェニルアミノキノリン含有化合物、又はその類似体又は誘導体を含むことがある。
国際公開第WO2009/051909号では、変異CFTRタンパク質の細胞変質を改善する化合物及びその使用が説明されている。この発明は、変異CFTRの活性を増加させる組成物、製剤及び方法を提供する。組成物、製剤及び方法は、嚢胞性線維症などの変異CFTRに関連する疾患の研究及び治療に有用である。この発明の組成物は、1つ又は複数の上記発明のビチアゾール含有化合物、又はその類似体又は誘導体を含むことがある。
CFTRタンパク質のフェニルアラニン508は、CFTRのNBD1ドメインの表面に生じる。現在の構造研究及び生物物理学的研究では、野生型ドメインのタンパク質とΔF508変異ドメインとの間に、CFTRタンパク質の折り畳み動態及び熱力学的安定性に影響を及ぼし得る有意な差は明らかになっていない。両方のドメインの解析された結晶構造は、F508が占有すべき部位の付近に位置するアミノ酸の再構成にわずかな違いを示すのみである(10)。
本発明の目的は、変異CFTRタンパク質の細胞プロセッシングを補正する組成物、製剤及び方法を提供することである。F508の欠失は、X線の結果で観察されているようにNBD1ドメインの構造に最小限の影響しか与えず、細胞中のCFTRタンパク質の変異型と自然型の挙動における劇的な違いを説明することができない。本発明では、両方のタンパク質型の構造データを、NBD1の動的性質を解明するために設計されたコンピュータシミュレーションにかけた。本発明では、分子動力学的方法を使用している。この方法は、シミュレートされた系を形成する原子間の相互作用の反復計算、及び運動方程式の解析に基づいている(15)。(研究した両NBD1の型の)これらのシミュレーションの結果、初期の物理学的仮定に従って目的タンパク質がとることができる幾つかの構造セット、いわゆる軌跡が得られる。
2つのドメインの分子動力学的軌跡の分析により、野生型タンパク質がとっている配座状態とは有意に異なる変異タンパク質配座を単離することが可能であった。この配座は、ATP結合部位の両側に位置する、タンパク質の表面上に2つの主要ポケットを有する。この配座のタンパク質の構造を使用して、ΔF508−CFTR活性を補正するための化合物を開発した。
本発明においては、本発明の目的の実現、及び先行技術で説明されているような嚢胞性線維症の治療に実際使用される化合物に関連する問題の解決がプロセスの最高の効率で達成されている。
本発明の主題は、変異CFTRタンパク質の修飾因子である一般式(I)の化合物、
(I)
のE及びZ幾何異性体、鏡像異性体やジアステレオ異性体を含む光学活性体、及びそれらのラセミ体又は立体異性体の混合物又はその薬学的に許容可能な塩又はその錯体に関し、
ここで、Z は、分岐状又は非分岐状でnが1から5までの整数である−C(2n)−、非置換又は置換、分岐状又は非分岐状でnが2から5までの整数であるE又はZ幾何異性体の−C(2n−2) −からなる群から独立に選択され、嚢胞性線維症を治療するための薬物を製造するために使用される。
ましい態様では、置換基R及びRは、部分式(Ia)の群から独立に選択され、
ここで、A、A、A、A、A、Aは、独立に選択されるN又はC原子であり、ここで、環は0〜3個の窒素原子を含み、
ここで、E、E、E、E、Eは、任意の置換基を表し、−CF、−CHF、−CHF、−NH 、−F、−Cl、−Br、−I、分岐状又は非分岐状でnが1から5までの整数である−C2n 、分岐状又は非分岐状でnが2から5までの整数であるE又はZ幾何異性体の−C(2n−2) 、分岐状又は非分岐状でnが2から5までの整数である−C(2n−4)、−PO、−OPOから選択され
こで、Rは、−H、低級アルキル基、−CN、−CF、−CHF、−CHF、−CHCl、−CHBr、−CHI、−F、−Cl、−Br、−I、−NHからなる群から独立に選択される
本発明のさらに好ましい態様では、化合物は以下の構造で表される。
