JP5926487B2 - Method for treating cancer resistant to ErbB therapy - Google Patents

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Description

関連出願
この出願は、２００７年４月１３日に出願された、米国仮出願第６０／９２３，３８４号（上記出願は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。 This application claims the benefit of US Provisional Application No. 60 / 923,384, filed Apr. 13, 2007, which is hereby incorporated by reference in its entirety. .

政府支援
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた、認可番号ＲＯ１ＣＡ１１４４６５およびＫ０８ＣＡ１２００６０−０１下の政府支援で行われた。政府は、本発明において、ある一定の権利を有する。 Government Support This invention was made with government support under grant numbers RO1CA114465 and K08CA120060-01 awarded by the National Institutes of Health. The government has certain rights in this invention.

肺癌は、癌による死の主要原因であり、世界中のすべての死の３分の１を占める。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、すべての組織型（ｈｉｓｔｏｔｙｐｅ）の肺癌の約７５〜８５％を占め、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）が残りを占める。大規模な前臨床的および臨床的研究にもかかわらず、ＮＳＣＬＣを有する患者についての全体的な予後は、依然として乏しいままであり、５年生存率はわずかに１４％である。   Lung cancer is the leading cause of cancer death and accounts for one third of all deaths worldwide. Non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for approximately 75-85% of all histotype lung cancers, and small cell lung cancer (SCLC) accounts for the rest. Despite extensive preclinical and clinical studies, the overall prognosis for patients with NSCLC remains poor with a 5-year survival rate of only 14%.

近年、細胞形質転換の基礎をなす分子機構および癌の発症に関する知見は、大いに拡大している。肺癌を含めた様々な癌に関与する、ＥｒｂＢ受容体などのチロシンキナーゼ受容体を標的にする治療剤が発見された。特に、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ受容体を標的にする薬剤が開発された。ＥＧＦＲ−チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）ＺＤ１８３９（Ｉｒｅｓｓａ（商標））およびエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標））を含めた、小分子ＥＧＦＲ標的療法は、良好な最初の臨床的結果を示したが、腫瘍細胞は、時間ととともに耐性を発生させることが多く、治療に対して非応答性となる場合がある。   In recent years, the knowledge about the molecular mechanisms underlying cancer transformation and the development of cancer has greatly expanded. Therapeutic agents that target tyrosine kinase receptors, such as ErbB receptors, have been discovered that are involved in various cancers, including lung cancer. In particular, drugs that target epidermal growth factor receptor (EGFR) and ErbB receptor have been developed. Small molecule EGFR targeted therapy, including EGFR-tyrosine kinase inhibitor (TKI) ZD1839 (Iressa ™) and erlotinib (Tarceva ™) showed good initial clinical results, but tumor cells Often, tolerance develops over time and may become unresponsive to treatment.

従来のＴＫＩ療法に対して応答性でない、ＮＳＣＬＣなどの癌に罹患している患者を治療するための新規の手法が必要とされている。   There is a need for new approaches to treat patients suffering from cancers such as NSCLC that are not responsive to conventional TKI therapy.

一態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療に耐性である癌に罹患している対象を治療するための方法であって、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。   In one aspect, the invention provides a method for treating a subject suffering from a cancer that is resistant to treatment with an anti-ErbB therapeutic, comprising administering an anti-ErbB therapeutic and an anti-MET therapeutic to the subject A method comprising the steps of:

ある特定の実施形態では、癌は、例えば、肺癌、脳の癌（ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌、頭頸部癌、大腸癌、卵巣癌、胃癌、または膵癌とすることができる。例示的な実施形態では、癌は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。   In certain embodiments, the cancer can be, for example, lung cancer, brain cancer, breast cancer, head and neck cancer, colon cancer, ovarian cancer, gastric cancer, or pancreatic cancer. In an exemplary embodiment, the cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC).

ある特定の実施形態では、対象は、ＥｒｂＢ活性化突然変異または遺伝子増幅（例えば、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４活性化突然変異または遺伝子増幅）を有する場合がある。ある特定の実施形態では、対象は、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有する場合がある。ある特定の実施形態では、対象は、ＥｒｂＢ活性化突然変異または遺伝子増幅と、ＭＥＴ活性化突然変異または遺伝子増幅の両方を有する場合がある。   In certain embodiments, the subject may have an ErbB activating mutation or gene amplification (eg, an EGFR, ErbB2, ErbB3, or ErbB4 activating mutation or gene amplification). In certain embodiments, the subject may have a MET activating mutation or MET gene amplification. In certain embodiments, the subject may have both an ErbB activating mutation or gene amplification and a MET activating mutation or gene amplification.

ある特定の実施形態では、癌は、以下の抗ＥｒｂＢ治療剤の１つまたは複数を用いた治療に耐性である場合がある：抗ＥＧＦＲ治療剤、抗ＥｒｂＢ２治療剤、抗ＥｒｂＢ３治療剤、または抗ＥｒｂＢ４治療剤。癌が耐性である抗ＥｒｂＢ治療剤は、例えば、小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤である場合がある。ある特定の実施形態では、癌は、抗ＥｒｂＢ抗体、ＥｒｂＢ遺伝子を標的にしたｓｉＲＮＡ、またはＥｒｂＢキナーゼ阻害剤を用いた治療に耐性となり得る。例示的な実施形態では、癌は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に用いた治療に耐性である。ある特定の実施形態では、癌は、以下の抗ＥＧＦＲ治療剤の１つまたは複数を用いた治療に耐性である：ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ＢＩＢＷ２９９２、ＺＤ６４７４、ＡＶ−４１２、ＥＸＥＬ−７６４７、ＨＫＩ−２７２、セツキシマブ、パンチヌムマブ（ｐａｎｔｉｎｕｍｕｍａｂ）、またはトラスツズマブ。   In certain embodiments, the cancer may be resistant to treatment with one or more of the following anti-ErbB therapeutics: anti-EGFR therapeutics, anti-ErbB2 therapeutics, anti-ErbB3 therapeutics, or anti-ErbB3 therapeutics ErbB4 therapeutic agent. An anti-ErbB therapeutic that is resistant to cancer can be, for example, a small molecule therapeutic, a nucleic acid therapeutic, or a protein therapeutic. In certain embodiments, the cancer can be resistant to treatment with an anti-ErbB antibody, an siRNA targeted to the ErbB gene, or an ErbB kinase inhibitor. In an exemplary embodiment, the cancer is resistant to treatment with an EGFR kinase inhibitor. In certain embodiments, the cancer is resistant to treatment with one or more of the following anti-EGFR therapeutics: gefitinib, erlotinib, lapatinib, PF00299804, CI-1033, EKB-569, BIBW2992, ZD6474, AV-412, EXEL-7647, HKI-272, cetuximab, pantinumumab, or trastuzumab.

ある特定の実施形態では、以下の抗ＥｒｂＢ治療剤の１つまたは複数を、対象に投与する：抗ＥＧＦＲ治療剤、抗ＥｒｂＢ２治療剤、抗ＥｒｂＢ３治療剤、または抗ＥｒｂＢ４治療剤。対象に投与するのに適した抗ＥｒｂＢ治療剤には、例えば、小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤が含まれる。例示的な実施形態では、以下の抗ＥＧＦＲ治療剤の１つまたは複数を対象に投与する：ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ＢＩＢＷ２９９２、ＺＤ６４７４、ＡＶ−４１２、ＥＸＥＬ−７６４７、ＨＫＩ−２７２、セツキシマブ、パンチヌムマブ、またはトラスツズマブ。   In certain embodiments, one or more of the following anti-ErbB therapeutics are administered to the subject: an anti-EGFR therapeutic agent, an anti-ErbB2 therapeutic agent, an anti-ErbB3 therapeutic agent, or an anti-ErbB4 therapeutic agent. Suitable anti-ErbB therapeutics for administration to a subject include, for example, small molecule therapeutics, nucleic acid therapeutics, or protein therapeutics. In exemplary embodiments, one or more of the following anti-EGFR therapeutics is administered to the subject: gefitinib, erlotinib, lapatinib, PF00299804, CI-1033, EKB-569, BIBW2992, ZD6474, AV-412, EXEL- 7647, HKI-272, cetuximab, pantinumumab, or trastuzumab.

ある特定の実施形態では、以下の抗ＭＥＴ治療剤の１つまたは複数を対象に投与する：小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤。例示的な実施形態では、以下の抗ＭＥＴ治療剤の１つまたは複数を対象に投与する：ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＳＵ５４１６、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２、またはＯＡ−５Ｄ５。   In certain embodiments, one or more of the following anti-MET therapeutics are administered to the subject: a small molecule therapeutic, a nucleic acid therapeutic, or a protein therapeutic. In exemplary embodiments, one or more of the following anti-MET therapeutics is administered to the subject: PHA-665,752, SU11274, SU5416, PF-02341066, XL-880, MGCD265, XL184, ARQ197, MP- 470, SGX-523, JNJ38887705, AMG102, or OA-5D5.

ある特定の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を対象に同時に投与する。抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤は、同時製剤（ｃｏｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）として対象に投与することができる。   In certain embodiments, the anti-ErbB therapeutic and the anti-MET therapeutic are administered to the subject simultaneously. The anti-ErbB therapeutic agent and the anti-MET therapeutic agent can be administered to the subject as a coformation.

ある特定の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療に耐性である癌に罹患している患者を治療するための方法は、少なくとも１つの追加の治療を前記対象に施すステップをさらに含むことができる。例示的な治療には、例えば、追加の治療剤の投与、照射、光ダイナミック療法、レーザー療法、または手術が含まれる。   In certain embodiments, the method for treating a patient suffering from a cancer that is resistant to treatment with an anti-ErbB therapeutic further comprises the step of applying at least one additional treatment to the subject. Can do. Exemplary treatments include, for example, administration of additional therapeutic agents, irradiation, photodynamic therapy, laser therapy, or surgery.

ある特定の実施形態では、治療される対象は、哺乳動物、例えば、ヒトなどとすることができる。   In certain embodiments, the subject to be treated can be a mammal, such as a human.

別の態様では、本発明は、ＥｒｂＢ活性化突然変異またはＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している対象を治療するための方法であって、この対象は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療に対する耐性を発生しており、この対象がＭＥＴ活性および／またはレベルの上昇（例えば、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅）を有するかどうかを判定するステップと、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有する対象に、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を投与するステップとを含む方法を提供する。   In another aspect, the invention provides a method for treating a subject suffering from a cancer associated with an ErbB activating mutation or ErbB gene amplification, wherein the subject is treated with an anti-ErbB therapeutic agent. Determining whether the subject has developed resistance to MET and has increased MET activity and / or levels (eg, MET activating mutation or MET gene amplification), and MET activating mutation or MET gene Administering an anti-ErbB therapeutic agent and an anti-MET therapeutic agent to a subject having amplification.

別の態様では、本発明は、ＥｒｂＢ活性化突然変異またはＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している対象を治療するための方法であって、（ｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて治療されている対象をモニターすることによって、この患者が、ＭＥＴレベルおよび／または活性の上昇（例えば、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅）を発生させるかどうかを判定するステップと、（ｉｉ）この対象が、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を発生させている場合、この対象の治療レジメンを修正することによって、抗ＥｒｂＢ治療剤に加えて抗ＭＥＴ治療剤を含めるステップとを含む方法を提供する。   In another aspect, the invention provides a method for treating a subject suffering from a cancer associated with an ErbB activating mutation or ErbB gene amplification, wherein (i) the subject is treated with an anti-ErbB therapeutic agent. Determining whether the patient develops an increase in MET levels and / or activity (eg, a MET-activating mutation or MET gene amplification) by monitoring the subject, (ii) the subject Including generating an MET therapeutic agent in addition to the anti-ErbB therapeutic agent by modifying the subject's therapeutic regimen when generating a MET activating mutation or MET gene amplification. .

別の態様では、本発明は、ＥｒｂＢ活性化突然変異またはＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している対象を治療するための方法であって、（ｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて治療されている対象をモニターすることによって、この対象が阻害剤に対する耐性を発生させるかどうかを判定するステップと、（ｉｉ）この対象を検査することによって、この対象が、ＭＥＴレベルおよび／または活性の上昇（ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅など）を有するかどうかを判定するステップと、（ｉｉｉ）この対象が、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有する場合、この対象の治療レジメンを修正することによって、抗ＥｒｂＢ治療剤に加えて抗ＭＥＴ治療剤を含めるステップとを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＭＥＴレベルおよび／または活性が上昇している患者は、ＨＧＦレベルおよび／または活性も上昇している。   In another aspect, the invention provides a method for treating a subject suffering from a cancer associated with an ErbB activating mutation or ErbB gene amplification, wherein (i) the subject is treated with an anti-ErbB therapeutic agent. Determining whether the subject develops resistance to the inhibitor by monitoring the subject, and (ii) increasing the MET level and / or activity by examining the subject Determining whether it has (such as a MET activating mutation or MET gene amplification) and (iii) if the subject has a MET activating mutation or MET gene amplification, modify the treatment regimen of the subject Thereby including an anti-MET therapeutic agent in addition to the anti-ErbB therapeutic agent. In certain embodiments, patients with increased MET levels and / or activity also have increased HGF levels and / or activity.

別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤を評価するための方法であって、（ｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて治療されている対象の集団をモニターすることによって、治療剤に対する耐性を発生させる対象を特定するステップと、（ｉｉ）耐性の対象を検査することによって、この対象が、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有するかどうかを判定するステップと、（ｉｉｉ）この対象が、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有する場合、この対象の治療レジメンを修正することによって、抗ＥｒｂＢ治療剤に加えて抗ＭＥＴ治療剤を含めるステップとを含む方法を提供する。   In another aspect, the present invention is a method for evaluating an anti-ErbB therapeutic, comprising: (i) resistance to a therapeutic by monitoring a population of subjects being treated with the anti-ErbB therapeutic. Identifying a subject that develops; (ii) determining whether the subject has a MET-activating mutation or MET gene amplification by examining the resistant subject; and (iii) the subject. Including a MET activating mutation or a MET gene amplification, the method comprises modifying the subject's treatment regimen to include an anti-MET therapeutic agent in addition to the anti-ErbB therapeutic agent.

別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中のＥｒｂＢリン酸化を低減するための方法であって、この細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＥｒｂＢはＥｒｂＢ−３とすることができ、抗ＥｒｂＢ治療剤は、抗ＥｒｂＢ−３治療剤とすることができる。   In another aspect, the present invention is a method for reducing ErbB phosphorylation in cancer cells that has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic and comprises a MET activating mutation or MET gene amplification comprising: There is provided a method comprising contacting a cell with an anti-MET therapeutic and an anti-ErbB therapeutic. In certain embodiments, ErbB can be ErbB-3 and the anti-ErbB therapeutic agent can be an anti-ErbB-3 therapeutic agent.

別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中のＰＩ３Ｋ媒介シグナル伝達を低減するための方法であって、この細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法を提供する。   In another aspect, the present invention is a method for reducing PI3K-mediated signaling in cancer cells that has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic and comprises a MET activating mutation or MET gene amplification comprising: A method is provided comprising contacting the cell with an anti-MET therapeutic and an anti-ErbB therapeutic.

別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中のＥｒｂＢ媒介シグナル伝達を低減するための方法であって、この細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法を提供する。   In another aspect, the present invention is a method for reducing ErbB mediated signaling in cancer cells that has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic and comprises a MET activating mutation or MET gene amplification comprising: A method is provided comprising contacting the cell with an anti-MET therapeutic and an anti-ErbB therapeutic.

別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞の、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する感受性を回復させるための方法であって、この細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法を提供する。   In another aspect, the invention is a method for restoring sensitivity of an anti-ErbB therapeutic to a cancer cell that has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic and contains a MET activating mutation or MET gene amplification. A method comprising contacting the cell with an anti-MET therapeutic agent and an anti-ErbB therapeutic agent.

別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞の成長または増殖を低減するための方法であって、この細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法を提供する。   In another aspect, the present invention provides a method for reducing the growth or proliferation of cancer cells that have acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic agent and that comprise a MET activating mutation or MET gene amplification comprising: Contacting with an anti-MET therapeutic agent and an anti-ErbB therapeutic agent.

別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞のアポトーシスを増大させるための方法であって、この細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法を提供する。   In another aspect, the present invention is a method for increasing apoptosis of cancer cells that have acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic and includes MET activating mutations or MET gene amplification, wherein A method comprising contacting with a MET therapeutic agent and an anti-ErbB therapeutic agent is provided.

別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞の、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を低減するための方法であって、この細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法を提供する。   In another aspect, the present invention is a method for reducing resistance of an anti-ErbB therapeutic to a cancer cell that has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic and comprises a MET activating mutation or MET gene amplification. A method comprising contacting the cell with an anti-MET therapeutic agent and an anti-ErbB therapeutic agent.

別の態様では、本発明は、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中の、獲得された抗ＥｒｂＢ治療剤耐性を治療するための方法であって、この細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法を提供する。   In another aspect, the invention provides a method for treating acquired anti-ErbB therapeutic resistance in a cancer cell comprising a MET activating mutation or MET gene amplification, wherein the cell is treated with an anti-MET therapeutic agent. And a method comprising contacting with an anti-ErbB therapeutic.

ある特定の実施形態では、癌細胞は哺乳動物癌細胞、例えば、ヒト癌細胞などである。癌細胞は、細胞株または一次組織試料由来であってもよい。ある特定の実施形態では、癌細胞は、肺癌細胞、脳の癌細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、大腸癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、または膵癌細胞とすることができる。ある特定の実施形態では、癌細胞は、任意のＥｒｂＢ誘導性癌とすることができる。ある特定の実施形態では、癌細胞の成長および／または生存は、ＥｒｂＢによって促進される。ある特定の実施形態では、癌細胞は、ＥｒｂＢ活性化突然変異、例えば、ＥＧＦＲ活性化突然変異などを含むことができる。ある特定の実施形態では、癌細胞は、ＥｒｂＢ遺伝子増幅、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子増幅などを含むことができる。ある特定の実施形態では、ＥｒｂＢ遺伝子増幅および／またはＭＥＴ増幅は、少なくとも２倍である。   In certain embodiments, the cancer cell is a mammalian cancer cell, such as a human cancer cell. Cancer cells may be derived from cell lines or primary tissue samples. In certain embodiments, the cancer cells can be lung cancer cells, brain cancer cells, breast cancer cells, head and neck cancer cells, colon cancer cells, ovarian cancer cells, gastric cancer cells, or pancreatic cancer cells. In certain embodiments, the cancer cell can be any ErbB-induced cancer. In certain embodiments, cancer cell growth and / or survival is promoted by ErbB. In certain embodiments, the cancer cell can comprise an ErbB activating mutation, such as an EGFR activating mutation. In certain embodiments, the cancer cells can include ErbB gene amplification, such as EGFR gene amplification. In certain embodiments, ErbB gene amplification and / or MET amplification is at least 2-fold.

ある特定の実施形態では、癌細胞は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性の増大に関連するＥｒｂＢ遺伝子突然変異、例えば、ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ突然変異などを含む。   In certain embodiments, the cancer cell comprises an ErbB gene mutation associated with increased resistance to an anti-ErbB therapeutic, such as the EGFR T790M mutation.

ある特定の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤は、抗ＥＧＦＲ治療剤、抗ＥｒｂＢ２治療剤、抗ＥｒｂＢ３治療剤、または抗ＥｒｂＢ４治療剤からなる群から選択される。抗ＥｒｂＢ治療剤は、小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤とすることができる。ある特定の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤は、抗体、アンチセンス分子、または小分子キナーゼ阻害剤である。例示的な実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ＢＩＢＷ２９９２、ＺＤ６４７４、ＡＶ−４１２、ＥＸＥＬ−７６４７、ＨＫＩ−２７２、セツキシマブ、パンチヌムマブ、またはトラスツズマブからなる群から選択されるＥＧＦＲキナーゼ阻害剤である。例示的な実施形態では、抗ＥｒｂＢタンパク質治療剤は、セツキシマブ、パニツムマブ、およびトラスツズマブからなる群から選択される抗ＥＧＦＲ抗体である。例示的な実施形態では、抗ＥｒｂＢ核酸治療剤はｓｉＲＮＡ分子である。   In certain embodiments, the anti-ErbB therapeutic is selected from the group consisting of an anti-EGFR therapeutic, an anti-ErbB2 therapeutic, an anti-ErbB3 therapeutic, or an anti-ErbB4 therapeutic. The anti-ErbB therapeutic can be a small molecule therapeutic, a nucleic acid therapeutic, or a protein therapeutic. In certain embodiments, the anti-ErbB therapeutic is an antibody, an antisense molecule, or a small molecule kinase inhibitor. In exemplary embodiments, the anti-ErbB therapeutic agent is gefitinib, erlotinib, lapatinib, PF00299804, CI-1033, EKB-569, BIBW2992, ZD6474, AV-412, EXEL-7647, HKI-272, cetuximab, pantinumumab, or An EGFR kinase inhibitor selected from the group consisting of trastuzumab. In an exemplary embodiment, the anti-ErbB protein therapeutic is an anti-EGFR antibody selected from the group consisting of cetuximab, panitumumab, and trastuzumab. In an exemplary embodiment, the anti-ErbB nucleic acid therapeutic is a siRNA molecule.

ある特定の実施形態では、抗ＭＥＴ治療剤は、小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤である。例示的な実施形態では、抗ＭＥＴ治療剤は、ＭＥＴに対する抗体、または肝細胞成長因子（ＨＧＦ）に対する抗体である。例示的な実施形態では、抗ＭＥＴ治療剤は、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＳＵ５４１６、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２、またはＯＡ−５Ｄ５である。例示的な実施形態では、抗ＭＥＴ治療剤はｓｉＲＮＡ分子である。   In certain embodiments, the anti-MET therapeutic is a small molecule therapeutic, a nucleic acid therapeutic, or a protein therapeutic. In an exemplary embodiment, the anti-MET therapeutic is an antibody against MET or an antibody against hepatocyte growth factor (HGF). In exemplary embodiments, the anti-MET therapeutic agent is PHA-665,752, SU11274, SU5416, PF-02341066, XL-880, MGCD265, XL184, ARQ197, MP-470, SGX-523, JNJ38887705, AMG102, or OA-5D5. In an exemplary embodiment, the anti-MET therapeutic is an siRNA molecule.

ある特定の実施形態では、細胞を抗ＭＥＴ治療剤およびＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップは、少なくとも１つの追加の治療様式を含む治療レジメンの一部であり、例えば、少なくとも１つの追加の治療様式は、前記細胞を１つまたは複数の追加の治療剤と接触させること、照射、光ダイナミック療法、レーザー療法、および手術からなる群から選択される。   In certain embodiments, the step of contacting the cell with an anti-MET therapeutic and an ErbB therapeutic is part of a treatment regimen that includes at least one additional treatment modality, for example, at least one additional treatment modality is Contacting the cells with one or more additional therapeutic agents, selected from the group consisting of irradiation, photodynamic therapy, laser therapy, and surgery.

別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて治療されており、前記抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得した癌に罹患している対象を、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を用いて治療するための候補として特定するための方法であって、前記対象由来の癌細胞中のＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を検出するステップを含む方法を提供する。   In another aspect, the present invention provides a method for treating a subject suffering from a cancer that has been treated with an anti-ErbB therapeutic agent and has acquired resistance to the anti-ErbB therapeutic agent, with an anti-ErbB therapeutic agent and an anti-MET therapeutic agent. A method for identifying as a candidate for treatment using, comprising detecting a MET activating mutation or MET gene amplification in a cancer cell from said subject is provided.

別の態様では、本発明は、抗ＭＥＴ治療剤を特定するための方法であって、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得し、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞を、抗ＥｒｂＢ治療剤および試験化合物と接触させるステップと、抗ＥｒｂＢ治療剤のみと接触させた同じ細胞中の細胞の過程（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｃｅｓｓ）と比較した、ＥｒｂＢリン酸化の減少、ＭＥＴリン酸化の減少、ＥｒｂＢ−ＭＥＴ会合（ＥｒｂＢ−ＭＥＴ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の減少、ＥＧＦＲリン酸化の減少、ＡＫＴリン酸化の減少、細胞成長の減少、細胞増殖の減少、およびアポトーシスの増大からなる群から選択される前記細胞の過程の変化を検出するステップとを含む方法を提供する。   In another aspect, the present invention provides a method for identifying an anti-MET therapeutic agent, wherein the cancer cell has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic agent and comprises a MET activating mutation or MET gene amplification. Reducing ErbB phosphorylation, reducing MET phosphorylation, ErbB-MET, as compared to contacting the therapeutic agent and a test compound with a cellular process in the same cell contacted with the anti-ErbB therapeutic alone A change in the process of said cells selected from the group consisting of reduced association (ErbB-MET association), reduced EGFR phosphorylation, reduced AKT phosphorylation, decreased cell growth, decreased cell proliferation, and increased apoptosis. And detecting.

別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて治療されており、前記抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得するリスクのある対象を特定するための方法であって、前記対象由来の癌細胞中のＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅の存在を検出するステップを含み、前記ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅の存在が、前記耐性を獲得するリスクを示す方法を提供する。   In another aspect, the invention provides a method for identifying a subject that has been treated with an anti-ErbB therapeutic and is at risk of acquiring resistance to said anti-ErbB therapeutic, comprising: Detecting the presence of a MET activating mutation or MET gene amplification in a cell, wherein the presence of the MET activating mutation or MET gene amplification provides a method for indicating the risk of acquiring said resistance.

別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得した細胞を作製するための方法であって、抗ＥｒｂＢ治療剤に感受性である細胞を、少なくとも１つの抗ＥｒｂＢ治療剤と少なくとも４週間接触させるステップと、前記抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得する細胞を特定するステップとを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、細胞は、前記抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を付与するＥｒｂＢ遺伝子中に突然変異を含まない。   In another aspect, the present invention provides a method for making a cell that has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic agent, wherein the cell sensitive to the anti-ErbB therapeutic agent is treated with at least one anti-ErbB therapeutic agent and at least 4 There is provided a method comprising the steps of weekly contacting and identifying cells that acquire resistance to the anti-ErbB therapeutic. In certain embodiments, the cell does not contain a mutation in the ErbB gene that confers resistance to the anti-ErbB therapeutic.

別の態様では、本発明は、本明細書に提供される方法によって作製される細胞を提供する。例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得した細胞を提供する。   In another aspect, the present invention provides a cell produced by the methods provided herein. For example, cells that have acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic are provided.

別の態様では、本願は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療に耐性である癌に罹患している対象を治療するための方法であって、この対象に、抗ＥｒｂＢ治療剤、およびＭＥＴのＨＧＦ媒介活性化を阻害する薬剤を投与するステップを含む方法を提供する。ＭＥＴのＨＧＦ媒介活性化を阻害する薬剤は、例えば、ＨＧＦがＭＥＴに結合するのを妨げる抗体、例えば、抗ＨＧＦ抗体または抗ＭＥＴ抗体とすることができる。   In another aspect, the present application provides a method for treating a subject suffering from a cancer that is resistant to treatment with an anti-ErbB therapeutic comprising the subject comprising an anti-ErbB therapeutic, and MET HGF. A method comprising administering an agent that inhibits mediated activation is provided. An agent that inhibits HGF-mediated activation of MET can be, for example, an antibody that prevents HGF from binding to MET, such as an anti-HGF antibody or an anti-MET antibody.

別の態様では、本開示は、ＥＧＦＲのエクソン１９中の欠失およびＭＥＴ遺伝子増幅を含む細胞または細胞株を提供する。ある特定の実施形態では、細胞または細胞株は、哺乳動物細胞または細胞株、例えば、ヒト細胞または細胞株などである。ある特定の実施形態では、細胞または細胞株は、上皮細胞または細胞株である。ある特定の実施形態では、細胞または細胞株は、腺癌細胞または細胞株、例えば、肺腺癌細胞株などである。ある特定の実施形態では、エクソン１９中の欠失は、ヒトＥＧＦＲの残基Ｅ７４６−Ａ７５０の欠失である。ある特定の実施形態では、ＭＥＴ遺伝子は、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または３〜１０倍、３〜５倍、または５〜１０倍増幅される。ある特定の実施形態では、ＭＥＴ遺伝子増幅を有していない細胞中のＭＥＴタンパク質発現のレベルと比較した場合、ＭＥＴタンパク質発現のレベルは、少なくとも２倍、少なくとも３倍、５倍、少なくとも１０倍、または３〜１０倍、３〜５倍、または５〜１０倍上昇する。ある特定の実施形態では、細胞または細胞株は、ＥＧＦＲ遺伝子中にＴ７９０Ｍ突然変異を含まない。ある特定の実施形態では、細胞または細胞株は、少なくとも１つのＴＫＩ、例えば、ＥＧＦＲ阻害剤などに耐性である。ある特定の実施形態では、細胞または細胞株は、ＣＬ−３８７，７８５および／またはゲフィチニブに耐性である。   In another aspect, the disclosure provides a cell or cell line comprising a deletion in EGFR exon 19 and MET gene amplification. In certain embodiments, the cell or cell line is a mammalian cell or cell line, such as a human cell or cell line. In certain embodiments, the cell or cell line is an epithelial cell or cell line. In certain embodiments, the cell or cell line is an adenocarcinoma cell or cell line, such as a lung adenocarcinoma cell line. In certain embodiments, the deletion in exon 19 is a deletion of residues E746-A750 of human EGFR. In certain embodiments, the MET gene is amplified at least 3 fold, at least 5 fold, at least 10 fold, at least 20 fold, or 3 to 10 fold, 3 to 5 fold, or 5 to 10 fold. In certain embodiments, the level of MET protein expression is at least 2-fold, at least 3-fold, 5-fold, at least 10-fold when compared to the level of MET protein expression in a cell without MET gene amplification. Or it increases 3 to 10 times, 3 to 5 times, or 5 to 10 times. In certain embodiments, the cell or cell line does not contain a T790M mutation in the EGFR gene. In certain embodiments, the cell or cell line is resistant to at least one TKI, such as an EGFR inhibitor. In certain embodiments, the cell or cell line is resistant to CL-387,785 and / or gefitinib.

本発明の前述のおよび他の特徴および利点が、以下の添付の図面と併せて以下の例示的な実施形態の詳細な説明から、より完全に理解されるであろう。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた処置に耐性である癌に罹患している被験体を処置するための方法であって、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を該被験体に投与するステップを含む方法。
（項目２）
前記癌が、肺癌、脳の癌、乳癌、頭頸部癌、大腸癌、卵巣癌、胃癌、または膵癌である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記被験体が、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４活性化変異または遺伝子増幅を有する、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記被験体が、ＥＧＦＲ活性化変異またはＥＧＦＲ遺伝子増幅を有する、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記被験体が、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有する、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記癌が、以下の抗ＥｒｂＢ治療剤：抗ＥＧＦＲ治療剤、抗ＥｒｂＢ２治療剤、抗ＥｒｂＢ３治療剤、または抗ＥｒｂＢ４治療剤の１つまたは複数を用いた処置に耐性である、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記癌が、以下の抗ＥｒｂＢ治療剤：小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤の１つまたは複数を用いた処置に耐性である、項目１または７に記載の方法。
（項目９）
前記癌が、抗ＥｒｂＢ抗体を用いた処置に耐性である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記癌が、ＥｒｂＢ遺伝子を標的にしたｓｉＲＮＡを用いた処置に耐性である、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記癌が、ＥｒｂＢキナーゼ阻害剤を用いた処置に耐性である、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記癌が、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いた処置に耐性である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記癌が、以下の抗ＥＧＦＲ治療剤：ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ＢＩＢＷ２９９２、ＺＤ６４７４、ＡＶ−４１２、ＥＸＥＬ−７６４７、ＨＫＩ−２７２、セツキシマブ、パンチヌムマブ、またはトラスツズマブの１つまたは複数を用いた処置に耐性である、項目７に記載の方法。
（項目１４）
以下の抗ＥｒｂＢ治療剤：抗ＥＧＦＲ治療剤、抗ＥｒｂＢ２治療剤、抗ＥｒｂＢ３治療剤、または抗ＥｒｂＢ４治療剤の１つまたは複数が前記被験体に投与される、項目１〜１３のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
以下の抗ＥｒｂＢ治療剤：小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤の１つまたは複数が前記被験体に投与される、項目１または１４に記載の方法。
（項目１６）
以下の抗ＥＧＦＲ治療剤：ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ＢＩＢＷ２９９２、ＺＤ６４７４、ＥＸＥＬ−７６４７、ＡＶ−４１２、ＨＫＩ−２７２、セツキシマブ、パンチヌムマブ、またはトラスツズマブの１つまたは複数が前記被験体に投与される、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
以下の抗ＭＥＴ治療剤：小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤の１つまたは複数が前記被験体に投与される、項目１〜１６のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
以下の抗ＭＥＴ治療剤：ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＳＵ５４１６、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２、またはＯＡ−５Ｄ５の１つまたは複数が前記被験体に投与される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記抗ＥｒｂＢ治療剤および前記抗ＭＥＴ治療剤が、前記被験体に同時に投与される、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記抗ＥｒｂＢ治療剤および前記抗ＭＥＴ治療剤が、同時製剤として前記被験体に投与される、項目１に記載の方法。
（項目２１）
少なくとも１つの追加の処置を前記被験体に施すステップをさらに含む、項目１〜２０のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記追加の処置が、以下のうちの１つまたは複数である、項目２１に記載の方法：追加の治療剤の投与、照射、光ダイナミック療法、レーザー療法、または手術。
（項目２３）
前記被験体が哺乳動物である、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記哺乳動物がヒトである、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
ＥｒｂＢ活性化変異またはＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している被験体を処置するための方法であって、該被験体は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた処置に対する耐性を発生しており、該被験体がＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有するかどうかを判定するステップと、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有する被験体に、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を投与するステップとを含む方法。
（項目２６）
ＥｒｂＢ活性化変異またはＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している被験体を処置するための方法であって、
（ｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて処置されている被験体をモニターすることによって、該被験体が、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を発生させるかどうかを判定するステップと、
（ｉｉ）該被験体が、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を発生させている場合、該被験体の処置レジメンを修正することによって、該抗ＥｒｂＢ治療剤に加えて抗ＭＥＴ治療剤を含めるステップと
を含む方法。
（項目２７）
ＥｒｂＢ活性化変異またはＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している被験体を処置するための方法であって、
（ｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて処置されている被験体をモニターすることによって、該被験体が阻害剤に対する耐性を発生させるかどうかを判定するステップと、
（ｉｉ）該被験体を検査することによって、該被験体が、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有するかどうかを判定するステップと、
（ｉｉｉ）該被験体が、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有する場合、該被験体の処置レジメンを修正することによって、該抗ＥｒｂＢ治療剤に加えて抗ＭＥＴ治療剤を含めるステップと
を含む方法。
（項目２８）
抗ＥｒｂＢ治療剤を評価するための方法であって、
（ｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて処置されている被験体の集団をモニターすることによって、該治療剤に対する耐性を発生させる被験体を特定するステップと、
（ｉｉ）該耐性の被験体を検査することによって、該被験体が、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有するかどうかを判定するステップと、
（ｉｉｉ）該被験体が、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有する場合、該被験体の処置レジメンを修正することによって、該抗ＥｒｂＢ治療剤に加えて抗ＭＥＴ治療剤を含めるステップと
を含む方法。
（項目２９）
抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中のＥｒｂＢリン酸化を低減するための方法であって、該細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法。
（項目３０）
抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中のＰＩ３Ｋ媒介シグナル伝達を低減するための方法であって、該細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法。
（項目３１）
抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中のＥｒｂＢ媒介シグナル伝達を低減するための方法であって、該細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法。
（項目３２）
抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞の、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する感受性を回復させるための方法であって、該細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法。
（項目３３）
抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞の成長または増殖を低減するための方法であって、該細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法。
（項目３４）
抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞のアポトーシスを増大させるための方法であって、該細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法。
（項目３５）
抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞の、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を低減するための方法であって、該細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法。
（項目３６）
ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中の、獲得された抗ＥｒｂＢ治療剤耐性を処置するための方法であって、該細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法。
（項目３７）
前記癌細胞が哺乳動物癌細胞である、項目２９〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
前記哺乳動物癌細胞がヒト癌細胞である、項目２９〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目３９）
前記癌細胞が細胞株である、項目３７または３８に記載の方法。
（項目４０）
前記癌細胞が初代組織試料由来である、項目３７または３８に記載の方法。
（項目４１）
前記癌細胞が、肺癌細胞、脳の癌細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、大腸癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞または膵癌細胞からなる群から選択される、項目２９〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目４２）
前記癌細胞が任意のＥｒｂＢ誘導性癌である、項目２９〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目４３）
前記癌細胞がＥｒｂＢ活性化変異を含む、項目２９〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目４４）
前記ＥｒｂＢ活性化変異がＥＧＦＲ活性化変異である、項目４４に記載の方法。
（項目４５）
前記癌細胞がＥｒｂＢ遺伝子増幅を含む、項目２９〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目４６）
前記ＥｒｂＢ遺伝子増幅がＥＧＦＲ遺伝子増幅である、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記ＥｒｂＢ遺伝子増幅が少なくとも２倍である、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記ＭＥＴ増幅が少なくとも２倍である、項目２９〜４７のいずれかに記載の方法。
（項目４９）
前記癌細胞が、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性の増大に関連するＥｒｂＢ遺伝子変異を含む、項目２９〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目５０）
抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性の増大に関連する前記ＥｒｂＢ遺伝子変異が、ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ変異である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記抗ＥｒｂＢ治療剤が、抗ＥＧＦＲ治療剤、抗ＥｒｂＢ２治療剤、抗ＥｒｂＢ３治療剤、または抗ＥｒｂＢ４治療剤からなる群から選択される、項目２９〜５０のいずれかに記載の方法。
（項目５２）
前記抗ＥｒｂＢ治療剤が、小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤である、項目２９〜５１のいずれかに記載の方法。
（項目５３）
前記抗ＥｒｂＢ治療剤が、抗体、アンチセンス分子、または小分子キナーゼ阻害剤である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記抗ＥｒｂＢ治療剤が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ＢＩＢＷ２９９２、ＺＤ６４７４、ＡＶ−４１２、ＨＫＩ−２７２、ＥＸＥＬ−７６４７、セツキシマブ、パンチヌムマブ、またはトラスツズマブからなる群から選択されるＥＧＦＲキナーゼ阻害剤である、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
前記抗体が、セツキシマブ、パニツムマブ、およびトラスツズマブからなる群から選択される抗ＥＧＦＲ抗体である、項目５２に記載の方法。
（項目５６）
前記核酸治療剤がｓｉＲＮＡ分子である、項目５２に記載の方法。
（項目５７）
前記抗ＭＥＴ治療剤が、小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤である、項目２９〜５６のいずれかに記載の方法。
（項目５８）
前記抗ＭＥＴ治療剤が、ＭＥＴに対する抗体、または肝細胞成長因子（ＨＧＦ）に対する抗体である、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記抗ＭＥＴ治療剤が、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＳＵ５４１６、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２、またはＯＡ−５Ｄ５である、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
前記核酸治療剤がｓｉＲＮＡ分子である、項目５７に記載の方法。
（項目６１）
前記細胞を抗ＭＥＴ治療剤およびＥｒｂＢ治療剤と接触させる前記ステップが、少なくとも１つの追加の処置様式を含む治療レジメンの一部である、項目２９〜６０のいずれかに記載の方法。
（項目６２）
前記少なくとも１つの追加の処置様式が、前記細胞を１つまたは複数の追加の治療剤と接触させること、照射、光ダイナミック療法、レーザー療法、および手術からなる群から選択される、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて処置されており、該抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得した癌に罹患している被験体を、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を用いて処置するための候補として特定するための方法であって、該被験体由来の癌細胞中のＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を検出するステップを含む方法。
（項目６４）
抗ＭＥＴ治療剤を特定するための方法であって、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得し、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞を、抗ＥｒｂＢ治療剤および試験化合物と接触させるステップと、抗ＥｒｂＢ治療剤のみと接触させた同じ細胞中の細胞の過程と比較した、ＥｒｂＢリン酸化の減少、ＭＥＴリン酸化の減少、ＥｒｂＢ−ＭＥＴ会合の減少、ＥＧＦＲリン酸化の減少、ＡＫＴリン酸化の減少、細胞成長の減少、細胞増殖の減少、およびアポトーシスの増大からなる群から選択される該細胞の過程の変化を検出するステップとを含む方法。
（項目６５）
抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて処置されており、該抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得するリスクのある被験体を特定するための方法であって、該被験体由来の癌細胞中のＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅の存在を検出するステップを含み、該ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅の存在が、該耐性を獲得するリスクを示す方法。
（項目６６）
抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得した細胞を作製するための方法であって、抗ＥｒｂＢ治療剤に感受性である細胞を、少なくとも１つの抗ＥｒｂＢ治療剤と少なくとも４週間接触させるステップと、該抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得する細胞を特定するステップとを含む方法。
（項目６７）
前記細胞が、前記抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を付与するＥｒｂＢ遺伝子中に変異を含まない、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
項目６６に記載の方法によって作製される細胞。
（項目６９）
抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた処置に耐性である癌に罹患している被験体を処置するための方法であって、該被験体に、抗ＥｒｂＢ治療剤、およびＭＥＴのＨＧＦ媒介活性化を阻害する薬剤を投与するステップを含む方法。
（項目７０）
前記薬剤が、ＨＧＦがＭＥＴに結合するのを妨げる抗体である、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記抗体が抗ＨＧＦ抗体である、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記抗体が抗ＭＥＴ抗体である、項目７０に記載の方法。
（項目７３）
前記ＥｒｂＢがＥｒｂＢ−３である、項目２５、２６、２７、または２９に記載の方法。
（項目７４）
前記抗ＥｒｂＢ治療剤が抗ＥｒｂＢ３治療剤である、項目１または２５〜３６に記載の方法。
（項目７５）
前記癌細胞の成長および／または生存がＥｒｂＢによって促進される、項目２９〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目７６）
ＥｒｂＢ活性化変異またはＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している被験体を処置するための方法であって、該被験体は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた処置に対する耐性を発生させており、該方法は、該被験体のＭＥＴレベルおよび／または活性が上昇しているかどうかを判定するステップと、ＭＥＴ活性が上昇している被験体に、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を投与するステップとを含む方法。
（項目７７）
ＥｒｂＢ活性化変異またはＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している被験体を処置するための方法であって、
（ｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて処置されている被験体をモニターすることによって、該被験体が、レベルおよび／またはＭＥＴ活性の上昇を発生させるかどうかを判定するステップと、
（ｉｉ）該被験体が、ＭＥＴレベルおよび／または活性の上昇を発生させている場合、該被験体の処置レジメンを修正することによって、該抗ＥｒｂＢ治療剤に加えて抗ＭＥＴ治療剤を含めるステップと
を含む方法。
（項目７８）
ＥｒｂＢ活性化変異またはＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している被験体を処置するための方法であって、
（ｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて処置されている被験体をモニターすることによって、該被験体が、阻害剤に対する耐性を発生させるかどうかを判定するステップと、
（ｉｉ）該被験体を検査することによって、該被験体のＭＥＴレベルおよび／または活性が上昇しているかどうかを判定するステップと、
（ｉｉｉ）該被験体のＭＥＴレベルおよび／または活性が上昇している場合、該被験体の処置レジメンを修正することによって、該抗ＥｒｂＢ治療剤に加えて抗ＭＥＴ治療剤を含めるステップと
を含む方法。
（項目７９）
前記ＭＥＴ活性の上昇が、ＭＥＴ遺伝子増幅、ＭＥＴ活性化変異、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化に関連する、項目７６〜７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記ＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化が、ＨＧＦ発現レベルの上昇またはＨＧＦ活性の上昇に関連する、項目７６〜７９のいずれかに記載の方法。
（項目８１）
前記ＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化が、ＨＧＦ遺伝子増幅またはＨＧＦ活性化変異に関連する、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記抗ＭＥＴ治療剤が、ＭＥＴのＨＧＦ媒介活性化を阻害する薬剤である、項目７６〜７８のいずれかに記載の方法。
（項目８３）
前記薬剤が、ＨＧＦがＭＥＴに結合するのを妨げる抗体である、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記抗体が、抗ＨＧＦ抗体または抗ＭＥＴ抗体である、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
ＥＧＦＲのエクソン１９中の欠失およびＭＥＴ遺伝子増幅を含む細胞株。 The foregoing and other features and advantages of the invention will be more fully understood from the following detailed description of exemplary embodiments, taken in conjunction with the accompanying drawings, in which:
In a preferred embodiment of the present invention, for example, the following is provided:
(Item 1)
A method for treating a subject suffering from cancer that is resistant to treatment with an anti-ErbB therapeutic agent, comprising the step of administering an anti-ErbB therapeutic agent and an anti-MET therapeutic agent to the subject .
(Item 2)
Item 2. The method according to Item 1, wherein the cancer is lung cancer, brain cancer, breast cancer, head and neck cancer, colon cancer, ovarian cancer, stomach cancer, or pancreatic cancer.
(Item 3)
Item 3. The method according to Item 2, wherein the cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC).
(Item 4)
4. The method of any of items 1-3, wherein the subject has an EGFR, ErbB2, ErbB3, or ErbB4 activating mutation or gene amplification.
(Item 5)
Item 5. The method according to Item 4, wherein the subject has an EGFR activating mutation or EGFR gene amplification.
(Item 6)
6. The method according to any of items 1 to 5, wherein the subject has a MET activating mutation or MET gene amplification.
(Item 7)
Item 1-6, wherein the cancer is resistant to treatment with one or more of the following anti-ErbB therapeutics: anti-EGFR therapeutics, anti-ErbB2 therapeutics, anti-ErbB3 therapeutics, or anti-ErbB4 therapeutics The method according to any one.
(Item 8)
8. The method of item 1 or 7, wherein the cancer is resistant to treatment with one or more of the following anti-ErbB therapeutics: small molecule therapeutics, nucleic acid therapeutics, or protein therapeutics.
(Item 9)
Item 9. The method according to Item 8, wherein the cancer is resistant to treatment with an anti-ErbB antibody.
(Item 10)
9. The method of item 8, wherein the cancer is resistant to treatment with siRNA targeting the ErbB gene.
(Item 11)
9. The method of item 8, wherein the cancer is resistant to treatment with an ErbB kinase inhibitor.
(Item 12)
12. The method of item 11, wherein the cancer is resistant to treatment with an EGFR kinase inhibitor.
(Item 13)
The cancer is one of the following anti-EGFR therapeutic agents: gefitinib, erlotinib, lapatinib, PF00299804, CI-1033, EKB-569, BIBW2992, ZD6474, AV-412, EXEL-7647, HKI-272, cetuximab, pantinumumab, or trastuzumab 8. The method of item 7, wherein the method is resistant to treatment with one or more.
(Item 14)
14. Any of items 1-13, wherein one or more of the following anti-ErbB therapeutic agents: anti-EGFR therapeutic agent, anti-ErbB2 therapeutic agent, anti-ErbB3 therapeutic agent, or anti-ErbB4 therapeutic agent is administered to the subject. the method of.
(Item 15)
15. The method of item 1 or 14, wherein one or more of the following anti-ErbB therapeutics: small molecule therapeutics, nucleic acid therapeutics, or protein therapeutics are administered to the subject.
(Item 16)
One or more of the following anti-EGFR therapeutic agents: gefitinib, erlotinib, lapatinib, PF00299804, CI-1033, EKB-569, BIBW2992, ZD6474, EXEL-7647, AV-412, HKI-272, cetuximab, pantinumumab, or trastuzumab 15. The method of item 14, wherein is administered to the subject.
(Item 17)
17. The method of any of items 1-16, wherein one or more of the following anti-MET therapeutics: small molecule therapeutics, nucleic acid therapeutics, or protein therapeutics are administered to the subject.
(Item 18)
One of the following anti-MET therapeutic agents: PHA-665,752, SU11274, SU5416, PF-02341066, XL-880, MGCD265, XL184, ARQ197, MP-470, SGX-523, JNJ38887705, AMG102, or OA-5D5 18. The method of item 17, wherein more than one is administered to the subject.
(Item 19)
The method of item 1, wherein the anti-ErbB therapeutic agent and the anti-MET therapeutic agent are administered simultaneously to the subject.
(Item 20)
The method of item 1, wherein the anti-ErbB therapeutic and the anti-MET therapeutic are administered to the subject as a co-formulation.
(Item 21)
21. A method according to any of items 1-20, further comprising the step of applying at least one additional treatment to the subject.
(Item 22)
28. The method of item 21, wherein the additional treatment is one or more of the following: administration of an additional therapeutic agent, irradiation, photodynamic therapy, laser therapy, or surgery.
(Item 23)
Item 2. The method according to Item 1, wherein the subject is a mammal.
(Item 24)
Item 22. The method according to Item 21, wherein the mammal is a human.
(Item 25)
A method for treating a subject suffering from an ErbB activating mutation or a cancer associated with ErbB gene amplification, wherein the subject has developed resistance to treatment with an anti-ErbB therapeutic agent; Determining whether the subject has a MET activating mutation or MET gene amplification; administering an anti-ErbB therapeutic agent and an anti-MET therapeutic agent to a subject having a MET activating mutation or MET gene amplification; Including methods.
(Item 26)
A method for treating a subject suffering from a cancer associated with an ErbB activating mutation or an ErbB gene amplification comprising:
(I) determining whether the subject develops a MET activating mutation or MET gene amplification by monitoring the subject being treated with an anti-ErbB therapeutic agent;
(Ii) including an anti-MET therapeutic agent in addition to the anti-ErbB therapeutic agent by modifying the subject's treatment regimen if the subject has developed a MET-activating mutation or MET gene amplification. When
Including methods.
(Item 27)
A method for treating a subject suffering from a cancer associated with an ErbB activating mutation or an ErbB gene amplification comprising:
(I) determining whether the subject develops resistance to the inhibitor by monitoring the subject being treated with the anti-ErbB therapeutic agent;
(Ii) determining whether the subject has a MET activating mutation or MET gene amplification by examining the subject;
(Iii) if the subject has a MET activating mutation or MET gene amplification, including an anti-MET therapeutic agent in addition to the anti-ErbB therapeutic agent by modifying the subject's treatment regimen;
Including methods.
(Item 28)
A method for evaluating an anti-ErbB therapeutic comprising:
(I) identifying a subject that develops resistance to the therapeutic agent by monitoring a population of subjects being treated with the anti-ErbB therapeutic agent;
(Ii) determining whether the subject has a MET activating mutation or MET gene amplification by examining the resistant subject;
(Iii) if the subject has a MET activating mutation or MET gene amplification, including an anti-MET therapeutic agent in addition to the anti-ErbB therapeutic agent by modifying the subject's treatment regimen;
Including methods.
(Item 29)
A method for reducing ErbB phosphorylation in a cancer cell that has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic agent and comprises a MET activating mutation or MET gene amplification comprising the anti-MET therapeutic agent and the anti-ErbB therapeutic agent A method comprising the step of contacting with an agent.
(Item 30)
A method for reducing PI3K-mediated signal transduction in a cancer cell that has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic and comprises a MET activating mutation or MET gene amplification, said cell comprising the anti-MET therapeutic and anti-ErbB A method comprising the step of contacting with a therapeutic agent.
(Item 31)
A method for reducing ErbB-mediated signal transduction in cancer cells that has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic and includes MET-activating mutations or MET gene amplification, wherein the cells are treated with anti-MET therapeutic and anti-ErbB. A method comprising the step of contacting with a therapeutic agent.
(Item 32)
A method for restoring the sensitivity of a cancer cell having acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic agent and comprising a MET-activating mutation or MET gene amplification to the anti-ErbB therapeutic agent, wherein the cell is treated with an anti-MET therapeutic agent and Contacting with an anti-ErbB therapeutic.
(Item 33)
A method for reducing the growth or proliferation of a cancer cell that has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic agent and contains a MET activating mutation or MET gene amplification, comprising the anti-MET therapeutic agent and the anti-ErbB therapeutic agent A method comprising the step of contacting with.
(Item 34)
A method for increasing apoptosis of cancer cells that has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic and includes MET activating mutations or MET gene amplification comprising contacting the cells with the anti-MET therapeutic and anti-ErbB therapeutic A method comprising the step of causing.
(Item 35)
A method for reducing the resistance of an anti-ErbB therapeutic agent to a cancer cell that has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic agent and comprises a MET activating mutation or MET gene amplification, comprising: Contacting with an anti-ErbB therapeutic.
(Item 36)
A method for treating acquired anti-ErbB therapeutic resistance in a cancer cell comprising a MET activating mutation or MET gene amplification comprising contacting the cell with an anti-MET therapeutic and an anti-ErbB therapeutic. Including methods.
(Item 37)
The method according to any of items 29 to 36, wherein the cancer cells are mammalian cancer cells.
(Item 38)
The method according to any of items 29 to 36, wherein the mammalian cancer cell is a human cancer cell.
(Item 39)
39. The method of item 37 or 38, wherein the cancer cell is a cell line.
(Item 40)
39. The method of item 37 or 38, wherein the cancer cells are derived from a primary tissue sample.
(Item 41)
Any of Items 29 to 36, wherein the cancer cells are selected from the group consisting of lung cancer cells, brain cancer cells, breast cancer cells, head and neck cancer cells, colon cancer cells, ovarian cancer cells, gastric cancer cells or pancreatic cancer cells. The method described.
(Item 42)
The method according to any of items 29 to 36, wherein the cancer cells are any ErbB-induced cancer.
(Item 43)
The method according to any of items 29 to 36, wherein the cancer cell comprises an ErbB activating mutation.
(Item 44)
45. The method of item 44, wherein the ErbB activating mutation is an EGFR activating mutation.
(Item 45)
37. A method according to any of items 29 to 36, wherein the cancer cell comprises ErbB gene amplification.
(Item 46)
46. The method of item 45, wherein said ErbB gene amplification is EGFR gene amplification.
(Item 47)
46. The method of item 45, wherein the ErbB gene amplification is at least 2-fold.
(Item 48)
48. A method according to any of items 29 to 47, wherein the MET amplification is at least twice.
(Item 49)
37. The method of any of items 29-36, wherein the cancer cell comprises an ErbB gene mutation associated with increased resistance to an anti-ErbB therapeutic.
(Item 50)
50. The method of item 49, wherein the ErbB gene mutation associated with increased resistance to an anti-ErbB therapeutic is an EGFR T790M mutation.
(Item 51)
51. The method according to any of items 29-50, wherein the anti-ErbB therapeutic agent is selected from the group consisting of an anti-EGFR therapeutic agent, an anti-ErbB2 therapeutic agent, an anti-ErbB3 therapeutic agent, or an anti-ErbB4 therapeutic agent.
(Item 52)
52. The method according to any of items 29 to 51, wherein the anti-ErbB therapeutic agent is a small molecule therapeutic agent, a nucleic acid therapeutic agent, or a protein therapeutic agent.
(Item 53)
53. The method of item 52, wherein the anti-ErbB therapeutic agent is an antibody, an antisense molecule, or a small molecule kinase inhibitor.
(Item 54)
The anti-ErbB therapeutic agent is selected from the group consisting of gefitinib, erlotinib, lapatinib, PF00299804, CI-1033, EKB-569, BIBW2992, ZD6474, AV-412, HKI-272, EXEL-7647, cetuximab, pantinumumab, or trastuzumab 53. The method according to item 52, wherein the method is an EGFR kinase inhibitor.
(Item 55)
53. The method of item 52, wherein the antibody is an anti-EGFR antibody selected from the group consisting of cetuximab, panitumumab, and trastuzumab.
(Item 56)
53. The method of item 52, wherein the nucleic acid therapeutic agent is a siRNA molecule.
(Item 57)
57. The method according to any of items 29 to 56, wherein the anti-MET therapeutic agent is a small molecule therapeutic agent, a nucleic acid therapeutic agent, or a protein therapeutic agent.
(Item 58)
58. The method of item 57, wherein the anti-MET therapeutic agent is an antibody against MET or an antibody against hepatocyte growth factor (HGF).
(Item 59)
The anti-MET therapeutic agent is PHA-665,752, SU11274, SU5416, PF-02341066, XL-880, MGCD265, XL184, ARQ197, MP-470, SGX-523, JNJ38887705, AMG102, or OA-5D5. 58. A method according to item 57.
(Item 60)
58. The method of item 57, wherein the nucleic acid therapeutic agent is a siRNA molecule.
(Item 61)
61. The method of any of items 29-60, wherein the step of contacting the cells with an anti-MET therapeutic and an ErbB therapeutic is part of a therapeutic regimen that includes at least one additional treatment modality.
(Item 62)
62. The item 61, wherein the at least one additional treatment modality is selected from the group consisting of contacting the cells with one or more additional therapeutic agents, irradiation, photodynamic therapy, laser therapy, and surgery. the method of.
(Item 63)
Candidates suffering from cancer that have been treated with an anti-ErbB therapeutic agent and have acquired resistance to the anti-ErbB therapeutic agent as candidates for treatment with an anti-ErbB therapeutic agent and an anti-MET therapeutic agent A method for identifying comprising detecting a MET activating mutation or MET gene amplification in a cancer cell from the subject.
(Item 64)
A method for identifying an anti-MET therapeutic agent, comprising obtaining resistance to an anti-ErbB therapeutic agent and contacting a cancer cell comprising a MET-activating mutation or MET gene amplification with the anti-ErbB therapeutic agent and a test compound; Reduced ErbB phosphorylation, reduced MET phosphorylation, reduced ErbB-MET association, reduced EGFR phosphorylation, AKT phosphorylation, compared to cellular processes in the same cell contacted with anti-ErbB therapeutic alone Detecting a change in the process of the cell selected from the group consisting of a decrease, a decrease in cell growth, a decrease in cell proliferation, and an increase in apoptosis.
(Item 65)
A method for identifying a subject that has been treated with an anti-ErbB therapeutic and is at risk of acquiring resistance to the anti-ErbB therapeutic, comprising: a MET-activating mutation in a cancer cell from the subject Or detecting the presence of MET gene amplification, wherein the presence of the MET activating mutation or MET gene amplification indicates a risk of acquiring the resistance.
(Item 66)
A method for producing a cell that has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic agent, wherein the cell sensitive to the anti-ErbB therapeutic agent is contacted with at least one anti-ErbB therapeutic agent for at least 4 weeks; Identifying cells that acquire resistance to the therapeutic agent.
(Item 67)
70. The method according to item 66, wherein the cell does not contain a mutation in the ErbB gene that confers resistance to the anti-ErbB therapeutic agent.
(Item 68)
70. A cell produced by the method according to item 66.
(Item 69)
A method for treating a subject suffering from a cancer that is resistant to treatment with an anti-ErbB therapeutic agent, wherein the subject inhibits HGF-mediated activation of the anti-ErbB therapeutic agent and MET. Administering a medicament.
(Item 70)
70. The method of item 69, wherein the agent is an antibody that prevents HGF from binding to MET.
(Item 71)
71. The method of item 70, wherein the antibody is an anti-HGF antibody.
(Item 72)
71. The method of item 70, wherein the antibody is an anti-MET antibody.
(Item 73)
30. The method of items 25, 26, 27, or 29, wherein the ErbB is ErbB-3.
(Item 74)
The method according to item 1 or 25 to 36, wherein the anti-ErbB therapeutic agent is an anti-ErbB3 therapeutic agent.
(Item 75)
The method according to any of items 29 to 36, wherein the growth and / or survival of the cancer cells is promoted by ErbB.
(Item 76)
A method for treating a subject suffering from an ErbB activating mutation or a cancer associated with ErbB gene amplification, said subject developing resistance to treatment with an anti-ErbB therapeutic agent; The method includes determining whether the subject has increased MET levels and / or activity, and administering an anti-ErbB therapeutic agent and an anti-MET therapeutic agent to a subject having increased MET activity. And a method comprising.
(Item 77)
A method for treating a subject suffering from a cancer associated with an ErbB activating mutation or an ErbB gene amplification comprising:
(I) determining whether the subject produces an increase in levels and / or MET activity by monitoring the subject being treated with an anti-ErbB therapeutic agent;
(Ii) including an anti-MET therapeutic agent in addition to the anti-ErbB therapeutic agent by modifying the subject's treatment regimen if the subject is developing elevated MET levels and / or activity. When
Including methods.
(Item 78)
A method for treating a subject suffering from a cancer associated with an ErbB activating mutation or an ErbB gene amplification comprising:
(I) determining whether the subject develops resistance to the inhibitor by monitoring the subject being treated with the anti-ErbB therapeutic agent;
(Ii) determining whether the subject's MET level and / or activity is elevated by examining the subject;
(Iii) including an anti-MET therapeutic agent in addition to the anti-ErbB therapeutic agent by modifying the subject's treatment regimen if the subject's MET level and / or activity is elevated;
Including methods.
(Item 79)
79. The method of any one of items 76-78, wherein the increase in MET activity is associated with MET gene amplification, MET activating mutation, or HGF-mediated MET activation.
(Item 80)
80. The method of any of items 76-79, wherein the HGF-mediated MET activation is associated with increased HGF expression levels or increased HGF activity.
(Item 81)
81. The method of item 80, wherein the HGF-mediated MET activation is associated with HGF gene amplification or HGF activating mutation.
(Item 82)
79. The method according to any of items 76 to 78, wherein the anti-MET therapeutic agent is an agent that inhibits HGF-mediated activation of MET.
(Item 83)
83. The method of item 82, wherein the agent is an antibody that prevents HGF from binding to MET.
(Item 84)
84. A method according to item 83, wherein the antibody is an anti-HGF antibody or an anti-MET antibody.
(Item 85)
A cell line comprising a deletion in exon 19 of EGFR and MET gene amplification.

ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞はインビトロでゲフィチニブに耐性であり、ＭＥＴ増幅を含む。Ａ．ＨＣＣ８２７細胞株は、ＥＧＦＲ（Ｅ７４６〜Ａ７５０欠失）変異を有しており、ゲフィチニブ感受性（ＩＣ５０−４ｎＭ）であるが、ゲフィチニブの濃度を増加させながら増殖させることによってゲフィチニブ耐性となった。ＨＣＣ８２７親細胞株ならびに２種のゲフィチニブ耐性クローンであるＨＣＣ８２７ＧＲ５およびＨＣＣ８２７ＧＲ６をともに、ゲフィチニブの濃度を増加させながらＭＴＳ生存アッセイに供した。Ｂ．ゲフィチニブ耐性ＨＣＣ８２７ＧＲ５細胞は、ゲフィチニブ存在下でＥＲＢＢ３およびＡｋｔリン酸化を維持する。ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ８２７ＧＲ５細胞をゲフィチニブの量を増加させながら６時間曝露した。細胞を溶解し、規定の抗体でプローブした。ＨＣＣ８２７ＧＲ５は、１０μＭのゲフィチニブが存在する場合でさえ、ＥＲＢＢ３およびＡｋｔ（および程度は小さいがＥＧＦＲ）のリン酸化を維持する。Ｃ．ＨＣＣ８２７ＧＲ５細胞は、ゲフィチニブ存在下で、ＥＲＢＢ３およびＭＥＴのリン酸化を維持する。未処理のおよび１μＭのゲフィチニブで処理したＨＣＣ８２７およびＨＣＣ８２７ＧＲ５細胞の溶解産物を、４２種の異なるホスホ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に対する抗体を含有するホスホＲＴＫアレイ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）とハイブリダイズさせた。未処理のＨＣＣ８２７およびＨＣＣ８２７ＧＲ５細胞は大量のｐ−ＥＧＦＲ、ｐ−ＥＲＢＢ２、ｐ−ＥＲＢＢ３およびｐ−ＭＥＴを含有する。ゲフィチニブ処理後（右側パネル）、ＨＣＣ８２７細胞ではほんの一部のｐ−ＥＧＦＲが残存する。HCC827GR cells are resistant to gefitinib in vitro and contain MET amplification. A. The HCC827 cell line has an EGFR (E746-A750 deletion) mutation and is sensitive to gefitinib (IC50-4 nM), but became resistant to gefitinib by growing with increasing concentrations of gefitinib. Both the HCC827 parental cell line and two gefitinib resistant clones, HCC827GR5 and HCC827GR6, were subjected to an MTS survival assay with increasing concentrations of gefitinib. B. Gefitinib resistant HCC827GR5 cells maintain ERBB3 and Akt phosphorylation in the presence of gefitinib. HCC827 and HCC827GR5 cells were exposed for 6 hours with increasing amounts of gefitinib. Cells were lysed and probed with defined antibodies. HCC827GR5 maintains phosphorylation of ERBB3 and Akt (and to a lesser extent EGFR) even in the presence of 10 μM gefitinib. C. HCC827GR5 cells maintain ERBB3 and MET phosphorylation in the presence of gefitinib. Untreated and 1 μM gefitinib-treated HCC827 and HCC827GR5 cell lysates were hybridized with phosphoRTK arrays (R & D systems) containing antibodies against 42 different phosphoreceptor tyrosine kinases (RTKs). Untreated HCC827 and HCC827GR5 cells contain large amounts of p-EGFR, p-ERBB2, p-ERBB3 and p-MET. Only a small portion of p-EGFR remains in HCC827 cells after gefitinib treatment (right panel). ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞はインビトロでゲフィチニブに耐性であり、ＭＥＴ増幅を含む。Ｄ．ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞は、７番染色体に限局的な増幅を含有する。Ｈｕｍａｎ Ｍａｐｐｉｎｇ ２５０Ｋ Ｓｔｙ一塩基多型（ＳＮＰ）アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．）を使用してゲノムワイドなコピー数変化を生じさせ、前述のｄＣｈｉｐプログラムを使用して解析した。ＧＲクローンを親ＨＣＣ８２７細胞株と比較する。右側の赤色の垂直線は親細胞株に対して設定される。見てわかるように、７番染色体長腕に限局的な増幅がある。Ｅ．ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞の増幅はＭＥＴを包含しているが、その既知のリガンドＨＧＦまたはＥＧＦＲを包含していない。１Ｄのデータの拡大図。７番染色体の限局的な増幅は７ｇ３１．１〜７ｇ３３．３まで及び、ＭＥＴを含有するがＨＧＦまたはＥＧＦＲを含有しない。HCC827GR cells are resistant to gefitinib in vitro and contain MET amplification. D. HCC827GR cells contain amplification localized to chromosome 7. Human Mapping 250K Sty single nucleotide polymorphism (SNP) arrays (Affymetrix, Inc.) were used to generate genome-wide copy number changes and were analyzed using the dChip program described above. The GR clone is compared to the parent HCC827 cell line. The right red vertical line is set for the parent cell line. As you can see, there is a localized amplification in the long arm of chromosome 7. E. Amplification of HCC827GR cells includes MET, but not its known ligand HGF or EGFR. Enlarged view of 1D data. Localized amplification of chromosome 7 extends from 7g31.1 to 7g33.3 and contains MET but no HGF or EGFR. ＭＥＴおよびＥＧＦＲの同時阻害はＨＣＣ８２７ＧＲ細胞の成長を抑制し、ＥＲＢＢ３／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を下方制御する。Ａ．ＨＣＣ８２７ＧＲ５細胞を、ゲフィチニブもしくはＰＨＡ−６６５７５２単独で、または組み合わせて、濃度を増加させながら処理し、ＭＴＳ生存アッセイ（方法）に供した。細胞は、ゲフィチニブおよびＰＨＡ−６６５７５２の組合せに曝露された場合にのみ顕著に成長を阻害された。Ｂ．ゲフィチニブ、ＰＨＡ−６６５７５２のいずれかまたは両方の薬物を用いて処理されたＨＣＣ８２７ならびにＨＣＣ８２７ＧＲ６、ＧＲ７およびＧＲ８細胞株のウェスタンブロット解析。細胞を１μＭのゲフィチニブもしくは１μＭのＰＨＡ−６６５７５２単独、または組合せの後に６時間処理した。細胞を溶解し、規定の抗体でプローブした。ＨＣＣ８２７親細胞株の場合とは異なり、ｐ−ＥＲＢＢ３およびｐ−Ａｋｔはゲフィチニブ存在下で維持される。親または耐性細胞株におけるＭＥＴ単独阻害はｐ−ＥＲＢＢ３またはｐ−Ａｋｔに顕著な影響を及ぼさない。しかしながら、ゲフィチニブと組み合わせると、ｐ−ＥＲＢＢ３、ｐ−Ａｋｔおよびｐ−ＥＲＫ１／２の顕著な阻害が起こる。Ｃ．ゲフィチニブおよびＰＨＡ−６６５７５２の組合せは、ＨＣＣ８２７ＧＲ６、ＧＲ７およびＧＲ８細胞におけるｐ８５とＥｒｂＢ３の結合を妨げる。ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ８２７ＧＲ細胞を、１μＭのゲフィチニブもしくは１μＭのＰＨＡ−６６５７５２単独または組合せに６時間曝露させ、その後溶解した。溶解産物を抗ｐ８５抗体で免疫沈降し、この免疫沈降物を抗ホスホチロシン、抗ＥＲＢＢ−３、抗Ｇａｂ１および抗ｐ−８５抗体を用いてプローブした。ＨＣＣ８２７親細胞株において、ＥＲＢＢ３とｐ８５の結合はゲフィチニブにより妨げられるが、ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞においてはゲフィチニブ存在下であってもこの相互作用は維持される。Ｇａｂ１とｐ８５の結合はＨＣＣ８２７ＧＲ細胞においてＰＨＡ−６６５７５２単独で妨害される一方、ゲフィチニブおよびＰＨＡ−６６５７５２の組合せのみがこれらの細胞株においてＥＲＢＢ３をｐ８５から解離させる。Simultaneous inhibition of MET and EGFR suppresses the growth of HCC827GR cells and down-regulates ERBB3 / PI3K / AKT signaling. A. HCC827GR5 cells were treated with gefitinib or PHA-665752 alone or in combination at increasing concentrations and subjected to the MTS survival assay (method). Cells were markedly inhibited from growth only when exposed to the combination of gefitinib and PHA-665752. B. Western blot analysis of HCC827 and HCC827GR6, GR7 and GR8 cell lines treated with gefitinib, PHA-665752 or both drugs. Cells were treated for 6 hours after 1 μM gefitinib or 1 μM PHA-665752 alone or in combination. Cells were lysed and probed with defined antibodies. Unlike the HCC827 parental cell line, p-ERBB3 and p-Akt are maintained in the presence of gefitinib. Inhibition of MET alone in parental or resistant cell lines has no significant effect on p-ERBB3 or p-Akt. However, when combined with gefitinib, significant inhibition of p-ERBB3, p-Akt and p-ERK1 / 2 occurs. C. The combination of gefitinib and PHA-665752 prevents p85 and ErbB3 binding in HCC827GR6, GR7 and GR8 cells. HCC827 and HCC827GR cells were exposed to 1 μM gefitinib or 1 μM PHA-665752 alone or in combination for 6 hours and then lysed. The lysate was immunoprecipitated with anti-p85 antibody and the immunoprecipitate was probed with anti-phosphotyrosine, anti-ERBB-3, anti-Gab1 and anti-p-85 antibodies. In the HCC827 parent cell line, the binding of ERBB3 and p85 is prevented by gefitinib, but this interaction is maintained in HCC827GR cells even in the presence of gefitinib. The binding of Gab1 and p85 is blocked by PHA-666552 alone in HCC827GR cells, whereas only the combination of gefitinib and PHA-665752 dissociates ERBB3 from p85 in these cell lines. ＭＥＴおよびＥＧＦＲの同時阻害はＨＣＣ８２７ＧＲ細胞の成長を抑制し、ＥＲＢＢ３／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を下方制御する。Ｄ．対照ｓｈＲＮＡまたはＭＥＴの異なる２つの領域に対するｓｈＲＮＡを含有するレンチウイルスコンストラクトをＨＣＣ８２７ＧＲ６細胞に感染させ（方法）、ゲフィチニブ存在下での成長をＭＴＳアッセイにより検査した。ＭＥＴに対するｓｈＲＮＡを含有するＨＣＣ８２７ＧＲ６細胞はゲフィチニブ感受性を回復するが、対照ｓｈＲＮＡに感染させたものは耐性のままである。Ｅ．ゲフィチニブは、ＭＥＴ ｓｈＲＮＡを感染させたＨＣＣ８２７ＧＲ６細胞においてＥＲＢＢ３／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を下方制御する。対照ｓｈＲＮＡまたはＭＥＴに対するｓｈＲＮＡを感染させたＨＣＣ８２７ＧＲ６細胞を１μＭのゲフィチニブで６時間処理した。細胞を溶解し、規定の抗体でプローブした。対照ｓｈＲＮＡを感染させたＨＣＣ８２７ＧＲ６細胞において、ゲフィチニブ処理はｐ−ＥＲＢＢ３またはｐ−ＡＫＴに影響を及ぼさない。対照的に、ＭＥＴの下方制御はＨＣＣ８２７ＧＲ６細胞においてゲフィチニブのｐ−ＥＲＢＢ３およびｐ−ＡＫＴを下方制御する能力を回復させる。Simultaneous inhibition of MET and EGFR suppresses the growth of HCC827GR cells and down-regulates ERBB3 / PI3K / AKT signaling. D. HCC827GR6 cells were infected (method) with lentiviral constructs containing shRNA against two different regions of control shRNA or MET, and growth in the presence of gefitinib was examined by MTS assay. HCC827GR6 cells containing shRNA against MET restore gefitinib sensitivity, while those infected with control shRNA remain resistant. E. Gefitinib down-regulates ERBB3 / PI3K / AKT signaling in HCC827GR6 cells infected with MET shRNA. HCC827GR6 cells infected with control shRNA or shRNA against MET were treated with 1 μM gefitinib for 6 hours. Cells were lysed and probed with defined antibodies. In HCC827GR6 cells infected with control shRNA, gefitinib treatment does not affect p-ERBB3 or p-AKT. In contrast, MET downregulation restores the ability of gefitinib to downregulate p-ERBB3 and p-AKT in HCC827GR6 cells. 別のＭＥＴ増幅細胞株においてＭＥＴはＥＲＢＢ３を活性化する。Ａ．ＭＥＴ増幅細胞株はＥＲＢＢ３を利用してＰＩ３ＫＩＡＫＴシグナル伝達を活性化する。ＭＥＴ増幅胃癌（ＳＮＵ−６３８およびＭＫＮ−４５）およびＮＳＣＬＣ（Ｈ１９９３）細胞、ＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣ（ＨＣＣ８２７）およびＥＲＢＢ２増幅乳癌細胞（ＢＴ４７４）を、ゲフィチニブ（１μＭ）、ＰＨＡ−６６５，７５２（１μＭ）、ラパチニブ（１μＭ）またはＣＬ−３８７，７８５（１μＭ）で６時間処理した後、溶解した。溶解産物を抗ｐ８５抗体で免疫沈降し、この免疫沈降物を抗ホスホチロシン、抗ＥＲＢＢ−３および抗ｐ−８５抗体を用いてプローブした（＊ＰＴｙｒブロットに示す）。並行して、溶解産物をウェスタンブロット法により解析し、規定の抗体でプローブした。ＭＥＴ増幅細胞に見られるように、ＰＨＡ−６６５，７５２のみがＥＲＢＢ３とｐ８５の結合妨害ならびにＥＲＢＢ３およびＡｋｔのリン酸化の下方制御を引き起こした。対照として、ＥＧＦＲ変異ＨＣＣ８２７細胞およびＥＲＢＢ２増幅ＢＴ４７４細胞はそれぞれ、ＥＧＦＲおよびＥＲＢＢ２阻害剤の存在下においてｐ８５とＥＲＢＢ３の結合の低下ならびにｐ−ＥＲＢＢ３およびｐ−ＡＫＴの下方制御を示す。ＰＨＡ−６６５，７５２はこれらの細胞株のいずれにおいてもＰＩ３シグナル伝達に影響を及ぼさない。In another MET amplified cell line, MET activates ERBB3. A. MET amplified cell lines utilize ERBB3 to activate PI3KIAKT signaling. MET amplified gastric cancer (SNU-638 and MKN-45) and NSCLC (H1993) cells, EGFR mutant NSCLC (HCC827) and ERBB2 amplified breast cancer cells (BT474) were transformed into gefitinib (1 μM), PHA-665,752 (1 μM), lapatinib (1 μM) or CL-387,785 (1 μM) for 6 hours and then dissolved. The lysate was immunoprecipitated with anti-p85 antibody and the immunoprecipitate was probed with anti-phosphotyrosine, anti-ERBB-3 and anti-p-85 antibodies (* shown in PTyr blot). In parallel, lysates were analyzed by Western blotting and probed with defined antibodies. As seen in MET-amplified cells, only PHA-665,752 caused interference with ERBB3 and p85 binding and down-regulation of ERBB3 and Akt phosphorylation. As a control, EGFR mutant HCC827 cells and ERBB2 amplified BT474 cells show reduced binding of p85 and ERBB3 and downregulation of p-ERBB3 and p-AKT, respectively, in the presence of EGFR and ERBB2 inhibitors. PHA-665,752 does not affect PI3 signaling in any of these cell lines. 別のＭＥＴ増幅細胞株においてＭＥＴはＥＲＢＢ３を活性化する。Ｂ．ＥＲＢＢ３ノックダウンはＳＮＵ−６３８細胞においてｐ−ＡＫＴの下方制御を引き起こす。スクランブル（ＳＣ）配列、ＥＲＢＢ３特異的配列、対照配列（ＣＴＲＬ）またはＧＦＰを含有するレンチウイルスｓｈＲＮＡコンストラクトを、ＳＮＵ６３８細胞に感染させた（方法）。感染から７２時間後、細胞を溶解し、規定の抗体でプローブした。ＥＲＢＢ３特異的ｓｈＲＮＡはｐ−ＡＫＴの下方制御を引き起こす。Ｃ．ＥＲＢＢ３ｓｈＲＮＡはＳＮＵ−６３８細胞の成長を阻害する。ＳＮＵ−６３８細胞の成長を、ＢのｓｈＲＮＡコンストラクトの感染から５日後、ＭＴＳアッセイにより検査した。成長はＳＣｓｈＲＮＡに標準化した。ＥＲＢＢ３ｓｈＲＮＡの感染はＳＮＵ−６３８細胞の顕著な成長阻害を引き起こす。Ｄ．ＣＨＯ細胞においてＭＥＴはＥＲＢＢ３を活性化する。ＣＨＯ細胞を、ＧＦＰ、ＥＲＢＢ３ｃＤＮＡ単独でまたＭＥＴｃＤＮＡと組み合わせてトランスフェクトした。細胞を、ＰＨＡ−６６５，７５２（１ＰＭ）、ゲフィチニブ（３μＭ）、ラパチニブ（３μＭ）またはＰＰ２（１０μＭ）で６時間処理し、処理した細胞を溶解しｐ−ＥＲＢＢ３およびＥＲＢＢ３でプローブした。見てわかるように、ＥＲＢＢ３はＭＥＴの存在下でのみリン酸化され、このリン酸化はＰＨＡ−６６５，７５２により阻害されるが、ゲフィチニブ、ラパチニブまたはＰＰ２では阻害されない。In another MET amplified cell line, MET activates ERBB3. B. ERBB3 knockdown causes downregulation of p-AKT in SNU-638 cells. SNU638 cells were infected with scrambled (SC) sequences, ERBB3 specific sequences, control sequences (CTRL) or GFP containing GFP (method). 72 hours after infection, cells were lysed and probed with defined antibodies. ERBB3-specific shRNA causes down-regulation of p-AKT. C. ERBB3 shRNA inhibits the growth of SNU-638 cells. The growth of SNU-638 cells was examined by MTS assay 5 days after infection with the B shRNA construct. Growth was normalized to SC shRNA. Infection with ERBB3 shRNA causes significant growth inhibition of SNU-638 cells. D. MET activates ERBB3 in CHO cells. CHO cells were transfected with GFP, ERBB3 cDNA alone and in combination with MET cDNA. Cells were treated with PHA-665,752 (1 PM), gefitinib (3 μM), lapatinib (3 μM) or PP2 (10 μM) for 6 hours, and the treated cells were lysed and probed with p-ERBB3 and ERBB3. As can be seen, ERBB3 is phosphorylated only in the presence of MET, and this phosphorylation is inhibited by PHA-665,752, but not gefitinib, lapatinib or PP2. 別のＭＥＴ増幅細胞株においてＭＥＴはＥＲＢＢ３を活性化する。Ｅ．ＥＲＢＢ３はＭＥＴの存在下でｐ８５と共沈し、またＰＨＡ−６６５，７５２により阻害される。ＰＨＡ−６６５，７５２（１μＭ）、ゲフィチニブ（３μＭ）またはラパチニブ（３μＭ）の存在下または非存在下で、ＧＦＰ、ＥＲＢＢ３またはＭＥＴ、およびＥＲＢＢ３を用いてトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のＥＲＢＢ３を用いて免疫沈降を行った。得られたタンパク質を溶解し、規定の抗体でプローブした。見てわかるように、ｐ８５はＭＥＴの存在下でのみＥＲＢＢ３と共沈し、これはＰＨＡ−６６５，７５２により阻害されるが、ゲフィチニブまたはラパチニブでは阻害されない。Ｆ．ＣＨＯ細胞のＭＥＴおよびＥＲＢＢ３共沈物。ＰＨＡ−６６５，７５２（１μＭ）処理有りまたは無しで、ＧＦＰ、ＭＥＴ単独、ＥＲＢＢ３単独またはＭＥＴおよびＥＲＢＢ３を用いてトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いて、ＭＥＴを使用した免疫沈降を行った。得られた溶解産物をＥＲＢＢ３またはＭＥＴでプローブした。見てわかるように、ＭＥＴのみが両方のコンストラクトでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のＥＲＢＢ３を免疫沈降させる。In another MET amplified cell line, MET activates ERBB3. E. ERBB3 coprecipitates with p85 in the presence of MET and is inhibited by PHA-665,752. Immunoprecipitation with ERBB3 of CHO cells transfected with GFP, ERBB3 or MET, and ERBB3 in the presence or absence of PHA-665,752 (1 μM), gefitinib (3 μM) or lapatinib (3 μM) Went. The resulting protein was dissolved and probed with a defined antibody. As can be seen, p85 coprecipitates with ERBB3 only in the presence of MET, which is inhibited by PHA-665,752, but not gefitinib or lapatinib. F. MET and ERBB3 coprecipitate of CHO cells. Immunoprecipitation using MET was performed using CHO cells transfected with GFP, MET alone, ERBB3 alone or MET and ERBB3, with or without PHA-665,752 (1 μM) treatment. The resulting lysate was probed with ERBB3 or MET. As can be seen, only MET immunoprecipitates ERBB3 in CHO cells transfected with both constructs. 異種移植片およびＮＳＣＬＣ患者の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析。ＨＣＣ８２７細胞およびＨＣＣ８７５ＧＲ５細胞異種移植片のパラフィン切片に対して、およびゲフィチニブ処理前および後の患者８の腫瘍標本に対して（図５）二重色ＦＩＳＨ（ＣＥＰ７（緑色）、１Ｄ７Ｓ５２２（赤色））を行った。ＨＣＣ８２７ＧＲ５細胞およびゲフィチニブ処理後腫瘍標本においてＭＥＴ増幅が明らかである。これらの画像の倍率は１０００×である。Fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis of xenografts and NSCLC patients. Double color FISH (CEP7 (green), 1D7S522 (red)) for paraffin sections of HCC827 and HCC875GR5 cell xenografts and for tumor specimens of patient 8 before and after gefitinib treatment (FIG. 5) went. MET amplification is evident in HCC827GR5 cells and gefitinib-treated tumor specimens. The magnification of these images is 1000 ×. ゲフィチニブまたはエルロチニブに対する耐性を獲得したＮＳＣＬＣ患者における遺伝子変化の要約。ＥＧＦＲ変異を有する１８人のＮＳＣＬＣ患者を、処理前および後の標本の対（ｎ＝８）または処理後の標本のみ（ｎ＝１０）を用いて、ＥＧＦＲ変異、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍの存在およびＭＥＴ増幅に関して定量ＰＣＲまたはＦＩＳＨによって解析した。結果の列は、ＱＰＣＲによって解析された患者のＭＥＴコピー数（標準偏差）およびＦＩＳＨによって解析された患者のＣＥＰ７と比較してさらに＞３のＭＥＴ遺伝子座のコピーを有する細胞のパーセントを示す。ＭＥＴ増幅を有する腫瘍標本に星印を付けている。１８人の患者のうち４人（２２％）に、処理後腫瘍標本における明らかなＭＥＴ増幅が見られ、１／４においてこの増幅はＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ同時変異を有する標本に起こる。Summary of genetic changes in NSCLC patients who acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Eighteen NSCLC patients with EGFR mutations were analyzed for EGFR mutation, presence of EGFR T790M and MET amplification, using pre- and post-treatment specimen pairs (n = 8) or post-treatment specimens only (n = 10). Analyzed by quantitative PCR or FISH. The results column shows the MET copy number (standard deviation) of patients analyzed by QPCR and the percentage of cells with a copy of> 3 more MET loci compared to CEP7 of patients analyzed by FISH. Tumor specimens with MET amplification are marked with an asterisk. Four of 18 patients (22%) have a clear MET amplification in post-treatment tumor specimens, and in 1/4 this amplification occurs in specimens with EGFR T790M co-mutation. ＨＣＣ８２７耐性細胞および親細胞株について、定量ＰＣＲによって測定されたＭＥＴコピー数のプロットを示す。結果は、ＨＣＣ８２７親細胞株と比較してすべてのＨＣＣ８２７耐性細胞株においてＭＥＴが５〜１０倍増幅されたことを示す。A plot of MET copy number measured by quantitative PCR for HCC827 resistant cells and the parent cell line is shown. The results show that MET was amplified 5 to 10 times in all HCC827 resistant cell lines compared to the HCC827 parental cell line. 親および耐性細胞をゲフィチニブ単独で、ＰＨＡ−６６５，７５２単独で、または両薬物を組み合わせて処理する。細胞抽出物を免疫ブロットし、規定の抗体でタンパク質を検出した。ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞は、ゲフィチニブおよびＭＥＴキナーゼ阻害剤ＰＨＡ−６６５，７５２の両方で処理した後のみ、アポトーシスを受ける。対照的に、切断された（８９ｋＤＡ）ＰＡＲＰの出現による基準としてアポトーシスを誘導するにはゲフィチニブ単独で十分である。Parental and resistant cells are treated with gefitinib alone, PHA-665,752 alone, or a combination of both drugs. Cell extracts were immunoblotted and proteins were detected with defined antibodies. HCC827GR cells undergo apoptosis only after treatment with both gefitinib and the MET kinase inhibitor PHA-665,752. In contrast, gefitinib alone is sufficient to induce apoptosis as a criterion by the appearance of cleaved (89 kDa) PARP. ＨＣＣ８２７親細胞株と比較してＨＣＣ８２７ＧＲクローンにおいて特異に過剰発現される上位２０個の遺伝子が示されている。遺伝子の染色***置および発現レベルの（６個のＨＣＣ８２７ＧＲクローンの）平均倍率変化もまた示されている。Shown are the top 20 genes that are specifically overexpressed in the HCC827GR clone compared to the HCC827 parental cell line. The average fold change (of 6 HCC827GR clones) in the chromosomal location and expression level of the gene is also shown. ＦＩＳＨにより分析した患者標本の破壊。各サンプルにおいて１００個の細胞を計数し、ＣＥＰ７と比較してさらに２個または３個より多いＭＥＴコピーを含有する細胞のパーセントを示す。Destruction of patient specimen analyzed by FISH. 100 cells in each sample are counted and indicate the percentage of cells containing 2 or more more MET copies compared to CEP7. ＨＧＦおよびゲフィチニブで処理した細胞の生存曲線。左上パネル、時間に対する生存細胞パーセント。右上パネルは、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ゲフィチニブ（ＴＨＩ）、またはＨＧＦおよびゲフィチニブの両方を用いて処理した細胞においてＡｋｔおよびリン酸化Ａｋｔを検出するウェスタンブロットを図示する。下パネルはＨＧＦおよびゲフィチニブで処理したディッシュにおける生存細胞を示す。Survival curve of cells treated with HGF and gefitinib. Upper left panel, percent viable cells over time. The upper right panel depicts a Western blot that detects Akt and phosphorylated Akt in cells treated with hepatocyte growth factor (HGF), gefitinib (THI), or both HGF and gefitinib. The lower panel shows viable cells in dishes treated with HGF and gefitinib.

１．定義
本明細書で使用する場合、以下の用語および語句は、以下に示す意味を有する。他で定義されていない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。 1. Definitions As used herein, the following terms and phrases have the meanings set forth below. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art.

用語「など」は、語句「それだけに限らないが、〜など」を意味するのに本明細書で使用し、これと互換的に使用する。   The term “such as” is used herein and interchangeably to mean the phrase “but not limited to” and the like.

単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、脈絡により他に明確に指示されていない限り、複数の参照を含む。   The singular forms “a”, “an”, and “the” include plural references unless the context clearly dictates otherwise.

用語「癌」は、本明細書で使用する場合、前癌性細胞と癌性細胞、および組織、ならびにすべての転移に対して、悪性であっても良性であっても、すべての腫瘍性の細胞成長ならびに増殖を指す。２つの一般的な癌の種類、すなわち良性と悪性が存在する。ほとんどすべての良性癌は被包性であり、非侵襲性である。対照的に、悪性癌は、ほとんど決して被包性ではなく、浸潤性、破壊性の成長によって隣接組織を浸潤する。この浸潤性成長に続いて、癌細胞が、原発癌と不連続な部位に移植する場合がある。最初の位置から遊走し、重要な器官を刺激する（それによって、転移性の病変を生じる）癌は、患部器官の機能劣化を通じて、最終的に対象の死に至る場合がある。転移は、原発癌から体の他の部分への癌細胞の内転移から生じる、原発癌の位置と異なる癌細胞の領域である。   The term “cancer” as used herein refers to all neoplastic cells, whether malignant or benign, for precancerous and cancerous cells and tissues, and all metastases. Refers to cell growth as well as proliferation. There are two common types of cancer: benign and malignant. Almost all benign cancers are encapsulated and noninvasive. In contrast, malignant cancers are almost never encapsulated and invade adjacent tissues with invasive, destructive growth. Following this invasive growth, cancer cells may be transplanted to sites discontinuous with the primary cancer. Cancers that migrate from their initial location and stimulate important organs (and thereby produce metastatic lesions) can eventually lead to the death of the subject through a deterioration of the function of the affected organ. Metastasis is a region of cancer cells that differs from the location of the primary cancer resulting from the internal metastasis of cancer cells from the primary cancer to other parts of the body.

用語「含む」および「含むこと」は、開放性の意味、すなわち追加の要素を含むことができる意味を含めて使用する。   The terms “comprising” and “including” are used to include an open meaning, that is, a meaning that can include additional elements.

用語「含めて」は、「それだけに限らないが、〜を含めて」を意味するのに使用する。「含めて」および「それだけに限らないが、〜を含めて」は、互換的に使用する。   The term “including” is used to mean “including but not limited to”. “Including” and “including but not limited to” are used interchangeably.

「患者」または「対象」は、当技術分野で既知の哺乳動物を指す。例示的な哺乳動物には、ヒト、霊長類、家畜動物（ウシ、ブタなどを含めて）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコなど）ならびにげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれる。   “Patient” or “subject” refers to a mammal known in the art. Exemplary mammals include humans, primates, livestock animals (including cows, pigs, etc.), companion animals (eg, dogs, cats, etc.) and rodents (eg, mice and rats).

本明細書で使用する場合、当業者に十分に理解されているように、「治療」は、臨床的結果を含めた有益な、または所望の結果を得るための手段である。有益な、または所望の臨床的結果として、それだけに限らないが、検出可能であっても、検出不可能であっても、１つまたは複数の症状または状態の軽減または寛解、疾患の程度の縮小、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化していない）、疾患の蔓延の予防、疾患の経過の遅延または緩徐化、疾患状態の寛解または緩和、緩解（部分的または全体的）を挙げることができる。「治療」は、治療を受けていない場合に予期される生存時間と比較して、生存期間を延長することも意味することができる。   As used herein, as well understood by those of skill in the art, “treatment” is a means for obtaining beneficial or desired results, including clinical results. Beneficial or desired clinical outcome, including, but not limited to, reducing or ameliorating one or more symptoms or conditions, reducing the degree of disease, whether detectable or undetectable, Stabilize (ie, have not worsened) the disease state, prevent the spread of the disease, delay or slow down the course of the disease, remission or alleviation of the disease state, remission (partial or total) . “Treatment” can also mean prolonging survival as compared to expected survival if not receiving treatment.

２．ＥＧＦＲ ＴＫＩ耐性の癌を治療するための方法
本明細書では、抗ＥｒｂＢ治療剤と抗ＭＥＴ治療剤の組合せを使用して、癌を治療し、癌にかかっている対象の平均余命を延長し、または１つもしくは複数の、癌に関連する症状を低減するための方法を提供する。例えば、抗ＥｒｂＢｌ治療剤（ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１）、抗ＥｒｂＢ２治療剤（ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ／Ｈｅｒ２）、抗ＥＲＢ３治療剤（ＥｒｂＢ３／Ｈｅｒ３）、または抗ＥｒｂＢ４治療剤（ＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４）を含めた任意の抗ＥｒｂＢ治療剤を、本明細書に記載される方法に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＥｒｂＢ活性および／または発現レベルの上昇（例えば、ＥｒｂＢ活性化突然変異、ＥｒｂＢ遺伝子増幅、またはリガンド媒介ＥｒｂＢ活性化）ならびにＭＥＴ活性および／または発現レベルの上昇（例えば、ＭＥＴ活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化など）に関連する癌に罹患している対象を治療するのに使用することができる。ＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化は、ＨＧＦ活性および／または発現レベルのレベルの上昇（例えば、ＨＧＦ活性化突然変異またはＨＧＦ遺伝子増幅など）に関連する場合がある。 2. Methods for treating EGFR TKI resistant cancers Herein, a combination of an anti-ErbB therapeutic agent and an anti-MET therapeutic agent is used to treat cancer and prolong the life expectancy of a subject suffering from cancer. Alternatively, a method for reducing one or more cancer-related symptoms is provided. Any, including, for example, anti-ErbBl therapeutic (ErbB1 / EGFR / HER1), anti-ErbB2 therapeutic (ErbB2 / Neu / Her2), anti-ERB3 therapeutic (ErbB3 / Her3), or anti-ErbB4 therapeutic (ErbB4 / Her4) Of anti-ErbB therapeutics can be used according to the methods described herein. In certain embodiments, the methods described herein may increase ErbB activity and / or expression levels (eg, ErbB activating mutation, ErbB gene amplification, or ligand-mediated ErbB activation) and MET activity and It can be used to treat a subject suffering from a cancer associated with increased expression levels (eg, MET activating mutation, MET gene amplification, or HGF mediated MET activation, etc.). HGF-mediated MET activation may be associated with increased levels of HGF activity and / or expression levels (eg, HGF activating mutation or HGF gene amplification, etc.).

例示的な実施形態では、本明細書に記載される方法は、以下の種類の癌の１つまたは複数を治療するのに使用することができる：卵巣、膵臓、肺、脳、***、頭頸部、大腸、胃、膵臓、直腸、腎臓、肝臓、膀胱、前立腺、胃、甲状腺、下垂体、副腎性またはグリア芽細胞腫の癌。例示的な実施形態では、この方法は、肺癌、例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などを治療するのに使用することができる。   In an exemplary embodiment, the methods described herein can be used to treat one or more of the following types of cancer: ovary, pancreas, lung, brain, breast, head and neck Cancer of large intestine, stomach, pancreas, rectum, kidney, liver, bladder, prostate, stomach, thyroid, pituitary, adrenal or glioblastoma. In an exemplary embodiment, the method can be used to treat lung cancer, such as non-small cell lung cancer (NSCLC).