好ましい態様では、本発明の修飾因子は、細胞膜を横断するCFTR依存性イオン輸送に影響を与え、及び/又は細胞表面に到達する変異CFTRタンパク質の数を増加させる活性を有する。
好ましい態様では、本発明の修飾因子は、変異CFTRタンパク質の構造に対する安定効果を有し、及び/又は変異CFTRの成熟前分解に関与する細胞タンパク質との相互作用を遮断する。
好ましい態様では、本発明の修飾因子は、変異CFTRタンパク質に影響を及ぼし、ここで、上記CFTR変異は、ΔF508−CFTR変異、又はクラスIIの別の変異である。
他の好ましい態様では、本発明は、CFTRタンパク質機能不全に関連する病気を治療するための薬物を製造するために修飾因子又は薬学的に許容可能なその塩又はそのプロドラッグの使用に関する。
さらに好ましい態様では、CFTRタンパク質機能不全に関連する病気とは嚢胞性線維症である。
さらに好ましい態様では、ΔF508−CFTR変異、又はクラスIIの別の変異は、CFTRタンパク質機能不全に関与する。
本発明を添付図面に図示する。
ΔF508−CFTR HeLa細胞中での1μMのヨウ化物流出に対する様々な化合物の影響。(a)Aのように様々な薬剤で処理した細胞中におけるFsk/Gsk依存ヨウ化物流出のピーク振幅を示す棒グラフ。値は3つの独立した実験の平均値である。p<0.05、**p<0.01。(b)in silicoで特定した活性補正剤の化学構造。(c)ΔF508−CFTRを安定トランスフェクトし、10μMの様々な化合物で24時間処理したHeLa細胞から得られたヨウ化物流出曲線の例。CFTR依存性応答は、トレース上の水平線で示すように10μMのフォースコリン(Fsk)+30μMのゲニステインによって誘導した。(d)ポケット2に活性を有する化合物407882及び73100、並びに、ポケット1に活性を有する化合物130813について、EC50を測定した。118208については、100μMでもヨウ化物流出が最高値に達しなかったため正確に測定できなかった(これも図示)。 化合物がCFTR輸送に及ぼす影響とは無関係に増強活性を有するか試験するために、未処理のWT−CFTRHeLa細胞のヨウ化物流出を検査した。フォースコリンと一緒に化合物を添加し、その影響をフォースコリンのみ、又はフォースコリン+ゲニステインの場合と比較した。ゲニステインと異なり、試験した分子はすべてフォースコリンのみの場合より大きいIの流出を誘導した。 ΔF508−CFTRを救済するためにミグルスタットで2時間処理したΔF508−CFTRHeLa細胞で、増強作用も検査した。フォースコリンのみ、フォースコリン+ゲニステイン、又はフォースコリン+様々な化合物でI流出を刺激した。図に示すように、ゲニステインのみが流出を増加させることができ、本発明者らの薬剤では増強活性がないことが実証された。 特定された補正剤がΔF508−CFTRの成熟及び細胞局在化に及ぼす影響。(a)様々な化合物がCFTRプロセッシングに及ぼす影響。Mab24−1と共に1μMの様々な化合物で24時間処理したHeLa細胞からのタンパク質のWT−CFTR及びΔF508−CFTRタンパク質の代表的な免疫ブロット。CFTRの成熟形(バンドC)及び未成熟形(バンドB)の位置を示す。(b)WT−CFTR、ΔF508−CFTRのみ、及び本発明の分子で補正した後のΔF508−CFTRの相対的強度(C/B+C)の比較。(c)1μMで使用した様々な化合物がCFTRの局在化に及ぼす影響。WT−CFTRの細胞膜局在化及びΔF508−CFTRの細胞内局在化を示す共焦点像。薬剤の影響をパネルcからfに示す。棒:20μM。矢印は細胞膜におけるCFTRの染色を示す。 1μMで試験したヨウ化物流出に対する活性化合物の増強効果。(a)407882、118208、(b)118208、73100、(c)407882、37173のそれぞれについて、単独及び両方の化合物で24時間処理した細胞について、トレースの上の水平線で示された1μMのフォースコリン(Fsk)+30μMのゲニステイン(Gsk)への反応としてのヨウ化物流出。(d)同様に様々な薬剤で処理した細胞中のFsk/Gsk依存性ヨウ化物流出のピーク振幅を示す棒グラフ。値は3つの独立した実験の平均値である。p<0.05、**p<0.01。 (a)/(b)1μMの407882(12)+118208(6)化合物で処理したHeLa細胞中のcAMP依存塩化物流の電流と電圧の関係。 ΔF508CF患者(CF−4KM)の細胞由来の上皮漿液細胞株における1μMでのヨウ化物流出に与える様々な化合物の影響。最も有力な分子407882では濃度依存性が示された。 ΔF508/ΔF508マウスの鼻電位差(ΔVTE)に与える73100+118208分子の影響。基準値VTE、及び100μMのアミロライドΔVTEamilを鼻上皮に灌流することによって誘発された変化ΔVTEは、2種類の分子で、又はリポソームのみで処理したマウスで同様であった。マウス5匹中3匹での低Cl溶液の灌流は、VTEを2mV(ΔVTEamil−lowCl)、すなわち処理の有意な効果として発明者らが確定した閾値より大きく過分極化した。CFTR阻害剤IInh172によって明らかとなったCFTR関連電流は、(ΔVTEamil−lowCl)の約30%を表す(データは開示せず)。
本発明をよりよく理解するために、本発明の主題の実施例を以下に開示する。
実施例
材料及び方法
抗体
以下の抗体を使用した。すなわちMAB25031(クローン24−1、R&D systems、米国)及びMM13−4(Upstate)、CFTR検出用モノクローナル抗体(mAb)である。蛍光二次抗体Alexa 594及び488はMolecular Probes(Cergy Pontoise、フランス)から購入した。
細胞培養
安定トランスフェクトHeLa細胞(コントロールとしてのpTracerプラスミド(pTracer)のみ、又は発現したWT−CFTR(spTCF−WT)、ΔF508−CFTRs(pTCF−F508del)を有する)はPascale Fanen(Inserm U.468、クレテイユ(Creteil)、フランス)から提供され、他(16)で説明の通りに培養した。簡潔に言うと、HeLa細胞を10%の熱不活化したFCS、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン及び250μg/mlのゼオシンを追加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で培養した。培養は37℃、5%COの加湿インキュベータ内で行った。これらの細胞中のWT−CFTR及びΔF508−CFTRの発現は、研究中、常に免疫沈降反応及び免疫細胞化学法によって検証した。75%コンフルーエンスに到達した細胞について、(1及び10μMの)様々な分子及び溶媒で処理を実行した。
野生型SV40ウィルスを使用してΔF508同型変異体のCF気管腺漿液細胞の初代培養を形質転換させることによって取たCF−KM4細胞株を他(17)で説明の通りに培養した。
免疫ブロット実験
75cmのフラスコ中で培養した細胞を氷冷PBSで2回洗浄し、2mlのPBS中でかき集め、600gで5分間遠心分離した。ペレットを300μlのRIPA緩衝剤(50mMのトリスHCl、150mMのNaCl、1%のトリトンX−100、1%のNaデオキシコレート、0.1%のSDS、pH7.5)中、4℃で30分間攪拌して懸濁させた。15000gで30分間遠心分離した後、上澄みを、上述(18)をわずかに変更して免疫ブロット実験用に処理した。