癌に関連する場合があるＥｒｂＢ活性化突然変異の例として、例えば、点突然変異、欠失突然変異、挿入突然変異、反転またはＥｒｂＢタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増大させる遺伝子増幅が挙げられる。例示的な生物活性として、例えば、チロシンキナーゼ活性（ＥｒｂＢｌ、ＥｒｂＢ２、またはＥｒｂＢ４）、タンパク質間相互作用の形成（例えば、受容体ホモまたはヘテロ二量体化、リガンド結合、基質への結合など）、またはＥｒｂＢ媒介シグナル伝達が挙げられる。突然変異は、ＥｒｂＢ遺伝子の任意の部分、またはＥｒｂＢ遺伝子に関連する調節領域に位置することができる。例示的なＥｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）突然変異には、例えば、エクソン１８、１９、２０または２１における突然変異、キナーゼドメインにおける突然変異、Ｇ７１９Ａ、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｓ７６８Ｉ、Ｌ８５８Ｐ、Ｅ７４６−Ｒ７４８ ｄｅｌ、Ｒ７４８−Ｐ７５３ ｄｅｌ、Ｍ７６６−Ａ７６７ Ａｌ ｉｎｓ、Ｓ７６８−Ｖ７６９ ＳＶＡ ｉｎｓ、Ｐ７７２−Ｈ７７３ ＮＳ ｉｎｓ、２４０２Ｇ＞Ｃ、２４８２Ｇ＞Ａ、２４８６Ｔ＞Ｃ、２４９１Ｇ＞Ｃ、２４９４Ｇ＞Ｃ、２５１０Ｃ＞Ｔ、２５３９Ｇ＞Ａ、２５４９Ｇ＞Ｔ、２５６３Ｃ＞Ｔ、２８１９Ｔ＞Ｃ、２４８２−２４９０ ｄｅｌ、２４８６−２５０３ ｄｅｌ、２５４４−２５４５ ｉｎｓ ＧＣＣＡＴＡ、２５５４−２５５５ ｉｎｓ ＣＣＡＧＣＧＴＧＧ、または２５６２−２５６３ ｉｎｓ ＡＡＣＴＣＣが含まれる。ＥｒｂＢ１活性化突然変異の他の例は、当技術分野で既知である（例えば、米国特許公開第２００５／０２７２０８３を参照されたい）。例示的なＥｒｂＢ２突然変異には、例えば、キナーゼドメインにおける突然変異、またはエクソン２０挿入、例えば、Ｇ７７６ｉｎｓＶ＿Ｇ／ＣおよびＡ７７５ｉｎｓＹＶＭＡなどが含まれる。例示的なＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４突然変異として、例えば、キナーゼドメインにおける突然変異を挙げることができる。ヒトＥｒｂＢｌ、ヒトＥｒｂＢ２、ヒトＥｒｂＢ３およびヒトＥｒｂＢ４を含めた様々なＥｒｂＢ配列についてのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、公的に入手可能であり、例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．でのワールドワイドウェブ上で見出すことができる。例えば、ヒトＥｒｂＢｌ（ＥＧＦＲ）についてのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００５２２８およびＮＰ＿００５２１９に見出すことができ、ヒトＥｒｂＢ２についてのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００４４４８およびＮＰ＿００４４３９に見出すことができ、ヒトＥｒｂＢ３についてのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００１９８２およびＮＰ＿００１９７３に見出すことができ、ヒトＥｒｂＢ４についてのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００５２３５およびＮＰ＿００５２２６に見出すことができる。受容体ホモ−およびヘテロ−二量体を含めたＥｒｂＢ受容体、受容体リガンド、自己リン酸化部位、およびＥｒｂＢ媒介シグナル伝達に関与するシグナル伝達分子についての情報は、当技術分野で既知である（例えば、Ｈｙｎｅｓ ａｎｄ Ｌａｎｅ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ５巻：３４１〜３５４頁（２００５年）を参照されたい）。   Examples of ErbB activating mutations that may be associated with cancer include, for example, point mutations, deletion mutations, insertion mutations, inversions, or gene amplification that increases at least one biological activity of the ErbB protein. Exemplary biological activities include, for example, tyrosine kinase activity (ErbB1, ErbB2, or ErbB4), formation of protein-protein interactions (eg, receptor homo- or heterodimerization, ligand binding, binding to a substrate, etc.), Or ErbB mediated signaling. The mutation can be located in any part of the ErbB gene or in a regulatory region associated with the ErbB gene. Exemplary ErbB1 (EGFR) mutations include, for example, mutations in exon 18, 19, 20 or 21, mutations in the kinase domain, G719A, L858R, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, V765M, S768I, L858P, E746-R748 del, R748-P753 del, M766-A767 Al ins, S768-V769 SVA ins, P772-H773 NS ins 2402G> C, 2482G> A, 2486T> C, 2491G> C, 2494G> C, 2510C> T, 2539G> A, 2549G> T, 2563C> T, 2819T> C, 2482-2490 del, 2486-2503 del, 2544-2545 ins GCCATA 2554-2555 is included ins CCAGCGTGG or 2562-2563 ins AACTCC,. Other examples of ErbB1 activating mutations are known in the art (see, eg, US Patent Publication No. 2005/0272083). Exemplary ErbB2 mutations include, for example, mutations in the kinase domain, or exon 20 insertions such as G776insV_G / C and A775insYVMA. Exemplary ErbB3 and ErbB4 mutations can include, for example, mutations in the kinase domain. Nucleotide and amino acid sequences for various ErbB sequences, including human ErbB1, human ErbB2, human ErbB3 and human ErbB4 are publicly available, see, eg, ncbi. nlm. nih. gov. Can be found on the World Wide Web at. For example, the nucleotide and amino acid sequences for human ErbB1 (EGFR) can be found in GenBank accession numbers NM_005228 and NP_005219, respectively, and the nucleotide and amino acid sequences for human ErbB2 can be found in GenBank accession numbers NM_004448 and The nucleotide and amino acid sequences for human ErbB3 can be found in GenBank accession numbers NM_001982 and NP_001973, respectively, and the nucleotide and amino acid sequences for human ErbB4 can be found in GenBank accession numbers, respectively. What to find in NM_005235 and NP_005226 Can. Information about ErbB receptors, including receptor homo- and hetero-dimers, receptor ligands, autophosphorylation sites, and signaling molecules involved in ErbB-mediated signaling are known in the art ( (See, for example, Hynes and Lane, Nature Reviews Cancer 5: 341-354 (2005)).

他の実施形態では、ＥｒｂＢ活性化突然変異は、ＥｒｂＢ配列自体の外側の突然変異であってもよく、これは、ＥｒｂＢタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増大させる。例えば、ＥｒｂＢリガンドを過剰発現させる突然変異は、ＥｒｂＢ活性を増大させることができ、したがって、ＥｒｂＢ活性化突然変異とみなされるであろう。同様に、ＥｒｂＢ発現に関与する転写因子を過剰発現させる突然変異は、ＥｒｂＢタンパク質を過剰発現させ、ＥｒｂＢ活性を増大させることができ、したがって、やはりＥｒｂＢ活性化突然変異とみなされるであろう。そのような例は単に例示的であり、様々な他のＥｒｂＢ活性化突然変異は、本明細書に提供される開示に基づいて当業者によって企図することができる。   In other embodiments, the ErbB activating mutation may be a mutation outside of the ErbB sequence itself, which increases at least one biological activity of the ErbB protein. For example, a mutation that overexpresses an ErbB ligand can increase ErbB activity and therefore would be considered an ErbB activating mutation. Similarly, a mutation that overexpresses a transcription factor involved in ErbB expression can overexpress the ErbB protein and increase ErbB activity, and therefore would also be considered an ErbB activating mutation. Such examples are merely illustrative, and a variety of other ErbB activating mutations can be contemplated by one of skill in the art based on the disclosure provided herein.

例示的な実施形態では、本明細書に記載される方法は、抗ＥｒｂＢ１療法、抗ＥｒｂＢ２療法、抗ＥｒｂＢ３療法、および／または抗ＥｒｂＢ４療法を含めた、１つまたは複数の抗ＥｒｂＢ療法を用いた療法に耐性を獲得した癌を治療するのに使用することができる。様々な抗ＥｒｂＢ治療剤は、当技術分野で既知であり、例えば、小分子治療剤、タンパク質治療剤、または核酸治療剤を含む。さらに、抗ＥｒｂＢ治療剤の例は、本明細書で以下に提供される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＥｒｂＢキナーゼ阻害剤を用いた治療に耐性である癌を治療するのに使用することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＥｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）キナーゼ阻害剤を用いた療法に耐性である癌を治療するのに使用することができる。例示的な実施形態では、本明細書に記載される方法は、ゲフィチニブ、エルロチニブまたは両方を用いた治療に耐性である癌を治療するのに使用することができる。   In an exemplary embodiment, the methods described herein used one or more anti-ErbB therapies, including anti-ErbB1 therapy, anti-ErbB2 therapy, anti-ErbB3 therapy, and / or anti-ErbB4 therapy It can be used to treat cancer that has acquired resistance to therapy. Various anti-ErbB therapeutics are known in the art and include, for example, small molecule therapeutics, protein therapeutics, or nucleic acid therapeutics. In addition, examples of anti-ErbB therapeutics are provided herein below. In certain embodiments, the methods described herein can be used to treat cancer that is resistant to treatment with an ErbB kinase inhibitor. In certain embodiments, the methods described herein can be used to treat cancer that is resistant to therapy with an ErbB1 (EGFR) kinase inhibitor. In exemplary embodiments, the methods described herein can be used to treat cancer that is resistant to treatment with gefitinib, erlotinib, or both.

様々な質的および／または定量的な方法を、対象が抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療に耐性を発生させている、または耐性を発生させることに感受性であるかを判定するのに使用することができる。例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤を服用しながら最初の改善を示した対象は、抗ＥｒｂＢ治療剤の有効性が小さくなり、またはもはや有効でなくなった徴候を示す場合がある。耐性と関連して低下または減少し得る、有効な抗ＥｒｂＢ治療剤の例示的な指標には、例えば、患者の健康の改善、腫瘍サイズの減少または縮小、腫瘍成長の停止または減速、および／または体内の他の部位への癌細胞の転移のないことが含まれる。抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性に関連し得る症状として、例えば、患者の健康の低下または横ばい状態、腫瘍サイズの増大、腫瘍成長低下の停止または減速、および／または１つの部位から他の器官、組織、または細胞への体内での癌性細胞の蔓延が挙げられる。   Use various qualitative and / or quantitative methods to determine whether a subject is developing resistance to, or sensitive to, developing treatment with an anti-ErbB therapeutic. Can do. For example, a subject who shows an initial improvement while taking an anti-ErbB therapeutic may show signs that the anti-ErbB therapeutic is less effective or no longer effective. Exemplary indicators of effective anti-ErbB therapeutics that may be reduced or decreased in connection with resistance include, for example, improved patient health, reduced or reduced tumor size, cessation or slowing of tumor growth, and / or This includes the absence of cancer cell metastasis to other parts of the body. Symptoms that may be associated with resistance to anti-ErbB therapeutics include, for example, decreased or flattened patient health, increased tumor size, stopped or slowed down tumor growth, and / or from one site to another organ, tissue, Or the spread of cancerous cells in the body to the cells.

癌に関連する様々な症状は、抗ＥｒｂＢ療法に対する耐性を発生させた、または耐性を発生させることに感受性である対象を特定するのに使用することもできる。特に、そのような症状は、抗ＥｒｂＢ療法を用いて治療されている対象において、発症、悪化、または再発する場合がある。例示的な症状として、例えば、食欲不振症、認知機能障害、抑うつ症、呼吸困難、疲労、ホルモン撹乱、好中球減少、疼痛、末梢ニューロパチー、および性機能障害が挙げられる。癌に関連する症状は、癌の種類によって変化し得る。例えば、子宮頚癌に関連する症状には、例えば、異常出血、異常な大量の腟分泌物、通常の月経周期に関係していない骨盤痛、排尿の間の膀胱痛または疼痛、および規則的な月経期の間、***、圧注、もしくは骨盤内診察後の出血が含まれる。肺癌に関連する症状として、例えば、持続性の咳、喀血、息切れ、喘鳴胸痛、食欲低下、試みや疲労を伴わない体重低下を挙げることができる。肝癌に対する症状として、例えば、食欲ならびに体重低下、特に、背中および肩に及ぶ場合のある、腹部の右上部分の腹痛、吐き気ならびに嘔吐、一般的な脱力感ならびに疲労、肝肥大、腹部膨満（腹水）、ならびに皮膚および白眼の黄変（黄疸）を挙げることができる。腫瘍学における当業者は、特定の癌の種類に関連する症状を容易に特定することができる。   Various symptoms associated with cancer can also be used to identify subjects who have developed or are susceptible to developing resistance to anti-ErbB therapy. In particular, such symptoms may develop, worsen, or recur in a subject being treated with anti-ErbB therapy. Exemplary symptoms include, for example, anorexia, cognitive impairment, depression, dyspnea, fatigue, hormonal disturbance, neutropenia, pain, peripheral neuropathy, and sexual dysfunction. Cancer-related symptoms can vary depending on the type of cancer. For example, symptoms associated with cervical cancer include, for example, abnormal bleeding, abnormally large vaginal discharge, pelvic pain not related to the normal menstrual cycle, bladder pain or pain during urination, and regular During menstruation, this includes bleeding after intercourse, pressure injection, or pelvic examination. Symptoms associated with lung cancer include, for example, persistent cough, hemoptysis, shortness of breath, wheezing chest pain, loss of appetite, weight loss without trial or fatigue. Symptoms for liver cancer include, for example, appetite and weight loss, especially abdominal pain in the upper right part of the abdomen, nausea and vomiting that may affect the back and shoulders, general weakness and fatigue, liver enlargement, abdominal distension (ascites) And yellowing of the skin and white eyes (jaundice). One skilled in oncology can readily identify symptoms associated with a particular cancer type.

対象が、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を発生させたかどうかを判定するための他の手段には、例えば、以下のうちの１つまたは複数を検査することが含まれる：ＥｒｂＢｌ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、もしくはＥｒｂＢ４リン酸化、ホスファチジルイノシトール３’−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）媒介シグナル伝達、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、もしくはＥｒｂＢ４媒介シグナル伝達、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する癌細胞の感受性、癌細胞の成長もしくは増殖、または癌細胞アポトーシス。例えば、対照と比較した場合の、ＥｒｂＢリン酸化、ＰＩ３Ｋ媒介シグナル伝達、および／またはＥｒｂＢ媒介シグナル伝達の増大は、対象が、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を発生させた、または耐性を発生させることに感受性であることを示している場合がある。ＥｒｂＢリン酸化、ＰＩ３Ｋ媒介シグナル伝達およびＥｒｂＢ媒介シグナル伝達を判定するための方法は、既知の技法を使用して決定することができ、本明細書でさらに説明される。   Other means for determining whether a subject has developed resistance to an anti-ErbB therapeutic include, for example, examining one or more of the following: ErbBl, ErbB2, ErbB3, or ErbB4 phosphorylation, phosphatidylinositol 3′-kinase (PI3K) mediated signaling, ErbB1, ErbB2, ErbB3, or ErbB4 mediated signaling, sensitivity of cancer cells to anti-ErbB therapeutics, growth or proliferation of cancer cells, or cancer cell apoptosis . For example, an increase in ErbB phosphorylation, PI3K mediated signaling, and / or ErbB mediated signaling, as compared to a control, may indicate that the subject has developed or develops resistance to an anti-ErbB therapeutic. May indicate sensitivity. Methods for determining ErbB phosphorylation, PI3K mediated signaling and ErbB mediated signaling can be determined using known techniques and are further described herein.

さらに、対照と比較した場合の、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する癌細胞の感受性の減少、癌細胞の成長もしくは増殖の増大、および／または癌細胞アポトーシスの減少も、対象が、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を発生させた、または耐性を発生させることに感受性であることを示している場合がある。本明細書でさらに説明される標準的な方法を使用して、癌細胞の感受性、成長、増殖またはアポトーシスを判定することが可能である。例えば、癌細胞の感受性、成長、増殖またはアポトーシスは、インサイチュまたはインビトロで判定することができる。インサイチュでの測定では、例えば、癌の成長または転移を検査することによって、対象における抗ＥｒｂＢ療法の効果を観察することができる。あるいは、対象由来の癌細胞の試料を取り出し、インビトロで試験することによって、例えば、対象由来の細胞の感受性、成長、増殖またはアポトーシスを判定することができる。インビトロ分析では、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いてインサイチュで処理し、次いでインビトロでの分析のために対象から取り出した細胞の分析を行うことができ、または癌細胞をインビトロで抗ＥｒｂＢ療法と接触させることができる。癌細胞の成長、増殖およびアポトーシスを検査するための適当な方法を、以下にさらに説明する。   In addition, decreased sensitivity of cancer cells to anti-ErbB therapeutics, increased growth or proliferation of cancer cells, and / or decreased apoptosis of cancer cells compared to controls may also reduce the resistance of anti-ErbB therapeutics to a subject. It may indicate that it is susceptible to developing or developing resistance. Standard methods further described herein can be used to determine cancer cell sensitivity, growth, proliferation or apoptosis. For example, cancer cell sensitivity, growth, proliferation or apoptosis can be determined in situ or in vitro. In situ measurements can observe the effects of anti-ErbB therapy in a subject, for example, by examining cancer growth or metastasis. Alternatively, a sample of cancer cells from a subject can be removed and tested in vitro, for example, to determine the sensitivity, growth, proliferation or apoptosis of cells from the subject. In vitro analysis can be performed in situ with an anti-ErbB therapeutic, followed by analysis of cells removed from the subject for in vitro analysis, or contacting cancer cells with anti-ErbB therapy in vitro Can do. Suitable methods for examining cancer cell growth, proliferation and apoptosis are further described below.

様々な実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性の１つまたは複数の測定値を対照と比較することが望ましい場合がある。例示的な対照として、例えば、治療前の同じ対象、治療の間のより早い時点での同じ対象、または療法に耐性であってもなくてもよい、同じ抗ＥｒｂＢ療法を受けている異なる対象における、健康、腫瘍サイズ、腫瘍成長、または転移の存在または速度が挙げられる。他の種類の適当な対照として、例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療の間のより早い時点での同じ対象、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療の前の同じ対象、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療に応答性である対照の対象、既知の抗ＥｒｂＢ応答性を有する細胞株、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療に耐性である対照の対象に由来する細胞の抗ＥｒｂＢ治療剤に対する感受性、成長、増殖もしくはアポトーシス、または所与の測定についての基準値が挙げられる。そのような対照は、所与の対象について上述したものと類似したインサイチュ測定またはインビトロ測定とすることができる。様々な実施形態では、対照は、治療前の同じ対象からの同じ組織由来の細胞、治療の間のより早期の同じ対象からの同じ組織由来の細胞、同じ対象由来の非腫瘍形成性細胞、他の対象由来の非腫瘍形成性細胞、集団または複数の対象由来の非腫瘍形成性細胞、または確立された細胞株を利用することができる。対照は、ハードコピーまたはデータベースにおける基準値または表とすることもでき、これは、関連情報、例えば、性別、癌の状態、任意の転移の存在、投与される任意の種類の治療、ＥｒｂＢ遺伝子中の活性化突然変異または遺伝子増幅の存在または非存在、ＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異または遺伝子増幅の存在または非存在、ＥｒｂＢリン酸化のレベル、ＰＩ３Ｋシグナル伝達のレベルなどを場合により伴った１つまたは複数の個体から導き出すことができる。   In various embodiments, it may be desirable to compare one or more measures of resistance to an anti-ErbB therapeutic with a control. Exemplary controls include, for example, the same subject prior to treatment, the same subject at an earlier time during treatment, or different subjects receiving the same anti-ErbB therapy, which may or may not be resistant to therapy. , Health, tumor size, tumor growth, or the presence or rate of metastasis. As other types of suitable controls, for example, using the same subject at an earlier time during treatment with an anti-ErbB therapeutic, the same subject prior to treatment with an anti-ErbB therapeutic, an anti-ErbB therapeutic Control subjects responsive to treatment, cell lines with known anti-ErbB responsiveness, sensitivity of cells derived from control subjects resistant to treatment with anti-ErbB therapeutics to anti-ErbB therapeutics, growth Reference values for proliferation, apoptosis, or a given measurement. Such a control can be an in situ measurement or an in vitro measurement similar to that described above for a given subject. In various embodiments, the controls are cells from the same tissue from the same subject prior to treatment, cells from the same tissue from the same subject earlier during treatment, non-tumorigenic cells from the same subject, etc. Non-tumorigenic cells from multiple subjects, non-tumorigenic cells from a population or multiple subjects, or established cell lines can be utilized. The control can also be a hard copy or a reference value or table in a database, which can be related information such as sex, cancer status, presence of any metastasis, any kind of treatment administered, in the ErbB gene One optionally associated with the presence or absence of an activating mutation or gene amplification, presence or absence of an activating mutation or gene amplification in the MET gene, level of ErbB phosphorylation, level of PI3K signaling, etc. Or it can be derived from multiple individuals.

さらに他の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を発生させた対照の識別では、例えば、ＭＥＴ遺伝子の活性化突然変異、またはＭＥＴ遺伝子増幅から生じる、ＭＥＴ発現レベルの上昇、またはＭＥＴ活性の上昇を検出することができる。ＭＥＴ遺伝子の活性化突然変異は、例えば、点突然変異、欠失突然変異、挿入突然変異、反転またはＭＥＴタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増大させる遺伝子増幅を含めた任意の種類の突然変異とすることができる。例示的な生物活性として、例えば、チロシンキナーゼ活性、タンパク質間相互作用の形成（例えば、受容体ホモまたはヘテロ二量体化、リガンド結合、基質への結合など）、およびＭＥＴ媒介シグナル伝達が挙げられる。突然変異は、ＭＥＴ遺伝子の任意の部分、またはこの遺伝子に関連する調節領域に位置することができる。例示的な突然変異には、例えば、ＭＥＴのキナーゼドメインにおける突然変異、または野生型ＭＥＴと比べて、以下の位置の任意の１つまたは複数でのアミノ酸変化をもたらす突然変異が含まれる：Ｎ３７５、Ｉ６３８、Ｖ１３、Ｖ９２３、Ｉ３１６およびＥ１６８。ＭＥＴ突然変異または遺伝子増幅を検出するための方法は、当技術分野で認められた技法を伴い、これらは、本明細書でさらに説明される。他の実施形態では、ＭＥＴ活性化突然変異は、ＭＥＴ配列自体の外側の突然変異であってもよく、これは、ＭＥＴタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増大させる。例えば、ＭＥＴリガンドを過剰発現させる突然変異は、ＭＥＴ活性を増大させることができ、したがって、ＭＥＴ活性化突然変異とみなされるであろう。同様に、ＭＥＴ発現に関与する転写因子を過剰発現させる突然変異は、ＭＥＴを過剰発現させ、ＭＥＴ活性を増大させることができ、したがって、やはりＭＥＴ活性化突然変異とみなされるであろう。そのような例は単に例示的であり、様々な他のＭＥＴ活性化突然変異は、本明細書に提供される開示に基づいて当業者によって企図することができる。   In still other embodiments, identifying a control that has developed resistance to an anti-ErbB therapeutic includes, for example, increased MET expression levels, or increased MET activity resulting from activating mutations in the MET gene, or MET gene amplification, for example. Can be detected. An activating mutation of the MET gene is any kind of mutation including, for example, point mutations, deletion mutations, insertion mutations, inversions or gene amplifications that increase at least one biological activity of the MET protein. be able to. Exemplary biological activities include, for example, tyrosine kinase activity, formation of protein-protein interactions (eg, receptor homo- or heterodimerization, ligand binding, binding to substrates, etc.), and MET-mediated signaling. . Mutations can be located in any part of the MET gene, or in the regulatory region associated with this gene. Exemplary mutations include, for example, mutations in the kinase domain of MET, or mutations that result in amino acid changes at any one or more of the following positions compared to wild-type MET: N375, I638, V13, V923, I316 and E168. Methods for detecting MET mutations or gene amplification involve techniques recognized in the art, which are further described herein. In other embodiments, the MET activating mutation may be a mutation outside of the MET sequence itself, which increases at least one biological activity of the MET protein. For example, a mutation that overexpresses a MET ligand can increase MET activity and therefore would be considered a MET activating mutation. Similarly, a mutation that overexpresses a transcription factor involved in MET expression can overexpress MET and increase MET activity, and therefore would also be considered a MET activating mutation. Such examples are merely illustrative, and various other MET activating mutations can be contemplated by one of ordinary skill in the art based on the disclosure provided herein.

ある特定の実施形態では、ＭＥＴ活性のレベルの上昇は、ＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化と関連することができる。ＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化は、例えば、ＨＧＦ活性化突然変異またはＨＧＦ遺伝子増幅と関連することができる。ＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化、ＨＧＦ活性化突然変異またはＨＧＦ遺伝子増幅を検出するための方法は、当技術分野で認められた技法を伴い、これらは、本明細書でさらに説明される。   In certain embodiments, increased levels of MET activity can be associated with HGF-mediated MET activation. HGF-mediated MET activation can be associated with, for example, HGF activating mutation or HGF gene amplification. Methods for detecting HGF-mediated MET activation, HGF activating mutations or HGF gene amplification involve techniques recognized in the art, which are further described herein.

例示的な実施形態では、上記方法の組合せは、抗ＥｒｂＢ療法に対する耐性を発生させた、または耐性を発生させることに感受性である対象を識別するのに使用することができる。例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療の過程の間、対象の健康、腫瘍サイズ、および／または癌の転移を、医師によってモニターすることができる。対象が、抗ＥｒｂＢ療法の有効性が低下していることを示す症状を示し始めた場合、二次スクリーニングを使用することによって、抗ＥｒｂＢ療法に耐性となってきている対象を識別することができる。例えば、対象をスクリーニングすることによって、ＥｒｂＢリン酸化、ＰＩ３Ｋ媒介シグナル伝達、ＥｒｂＢ媒介シグナル伝達、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する癌細胞の感受性、癌細胞の成長もしくは増殖、癌細胞アポトーシス、および／またはＭＥＴ活性もしくは発現のレベルの上昇、例えば、ＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、もしくはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化などの存在を検査することができる。例示的な実施形態では、抗ＥｒｂＢ療法を受けている対象は、対象の健康、腫瘍サイズ、および／または癌の転移に基づいて、耐性の徴候について治療過程の間モニターされる。次いで抗ＥｒｂＢ療法に耐性であるリスクの疑いのある対象は、試験されることによって、その対象がＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化を有するかどうかを識別される。他の実施形態では、対象の健康、腫瘍サイズ、および／または癌の転移に関わらず、ＭＥＴ遺伝子の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化の存在について、抗ＥｒｂＢ療法を用いた治療過程の間、対象をモニターすることができる。さらに他の実施形態では、抗ＥｒｂＢ療法を用いた治療を受けている対象を、治療の間モニターすることによって、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する癌細胞の感受性、癌細胞の成長もしくは増殖、および／または癌細胞アポトーシスを判定することができる。次いで抗ＥｒｂＢ治療剤に耐性であるリスクの疑いのある対象は、ＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化の存在について試験することができる。上述した組合せは単に例示的であり、すべての他の可能な組合せも本明細書で企図されており、本開示に基づけば当業者に明白となるであろう。   In an exemplary embodiment, a combination of the above methods can be used to identify subjects who have developed or are susceptible to developing resistance to anti-ErbB therapy. For example, a subject's health, tumor size, and / or cancer metastasis can be monitored by a physician during the course of treatment with an anti-ErbB therapeutic. If a subject begins to show symptoms that indicate that anti-ErbB therapy is less effective, secondary screening can be used to identify subjects that have become resistant to anti-ErbB therapy. . For example, by screening subjects, ErbB phosphorylation, PI3K mediated signaling, ErbB mediated signaling, sensitivity of cancer cells to anti-ErbB therapeutics, cancer cell growth or proliferation, cancer cell apoptosis, and / or MET activity or The presence of elevated levels of expression, such as activating mutations in the MET gene, MET gene amplification, or HGF-mediated MET activation, can be examined. In an exemplary embodiment, a subject undergoing anti-ErbB therapy is monitored during the course of treatment for signs of resistance based on the subject's health, tumor size, and / or cancer metastasis. Subjects suspected of being resistant to anti-ErbB therapy are then tested to identify whether the subject has an activating mutation in the MET gene, MET gene amplification, or HGF-mediated MET activation Is done. In other embodiments, anti-ErbB therapy is used for the presence of MET gene activating mutation, MET gene amplification, or HGF-mediated MET activation, regardless of the subject's health, tumor size, and / or cancer metastasis. The subject can be monitored during the course of treatment. In yet other embodiments, a subject undergoing treatment with anti-ErbB therapy is monitored during treatment to monitor the sensitivity of cancer cells to anti-ErbB therapeutics, growth or proliferation of cancer cells, and / or cancer. Cell apoptosis can be determined. Subjects suspected of being resistant to an anti-ErbB therapeutic can then be tested for the presence of an activating mutation, MET gene amplification, or HGF-mediated MET activation in the MET gene. The combinations described above are merely exemplary, and all other possible combinations are contemplated herein and will be apparent to those skilled in the art based on the present disclosure.

様々な実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性についてモニターされている対象は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療の過程の間、１つまたは複数の時点で評価することができる。例示的な実施形態では、対象は、治療過程の間、規則的な間隔でモニターすることができる。例えば、対象は、それぞれ医師に診てもらう間、それぞれの抗ＥｒｂＢ治療剤の投薬などを施すとともに、少なくとも１日１回、１日おきに１回、１週間に１回、１週間おきに１回、１カ月に１回モニターすることができる。モニタリングは、対象による自己評価、医師による評価、実験室試験に基づく評価、およびこれらの様々な組合せを伴うことができる。   In various embodiments, a subject being monitored for resistance to an anti-ErbB therapeutic can be evaluated at one or more time points during the course of treatment with the anti-ErbB therapeutic. In an exemplary embodiment, the subject can be monitored at regular intervals during the course of treatment. For example, each subject is administered each anti-ErbB therapeutic agent while seeing a doctor, and at least once a day, once every other day, once a week, and once every other week. Can be monitored once a month. Monitoring can involve subject self-assessment, physician assessment, laboratory test assessment, and various combinations thereof.

抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を発生させ、またはそのような耐性を発生させることに感受性となり、ＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化を有する対象が特定された時点で、抗ＥｒｂＢ療法と抗ＭＥＴ療法の組合せがその患者に投与される。例示的な抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を本明細書でさらに説明する。例示的な実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤は、以下の１つまたは複数からそれぞれ個々に選択される：小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤。例示的な実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤は、抗ＥＧＦＲ治療剤、例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ＢＩＢＷ２９９２、ＺＤ６４７４、ＡＶ−４１２、ＥＸＥＬ−７６４７、ＨＫＩ−２７２、セツキシマブ、パンチヌムマブ、もしくはトラスツズマブ、またはこれらの組合せなどであり、抗ＭＥＴ治療剤は、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＳＵ５４１６、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２、もしくはＯＡ−５Ｄ５、またはこれらの組合せである。   Once resistance to an anti-ErbB therapeutic is developed or sensitized to developing such resistance and a subject with an activating mutation in the MET gene, MET gene amplification or HGF-mediated MET activation is identified A combination of anti-ErbB therapy and anti-MET therapy is administered to the patient. Exemplary anti-ErbB therapeutics and anti-MET therapeutics are further described herein. In exemplary embodiments, the anti-ErbB therapeutic and anti-MET therapeutic are each individually selected from one or more of the following: a small molecule therapeutic, a nucleic acid therapeutic, or a protein therapeutic. In exemplary embodiments, the anti-ErbB therapeutic agent is an anti-EGFR therapeutic agent, such as gefitinib, erlotinib, lapatinib, PF00299804, CI-1033, EKB-569, BIBW2992, ZD6474, AV-412, EXEL-7647, HKI- 272, cetuximab, pantinumumab, or trastuzumab, or combinations thereof, and anti-MET therapeutic agents include PHA-665,752, SU11274, SU5416, PF-02341066, XL-880, MGCD265, XL184, ARQ197, MP-470 SGX-523, JNJ38887705, AMG102, or OA-5D5, or combinations thereof.

ある特定の実施形態では、抗ＭＥＴ治療剤との組合せの一部として投与される抗ＥｒｂＢ治療剤は、対象が耐性を発生させたのと同じ抗ＥｒｂＢ治療剤である。例えば、対象が、エルロチニブ（抗ＥｒｂＢ１治療剤）を用いて治療されており、次いでこの治療剤に対する耐性を発生させた場合、この対象は、将来、エルロチニブと、例えば、ＰＨＡ−６６５７５２（抗ＭＥＴ治療剤）の組合せを用いて治療することができる。あるいは、抗ＥｒｂＢ治療剤は、対象が耐性を発生させた治療剤と異なっていてもよい。例えば、対象が、エルロチニブを用いて治療されており、次いでこの治療剤に対する耐性を発生させた場合、この対象は、将来、ゲフィチニブ（別の抗ＥｒｂＢ１治療剤）と、例えば、ＰＨＡ−６６５７５２を用いて治療することができる。これらの組合せは単に例示的であり、多くの他の組合せは本明細書で企図されており、本開示に基づけば当業者に明白となるであろう。   In certain embodiments, the anti-ErbB therapeutic administered as part of a combination with an anti-MET therapeutic is the same anti-ErbB therapeutic that the subject has developed resistance to. For example, if a subject is being treated with erlotinib (an anti-ErbB1 therapeutic agent) and then develops resistance to the therapeutic agent, the subject will be treated with erlotinib, for example, PHA-665752 (anti-MET treatment). Can be treated with a combination of agents. Alternatively, the anti-ErbB therapeutic agent may be different from the therapeutic agent in which the subject has developed resistance. For example, if a subject has been treated with erlotinib and then developed resistance to the therapeutic agent, the subject will use gefitinib (another anti-ErbB1 therapeutic agent) in the future, for example, PHA-665752. Can be treated. These combinations are merely exemplary, and many other combinations are contemplated herein and will be apparent to those of skill in the art based on the present disclosure.

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法では、抗ＥｒｂＢ治療剤と抗ＭＥＴ治療剤の組合せを投与する。抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を含む併用療法は、（１）少なくとも１つの抗ＥｒｂＢ治療剤および少なくとも１つの抗ＭＥＴ治療剤の同時製剤を含む医薬組成物、ならびに（２）抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤が同じ組成物中で製剤化されていない（しかし、同じキットまたはパッケージ、例えばブリスター包装または他の多容器（ｍｕｌｔｉ−ｃｈａｍｂｅｒ）パッケージなど；使用者によって分離することができる、接続された、別々に密閉された容器（例えば、フォイルポーチ（ｆｏｉｌ ｐｏｕｃｈ））；または治療剤が別々の容器中にあるキット内に存在することができる）、１つまたは複数の抗ＥｒｂＢ治療剤と、１つまたは複数の抗ＭＥＴ治療剤の同時投与を指すことができる。別々の製剤を使用する場合、治療剤は、同じ時間（同時に）、断続的に、または交互に投与することができ、様々な実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤は、抗ＭＥＴ治療剤の前に、もしくは抗ＭＥＴ治療剤に続いて、または前述の様々な組合せで投与することができる。   In certain embodiments, the methods described herein administer a combination of an anti-ErbB therapeutic and an anti-MET therapeutic. A combination therapy comprising an anti-ErbB therapeutic and an anti-MET therapeutic comprises (1) a pharmaceutical composition comprising a co-formulation of at least one anti-ErbB therapeutic and at least one anti-MET therapeutic, and (2) an anti-ErbB therapeutic And the anti-MET therapeutic agent is not formulated in the same composition (but the same kit or package, such as a blister package or other multi-chamber package; a connection that can be separated by the user, A separately sealed container (eg, a foil pouch); or a therapeutic agent can be present in a kit in separate containers) and one or more anti-ErbB therapeutic agents It may refer to the simultaneous administration of one or more anti-MET therapeutics. When using separate formulations, the therapeutic agents can be administered at the same time (simultaneously), intermittently or alternately, and in various embodiments, the anti-ErbB therapeutic agent is administered prior to the anti-MET therapeutic agent. Or following an anti-MET therapeutic, or in various combinations as described above.

様々な実施形態では、本明細書に提供される方法では、例えば、ＥｒｂＢ遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、および／またはＨＧＦ遺伝子の活性化突然変異または遺伝子増幅を識別するために、対象由来の生体試料の分析を行う。例えば、対象から採取した体液試料、細胞試料、または組織試料を含めた、任意の適当な対象由来の生体試料を、本方法に従って使用することができる。適当な体液として、それだけに限らないが、胸膜液試料、肺または気管支の洗浄液試料、滑液試料、腹膜液試料、骨髄穿刺液試料、リンパ液、脳脊髄液、腹水試料、羊膜液試料、痰試料、膀胱洗浄液、***、尿、唾液、涙、血液、ならびにその成分血清および血漿などが挙げられる。例示的な実施形態では、生体試料は、対象における１つまたは複数の部位に由来する癌細胞を含む試料である。例えば、腫瘍生検または切除から得た生体試料を使用することができる。ある特定の実施形態では、対象内の１つを超える部位に由来する腫瘍試料を試験することが望ましい場合がある。対象が１つを超える部位で腫瘍を有する場合、それぞれの腫瘍部位で、ＥｒｂＢ遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、および／またはＨＧＦ遺伝子の活性化突然変異または遺伝子増幅について試験することによって、腫瘍が、同じまたは異なる遺伝子修飾に関連するのかを判定することが望ましい場合がある。   In various embodiments, the methods provided herein analyze biological samples from a subject, for example, to identify activating mutations or gene amplifications of ErbB, MET, and / or HGF genes. I do. For example, any suitable subject-derived biological sample, including a body fluid sample, cell sample, or tissue sample collected from the subject, can be used in accordance with the present method. Suitable body fluids include, but are not limited to, pleural fluid samples, lung or bronchial lavage fluid samples, synovial fluid samples, peritoneal fluid samples, bone marrow puncture fluid samples, lymph fluid, cerebrospinal fluid, ascites fluid samples, amniotic fluid samples, sputum samples, Examples include bladder lavage fluid, semen, urine, saliva, tears, blood, and serum and plasma components thereof. In an exemplary embodiment, the biological sample is a sample comprising cancer cells derived from one or more sites in the subject. For example, a biological sample obtained from a tumor biopsy or excision can be used. In certain embodiments, it may be desirable to test tumor samples derived from more than one site within a subject. If the subject has a tumor at more than one site, the tumors are the same or different by testing for activating mutations or gene amplification of the ErbB gene, MET gene, and / or HGF gene at each tumor site It may be desirable to determine if it is related to genetic modification.

ある特定の実施形態では、抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法は、他の治療または治療剤、例えば、抗原、アジュバント、免疫調節剤、もしくは抗体を含む受動免疫療法などの他の免疫療法などとともに使用することができる。抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法は、非薬物治療、例えば、手術、放射線療法、または化学療法などとともに投与することもできる。他の療法は、抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法を用いた治療の前、同時、または後に投与することができる。抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法を、他の治療の前または後に投与することができるように、異なる治療の投与の間に、数時間、数日、および場合によって数週間の遅延が存在することもある。   In certain embodiments, the anti-ErbB / anti-MET combination therapy is used in conjunction with other treatments or therapeutic agents, such as other immunotherapy such as passive immunotherapy including antigens, adjuvants, immunomodulators, or antibodies. be able to. The anti-ErbB / anti-MET combination therapy can also be administered with non-drug treatments such as surgery, radiation therapy, or chemotherapy. Other therapies can be administered before, simultaneously with, or after treatment with the anti-ErbB / anti-MET combination therapy. There may also be delays of hours, days, and possibly weeks between administration of different treatments so that the anti-ErbB / anti-MET combination therapy can be administered before or after other treatments. is there.

一実施形態では、抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法は、別の抗癌療法、特に、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤の投与を含まない別の抗癌療法とともに（すなわち、前、間、または後）に対象に投与される。例えば、抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法は、例えば以下のものなどの腫瘍学の当業者に既知の化学療法薬の任意の１つまたは複数と一緒に投与することができる（参考文献：Ｃａｎｃｅｒ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、ＤｅＶｉｔａ， Ｖ． Ｔ．、Ｈｅｌｌｍａｎ， Ｓ．、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓ． Ａ．、６版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、２００１年）：アバレリクス、アドリアマイシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アンチド、アリミデクス、アシミシン、アスパラギナーゼ、ＡＺＤ２１７１（Ｒｅｃｅｎｔｉｎ（商標））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ／ＢＣＧ（ＴｈｅｒａＣｙｓ（商標）、ＴＩＣＥ（商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（商標））、ブラタシン、ブセレリン、ブスルファン、カンポテシン（ｃａｍｐｏｔｈｅｃｉｎ）、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（商標））、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ジスコデルモリド、デキサメタゾン、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標））、ドキソルビシン、Ａｂｘ−ＥＧＦ、エポチロン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フロクスウリジン、５−フルオロウラシル、フィルグラスチム、フラボピリドール、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、フルベストラント、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（商標））、ゲニステイン、ゴセレリン、グアナコン（ｇｕａｎａｃｏｎｅ）、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖａｃ（商標））、インターフェロン、インターロイキン、イリノテカン、イブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ（商標））、イロノテカン（ｉｒｏｎｏｔｅｃａｎ）、イクサベピロン（ＢＭＳ−２４７５５０）、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ミトゾロミド、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標））、パミドロネート、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プレドニゾン、プロカルバジン、ラルチトレキセド（Ｔｏｍｕｄｅｘ（商標））、ラパマイシン、ランプトテシン（ｒａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（商標））、ロリニアスタチン、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（商標）／Ｂａｙｅｒ ＢＡＹ４３−９００６）、スクアモシン、スクアモタシン（ｓｑｕａｍｏｔａｃｉｎ）、ストレプトゾシン、スラミン、リンゴ酸スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（商標））、タモキシフェン、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（商標））、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、二塩化チタノセン、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（商標））、トラスツズマブ、トレチノイン、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン、ゾレドロネート。   In one embodiment, the anti-ErbB / anti-MET combination therapy is in conjunction with another anti-cancer therapy, particularly another anti-cancer therapy that does not include administration of an anti-ErbB therapeutic and / or anti-MET therapeutic (ie, before, between Or later) to the subject. For example, the anti-ErbB / anti-MET combination therapy can be administered with any one or more of chemotherapeutic agents known to those of skill in oncology, such as, for example: (Cancer, Principles) & Practice of Oncology, DeVita, V. T., Hellman, S., Rosenberg, S. A., 6th edition, Lippincott-Raven, Philadelphia, 2001): Abarelix, Adriamycin, Almidreutamintelumine, Aldesramite Minteol , Amsacrine, anastrozole, antide, arimidex, asimisin, asparaginase, AZD2171 (Recentin ™), Bacillus Calmette-Guerin / B CG (TheraCys (TM), TICE (TM)), bevacizumab (Avastin (TM)), bicalutamide, bleomycin, bortezomib (Velcade (TM)), bratacin, buserelin, busulfan, campotethecin, bopracicarin, bopracitabine, capecitabine, capricecin Chlorambucil, chlorodeoxyadenosine, cisplatin, cladribine, clodronate, colchicine, cyclophosphamide, cyproterone, cytarabine, dacarbazine, dactinomycin, dasatinib (Sprycel ™), daunorubicin, dienestrol, diethylstilbestrol, discodermolide, Dexamethasone, docetaxel (Taxotere ™), doxorubicin, Abx-EGF Epothilone, epirubicin, estradiol, estramustine, etoposide, exemestane, floxuridine, 5-fluorouracil, filgrastim, flavopiridol, fludarabine, fludrocortisone, fluorouracil, fluoxymesterone, flutamide, fulvestrant, gemcitabine (Gemzar (TM)), genistein, goserelin, guanacone, hydroxyurea, idarubicin, ifosfamide, imatinib mesylate (Gleevac (TM)), interferon, interleukin, irinotecan, ibritumomab (Zevalino (te)), ilovalin (tevalino tecan) irinotecan), ixabepilone (BMS-247550), letrozole, leucovorin, leu Lolide, levamisole, lomustine, mechlorethamine, medroxyprogesterone, megestrol, melphalan, mercaptopurine, mesna, methotrexate, mitramycin, mitomycin, mitotane, mitoxantrone, mitozolomide, nilutamide, nocodazole, octreotide, oxaliplatin, paclitaxel Taxol ™), pamidronate, pegaspargase, pentostatin, pricamycin, porfimer, prednisone, procarbazine, raltitrexed (Tomudex ™), rapamycin, ramptothecin, rituximab (Rituxan ™), rolinestatin , Sorafenib (Nexavar ™ / Bayer BAY 43-9006), Quamosine, squamotacin, streptozocin, suramin, sunitinib malate (Sutent (TM)), tamoxifen, temsirolimus (CCI-779), temozolomide (Temodar (TM)), teniposide, testosterone, thioguanate, thioguanine chloride , Topotecan, toremifene, tositumomab (Bexar ™), trastuzumab, tretinoin, VEGF Trap, vinblastine, vincristine, vindesine, and vinorelbine, zoledronate.

抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法は、癌のための非薬物治療、例えば、癌塊を除去するための外科的手順、化学療法または放射線療法などとともに使用することもできる。非薬物療法は、抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法を用いた治療の前、同時、または後に投与することができる。本発明の薬剤を、他の治療の前または後に投与することができるように、異なる治療の投与の間に、数時間、数日、および場合によって数週間の遅延が存在することもある。   Anti-ErbB / anti-MET combination therapy can also be used with non-drug treatments for cancer, such as surgical procedures to remove masses, chemotherapy or radiation therapy. Non-drug therapy can be administered before, simultaneously with, or after treatment with anti-ErbB / anti-MET combination therapy. There may be a delay of hours, days, and sometimes weeks between administration of different treatments, so that the agents of the invention can be administered before or after other treatments.

一実施形態では、抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法は、外科的手順の間、例えば、腫瘍の除去または腫瘍生検の間などに投与することができる。癌を治療するための外科的方法には、腹腔内手術、例えば、右または左結腸半切除、Ｓ字の、亜全または全結腸切除および胃切除、根治的または部分的***切除、前立腺切除および子宮摘出などが含まれる。一実施形態では、抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法は、腫瘍の外科的除去の後、または間に、癌塊の範囲に局所的に投与することができる。   In one embodiment, the anti-ErbB / anti-MET combination therapy can be administered during a surgical procedure, such as during tumor removal or tumor biopsy. Surgical methods for treating cancer include intraperitoneal surgery, such as right or left hemicolectomy, sigmoidal, subtotal or total colectomy and gastrectomy, radical or partial mastectomy, prostatectomy and Includes hysterectomy. In one embodiment, the anti-ErbB / anti-MET combination therapy can be administered locally to the area of the cancer mass after or during surgical removal of the tumor.

さらに、抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法は、外部ビーム照射、強度変調放射線治療（ＩＭＲＴ）を含めた任意の形態の放射線療法、ならびに例えば、γナイフ、サイバーナイフ、ライナック、および組織内照射（例えば、インプラント放射性シードまたはＧｌｉａＳｉｔｅバルーンなど）を含めた任意の形態の放射線手術と一緒に投与することができる。   Further, anti-ErbB / anti-MET combination therapy can include any form of radiation therapy including external beam irradiation, intensity modulated radiation therapy (IMRT), and, for example, gamma knife, cyberknife, linac, and intra-tissue irradiation (eg, Can be administered with any form of radiosurgery, including implant radioactive seeds or GliaSite balloons).