サンプルを8%のSDS−PAGEで分画し、PVDF膜上に転写させ、オデッセイ赤外線画像システム(LI-COR Biosciences、ネブラスカ州、米国)の製造業者の推奨事項に従って分析を実行した。ブロット膜をオデッセイ緩衝剤(ScienceTec、パリ、フランス)で1時間ブロッキングし、モノクローナル抗CFTR Mab24−1(1/1000)を使用してハイブリダイズさせた。タンパク質は、二次抗体(1/10000)とのインキュベーションによって可視化し、ECL技術(19)を使用して検出した。
免疫蛍光染色
ガラスカバースリップ上で培養したHeLa細胞を上述の通り、及びLipecka他(20)で説明の通りに処理した。細胞を4%のホルムアルデヒドで固定し、PBS中の0.1%のトリトンで透過化処理した。細胞をPBS/トリトン中の1%のウシ血清アルブミンでブロッキングし、一次抗体24−1(1:300)と共に4℃で一晩インキュベートした。洗浄し、5%の正常ヤギ血清でブロッキングした後、細胞を二次抗体と共にインキュベートした。ガラスカバースリップはVectashield封入剤(Vector Laboratories)を使用して封入し、共焦点レーザー顕微鏡(Zeiss、LSM510)で検査した。
ヨウ化物流出実験
CFTR塩化物チャンネルの活性を、以前の説明(21)通りに形質転換されたCHO細胞からのヨウ化物(125I)流出を測定することによって測定した。96ウェルのプレートで4日間培養した細胞を、137mMのNaCl、5.36mMのKCl、0.4mMのNaHPO、0.8mMのMgCl、1.8mMのCaCl、5.5mMのグルコース、及び10mMのHEPESを含むpH7.4の改変アール塩溶液2mlで2回洗浄した。次に、1mMのKIを含む同じ培地(1mCiのNa125I/ml、NEN Life Science Products)と共に37℃で30分細胞をインキュベートした。洗浄後、細胞を1mlの改変アール塩溶液と共にインキュベートした。1分後、培地を取り出してカウントし、1mlの同じ媒質と素早く交換した。この手順を1分毎に8分間繰り返した。最初の3つのアリコートを使用して、流出緩衝剤のみの安定したベースラインを確定した。CFTR塩化物チャンネルを活性化させるために、次のアリコートでは細胞内cAMPの増加を目的とするカクテル(10μMのフォースコリン及び30μMのゲニステイン)を含む培地を使用した。インキュベーションの最後に培地を回収し、細胞を1NのNaOH中で可溶化した。ガイガーカウンター(LKB)を使用して放射性を測定した。時間0における125I(cpm)の総カウントは、1分毎のサンプルでカウントしたcpmとNaOH画分のcpmとの合計として計算した。各時点で失われた当初の細胞内125Iの画分を求め、125I流出の時間依存係数をBecq他(22)に従って下式から計算した。
ln(125t1125t2)/(t−t
ここで、
125Itは、時間tにおける細胞内125Iであり、
及びtは、連続する時点である。
曲線は125Iの流出対時間の係数をプロットすることによって作成した。データはn個の別個の実験の平均値±標準誤差として表される。
差は、p値が0.05未満の場合、スチューデントのt検定を使用して統計的に有意と見なした。
全細胞パッチクランプ記録
全細胞構成のパッチクランプ記録法の技術は、他(23,24)で説明されている。安定トランスフェクト細胞を、倒立顕微鏡のステージに装着した35mmの細胞培養プラスチックペトリ皿に播種した。パッチクランプ実験は、ディジットデータ1440(digitdata 1440)インタフェース(Axon Intruments、米国)を介してコンピュータによって制御されたAxopatch 200A増幅器で室温にて実施した。Setterマイクロピペットプラーを使用して硬質ガラス(Kimax 51)からピペットを引き出し、その先端を熱加工した。ナイスタチン穿孔パッチクランプ構成を使用して、電流記録を実施した。ナイスタチン原液(50mg/ml)は、DMSO中で毎日調製した。原液を内部溶液で希釈し(1:250)、次にこれを1分間超音波処理した。内部溶液は、131mMのNaCl、2mMのMgCl、及び10mMのHepes−Naを含み、NaOHでpH7.3に調整した。浴液は150mMのNaCl、1mMのCaCl、1mMのMgCl、35mMの蔗糖及び10mMのHepes−Naを含み、NaOHでpH7.3に調整した。