別の態様では、本発明は、細胞を、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤と接触させることによって、癌細胞におけるＥｒｂＢリン酸化を低減するための方法を提供する。例示的な実施形態では、癌細胞は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、例えば、ＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化に関連するＭＥＴ活性および／または発現のレベルの上昇を含む。本明細書に開示される方法は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３および／またはＥｒｂＢ４の１つまたは複数のリン酸化を低減するのに使用することができる。ＥｒｂＢリン酸化を検査するための方法は、当技術分野で既知である。例えば、抗ホスホＥｒｂＢ抗体を使用することによって、細胞（例えば、免疫組織化学的技法）または細胞可溶化物中のリン酸化ＥｒｂＢの存在および／または量を判定することができる。あるいは、細胞可溶化物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を移動させ、ニトロセルロースにブロットし、次いで抗ＥｒｂＢ抗体でプローブすることによって、細胞中の１つまたは複数のリン酸化ＥｒｂＢタンパク質の存在および／または量を検出することができる。さらに、抗ＥｒｂＢ（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、またはＥｒｂＢ４）抗体を使用することによって、細胞可溶化物からＥｒｂＢタンパク質を免疫沈降することができ、次いでこのＥｒｂＢタンパク質をキナーゼアッセイにおいて使用することによって、細胞中の活性な、リン酸化ＥｒｂＢタンパク質の存在を検出することができる。ＥｒｂＢタンパク質についての適当なキナーゼアッセイは、タンパク質基質のリン酸化を測定するための方法として当技術分野で公知である。さらに別の実施形態では、抗ＥｒｂＢタンパク質の存在および／または量は、ホスホ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）アレイ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから市販されている）を使用して判定することができる。ＥｒｂＢ１、ホスホＥｒｂＢ１、ＥｂＢ２、ホスホＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ホスホＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４およびホスホＥｒｂＢ４に特異的な抗体は市販されている（例えば、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡを参照されたい）。ある特定の実施形態では、癌細胞中のＥｒｂＢリン酸化のレベルを、対照、例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤、抗ＭＥＴ治療剤、もしくは両方と接触していない細胞、または異なる量の、治療剤の１つもしくは両方と接触した細胞、または所与のアッセイに対する期待値などの基準値と比較することが望ましい場合がある。   In another aspect, the invention provides a method for reducing ErbB phosphorylation in cancer cells by contacting the cell with an anti-ErbB therapeutic agent and an anti-MET therapeutic agent. In an exemplary embodiment, the cancer cell has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic, eg, MET activity associated with activating mutations in the MET gene, MET gene amplification, or HGF-mediated MET activation and // increased level of expression. The methods disclosed herein can be used to reduce one or more phosphorylations of ErbB1, ErbB2, ErbB3 and / or ErbB4. Methods for examining ErbB phosphorylation are known in the art. For example, by using an anti-phospho ErbB antibody, the presence and / or amount of phosphorylated ErbB in a cell (eg, immunohistochemical technique) or cell lysate can be determined. Alternatively, the cell lysate can be run on an SDS-PAGE gel, blotted to nitrocellulose, and then probed with an anti-ErbB antibody to thereby detect the presence of one or more phosphorylated ErbB proteins in the cell and / or The amount can be detected. Furthermore, by using an anti-ErbB (eg, ErbB1, ErbB2, or ErbB4) antibody, the ErbB protein can be immunoprecipitated from cell lysates, and then this ErbB protein can be used in a kinase assay to The presence of active, phosphorylated ErbB protein in it can be detected. Suitable kinase assays for ErbB proteins are known in the art as methods for measuring protein substrate phosphorylation. In yet another embodiment, the presence and / or amount of anti-ErbB protein can be determined using a phosphoreceptor tyrosine kinase (RTK) array (commercially available from R & D systems). Antibodies specific for ErbB1, phospho-ErbB1, EbB2, phospho-ErbB2, ErbB3, phospho-ErbB3, ErbB4 and phospho-ErbB4 are commercially available (see, eg, Cell Signaling Technology, Danvers, MA). In certain embodiments, the level of ErbB phosphorylation in a cancer cell is controlled by a control, eg, a cell that is not in contact with an anti-ErbB therapeutic agent, an anti-MET therapeutic agent, or both, or different amounts of one of the therapeutic agents. It may be desirable to compare to a reference value, such as an expected value for a given assay, or cells in contact with one or both.

別の態様では、本発明は、細胞を、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤と接触させることによって、癌細胞におけるＰＩ３Ｋ媒介シグナル伝達を低減するための方法を提供する。例示的な実施形態では、癌細胞は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性および／または発現のレベルの上昇（例えば、ＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化に関連した）を含む。ＰＩ３Ｋ媒介シグナル伝達を検査するための方法は、当技術分野で既知である。例えば、米国特許公開第２００５／０１７０４３９号には、ＥｒｂＢ受容体とＰＩ３キナーゼの間に形成される結合複合体を判定するための方法が記載されている。あるいは、ＰＩ３Ｋ活性化に応答してリン酸化されるタンパク質（例えば、Ａｋｔなど）のリン酸化形態の存在または非存在は、基質に特異的な抗体を使用してアッセイすることができる。ＰＫＢ／ＡＫＴの様々なリン酸化形態に特異的な抗体は市販されている（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＫ） Ｌｔｄ ｏｆ Ｈｉｔｃｈｉｎ、Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅを参照されたい）。他の適当な抗体は、当業者にわかるであろう。これらのタンパク質を測定するためのイムノアッセイは、多くの様々な、好都合な方法で実施することができ、これは当業者に公知である。あるいは、免疫組織化学的技法を使用することによって、癌細胞中のＰＫＢ／ＡＫＴのリン酸化形態を同定することができる。ある特定の実施形態では、癌細胞中のＰＩ３Ｋ媒介シグナル伝達のレベルを、対照、例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤、抗ＭＥＴ治療剤、もしくは両方と接触していない細胞、または異なる量の、治療剤の１つもしくは両方と接触した細胞、または所与のアッセイに対する期待値などの基準値と比較することが望ましい場合がある。   In another aspect, the invention provides a method for reducing PI3K-mediated signaling in cancer cells by contacting the cells with an anti-ErbB therapeutic agent and an anti-MET therapeutic agent. In an exemplary embodiment, the cancer cell has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic and has an increased level of MET activity and / or expression (eg, an activating mutation in the MET gene, MET gene amplification, or Related to HGF-mediated MET activation). Methods for examining PI3K-mediated signal transduction are known in the art. For example, US Patent Publication No. 2005/0170439 describes a method for determining the binding complex formed between an ErbB receptor and PI3 kinase. Alternatively, the presence or absence of a phosphorylated form of a protein (eg, Akt, etc.) that is phosphorylated in response to PI3K activation can be assayed using a substrate specific antibody. Antibodies specific for various phosphorylated forms of PKB / AKT are commercially available (see, eg, New England Biolabs (UK) Ltd of Hitchin, Hertfordshire). Other suitable antibodies will be known to those skilled in the art. Immunoassays for measuring these proteins can be performed in a number of different and convenient ways, known to those skilled in the art. Alternatively, immunohistochemical techniques can be used to identify phosphorylated forms of PKB / AKT in cancer cells. In certain embodiments, the level of PI3K-mediated signaling in a cancer cell is measured by a control, eg, a cell not in contact with an anti-ErbB therapeutic agent, an anti-MET therapeutic agent, or both, It may be desirable to compare to a reference value, such as the expected value for a given assay, or cells in contact with one or both.

別の態様では、本発明は、細胞を、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤と接触させることによって、癌細胞におけるＥｒｂＢ媒介シグナル伝達を低減するための方法を提供する。例示的な実施形態では、癌細胞は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、例えば、ＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化に関連するＭＥＴ活性および／または発現のレベルの上昇を含む。本明細書に開示される方法を使用することによって、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３および／またはＥｒｂＢ４の１つまたは複数によって媒介されるシグナル伝達を低減することができる。ＥｒｂＢ媒介シグナル伝達を検査するための方法は、当技術分野で既知である。例えば、ＥｒｂＢタンパク質の基質に特異的な抗体を使用することによって、細胞（例えば、免疫組織化学的技法）または細胞由来の溶解産物（例えば、ウエスタンブロッティング法）中に存在するリン酸化基質の存在を特定し、またはその量を求めることができる。さらに、ＥｒｂＢ基質は、細胞可溶化物から免疫沈降させ、活性アッセイにおいて使用することによって、この基質がリン酸化され、したがってＥｒｂＢ受容体キナーゼによって活性化されており、それによってＥｒｂＢ媒介シグナル伝達を反映しているかどうかを判定することができる。ある特定の実施形態では、癌細胞中のＥｒｂＢ媒介シグナル伝達のレベルを、対照、例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤、抗ＭＥＴ治療剤、もしくは両方と接触していない細胞、または異なる量の、治療剤の１つもしくは両方と接触した細胞、または所与のアッセイに対する期待値などの基準値と比較することが望ましい場合がある。   In another aspect, the invention provides a method for reducing ErbB-mediated signaling in cancer cells by contacting the cell with an anti-ErbB therapeutic agent and an anti-MET therapeutic agent. In an exemplary embodiment, the cancer cell has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic, eg, MET activity associated with activating mutations in the MET gene, MET gene amplification, or HGF-mediated MET activation and // increased level of expression. By using the methods disclosed herein, signaling mediated by one or more of ErbB1, ErbB2, ErbB3 and / or ErbB4 can be reduced. Methods for examining ErbB mediated signaling are known in the art. For example, by using antibodies specific for ErbB protein substrates, the presence of phosphorylated substrates present in cells (eg, immunohistochemical techniques) or cell-derived lysates (eg, Western blotting) can be determined. You can identify or determine the amount. In addition, the ErbB substrate is immunoprecipitated from cell lysates and used in an activity assay so that this substrate is phosphorylated and thus activated by ErbB receptor kinase, thereby reflecting ErbB-mediated signaling. It can be determined whether or not. In certain embodiments, the level of ErbB-mediated signaling in a cancer cell is measured by a control, eg, a cell that is not in contact with an anti-ErbB therapeutic agent, an anti-MET therapeutic agent, or both, or different amounts of therapeutic agent. It may be desirable to compare to a reference value, such as the expected value for a given assay, or cells in contact with one or both.

別の態様では、本発明は、細胞を、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤と接触させることによって、（ｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤に対する癌細胞の感受性を回復し、（ｉｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤に対する癌細胞の耐性を低減し、かつ／または（ｉｉｉ）癌細胞における、獲得された抗ＥｒｂＢ治療剤耐性を治療するための方法を提供する。例示的な実施形態では、癌細胞は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、例えば、ＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化に関連するＭＥＴ活性および／または発現のレベルの上昇を含む。本明細書に開示される方法を使用することによって、以下のもの、すなわち、抗ＥｒｂＢ１治療剤、抗ＥｒｂＢ２治療剤、抗ＥｒｂＢ３治療剤および／または抗ＥｒｂＢ４治療剤の１つまたは複数に対する癌細胞の感受性を回復し、耐性を低減し、かつ／または獲得された耐性を治療することができる。抗ＥｒｂＢ治療剤に対する細胞の感受性および／または耐性を検査するための方法は、当技術分野で既知である。例えば、細胞成長および／または増殖の量、ならびに／またはアポトーシスの量は、抗ＥｒｂＢ治療剤単独と比較した場合、抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法の存在下で求めることができる。癌細胞の細胞成長および／または増殖の減少、ならびに／またはアポトーシスの増大は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する感受性の増大、または耐性の低減を示す。細胞成長、増殖およびアポトーシスを検査するための方法は、当技術分野で既知であり、本明細書で以下にさらに説明する。   In another aspect, the invention restores the sensitivity of cancer cells to an anti-ErbB therapeutic agent by contacting the cell with an anti-ErbB therapeutic agent and an anti-MET therapeutic agent, and (ii) an anti-ErbB therapeutic agent. Methods for reducing cancer cell resistance to and / or (iii) treating acquired anti-ErbB therapeutic resistance in cancer cells are provided. In an exemplary embodiment, the cancer cell has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic, eg, MET activity associated with activating mutations in the MET gene, MET gene amplification, or HGF-mediated MET activation and // increased level of expression. By using the methods disclosed herein, cancer cells against one or more of the following: anti-ErbB1 therapeutic agent, anti-ErbB2 therapeutic agent, anti-ErbB3 therapeutic agent and / or anti-ErbB4 therapeutic agent Sensitivity can be restored, tolerance can be reduced, and / or acquired resistance can be treated. Methods for examining cell sensitivity and / or resistance to anti-ErbB therapeutics are known in the art. For example, the amount of cell growth and / or proliferation, and / or the amount of apoptosis can be determined in the presence of an anti-ErbB / anti-MET combination therapy when compared to the anti-ErbB therapeutic alone. A decrease in cell growth and / or proliferation of cancer cells and / or an increase in apoptosis indicates an increase in sensitivity or a decrease in resistance to the anti-ErbB therapeutic. Methods for examining cell growth, proliferation and apoptosis are known in the art and are further described herein below.

別の態様では、本発明は、細胞を、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤と接触させることによって、癌細胞の成長および／または増殖を低減し、または癌細胞のアポトーシスを増大させるための方法を提供する。例示的な実施形態では、癌細胞は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、例えば、ＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化に関連するＭＥＴ活性および／または発現のレベルの上昇を含む。癌細胞の成長および／または増殖および／またはアポトーシスを検査するための方法は、当技術分野で公知である。細胞成長および／または増殖ならびに／またはアポトーシスを判定するための例示的な方法には、例えば、アラマーブルー、Ｂｒｄ Ｕ、ＭＴＴ、トリパンブルー排除、３Ｈ−チミジン取り込み、ならびにＸＴＴアッセイが含まれる。細胞成長および／または増殖ならびに／またはアポトーシスを判定するためのキットは、様々な供給源から市販されている。ある特定の実施形態では、癌細胞の成長および／または増殖および／またはアポトーシスのレベルを、対照、例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤、抗ＭＥＴ治療剤、もしくは両方と接触していない細胞、または異なる量の、治療剤の１つもしくは両方と接触した細胞、または所与のアッセイに対する期待値などの基準値と比較することが望ましい場合がある。 In another aspect, the present invention provides a method for reducing cancer cell growth and / or proliferation or increasing cancer cell apoptosis by contacting the cell with an anti-ErbB therapeutic agent and an anti-MET therapeutic agent. I will provide a. In an exemplary embodiment, the cancer cell has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic, eg, MET activity associated with activating mutations in the MET gene, MET gene amplification, or HGF-mediated MET activation and // increased level of expression. Methods for examining cancer cell growth and / or proliferation and / or apoptosis are known in the art. Exemplary methods for determining cell growth and / or proliferation and / or apoptosis include, for example, alamar blue, Brd U, MTT, trypan blue exclusion, 3 H-thymidine incorporation, and XTT assay. Kits for determining cell growth and / or proliferation and / or apoptosis are commercially available from a variety of sources. In certain embodiments, the level of cancer cell growth and / or proliferation and / or apoptosis is measured by a control, eg, cells not in contact with an anti-ErbB therapeutic agent, anti-MET therapeutic agent, or both, or different amounts of It may be desirable to compare to a reference value, such as a cell in contact with one or both of the therapeutic agents, or an expected value for a given assay.

３．抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤
本明細書に記載される様々な方法は、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を利用する。抗ＥｒｂＢ活性または抗ＭＥＴ活性を示す任意の種類の治療剤を、本明細書に記載される方法に従って使用することができる。抗ＥｒｂＢ活性を有する治療剤は、ＥｒｂＢタンパク質の少なくとも１つの生物活性をアンタゴナイズ（例えば、低減または阻害）する任意のものである。例示的な生物活性として、例えば、チロシンキナーゼ活性（ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２またはＥｒｂＢ４について）、タンパク質間相互作用の形成（例えば、受容体ホモまたはヘテロ二量体化、リガンド結合、基質への結合など）、およびＥｒｂＢ媒介シグナル伝達が挙げられる。同様に、抗ＭＥＴ活性を有する治療剤は、ＭＥＴタンパク質の少なくとも１つの生物活性をアンタゴナイズ（例えば、低減または阻害）する任意のものである。例示的な生物活性として、例えば、チロシンキナーゼ活性、タンパク質間相互作用の形成（例えば、受容体ホモまたはヘテロ二量体化、リガンド結合、基質への結合など）、およびＭＥＴ媒介シグナル伝達が挙げられる。例示的な抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤として、例えば、小分子治療剤、核酸治療剤（例えば、アンチセンス核酸、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、または酵素的核酸など）、およびタンパク質治療剤（例えば、抗体など）が挙げられる。さらに、本明細書に記載される様々な方法は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を発生させた癌の治療方法を伴う。この方法は、治療目的で、本明細書に記載される任意の抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を発生させた癌を治療するために使用することができる。 3. Anti-ErbB Therapeutic Agents and Anti-MET Therapeutic Agents The various methods described herein utilize anti-ErbB therapeutic agents and anti-MET therapeutic agents. Any type of therapeutic agent that exhibits anti-ErbB or anti-MET activity can be used in accordance with the methods described herein. A therapeutic agent having anti-ErbB activity is any that antagonizes (eg, reduces or inhibits) at least one biological activity of an ErbB protein. Exemplary biological activities include, for example, tyrosine kinase activity (for ErbB1, ErbB2 or ErbB4), formation of protein-protein interactions (eg, receptor homo- or heterodimerization, ligand binding, binding to a substrate, etc.), And ErbB mediated signaling. Similarly, a therapeutic agent having anti-MET activity is any that antagonizes (eg, reduces or inhibits) at least one biological activity of a MET protein. Exemplary biological activities include, for example, tyrosine kinase activity, formation of protein-protein interactions (eg, receptor homo- or heterodimerization, ligand binding, binding to substrates, etc.), and MET-mediated signaling. . Exemplary anti-ErbB and anti-MET therapeutics include, for example, small molecule therapeutics, nucleic acid therapeutics (eg, antisense nucleic acids, dsRNA, siRNA, or enzymatic nucleic acids), and protein therapeutics (eg, antibodies Etc.). Further, the various methods described herein involve methods for treating cancer that has developed resistance to anti-ErbB therapeutics. This method can be used for therapeutic purposes to treat a cancer that has developed resistance to any of the anti-ErbB therapeutics described herein.

ある特定の実施形態では、抗ＥｒｂＢまたは抗ＭＥＴ治療剤は小分子治療剤である。小分子治療剤には、ＥｒｂＢまたはＭＥＴの少なくとも１つの生物活性をアンタゴナイズする任意の小分子が含まれる。例示的な小分子治療剤はキナーゼ阻害剤である。他の適当な小分子治療剤には、受容体二量体化またはリガンド結合をアンタゴナイズする小分子が含まれる。抗ＥｒｂＢ小分子治療剤および抗ＭＥＴ小分子治療剤の適当な例を以下に提供する。   In certain embodiments, the anti-ErbB or anti-MET therapeutic agent is a small molecule therapeutic agent. Small molecule therapeutics include any small molecule that antagonizes at least one biological activity of ErbB or MET. An exemplary small molecule therapeutic is a kinase inhibitor. Other suitable small molecule therapeutics include small molecules that antagonize receptor dimerization or ligand binding. Suitable examples of anti-ErbB small molecule therapeutics and anti-MET small molecule therapeutics are provided below.

一実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤または抗ＭＥＴ治療剤は、アンチセンス核酸とすることができる。「アンチセンス核酸」とは、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＰＮＡ（タンパク質核酸）相互作用によって標的核酸に結合し、標的核酸の活性を変化させる非酵素的核酸化合物を意味する（概説については、ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ、１９９３年 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１巻、１００４頁ならびにＷｏｏｌｆら、米国特許第５，８４９，９０２号を参照されたい）。一般に、アンチセンス分子は、このアンチセンス分子の１つの連続した配列に沿って、標的配列と相補性である。しかし、ある特定の実施形態では、アンチセンス分子は、ループを形成し、ループを形成する基質核酸に結合することができる。したがって、アンチセンス分子は、２つ（もしくはそれ以上）の連続していない基質配列と相補性であることができ、またはアンチセンス分子の２つ（またはそれ以上）の連続していない配列部分は、標的配列と相補性であることができ、あるいはその両方である。現在のアンチセンス戦略の概説については、Ｓｃｈｍａｊｕｋら、１９９９年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７４巻、２１７８３〜２１７８９頁、Ｄｅｌｉｈａｓら、１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ、１５巻、７５１〜７５３頁、Ｓｔｅｉｎら、１９９７年、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎ． Ａ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．、７巻、１５１頁、Ｃｒｏｏｋｅ、２０００年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３１３巻、３〜４５頁、Ｃｒｏｏｋｅ、１９９８年、Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｇｅｎｅｔ． Ｅｎｇ． Ｒｅｖ．、１５巻、１２１〜１５７頁、Ｃｒｏｏｋｅ、１９９７年、Ａｄ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４０巻、１〜４９頁を参照されたい。   In one embodiment, the anti-ErbB therapeutic or anti-MET therapeutic can be an antisense nucleic acid. “Antisense nucleic acid” means a non-enzymatic nucleic acid compound that binds to and alters the activity of a target nucleic acid through RNA-RNA, RNA-DNA or RNA-PNA (protein nucleic acid) interactions (for review) (See Stein and Cheng, 1993 Science 261, 1004 and Woolf et al., US Pat. No. 5,849,902). In general, an antisense molecule is complementary to a target sequence along one contiguous sequence of the antisense molecule. However, in certain embodiments, the antisense molecule can form a loop and bind to a substrate nucleic acid that forms the loop. Thus, an antisense molecule can be complementary to two (or more) non-contiguous substrate sequences, or two (or more) non-contiguous sequence portions of an antisense molecule can be , Can be complementary to the target sequence, or both. For a review of current antisense strategies, see Schmajuk et al., 1999, J. MoI. Biol. Chem. 274, 21783-21789, Delihas et al., 1997, Nature, 15, 751-753, Stein et al., 1997, Antisense N. A. Drug Dev. 7, 151, Crooke, 2000, Methods Enzymol. 313, 3-45, Crooke, 1998, Biotech. Genet. Eng. Rev. 15, 121-157, Crooke, 1997, Ad. Pharmacol. 40, pages 1-49.

他の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤または抗ＭＥＴ治療剤は、ｓｉＲＮＡとすることができる。用語「短鎖干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」または「短鎖干渉核酸」は、細胞によって適切に処理される場合、ＲＮＡｉまたは遺伝子サイレンシングを媒介することができる任意の核酸化合物を指す。例えば、ｓｉＲＮＡは、自己相補性のセンスおよびアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子とすることができ、アンチセンス領域は、標的核酸化合物（例えば、ＲＴＫ）との相補性を含む。ｓｉＲＮＡは、自己相補性のセンスおよびアンチセンス領域を有する一本鎖のヘアピンポリヌクレオチドとすることができ、アンチセンス領域は、標的核酸化合物との相補性を含む。ｓｉＲＮＡは、２つ以上のループ構造および自己相補性のセンスおよびアンチセンス領域を含むステムを有する、環状の一本鎖ポリヌクレオチドとすることができ、アンチセンス領域は、標的核酸化合物との相補性を含み、環状のポリヌクレオチドは、インビボまたはインビトロで処理されることによって、ＲＮＡｉを媒介することができる活性ｓｉＲＮＡを生成することができる。ｓｉＲＮＡは、標的核酸化合物との相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドも含むことができ、この一本鎖ポリヌクレオチドは、末端リン酸エステル基、例えば、５’−リン酸（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００２年、Ｃｅｌｌ．、１１０巻、５６３〜５７４頁）、または５’，３’−二リン酸などをさらに含むことができる。   In other embodiments, the anti-ErbB therapeutic or anti-MET therapeutic can be siRNA. The term “short interfering RNA”, “siRNA” or “short interfering nucleic acid” refers to any nucleic acid compound capable of mediating RNAi or gene silencing when properly processed by a cell. For example, the siRNA can be a double-stranded polynucleotide molecule that includes self-complementary sense and antisense regions, where the antisense region includes complementarity with a target nucleic acid compound (eg, RTK). The siRNA can be a single-stranded hairpin polynucleotide having self-complementary sense and antisense regions, where the antisense region includes complementarity with the target nucleic acid compound. The siRNA can be a circular single-stranded polynucleotide having two or more loop structures and a stem containing self-complementary sense and antisense regions, where the antisense region is complementary to the target nucleic acid compound. And circular polynucleotides can be processed in vivo or in vitro to produce active siRNA capable of mediating RNAi. The siRNA can also include a single stranded polynucleotide having complementarity with the target nucleic acid compound, wherein the single stranded polynucleotide comprises a terminal phosphate ester group, such as a 5′-phosphate (eg, Martinez et al., 2002, Cell., 110, 563-574), or 5 ′, 3′-diphosphate and the like.

本明細書で記述する場合、ｓｉＲＮＡは、長さが約１９〜３０ヌクレオチド、または長さが２１〜２３ヌクレオチドとすることができる。ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ複合体をリクルートし、特定の配列と一対になることによって、この複合体を標的ｍＲＮＡに導くと理解されている。結果として、標的ｍＲＮＡは、タンパク質複合体中のヌクレアーゼによって分解される。特定の実施形態では、２１〜２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ分子は３’ヒドロキシル基を含む。ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡコンストラクトは、例えば、酵素ダイサーの存在下で、より長い二本鎖のＲＮＡを処理することによって生成することができる。一実施形態では、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａインビトロ系が使用される。この実施形態では、ｄｓＲＮＡは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ胚に由来する可溶性抽出物と混合され、それによって組合せが生成される。この組合せは、ｄｓＲＮＡが処理されて約２１〜約２３ヌクレオチドのＲＮＡ分子になる条件下で維持される。ｓｉＲＮＡ分子は、当業者に既知のいくつかの技法を使用して精製することができる。例えば、ゲル電気泳動を使用することによって、ｓｉＲＮＡを精製することができる。あるいは、非変性カラムクロマトグラフィーなどの非変性方法を使用することによって、ｓｉＲＮＡを精製することができる。さらに、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）、グリセロール勾配遠心分離、抗体を用いた親和性精製を使用することによって、ｓｉＲＮＡを精製することができる。   As described herein, siRNAs can be about 19-30 nucleotides in length, or 21-23 nucleotides in length. siRNAs are understood to guide the complex to the target mRNA by recruiting the nuclease complex and pairing with a specific sequence. As a result, the target mRNA is degraded by nucleases in the protein complex. In certain embodiments, the 21-23 nucleotide siRNA molecule comprises a 3 'hydroxyl group. In certain embodiments, siRNA constructs can be generated, for example, by processing longer double stranded RNAs in the presence of the enzyme Dicer. In one embodiment, the Drosophila in vitro system is used. In this embodiment, dsRNA is mixed with a soluble extract derived from Drosophila embryos, thereby producing a combination. This combination is maintained under conditions where the dsRNA is processed to an RNA molecule of about 21 to about 23 nucleotides. siRNA molecules can be purified using a number of techniques known to those of skill in the art. For example, siRNA can be purified by using gel electrophoresis. Alternatively, siRNA can be purified by using non-denaturing methods such as non-denaturing column chromatography. In addition, siRNA can be purified by using chromatography (eg, size exclusion chromatography), glycerol gradient centrifugation, affinity purification using antibodies.

ｓｉＲＮＡの生成は、化学合成法または組換え核酸技法によって実施することができる。処理された細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼは、インビボで転写を媒介することができ、またはクローン化ＲＮＡポリメラーゼは、インビトロでの転写のために使用することができる。本明細書で使用する場合、ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含有する分子に限定される必要はないが、ＤＮＡ鎖、いくつかのＤＮＡヌクレオチドを含有し、かつ／または化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドを包含することができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、例えば、細胞ヌクレアーゼに対する感受性を低減し、バイオアベイラビリティーを改善し、製剤の特性を改善し、かつ／または他の薬物動態学的性質を変化させるために、リン酸−糖主鎖またはヌクレオシドに対する修飾を含むことができる。例えば、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合を修飾することによって、窒素または硫黄ヘテロ原子の少なくとも１つを含めることができる。ＲＮＡ構造中の修飾を調整することによって、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に対する一般的な応答を回避しながら、特定の遺伝的阻害を可能にすることができる。同様に、塩基を修飾することによって、アデノシンデアミナーゼの活性を遮断することができる。ｄｓＲＮＡは、酵素的に、または部分的／全有機合成によって生成することができ、任意の修飾されたリボヌクレオチドを、インビトロ酵素的または有機合成によって導入することができる。ＲＮＡ分子を化学的に修飾する方法は、ｄｓＲＮＡを修飾することにも適合させることができる（例えば、Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２５巻：７７６〜７８０頁；Ｗｉｌｓｏｎら（１９９４年）Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇ ７巻：８９〜９８頁；Ｃｈｅｎら（１９９５年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３巻：２６６１〜２６６８頁；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎら（１９９７年）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ７巻：５５〜６１頁を参照されたい）。単に例えば、ｓｉＲＮＡの主鎖は、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、ホスホジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、キメラのメチルホスホネート−ホスホジエステル、ペプチド核酸、オリゴマーまたは糖修飾を含む５−プロピニル−ピリミジン（例えば、２’−置換リボヌクレオシド、ａ−配置）で修飾することができる。ある特定の場合では、本開示のｄｓＲＮＡｓは、２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠いている。   Generation of siRNA can be performed by chemical synthesis methods or by recombinant nucleic acid techniques. The endogenous RNA polymerase of the treated cell can mediate transcription in vivo, or the cloned RNA polymerase can be used for transcription in vitro. As used herein, siRNA molecules need not be limited to molecules containing only RNA, but include DNA strands, several DNA nucleotides, and / or chemically modified nucleotides and Non-nucleotides can be included. For example, siRNAs may be phosphate-sugar backbones, for example, to reduce sensitivity to cellular nucleases, improve bioavailability, improve formulation properties, and / or alter other pharmacokinetic properties. Modifications to the chain or nucleoside can be included. For example, at least one of a nitrogen or sulfur heteroatom can be included by modifying the phosphodiester bond of the natural RNA. By tailoring modifications in the RNA structure, specific genetic inhibition can be allowed while avoiding a general response to double-stranded RNA (dsRNA). Similarly, the activity of adenosine deaminase can be blocked by modifying the base. dsRNA can be produced enzymatically or by partial / total organic synthesis, and any modified ribonucleotide can be introduced by in vitro enzymatic or organic synthesis. Methods for chemically modifying RNA molecules can also be adapted to modify dsRNA (eg, Heidenreich et al. (1997) Nucleic Acids Res, 25: 776-780; Wilson et al. (1994). See J Mol Recog 7: 89-98; Chen et al. (1995) Nucleic Acids Res 23: 2661-2668; Hirschbein et al. (1997) Antisense Nucleic Drug Dev 7: 55-61. ). Simply, for example, the backbone of siRNA is phosphorothioate, phosphoramidate, phosphodithioate, chimeric methylphosphonate-phosphodiester, peptide nucleic acids, oligomers or sugar modifications containing 5-propynyl-pyrimidines (eg, 2′- Substituted ribonucleosides, a-configuration). In certain cases, dsRNAs of the present disclosure lack 2'-hydroxy (2'-OH) containing nucleotides.

ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖は、長さが約１〜約６ヌクレオチド、または長さが約２〜約４ヌクレオチド、または長さが約１〜３ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。ある特定の実施形態では、一方の鎖は３’オーバーハングを有し、他方の鎖は、平滑末端とするか、やはりオーバーハングを有することができる。オーバーハングの長さはそれぞれの鎖について、同じであっても、異なっていてもよい。ｓｉＲＮＡの安定性をさらに高めるために、３’オーバーハングは、劣化に対して安定化させることができる。一実施形態では、ＲＮＡは、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含めることによって安定化する。あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、２’−デオキシチミジンによるウリジンヌクレオチド３’オーバーハングの置換は許容されており、ＲＮＡｉの効率に影響しない。２’ヒドロキシルが存在しないことにより、組織培養培地中でオーバーハングのヌクレアーゼ耐性が著しく増強され、インビボで有益となり得る。   In certain embodiments, at least one strand of the siRNA molecule is about 1 to about 6 nucleotides in length, or about 2 to about 4 nucleotides in length, or 3 ′ over about 1 to 3 nucleotides in length. Have a hang. In certain embodiments, one strand can have a 3 'overhang and the other strand can be blunt ended or still have an overhang. The length of the overhang may be the same or different for each chain. In order to further enhance the stability of the siRNA, the 3 'overhang can be stabilized against degradation. In one embodiment, the RNA is stabilized by including purine nucleotides such as adenosine or guanosine nucleotides. Alternatively, substitution of pyrimidine nucleotides by modified analogs, such as substitution of uridine nucleotide 3 'overhangs by 2'-deoxythymidine is tolerated and does not affect RNAi efficiency. The absence of the 2 'hydroxyl can greatly enhance the nuclease resistance of overhangs in tissue culture media and can be beneficial in vivo.

他の実施形態では、干渉ＲＮＡは、長い二本鎖ＲＮＡの形態とすることもできる。例えば、ｄｓＲＮＡの二本鎖の部分は、長さが少なくとも２５、５０、１００、２００、３００もしくは４００塩基、または長さが約４００〜８００塩基とすることができる。場合により、ｄｓＲＮＡは、例えば、細胞中にｓｉＲＮＡ配列を生成するために、細胞内で消化することができる。しかし、インビボで長い二本鎖ＲＮＡを使用することは必ずしも実用的ではないが、これはおそらく、配列非依存性のｄｓＲＮＡ応答によって生じる場合のある有害な効果のためである。そのような実施形態では、局所送達系および／またはインターフェロンもしくはＰＫＲの効果を低減する作用剤の使用が好適である。   In other embodiments, the interfering RNA can be in the form of long double stranded RNA. For example, the dsRNA double-stranded portion can be at least 25, 50, 100, 200, 300 or 400 bases in length, or about 400-800 bases in length. Optionally, the dsRNA can be digested within the cell, for example, to generate a siRNA sequence in the cell. However, the use of long double-stranded RNAs in vivo is not always practical, probably because of the deleterious effects that can be caused by a sequence-independent dsRNA response. In such embodiments, the use of local delivery systems and / or agents that reduce the effects of interferon or PKR is preferred.

他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ヘアピン構造（例えば、ヘアピンＲＮＡ）の形態とすることができる。ヘアピンＲＮＡは、外因的に合成することができ、またはインビボで、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから転写することによって形成することができる。哺乳動物細胞における遺伝子サイレンシングのためにそのようなヘアピンＲＮＡを作製または使用する例は、例えば、Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ、２００２年、１６巻：９４８〜５８頁；ＭｃＣａｆｆｒｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、４１８巻：３８〜９頁；ＭｃＭａｎｕｓら、ＲＮＡ、２００２年、８巻：８４２〜５０頁；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２００２年、９９巻：６０４７〜５２頁に記載されている。そのようなヘアピンＲＮＡは、細胞中または動物中で操作されることによって、所望の遺伝子の連続的で安定な抑制を確実にすることが好ましい。ｓｉＲＮＡは、細胞中でヘアピンＲＮＡを処理することによって生成することができることは、当技術分野で既知である。   In other embodiments, the siRNA can be in the form of a hairpin structure (eg, hairpin RNA). Hairpin RNA can be synthesized exogenously or can be formed by transcription from an RNA polymerase III promoter in vivo. Examples of making or using such hairpin RNAs for gene silencing in mammalian cells are described, for example, in Paddison et al., Genes Dev, 2002, 16: 948-58; McCaffrey et al., Nature, 2002. 418: 38-9; McManus et al., RNA, 2002, 8: 842-50; Yu et al., Proc Nati Acad Sci USA, 2002, 99: 6047-52. Such hairpin RNAs are preferably engineered in cells or animals to ensure continuous and stable suppression of the desired gene. It is known in the art that siRNA can be generated by treating hairpin RNA in cells.

ＰＣＴ出願ＷＯ０１／７７３５０には、真核細胞中で、同じ導入遺伝子のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ転写物の両方を生じさせるために、導入遺伝子を双方向転写するための例示的なベクターが記載されている。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、以下の独特の特徴を有する組換えベクターを提供する：これは対抗する方向に、対象とするｓｉＲＮＡについての導入遺伝子と隣接して配置された２つの重複転写ユニットを有するウイルスレプリコンを含み、この２つの重複転写ユニットにより、宿主細胞中で同じ導入遺伝子断片からセンスおよびアンチセンスＲＮＡ転写物の両方が生じる。   PCT application WO 01/77350 describes exemplary vectors for bidirectional transcription of transgenes in eukaryotic cells to produce both sense and antisense RNA transcripts of the same transgene. Yes. Thus, in certain embodiments, the present disclosure provides a recombinant vector having the following unique characteristics: 2 which are placed in the opposite direction, adjacent to the transgene for the siRNA of interest. A viral replicon having two overlapping transcription units, which generate both sense and antisense RNA transcripts from the same transgene fragment in the host cell.

ある特定の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤または抗ＭＥＴ治療剤は、酵素的核酸とすることができる。「酵素的核酸」とは、基質結合領域内で、指定された標的遺伝子との相補性を有し、標的核酸を特異的に切断することに活性である酵素活性も有する核酸を意味する。酵素的核酸は、分子間で核酸を切断することができ、それによって標的核酸を不活化すると理解されている。これらの相補性領域により、酵素的核酸の標的核酸への十分なハイブリダイゼーションが可能になり、したがって切断が可能になる。１００パーセントの相補性（同一性）が好適であるが、５０〜７５％の低い相補性でも有用となり得る（例えば、ＷｅｒｎｅｒおよびＵｈｌｅｎｂｅｃｋ、１９９５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２３巻、２０９２〜２０９６頁；Ｈａｍｍａｎｎら、１９９９年、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．、９巻、２５〜３１頁を参照されたい）。酵素的核酸は、塩基、糖、および／またはリン酸基の箇所で修飾することができる。本明細書で記述する場合、用語「酵素的核酸」は、語句、例えば、リボザイム、触媒的ＲＮＡ、酵素的ＲＮＡ、触媒的ＤＮＡ、アプタザイムもしくはアプタマー結合リボザイム、調節可能リボザイム、触媒的オリゴヌクレオチド、ヌクレオザイム（ｎｕｃｌｅｏｚｙｍｅ）、ＤＮＡザイム、ＲＮＡ酵素、エンドリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ミニザイム、リードザイム、オリゴザイムまたはＤＮＡ酵素などと互換的に使用される。これらの専門用語のすべては、酵素活性を有する核酸を記述する。本明細書に記載される特異的な酵素的核酸は、限定的であることを意味するのでなく、当業者は、酵素的核酸において重要なのは、これは、１つまたは複数の標的核酸領域と相補性である特異的基質結合部位を有し、分子に核酸切断活性および／または核酸連結活性を付与するその基質結合部位内またはこの周囲にヌクレオチド配列を有することであることを認識するであろう（Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；Ｃｅｃｈら、１９８８年、２６０ ＪＡＭＡ ３０３０）。一実施形態では、酵素的核酸は、ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断することによって、ｍＲＮＡの翻訳を妨げるように設計されたリボザイムである（例えば、１９９０年１０月４日に公開された、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４、；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７巻：１２２２〜１２２５頁；および米国特許第５，０９３，２４６号を参照されたい）。別の実施形態では、酵素的核酸はＤＮＡ酵素である。ＤＮＡ酵素を作製し、投与する方法は、例えば、米国特許第６，１１０，４６２号に見出すことができる。   In certain embodiments, the anti-ErbB therapeutic or anti-MET therapeutic can be an enzymatic nucleic acid. The term “enzymatic nucleic acid” means a nucleic acid having complementarity with a designated target gene in a substrate binding region and also having an enzymatic activity that is active in specifically cleaving the target nucleic acid. Enzymatic nucleic acids are understood to be able to cleave nucleic acids between molecules, thereby inactivating the target nucleic acid. These complementary regions allow sufficient hybridization of the enzymatic nucleic acid to the target nucleic acid and thus allow cleavage. 100 percent complementarity (identity) is preferred, but complementarity as low as 50-75% can also be useful (eg Werner and Uhlenbeck, 1995, Nucleic Acids Research, 23, 2092-2096; Hammann Et al., 1999, Antisense and Nucleic Acid Drug Dev., 9, 25-31). Enzymatic nucleic acids can be modified at the base, sugar, and / or phosphate group. As used herein, the term “enzymatic nucleic acid” refers to a phrase such as ribozyme, catalytic RNA, enzymatic RNA, catalytic DNA, aptazyme or aptamer-binding ribozyme, regulatable ribozyme, catalytic oligonucleotide, nucleoside. Used interchangeably with zyme, DNAzyme, RNA enzyme, endoribonuclease, endonuclease, minizyme, leadzyme, oligozyme or DNA enzyme. All of these terminology describe nucleic acids with enzymatic activity. The specific enzymatic nucleic acids described herein are not meant to be limiting, and those skilled in the art will appreciate that in enzymatic nucleic acids this is complementary to one or more target nucleic acid regions. It will be appreciated that it has a specific substrate binding site that is sexual and has a nucleotide sequence in or around that substrate binding site that confers nucleic acid cleavage and / or nucleic acid linking activity to the molecule ( Cech et al., US Pat. No. 4,987,071; Cech et al., 1988, 260 JAMA 3030). In one embodiment, the enzymatic nucleic acid is a ribozyme designed to prevent translation of mRNA by catalytic cleavage of the mRNA transcript (eg, PCT published on Oct. 4, 1990). See International Publication WO 90/11364; Sarver et al., 1990, Science 247: 1222-1225; and US Pat. No. 5,093,246). In another embodiment, the enzymatic nucleic acid is a DNA enzyme. Methods for making and administering DNA enzymes can be found, for example, in US Pat. No. 6,110,462.

別の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤または抗ＭＥＴ治療剤は、抗体、例えば、ＥｒｂＢタンパク質（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、もしくはＥｒｂＢ４）、ＭＥＴタンパク質、ＥｒｂＢリガンド（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＡＲ、ＢＴＣ、ＨＢ−ＥＰＲ、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、もしくはＮＲＧ４）、またはＭＥＴリガンド（例えば、肝細胞成長因子（ＨＧＦ））に結合する抗体などとすることができる。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、その抗原結合性断片を含むことが意図されている。抗体は、従来の技法を使用して断片化することができ、断片は、全抗体に対して適当であるのと同じ様式で、有用性についてスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、ペプシンを用いて抗体を処理することによって生成することができる。得られたＦ（ａｂ’）２断片を処理することによって、ジスルフィド架橋を還元してＦａｂ’断片を作製することができる。抗体には、二重特異性分子およびキメラ分子、ならびに単鎖（ｓｃＦｖ）抗体が含まれることがさらに意図されている。三量体抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および単鎖抗体も含まれる。すべてのこれらの修飾形態の抗体、ならびに抗体の断片は、用語「抗体」に含まれることが意図されている。 In another embodiment, the anti-ErbB therapeutic or anti-MET therapeutic is an antibody, such as an ErbB protein (eg, ErbB1, ErbB2, ErbB3, or ErbB4), a MET protein, an ErbB ligand (eg, EGF, TGFα, AR, BTC, HB-EPR, NRG1, NRG2, NRG3, or NRG4), or an antibody that binds to a MET ligand (eg, hepatocyte growth factor (HGF)). As used herein, the term “antibody” is intended to include antigen-binding fragments thereof. Antibodies can be fragmented using conventional techniques, and the fragments can be screened for utility in the same manner as is appropriate for whole antibodies. For example, F (ab ′) 2 fragments can be generated by treating antibody with pepsin. By treating the resulting F (ab ′) 2 fragment, the disulfide bridge can be reduced to produce a Fab ′ fragment. Antibodies are further intended to include bispecific and chimeric molecules, as well as single chain (scFv) antibodies. Also included are trimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, and single chain antibodies. All these modified forms of antibodies, as well as fragments of antibodies, are intended to be included in the term “antibody”.

抗体は、当技術分野で既知の方法によって誘発することができる。例えば、マウス、ハムスターまたはウサギなどの哺乳動物を、ＥｒｂＢタンパク質、ＭＥＴタンパク質、ＥｒｂＢリガンドまたはＭＥＴリガンドの免疫原性形態（例えば、抗体応答を誘発することができる抗原断片）で免役することができる。あるいは、免疫化は、ＥｒｂＢタンパク質、ＭＥＴタンパク質、ＥｒｂＢリガンドまたはＭＥＴリガンドをインビボで発現する核酸を使用して行うことができ、観察される免疫原性応答を生じる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与するための技法には、担体への結合、または当技術分野で公知である他の技法が含まれる。例えば、本発明のポリペプチドのペプチジル部分を、アジュバントの存在下で施すことができる。免疫化の進行は、血漿または血清中の抗体価の検出によってモニターすることができる。標準的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを、抗原としての免疫源とともに使用することによって、抗体のレベルを評価することができる。   Antibodies can be induced by methods known in the art. For example, a mammal such as a mouse, hamster or rabbit can be immunized with an ErbB protein, MET protein, ErbB ligand or an immunogenic form of a MET ligand (eg, an antigenic fragment capable of eliciting an antibody response). Alternatively, immunization can be performed using ErbB protein, MET protein, ErbB ligand or nucleic acid expressing MET ligand in vivo, resulting in an observed immunogenic response. Techniques for conferring immunogenicity on a protein or peptide include conjugation to a carrier or other techniques known in the art. For example, the peptidyl moiety of the polypeptides of the invention can be applied in the presence of an adjuvant. The progress of immunization can be monitored by detection of antibody titers in plasma or serum. Standard ELISA or other immunoassays can be used with the immunogen as an antigen to assess antibody levels.

免疫化した後、本発明のポリペプチドと反応性の抗血清を得ることができ、必要に応じて、血清からポリクローナル抗体を単離することができる。モノクローナル抗体を生成するために、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫動物から収集し、標準的な体細胞融合手順により、骨髄腫細胞などの不死化細胞と融合させることによって、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。そのような技法は、当技術分野で公知であり、例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂａｒら、（１９８３年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４巻：７２頁）、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら、（１９８５年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． ７７〜９６頁）のようなハイブリドーマ技法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜４９７頁によって最初に開発された）を含む。ハイブリドーマ細胞を免疫化学的にスクリーニングして、本発明のポリペプチドと特異的に反応性の抗体を生成することができ、モノクローナル抗体を単離することができる。   After immunization, an antiserum reactive with the polypeptide of the present invention can be obtained, and if necessary, a polyclonal antibody can be isolated from the serum. Obtaining hybridoma cells by collecting antibody-producing cells (lymphocytes) from immunized animals and fusing them with immortalized cells such as myeloma cells by standard somatic cell fusion procedures to generate monoclonal antibodies. Can do. Such techniques are known in the art and include, for example, the human B cell hybridoma technique (Kozbar et al. (1983) Immunology Today, 4:72), and EBV- for generating human monoclonal antibodies. Hybridoma techniques (Kohler and Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497, such as hybridoma techniques (Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapeutics, Alan R. Liss, Inc. 77-96). First developed by page). Hybridoma cells can be screened immunochemically to produce antibodies specifically reactive with the polypeptides of the invention, and monoclonal antibodies can be isolated.

ある特定の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤は、タンパク質ディスプレイ骨格（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｃａｆｆｏｌｄ）とすることができ（例えば、Ｈｏｓｓｅ， Ｒ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５巻：１４〜２７頁（２００６年）を参照されたい）、これは、ＥｒｂＢタンパク質（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４）、ＭＥＴタンパク質、ＥｒｂＢリガンド（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＡＲ、ＢＴＣ、ＨＢ−ＥＰＲ、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、もしくはＮＲＧ４）、またはＭＥＴリガンド（例えば、肝細胞成長因子（ＨＧＦ））に結合する。一実施形態では、タンパク質ディスプレイ骨格は、フィブロネクチンベース「アドレス可能な」治療剤結合分子（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）である（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／３４７８４号、同第ＷＯ０１／６４９４２号、同第ＷＯ０２／０３２９２５号を参照されたい）。フィブロネクチンドメインＩＩＩ（ＦｎＩＩＩ）ループは、有用な治療ツールを開発するために、ランダムな突然変異にかけ、標的結合、選択、およびさらなる突然変異の反復ラウンドの進化スキーム（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｓｃｈｅｍｅ）に向けることができる領域を含む。   In certain embodiments, the anti-ErbB therapeutic and / or anti-MET therapeutic can be a protein display scaffold (eg, Hosse, RJ et al., Protein Science, Volume 15: 14-27 (2006)), which includes ErbB proteins (eg, ErbB1, ErbB2, ErbB3, or ErbB4), MET proteins, ErbB ligands (eg, EGF, TGFα, AR, BTC, HB- EPR, NRG1, NRG2, NRG3, or NRG4), or a MET ligand (eg, hepatocyte growth factor (HGF)). In one embodiment, the protein display scaffold is a fibronectin-based “addressable” therapeutic binding molecule (eg, PCT Publication Nos. WO00 / 34784, WO01 / 64942, WO02 / No. 032925). The fibronectin domain III (FnIII) loop is a region that can be subjected to random mutations, targeted binding, selection, and an evolutionary scheme of further mutation iterations to develop useful therapeutic tools including.

ある特定の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤は、ＥｒｂＢ受容体またはＭＥＴ受容体とその対応するリガンドとの間の結合性を低減するポリペプチドとすることができる。一実施形態では、ポリペプチドは、可溶性のＥｒｂＢまたはＭＥＴポリペプチド、特に、ＥｒｂＢまたはＭＥＴの細胞外ドメイン、例えば、ＥｒｂＢまたはＭＥＴタンパク質の任意の天然に存在する細胞外ドメインなどを含むポリペプチド、ならびにリガンド結合を保持する任意のその変異体（突然変異体、断片およびペプチド模倣体形態を含めて）とすることができる。   In certain embodiments, the anti-ErbB therapeutic and / or anti-MET therapeutic can be a polypeptide that reduces the binding between the ErbB receptor or MET receptor and its corresponding ligand. In one embodiment, the polypeptide comprises a soluble ErbB or MET polypeptide, in particular a polypeptide comprising the extracellular domain of ErbB or MET, such as any naturally occurring extracellular domain of ErbB or MET protein, and It can be any variant thereof that retains ligand binding, including mutant, fragment and peptidomimetic forms.

ある特定の実施形態では、ＥｒｂＢまたはＭＥＴリガンド結合ポリペプチドには、ペプチド模倣体が含まれる。ペプチド模倣体は、化学的に修飾されたペプチド、および天然に存在しないアミノ酸、ペプトイドなどを含むペプチド様分子を指す。ペプチド模倣体は、対象に投与されたとき、安定性の増強を含めて、ペプチドに対して様々な利点を供給する。ペプチド模倣体を同定するための方法は、当技術分野で公知であり、潜在的なペプチド模倣体のライブラリーを含むデータベースのスクリーニングを含む。例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄａｔａｂａｓｅは、既知の結晶構造を有する３００，０００化合物を超える収集を含む（Ａｌｌｅｎら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ， Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｂ、３５巻：２３３１頁（１９７９年））。標的分子の結晶構造が全く入手可能でない場合、構造は、例えば、プログラムＣＯＮＣＯＲＤ（Ｒｕｓｉｎｋｏら、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｆ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｓｃｉ． ２９巻：２５１頁（１９８９年））を使用して作製することができる。別のデータベース、ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ， Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ Ｃａｌｉｆ．）は、市販されている約１００，０００の化合物を含み、ＥｒｂＢまたはＭＥＴリガンド結合ポリペプチドの潜在的なペプチド模倣体を同定するために検索することができる。   In certain embodiments, the ErbB or MET ligand binding polypeptide includes a peptidomimetic. Peptidomimetics refers to peptide-like molecules comprising chemically modified peptides and non-naturally occurring amino acids, peptoids, and the like. Peptidomimetics provide various advantages over peptides, including enhanced stability, when administered to a subject. Methods for identifying peptidomimetics are known in the art and include screening databases that contain libraries of potential peptidomimetics. For example, Cambridge Structural Database includes a collection of over 300,000 compounds with known crystal structures (Allen et al., Acta Crystallogr, Section B, 35: 2331 (1979)). If the crystal structure of the target molecule is not available at all, the structure can be created using, for example, the program CONCORD (Rusinko et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci. 29: 251 (1989)). Can do. Another database, the Available Chemicals Directory (Molecular Design Limited, Information Systems; San Leandro Calif.), Contains approximately 100,000 compounds of commercially available, ErbB or MET ligand-peptidomimetic polypeptides. Can be searched to identify.

ある特定の態様では、ＥｒｂＢまたはＭＥＴリガンド結合ポリペプチドの機能性変異体または修飾形態には、ＥｒｂＢまたはＭＥＴポリペプチドの少なくとも一部、および１つまたは複数の融合ドメインを有する融合タンパク質が含まれる。そのような融合ドメインの公知の例には、それだけに限らないが、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンが含まれる。例示的な実施形態では、ＥｒｂＢまたはＭＥＴ−ポリペプチドは、インビボでＥｒｂＢまたはＭＥＴポリペプチドを安定化させるドメイン（「スタビライザー」ドメイン）と融合される。「安定化する」とは、血清半減期を増大させる任意のことを意味し、これが、破壊の減少、腎臓によるクリアランスの減少、または他の薬物動態学的効果のためであるかどうかに関係ない。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合により、広範囲のタンパク質に望ましい薬物動態学的性質が付与されることが知られている。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合も、望ましい性質を付与し得る。選択することができる他の種類の融合ドメインとして、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ドメイン、および機能ドメイン（追加の生物学的機能を付与する）が挙げられる。   In certain aspects, a functional variant or modified form of an ErbB or MET ligand binding polypeptide includes a fusion protein having at least a portion of an ErbB or MET polypeptide and one or more fusion domains. Known examples of such fusion domains include, but are not limited to, polyhistidine, Glu-Glu, glutathione S transferase (GST), thioredoxin, protein A, protein G, immunoglobulin heavy chain constant region (Fc), maltose Binding protein (MBP) or human serum albumin is included. In an exemplary embodiment, the ErbB or MET-polypeptide is fused to a domain that stabilizes the ErbB or MET polypeptide in vivo (a “stabilizer” domain). “Stabilize” means anything that increases serum half-life, regardless of whether this is due to decreased destruction, decreased clearance by the kidney, or other pharmacokinetic effects. . Fusion with the Fc portion of an immunoglobulin is known to impart desirable pharmacokinetic properties to a wide range of proteins. Similarly, fusion to human serum albumin can confer desirable properties. Other types of fusion domains that can be selected include multimerization (eg, dimerization, tetramerization) domains, and functional domains (providing additional biological functions).

抗ＥｒｂＢ１（抗ＥＧＦＲ）治療剤の例は、当技術分野で既知である。例えば、小分子抗ＥｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）治療剤として、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、例えば、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（商標）；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、Ｌｏｎｄｏｎ）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（商標）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ＢＩＢＷ２９９２、ＺＤ６４７４、ＡＶ−４１２またはＨＫＩ−２７２などが挙げられる。抗ＥＧＦＲタンパク質治療剤として、例えば、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（商標）、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹおよびＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（商標）、Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＥＭＤ−７２００（Ｍｅｒｃｋ ＡＧ）、ＡＢＸ−ＥＧＦ（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．およびＡｂｇｅｎｉｘ Ｉｎｃ．）、ＨＲ３（キューバ政府）、ＩｇＡ抗体（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｒｌａｎｇｅｎ−Ｎｕｒｅｍｂｅｒｇ）、ＴＰ−３８（ＩＶＡＸ）などが挙げられる。   Examples of anti-ErbB1 (anti-EGFR) therapeutic agents are known in the art. For example, as a small molecule anti-ErbB1 (EGFR) therapeutic, an EGFR kinase inhibitor such as gefitinib (IRESSA ™; AstraZeneca, London), erlotinib (TARCEVA ™; Genentech, South San Francisco, CA), Lapatibu, PF002998804, CI-1033, EKB-569, BIBW2992, ZD6474, AV-412, HKI-272, etc. are mentioned. Anti-EGFR protein therapeutics include, for example, anti-EGFR antibodies such as cetuximab (ERBITUX ™, ImClone Systems Inc, New York, NY and Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ), Panitum B A Thousand Oaks, CA), EMD-7200 (Merck AG), ABX-EGF (Amgen Inc. and Abgenix Inc.), HR3 (Cuban government), IgA antibody (University of Erlengen-Nuremberg IV), TP, etc. Is mentioned.

抗ＥｒｂＢ２治療剤の例として、例えば、ＣＰ−７２４−７１４、ＣＩ−１０３３（カネルチニブ）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）（トラスツズマブ）、ＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標）（ペルツズマブ）、ＴＡＫ−１６５、ＧＷ−５７２０１６（イオナファルニブ（Ｉｏｎａｆａｒｎｉｂ））、ＧＷ−２８２９７４、ＥＫＢ−５６９、ＰＩ−１６６、ｄＨＥＲ２（ＨＥＲ２ワクチン）、ＡＰＣ８０２４（ＨＥＲ２ワクチン）、抗ＨＥＲ／２ｎｅｕ二重特異性抗体、Ｂ７．ｈｅｒ２ＩｇＧ３、ＡＳ ＨＥＲ２三官能性二重特異性抗体、ｍＡＢ ＡＲ−２０９およびｍＡＢ ２Ｂ−１が挙げられる。追加の抗ＥｒｂＢ２治療剤には、ＷＯ９８／０２４３４、ＷＯ９９／３５１４６、ＷＯ９９／３５１３２、ＷＯ９８／０２４３７、ＷＯ９７／１３７６０、ＷＯ９５／１９９７０、ＷＯ２００１／９８２７７、米国特許第５，５８７，４５８号、米国特許第５，８７７，３０５号、米国特許第６，４６５，４４９号、および同第６，２８４，７６４号に記載されているものが含まれる。   Examples of anti-ErbB2 therapeutic agents include, for example, CP-724-714, CI-1033 (caneltinib), HERCEPTIN (TM) (trastuzumab), OMNITAG (TM) (pertuzumab), TAK-165, GW-572016 (Ionafarnib (Ionafarnib) )), GW-282974, EKB-569, PI-166, dHER2 (HER2 vaccine), APC8024 (HER2 vaccine), anti-HER / 2neu bispecific antibody, B7. her2IgG3, AS HER2 trifunctional bispecific antibody, mAB AR-209 and mAB 2B-1. Additional anti-ErbB2 therapeutic agents include WO98 / 02434, WO99 / 35146, WO99 / 35132, WO98 / 02437, WO97 / 13760, WO95 / 19970, WO2001 / 98277, US Pat. No. 5,587,458, US Pat. No. 5,877,305, US Pat. Nos. 6,465,449, and 6,284,764.

抗ＥｒｂＢ３治療剤の例には、例えば、抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、米国特許公開第２００４０１９７３３２号を参照されたい）が含まれる。   Examples of anti-ErbB3 therapeutics include, for example, anti-ErbB3 antibodies (see, eg, US Patent Publication No. 20040197332).

抗ＥｒｂＢ４治療剤の例には、例えば、抗ＥｒｂＢ４ ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｍａａｔｔａら、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ １７巻：６７〜７９頁（２００６年）、またはＥｒｂＢ４キナーゼ阻害剤、例えば、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、およびＡＶ４１２などが含まれる。   Examples of anti-ErbB4 therapeutics include, for example, anti-ErbB4 siRNA (eg, Maatta et al., Mol. Biol. Cell 17: 67-79 (2006), or ErbB4 kinase inhibitors such as CI-1033, EKB. -569, lapatinib, PF00299804, AV412 and the like.

抗ＥｒｂＢ治療剤は、複数の標的を含む治療剤、例えば、ＧＷ５７２０１６、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、およびＯｍｎｉｔａｒｇ（商標）を含めた、ｐａｎ ＥＲＢＢ受容体阻害剤なども包含する。   Anti-ErbB therapeutic agents also include therapeutic agents containing multiple targets, such as pan ERBB receptor inhibitors, including GW572016, CI-1033, EKB-569, and Omnitarg ™.

例示的な抗ＭＥＴ治療剤として、例えば、ＭＥＴキナーゼ阻害剤、例えば、ＰＨＡ−６６５７５２（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ＰＦ−０２３４１０６６（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ＳＵ１１２７４、ＳＵ５４１６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２、およびＯＡ−５Ｄ５などが挙げられる。   Exemplary anti-MET therapeutics include, for example, MET kinase inhibitors such as PHA-665752 (Pfizer, Inc, La Jolla, Calif.), PF-02341066 (Pfizer, Inc, La Jolla, Calif.), SU11274, SU5416, XL-880, MGCD265, XL184, ARQ197, MP-470, SGX-523, JNJ38887705, AMG102, OA-5D5, etc. are mentioned.

４．ＥｒｂＢ修飾およびＭＥＴ修飾を検出するための方法
様々な実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＥｒｂＢ活性化突然変異、ＥｒｂＢ遺伝子増幅、リガンド誘発性ＥｒｂＢ活性化、ＭＥＴ活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、および／またはリガンド媒介ＭＥＴ活性化の検出を伴うことができる。ＥｒｂＢおよびＭＥＴ活性化突然変異の様々な例は、本明細書でさらに記載されており、ＥｒｂＢ配列およびＭＥＴ配列自体の外側の突然変異を含み、これは、ＥｒｂＢまたはＭＥＴタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増大させる。核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の分析、タンパク質産物の分析、および／またはタンパク質活性の分析を伴う方法を含めて、突然変異または遺伝子増幅を検出するために、任意の当技術分野で認められた技法を使用することができる。そのような検出方法は、質的および定量的検出方法の両方を包含する。例示的な方法を本明細書でさらに説明する。 4). Methods for Detecting ErbB and MET Modifications In various embodiments, the methods described herein include ErbB activating mutations, ErbB gene amplification, ligand-induced ErbB activation, MET activating mutations, It may involve MET gene amplification and / or detection of ligand-mediated MET activation. Various examples of ErbB and MET activating mutations are further described herein, including mutations outside the ErbB sequence and the MET sequence itself, which include at least one biological activity of the ErbB or MET protein. Increase. Any art-recognized technique for detecting mutations or gene amplification, including methods involving analysis of nucleic acids (DNA or RNA), analysis of protein products, and / or analysis of protein activity Can be used. Such detection methods include both qualitative and quantitative detection methods. Exemplary methods are further described herein.

遺伝子突然変異
遺伝子突然変異は、核酸試料を、突然変異体配列と特異的にハイブリダイズすることができるプローブと接触させ、次いでプローブのハイブリダイゼーションを検出することによって検出することができる。プローブは一般に、放射性同位体（３Ｈ、３２Ｐ、３３ｐなど）、蛍光剤（ローダミン、フルオレセイン、など）または発色剤（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔ）などで検出可能に標識されることによって、ハイブリダイゼーションの検出を促進する。当業者は、本明細書に提供された開示に基づいて、対象の突然変異を検出するのに適したプローブを容易に設計することができる。例えば、プローブは、アンチセンスオリゴマー、例えば、ＰＮＡ、モルホリノ−ホスホラミデート、ＬＮＡまたは２’−アルコキシアルコキシとすることができ、長さを約８ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約１０〜約７５、約１５〜約５０、または約２０〜約３０ヌクレオチドとすることができる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のプローブは、固体支持体上に孤立させることができ、検出可能に標識された核酸試料は、支持体上でプローブとハイブリダイズすることができる。例えば、このプローブは、複数の固定化された配列を含むマイクロアレイの一部とすることができる。アレイハイブリダイゼーションおよび分析のための方法は、当業者に既知である。 Gene mutations Gene mutations can be detected by contacting a nucleic acid sample with a probe that can specifically hybridize to the mutant sequence and then detecting hybridization of the probe. Probes are generally detected by hybridization with a radioisotope ( 3 H, 32 P, 33 p, etc.), a fluorescent agent (rhodamine, fluorescein, etc.) or a chromogenic agent (chromogen agent). Promote. One of ordinary skill in the art can readily design probes suitable for detecting a mutation of interest based on the disclosure provided herein. For example, the probe can be an antisense oligomer, such as PNA, morpholino-phosphoramidate, LNA or 2′-alkoxyalkoxy, and can be about 8 nucleotides to about 100 nucleotides in length, about 10 to about 75, about It can be 15 to about 50, or about 20 to about 30 nucleotides. In certain embodiments, one or more probes can be isolated on a solid support and a detectably labeled nucleic acid sample can be hybridized with the probes on the support. For example, the probe can be part of a microarray that includes a plurality of immobilized sequences. Methods for array hybridization and analysis are known to those skilled in the art.

あるいは、遺伝子突然変異は、突然変異を含んでいると思われる核酸配列またはその一部を増幅し、増幅核酸の電気泳動移動度を、対応する野生型遺伝子またはその断片の電気泳動移動度と比較することによって、試料中で検出することができる。移動度の差は、増幅核酸配列中の突然変異の存在を示す。電気泳動移動度は、ポリアクリルアミドゲル上で求めることができる。この方法は、挿入および／または欠失突然変異の検出に特に有用である。   Alternatively, a gene mutation amplifies a nucleic acid sequence or portion thereof that appears to contain a mutation, and compares the electrophoretic mobility of the amplified nucleic acid with the electrophoretic mobility of the corresponding wild type gene or fragment thereof. By doing so, it can be detected in the sample. A difference in mobility indicates the presence of a mutation in the amplified nucleic acid sequence. Electrophoretic mobility can be determined on a polyacrylamide gel. This method is particularly useful for detecting insertion and / or deletion mutations.

突然変異の別の適当な検出方法では、酵素突然変異検出（ＥＭＤ）（Ｄｅｌ Ｔｉｔｏら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４巻：７３１〜７３９頁、１９９８年）を使用する。ＥＭＤは、バクテリオファージリゾルベースＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩを使用し、これは、点突然変異、挿入および欠失から生じる塩基対ミスマッチに起因する構造的な歪みを検出し、切断するまで、二本鎖ＤＮＡに沿って走査する。例えば、ゲル電気泳動による、リゾルベース切断によって形成された断片の検出は、突然変異の存在を示す。ＥＭＤ法の利点は、ＰＣＲ反応から直接アッセイされる、点突然変異、欠失、挿入を同定するための単一のプロトコルであり、試料精製の必要性を排除し、ハイブリダイゼーション時間を短縮し、信号対雑音比を増大させる。最大２０倍過剰の正常ＤＮＡと、サイズが最大４ｋｂの断片を含む混合試料を、この方法を使用してアッセイすることができる。しかし、ＥＭＤ走査により、突然変異陽性試料において起こる特定の塩基変化は同定されず、必要であれば、突然変異の素性に対して追加の配列決定手順を必要とする。ＣＥＬ Ｉ酵素も、米国特許第５，８６９，２４５号で実証されているように、リゾルベースＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩと同様に使用することができる。   Another suitable method for detecting mutations uses enzymatic mutation detection (EMD) (Del Tito et al., Clinical Chemistry 44: 731-739, 1998). EMD uses bacteriophage resol-based T4 endonuclease VII, which detects structural distortions resulting from base pair mismatches resulting from point mutations, insertions and deletions, and is double-stranded until cleaved. Scan along the DNA. For example, detection of fragments formed by resol-based cleavage by gel electrophoresis indicates the presence of a mutation. The advantage of the EMD method is a single protocol to identify point mutations, deletions, insertions that are assayed directly from the PCR reaction, eliminating the need for sample purification, reducing hybridization time, Increase the signal-to-noise ratio. Mixed samples containing up to 20-fold excess normal DNA and fragments up to 4 kb in size can be assayed using this method. However, EMD scans do not identify specific base changes that occur in mutation-positive samples and, if necessary, require additional sequencing procedures for mutation identity. The CEL I enzyme can also be used in the same manner as the resol-based T4 endonuclease VII, as demonstrated in US Pat. No. 5,869,245.

点突然変異の検出は、当技術分野で公知である技法を使用して、分子クローニングおよびポリヌクレオチドの配列決定によって実現することができる。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって、生体試料、例えば、癌細胞などに由来するゲノムＤＮＡ標本から遺伝子配列を直接増幅することができる。次いで増幅された配列のＤＮＡ配列を求め、それから突然変異を同定することができる。ポリメラーゼ連鎖反応は当技術分野で公知であり、例えば、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９巻：４８７頁、１９８８年；米国特許第４，６８３，２０３号；および米国特許第４，６８３，１９５号に記載されている。   Detection of point mutations can be accomplished by molecular cloning and polynucleotide sequencing using techniques known in the art. Alternatively, the gene sequence can be directly amplified from a genomic DNA sample derived from a biological sample, such as a cancer cell, by using the polymerase chain reaction (PCR). The DNA sequence of the amplified sequence can then be determined from which mutations can be identified. Polymerase chain reaction is known in the art and is described, for example, in Saiki et al., Science 239: 487, 1988; US Pat. No. 4,683,203; and US Pat. No. 4,683,195. ing.

さらに、対立遺伝子特異的ＰＣＲも、突然変異を検出するのに使用することができる（ＲｕａｎｏおよびＫｉｄｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７巻、８３９２頁、１９８９年）。この技法によれば、特定の配列の３’末端とハイブリダイズするプライマーが使用される。突然変異のために特定の配列が存在しない場合、増幅産物は産生されない。   In addition, allele specific PCR can also be used to detect mutations (Ruano and Kidd, Nucleic Acids Research, 17, 8392, 1989). According to this technique, a primer is used that hybridizes with the 3 'end of a particular sequence. If the specific sequence is not present due to mutation, no amplification product is produced.

遺伝子の挿入および欠失は、クローニング、配列決定および増幅によっても検出することができる。さらに、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）は、配列変化を記録するのに使用することができる。一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析も、塩基変化変異体（ｂａｓｅ ｃｈａｎｇｅ ｖａｒｉａｎｔ）を検出するのに使用することができる（例えば、Ｏｒｉｔａら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６巻、２７６６〜２７７０頁、１９８９年、およびＧｅｎｏｍｉｃｓ、５巻、８７４〜８７９頁、１９８９年を参照されたい）。当技術分野で知られているような、挿入および欠失を検出するための他の技法は、本明細書に記載される方法に従って使用することができる。   Gene insertions and deletions can also be detected by cloning, sequencing and amplification. In addition, restriction fragment length polymorphism (RFLP) can be used to record sequence changes. Single-stranded DNA conformational polymorphism (SSCP) analysis can also be used to detect base change variants (eg, Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86). Vol., 2766-2770, 1989, and Genomics, 5, 874-879, 1989). Other techniques for detecting insertions and deletions, as known in the art, can be used according to the methods described herein.

ミスマッチ検出（例えば、１００％相補性でない二本鎖の検出）も、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列中の点突然変異を検出するのに使用することができる（例えば、米国特許第５，４５９，０３９号、同第５，５５６，７５０号、同第５，６７９，５２２号、同第５，８６１，４８２号、同第５，９２２，５３９号、および同第６，００８，０３１号を参照されたい）。   Mismatch detection (eg, detection of double strands that are not 100% complementary) can also be used to detect point mutations in DNA or RNA sequences (eg, US Pat. No. 5,459,039, (See 5,556,750, 5,679,522, 5,861,482, 5,922,539, and 6,008,031) .

ミスマッチ切断を伴うＲＮａｓｅ保護も、点突然変異を含めた突然変異を検出するのに使用することができる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８２巻、７５７５頁、１９８５年、およびＭｅｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０巻、１２４２頁、１９８５年を参照されたい）。手短に言えば、この方法では、野生型配列と相補性である標識リボプローブを使用する。リボプローブおよび試料から単離されたｍＲＮＡまたはＤＮＡは、一緒にアニール（ハイブリダイズ）され、引き続いて、二本鎖ＲＮＡ構造におけるいくつかのミスマッチを検出することができる酵素ＲＮａｓｅ Ａで消化される。ＲＮａｓｅ Ａによってミスマッチが検出された場合、これは、ミスマッチの部位で切断し、それによってより短い断片を生成し、この断片は、ゲル電気泳動などの分離技術を使用して検出することができる。   RNase protection with mismatch truncation can also be used to detect mutations, including point mutations (eg Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7575, 1985). And Meyers et al., Science, 230, 1242, 1985). Briefly, this method uses a labeled riboprobe that is complementary to the wild-type sequence. The mRNA or DNA isolated from the riboprobe and the sample is annealed (hybridized) together and subsequently digested with the enzyme RNase A, which can detect some mismatches in the double stranded RNA structure. If a mismatch is detected by RNase A, it will cleave at the site of the mismatch, thereby producing a shorter fragment, which can be detected using a separation technique such as gel electrophoresis.

同様の様式で、ＤＮＡプローブを使用することによって、酵素的または化学的切断を通じてミスマッチを検出することができる。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５巻、４３９７頁、１９８８年；およびＳｈｅｎｋら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７２巻、９８９頁、１９７５年を参照されたい。あるいは、ミスマッチは、マッチ二本鎖と比べた、ミスマッチ二本鎖の電気泳動移動度のシフトによって検出することができる。例えば、Ｃａｒｉｅｌｌｏ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、４２巻、７２６頁、１９８８年を参照されたい。リボプローブまたはＤＮＡプローブとともに、突然変異を含んでいる場合のある細胞ｍＲＮＡまたはＤＮＡは、ハイブリダイゼーションの前にＰＣＲを使用して増幅することができる。特に変化が、欠失および挿入などのグロス再配列（ｇｒｏｓｓ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）である場合、ＤＮＡ配列の変化は、サザンハイブリダイゼーションを使用しても検出することができる。   In a similar manner, mismatches can be detected through enzymatic or chemical cleavage by using DNA probes. See, for example, Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 4397, 1988; and Shenk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 989, 1975. Alternatively, the mismatch can be detected by a shift in electrophoretic mobility of the mismatched duplex compared to the matched duplex. See, for example, Cariello, Human Genetics, 42, 726, 1988. Along with riboprobes or DNA probes, cellular mRNA or DNA that may contain mutations can be amplified using PCR prior to hybridization. Changes in the DNA sequence can also be detected using Southern hybridization, particularly where the change is a gross rearrangement such as deletions and insertions.

遺伝子増幅
増幅した標的遺伝子の存在は、標的遺伝子のコピー数、すなわち、標的タンパク質をコードする、細胞中のＤＮＡ配列の数を求めることによって評価することができる。一般に、正常な二倍体細胞は、２コピーの所与の常染色体遺伝子を有するが、コピー数は、遺伝子増幅または複製によって増加させることができる。特定の遺伝子のコピー数の評価方法は、当技術分野で公知であり、ハイブリダイゼーションおよび増幅に基づくアッセイを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子の増幅されたコピーの実際の数が求められる。あるいは、遺伝子増幅の質的な尺度を得ることができる。遺伝子増幅を検出するための様々な方法には、例えば、増幅に基づく方法、およびハイブリダイゼーションに基づく方法（サザンブロット法、ＦＩＳＨ、ＣＧＨおよびマイクロアレイ技法など）が含まれ、本明細書でさらに説明する。 Gene amplification The presence of an amplified target gene can be assessed by determining the copy number of the target gene, ie, the number of DNA sequences in the cell that encode the target protein. In general, normal diploid cells have two copies of a given autosomal gene, but copy number can be increased by gene amplification or replication. Methods for assessing the copy number of a particular gene are known in the art and include hybridization and amplification based assays. In some embodiments, the actual number of amplified copies of the gene is determined. Alternatively, a qualitative measure of gene amplification can be obtained. Various methods for detecting gene amplification include, for example, amplification-based methods and hybridization-based methods (such as Southern blotting, FISH, CGH, and microarray techniques) and are further described herein. .

増幅に基づく方法
遺伝子増幅を検出するための増幅に基づく方法は、増幅された配列のコピー数を測定するのに使用することができ、対象とする配列の増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわちＰＣＲを使用して）を伴う。定量的な増幅では、増幅産物の量は、最初の試料中の鋳型の量に比例する。適切な対照との比較により、所与の試料中の対象とする配列のコピー数の尺度が提供される。対照と比較した場合の、より高いレベルの増幅産物の存在は、配列が増幅されたことを示す。 Amplification-based methods Amplification-based methods for detecting gene amplification can be used to determine the copy number of amplified sequences and can be used to amplify sequences of interest (eg, polymerase chain reaction, ie PCR). Using). In quantitative amplification, the amount of amplification product is proportional to the amount of template in the initial sample. Comparison with appropriate controls provides a measure of the copy number of the sequence of interest in a given sample. The presence of a higher level of amplification product when compared to the control indicates that the sequence has been amplified.

定量的増幅の方法は、当業者に公知である。例えば、定量的ＰＣＲでは、同じプライマーを使用して、既知量の制御配列を同時に増幅する。これにより内部標準が提供され、これは、ＰＣＲ反応を較正するのに使用することができる。定量的なＰＣＲのための詳細なプロトコルは、例えば、Ｉｎｎｉｓら（１９９０年）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ．に提供されている。ＥｒｂＢおよびＭＥＴ遺伝子についての核酸配列は既知であり、これらの遺伝子の任意の部分を増幅するのに使用することができるプライマーを、当業者が選択することを可能にするのに十分である。   Methods of quantitative amplification are known to those skilled in the art. For example, in quantitative PCR, the same primers are used to simultaneously amplify known amounts of control sequences. This provides an internal standard, which can be used to calibrate the PCR reaction. Detailed protocols for quantitative PCR are described, for example, in Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N. Y. Has been provided to. The nucleic acid sequences for the ErbB and MET genes are known and are sufficient to allow one skilled in the art to select primers that can be used to amplify any portion of these genes.

リアルタイムＰＣＲは、遺伝子コピーレベルまたはｍＲＮＡ発現のレベルを求めるために使用することができる別の増幅技法である（例えば、Ｇｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６巻：９９５〜１００１頁、１９９６年；Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６巻：９８６〜９９４頁、１９９６年を参照されたい）。リアルタイムＰＣＲは、増幅の間のＰＣＲ産物蓄積のレベルを評価する。この技法により、複数の試料におけるｍＲＮＡレベルの定量的評価が可能になる。遺伝子コピーレベルについては、全ゲノムＤＮＡが試料から単離される。ｍＲＮＡレベルについては、ｍＲＮＡが試料から抽出され、ｃＤＮＡが標準的な技法を使用して調製される。リアルタイムＰＣＲは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）７７００プリズム計測器を使用して実施することができる。マッチングプライマーおよび蛍光プローブは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって提供されるプライマーエクスプレスプログラムを使用して、対象とする遺伝子について設計することができる。プライマーおよびプローブの至適濃度は、当業者によって最初に求めることができ、対照（例えば、β−アクチン）プライマーおよびプローブは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から市販で入手することができる。試料中の対象とする特定の核酸の量を定量化するために、検量線が対照を使用して作成される。検量線は、リアルタイムＰＣＲで求められたＣｔ値を使用して作成することができ、これは、アッセイで使用される、対象とする核酸の初期濃度に関係する。対象とする遺伝子の１０〜１０６コピーの範囲の標準希釈は、一般に十分である。さらに、制御配列についての検量線が作成される。これにより、比較目的で、対照の量に対する、組織試料中の対象とする核酸の初期含量の標準化が可能になる。 Real-time PCR is another amplification technique that can be used to determine gene copy levels or levels of mRNA expression (eg, Gibson et al., Genome Research 6: 995-1001, 1996; Heid et al., Genome. Research 6: 986-994, 1996). Real-time PCR assesses the level of PCR product accumulation during amplification. This technique allows quantitative assessment of mRNA levels in multiple samples. For gene copy levels, total genomic DNA is isolated from the sample. For mRNA levels, mRNA is extracted from the sample and cDNA is prepared using standard techniques. Real-time PCR can be performed, for example, using a Perkin Elmer / Applied Biosystems (Foster City, Calif.) 7700 prism instrument. Matching primers and fluorescent probes can be designed for the gene of interest using, for example, the primer express program provided by Perkin Elmer / Applied Biosystems (Foster City, CA). Optimal concentrations of primers and probes can be initially determined by those skilled in the art, and control (eg, β-actin) primers and probes are obtained commercially, eg, from Perkin Elmer / Applied Biosystems (Foster City, Calif.). be able to. In order to quantify the amount of a particular nucleic acid of interest in a sample, a standard curve is generated using a control. A standard curve can be generated using Ct values determined by real-time PCR, which is related to the initial concentration of the nucleic acid of interest used in the assay. Standard dilutions in the range of 10 to 10 6 copies of the gene of interest are generally sufficient. In addition, a calibration curve for the control sequence is created. This allows the normalization of the initial content of the nucleic acid of interest in the tissue sample relative to the control amount for comparison purposes.

ＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用するリアルタイム定量的ＰＣＲの方法は、当技術分野で公知である。リアルタイム定量的ＰＣＲについての詳細なプロトコルは、例えば、ＲＮＡについては、Ｇｉｂｓｏｎら、１９９６年、Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１０巻：９９５〜１００１頁；およびＤＮＡについては、Ｈｅｉｄら、１９９６年、Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１０巻：９８６〜９９４頁に提供されている。ＴａｑＭａｎ（商標）に基づくアッセイは、５’蛍光色素および３’クエンチ剤を含む蛍光性オリゴヌクレオチドプローブを使用する。このプローブは、ＰＣＲ産物とハイブリダイズするが、３’末端の遮断剤のためにそれ自体で伸長することはできない。ＰＣＲ産物が引き続くサイクルで増幅されるとき、ポリメラーゼ、例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）の５’ヌクレアーゼ活性により、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブが切断される。この切断により、５’蛍光色素と３’クエンチ剤が分離され、それによって増幅の関数として蛍光が増大する（例えば、ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ．ｃｏｍのワールドワイドウェブを参照されたい）。   Real-time quantitative PCR methods using TaqMan ™ probes are known in the art. Detailed protocols for real-time quantitative PCR are described in, for example, Gibson et al., 1996, A novel method for real time quantitative RT-PCR for RNA. Genome Res. 10: 995-1001; and for DNA, see Heid et al., 1996, Real time quantitative PCR. Genome Res. 10: 986-994. The TaqMan ™ based assay uses a fluorescent oligonucleotide probe containing a 5 'fluorescent dye and a 3' quenching agent. This probe hybridizes with the PCR product but cannot extend by itself due to a blocking agent at the 3 'end. When the PCR product is amplified in subsequent cycles, the TaqMan ™ probe is cleaved by the 5 'nuclease activity of a polymerase, eg, AmpliTaq ™. This cleavage separates the 5 'fluorescent dye and the 3' quenching agent, thereby increasing fluorescence as a function of amplification (see, eg, the perkin-elmer.com world wide web).

ハイブリダイゼーションに基づくアッセイ
ハイブリダイゼーションアッセイも、遺伝子コピー数を検出するのに使用することができる。ハイブリダイゼーションに基づくアッセイには、それだけに限らないが、サザンブロットまたはインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）などの従来の「直接プローブ」法、および比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）などの「比較プローブ」法が含まれる。この方法は、それだけに限らないが、以下に説明するように、基質結合（例えば、膜またはガラス）法またはアレイに基づく手法を含めた、多種多様な形式で使用することができる。 Hybridization-based assays Hybridization assays can also be used to detect gene copy number. Hybridization-based assays include, but are not limited to, traditional “direct probe” methods such as Southern blot or in situ hybridization (eg, FISH), and “comparison probe” methods such as comparative genomic hybridization (CGH). included. This method can be used in a wide variety of formats including, but not limited to, substrate binding (eg, membrane or glass) methods or array-based approaches, as described below.

遺伝子コピー数を評価するための一方法は、サザンブロット法を伴う。サザンブロットを行うための方法は、当業者に既知である（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９章、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５年、またはＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９年を参照されたい）。そのようなアッセイでは、ゲノムＤＮＡ（一般に、電気泳動ゲル上で断片化および分離される）は、標的領域に特異的なプローブとハイブリダイズされる。標的領域についてのプローブからのハイブリダイゼーションシグナルの強度を、通常のゲノムＤＮＡ（例えば、同じまたは関連する細胞、組織、器官などの増幅されていない部分）の分析からの対照プローブシグナルと比較することにより、標的核酸の相対的なコピー数の推定値が提供される。対照より高い強度レベルは、配列が増幅されたことを示す。   One method for assessing gene copy number involves Southern blotting. Methods for performing Southern blots are known to those skilled in the art (Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, edited by Ausubel et al., Green Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1995, or Sambrok et al., Sambrook, et al. (Laboratory Manual, 2nd edition, 1-3, Cold Spring Harbor Press, NY, 1989). In such an assay, genomic DNA (generally fragmented and separated on an electrophoresis gel) is hybridized with a probe specific for the target region. By comparing the intensity of the hybridization signal from the probe for the target region with a control probe signal from analysis of normal genomic DNA (eg, unamplified portions of the same or related cells, tissues, organs, etc.) , An estimate of the relative copy number of the target nucleic acid is provided. A higher intensity level than the control indicates that the sequence was amplified.

蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）も、遺伝子のコピー数を求めるのに使用することができる。ＦＩＳＨは、当業者に既知である（Ａｎｇｅｒｅｒ、１９８７年 Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５２巻：６４９頁を参照されたい）。一般的なインサイチュハイブリダイゼーションアッセイでは、細胞または組織切片は、固体支持体、一般にガラススライドに固定される。核酸がプローブされる場合、細胞は、熱またはアルカリを用いて一般に変性される。次いで細胞を、適度な温度のハイブリダイゼーション溶液と接触させることによって、タンパク質をコードする核酸配列に特異的な標識プローブのアニーリングを可能にする。次いで標的（例えば、細胞）は、適切な信号対雑音比が得られるまで、所定のストリンジェンシーまたは漸増ストリンジェンシーで一般に洗浄される。そのような用途で使用されるプローブは、放射性同位体または蛍光レポーターで一般に標識される。好適なプローブは、ストリンジェントな条件下で、標的核酸（複数も）との特異的なハイブリダイゼーションを可能にするために、十分に長く、例えば、約５０、１００、または２００ヌクレオチド〜約１０００以上のヌクレオチドである。用途によっては、反復配列のハイブリダイゼーション能力を遮断することが必要である。したがって、いくつかの実施形態では、ｔＲＮＡ、ヒトゲノムＤＮＡ、またはＣｏｔ−１ ＤＮＡを使用することによって、非特異的なハイブリダイゼーションを遮断する。   Fluorescence in situ hybridization (FISH) can also be used to determine gene copy number. FISH is known to those skilled in the art (see Angeler, 1987 Meth. Enzymol., 152: 649). In a typical in situ hybridization assay, cells or tissue sections are fixed to a solid support, generally a glass slide. When nucleic acid is probed, cells are generally denatured using heat or alkali. The cells are then contacted with a moderate temperature hybridization solution to allow annealing of the labeled probe specific for the nucleic acid sequence encoding the protein. The target (eg, cell) is then generally washed with a predetermined or increasing stringency until an appropriate signal to noise ratio is obtained. Probes used in such applications are generally labeled with radioisotopes or fluorescent reporters. Suitable probes are long enough to allow specific hybridization with the target nucleic acid (s) under stringent conditions, for example from about 50, 100, or 200 nucleotides to about 1000 or more. Of nucleotides. In some applications it is necessary to block the hybridization capacity of repetitive sequences. Thus, in some embodiments, non-specific hybridization is blocked by using tRNA, human genomic DNA, or Cot-1 DNA.

比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）も、遺伝子コピー数を求めるのに使用することができる。比較ゲノムハイブリダイゼーション方法では、核酸の「試験」収集物（例えば、可能性がある腫瘍から）が、第１の標識で標識され、第２の収集物（例えば、正常細胞または正常組織から）が第２の標識で標識される。核酸のハイブリダイゼーションの比は、アレイ中で、それぞれファイバー（ｆｉｂｅｒ）に結合している第１および第２の標識の比によって求められる。例えば、試験収集物中の遺伝子増幅による、２つの標識からのシグナルの比の差が検出され、この比により、使用された特定のプローブに対応して、遺伝子コピー数の尺度が提供される。ＤＮＡコピー数変化の細胞遺伝学的な表示は、ＣＧＨによって生成することができ、これは、差次的に標識された試験ゲノムＤＮＡおよび基準ゲノムＤＮＡ由来の染色体の長さに沿った蛍光比を提供する。   Comparative genomic hybridization (CGH) can also be used to determine gene copy number. In comparative genomic hybridization methods, a “test” collection of nucleic acids (eg, from a potential tumor) is labeled with a first label and a second collection (eg, from normal cells or tissues) Labeled with a second label. The ratio of nucleic acid hybridization is determined by the ratio of the first and second labels bound to the fibers in the array, respectively. For example, a difference in the ratio of signals from two labels due to gene amplification in the test collection is detected, and this ratio provides a measure of gene copy number corresponding to the particular probe used. Cytogenetic representations of DNA copy number changes can be generated by CGH, which measures the fluorescence ratio along the length of chromosomes from differentially labeled test genomic DNA and reference genomic DNA. provide.

ＤＮＡコピー数は、マイクロアレイに基づくプラットフォームによっても分析することができる。様々なマイクロアレイ方法の詳細は、文献中に見出すことができる。例えば、米国特許第６，２３２，０６８号；Ｐｏｌｌａｃｋら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、２３巻（１号）：４１〜６頁、（１９９９年）、Ｐａｓｔｉｎｅｎ（１９９７年） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ７巻：６０６〜６１４頁；Ｊａｃｋｓｏｎ （１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４巻：１６８５頁；Ｃｈｅｅ（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４巻：６１０頁；ＷＯ９６／１７９５８、Ｐｉｎｋｅｌら、（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０巻：２０７〜２１１頁などを参照されたい。   DNA copy number can also be analyzed by a microarray-based platform. Details of various microarray methods can be found in the literature. See, e.g., U.S. Patent No. 6,232,068; Pollac et al., Nat. Genet. 23 (1): 41-6, (1999), Pastinen (1997) Genome Res. 7: 606-614; Jackson (1996) Nature Biotechnology 14: 1685; Chee (1995) Science 274: 610; WO 96/17958, Pinkel et al. (1998) Nature Genetics 20: Refer to page 211, etc.

アレイを調製するのに使用されるＤＮＡは、重要ではない。例えば、アレイは、ゲノムＤＮＡ、例えば、重複クローンを含むことができ、これは、所望の遺伝子を含むゲノムの一部、または遺伝子自体の高分解能走査を提供する。ゲノム核酸は、例えば、ＨＡＣ、ＭＡＣ、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＰＩ、コスミド、プラスミド、ゲノムクローンのＡｌｕ間（ｉｎｔｅｒ−Ａｌｕ）ＰＣＲ産物、ゲノムクローンの制限消化、ｃＤＮＡクローン、増幅（例えば、ＰＣＲ）産物などから得ることができる。アレイは、オリゴヌクレオチド合成技術を使用しても作製することができる。したがって、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、ならびにＰＣＴ特許公開第ＷＯ９０／１５０７０号および同第ＷＯ９２／１００９２号には、高密度オリゴヌクレオチドアレイの光指向コンビナトリアル合成の使用が教示されている。   The DNA used to prepare the array is not critical. For example, the array can include genomic DNA, eg, overlapping clones, which provide a high resolution scan of a portion of the genome containing the desired gene, or the gene itself. Genomic nucleic acid can be, for example, HAC, MAC, YAC, BAC, PAC, PI, cosmid, plasmid, inter-Alu PCR product of genomic clone, restriction digest of genomic clone, cDNA clone, amplification (eg, PCR) It can be obtained from products. Arrays can also be made using oligonucleotide synthesis techniques. Thus, for example, US Pat. No. 5,143,854 and PCT Patent Publication Nos. WO90 / 15070 and WO92 / 10092 teach the use of light-directed combinatorial synthesis of high-density oligonucleotide arrays. .

マイクロアレイ法ともに使用するのに適したハイブリダイゼーションプロトコルは、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ（１９８４年）ＥＭＢＯ Ｊ． ３巻：１２２７〜１２３４頁；Ｐｉｎｋｅｌ（１９８８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５巻：９１３８〜９１４２頁；ＥＰＯ公開第４３０，４０２号；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３３巻：Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｃｈｏｏ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．（１９９４年）、Ｐｉｎｋｅｌら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０巻：２０７〜２１１頁、またはＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ（１９９２年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９巻：５３２１〜５３２５頁（１９９２年）などに記載されている。   Hybridization protocols suitable for use with the microarray method are described, for example, in Albertson (1984) EMBO J. et al. 3: 1227-1234; Pinkel (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9138-9142; EPO Publication No. 430,402; Methods in Molecular Biology, 33: In Situ Hybridization Protocols, Choo Ed., Humana Press, Totowa, N .; J. et al. (1994), Pinkel et al. (1998) Nature Genetics 20: 207-211; or Kallioniemi (1992) Proc. Natl. Acad Sci USA 89: 5321-5325 (1992).

ハイブリダイゼーションアッセイの感受性は、検出される標的核酸を増殖させる核酸増幅系を使用することによって増強することができる。そのような系の例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）系およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）系が含まれる。最近当技術分野で記載された他の方法は、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡＯ、Ｃａｎｇｅｎｅ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）およびＱβレプリカーゼ系である。   The sensitivity of the hybridization assay can be enhanced by using a nucleic acid amplification system that propagates the target nucleic acid to be detected. Examples of such systems include the polymerase chain reaction (PCR) system and the ligase chain reaction (LCR) system. Other methods recently described in the art are nucleic acid sequence-based amplification (NASBAO, Cangene, Mississauga, Ontario) and the Qβ replicase system.

発現レベル
ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ活性化突然変異または遺伝子増幅の検出は、ＲＮＡ発現レベルおよびタンパク質発現レベルを含めた、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ発現レベルを分析することによっても検出することができる。ＲＮＡ発現レベルの分析は、１つもしくは複数の転写産物、例えば、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡなど、および／またはｍＲＮＡの１つもしくは複数のスプライス変異体の判定を伴うことができる。例えば、タンパク質、スプライスされたｍＲＮＡ変異体から生じるタンパク質変異体、および翻訳後に修飾されたタンパク質を含めた、様々なタンパク質産物も測定することによって、発現レベルを判定することができる。 Expression Levels Detection of ErbB and / or MET activating mutations or gene amplification can also be detected by analyzing ErbB and / or MET expression levels, including RNA expression levels and protein expression levels. Analysis of RNA expression levels can involve determination of one or more transcripts, eg, hnRNA, mRNA, etc. and / or one or more splice variants of mRNA. For example, expression levels can be determined by measuring various protein products, including proteins, protein variants resulting from spliced mRNA variants, and post-translationally modified proteins.

ＲＮＡ発現
ＲＮＡ産物の発現レベルを測定する任意の適当な手段を、本明細書に記載される方法に従って使用することができる。例えば、この方法は、例えば、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲ産物、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、または１つもしくは複数のＥｒｂＢおよび／もしくはＭＥＴ ＲＮＡ産物に特異的にハイブリダイズする、天然に存在する修飾ヌクレオチドの他の組合せを含めた、１つまたは複数のＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ ＲＮＡ産物に特異的にハイブリダイズする様々なポリヌクレオチドを利用することができる。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、アレイハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、ヌクレアーゼ保護およびノーザンブロットを含めた、本明細書にさらに記載される、ＲＮＡ発現を測定するための方法と組み合わせて使用することができる。 RNA expression Any suitable means of measuring the expression level of an RNA product can be used according to the methods described herein. For example, the method is naturally occurring, eg, specifically hybridizes to an oligonucleotide, cDNA, DNA, RNA, PCR product, synthetic DNA, synthetic RNA, or one or more ErbB and / or MET RNA products. Various polynucleotides that specifically hybridize to one or more ErbB and / or MET RNA products can be utilized, including other combinations of modified nucleotides. Such polynucleotides can be used in combination with the methods for measuring RNA expression further described herein, including, for example, array hybridization, RT-PCR, nuclease protection and Northern blots. it can.

ある特定の実施形態では、アレイハイブリダイゼーションを使用することによって、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ ＲＮＡ発現のレベルを評価することができる。アレイハイブリダイゼーションでは、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ ＲＮＡ発現産物とハイブリダイズすることができる、支持体に安定に付随した核酸メンバーが利用される。アレイに付着される核酸メンバーの長さは、８〜１０００ヌクレオチドの範囲とすることができ、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ ＲＮＡ産物に特異的であるように選択される。このアレイは、例えば、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、およびＭＥＴ、ならびに前述の任意のリガンド、例えば、ＥｒｂＢリガンド（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＡＲ、ＢＴＣ、ＨＢ−ＥＰＲ、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、またはＮＲＧ４）、またはＭＥＴリガンド（例えば、肝細胞成長因子（ＨＧＦ））を含めた、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴに特異的な１つもしくは複数の核酸メンバー、またはその変異体（例えば、スプライス変異体）を含むことができる。核酸メンバーは、一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡもしくはＤＮＡとすることができ、かつ／またはオリゴヌクレオチド、もしくはｃＤＮＡから増幅されたＰＣＲ断片とすることができる。オリゴヌクレオチドは、長さが約１０〜１００、１０〜５０、２０〜５０、または２０〜３０ヌクレオチドであることが好ましい。ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴの発現された領域の部分は、アレイ上でプローブとして利用することができる。より詳細には、ＥｒｂＢおよび／もしくはＭＥＴ遺伝子と相補性であるオリゴヌクレオチド、ならびにまたはＥｒｂＢおよび／もしくはＭＥＴ遺伝子に由来するｃＤＮＡは有用である。オリゴヌクレオチドベースのアレイについては、プローブとして有用である、対象とする遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドの選択は、当技術分野でよく理解されている。より詳細には、標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にする領域を選択することが重要である。オリゴヌクレオチドのＴｍ、ＧＣ含量率、二次構造の程度、および核酸の長さなどの要因は、重要な要因である。例えば、米国特許第６，５５１，７８４号を参照されたい。   In certain embodiments, the level of ErbB and / or MET RNA expression can be assessed by using array hybridization. Array hybridization utilizes nucleic acid members stably associated with the support that can hybridize with ErbB and / or MET RNA expression products. The length of the nucleic acid members attached to the array can range from 8 to 1000 nucleotides and is selected to be specific for ErbB and / or MET RNA products. This array can be, for example, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, and MET, and any of the aforementioned ligands, such as ErbB ligands (eg, EGF, TGFα, AR, BTC, HB-EPR, NRG1, NRG2, NRG3, or NRG4), or one or more nucleic acid members specific for ErbB and / or MET, including MET ligands (eg, hepatocyte growth factor (HGF)), or variants thereof (eg, splice variants) Can be included. Nucleic acid members can be single-stranded or double-stranded RNA or DNA and / or can be PCR fragments amplified from oligonucleotides or cDNA. Oligonucleotides are preferably about 10-100, 10-50, 20-50, or 20-30 nucleotides in length. A portion of the ErbB and / or MET expressed region can be utilized as a probe on the array. More particularly, oligonucleotides that are complementary to the ErbB and / or MET gene and / or cDNA derived from the ErbB and / or MET gene are useful. For oligonucleotide-based arrays, the selection of oligonucleotides corresponding to the gene of interest that are useful as probes is well understood in the art. More particularly, it is important to select a region that allows hybridization with the target nucleic acid. Factors such as oligonucleotide Tm, GC content, degree of secondary structure, and nucleic acid length are important factors. See, for example, US Pat. No. 6,551,784.