電流は、0mVの保持電位から3秒の間隔で60mVの振幅の規則的電圧パルスを1秒間加えることにより記録した。
I−V曲線を確立するために、−100mVと+80mVの間の膜電位に向かって一連の9回の電圧ジャンプ(毎回1秒の継続時間)で、規則的電圧パルスを中断した。200μmの8−(4−クロロフェニルチオ)−cAMPナトリウム塩(CPT−cAMP)と100μMの3−イソブチル−1−メチルキサンチン(IBMX)でCFTR Cl−電流を活性化した。
最大刺激に到達すると、CPT−cAMP溶液に添加した5μMの特定のCFTR阻害剤、すなわちCFTRinh−172に細胞を浸漬した。CFTR電流とは、CPT−cAMPによる最大刺激中とCFTRinh−172による阻害後に記録された電流振幅の差と定義した。
鼻電位差(NPD)測定
鼻電位測定法は、発明者らが幼児のために開発した技術(25)を採用し、小型化したものである。ケタミン(133mg/kg;IMALGENE 1000、MERIAL、フランス)及びキシラジン(13.3mg/kg;Rompun 2%、BayerPharma、フランス)を腹腔内投与して、マウスに麻酔をかけた。マウスを45°傾斜した板上に位置決めし、マウスの殺傷を回避するために鼻の下に紙パッドを配置した。皮下注射針を寒天ブリッジでAg/AgCl基準電極に接続した。二腔管ポリエチレンカテーテル(直径0.5mm)を一方の鼻孔に深さ4mmで挿入した。リンゲル液(140mMのNaCl、6mMのKCl、10mMのHEPES、10mMの蔗糖、1mMのMgCl2、2mMのCaCl2で、NaOHでpH7.4に調整)を0.15mL/時で灌流した一方の腔管を、測定用Ag/AgCl電極に接続した。2つのAg/AgCl電極を高インピーダンス電圧計(LOGAN research Ltd、英国)に接続した。第2の腔管は以下のシーケンスで溶液を灌流した。すなわち(1)リンゲル液、(2)アミロライド(Naコンダクタンスの阻害剤、100μM)を含むリンゲル液、(3)Clコンダクタンスを明らかにする低塩化物リンゲル液(140mMのグルコン酸ナトリウム、6mMのグルコン酸カリウム、10mMのHepes、10mMの蔗糖、1mMのMgCl、6mMのグルコン酸カルシウムで、NaOHでpH7.4に調整)、(4)CFTRの関与を評価するCFTR阻害剤−172(5μM、Calbiochem、ドイツ)を含む低塩化物リンゲル液である。各溶液は少なくとも3分間灌流し、灌流を切り換える前に30秒間安定させる必要があった。定常状態の経上皮電位VTE、ΔVTEAmil(アミロライド含有溶液の灌流後に記録したVTEと経上皮電位との差)、ΔVTEamilLowCl(低Cl含有溶液とアミロライド含有溶液で灌流した後に記録したVTEと経上皮電位との差)、及びΔVTEamilLowClInh−172(VTEと以前の溶液にCFTR阻害剤を添加した後との差)は、安定中に記録した30の値の平均であった。
MTT細胞生存度アッセイ(26)
細胞生存度を測定するために、典型的なMTTアッセイを用いた。HeLa細胞を96ウェルのプレートで培養し、様々な濃度の本発明の化合物に24時間曝露した。洗浄後、次いでMTT溶液及び培地を導入した。インキュベーション後、その結果のホルマザン結晶をジメチルスルホキシド中で溶解させ、マイクロプレートリーダーで570nmの吸収強度を測定した。
生細胞中では黄色いMTTは紫のホルマザンに還元される。この染色溶液の吸収率は、分光光度計で特定の波長を測定することによって定量化することができる。この変換は、生(生)細胞の数に直接関連づけることができる。
仮想スクリーニング−修飾因子化合物の特定