アレイは、特別に仕立てて構築するか、市販供給業者から購入することができる。アレイを構築するための様々な方法は、当技術分野で公知である。例えば、アレイフォーマットにおける、固体支持体上でのオリゴヌクレオチド合成に適用可能な方法および技法は、例えば、ＷＯ００／５８５１６、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，２４２，９７４号、同第５，２５２，７４３号、同第５，３２４，６３３号、同第５，３８４，２６１号、同第５，４０５，７８３号、同第５，４２４，１８６号、同第５，４５１，６８３号、同第５，４８２，８６７号、同第５，４９１，０７４号、同第５，５２７，６８１号、同第５，５５０，２１５号、同第５，５７１，６３９号、同第５，５７８，８３２号、同第５，５９３，８３９号、同第５，５９９，６９５号、同第５，６２４，７１１号、同第５，６３１，７３４号、同第５，７９５，７１６号、同第５，８３１，０７０号、同第５，８３７，８３２号、同第５，８５６，１０１号、同第５，８５８，６５９号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９６８，７４０号、同第５，９７４，１６４号、同第５，９８１，１８５号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，０３３，８６０号、同第６，０４０，１９３号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１３６，２６９号、同第６，２６９，８４６号、および同第６，４２８，７５２号、ならびにＺｈｏｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３２巻：５４０９〜５４１７頁（２００４年）に記載されている。   Arrays can be specially tailored and built or purchased from commercial suppliers. Various methods for constructing arrays are known in the art. For example, methods and techniques applicable to oligonucleotide synthesis on a solid support in an array format are described, for example, in WO 00/58516, US Pat. Nos. 5,143,854, 5,242,974, 5,252,743, 5,324,633, 5,384,261, 5,405,783, 5,424,186, 5,451 No. 683, No. 5,482,867, No. 5,491,074, No. 5,527,681, No. 5,550,215, No. 5,571,639, No. 5,578,832, 5,593,839, 5,599,695, 5,624,711, 5,631,734, 5,795,716 No. 5, No. 5,831,070, No. 5 No. 837,832, No. 5,856,101, No. 5,858,659, No. 5,936,324, No. 5,968,740, No. 5,974,164, 5,981,185, 5,981,956, 6,025,601, 6,033,860, 6,040,193, 6,090 , 555, 6,136,269, 6,269,846, and 6,428,752, and Zhou et al., Nucleic Acids Res. 32: 5409-5417 (2004).

例示的な実施形態では、構築および／または選択オリゴヌクレオチドは、マスクレスアレイシンセサイザー（ＭＡＳ）を使用して、固体支持体上で合成することができる。マスクレスアレイシンセサイザーは、例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／４２８１３号および対応する米国特許第６，３７５，９０３号に記載されている。アレイを構築するための他の方法として、例えば、マスクを利用する光指向法（例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，５１０，２７０号および同第５，５２７，６８１号に記載されているＶＬＳＩＰＳ（商標）法）、フローチャネル法（例えば、米国特許第５，３８４，２６１号を参照されたい）、スポッティング法（例えば、米国特許第５，８０７，５２２号を参照されたい）、ピンベース法（ｐｉｎ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ）（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号を参照されたい）、および複数の支持体を利用する方法（例えば、米国特許第５，７７０，３５８号、同第５，６３９，６０３号、および同第５，５４１，０６１号を参照されたい）が挙げられる。   In an exemplary embodiment, construction and / or selection oligonucleotides can be synthesized on a solid support using a maskless array synthesizer (MAS). Maskless array synthesizers are described, for example, in PCT application WO 99/42813 and corresponding US Pat. No. 6,375,903. Other methods for constructing arrays include, for example, light directing methods that utilize masks (eg, US Pat. Nos. 5,143,854, 5,510,270, and 5,527,681). VLSIPS (TM) method), flow channel method (see, eg, US Pat. No. 5,384,261), spotting method (see, eg, US Pat. No. 5,807,522). ), Pin-based methods (see, eg, US Pat. No. 5,288,514), and methods utilizing multiple supports (eg, US Pat. No. 5,770,358). No. 5,639,603, and 5,541,061).

ある特定の実施形態では、支持体の表面に安定に付随した核酸メンバーのアレイは、相補性の核酸メンバー／標的複合体のハイブリダイゼーションパターンを作製するのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸を含む試料と接触し、アレイ上の独特の位置における１つまたは複数の相補性の核酸メンバーは、標的核酸に特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイズする標的核酸の素性は、アレイ上の核酸メンバーの位置を参照して求めることができる。   In certain embodiments, an array of nucleic acid members that are stably associated with the surface of a support is a target nucleic acid under hybridization conditions sufficient to create a hybridization pattern of complementary nucleic acid member / target complexes. One or more complementary nucleic acid members at a unique location on the array that are in contact with the sample containing, specifically hybridize to the target nucleic acid. The identity of the target nucleic acid to be hybridized can be determined by referring to the position of the nucleic acid member on the array.

ゲノムＤＮＡに対応するオリゴヌクレオチドまたは核酸、ハウスキーピング遺伝子、ベクター配列、陰性および陽性対照遺伝子などを含む核酸メンバーを含めた対照核酸メンバーは、アレイ上に存在することができる。対照核酸メンバーは、較正または対照遺伝子であり、その機能は、対象とする特定の遺伝子が発現されるかどうかを伝えることではなく、むしろ発現のバックラウンドまたは基礎レベルなどの他の有用な情報を提供することである。   Control nucleic acid members can be present on the array, including nucleic acid members including oligonucleotides or nucleic acids corresponding to genomic DNA, housekeeping genes, vector sequences, negative and positive control genes, and the like. A control nucleic acid member is a calibration or control gene whose function is not to convey whether a particular gene of interest is expressed, but rather to provide other useful information such as expression background or basal levels. Is to provide.

アレイ上の他の対照核酸を、標的発現対照核酸およびミスマッチ対照ヌクレオチドとして使用することによって、プローブが向けられる標的以外の、試料中の核酸への非特異的結合またはクロスハイブリダイゼーションをモニターすることができる。したがって、ミスマッチプローブは、ハイブリダイゼーションが特異的であるか、特異的でないかを示す。例えば、標的が存在する場合、完全にマッチしたプローブは、ミスマッチしたプローブより常に鮮明であるはずである。さらに、すべての対照ミスマッチが存在する場合、ミスマッチプローブは、突然変異を検出するのに使用される。   Monitoring non-specific binding or cross-hybridization to nucleic acids in the sample other than the target to which the probe is directed by using other control nucleic acids on the array as target expression control nucleic acids and mismatch control nucleotides it can. Thus, the mismatch probe indicates whether the hybridization is specific or not specific. For example, in the presence of a target, a perfectly matched probe should always be sharper than a mismatched probe. Furthermore, if all control mismatches are present, a mismatch probe is used to detect the mutation.

本明細書に提供されるアレイは、アレイが使用されるアッセイ条件下、特にハイスループット取り扱い条件下で、上に存在する付随した核酸に対して物理的な支持体および構造を提供するのに十分な基質を含むことができる。   The arrays provided herein are sufficient to provide physical support and structure for the associated nucleic acid present thereon under the assay conditions in which the array is used, particularly under high throughput handling conditions. Various substrates can be included.

基質は、粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、管、球、ビーズ、容器、キャピラリー、詰め物、薄片、膜、プレート、スライド、チップなどとして存在する、生物学的、非生物学的、有機、無機、またはこれらの任意の組合せとすることができる。基質は、好都合な形状、例えば円盤、正方形、球、円などを有することができる。基質は、平ら、すなわち平面であることが好ましいが、様々な代替の表面構成を採用することができる。基質は、重合ラングミュアーブロジェット膜、官能化ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳＩＮ４、変性ケイ素、または多種多様なゲルもしくはポリマー、例えば、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネートなどの任意の１つ、またはこれらの組合せとすることができる。他の基質材料は、本開示を考慮して、当業者に容易に明らかとなるであろう。 Substrates exist as particles, chains, precipitates, gels, sheets, tubes, spheres, beads, containers, capillaries, fillings, flakes, membranes, plates, slides, chips, biological, non-biological, organic Can be inorganic, or any combination thereof. The substrate can have any convenient shape, such as a disk, square, sphere, circle, and the like. The substrate is preferably flat, i.e. planar, but various alternative surface configurations can be employed. The substrate can be a polymerized Langmuir Blodgett film, functionalized glass, Si, Ge, GaAs, GaP, SiO 2 , SIN 4 , modified silicon, or a wide variety of gels or polymers such as (poly) tetrafluoroethylene, (poly ) Any one of vinylidene difluoride, polystyrene, polycarbonate, etc., or a combination thereof. Other substrate materials will be readily apparent to those skilled in the art in view of the present disclosure.

ある特定の実施形態では、標的核酸試料は、生体試料から単離された、全ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対応する核酸試料（例えば、ｃＤＮＡ）を含むことができる。全ｍＲＮＡは、例えば、酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム抽出法を使用して、所与の試料から単離することができ、ｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡは、オリゴｄＴカラムクロマトグラフィーまたは（ｄＴ）ｎ磁気ビーズを使用して単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２版）、１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９８９年）、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ． Ａｕｓｕｂｅｌら編 Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７年）を参照されたい。ある特定の実施形態では、全ＲＮＡは、ＴＲｌｚｏｌ（商標）試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５５９６）を使用して抽出することができる。ＲＮＡの純度および完全性は、２６０／２８０ｎｍでの吸光度およびアガロースゲル電気泳動とその後の紫外光下での検査によって評価することができる。   In certain embodiments, the target nucleic acid sample can include total mRNA or a nucleic acid sample corresponding to mRNA (eg, cDNA) isolated from a biological sample. Total mRNA can be isolated from a given sample using, for example, the acid guanidinium-phenol-chloroform extraction method, and polyA + mRNA can be isolated using oligo dT column chromatography or (dT) n magnetic beads. (E.g., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition), 1-3 volumes, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989), or Current Protocols in Molecular Biolog. See Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987). In embodiments, total RNA can be extracted using TRlzol ™ reagent (GIBCO / BRL, Invitrogen Life Technologies, catalog number 15596) RNA purity and absorbance at 260/280 nm. And can be evaluated by agarose gel electrophoresis and subsequent inspection under ultraviolet light.

ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションの前に標的核酸試料を増幅することが望ましい場合がある。当業者は、いかなる増幅方法も使用され、定量的結果が望まれる場合、増幅核酸の相対度数について維持または制御する方法を使用するように注意しなければならないことを理解するであろう。定量的な増幅方法は、当業者に公知である。例えば、定量的ＰＣＲでは、同じプライマーを使用して、既知量の制御配列を同時に増幅する。これにより、ＰＣＲ反応を較正するのに使用することができる内部標準が提供される。したがって高密度アレイは、増幅核酸の定量化のための内部標準に特異的なプローブを含むことができる。定量的ＰＣＲについての詳細なプロトコルは、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓら、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ．、（１９９０年）に提供されている。   In certain embodiments, it may be desirable to amplify the target nucleic acid sample prior to hybridization. One skilled in the art will understand that any amplification method may be used and care should be taken to use methods that maintain or control the relative frequency of the amplified nucleic acid if quantitative results are desired. Quantitative amplification methods are known to those skilled in the art. For example, in quantitative PCR, the same primers are used to simultaneously amplify known amounts of control sequences. This provides an internal standard that can be used to calibrate the PCR reaction. Thus, a high density array can include probes specific to an internal standard for quantification of amplified nucleic acids. Detailed protocols for quantitative PCR are described in PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N. Y. (1990).

ある特定の実施形態では、標的核酸試料のｍＲＮＡは、逆転写酵素ならびにオリゴｄＴおよびファージＴ７プロモーターをコードする配列からなるプライマーで逆転写されることによって、一本鎖のＤＮＡ鋳型を提供する。第２のＤＮＡ鎖は、ＤＮＡポリメラーゼを使用して重合される。二本鎖のｃＤＮＡの合成の後、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが加えられ、ＲＮＡがｃＤＮＡ鋳型から転写される。それぞれ１つのｃＤＮＡ鋳型からの転写の連続的なラウンドにより、ＲＮＡが増幅される。インビトロ転写の方法は、当業者に公知であり（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい）、この特定の方法は、Ｖａｎ Ｇｅｌｄｅｒら、１９９０年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８７巻：１６６３〜１６６７頁に詳細に記載されており、この筆者らは、この方法によるインビトロ増幅により、様々なＲＮＡ転写物の相対度数が保存されることを実証している。さらに、Ｅｂｅｒｗｉｎｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９巻：３０１０〜３０１４頁は、インビトロ転写による２ラウンドの増幅を使用することによって、最初の出発材料の１０６倍を超える増幅を実現し、それによって生体試料が限られている場合でさえ発現をモニターすることを可能にするプロトコルを提供している。 In certain embodiments, the mRNA of the target nucleic acid sample is reverse transcribed with a reverse transcriptase and a primer consisting of sequences encoding oligo dT and phage T7 promoters to provide a single stranded DNA template. The second DNA strand is polymerized using a DNA polymerase. After synthesis of double stranded cDNA, T7 RNA polymerase is added and RNA is transcribed from the cDNA template. RNA is amplified by successive rounds of transcription from each one cDNA template. Methods of in vitro transcription are known to those skilled in the art (see, eg, Sambrook, supra), and this particular method is described in Van Gelder et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1663-1667, and the authors demonstrate that in vitro amplification by this method preserves the relative frequencies of various RNA transcripts. Furthermore, Eberwine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 vol: 3010-3014 page, by using the two rounds of amplification by in vitro transcription, to achieve amplification of greater than 10 6 times the initial starting material, whereby when the biological sample is limited Even protocols are provided that make it possible to monitor expression.

本明細書に記載される方法に従って使用するのに適した検出可能な標識には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物が含まれる。有用な標識として、標識ストレプトアビジンコンジュゲートを用いた染色のためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡで一般に使用される他のもの）、および熱量測定標識、例えば、コロイド金または色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、など）ビーズが挙げられる。そのような標識の使用を教示する特許には、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号が含まれる。 Detectable labels suitable for use in accordance with the methods described herein are detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, optical or chemical means Any composition is included. Useful labels include biotin for staining with labeled streptavidin conjugates, magnetic beads (eg, Dynabeads ™), fluorescent dyes (eg, fluorescein, Texas red, rhodamine, green fluorescent protein, etc.), radiolabels (Eg, 3 H, 125 I, 35 S, 14 C, or 32 P), enzymes (eg, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, and others commonly used in ELISA), and calorimetric labels, eg, Colloidal gold or colored glass or plastic (eg, polystyrene, polypropylene, latex, etc.) beads. Patents that teach the use of such labels include: US Pat. Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; and 4,366,241.

そのような標識の検出手段は、当業者に公知である。したがって、例えば、放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーは、光検出器を使用して発光を検出することによって検出することができる。酵素標識は、一般に、基質とともに酵素を提供し、その基質に対する酵素の作用によって生成した反応生成物を検出することによって検出され、熱量測定標識は、着色標識を単に可視化することによって検出される。   Such label detection means are known to those skilled in the art. Thus, for example, radiolabels can be detected using photographic film or scintillation counters, and fluorescent markers can be detected by detecting luminescence using a photodetector. Enzymatic labels are generally detected by providing an enzyme with the substrate and detecting the reaction product produced by the action of the enzyme on the substrate, and the calorimetric label is detected by simply visualizing the colored label.

標識は、当業者に公知の任意のいくつかの手段によって組み込むことができる。例えば、標識は、試料核酸の調製中に、増幅ステップの間に同時に組み込むことができる。したがって、例えば、標識プライマーまたは標識ヌクレオチドを含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標識増幅産物を提供することになる。さらに、標識ヌクレオチド（例えば、フルオレセイン標識ＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を使用した、上述したような転写増幅は、転写核酸中に標識を組み込む。   The label can be incorporated by any of several means known to those skilled in the art. For example, the label can be incorporated simultaneously during the amplification step during the preparation of the sample nucleic acid. Thus, for example, a polymerase chain reaction (PCR) comprising a labeled primer or a labeled nucleotide will provide a labeled amplification product. Furthermore, transcription amplification as described above using labeled nucleotides (eg, fluorescein labeled UTP and / or CTP) incorporates a label into the transcribed nucleic acid.

あるいは、標識は、最初の核酸試料（例えば、ｍＲＮＡ、ｐｏｌｙＡ ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、など）、または増幅が完了した後の増幅産物に直接添加することができる。核酸に標識を付ける手段は、当業者に公知であり、例えば、ニックトランスレーションまたは核酸のキナージング（ｋｉｎａｓｉｎｇ）による末端標識（例えば、標識ＲＮＡを用いて）、およびその後の試料核酸を標識（例えば、フルオロフォア）に結合する核酸リンカーの結合（連結）を含む。   Alternatively, the label can be added directly to the initial nucleic acid sample (eg, mRNA, polyA mRNA, cDNA, etc.) or the amplification product after amplification is complete. Means for labeling nucleic acids are known to those of skill in the art, for example, end labeling (eg, using labeled RNA) by nick translation or nucleic acid kinase, and subsequent labeling of the sample nucleic acid (eg, Including a linkage (linkage) of a nucleic acid linker that binds to the fluorophore.

ある特定の実施形態では、蛍光修飾は、シアニン色素、例えば、Ｃｙ−３／Ｃｙ−５ ｄＵＴＰ、Ｃｙ−３／Ｃｙ−５ ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、またはアレクサ色素によるものである（Ｋｈａｎら、１９９８年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８巻：５００９〜５０１３頁）。   In certain embodiments, the fluorescent modification is by a cyanine dye, such as Cy-3 / Cy-5 dUTP, Cy-3 / Cy-5 dCTP (Amersham Pharmacia), or Alexa dye (Khan et al., 1998). Year, Cancer Res. 58: 5009-5013).

ある特定の実施形態では、例えば、対象（例えば、癌または別の過剰増殖障害を有するか、これらを有するリスクのある対象）に由来する標的核酸試料、および対照核酸試料（例えば、健康な個体）を含めた、２つの標的核酸試料をアレイに同時にハイブリダイズすることが望ましい場合がある。さらなる実施形態では、一方の標的核酸試料は、対象の腫瘍または他の癌性成長から得ることができ、第２の標的核酸試料は、同じ対象由来の健康な生体物質から得ることができる。比較のために使用される２つの標的試料は、区別可能な検出シグナルを生成する異なる蛍光色素で標識され、例えば、対照試料由来の標的は、Ｃｙ５で標識され、モニターまたは診断される対象由来の標的は、Ｃｙ３で標識される。異なって標識された標的試料は、同じマイクロアレイに同時にハイブリダイズされる。標識された標的は、当技術分野で既知の方法を使用して、例えば、エタノール精製またはカラム精製によって精製することができる。   In certain embodiments, for example, a target nucleic acid sample from a subject (eg, a subject having or at risk of having cancer or another hyperproliferative disorder), and a control nucleic acid sample (eg, a healthy individual) It may be desirable to hybridize two target nucleic acid samples to the array simultaneously, including In further embodiments, one target nucleic acid sample can be obtained from a subject's tumor or other cancerous growth and a second target nucleic acid sample can be obtained from healthy biological material from the same subject. The two target samples used for comparison are labeled with different fluorescent dyes that produce a distinguishable detection signal, eg, a target from a control sample is labeled with Cy5 from a subject to be monitored or diagnosed The target is labeled with Cy3. Differently labeled target samples are simultaneously hybridized to the same microarray. The labeled target can be purified using methods known in the art, for example, by ethanol purification or column purification.

ある特定の実施形態では、標的核酸試料は、マイクロアレイから生じるシグナルを標準化するために、マイクロアレイ上の対照プローブとハイブリダイズする、１つまたは複数の対照分子を含む。標識された標準化標的は、例えば、上述したマイクロアレイ上にスポットされる対照オリゴヌクレオチドと完全に相補性である核酸配列とすることができる。ハイブリダイゼーション後に標準化対照から得たシグナルは、ハイブリダイゼーション条件、標識強度、読み効率（ｒｅａｄｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）および完全なハイブリダイゼーションのシグナルをアレイ間で変化させる場合のある他の要因の変化についての対照を提供する。アレイ中のすべての他のプローブから読まれるシグナル（例えば、蛍光強度）は、対照プローブからのシグナル（例えば、蛍光強度）によって除し、それによって測定値を標準化することができる。   In certain embodiments, the target nucleic acid sample includes one or more control molecules that hybridize with a control probe on the microarray to normalize the signal originating from the microarray. The labeled normalized target can be, for example, a nucleic acid sequence that is completely complementary to a control oligonucleotide spotted on the microarray described above. The signal obtained from the standardized control after hybridization provides a control for changes in hybridization conditions, label intensity, reading efficiency and other factors that may change the signal of complete hybridization between arrays. To do. The signal read from all other probes in the array (eg, fluorescence intensity) can be divided by the signal from the control probe (eg, fluorescence intensity), thereby normalizing the measurement.

標準化標的は、試料中に存在する他の標的の平均長を反映するように選択することができ、これらは、様々な長さを網羅するように選択することができる。標準化対照（複数も）も、アレイ中の他のプローブの（平均）塩基組成を反映するように選択することができる。ある特定の実施形態では、１つまたは数個のみの標準化プローブが使用され、これらは、満足にハイブリダイズし（すなわち、二次構造を全く有さず、自己ハイブリダイズしない）、任意の標的分子とマッチしないように選択される。標準化プローブは、アレイ中の任意の位置またはアレイ全体にわたって複数の位置で局在化することによって、ハイブリダイゼーション効率の空間的変化を制御することができる。例えば、標準化対照は、アレイの隅角部または縁部ならびに中間部に位置することができる。   Normalized targets can be selected to reflect the average length of other targets present in the sample, and these can be selected to cover a variety of lengths. The normalization control (s) can also be selected to reflect the (average) base composition of the other probes in the array. In certain embodiments, only one or a few standardized probes are used, which hybridize satisfactorily (ie, have no secondary structure and do not self-hybridize) and any target molecule Is selected so as not to match. Standardized probes can control spatial variations in hybridization efficiency by localizing at any location in the array or multiple locations throughout the array. For example, normalization controls can be located at the corners or edges as well as the middle of the array.

核酸のアレイへのハイブリダイゼーションでは、プローブまたは標的核酸メンバーおよびその相補性の標的が、相補性の塩基対合を通じて安定なハイブリッド二本鎖を形成することができる条件下で、アレイ上の変性プローブまたは標的核酸メンバーおよび標的核酸試料をインキュベートする。次いでハイブリッド二本鎖を形成しない核酸は、一般に、付けられた検出可能な標識の検出によって検出されるハイブリダイズした核酸を残して洗い流される。核酸は、温度を上昇させ、または核酸を含む緩衝液の塩濃度を減少させることによって変性されることが一般に認識されている。低いストリンジェンシー条件下で（例えば、低温および／または高濃度の塩）、アニールされた配列が完全に相補性でない場合でも、ハイブリッド二本鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、またはＲＮＡ：ＤＮＡ）は形成する。したがって、ハイブリダイゼーションの特異性は、より低いストリンジェンシーで低減される。逆に、より高いストリンジェンシー（例えば、高温またはより低濃度の塩）では、順調なハイブリダイゼーションには、ミスマッチがより少ないことが要求される。ハイブリダイゼーション条件を至適化する方法は、当業者に公知である（例えば、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４巻：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｐ． Ｔｉｊｓｓｅｎ編 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９９３年）を参照されたい）。   For hybridization of nucleic acids to an array, a degenerate probe on the array under conditions that allow the probe or target nucleic acid member and its complementary target to form a stable hybrid duplex through complementary base pairing. Alternatively, the target nucleic acid member and the target nucleic acid sample are incubated. The nucleic acid that does not form a hybrid duplex is then generally washed away leaving the hybridized nucleic acid detected by detection of the attached detectable label. It is generally recognized that nucleic acids are denatured by increasing the temperature or decreasing the salt concentration of the buffer containing the nucleic acid. Under low stringency conditions (eg, low temperature and / or high salt concentration), hybrid duplexes (eg, DNA: DNA, RNA: RNA, or RNA: even if the annealed sequences are not perfectly complementary) DNA) forms. Thus, the specificity of hybridization is reduced with lower stringency. Conversely, at higher stringency (eg, high temperature or lower salt concentrations), successful hybridization requires fewer mismatches. Methods for optimizing hybridization conditions are known to those of skill in the art (see, eg, Laboratory Technologies in Biochemistry and Molecular Biology, 24: Hybridization With Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, P. Tijssen. See year)).

ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズされていない標識された、または標識されていない核酸は、洗浄によって支持体表面から除去され、それによって基質表面上にハイブリダイズした標識核酸のパターンが生成する。様々な洗浄液が、当業者に知られており、使用することができる。標識され、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドおよび／または核酸の得られたハイブリダイゼーションパターンは、様々方法で可視化または検出することができ、検出の特定の様式は、標的核酸試料の特定の標識に基づいて選択され、代表的な検出手段には、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、蛍光測定、熱量測定の測定、発光測定などが含まれる。   After hybridization, unhybridized labeled or unlabeled nucleic acid is removed from the support surface by washing, thereby producing a pattern of hybridized labeled nucleic acid on the substrate surface. Various cleaning solutions are known to those skilled in the art and can be used. The resulting hybridization pattern of labeled and hybridized oligonucleotides and / or nucleic acids can be visualized or detected in a variety of ways, and the particular mode of detection is selected based on the particular label of the target nucleic acid sample. Typical detection means include scintillation counting, autoradiography, fluorescence measurement, calorimetric measurement, luminescence measurement, and the like.

ハイブリダイゼーション、洗浄ステップおよび／または引き続く処理の後、得られたハイブリダイゼーションパターンは検出される。ハイブリダイゼーションパターンを検出、または可視化することにおいて、標識の強度またはシグナル値は、検出されるだけでなく、定量化され、例えば、ハイブリダイズしたアレイ上の各スポットからのシグナルは測定され、既知数の末端標識標的核酸によって発せられるシグナルに対応する単位値と比較されることによって、ハイブリダイゼーションパターン中のアレイ上の特定のスポットにハイブリダイズした、各末端標識標的のコピー数のカウントまたは絶対値を得る。   After hybridization, washing steps and / or subsequent processing, the resulting hybridization pattern is detected. In detecting or visualizing the hybridization pattern, the intensity or signal value of the label is not only detected, but also quantified, for example, the signal from each spot on the hybridized array is measured and a known number The copy number count or absolute value of each end-labeled target hybridized to a specific spot on the array in the hybridization pattern is compared with the unit value corresponding to the signal emitted by the end-labeled target nucleic acid. obtain.

アレイハイブリダイゼーションから収集したデータを分析するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、ハイブリダイゼーションの検出が蛍光標識を伴う場合、データ分析は、収集したデータから、基質の位置の関数として蛍光強度を求めるステップ、異常値、すなわち、所定の統計的分布から逸脱しているデータを除去するステップ、および残りのデータから、試験核酸の相対的結合親和性を計算するステップを含むことができる。得られたデータは、付随したオリゴヌクレオチドおよび／または核酸と試験核酸の間の結合親和性によって変化する、各領域での強度を含む画像として表示される。   Methods for analyzing data collected from array hybridization are known in the art. For example, if the detection of hybridization involves a fluorescent label, data analysis involves determining fluorescence intensity as a function of substrate position from the collected data, outliers, ie data deviating from a predetermined statistical distribution And calculating the relative binding affinity of the test nucleic acid from the remaining data. The resulting data is displayed as an image containing the intensity in each region, which varies with the associated oligonucleotide and / or the binding affinity between the nucleic acid and the test nucleic acid.

ある特定の実施形態では、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ ＲＮＡ産物の発現レベルは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と組み合わせた逆転写（ＲＴ）を使用して、試料に由来するＲＮＡ産物を増幅することによって測定することができる。ある特定の実施形態では、当業者に理解されるように、ＲＴは定量的とすることができる。   In certain embodiments, the expression level of ErbB and / or MET RNA product is measured by amplifying the RNA product from the sample using reverse transcription (RT) in combination with polymerase chain reaction (PCR). can do. In certain embodiments, RT can be quantitative, as will be appreciated by those skilled in the art.

試料に由来する全ＲＮＡ、またはｍＲＮＡは、鋳型として使用することができ、ＲＴＫの転写部分に特異的なプライマーは、逆転写を開始するのに使用される。ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡにする方法は公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年の上記に記載されている。プライマー設計は、市販のソフトウェア（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ １．０、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅなど）または標準的で当技術分野で公知である方法を利用して実現することができる。プライマーの設計および選択を支援するのに使用することができるプライマーソフトウェアプログラムには、例えば、Ｔｈｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｑｕｅｓｔソフトウェアが含まれ、これは、以下のウェブサイトリンクを通じて入手可能である：ｂｉｏｔｏｏｌｓ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｐｒｉｍｅｒｑｕｅｓｔ／。さらに、ＲＴＫのプライマー設計において使用するために、ヒトゲノムデータベースから配列情報を検索し、更新する場合、以下のウェブサイトリンクが有用であり：ｌ） ｔｈｅ ＮＣＢＩ ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ Ｈｏｍｅｐａｇｅ： ｎｃｂｉ．ｎｌｒｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ／のワールドワイドウェブ、および２） Ｅｎｓｅｍｂｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ：ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓのワールドワイドウェブ、適切なＲＴＫ情報、例えば、遺伝子または配列の記述、アクセションまたは配列ＩＤ、遺伝子記号、ＲｅｆＳｅｑ ＃、および／またはＵｎｉＧｅｎｅ ＃などを使用することが好ましい。   Total RNA, or mRNA, derived from the sample can be used as a template, and a primer specific for the transcription portion of RTK is used to initiate reverse transcription. Methods for reverse transcribing RNA into cDNA are known and are described, for example, in Sambrook et al., 1989, supra. Primer design can be achieved using commercially available software (eg, Primer Designer 1.0, Scientific Software, etc.) or standard and methods known in the art. Primer software programs that can be used to assist in primer design and selection include, for example, The Primer Quest software, which is available through the following website link: biotools. idtdna. com / primerquest /. In addition, the following website links are useful when retrieving and updating sequence information from the human genome database for use in RTK primer design: l) the NCBI LocusLink Homepage: ncbi. nlrm. nih. gov / LocusLink / World Wide Web and 2) Ensemble Human Genome Browser: ensembl. It is preferred to use the world wide web of org / Homo_sapiens, appropriate RTK information, such as a gene or sequence description, accession or sequence ID, gene symbol, RefSeq #, and / or UniGene #.

本明細書に記載される方法に従って使用することができるプライマーを設計するための一般的な指針には、以下のことが含まれる。産物または単位複製配列の長さは、約１００〜１５０塩基とすることができ、至適Ｔｍは、約６０℃、または約５８〜６２℃とすることができ、ＧＣ含量は、約５０％、または約４５〜５５％とすることができる。さらに、１つまたは複数の以下のものなどのある特定の配列を回避することが望ましい場合がある：（ｉ）同じプライマーの別の部分、またはプライマー−二量体形成を低減するための別のプライマーと相補性であるそれぞれのプライマーの３’末端での３つ以上の塩基のストリング（ｉｉ）別のプライマー配列と相補性であるプライマー内の配列、（ｉｉｉ）３’末端での３つ以上のＧまたはＣの連続、（ｉｖ）３塩基を超える単一塩基の繰り返し（ｖ）Ｇ／Ｇ−およびＡ／Ｔリッチドメインの不均衡な分布、ならびに／または（ｖｉ）３’末端でのＴ。   General guidelines for designing primers that can be used in accordance with the methods described herein include the following. The length of the product or amplicon can be about 100-150 bases, the optimal Tm can be about 60 ° C., or about 58-62 ° C., and the GC content can be about 50%, Or about 45-55%. In addition, it may be desirable to avoid certain sequences such as one or more of the following: (i) another part of the same primer, or another to reduce primer-dimer formation A string of three or more bases at the 3 ′ end of each primer that is complementary to the primer (ii) a sequence within the primer that is complementary to another primer sequence, (iii) three or more at the 3 ′ end (Iv) a single base repeat of more than 3 bases (v) an unbalanced distribution of G / G- and A / T rich domains and / or (vi) a T at the 3 ′ end .

逆転写の産物は、ＰＣＲのための鋳型として引き続いて使用される。ＰＣＲは、熱安定性の、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される、複数のサイクルのＤＮＡ複製を使用することにより、対象とする標的配列を増幅することによって、特定の核酸配列を急速に増幅するための方法を提供する。ＰＣＲは、増幅される核酸、増幅される配列に隣接する２つの一本鎖のオリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、緩衝液および塩の存在が必要である。ＰＣＲの方法は、当技術分野で公知である。ＰＣＲは、Ｍｕｌｌｉｓ ａｎｄ Ｆａｌｏｏｎａ、１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５５巻：３３５頁に記載されているように実施される。   The product of reverse transcription is subsequently used as a template for PCR. PCR rapidly amplifies a specific nucleic acid sequence by amplifying a target sequence of interest by using multiple cycles of DNA replication catalyzed by a thermostable, DNA-dependent DNA polymerase. Providing a method for PCR requires the presence of the nucleic acid to be amplified, two single stranded oligonucleotide primers adjacent to the amplified sequence, DNA polymerase, deoxyribonucleoside triphosphate, buffer and salt. PCR methods are known in the art. PCR is described in Mullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol. 155: 335.

本質的に定量的であるＱＲＴ−ＰＣＲを実施することによっても、ＲＴＫ遺伝子発現レベルの定量的尺度を提供することができる。ＱＲＴ−ＰＣＲでは、逆転写およびＰＣＲは、２ステップで実施することができ、またはＰＣＲと組み合わせた逆転写は、同時に実施することができる。ＴａｑＭａｎ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）などの市販のキットが存在する、これらの技法の１つは、転写物特異的なアンチセンスプローブを用いて実施される。このプローブは、ＰＣＲ産物（例えば、遺伝子に由来する核酸断片）に特異的であり、クエンチャーおよびオリゴヌクレオチドの５’末端と複合体形成した蛍光レポータープローブを用いて調製される。異なる蛍光マーカーが異なるレポーターに付けられ、１つの反応で２つの産物の測定を可能にしている。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが活性化されると、これは、５’−〜−３’エキソヌクレアーゼ活性によって、鋳型に結合したプローブの蛍光レポーターを切断する。クエンチャーの非存在下で、レポーターはすぐに蛍光を発する。レポーターの色変化は、それぞれ特異的な産物の量に比例し、蛍光光度計によって測定される。したがって各色の量が測定され、ＰＣＲ産物が定量化される。ＰＣＲ反応は、９６ウェルプレート中で実施され、その結果、多くの個体に由来する試料が同時に処理され、測定される。ＴａｑＭａｎ（商標）系は、ゲル電気泳動を必要としないという追加の利点を有し、検量線とともに使用される場合、定量化を可能にする。   Performing QRT-PCR that is quantitative in nature can also provide a quantitative measure of RTK gene expression levels. In QRT-PCR, reverse transcription and PCR can be performed in two steps, or reverse transcription combined with PCR can be performed simultaneously. One of these techniques, where there are commercially available kits such as TaqMan ™ (Perkin Elmer, Foster City, Calif.), Is performed using transcript-specific antisense probes. This probe is specific for PCR products (eg, nucleic acid fragments derived from genes) and is prepared using a fluorescent reporter probe complexed with a quencher and the 5 'end of the oligonucleotide. Different fluorescent markers are attached to different reporters, allowing measurement of two products in one reaction. When Taq DNA polymerase is activated, it cleaves the fluorescent reporter of the probe bound to the template by 5'- to -3 'exonuclease activity. In the absence of a quencher, the reporter immediately fluoresces. The color change of the reporter is proportional to the amount of each specific product and is measured by a fluorimeter. Thus, the amount of each color is measured and the PCR product is quantified. PCR reactions are performed in 96 well plates, so that samples from many individuals are processed and measured simultaneously. The TaqMan ™ system has the additional advantage of not requiring gel electrophoresis and allows quantification when used with a calibration curve.

ＰＣＲ産物を定量的に検出するのに有用な第２の技法は、市販のＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ Ｃａｌｉｆ．）などの挿入色素を使用することである。ＲＴ−ＰＣＲは、蛍光標識としてＳＹＢＲグリーンを使用して実施され、これは、ＰＣＲ段階の間にＰＣＲ産物中に組み込まれ、ＰＣＲ産物の量に比例した蛍光を生成する。さらに、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ（商標）を含めた、ｍＲＮＡ発現産物を定量的に測定するための他の系が知られている。   A second technique useful for quantitative detection of PCR products is to use an intercalating dye such as the commercially available QuantiTect SYBR Green PCR (Qiagen, Valencia Calif.). RT-PCR is performed using SYBR green as a fluorescent label, which is incorporated into the PCR product during the PCR step, producing fluorescence proportional to the amount of PCR product. In addition, other systems for quantitatively measuring mRNA expression products are known, including Molecular Beacons ™.

ＲＮＡ発現を定量的に測定するための追加の技法には、それだけに限らないが、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、Ｑβレプリカーゼ（例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０号を参照されたい）、等温増幅法（例えば、Ｗａｌｋｅｒら（１９９２年）ＰＮＡＳ ８９巻：３８２〜３９６号を参照されたい）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、修復連鎖反応、非対称定量的ＰＣＲ（例えば、米国特許公開第ＵＳ２００３３０１３４３０７Ａ１号を参照されたい）、およびＦｕｊａら、２００４年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０８巻：１９３〜２０５頁に記載されている多重化ミクロスフェアビーズアッセイが含まれる。   Additional techniques for quantitatively measuring RNA expression include, but are not limited to, polymerase chain reaction, ligase chain reaction, Qβ replicase (see, eg, International Application No. PCT / US87 / 00880), isothermal. Amplification methods (see, eg, Walker et al. (1992) PNAS 89: 382-396), strand displacement amplification (SDA), repair chain reaction, asymmetric quantitative PCR (see, eg, US Patent Publication No. US2003330134307A1). And the multiplexed microsphere bead assay described in Fuja et al., 2004, Journal of Biotechnology 108: 193-205.

遺伝子発現のレベルは、核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲを含めた、転写ベース増幅系（ＴＡＳ）を使用して、試料由来のＲＮＡを増幅することによって測定することができる。例えば、Ｋｗｏｈら（１９８９年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６巻：１１７３頁；国際公開第ＷＯ８８／１０３１５号；および米国特許第６，３２９，１７９号を参照されたい。ＮＡＳＢＡでは、増幅のための核酸は、従来のフェノール／クロロホルム抽出、熱変性、溶解緩衝液を用いた処理、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの単離のためのミニスピンカラム、またはＲＮＡの塩化グアニジニウム抽出を使用して調製することができる。これらの増幅技法では、標的特異的配列を有するプライマーをアニーリングする。重合の後、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、ＲＮａｓｅ Ｈで消化され、一方二本鎖ＤＮＡ分子は、再び熱変性される。いずれの場合でも、一本鎖のＤＮＡは、第２の標的特異的プライマーを添加し、その後に重合することによって、完全に二本鎖にされる。次いで二本鎖ＤＮＡ分子は、Ｔ７またはＳＰ６などのポリメラーゼによって多数回転写される。等温サイクル反応（ｃｙｃｌｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ）では、ＲＮＡは、逆転写されて二本鎖ＤＮＡになり、Ｔ７またはＳＰ６などのポリメラーゼで一度転写される。得られた産物は、切断されていても、完全であっても、標的特異的配列を示す。   The level of gene expression can be measured by amplifying RNA from the sample using a transcription-based amplification system (TAS), including nucleic acid sequence amplification (NASBA) and 3SR. See, for example, Kwoh et al. (1989) PNAS USA 86: 1173; International Publication No. WO 88/10315; and US Pat. No. 6,329,179. In NASBA, nucleic acids for amplification use conventional phenol / chloroform extraction, heat denaturation, treatment with lysis buffer, and mini-spin columns for DNA and RNA isolation, or guanidinium chloride extraction of RNA. Can be prepared. In these amplification techniques, a primer having a target specific sequence is annealed. After polymerization, the DNA / RNA hybrid is digested with RNase H, while double stranded DNA molecules are heat denatured again. In either case, the single stranded DNA is made fully double stranded by adding a second target specific primer followed by polymerization. The double stranded DNA molecule is then transcribed multiple times by a polymerase such as T7 or SP6. In a cyclic reaction, RNA is reverse transcribed into double stranded DNA, which is transcribed once with a polymerase such as T7 or SP6. The resulting product, whether cleaved or complete, exhibits a target specific sequence.

増幅産物を分離するのに、いくつかの技法を使用することができる。例えば、増幅産物は、従来方法を使用して、アガロース、アガロース−アクリルアミドまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年を参照されたい。電気泳動を用いることなく、ＰＣＲ産物を定量的に検出するためのいくつかの技法も使用することができる（例えば、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓら、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ．、（１９９０年））を参照されたい。例えば、クロマトグラフィー技法を使用することによって、分離を行うことができる。使用することができる多くの種類のクロマトグラフィー、すなわち、吸着、分配、イオン交換および分子篩、ＨＰＬＣが存在し、カラム、ペーパー、薄層、ガスクロマトグラフィーを含めた、これらを使用するための多くの特殊化された技法が存在する（Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ、Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２版、Ｗｍ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８２年）。   Several techniques can be used to separate the amplification products. For example, amplification products can be separated by agarose, agarose-acrylamide or polyacrylamide gel electrophoresis using conventional methods. See Sambrook et al., 1989. Several techniques can also be used to quantitatively detect PCR products without using electrophoresis (see, eg, PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N.). Y., (1990)). For example, the separation can be performed by using chromatographic techniques. There are many types of chromatography that can be used, i.e. adsorption, partitioning, ion exchange and molecular sieve, HPLC, many for using these, including column, paper, thin layer, gas chromatography There are specialized techniques (Freifelder, Physical Biochemistry Applications to Biochemistry and Molecular Biology, 2nd edition, Wm. Freeman and Co., New York, 1982).

対象とする核酸配列の増幅を確認するために、増幅産物は可視化されなければならない。１つの一般的な可視化方法では、臭化エチジウムを用いてゲルを染色し、ＵＶ光下で可視化する。あるいは、増幅産物が、放射測定的または蛍光定量的に標識されたヌクレオチドで一体的に標識されている場合、増幅産物は、分離した後に、Ｘ線フィルムに曝露するか、適切な刺激スペクトル下で可視化することができる。   In order to confirm amplification of the nucleic acid sequence of interest, the amplification product must be visualized. In one common visualization method, the gel is stained with ethidium bromide and visualized under UV light. Alternatively, if the amplification product is integrally labeled with radiometrically or fluorometrically labeled nucleotides, the amplification product can be exposed to X-ray film after separation or under an appropriate stimulation spectrum. Can be visualized.

あるいは、可視化は、間接的に実現することができる。増幅産物を分離した後、標識された核酸プローブは、対象とする増幅核酸配列と接触させる。プローブは、発色団と結合し、放射標識し、または抗体もしくはビオチンなどの結合パートナーと結合することができ、結合対の他のメンバーは検出可能部分を担持する。   Alternatively, visualization can be realized indirectly. After separating the amplification products, the labeled nucleic acid probe is brought into contact with the amplified nucleic acid sequence of interest. The probe can be bound to a chromophore, radiolabeled, or bound to a binding partner such as an antibody or biotin, with the other member of the binding pair carrying a detectable moiety.

さらに、検出は、サザンブロット法および標識プローブとのハイブリダイゼーションを使用して実施することができる。サザンブロット法が関与する技法は、当業者に公知であり、分子プロトコルについての多くの標準的な書籍において見出すことができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、上記を参照されたい。簡単に言えば、増幅産物は、ゲル電気泳動によって分離される。次いでゲルは、ニトロセルロースなどの膜と接触し、核酸の移動および非共有結合が可能になる。引き続いて、この膜は、標的増幅産物とハイブリダイズすることができる、発色団結合プローブとともにインキュベートされる。検出は、膜のＸ線フィルムへの曝露またはイオン放出検出デバイスによる。   Furthermore, detection can be performed using Southern blotting and hybridization with labeled probes. Techniques involving Southern blotting are known to those skilled in the art and can be found in many standard books on molecular protocols. See Sambrook et al., 1989, supra. Briefly, amplification products are separated by gel electrophoresis. The gel is then contacted with a membrane such as nitrocellulose, allowing nucleic acid transfer and non-covalent binding. Subsequently, the membrane is incubated with a chromophore-binding probe that can hybridize with the target amplification product. Detection is by exposure of the membrane to an X-ray film or an ion emission detection device.

ある特定の実施形態では、核酸分解酵素保護アッセイ（リボヌクレアーゼ保護アッセイおよびＳｉヌクレアーゼアッセイの両方を含めて）を使用することによって、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ ＲＮＡ産物を検出し、定量化することができる。核酸分解酵素保護アッセイでは、アンチセンスプローブ（例えば、放射標識されたか、非同位体標識された）は、ＲＮＡ試料と溶液中でハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの後、一本鎖の、ハイブリダイズしていないプローブおよびＲＮＡは、ヌクレアーゼによって分解される。残りの保護された断片を分離するために、アクリルアミドゲルが使用される。一般に、溶液ハイブリダイゼーションは、最大約１００μｇの試料ＲＮＡに適応することができるが、ブロットハイブリダイゼーションは、約２０〜３０μｇのＲＮＡ試料しか適応することができない。   In certain embodiments, ErbB and / or MET RNA products can be detected and quantified by using nucleolytic enzyme protection assays (including both ribonuclease protection assays and Si nuclease assays). In a nucleolytic enzyme protection assay, an antisense probe (eg, radiolabeled or non-isotopically labeled) hybridizes in solution with an RNA sample. Following hybridization, single-stranded, unhybridized probe and RNA are degraded by nucleases. An acrylamide gel is used to separate the remaining protected fragments. In general, solution hybridization can accommodate up to about 100 μg of sample RNA, whereas blot hybridization can only accommodate about 20-30 μg of RNA sample.

最も一般的な種類の核酸分解酵素保護アッセイであるリボヌクレアーゼ保護アッセイは、ＲＮＡプローブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチドおよび他の一本鎖ＤＮＡプローブは、Ｓ１ヌクレアーゼを含むアッセイにおいてのみ使用することができる。一本鎖の、アンチセンスプローブは、一般に、ヌクレアーゼによるプローブ：標的ハイブリッドの切断を防止するために、標的ＲＮＡと完全に相同性でなければならない。   The most common type of nucleolytic enzyme protection assay, the ribonuclease protection assay, requires the use of RNA probes. Oligonucleotides and other single stranded DNA probes can only be used in assays involving S1 nuclease. Single-stranded, antisense probes generally must be completely homologous to the target RNA to prevent cleavage of the probe: target hybrid by nucleases.

ある特定の実施形態では、ノーザンブロットアッセイを使用することによって、ＲＮＡ転写物のサイズを確認し、選択的にスプライスされたＲＮＡ転写物、ならびにＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ遺伝子のＲＮＡ産物の相対量を特定することができる。ノーザンブロットでは、ＲＮＡ試料は、変性条件下のアガロースゲル中の電気泳動により、サイズによって最初に分離される。次いでＲＮＡは、膜に移され、架橋され、標識プローブとハイブリダイズされる。ランダムに初回刺激された（ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅｄ）、ニックトランスレートされた、またはＰＣＲで生成したＤＮＡプローブ、インビトロで転写されたＲＮＡプローブ、およびオリゴヌクレオチドを含めた非同位体、または高比放射能放射標識プローブを使用することができる。さらに、部分的な相同性しか含まない配列（例えば、異なる種に由来するｃＤＮＡ、またはエクソンを含む場合のあるゲノムＤＮＡ断片）を、プローブとして使用することができる。標識プローブ、例えば、全長の、一本鎖ＤＮＡ、またはそのＤＮＡ配列の断片を含む放射標識ｃＤＮＡは、長さが少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、または少なくとも１００の連続したヌクレオチドまでの任意の長さとすることができる。プローブは、当業者に既知である、任意の多くの様々な方法によって標識することができる。これらの研究のために、最も一般に使用される標識は、放射性元素、酵素、紫外光に曝されると蛍光を発する化学物質などである。いくつかの蛍光物質が知られており、標識として利用することができる。これらには、それだけに限らないが、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルーおよびルシファーイエローが含まれる。特定の検出物質は、ヤギ中で調製され、イソチオシアネートによってフルオレセインと結合した抗ウサギ抗体である。同位元素の非限定例として、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅが挙げられる。酵素標識も同様に有用であり、現在利用されている熱量測定、分光光度的、蛍光分光光度的、電流測定、または気体定量技法のいずれによっても検出することができる。酵素は、架橋分子、例えば、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどとの反応によって、選択されたプローブに結合することができる。例えば、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼを含めた、当業者に既知の任意の酵素を利用することができる。米国特許第３，６５４，０９０号、同第３，８５０，７５２号、および同第４，０１６，０４３号は、代替の標識物質および方法の開示について例として参照される。 In certain embodiments, Northern blot assays are used to confirm the size of RNA transcripts and to identify the relative amounts of selectively spliced RNA transcripts and RNA products of ErbB and / or MET genes. can do. In Northern blots, RNA samples are first separated by size by electrophoresis in an agarose gel under denaturing conditions. The RNA is then transferred to a membrane, cross-linked and hybridized with a labeled probe. Random-primed, nick-translated, or PCR-generated DNA probes, in vitro transcribed RNA probes, and non-isotopic or high specific activity radiation including oligonucleotides Labeled probes can be used. In addition, sequences that contain only partial homology (eg, cDNA from different species, or genomic DNA fragments that may contain exons) can be used as probes. A labeled probe, eg, a radiolabeled cDNA comprising a full-length, single-stranded DNA, or a fragment of that DNA sequence, is any length up to at least 20, at least 30, at least 50, or at least 100 contiguous nucleotides in length. It can be. Probes can be labeled by any of a number of different methods known to those skilled in the art. For these studies, the most commonly used labels are radioactive elements, enzymes, chemicals that fluoresce when exposed to ultraviolet light, and the like. Several fluorescent materials are known and can be used as labels. These include, but are not limited to, fluorescein, rhodamine, auramine, Texas red, AMCA blue and lucifer yellow. A particular detection agent is an anti-rabbit antibody prepared in goat and conjugated with fluorescein by isothiocyanate. Non-limiting examples of isotopes include 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 36 Cl, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 90 Y, 125 I, 131 I, and 186 Re. . Enzymatic labels are equally useful and can be detected by any of the currently utilized calorimetric, spectrophotometric, fluorescent spectrophotometric, amperometric, or gas quantification techniques. Enzymes can bind to selected probes by reaction with cross-linking molecules such as carbodiimides, diisocyanates, glutaraldehydes and the like. Any enzyme known to those skilled in the art can be utilized including, for example, peroxidase, β-D-galactosidase, urease, glucose oxidase and peroxidase, and alkaline phosphatase. U.S. Pat. Nos. 3,654,090, 3,850,752, and 4,016,043 are referenced by way of example for disclosure of alternative labeling materials and methods.

タンパク質発現
活性化突然変異または遺伝子増幅は、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴタンパク質発現レベルを検査することによっても検出することができる。タンパク質発現レベルを測定するための任意の当技術分野で認められた技法は、例えば、ゲル電気泳動（２−Ｄゲル電気泳動を含めて）、質量分析法および抗体結合を含むことができる。生体試料中でタンパク質レベルをアッセイするための好適な方法には、抗体に基づく技法、例えば、イムノブロッティング（ウエスタンブロッティング）、免疫組織学的アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、またはタンパク質チップなどが含まれる。例えば、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ特異的モノクローナル抗体を、免疫吸着剤および酵素−標識プローブの両方として使用することによって、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴを検出および定量化することができる。試料中に存在するＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴの量は、線形回帰コンピューターアルゴリズムを使用して、標準試料中に存在する量を参照することによって計算することができる。別の実施形態では、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴは、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴタンパク質に特異的な抗体を使用して、生体試料から免疫沈降させることができる。次いで単離されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを実施し、標準的な手順を使用してブロットすることができる（例えば、ニトロセルロースまたは他の適当な物質に）。次いでブロットを抗ＥｒｂＢおよび／または抗ＭＥＴ特異抗体でプローブすることによって、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴタンパク質の発現レベルを求めることができる。 Protein Expression Activating mutations or gene amplification can also be detected by examining ErbB and / or MET protein expression levels. Any art-recognized technique for measuring protein expression levels can include, for example, gel electrophoresis (including 2-D gel electrophoresis), mass spectrometry, and antibody binding. Suitable methods for assaying protein levels in a biological sample include antibody-based techniques such as immunoblotting (Western blotting), immunohistological assays, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), radioimmunoassays (RIA). ), Or protein chips. For example, ErbB and / or MET can be detected and quantified by using ErbB and / or MET specific monoclonal antibodies as both an immunosorbent and an enzyme-labeled probe. The amount of ErbB and / or MET present in the sample can be calculated by referring to the amount present in the standard sample using a linear regression computer algorithm. In another embodiment, ErbB and / or MET can be immunoprecipitated from a biological sample using antibodies specific for ErbB and / or MET protein. The isolated protein can then be run on an SDS-PAGE gel and blotted using standard procedures (eg, to nitrocellulose or other suitable material). The expression level of ErbB and / or MET protein can then be determined by probing the blot with anti-ErbB and / or anti-MET specific antibodies.

ゲル電気泳動、免疫沈降法および質量分析法は、標準的な技法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９年）、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８年 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｇ． Ｓｕｉｚｄａｋ、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９６年）、ならびに本明細書に引用される他の参考文献に記載されているものなどを使用して実施することができる。   Gel electrophoresis, immunoprecipitation and mass spectrometry can be performed using standard techniques such as Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd edition, edited by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989ow, Har, 1989) Antibodies: A Laboratory Manual (1988 Cold Spring Harbor Laboratories), G.M. It can be performed using, for example, those described in Suizdak, Mass Spectrometry for Biotechnology (Academic Press 1996), as well as other references cited herein.

ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴの単離および検出に適した抗体は、様々な供給源から市販で購入することができる。ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴに特異的な抗体は、本明細書にさらに記載されている標準的な技法を使用して作製することもできる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌを参照されたい）。   Antibodies suitable for the isolation and detection of ErbB and / or MET can be purchased commercially from various sources. Antibodies specific for ErbB and / or MET can also be generated using standard techniques further described herein (see, eg, Current Protocols in Immunology and Using Antibodies: A Laboratory Manual). I want to be)

活性レベル
ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ活性化突然変異または遺伝子増幅は、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ活性を測定することによっても検出することができる。ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ活性を判定するための様々な方法は、当業者に既知であり、本明細書にさらに記載されている。ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ活性を測定するための例示的な方法には、例えば、以下のうちの１つまたは複数を検査することが含まれる：ＥｒｂＢおよび／もしくはＭＥＴリン酸化、ＥｒｂＢおよび／もしくはＭＥＴキナーゼ活性、またはＥｒｂＢおよび／もしくはＭＥＴ媒介シグナル伝達。ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ活性は、細胞可溶化物を使用して細胞に基づくアッセイにおいて、または精製された成分もしくは部分的に精製された成分を使用してインビトロで判定することができる。一実施形態では、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴリン酸化は、米国特許第６，１９７，５９９号に記載されている抗体アレイを使用して検査することができる。複数のリン酸化受容体チロシンキナーゼに結合する市販の抗体アレイには、ＲａｙＢｉｏ（商標）Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＡｒｒａｙおよびＲ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍのＰｈｏｓｐｈｏ−ＲＴＫ Ａｒｒａｙが含まれる。 Activity Levels ErbB and / or MET activating mutations or gene amplification can also be detected by measuring ErbB and / or MET activity. Various methods for determining ErbB and / or MET activity are known to those of skill in the art and are further described herein. Exemplary methods for measuring ErbB and / or MET activity include, for example, examining one or more of the following: ErbB and / or MET phosphorylation, ErbB and / or MET kinase Activity, or ErbB and / or MET mediated signaling. ErbB and / or MET activity can be determined in cell-based assays using cell lysates or in vitro using purified or partially purified components. In one embodiment, ErbB and / or MET phosphorylation can be examined using an antibody array as described in US Pat. No. 6,197,599. Commercial antibody arrays that bind to multiple phosphorylated receptor tyrosine kinases include RayBio ™ Phosphorylation Antibody Array and R & D System's Phospho-RTK Array.

リガンド媒介活性化
ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴのリガンド媒介活性化は、本明細書にさらに記載されている、様々な当技術分野で認められた技法を使用して判定することができる。例えば、リガンド媒介活性化は、リガンド遺伝子の遺伝子増幅を検出することによって、またはリガンド遺伝子中の活性化突然変異を検出することによって判定することができる。遺伝子増幅および遺伝子突然変異を検出するための様々な方法は、本明細書で上記に説明されている。代替の実施形態では、ＥｒｂＢまたはＭＥＴのリガンド媒介活性化は、ＥｒｂＢまたはＭＥＴ活性のレベルを求めることによって分析することができ、ＥｒｂＢまたはＭＥＴ活性の増大は、リガンドの量の増加に関連する。ＥｒｂＢおよびＭＥＴ活性を判定するための方法は、本明細書で上記に説明されている。他の実施形態では、ＥｒｂＢまたはＭＥＴのリガンド媒介活性化は、例えば、免疫組織化学的分析、ＥＬＩＳＡ、または活性アッセイを使用して、リガンドタンパク質発現または活性のレベルをアッセイすることによって判定することができる。ＥｒｂＢリガンドは、当技術分野で既知であり、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＡＲ、ＢＴＣ、ＨＢ−ＥＰＲ、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、およびＮＲＧ４を含む。肝細胞成長因子すなわちＨＧＦは、ＭＥＴについてのリガンドである。 Ligand-mediated activation Ligand-mediated activation of ErbB and / or MET can be determined using various art-recognized techniques as further described herein. For example, ligand-mediated activation can be determined by detecting gene amplification of the ligand gene or by detecting an activating mutation in the ligand gene. Various methods for detecting gene amplification and gene mutation are described herein above. In an alternative embodiment, ligand-mediated activation of ErbB or MET can be analyzed by determining the level of ErbB or MET activity, and an increase in ErbB or MET activity is associated with an increased amount of ligand. Methods for determining ErbB and MET activity are described herein above. In other embodiments, ligand-mediated activation of ErbB or MET can be determined by assaying the level of ligand protein expression or activity using, for example, immunohistochemical analysis, ELISA, or activity assay. it can. ErbB ligands are known in the art and include EGF, TGFα, AR, BTC, HB-EPR, NRG1, NRG2, NRG3, and NRG4. Hepatocyte growth factor or HGF is a ligand for MET.

５．アッセイ、キットおよび細胞株
別の態様において、本発明は抗ＭＥＴ療法を特定する方法を提供する。一般に、本方法は細胞を１つまたは複数の抗ＥｒｂＢ治療剤および試験化合物、例えば、候補抗ＭＥＴ治療剤の組合せと接触させることを含む。例えば細胞は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対して耐性を獲得した癌細胞であってもよい。加えて、細胞はＭＥＴ遺伝子またはＭＥＴ遺伝子増幅中に活性化突然変異を含んでもよい。抗ＭＥＴ治療剤としての試験化合物の有効性は、ＭＥＴタンパク質の１つまたは複数の生物活性の減少を検出することによって測定することができる。ＭＥＴタンパク質の生物活性減少の測定は、例えば、以下の細胞の過程の変化：ＥｒｂＢリン酸化の減少、ＭＥＴリン酸化の減少、ＥｒｂＢ−ＭＥＴ結合の減少、ＰＩ３Ｋ活性の減少、ＡＫＴリン酸化の減少、細胞成長の減少、細胞増殖の減少またはアポトーシスの増加の１つまたは複数を検出することによって検査することができる。ある特定の実施形態では、結果を、試験化合物の非存在下で行った２回反復アッセイまたは既知の抗ＭＥＴ活性を有する試験化合物の存在下で行った２回反復アッセイなどの対照と比較することが望ましい場合がある。さらに別の実施形態において、対照はデータベース中の参照番号であってもよい。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の方法は、ＭＥＴタンパク質の生物活性を試験化合物の非存在下での生物活性と比較して少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍またはそれ以上減少させる試験化合物を特定するために使用してもよい。例示的なＭＥＴ生物活性は、例えば、キナーゼ活性、タンパク質間相互作用（例えば、受容体ホモもしくはヘテロ二量体化、リガンド結合、または基質への結合など）、またはＭＥＴ媒介シグナル伝達を含む。 5. Assays, Kits and Cell Lines In another aspect, the invention provides methods for identifying anti-MET therapy. In general, the method includes contacting a cell with a combination of one or more anti-ErbB therapeutics and a test compound, eg, a candidate anti-MET therapeutic. For example, the cell may be a cancer cell that has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic agent. In addition, the cells may contain activating mutations during the MET gene or MET gene amplification. The effectiveness of a test compound as an anti-MET therapeutic can be measured by detecting a decrease in one or more biological activities of the MET protein. Measurement of decreased biological activity of the MET protein can include, for example, changes in the following cellular processes: decreased ErbB phosphorylation, decreased MET phosphorylation, decreased ErbB-MET binding, decreased PI3K activity, decreased AKT phosphorylation, It can be examined by detecting one or more of decreased cell growth, decreased cell proliferation or increased apoptosis. In certain embodiments, comparing the results to a control, such as a duplicate assay performed in the absence of the test compound or a duplicate assay performed in the presence of a test compound with known anti-MET activity. May be desirable. In yet another embodiment, the control may be a reference number in the database. In certain embodiments, the methods described herein provide that the biological activity of the MET protein is at least 2-fold, 3-fold, 5-fold, 10-fold, 15-fold compared to the biological activity in the absence of the test compound. It may be used to identify test compounds that reduce fold, 20 fold, 25 fold or more. Exemplary MET biological activities include, for example, kinase activity, protein-protein interactions (eg, receptor homo- or heterodimerization, ligand binding, or binding to a substrate), or MET-mediated signal transduction.

本明細書に記載のアッセイにおいて活性を試験する試験化合物は、化合物のライブラリーを含めて、タンパク質（翻訳後修飾されたタンパク質を含む）、ペプチド（化学的または酵素的に修飾されたペプチドを含む）、または小分子（炭水化物、ステロイド、脂質、アニオンまたはカチオン、薬物、有機小分子、オリゴヌクレオチド、抗体、および薬剤のタンパク質をコードする遺伝子またはアンチセンス分子を含む）を含むことができる。試験化合物は天然起源の（例えば、自然界にあるまたは自然界から単離された）ものであってもよく、または非天然起源の（例えば、合成の、化学合成されたまたは人工の）ものであってもよい。   Test compounds that are tested for activity in the assays described herein include proteins (including post-translationally modified proteins), peptides (including chemically or enzymatically modified peptides), including libraries of compounds. ), Or small molecules (including carbohydrates, steroids, lipids, anions or cations, drugs, small organic molecules, oligonucleotides, antibodies, and genes or antisense molecules encoding drug proteins). The test compound may be of natural origin (eg, in nature or isolated from nature), or of non-natural origin (eg, synthetic, chemically synthesized or artificial) Also good.

必要に応じて、試験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的に位置指定可能な平行固相または液相ライブラリー、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、「１−ビーズ１−化合物」ライブラリー法、および選択的親和性クロマトグラフィーを使用した合成ライブラリー法を含むがこれらに限定されるものではない、当技術分野において既知の多くのコンビナトリアルライブラリー法のいずれかを使用して得ることができる。生物学的ライブラリーによるアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチはポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用可能である。Ｌａｍ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １２巻、１４５頁、１９９７年を参照されたい。   If desired, the test compound can be a biological library, a spatially positionable parallel solid or liquid phase library, a synthetic library method requiring deconvolution, “1-bead 1-compound”. Obtained using any of a number of combinatorial library methods known in the art, including, but not limited to, library methods and synthetic library methods using selective affinity chromatography be able to. Biological library approaches are limited to polypeptide libraries, but the other four approaches are applicable to small molecule libraries of polypeptides, non-peptide oligomers, or compounds. Lam, Anticancer Drug Des. See Vol. 12, 145, 1997.

分子ライブラリーの合成方法は当技術分野においてよく知られている（例えば、ＤｅＷｉｔｔら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０巻、６９０９頁、１９９３年；ＥｒｂらＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１巻、１１４２２頁、１９９４年；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ ＭｅｄＣｈｅｍ． ３７巻、２６７８頁、１９９４年；Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１巻、１３０３頁、１９９３年；Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ Ｅｎｇｌ． ３３巻、２０５９頁、１９９４年；Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３巻、２０６１頁；Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ． Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ３７巻、１２３３頁、１９９４年を参照されたい）。化合物のライブラリーは溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３巻、４１２〜４２１頁、１９９２年を参照）に、またはビーズ（Ｌａｍ、Ｎａｔｕｒｅ ３５４巻、８２〜８４頁、１９９１年）、チップ（Ｆｏｄｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３６４巻、５５５〜５５６頁、１９９３年）、細菌もしくは胞子（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９巻、１８６５〜１８６９頁、１９９２年）、またはファージ（Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９巻、３８６〜３９０頁、１９９０年；Ｄｅｖｌｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９巻、４０４〜４０６頁、１９９０年）；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９７巻、６３７８〜６３８２頁、１９９０年；Ｆｅｌｉｃｉ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２巻、３０１〜３１０頁、１９９１年；およびＬａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）上に提供することができる。   Methods for synthesizing molecular libraries are well known in the art (eg, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J MedChem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Chem. Int. Ed Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061, Gallop et al., J. Med Chem. Page, 1994 See year). The library of compounds can be in solution (see, eg, Houghten, BioTechnologies 13, 412-421, 1992) or beads (Lam, Nature 354, 82-84, 1991), Chip, Nature 364, 555-556 (1993), bacteria or spores (Ladner, US Pat. No. 5,223,409), plasmids (Cull et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 89). 1865, 1869, 1992), or phage (Scott & Smith, Science 249, 386-390, 1990; Devlin, Science 249, 404-406, 1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378-6382, 1990; Felici, J. et al. Mol. Biol. 222, 301-310, 1991; and Ladner, US Pat. No. 5,223,409).

試験化合物を、ハイスループットスクリーニングを使用してＭＥＴ活性をアンタゴナイズする能力についてスクリーニングすることができる。ハイスループットスクリーニングを使用して、多数の試験化合物を迅速にスクリーニングできるように、多くの別個の化合物を並行して試験することができる。最も広範に確立されている技術では、９６ウェルマイクロタイタープレートを利用する。プレートに加えて、多くの器具、材料、ピペッター、自動制御装置、プレートウォッシャー、およびプレートリーダーは９６ウェルフォーマットに合うものが市販されている。   Test compounds can be screened for the ability to antagonize MET activity using high throughput screening. Many separate compounds can be tested in parallel so that high throughput screening can be used to rapidly screen large numbers of test compounds. The most widely established technology utilizes 96-well microtiter plates. In addition to plates, many instruments, materials, pipettors, automated controls, plate washers, and plate readers are commercially available that fit the 96-well format.

あるいは、フリーフォーマットアッセイ、またはサンプル間に物理的障壁のないアッセイを使用することができる。フリーフォーマットを含むアッセイは例えば、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．においてＦｉｒｓｔ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇで報告されたＪａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １９巻、１６１４〜１８頁（１９９４年）；Ｃｈｅｌｓｋｙ、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ： Ｎｏｖｅｌ ａｎｄ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」、（１１月７日〜１０日、１９９５年）；およびＳａｌｍｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ２巻、５７〜６３頁（１９９６年）に記載されている。別のハイスループットスクリーニング法は、Ｂｅｕｔｅｌら、米国特許第５，９７６，８１３号に記載されている。   Alternatively, free format assays or assays without physical barriers between samples can be used. Assays including free formats are described, for example, in Philadelphia, Pa. In the First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening in Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 19: 1614-18 (1994); Chelsky, “Strategies for Screening Combinatorial Libraries: Novel and Traditional Approaches”, (November 7-10, 1995); Salmon et al., Salmon 57 et al. -63 (1996). Another high throughput screening method is described in Beutel et al., US Pat. No. 5,976,813.

別の態様において、本発明は抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得した細胞を産生する方法を提供する。本方法は、抗ＥｒｂＢ治療剤に感受性の細胞を、少なくとも１つの抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させること、および抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得する細胞を特定することを含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載の方法によって産生された細胞は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を付与するＥｒｂＢ遺伝子に変異を含有せず、例えば、異なる機構またはＥｒｂＢ配列ではない配列中の変異によって細胞は耐性を獲得している。細胞は、抗ＥｒｂＢ治療剤と少なくとも５日間、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、またはそれ以上接触させてもよい。細胞は、経時的に濃度を増加させて抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させてもよい。例えば、所定の濃度の存在下で細胞成長が回復するにつれて濃度を増加させてもよく、この過程を繰り返してもよい。例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤の濃度を約ＩＣ３０〜約ＩＣ４０、ＩＣ５０、およびＩＣ６０、またはそれ以上まで経時的に増加させてもよい。抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得した細胞を特定する種々の方法を使用してもよく、本明細書にさらに記載する。例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得した細胞の特定は、例えば、抗ＥｒｂＢ治療存在下において以下：細胞成長の増加、細胞増殖の増加、アポトーシスの減少、ＥｒｂＢリン酸化の増加、ＭＥＴリン酸化の増加、ＥｒｂＢ−ＭＥＴ結合の増加、ＡＫＴリン酸化の増加、ＰＩ３キナーゼ媒介シグナル伝達の増加、ＥｒｂＢ媒介シグナル伝達の増加、ＭＥＴ媒介シグナル伝達の増加、ＭＥＴ活性化突然変異の存在、ＭＥＴ遺伝子増幅の存在、ＭＥＴの過剰発現、ＭＥＴリガンドの過剰発現などのうちの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、細胞の感受性を、例えば抗ＥｒｂＢ治療剤の非存在下で行った２回反復アッセイなどの対照と比較することが望ましい場合がある。さらに別の実施形態において、対照はデータベース中の参照番号であってもよい。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性が対照と比較して少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍またはそれ以上増加する細胞株を産生するために使用してもよい。 In another aspect, the present invention provides a method of producing cells that have acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic. The method includes contacting a cell sensitive to an anti-ErbB therapeutic with at least one anti-ErbB therapeutic and identifying a cell that acquires resistance to the anti-ErbB therapeutic. In an exemplary embodiment, cells produced by the methods described herein do not contain mutations in the ErbB gene that confer resistance to anti-ErbB therapeutics, eg, in sequences that are not different mechanisms or ErbB sequences. The cell has acquired resistance by the mutation. The cells may be contacted with the anti-ErbB therapeutic for at least 5 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, 6 weeks, 8 weeks, or longer. The cells may be contacted with the anti-ErbB therapeutic agent at increasing concentrations over time. For example, the concentration may be increased as cell growth recovers in the presence of a predetermined concentration, and this process may be repeated. For example, the concentration of the anti-ErbB therapeutic may be increased over time from about IC 30 to about IC 40 , IC 50 , and IC 60 , or higher. Various methods of identifying cells that have acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic may be used and are further described herein. For example, the identification of cells that have acquired resistance to anti-ErbB therapeutics is, for example, in the presence of anti-ErbB therapy: increased cell growth, increased cell proliferation, decreased apoptosis, increased ErbB phosphorylation, increased MET phosphorylation Increased, increased ErbB-MET binding, increased AKT phosphorylation, increased PI3 kinase mediated signaling, increased ErbB mediated signaling, increased MET mediated signaling, presence of MET activating mutations, presence of MET gene amplification , MET overexpression, MET ligand overexpression, and the like. In certain embodiments, it may be desirable to compare cell sensitivity to a control, such as a duplicate assay performed in the absence of an anti-ErbB therapeutic. In yet another embodiment, the control may be a reference number in the database. In certain embodiments, the methods described herein have at least a 2-fold, 3-fold, 5-fold, 10-fold, 15-fold, 20-fold, 25-fold or greater resistance to an anti-ErbB therapeutic compared to a control. It may be used to produce cell lines that increase further.

種々の実施形態において、細胞が１つまたは複数の抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を発生させるように、細胞を１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以上の異なる抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させることが望ましい場合がある。ある特定の実施形態では、細胞を単一タイプの抗ＥｒｂＢ治療剤（例えば、小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤）と接触させることが望ましい場合がある。あるいは、例えば、ＥｒｂＢキナーゼ阻害剤とｓｉＲＮＡ、またはＥｒｂＢキナーゼ阻害剤と抗ＥｒｂＢ抗体の組合せなど異なるクラスの抗ＥｒｂＢ治療剤の組合せを使用してもよい。ある特定の実施形態では、細胞が例えば抗ＥｒｂＢ１治療剤に対する耐性を発生させるように、細胞をＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４のうち１つのみを対象とする抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させることが望ましい場合がある。別の実施形態において、細胞を異なるＥｒｂＢタンパク質を標的とする抗ＥｒｂＢ治療剤の組合せと接触させることが望ましい場合がある。例えば、細胞が両タイプの治療剤に対する耐性を発生させるように、細胞を抗ＥｒｂＢ１（抗ＥＧＦＲ）治療剤および抗ＥｒｂＢ２治療剤と接触させることが望ましい場合がある。さらに別の実施形態において、本方法は、細胞を１つまたは複数の多特異的ＥｒｂＢ治療剤、例えば、２つ以上のＥｒｂＢタンパク質を標的とする１つまたは複数のキナーゼ阻害剤と接触させることを含んでもよい。このような治療剤の例は本明細書中にさらに記載されている。   In various embodiments, cells are treated with one, two, three, four, or five or more different anti-ErbB therapeutics such that the cells develop resistance to one or more anti-ErbB therapeutics. It may be desirable to make contact. In certain embodiments, it may be desirable to contact the cell with a single type of anti-ErbB therapeutic (eg, a small molecule therapeutic, a nucleic acid therapeutic, or a protein therapeutic). Alternatively, a combination of different classes of anti-ErbB therapeutics may be used, for example, an ErbB kinase inhibitor and siRNA, or a combination of an ErbB kinase inhibitor and an anti-ErbB antibody. In certain embodiments, contacting a cell with an anti-ErbB therapeutic directed to only one of ErbB1, ErbB2, ErbB3, or ErbB4 such that the cell develops resistance to, for example, an anti-ErbB1 therapeutic. It may be desirable. In another embodiment, it may be desirable to contact the cell with a combination of anti-ErbB therapeutics that target different ErbB proteins. For example, it may be desirable to contact a cell with an anti-ErbB1 (anti-EGFR) therapeutic agent and an anti-ErbB2 therapeutic agent so that the cell develops resistance to both types of therapeutic agents. In yet another embodiment, the method comprises contacting the cell with one or more multispecific ErbB therapeutics, eg, one or more kinase inhibitors that target two or more ErbB proteins. May be included. Examples of such therapeutic agents are further described herein.

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の方法によって産生された細胞または細胞株を提供する。特に、抗ＥｒｂＢ２治療剤耐性を生じさせるＥｒｂＢ配列に変異を含有しない、抗ＥｒｂＢ２治療剤耐性を獲得した細胞を本明細書において提供する。   In another aspect, the present invention provides a cell or cell line produced by the methods described herein. In particular, provided herein are cells that have acquired anti-ErbB2 therapeutic resistance that do not contain mutations in the ErbB sequence that results in anti-ErbB2 therapeutic resistance.

別の態様において、本発明は研究目的、創薬、診断目的、治療経過のモニタリング、用量最適化などに役立つキットを提供する。   In another aspect, the present invention provides kits useful for research purposes, drug discovery, diagnostic purposes, monitoring the course of treatment, dose optimization, and the like.

一実施形態において、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤に耐性の癌に罹患している患者を治療するためのキットを提供する。このようなキットは、ＭＥＴ活性化変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、もしくはＨＧＦに媒介されるＭＥＴ活性化（前述）を検出するための少なくとも１つの構成要素、および抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤（前述）を含んでもよい。例えば、キットは抗ＥｒｂＢ治療剤、およびＭＥＴ活性化変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦに媒介されるＭＥＴ活性化を検出するための少なくとも１つの構成要素を含んでもよい。このようなキットは、治療に対する耐性を発生する患者を特定するための、抗ＥｒｂＢ治療剤で治療されている対象のモニタリングに役に立ち得る。別の実施形態では、キットはＭＥＴ活性化変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦに媒介されるＭＥＴ活性化を検出するための少なくとも１つの構成要素、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を含んでもよい。このようなキットは、治療に対する耐性を発生する患者を特定するための、抗ＥｒｂＢ治療剤で治療されている対象のモニタリングに役に立ち、抗ＥｒｂＢ治療に耐性であると発見された、およびＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有する対象のための改良された治療レジメンを提供する。このようなキットは例示に過ぎず、本明細書に提供された開示に基づいて多くの他のタイプのキットが当業者によって想定され得る。   In one embodiment, the present invention provides a kit for treating a patient suffering from a cancer resistant to an anti-ErbB therapeutic. Such a kit comprises at least one component for detecting MET activating mutations, MET gene amplification, or HGF-mediated MET activation (as described above), and an anti-ErbB therapeutic and / or an anti-MET therapeutic. (Described above) may be included. For example, the kit may comprise an anti-ErbB therapeutic and at least one component for detecting MET activating mutations, MET gene amplification, or HGF-mediated MET activation. Such kits can be useful for monitoring subjects being treated with anti-ErbB therapeutics to identify patients who develop resistance to treatment. In another embodiment, the kit may comprise at least one component for detecting MET activating mutation, MET gene amplification, or HGF-mediated MET activation, an anti-ErbB therapeutic agent and an anti-MET therapeutic agent. . Such a kit has been found to be resistant to anti-ErbB treatment and is useful for monitoring subjects being treated with anti-ErbB therapeutics to identify patients who develop resistance to treatment, and MET activation An improved treatment regimen for subjects with mutations or MET gene amplification is provided. Such kits are exemplary only, and many other types of kits can be envisioned by those skilled in the art based on the disclosure provided herein.

ＭＥＴ活性化突然変異または遺伝子増幅を検出するための構成要素は、突然変異または遺伝子増幅を検出するための本明細書に記載の種々の方法と併用して使用できる任意の構成要素であってよい。例示的な構成要素は、例えば、ＭＥＴ（またはホスホＭＥＴ）、ＭＥＴリガンド、またはＭＥＴの基質に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、ＭＥＴまたはＭＥＴリガンドを特異的に増幅するＰＣＲプライマーセット、または支持体に接着された、ＭＥＴまたはＭＥＴリガンドをコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも断片を含む固体支持体（マイクロアレイチップなど）を含む。キットは、以下の１つまたは複数をさらに含有してもよい：検出標識、陽性対照、陰性対照、ＭＥＴタンパク質、キナーゼアッセイを行うための試薬、結合アッセイを行うための試薬、ＥｒｂＢ、ＭＥＴおよび／またはＰＩ３キナーゼ媒介シグナル伝達を測定するための試薬、使用説明書、反応容器、緩衝液など。キットはまた、ＥｒｂＢ活性化突然変異または遺伝子増幅を検出するための構成要素を含んでもよい。   A component for detecting a MET activating mutation or gene amplification may be any component that can be used in conjunction with the various methods described herein for detecting a mutation or gene amplification. . Exemplary components include, for example, MET (or phosphoMET), MET ligand, or an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a substrate of MET, a PCR primer set that specifically amplifies MET or MET ligand, or a support A solid support (such as a microarray chip) comprising at least a fragment of a polynucleotide sequence encoding MET or a MET ligand attached to The kit may further contain one or more of the following: detection label, positive control, negative control, MET protein, reagents for performing kinase assays, reagents for performing binding assays, ErbB, MET and / or Alternatively, reagents, instructions for use, reaction vessels, buffers, etc. for measuring PI3 kinase-mediated signal transduction. The kit may also include components for detecting ErbB activating mutations or gene amplification.

ある特定の実施形態では、キットは、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療に耐性の、ＥｒｂＢおよびＭＥＴ活性化突然変異または遺伝子増幅を有する癌細胞を含んでもよい。キットはまた、以下の１つまたは複数をさらに含有してもよい：検出標識、陽性対照、陰性対照、使用説明書、反応容器、緩衝液、抗ＥｒｂＢ治療剤、細胞の増殖、成長および／またはアポトーシスを測定するための試薬、キナーゼアッセイを行うための試薬、結合アッセイを行うための試薬、ＥｒｂＢ、ＭＥＴおよび／またはＰＩ３キナーゼ媒介シグナル伝達を測定するための試薬など。このようなキットは、例えば、ＭＥＴ治療剤の特定、抗ＥｒｂＢおよび抗ＭＥＴ治療剤の組合せの試験、薬剤投与または治療レジメンの最適化などに役に立ち得る。   In certain embodiments, the kit may comprise cancer cells with ErbB and MET activating mutations or gene amplification that are resistant to treatment with an anti-ErbB therapeutic. The kit may also further contain one or more of the following: detection label, positive control, negative control, instructions for use, reaction vessel, buffer, anti-ErbB therapeutic agent, cell proliferation, growth and / or Reagents for measuring apoptosis, reagents for performing kinase assays, reagents for performing binding assays, reagents for measuring ErbB, MET and / or PI3 kinase mediated signaling, and the like. Such kits can be useful, for example, in identifying MET therapeutics, testing combinations of anti-ErbB and anti-MET therapeutics, optimizing drug administration or treatment regimens, and the like.

キットのそれぞれの構成要素は、反応に適した最終濃度を実現するために混合してもよい。さらに、これらの構成要素に加えて、キットは反応に適した条件を与える緩衝液を含んでもよい。抗体、基質、リガンド、キナーゼなどのタンパク質構成要素を安定剤と混合してもよい。例えば、キット構成要素は、凍結乾燥後のタンパク質変性を防止するために、約１％ＢＳＡおよび約１％ポリオール（例えば、スクロースまたはフルクトースなど）の存在下で保存および／または輸送してもよい。   Each component of the kit may be mixed to achieve a final concentration suitable for the reaction. Further, in addition to these components, the kit may include a buffer that provides conditions suitable for the reaction. Protein components such as antibodies, substrates, ligands, kinases may be mixed with the stabilizer. For example, the kit components may be stored and / or transported in the presence of about 1% BSA and about 1% polyol (such as sucrose or fructose) to prevent protein denaturation after lyophilization.

ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるキットはまた、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴタンパク質およびＲＮＡ産物の発現を測定するための構成要素を含んでもよい。このような構成要素は、例えば、（１）生体試料のＲＮＡを精製するための試薬；（２）試験核酸を作製するためのプライマー；（３）ｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰ（プレミックスまたは別個の）、場合により１つまたは複数の独自に標識されたｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰ（例えば、ビオチン化またはＣｙ３またはＣｙ５タグ付きｄＮＴＰ）と一緒に；（４）蛍光色素の化学的に活性な誘導体などの合成後標識試薬；（５）逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素；（６）種々の緩衝媒体、例えば、ハイブリダイゼーションおよび洗浄用緩衝液など；（７）スピンカラムなどのような標識化プローブ精製試薬および構成要素；（８）タンパク質精製試薬；および（９）シグナル生成および検出試薬、例えば、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート、化学蛍光または化学発光基質などの、タンパク質およびＲＮＡ産物の発現を測定するために必要な材料および試薬を含む。特定の実施形態において、キットは、対照として使用するための生体試料から単離された、前標識され、品質管理されたタンパク質およびまたはＲＮＡを含む。   In certain embodiments, the kits provided herein may also include components for measuring the expression of ErbB and / or MET proteins and RNA products. Such components include, for example: (1) reagents for purifying RNA of biological samples; (2) primers for producing test nucleic acids; (3) dNTPs and / or rNTPs (premix or separate) Optionally with one or more uniquely labeled dNTPs and / or rNTPs (eg, biotinylated or Cy3 or Cy5 tagged dNTPs); (4) synthesis such as chemically active derivatives of fluorescent dyes Post-labeling reagents; (5) Enzymes such as reverse transcriptase and DNA polymerase; (6) Various buffer media such as hybridization and washing buffers; (7) Labeled probe purification reagents such as spin columns And (8) protein purification reagents; and (9) signal generation and detection reagents such as streptavidin - including alkaline phosphatase conjugate, such as chemiluminescence or chemiluminescent substrate, the materials and reagents required for measuring the expression of protein and RNA products. In certain embodiments, the kit comprises a pre-labeled, quality-controlled protein and / or RNA isolated from a biological sample for use as a control.

いくつかの実施形態において、キットはＲＴ−ＰＣＲ構成要素、またはハイブリダイゼーション構成要素を含んでもよい。例えば、キットは、核酸アレイ、タンパク質アレイ、抗体アレイ、ホスホタンパク質アレイ、ホスホ抗体アレイなどを含んでもよい。このようなキットを使用して、ＭＥＴ、ＥｒｂＢ、これらのリガンド、および／またはこれらの基質の発現レベルを測定することができる。   In some embodiments, the kit may include an RT-PCR component, or a hybridization component. For example, the kit may include a nucleic acid array, protein array, antibody array, phosphoprotein array, phosphoantibody array, and the like. Such kits can be used to measure the expression levels of MET, ErbB, their ligands, and / or their substrates.

６．医薬組成物
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象への１つまたは複数の抗ＥｒｂＢ治療剤および／または１つまたは複数の抗ＭＥＴ治療剤の投与を含んでもよい。抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤は、１つまたは複数の生理学的に許容可能な担体または賦形剤を使用して、従来の様式で処方することができる。例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤、およびこれらの生理学的に許容可能な塩および溶媒和物を、例えば、注射（例えば、ＳｕｂＱ（皮下）、ＩＭ（筋肉内）、ＩＰ（腹腔内））、吸入もしくは吹送（口または鼻を通して）、または経口、口腔、舌下、経皮、経鼻、非経口もしくは直腸投与による投与用に処方してもよい。一実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤は、標的細胞が存在する部位に、すなわち、特定の組織、器官、または体液（例えば、血液、脳脊髄液、腫瘍塊など）に局所的に投与することができる。 6). Pharmaceutical Compositions In certain embodiments, the methods described herein may comprise administration of one or more anti-ErbB therapeutics and / or one or more anti-MET therapeutics to a subject. The anti-ErbB therapeutic and / or anti-MET therapeutic can be formulated in a conventional manner using one or more physiologically acceptable carriers or excipients. For example, anti-ErbB therapeutics and / or anti-MET therapeutics, and physiologically acceptable salts and solvates thereof, for example, injection (eg, SubQ (subcutaneous), IM (intramuscular), IP (peritoneal) Internal))), inhalation or insufflation (through mouth or nose), or oral, buccal, sublingual, transdermal, nasal, parenteral or rectal administration. In one embodiment, the anti-ErbB therapeutic and / or anti-MET therapeutic is at the site where the target cells are present, ie, in a particular tissue, organ, or body fluid (eg, blood, cerebrospinal fluid, tumor mass, etc.). It can be administered topically.

抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤は、全身、および局所的または限局的投与を含む、種々の投与方法用に処方することができる。技術および処方は通常、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅａｄｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡで見ることができる。非経口投与には、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む注射が好ましい。注射用に、化合物を溶液中に、好ましくは例えばハンクス液またはリンゲル液などの生理学的に適合性のある緩衝液中に処方することができる。加えて、化合物を固体形態に処方し、使用直前に再溶解または懸濁してもよい。凍結乾燥形態もまた含まれる。   Anti-ErbB therapeutics and / or anti-MET therapeutics can be formulated for various methods of administration, including systemic and local or localized administration. Techniques and formulations are generally available from Remington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co. , Easton, PA. For parenteral administration, injection is preferred, including intramuscular, intravenous, intraperitoneal, and subcutaneous. For injection, the compounds can be formulated in solutions, preferably in physiologically compatible buffers such as Hank's solution or Ringer's solution. In addition, the compounds may be formulated in solid form and redissolved or suspended immediately before use. Freeze-dried forms are also included.

経口投与用に、医薬組成物は、結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウムなど）；滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたは二酸化ケイ素など）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウムデンプンなど）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）などの薬学的に許容可能な賦形剤を用いて従来の手段によって調製される、例えば、錠剤、薬用ドロップ、またはカプセルの形態をとることができる。錠剤は、当技術分野においてよく知られている方法によってコーティングしてもよい。経口投与用の液体製剤は、例えば、液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態をとることができ、または、使用前に水または他の適当なビヒクルと構成するための乾燥品として存在してもよい。このような液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素添加食用脂など）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴムなど）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、オイルエステル、エチルアルコールまたは精留植物油など）；および防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸）などの薬学的に許容可能な添加剤を用いて従来の手段によって調製することができる。製剤はまた、緩衝塩、香料、着色剤および甘味剤を適切なように含有してもよい。経口投与用の製剤は、活性化合物の放出を制御するように適切に処方してもよい。   For oral administration, the pharmaceutical composition comprises a binder (such as pregelatinized corn starch, polyvinyl pyrrolidone or hydroxypropyl methylcellulose); a filler (such as lactose, microcrystalline cellulose or calcium hydrogen phosphate); Pharmaceutically acceptable excipients such as, for example, magnesium stearate, talc or silicon dioxide; disintegrants (such as potato starch or sodium starch glycolate); or wetting agents (such as sodium lauryl sulfate) Can be prepared, for example, in the form of tablets, medicinal drops, or capsules. The tablets may be coated by methods well known in the art. Liquid dosage forms for oral administration can take the form of, for example, solutions, syrups or suspensions, or they can exist as a dry product for constitution with water or other suitable vehicle prior to use. Good. Such liquid formulations include suspensions (eg, sorbitol syrup, cellulose derivatives or hydrogenated edible fats); emulsifiers (eg, lecithin or gum arabic); non-aqueous vehicles (eg, almond oil, oil esters, ethyl Alcohol or rectified vegetable oils); and pharmaceutically acceptable additives such as preservatives (eg, methyl or propyl p-hydroxybenzoate or sorbic acid) and can be prepared by conventional means. The formulations may also contain buffer salts, flavoring agents, coloring agents and sweetening agents as appropriate. Preparations for oral administration may be suitably formulated to control the release of the active compound.

吸入による投与（例えば、肺送達）用には、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤を、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスなどの適当な推進剤の使用によって、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレー状の形態で都合よく送達することができる。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定できる。吸入器または吹送器で使用する、例えばゼラチンの、カプセルおよびカートリッジは、化合物の粉末混合物およびラクトースまたはデンプンなどの適当な粉末基剤を含有して処方することができる。   For administration by inhalation (eg, pulmonary delivery), anti-ErbB therapeutics and / or anti-MET therapeutics such as dichlorodifluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide or other suitable gas, etc. Can be conveniently delivered in the form of an aerosol spray from a pressurized pack or nebulizer. In the case of a pressurized aerosol, the dosage unit can be determined by providing a valve to deliver a metered amount. Capsules and cartridges, eg, gelatin, for use in an inhaler or insufflator can be formulated containing a powder mixture of the compound and a suitable powder base such as lactose or starch.

抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤は、注射、例えばボーラス注射または持続注入などによる非経口投与用に処方することができる。注射用の処方は、例えば、アンプルなどの単位剤形で、または防腐剤を添加した複数回投与容器で提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中で懸濁剤、液剤または乳剤などの形態をとってもよく、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの処方剤を含有してもよい。あるいは、活性成分は、使用前に適当なビヒクル、例えば、滅菌発熱物質除去水などと構成するための粉末形態であってもよい。   The anti-ErbB therapeutic and / or anti-MET therapeutic can be formulated for parenteral administration, such as by injection, eg, bolus injection or continuous infusion. Formulations for injection can be provided, for example, in unit dosage forms such as ampoules or in multi-dose containers supplemented with preservatives. The composition may take the form of a suspension, solution or emulsion in an oily or aqueous vehicle and may contain formulatory agents such as suspending, stabilizing and / or dispersing agents. Alternatively, the active ingredient may be in powder form for constitution with a suitable vehicle, such as sterile pyrogen-free water, before use.

加えて、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤はまた、デポー製剤として処方することもできる。このような長時間作用型の製剤は、埋込み（例えば、皮下または筋肉内に）によって、または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤は、適当なポリマー材料または疎水性材料（例えば、許容可能なオイル中の乳剤として）またはイオン交換樹脂と一緒に、または難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として処方することができる。放出制御処方はまたパッチも含む。   In addition, the anti-ErbB therapeutic and / or anti-MET therapeutic can also be formulated as a depot preparation. Such long acting formulations can be administered by implantation (for example subcutaneously or intramuscularly) or by intramuscular injection. Thus, for example, anti-ErbB therapeutics and / or anti-MET therapeutics may be combined with suitable polymeric or hydrophobic materials (eg, as emulsions in acceptable oils) or ion exchange resins, or as poorly soluble derivatives. For example, it can be formulated as a sparingly soluble salt. The controlled release formulation also includes a patch.

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の化合物を、中枢神経系（ＣＮＳ）への送達用に処方することができる（Ｂｅｇｌｅｙ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １０４巻：２９〜４５頁（２００４年）に概説されている）。ＣＮＳへの薬物送達のための従来のアプローチは以下を含む：神経外科的戦略（例えば、脳内注射または脳室内注入など）；ＢＢＢの内因性輸送経路の１つを活用するための薬剤の分子操作（例えば、それ自体はＢＢＢを通過できない薬剤と組み合わせて、内皮細胞表面分子に対する親和性を有する輸送ペプチドを含むキメラ融合タンパク質）；薬剤の脂溶性を高めるように設計される薬理学的戦略（例えば、水溶性薬剤の脂質またはコレステロール担体へのコンジュゲーションなど）；および（マンニトール溶液の頸動脈への注入またはアンジオテンシンペプチドなどの生物学的に活性な薬剤の使用の結果生じる）高浸透圧破壊によるＢＢＢ完全性の一時的破壊。   In certain embodiments, the compounds described herein can be formulated for delivery to the central nervous system (CNS) (Begley, Pharmacology & Therapeutics 104: 29-45 (2004)). Outlined)). Conventional approaches for drug delivery to the CNS include: neurosurgical strategies (eg, intracerebral injection or intracerebroventricular infusion); drug molecules to exploit one of the BBB's intrinsic transport pathways Manipulation (eg, a chimeric fusion protein comprising a transport peptide having an affinity for endothelial cell surface molecules in combination with a drug that cannot itself pass through the BBB); a pharmacological strategy designed to increase the lipophilicity of the drug ( For example, conjugation of water-soluble drugs to lipid or cholesterol carriers); and hyperosmotic disruption (resulting from injection of mannitol solution into the carotid artery or use of biologically active drugs such as angiotensin peptides) Temporary destruction of BBB integrity.

一実施形態において、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤は、一般に局所的薬物投与に適する局所用担体を含有し、当技術分野において知られる任意のこのような材料を含む、局所製剤に組み込まれる。局所用担体は、例えば、軟膏、ローション、クリーム、マイクロエマルジョン、ゲル、オイル、溶液など所望の形態の組成物を提供するように選択してもよく、天然起源または合成起源の材料から構成されてもよい。選択した担体が局所製剤の活性薬剤または他の構成要素に悪影響を及ぼさないことが好ましい。本明細書で使用される適当な局所用担体の例は、水、アルコールおよび他の非毒性有機溶媒、グリセリン、鉱油、シリコーン、ワセリン、ラノリン、脂肪酸、植物油、パラベン、ワックスなどを含む。   In one embodiment, the anti-ErbB therapeutic agent and / or anti-MET therapeutic agent generally comprises a topical carrier suitable for topical drug administration, and in a topical formulation comprising any such material known in the art. Incorporated. Topical carriers may be selected to provide the desired form of the composition, such as, for example, ointments, lotions, creams, microemulsions, gels, oils, solutions, etc., and are composed of materials of natural or synthetic origin Also good. It is preferred that the carrier selected does not adversely affect the active agent or other components of the topical formulation. Examples of suitable topical carriers for use herein include water, alcohol and other non-toxic organic solvents, glycerin, mineral oil, silicone, petrolatum, lanolin, fatty acids, vegetable oils, parabens, waxes and the like.