ヒット源として仮想スクリーニングプロセスでは低分子量化合物のデータベースを使用した。分子ドッキングプログラムDock6.1を使用して、タンパク質表面上の2つの有望な結合部位内にある小分子の配座空間を検査した。その後、選択した全リガンド及び全錯体を分子力場中で十分に極小化した。各ステップで、有望な錯体の評価のために一組のスコアリング関数を使用し、適切な分子を実験用に選択した。
結果
ヨウ化物(I−)流出に対する薬剤の効果
ΔF508−CFTRの輸送及び機能の薬剤補正を検査するために、I流出技術を使用したロボットのセルベースの方法を使用した肉眼アッセイでハロゲン化物の透過性を評価した。第一系列の実験では、ΔF508−CFTRHeLa細胞を24時間、1μMの全化合物で前処理し、その後にcAMP依存性放射標識ヨウ化物流出を測定することによって、電位補正剤の効果を検査した。ポケット1の化合物130813及び118208、及びポケット2の73100及び407882で処理すると、cAMPで刺激された放射標識ヨウ化物流出が大幅に増加し(図1a)、407882が最も有効である。この低い用量(1μM)では、cAMPで刺激された流出の増加は、既知の補正剤ミグルスタット(27)を100μM使用して観察した増加量よりも少なかった。4つの活性化合物のそれぞれで処理した後のI流出刺激の例を図1bに示す。CFTRチャンネルブロッカーCFTRinh−172の存在下で実験を実施した場合、cAMPで刺激されたI流出は完全に阻止された。
4つの化合物の効果を広範囲の濃度でさらに検査し、1μMのポケット1の化合物130813、及びそれぞれ10μM及び844nMのポケット2の2つの化合物407882及び73100についてEC50を測定した(図1c)。ポケット1の118208のEC50は、100μMでも最大ヨウ化物流出に到達していなかったので、厳密に測定できなかった(図1d)。化合物407882の効果は、10μMで使用した場合、3倍に増加することがあり、WT−CFTRで観察された値に匹敵する刺激流出に到達することは注目に値する(図2)。
CFTR輸送に対する効果に関係なく、化合物が増強活性を有するか否かを検査するために、未処理WT−CFTRHeLa細胞中にヨウ化物流出を試験した。フォースコリンとともに化合物を添加し、その効果をフォースコリンのみ又はフォースコリンとゲニステインとの場合と比較した。ゲニステインと異なり、検査したすべての分子はフォースコリンのみの場合より多くのI流出を誘導した(図2)。ΔF508−CFTRを救済するために、ミグルスタットで2時間処理したΔF508−CFTRHeLa細胞で、増強作用も検査した。I流出を、フォースコリンのみ、フォースコリンとゲニステイン、又はフォースコリンと別の化合物で刺激した。図3に示すように、ゲニステインのみが流出を増加させることができ、本発明の薬剤に増強活性がないことが実証された。
CFTRの成熟に対する薬剤の効果
ΔF508−CFTR輸送の補正剤としての4つの化合物の有効性を、免疫ブロットでさらに確認した。十分にグリコシル化したバンドCが検出された場合、これがΔF508−CFTRの適切なプロセッシングを示唆すると仮定した。代表的な免疫ブロットを図4aに示す。抗CFTR抗体がWT−CFTR細胞に由来するタンパク質の2つのバンド(図4aのWT−CFTRの列)を検出する。約170kDaの拡散バンド(バンドC)は、ゴルジ装置を通してプロセッシングされた十分にグリコシル化した成熟タンパク質に相当する。約145kDaより下のバンドは、小胞体中に局在する中心がグリコシル化した未成熟のタンパク質に相当する。ΔF508−CFTR発現細胞では、未成熟タンパク質のみが検出可能である(図4aのΔF508の列)。バンドCは、未処理細胞と比較して1μMの化合物407882で処理した細胞で明白に検出可能であり、170kDaの信号は、1μMの化合物118208又は130813で処理した細胞のDMSO処理との違いがなかった、又は1μMの化合物73100で処理した細胞で非常にわずかに増加した。化合物はいずれもタンパク質の総発現量を変化させなかった。バンドC+バンドBに対するバンドCの比率として表現される成熟CFTRの相対的存在量を図4bに示す。化合物407882のみが、成熟CFTRの相対的存在量を大幅に増加させた。
CFTR免疫局在決定における薬剤の効果
図4cは、WT−CFTR発現HeLa細胞の細胞膜における典型的なCFTR染色を示し、ΔF508−CFTRは細胞質全体に見られた。1μMの407882で細胞を24時間処理した結果、細胞膜で、又はその付近でCFTRが明白に染色され、ΔF508−CFTR輸送の救済が免疫ブロット実験と合致することを示す。細胞を3つの他の化合物118208、73100又は130813のそれぞれで処理した場合、図4cの化合物118208で示すように、細胞のごく一部分で細胞膜が点々状に断続的に染色されていることが観察された。
様々なポケットに結合した化合物の複合効果
2つの化合物が同じタンパク質配座であるが異なる表面腔に結合することによってΔF508−CFTRを補正することができる場合、その効果は相加的又は相乗的になり得る。2つの独立型のアッセイ、すなわちヨウ化物流出とパッチクランプによって、この仮説を検査した。ヨウ化物透過性検査の結果(図5)は、それぞれ1μMの化合物118208と407882(図5a)又は118208と73100(図5b)で細胞を複合処理すると、いずれかの分子のみで観察された結果よりcAMP依存性陰イオン流出が多くなることを示した。この系列の実験では、コントロールとして化合物37173(図5c)を使用した。何故なら、同じ濃度でcAMPで刺激したヨウ化物流出を全く誘導しなかったからである。図5に示すように、ΔF508−CFTRHeLa細胞を37173と407882で同時処理すると、407882処理のみと同様の振幅でcAMPで刺激したヨウ化物流出を誘導した。対照的に、化合物118208及び407882での同時処理は、各化合物によって誘導された流出の合計に等しい振幅のヨウ化物流出を誘導するが、118208と73100で処理した後は、わずかな相乗効果が観察された。
様々な化合物の活性を、パッチクランプ実験でも評価した。図6aは、様々な実験条件で−60mVにて記録した電流振幅の平均値をまとめたものである。CFTR関連電流密度(IΔF508−CFTR;pA/pF)は、cAMPで刺激した電流から、5μMのCFTRinh−172で阻害し、細胞のキャパシタンスまで正常化した後に記録した電流を引いた値と定義される。IΔF508−CFTRは未処理細胞中では非常に低く、記録前に細胞を27℃で24時間培養した場合は約3倍刺激された。細胞を1μMの118208、407882又は73100のみで24時間処理しても、個々のコントロールと比較して、電流振幅は増加しなかった(データは図示せず)。しかし、1μMの118208と407882又は118208と73100で24時間前処理すると、IΔF508−CFTRが有意な増加を示した。cptcAMP+IBMXが存在する状態で刺激する前、及びCFTRinh−172で阻害した後に118208と407882で前処理した細胞の線形I/Vプロットの例を図6bに示す。
CF−4KM細胞に対する407882及び118208の効果
次に、少量の内在性ΔF508−CFTRを発現しているΔF508−CF患者(CF−KM4)由来の上皮漿液細胞株中のCFTR依存ヨウ化物流出に対するHeLa細胞中で活性の4つの分子の効果を検査した。これらの上皮細胞では、化合物407882及び118208がなお大量のcAMP依存ヨウ化物流出を誘導することができた(図7)。しかし、HeLa細胞中でΔF508−CFTRを補正する2つの分子(130813及び73100)は、この細胞株では活性でなかったことに留意されたい。
ΔF508マウスの鼻電位差に対する73100と118208の効果
細胞での結果は、別々のポケットに作用する分子対が追加の補正効果を示すことを示唆している。これらの分子が生体内で活性であるか否かを検査するために、リポソームに(5:1で)組み込んだ30μlの73100と118208(それぞれ、0.1μモル)で、又はリポソームのみで24時間鼻腔内処理したΔF508/ΔF508マウスで、鼻電位差(ΔVTE)を観察した(25)。得られた結果を図8にまとめた。ΔF508マウスでは、ベースのVTE値、及び100μMのアミロライドで鼻上皮を灌流することによって誘導されたΔVTEの変化ΔVTEamilが、2種類の分子で、又はリポソームのみで処理したマウスと同様であった。対照的に、マウス5匹中3匹での低Cl溶液の灌流は、VTEを2mV(ΔVTEamil−lowCl)、すなわち処理の有意の効果として発明者らが規定した閾値より大きく過分極化した(原稿は準備中)。CFTR阻害剤IInh172によって明らかとなったCFTR関連電流は、(ΔVTEamil−lowCl)の約30%を表す(データは開示せず)。
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Claims (8)

  1. 一般式(I)の化合物、
    そのE及びZ幾何異性体、鏡像異性体やジアステレオ異性体を含む光学活性体、及びそれらのラセミ体又は立体異性体の混合物又はその薬学的に許容可能な塩又はその錯体であって、
    ここで、Zは、分岐状又は非分岐状でnが1から5までの整数である−C(2n)−、分岐状又は非分岐状でnが2から5までの整数であるE又はZ幾何異性体の−C(2n−2)−からなる群から独立に選択され、
    ここで、R及びRは、芳香族環又は複素芳香族環からなる群から独立に選択され、
    嚢胞性線維症を治療するための薬物を製造するために使用される、変異CFTRタンパク質の修飾
  2. 及びRは、部分式(Ia)の群から独立に選択され、
    ここで、A、A、A、A、A、Aは、独立に選択されるN又はC原子であり、ここで、環は、0〜3個の窒素原子を含み、
    ここで、E、E、E、E、Eは、任意の置換基を表し、−CF、−CHF、−CHF、−NH、−F、Cl、−Br、−I、−PO、−OPO、分岐状又は非分岐状でnが1から5までの整数である−C2n、分岐状又は非分岐状でnが2から5までの整数であるE又はZ幾何異性体の−C(2n−2)、分岐状又は非分岐状でnが2から5までの整数である−C(2n−4)から選択され、
    ここで、Rは、−H、低級アルキル基、−CN、−CF、−CHF、−CHF、−CHCl、−CHBr、−CHI、−F、−Cl、−Br、−I、−NHからなる群から独立に選択される、請求項1に記載の修飾剤
  3. 前記化合物は、以下の構造
    で表される、請求項1又は2に記載の修飾剤
  4. 変異CFTRタンパク質に影響を及ぼし、ここで、前記CFTR変異は、ΔF508−CFTR変異、又はクラスIIの別の変異であり、ΔF508−CFTR変異、又はクラスIIの別の変異は、CFTRタンパク質機能不全に関与する、請求項1又は2又は3に記載の修飾剤
  5. CFTRタンパク質機能不全に関連する前記病気は、嚢胞性線維症である、請求項4に記載の修飾剤
  6. 細胞膜を横断するCFTR依存性イオン輸送に影響を与え、及び/又は前記細胞表面に到達する変異CFTRタンパク質の数を増加する能力を有する、請求項1に記載の修飾
  7. 前記変異CFTRタンパク質の前記構造に対する安定効果を有し、及び/又は変異CFTRの成熟前分解に関与する細胞タンパク質との相互作用を遮断する、請求項1に記載の修飾
  8. 変異CFTRタンパク質に影響を及ぼし、ここで、前記CFTR変異は、ΔF508−CFTR変異、又はクラスIIの別の変異である、請求項1に記載の修飾
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