医薬組成物（化粧品を含む）は、０．００１〜１０重量％または０．１％〜５重量％など約０．００００１〜１００重量％の１つまたは複数の本明細書に記載の抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤を含むことができる。ある特定の局所製剤では、活性薬剤は製剤の約０．２５重量％〜７５重量％、好ましくは製剤の約０．２５重量％〜３０重量％、より好ましくは製剤の約０．５重量％〜１５重量％、および最も好ましくは製剤の約１．０重量％〜１０重量％の量で存在する。   The pharmaceutical composition (including cosmetics) comprises about 0.00001-100 wt% of one or more anti-ErbB treatments as described herein, such as 0.001-10 wt% or 0.1% -5 wt%. Agents and / or anti-MET therapeutics. In certain topical formulations, the active agent is from about 0.25% to 75% by weight of the formulation, preferably from about 0.25% to 30% by weight of the formulation, more preferably from about 0.5% to It is present in an amount of 15% by weight, and most preferably about 1.0% to 10% by weight of the formulation.

目の疾患を、例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤の全身、局所的、眼内注射によって、または抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤を放出する持続放出デバイスの挿入によって、治療または予防することができる。抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤を、化合物が眼表面と十分な時間接触を維持し、化合物を眼の角膜および内部領域、例えば、前房、後房、硝子体、房水、硝子体液、角膜、虹彩／毛様体、レンズ、脈絡膜／網膜および強膜などに浸透させるように、薬学的に許容可能な眼用ビヒクルで送達することができる。薬学的に許容可能な眼用ビヒクルは、例えば、軟膏、植物油またはカプセル化材料であってもよい。あるいは、化合物を硝子体液または房水中に直接注射してもよい。さらに別法では、目の治療のために化合物を静脈内注入または注射など全身に投与することができる。   Eye disease may be caused by, for example, systemic, topical, intraocular injection of an anti-ErbB therapeutic and / or anti-MET therapeutic, or by insertion of a sustained release device that releases the anti-ErbB therapeutic and / or anti-MET therapeutic. Can be treated or prevented. Anti-ErbB therapeutics and / or anti-MET therapeutics allow the compound to remain in contact with the ocular surface for a sufficient amount of time so that the compound can be It can be delivered in a pharmaceutically acceptable ophthalmic vehicle so as to penetrate body fluids, cornea, iris / ciliary body, lens, choroid / retina, sclera and the like. Pharmaceutically acceptable ophthalmic vehicles may be, for example, ointments, vegetable oils or encapsulating materials. Alternatively, the compound may be injected directly into the vitreous humor or aqueous humor. In yet another alternative, the compound can be administered systemically for intravenous eye treatment, such as intravenous infusion or injection.

核酸治療剤の送達方法は、当技術分野において知られている（例えば、Ａｋｈｔａｒら、１９９２年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．、２巻、１３９頁；およびＤｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ａｋｈｔａｒ編、１９９５年；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０２５９５号を参照されたい）。これらのプロトコルは、実質的にいかなる核酸の送達にも利用することができる。イオントフォレシスによる、またはヒドロゲル、シクロデキストリンなどの別のビヒクルへの組み込みによるリポソームカプセル化、生物分解性ナノカプセル、および生体接着性ミクロスフェアを含むがこれらに限定されない当業者に知られている様々な方法によって、核酸を細胞に投与することができる。あるいは、直接注射によってまたは注入ポンプの使用によって核酸／ビヒクルの組合せを局所的に送達する。他の送達経路は、経口（錠剤またはピル形態）および／または髄腔内送達（Ｇｏｌｄ、１９９７年、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、７６巻、１１５３〜１１５８頁）を含むがこれらに限定されない。他のアプローチは、例えば、コンジュゲートおよび生物分解性ポリマーの使用による様々な輸送および搬送システムの使用を含む。薬物送達戦略についての包括的概説に関しては、Ｈｏら、１９９９年、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．、１巻、３３６〜３４３頁およびＪａｉｎ、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ： Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ、Ｄｅｃｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、１９９８年およびＧｒｏｏｔｈｕｉｓら、１９９７年、Ｊ． ＮｅｕｒｏＶｉｒｏｌ．、３巻、３８７〜４００頁を参照されたい。核酸送達および投与のより詳細な説明は、Ｓｕｌｌｉｖａｎら、上記、Ｄｒａｐｅｒら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／２３５６９号、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／０５０９４号およびＫｌｉｍｕｋら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／０４８１９号に提供されている。   Methods of delivering nucleic acid therapeutics are known in the art (eg, Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; and Delivery Strategies for Antisense Therapeutics, Ed. 95, edited by Akhtar; See Sullivan et al., PCT Publication No. WO 94/02595). These protocols can be utilized for the delivery of virtually any nucleic acid. Various known to those skilled in the art including, but not limited to, liposomal encapsulation, biodegradable nanocapsules, and bioadhesive microspheres by iontophoresis or by incorporation into another vehicle such as a hydrogel, cyclodextrin, etc. The nucleic acid can be administered to the cell by any method. Alternatively, the nucleic acid / vehicle combination is delivered locally by direct injection or by use of an infusion pump. Other delivery routes include, but are not limited to, oral (tablet or pill form) and / or intrathecal delivery (Gold, 1997, Neuroscience, 76, 1153-1158). Other approaches include the use of various transport and delivery systems, for example by using conjugates and biodegradable polymers. For a comprehensive review of drug delivery strategies, see Ho et al., 1999, Curr. Opin. Mol. Ther. 1, 336-343 and Jain, Drug Delivery Systems: Technologies and Commercial Opportunities, Decision Resources, 1998 and Grothuis et al., 1997, J. Am. NeuroVirol. 3, pp. 387-400. A more detailed description of nucleic acid delivery and administration is provided in Sullivan et al., Supra, Draper et al., PCT Publication No. WO 93/23569, Beigelman et al., PCT Publication No. WO 99/05094, and Klimuk et al., PCT Publication No. WO 99/04819. Has been.

抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤の毒性および治療有効性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって判定することができる。ＬＤ５０は集団の５０％を致死させる用量である。ＥＤ５０は集団の５０％において治療的に有効な用量である。毒性および治療有効性の用量比（ＬＤ５０／ＥＤ５０）が治療指数である。大きい治療指数を示す抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤が好ましい。毒性の副作用を示す抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤を使用してもよいが、非感染細胞に対して予想される損傷を最小限にし、およびそれによって副作用を低減させるために、このような化合物を標的とする患部組織への薬物送達の設計には注意を払うべきである。 Toxicity and therapeutic efficacy of anti-ErbB therapeutics and / or anti-MET therapeutics can be determined by standard pharmaceutical procedures in cell cultures or experimental animals. LD 50 is the dose that kills 50% of the population. The ED 50 is a therapeutically effective dose in 50% of the population. The dose ratio between toxic and therapeutic efficacy (LD 50 / ED 50 ) is the therapeutic index. Anti-ErbB therapeutics and / or anti-MET therapeutics that exhibit large therapeutic indices are preferred. Anti-ErbB therapeutics and / or anti-MET therapeutics that exhibit toxic side effects may be used, but in order to minimize the expected damage to uninfected cells and thereby reduce side effects Care should be taken in designing drug delivery to affected tissues that target such compounds.

細胞培養物アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトに使用するための用量範囲を処方する際に使用することができる。このような化合物の用量は、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にあってもよい。用量は、採用された剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化してもよい。任意の化合物について、治療的に有効な用量を、最初は細胞培養物アッセイから予測することができる。細胞培養物において測定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度を達成するために、用量を動物モデルにおいて処方してもよい。ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために、このような情報を使用することができる。血漿中の濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。 Data obtained from cell culture assays and animal studies can be used in formulating a dosage range for use in humans. The dosage of such compounds may be within a range of circulating concentrations that include the ED 50 with little or no toxicity. The dose may vary within this range depending on the dosage form employed and the route of administration utilized. For any compound, the therapeutically effective dose can be estimated initially from cell culture assays. Doses may be formulated in animal models to achieve circulating plasma concentrations that include an IC 50 (ie, the concentration of the test compound that achieves half of the maximum inhibition of symptoms) measured in the cell culture. Such information can be used to more accurately determine useful doses in humans. The concentration in plasma can be measured, for example, by high performance liquid chromatography.

以下に一般的に記述する本発明は、本発明のある特定の態様および実施形態を例示するためだけに含まれ、本発明を制限することを決して意図しない以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。   The invention generally described below is included by way of illustration of certain specific aspects and embodiments of the invention only, and is not intended to limit the invention in any way by reference to the following examples. Will be more easily understood.

（実施例１）
ＭＥＴ増幅はＥＧＦＲキナーゼ阻害剤耐性を引き起こす
チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、標的キナーゼが遺伝子機構により活性化される、腫瘍の有効な抗癌治療として登場した。説得力のある臨床例として、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ、ＢＣＲ−ＡＢＬ転座）または消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ、ＫＩＴまたはＰＤＧＦＲＡの活性化突然変異）治療のためのイマチニブ、ならびに上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に活性化突然変異を保有する非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）治療のためのＥＧＦＲ ＴＫＩゲフィチニブおよびエルロチニブの使用が挙げられる（１〜４）。 Example 1
MET amplification causes EGFR kinase inhibitor resistance Tyrosine kinase inhibitor (TKI) has emerged as an effective anti-cancer therapy for tumors where the target kinase is activated by a genetic mechanism. Persuasive clinical examples include imatinib for treatment of chronic myeloid leukemia (CML, BCR-ABL translocation) or gastrointestinal stromal tumor (GIST, KIT or PDGFRA activating mutation), and epidermal growth factor reception The use of EGFR TKI gefitinib and erlotinib for the treatment of non-small cell lung cancer (NSCLC) carrying activating mutations in the body (EGFR) (1-4).

ＥＧＦＲの体細胞変異は、白人のＮＳＣＬＣ腫瘍の１０〜１５％およびアジア人のＮＳＣＬＣ腫瘍の３０〜４０％に起こり、ＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインのエクソン１８〜２１に位置する。一連のオーバーラップしたエクソン１９の欠失およびエクソン１２のミスセンス変異（Ｌ８５８Ｒ）という２つのよくあるタイプの変異が、すべての既知のＥＧＦＲ変異の８５％を占める（５）。ＥＧＦＲ変異細胞株をゲフィチニブで処理すると、患者において観察される劇的な臨床反応と同様のアポトーシスを引き起こす（６）。しかしながら、ＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣは最初ＥＧＦＲ阻害剤に反応するが、ゲフィチニブおよびエルロチニブで処置した患者の大多数において最終的にはこれらの薬剤に対する耐性を獲得する。このような患者の５０％において、７９０番目のトレオニンのメチオニンへの置換（Ｔ７９０Ｍ）という、単一の二次変異が特定された（７、８）。しかしながら、残りの腫瘍における耐性獲得の機構は不明である。ＥＧＦＲ変異腫瘍がＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達を活性化するために特にＥＲＢＢ３を利用すること、およびゲフィチニブがＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣにおいてアポトーシスを誘導するためにはＥＲＢＢ３／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路の下方制御が必要であることが示されている（９、１０）。とりわけ、ＥＲＢＢ２増幅乳癌細胞においてＥＲＢＢ３リン酸化の持続がゲフィチニブ耐性を引き起こすこともまた示されている（１１）。   EGFR somatic mutations occur in 10-15% of Caucasian NSCLC tumors and 30-40% of Asian NSCLC tumors and are located in exons 18-21 of the EGFR tyrosine kinase domain. Two common types of mutations, a series of overlapping exon 19 deletions and exon 12 missense mutations (L858R) account for 85% of all known EGFR mutations (5). Treatment of EGFR mutant cell lines with gefitinib causes apoptosis similar to the dramatic clinical response observed in patients (6). However, EGFR-mutated NSCLC initially responds to EGFR inhibitors, but eventually gains resistance to these drugs in the majority of patients treated with gefitinib and erlotinib. In 50% of these patients, a single secondary mutation was identified (7,8), the substitution of 790 threonine for methionine (T790M). However, the mechanism of acquired resistance in the remaining tumors is unclear. EGFR mutant tumors specifically utilize ERBB3 to activate PI3K / Akt signaling, and downregulation of the ERBB3 / PI3K / Akt signaling pathway is required for gefitinib to induce apoptosis in EGFR mutant NSCLC It has been shown (9, 10). In particular, it has also been shown that sustained ERBB3 phosphorylation causes gefitinib resistance in ERBB2-amplified breast cancer cells (11).

ゲフィチニブ耐性のさらなる機構を探求するために、ゲフィチニブ高感受性（ＩＣ５０ １０ｎＭ）ＥＧＦＲエクソン１９欠失（Ｅ７４６〜Ａ７５０欠失）変異ＮＳＣＬＣ細胞株、ＨＣＣ８２７の耐性クローンを、ゲフィチニブ濃度を増加させながら細胞を６カ月曝露させることによって作製した。得られた細胞株ＨＣＣ８２７ＧＲ（Ｇｅｆｔｉｎｉｂ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ（ゲフィチニブ耐性））および単一細胞から単離した６個のクローンは、インビトロでゲフィチニブ耐性であった（ＩＣ５０＞１０μＭ。図１Ａ）。親細胞株の場合とは異なり、ＧＲ細胞においてＥＲＢＢ３およびＡｋｔのリン酸化はゲフィチニブ存在下で維持された（図１Ｂ）。この観察結果はＥＧＦＲの二次変異によるものであったのかを確認するため、６個すべてのＧＲクローンのＥＧＦＲの全コード領域を配列決定したところ、既知のエクソン１９の欠失変異が明らかになった。しかしながら、Ｔ７９０Ｍ変異は検出されなかった。加えて、１％の頻度でも遺伝子変異を検出可能な高感度酵素法（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標））を使用して、６個すべてのＨＣＣ８２７ＧＲクローンのＥＧＦＲの全コード領域における変化を検査した（１２）。ＨＣＣ８２７親細胞株との差異は検出されなかった。さらに、Ｔ７９０Ｍ変異を保有するＮＳＣＬＣ細胞株の成長を阻害できる不可逆的阻害剤ＣＬ−３８７，７８５は、ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞株の成長を抑制しなかった（１３）。 In order to explore further mechanisms of gefitinib resistance, gefitinib hypersensitive (IC 50 10 nM) EGFR exon 19 deletion (E746-A750 deletion) mutant NSCLC cell line, HCC827 resistant clones, were tested while increasing gefitinib concentrations. Made by 6 months exposure. The resulting cell line HCC827GR (Geftinib Resistant) and 6 clones isolated from single cells were gefitinib resistant in vitro (IC 50 > 10 μM, FIG. 1A). Unlike the parental cell line, phosphorylation of ERBB3 and Akt was maintained in the presence of gefitinib in GR cells (FIG. 1B). To confirm whether this observation was due to a secondary mutation in EGFR, sequencing of all EGFR coding regions of all six GR clones revealed a known exon 19 deletion mutation. It was. However, the T790M mutation was not detected. In addition, a change in all EGFR coding regions of all six HCC827GR clones was examined using a sensitive enzyme method (Surveyor ™) capable of detecting genetic mutations with a frequency of 1% (12). No difference from the HCC827 parental cell line was detected. Furthermore, the irreversible inhibitor CL-387,785, which can inhibit the growth of NSCLC cell lines carrying the T790M mutation, did not suppress the growth of the HCC827GR cell line (13).

別の受容体の異常活性化が、観察された耐性を仲介しているかどうかを確認するために、ホスホ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）アレイ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ８２７ＧＲ５細胞の４２個の異なるリン酸化ＲＴＫパネルに対するゲフィチニブの効果を比較した（図１Ｃ）。ＨＣＣ８２７細胞株において、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ２およびＭＥＴはすべてリン酸化されており、これは１μＭのゲフィチニブ処理後に完全にまたは顕著に低下した。対照的にＨＣＣ８２７ＧＲ細胞において、ゲフィチニブ存在下であってもＭＥＴの顕著なリン酸化、ならびにＥＲＢＢ３およびＥＧＦＲの持続的なリン酸化が認められた（図１Ｃ）。耐性の背景にある機構をさらに探求するために、本発明者らはＨＣＣ８２７ＧＲ細胞株のゲノムワイドなコピー数解析を行い、Ｈｕｍａｎ Ｍａｐｐｉｎｇ ２５０Ｋ Ｓｔｙ一塩基多型（ＳＮＰ）アレイを使用してそれらをＨＣＣ８２７親細胞と比較した（図１Ｄ）。耐性細胞株において、親細胞株には存在しなかった７番染色体長腕（７ｇ３１．１〜７ｇ３３．３を包含している）における著しい限局的な増幅が検出された。この領域はＭＥＴ癌原遺伝子を含有する（図１Ｅ）。定量ＰＣＲを使用して、ＨＣＣ８２７親細胞株と比較してすべてのＨＣＣ８２７耐性細胞株においてＭＥＴが５〜１０倍増幅されたことを確認した（図６）。ｍＲＮＡ発現プロファイリングを使用して、本発明者らはさらにＧＲおよび親細胞株におけるｍＲＮＡ発現プロファイルを比較した（図８）。ＧＲ細胞において最も特異に過剰発現された２０個の配列のうち、ＭＥＴ自体は３回出現した。６個すべてのＨＣＣ８２７ＧＲクローンのＭＥＴの全コード領域を配列決定したが、ＭＥＴ変異は検出されなかった。総合すると、これらの結果はＭＥＴ増幅がＭＥＴ発現の増加を引き起こし、これがＨＣＣ８２７ＧＲ細胞株におけるゲフィチニブ存在下でのＭＥＴ、ＥＧＦＲおよびＥＲＢＢ３のリン酸化、およびインビトロでのゲフィチニブ耐性に関連することを示唆する。   To ascertain whether abnormal activation of another receptor mediates the observed resistance, a phosphoreceptor tyrosine kinase (RTK) array (R & D systems) was used to detect 42 of HCC827 and HCC827GR5 cells. The effect of gefitinib on different phosphorylated RTK panels was compared (FIG. 1C). In the HCC827 cell line, EGFR, ERBB3, ERBB2 and MET were all phosphorylated, which was completely or significantly reduced after treatment with 1 μM gefitinib. In contrast, in HCC827GR cells, significant phosphorylation of MET and persistent phosphorylation of ERBB3 and EGFR were observed even in the presence of gefitinib (FIG. 1C). To further explore the mechanism behind resistance, we performed a genome-wide copy number analysis of the HCC827GR cell line and used a Human Mapping 250K Sty single nucleotide polymorphism (SNP) array to identify them. Compared to parental cells (FIG. 1D). In the resistant cell line, significant localized amplification in the long arm of chromosome 7 (including 7g31.1 to 7g33.3) that was not present in the parental cell line was detected. This region contains the MET proto-oncogene (FIG. 1E). Quantitative PCR was used to confirm that MET was amplified 5-10 fold in all HCC827 resistant cell lines compared to the HCC827 parental cell line (FIG. 6). Using mRNA expression profiling, we further compared mRNA expression profiles in GR and parental cell lines (FIG. 8). Of the 20 sequences most specifically overexpressed in GR cells, MET itself appeared three times. The entire coding region of MET of all 6 HCC827GR clones was sequenced, but no MET mutation was detected. Taken together, these results suggest that MET amplification causes an increase in MET expression, which is associated with phosphorylation of MET, EGFR and ERBB3 in the presence of gefitinib in the HCC827GR cell line, and gefitinib resistance in vitro.

ＭＥＴシグナル伝達の増加がゲフィチニブ耐性獲得を引き起こすかどうかを確認するため、ＭＥＴ阻害がＨＣＣ８２７ＧＲ細胞の成長を抑制するかどうかを調べた。ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞をＭＥＴチロシンキナーゼ阻害剤であるＰＨＡ−６６５，７５２に単独で、またはゲフィチニブと組み合わせて曝露させた（１４）。ＨＣＣ８２７ＧＲ５細胞はゲフィチニブおよびＰＨＡ−６６５，７５２単独の両方に耐性であったが、組み合わせると、両薬物の濃度＞３３ｎＭで、顕著なアポトーシスを伴って（図７）８５％を超える成長阻害が認められた（図２Ａ）。他のすべてのＨＣＣ８２７ＧＲクローンで同様の結果が観察された。次に、耐性細胞においてＥＧＦＲシグナル伝達に対するゲフィチニブおよびＰＨＡ−６６５，７５２の効果を調べた。ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞株において、親細胞の場合とは異なり、ゲフィチニブは単独でＥＧＦＲのリン酸化を低下させるが完全には阻害できず、ｐ−ＥＲＢＢ３またはｐ−Ａｋｔに対する効果は最小であった。しかしながら、ＰＨＡ−６６５，７５２と組み合わせると、ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞株におけるＥＲＢＢ３およびＡｋｔリン酸化は完全に抑制される。注目すべきは、ゲフィチニブ処理で観察された残りのＥＧＦＲリン酸化もまた、ＰＨＡ−６６５，７５２の添加により除去され、前述のように残りのＥＧＦＲリン酸化がＭＥＴキナーゼ活性に起因していたことを示唆した（１５）。ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞においてＰＩ３ＫＩＡｋｔが活性化された機構をより正確に定義するために、ＰＩ３Ｋのｐ８５調節サブユニットを免疫沈降し、共沈したタンパク質を分析した。ＨＣＣ８２７親細胞株において、２つの主要なホスホチロシンタンパク質、ＥｒｂＢ３および既知のＭＥＴアダプタータンパク質である成長因子受容体結合タンパク質２（Ｇｒｂ２）結合バインダー１（Ｇａｂ１）がｐ８５と共沈する（図２Ｃ）（１６）。どちらの相互作用もゲフィチニブ存在下で妨害された。対照的に、ＥｒｂＢ３およびＧａｂ１はともに、ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞においてゲフィチニブ単独の存在下でｐ８５とやはり共沈したが、これらの相互作用はゲフィチニブおよびＰＨＡ−６６５，７５２の両方の存在下で完全に妨害された（図２Ｃ）。これらの観察結果は細胞抽出物において観察されたホスホＥＲＢＢ３の消失と一致し、ＭＥＴがＥＧＦＲキナーゼ活性に関係なくＥＲＢＢ３活性化を誘発できることを示唆する。ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞をＰＨＡ−６６５，７５２単独で処理すると、Ｇａｂ１のｐ８５との結合を妨げるがｐ−Ａｋｔレベルに対する効果は最小であり（図２Ｂおよび２Ｃ）、その結果、これらのゲフィチニブ耐性細胞株においてＧａｂ１のＰＩ３Ｋとの結合はＡｋｔリン酸化に必要ないことを示す。重要なことには、ＭＥＴの２つの異なる領域に対するショートヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡを使用してＭＥＴを下方制御すると、ＨＣＣ８２７ＧＲのゲフィチニブに対する感受性もまた回復する（図２Ｄ）（１７）。さらに、ＭＥＴ特異的ｓｈＲＮＡは２つともＭＥＴをＨＣＣ８２７親細胞株に見られるレベル（図２Ｂ参照）まで下方制御し、これらの細胞株においてＥＲＢＢ３およびＡｋｔリン酸化の両方を下方制御するゲフィチニブの能力を回復させた。総合すると、これらの結果はＭＥＴ増幅がＥＲＢＢ３リン酸化を維持することによってゲフィチニブ存在下でＰＩ３ＫＩＡｋｔシグナル伝達の持続的な活性化を引き起こすことを示唆する。   In order to confirm whether an increase in MET signaling causes gefitinib resistance acquisition, it was examined whether MET inhibition suppresses the growth of HCC827GR cells. HCC827GR cells were exposed to the MET tyrosine kinase inhibitor PHA-665,752 alone or in combination with gefitinib (14). HCC827GR5 cells were resistant to both gefitinib and PHA-665,752 alone, but when combined, growth inhibition greater than 85% was observed with significant apoptosis at both drug concentrations> 33 nM (FIG. 7). (FIG. 2A). Similar results were observed with all other HCC827GR clones. Next, the effect of gefitinib and PHA-665,752 on EGFR signaling in resistant cells was examined. In the HCC827GR cell line, unlike the parental cells, gefitinib alone decreased EGFR phosphorylation but could not be completely inhibited, with minimal effect on p-ERBB3 or p-Akt. However, when combined with PHA-665,752, ERBB3 and Akt phosphorylation in the HCC827GR cell line is completely suppressed. Of note, the remaining EGFR phosphorylation observed with gefitinib treatment was also removed by the addition of PHA-665,752, and the remaining EGFR phosphorylation was due to MET kinase activity as described above. Suggested (15). To more precisely define the mechanism by which PI3KIAkt was activated in HCC827GR cells, the p85 regulatory subunit of PI3K was immunoprecipitated and the coprecipitated protein was analyzed. In the HCC827 parental cell line, two major phosphotyrosine proteins, ErbB3, and a known MET adapter protein, growth factor receptor binding protein 2 (Grb2) binding binder 1 (Gab1) co-precipitate with p85 (FIG. 2C) (16 ). Both interactions were disrupted in the presence of gefitinib. In contrast, both ErbB3 and Gab1 were also co-precipitated with p85 in the presence of gefitinib alone in HCC827GR cells, but these interactions were completely blocked in the presence of both gefitinib and PHA-665,752. (FIG. 2C). These observations are consistent with the disappearance of phosphoERBB3 observed in cell extracts, suggesting that MET can induce ERBB3 activation regardless of EGFR kinase activity. Treatment of HCC827GR cells with PHA-665,752 alone prevents Gab1 binding to p85 but has minimal effect on p-Akt levels (FIGS. 2B and 2C), resulting in Gab1 in these gefitinib resistant cell lines. This indicates that the binding of PI3K is not required for Akt phosphorylation. Importantly, down-regulating MET using short hairpin (sh) RNA for two different regions of MET also restores the sensitivity of HCC827GR to gefitinib (FIG. 2D) (17). Furthermore, both MET-specific shRNAs downregulate MET to the level found in the HCC827 parental cell line (see FIG. 2B), and the ability of gefitinib to downregulate both ERBB3 and Akt phosphorylation in these cell lines. It was recovered. Taken together, these results suggest that MET amplification causes sustained activation of PI3KIAkt signaling in the presence of gefitinib by maintaining ERBB3 phosphorylation.

ＭＥＴ増幅およびそのＰＨＡ−６６５，７５２に対するインビトロ感受性との関連が、胃癌細胞株において最近報告された（１８）。したがって、ＭＥＴ増幅を有する他の細胞株もまたＥＲＢＢ３を利用してＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達を活性化するかどうかを確認した。ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞と同様に、Ｈ１９９３ＮＳＣＬＣ細胞においてならびにＳＮＵ６３８およびＭＫＮ４５胃癌細胞においてＥＲＢＢ３はｐ８５と結合することがわかった。この結合はＰＨＡ−６６５，７５２によって妨害されたが、ゲフィチニブ、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ２二重阻害剤ラパチニブによってまたはＣＬ−３８７，７８５によって妨害されなかった（図３Ａ）。したがって、ＭＥＴはＥＧＦＲおよびＥＲＢＢ２非依存的にＥＲＢＢ３リン酸化およびＰＩ３Ｋとの結合を引き起こす。同様にＥＲＢＢ３およびＡｋｔリン酸化はＰＨＡ−６６５，７５２のみに阻害された（図３Ａ）。加えて、ＥＲＢＢ３はＳＮＵ６３８細胞において、レンチウイルスを用いてこれらの細胞をＥＲＢＢ３特異的ｓｈＲＮＡに感染させ、顕著なｐ−Ａｋｔの減少（図３Ｂ）および成長阻害（図３Ｃ）を引き起こすことによって下方制御された。これらの検討を総合すると、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ活性化の機構としてＥＲＢＢ３がＭＥＴ依存的にチロシンリン酸化されるというＨＣＣ８２７ＧＲ細胞での観察結果は、他のＭＥＴ増幅細胞において一般化可能であることが示唆される。   MET amplification and its association with in vitro sensitivity to PHA-665,752 has recently been reported in gastric cancer cell lines (18). Therefore, it was confirmed whether other cell lines with MET amplification also utilize ERBB3 to activate PI3K / Akt signaling. Similar to HCC827GR cells, ERBB3 was found to bind to p85 in H1993 NSCLC cells and in SNU638 and MKN45 gastric cancer cells. This binding was blocked by PHA-665,752, but not by gefitinib, the EGFR / ERBB2 dual inhibitor lapatinib or by CL-387,785 (FIG. 3A). Therefore, MET causes ERBB3 phosphorylation and binding to PI3K in an EGFR and ERBB2 independent manner. Similarly, ERBB3 and Akt phosphorylation was inhibited only by PHA-665,752 (FIG. 3A). In addition, ERBB3 is downregulated in SNU638 cells by infecting these cells with ERBB3-specific shRNA using lentivirus, causing significant p-Akt reduction (FIG. 3B) and growth inhibition (FIG. 3C). It was done. Taken together, these findings suggest that ERBB3 is tyrosine phosphorylated in a MET-dependent manner as a mechanism of PI3K / Akt activation and can be generalized in other MET-amplified cells. The

そこで、ＭＥＴが直接ＥＲＢＢ３リン酸化を引き起こすことができるかどうかを確認した。検出可能なレベルのＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２またはＥＲＢＢ３を通常発現しないチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、ＥＲＢＢ３を単独でまたはＭＥＴと組み合わせて発現させた。ＭＥＴおよびＥＲＢＢ３を共発現しているＣＨＯ細胞において顕著なＥＲＢＢ３リン酸化が認められ、これはＰＨＡ−６６５，７５２によって妨げられたが、高用量のゲフィチニブ、ラパチニブまたはＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤ＰＰ２には妨げられなかった（図３Ｄ）。これらの細胞において、チロシンリン酸化ＥＲＢＢ３はＭＥＴキナーゼ依存的にｐ８５と共免疫沈降した（図３Ｅ）。また、ＣＨＯ細胞からのＥＲＢＢ３およびＭＥＴの共沈も観察された（図３Ｅおよび３Ｆ）。総合すると、これらの結果により、非ＥＲＢＢまたはＳＲＣ依存的にＭＥＴがＥＲＢＢ３と結合でき、ＥＲＢＢ３リン酸化およびＰＩ３Ｋとの結合を促進できることが示唆される。   Therefore, it was confirmed whether MET can directly cause ERBB3 phosphorylation. ERBB3 was expressed alone or in combination with MET in Chinese hamster ovary (CHO) cells that do not normally express detectable levels of EGFR, ERBB2 or ERBB3. Significant ERBB3 phosphorylation was observed in CHO cells co-expressing MET and ERBB3, which was prevented by PHA-665,752, but not by high doses of gefitinib, lapatinib or the SRC family kinase inhibitor PP2. Not (FIG. 3D). In these cells, tyrosine phosphorylated ERBB3 co-immunoprecipitated with p85 in a MET kinase dependent manner (FIG. 3E). Co-precipitation of ERBB3 and MET from CHO cells was also observed (FIGS. 3E and 3F). Taken together, these results suggest that MET can bind to ERBB3 in a non-ERBB or SRC-dependent manner and can promote ERBB3 phosphorylation and PI3K binding.

次に、ゲフィチニブ耐性を獲得したＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣ患者においてＭＥＴ増幅が起こり得るかどうかを調べた。全員が最初ゲフィチニブおよびエルロチニブに対して部分反応を得たが、その後ゲフィチニブまたはエルロチニブを受けている間に癌が成長した、１８人の患者を分析した。ＭＥＴ遺伝子座の定量ＰＣＲ（ｎ＝１１、腫瘍由来ＤＮＡのみが入手可能だった場合）または蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ、ｎ＝７、腫瘍切片が入手可能だった場合）の両方を使用した。８人の患者において、ゲフィチニブ耐性の発生前後の腫瘍切片対が入手可能であったが、１０人の患者においてはゲフィチニブおよびエルロチニブに対する臨床的耐性の後にのみ切片が入手可能であった（図５および図９）。サンプル対のある８人の患者のうち、ＭＥＴ増幅は２個の処置後の切片に検出されたが、処置前の切片には存在しなかった。患者１において、処置後切片のＭＥＴ増幅は、ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞株に見られた増幅レベルと同様であった（図５および６）。加えて、処置後切片のみが入手可能であった別の２人の患者（患者１２および１３）においてもＭＥＴ増幅が検出された。全体としてＭＥＴ増幅はゲフィチニブ／エルロチニブ耐性腫瘍切片の４／１８（２２％）に検出された。重要なことには、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ変異を有さない３個の切片において、およびＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ同時変異を有する１個の切片においてＭＥＴ増幅が観察された。興味深いことに、患者１２はＥＧＦＲ Ｔ７９０ＭおよびＭＥＴ増幅の両方を有していたが、それぞれの耐性様式は２つの異なる再発部位で別々に起こった。これらの結果は、ゲフィチニブ耐性を有するＮＳＣＬＣ患者においてＭＥＴ増幅が検出可能であることを示唆する。さらに、多数の耐性機構が同じ患者において同時に起こり得る。   Next, it was investigated whether MET amplification could occur in EGFR mutant NSCLC patients who acquired gefitinib resistance. All 18 patients who first had a partial response to gefitinib and erlotinib but subsequently analyzed 18 patients whose cancers grew while receiving gefitinib or erlotinib. Both quantitative PCR at the MET locus (n = 11, when only tumor-derived DNA was available) or fluorescence in situ hybridization (FISH, n = 7, when tumor sections were available) were used. In 8 patients, pairs of tumor sections before and after the development of gefitinib resistance were available, but in 10 patients, sections were only available after clinical resistance to gefitinib and erlotinib (Figure 5 and FIG. 9). Of the 8 patients with sample pairs, MET amplification was detected in 2 post-treatment sections but not in pre-treatment sections. In patient 1, post-treatment section MET amplification was similar to the level of amplification seen in the HCC827GR cell line (FIGS. 5 and 6). In addition, MET amplification was detected in another two patients (patients 12 and 13) where only post-treatment sections were available. Overall, MET amplification was detected in 4/18 (22%) of gefitinib / erlotinib resistant tumor sections. Importantly, MET amplification was observed in three sections without the EGFR T790M mutation and in one section with the EGFR T790M co-mutation. Interestingly, patient 12 had both EGFR T790M and MET amplification, but each resistance mode occurred separately at two different sites of relapse. These results suggest that MET amplification is detectable in NSCLC patients with gefitinib resistance. Furthermore, multiple resistance mechanisms can occur simultaneously in the same patient.

方法
細胞培養および試薬
ＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣ細胞株ＨＣＣ８２７（Ｅ７４６〜Ａ７５０欠失）、Ｈ３２５５（Ｌ８５８Ｒ）およびＨ３２５５ＧＲを本研究において使用し、広範に特徴づけた（３、３０〜３１、１０）。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から１１１９９３およびＢＴ４７４細胞を入手した。ＳＮＵ−６３８およびＭＫＮ−４５胃癌細胞はＷｏｎ Ｋｉ Ｋａｎｇ博士（Ｓａｍｓｕｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）から入手し、以前に特徴づけられている（１８、３２）。ＨＣＣ８２７、Ｈ１９９３ ＳＮＵ−６３８およびＭＫＮ−４５細胞株は、１０％ＦＢＳ（ＭＫＮ−４５には２０％）、１００単位／ｍＬペニシリン、１００単位／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭグルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＣＡ）中に維持した。１１３２５５およびＨ３２５５ＧＲは、５％ＦＢＳ、１００単位／ｍＬペニシリン、１００単位／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭグルタミンを添加したＡＣＬ−４培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中に維持した。 Methods Cell culture and reagents EGFR mutant NSCLC cell lines HCC827 (E746-A750 deletion), H3255 (L858R) and H3255GR were used and extensively characterized in this study (3, 30-31, 10). 111993 and BT474 cells were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Va.). SNU-638 and MKN-45 gastric cancer cells were obtained from Dr. Won Ki Kang (Samsung Medical Center, Seoul, Korea) and have been previously characterized (18, 32). HCC827, H1993 SNU-638 and MKN-45 cell lines are RPMI 1640 (Cellgro, Mediatech Inc.) supplemented with 10% FBS (20% for MKN-45), 100 units / mL penicillin, 100 units / mL streptomycin and 2 mM glutamine. , Herndon, CA). 113255 and H3255GR were maintained in ACL-4 medium (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) supplemented with 5% FBS, 100 units / mL penicillin, 100 units / mL streptomycin and 2 mM glutamine.

ゲフィチニブは商業的供給源から入手し、酢酸エチル抽出によって精製した。得られた生成物を液体クロマトグラフィーおよび質量分析法によって確認した。ラパチニブはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｕｓｔｏｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。Ｃｌ−３８７，７８５はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。ＰＨＡ−６６５，７５２はＰｆｉｚｅｒのギフトであった。すべての薬物のストック溶液をＤＭＳＯで調製し、−２０℃で保存した。   Gefitinib was obtained from a commercial source and purified by ethyl acetate extraction. The resulting product was confirmed by liquid chromatography and mass spectrometry. Lapatinib was purchased from American Custom Chemical Corporation (San Diego, Calif.). Cl-387,785 was purchased from Calbiochem. PHA-665,752 was a Pfizer gift. All drug stock solutions were prepared in DMSO and stored at -20 ° C.

細胞増殖および成長アッセイ
成長および成長阻害をＭＴＳアッセイにより評価した。生存細胞の数を測定するための比色法であるこのアッセイは、細胞による３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）から、細胞培養培地に可溶で分光光度法により検出できるホルマザン生成物への生物還元に基づいており、以前に確立された方法に従って行った（３、３１、１０）。 Cell proliferation and growth assay Growth and growth inhibition were assessed by MTS assay. This assay, which is a colorimetric method for measuring the number of viable cells, is based on 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4- Based on bioreduction from sulfophenyl) -2H-tetrazolium (MTS) to a formazan product that is soluble in cell culture medium and detectable spectrophotometrically and was performed according to previously established methods (3, 31 10).

細胞は７２時間処理に曝露させ、実験毎に使用した細胞数は経験的に測定し、事前に確立されている（３１）。すべての実験点を６〜１２個のウェルに設定し、すべての実験を少なくとも３回繰り返した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン３．００ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ワールドワイドウェブのｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）を使用して、データを図で示した。非線形回帰モデルを使用してＳ字状の用量反応に曲線を適合させた。   Cells are exposed to treatment for 72 hours and the number of cells used per experiment is empirically determined and established in advance (31). All experimental points were set in 6-12 wells and all experiments were repeated at least 3 times. Data was graphically represented using GraphPad Prism version 3.00 for Windows (GraphPad Software, graphpad.com on the World Wide Web). A curve was fitted to a sigmoidal dose response using a non-linear regression model.

抗体およびウェスタンブロット法
以前に指定された条件下で増殖させた細胞を次の溶解緩衝液中で溶解した：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０／１０％グリセロール／１ｍＭ ＥＤＴＡ／１ｍＭ ＥＧＴＡ／５ｍＭピロリン酸ナトリウム／５０ｍＭ ＮａＦ／１０ｎＭ（３−グリセロホスフェート／１ｍＭバナジウム酸ナトリウム／０．５ｍＭ ＤＴＴ／４μｇロイペプチン／４μｇ／ｍｌペプスタチン／４μｇ／ｍｌアポタンパク質／１ｍＭ ＰＭＳＦ。細胞溶解後、溶解産物を１６，０００×ｇで５分間、４℃で遠心分離した。上清を次の手順に使用した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動による分離の後にウェスタンブロット解析を行い、ニトロセルロース膜に移した。抗体メーカーの推奨に従って免疫ブロット法を行った。高感度化学発光システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．）を使用して抗体結合を検出した。 Antibodies and Western Blot Cells previously grown under specified conditions were lysed in the following lysis buffer: 20 mM Tris, pH 7.4 / 150 mM NaCl / 1% Nonidet P-40 / 10% glycerol / 1 mM. EDTA / 1 mM EGTA / 5 mM sodium pyrophosphate / 50 mM NaF / 10 nM (3-glycerophosphate / 1 mM sodium vanadate / 0.5 mM DTT / 4 μg leupeptin / 4 μg / ml pepstatin / 4 μg / ml apoprotein / 1 mM PMSF. After cell lysis The lysate was centrifuged at 16,000 × g for 5 minutes at 4 ° C. The supernatant was used in the following procedure: Western blot analysis was performed after separation by SDS / PAGE electrophoresis and transferred to a nitrocellulose membrane. Follow antibody manufacturer's recommendations Immunoblotting was performed. Antibody binding was detected using the enhanced chemiluminescence system (New England Nuclear Life Science Products Inc.).

抗ホスホＡｋｔ（Ｓｅｒ−４７３）、抗トータルＡｋｔ、抗ＥＧＦＲ、および抗ホスホＥｒｂＢ−３（Ｔｙｒ−１２８９）抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。抗ＥｒｂＢ−３抗体はＬａｂ Ｖｉｓｉｏｎから入手した。ホスホ特異的ＥＧＦＲ（ｐＹ１０６８）、ＭＥＴ（ｐＹ１２３４／１２３５）、トータルＥＲＫ１／２、ホスホＥＲＫ１／２（ｐＴ１８５／ｐＹ１８７）抗体はＢｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．から購入した。抗ｐ８５抗体はＵｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。トータルＭｅｔ（Ｃ−２８）抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から購入した。   Anti-phospho Akt (Ser-473), anti-total Akt, anti-EGFR, and anti-phospho ErbB-3 (Tyr-1289) antibodies were obtained from Cell Signaling Technology. Anti-ErbB-3 antibody was obtained from Lab Vision. Phospho-specific EGFR (pY1068), MET (pY1234 / 1235), total ERK1 / 2, phosphoERK1 / 2 (pT185 / pY187) antibodies are available from Biosource International Inc. Purchased from. Anti-p85 antibody was obtained from Upstate Biotechnology. Total Met (C-28) antibody was purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

インビトロゲフィチニブ耐性ＨＣＣ８２７の作製
耐性細胞株を作製するために、Ｈ３２５５を使用して本発明者らが以前に記載した方法と同様に、ゲフィチニブ濃度を増加させながらＨＣＣ８２７細胞を曝露させた（１０）。細胞が未処理の親細胞と同様な増殖動態を回復したときに、ゲフィチニブ濃度を１〜１００ｎＭまで段階的に増加させた。１００ｎＭのゲフィチニブ中で増殖可能であった細胞を、最初の薬物曝露から６カ月後に得た。耐性クローンの出現を確認するため、細胞を薬物のない状態で少なくとも４日間増殖させた後に各濃度で増殖後、ＭＴＳアッセイを行った。耐性ＨＣＣ８２７細胞はゲフィチニブ非存在下で１７回継代され、ＭＴＳで確認されたように耐性を維持した。６個の個々のクローン（ＨＣＣ８２７ＧＲ１、ＧＲ２、ＧＲ５、ＧＲ６、ＧＲ７およびＧＲ８）を単離し、すべてがゲフィチニブ耐性であることを個別に確認した。ＨＣＣ８２７細胞をゲフィチニブを用いずに維持し、そのゲフィチニブ感受性を５継代毎に検査した。期間中、親細胞株においてゲフィチニブ感受性に顕著な変化はなかった。 Generation of in vitro gefitinib-resistant HCC827 To generate a resistant cell line, H3255 was used to expose HCC827 cells with increasing gefitinib concentrations, similar to the method previously described by the inventors (10). When the cells restored growth kinetics similar to the untreated parental cells, the gefitinib concentration was increased stepwise from 1 to 100 nM. Cells that were able to grow in 100 nM gefitinib were obtained 6 months after the first drug exposure. To confirm the emergence of resistant clones, cells were grown for at least 4 days in the absence of drug and then grown at each concentration and then MTS assay was performed. Resistant HCC827 cells were passaged 17 times in the absence of gefitinib and maintained resistance as confirmed by MTS. Six individual clones (HCC827GR1, GR2, GR5, GR6, GR7 and GR8) were isolated and individually confirmed to be resistant to gefitinib. HCC827 cells were maintained without gefitinib and their gefitinib sensitivity was tested every 5 passages. During the period, there was no significant change in gefitinib sensitivity in the parent cell line.

ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）分析
ＨＣＣ８２７ＧＲクローンのＥＧＦＲ全コード領域を、以前に記載された高感度遺伝子スキャニング法の改良法を使用して遺伝子変化について調べた（１０、１２）。ＥＧＦＲ全コード領域を包含する７個のオーバーラップしたｃＤＮＡセグメントを作製し、以前に記載されたように分析した（１２）。ＰＣＲプライマーは要求に応じて入手可能である。 SURVEYOR ™ Analysis The entire EGFR coding region of the HCC827GR clone was examined for genetic alterations using a modification of the previously described sensitive gene scanning method (10, 12). Seven overlapping cDNA segments encompassing the entire EGFR coding region were generated and analyzed as previously described (12). PCR primers are available upon request.

細胞株のｃＤＮＡ配列決定
Ｔｒｉｚｏｌ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して細胞株から全ＲＮＡを単離し、ＲＮｅａｓｙ（商標）ミニエリュートクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製した。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、２μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを転写した。このｃＤＮＡをその後のＥＧＦＲおよびＭＥＴのＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。ＰＣＲ条件およびプライマーの詳細は以前に公表されている（３、１７）。 Cell Line cDNA Sequencing Isolate total RNA from cell lines using Trizol ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) and use RNeasy ™ Mini Elut Cleanup Kit (Qiagen, Valencia, CA) Purified. CDNA was transcribed from 2 μg of total RNA using Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen Life technologies, Carlsbad, Calif.). This cDNA was used as a template for subsequent EGFR and MET PCR amplification. Details of PCR conditions and primers have been published previously (3, 17).

ＭＥＴｓｈＲＮＡコンストラクトおよびレンチウイルス感染
ｐＬＫＯ．１ｐｕｒｏベクターでクローニングしたＭＥＴｓｈＲＮＡコンストラクトは、Ｈａｒｖａｒｄ ＲＮＡｉコンソーシアムから入手し、以前に特徴づけられている（１０、１７）。各コンストラクトは、ＭＥＴの異なる領域を標的とする２１ｂｐの配列、ヌクレオチド６個のヘアピン配列（ＣＴＣＧＡＧ）、および２１ｂｐの相補鎖配列を含有していた。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含有するベクターを対照として使用した。特異的ｓｈＲＮＡ配列は要求に応じて入手可能である。レンチウイルス産生および感染は以前に記載されたように行った（１０）。 METshRNA constructs and lentiviral infection pLKO. The METshRNA construct cloned in the 1 puro vector was obtained from the Harvard RNAi consortium and has been characterized previously (10, 17). Each construct contained a 21 bp sequence targeting a different region of MET, a 6 nucleotide hairpin sequence (CTCGAG), and a 21 bp complementary strand sequence. A vector containing green fluorescent protein (GFP) was used as a control. Specific shRNA sequences are available upon request. Lentiviral production and infection were performed as previously described (10).

ＳＮＰおよび発現解析
ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ８２７ＧＲ細胞を、培地および前述の収集した全ＲＮＡを含有する血清中で、細胞を供給後６時間、６０％コンフルエンスまで平板培養した。その後、ＲＮＡ標本を処理し、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＨＧＵ１３３Ａマイクロアレイにハイブリダイズさせ、スキャンした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐソフトウェアを使用して各遺伝子の発現値を計算し、ｄＣｈｉｐソフトウェア（ワールドワイドウェブのｂｉｏｓｕｎ１．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｃｏｍｐｌａｂ／ｄｃｈｉｐ／）を使用してデータを解析した。 SNP and expression analysis HCC827 and HCC827GR cells were plated to 60% confluence 6 hours after feeding in cells and serum containing the total RNA collected as described above. The RNA samples were then processed and hybridized to Affymetrix HGU133A microarray and scanned. The expression value of each gene was calculated using Affymetrix GeneChip software, and data was analyzed using dChip software (biosun1.harvard.edu/complab/dchip/ on the World Wide Web).

ＤＮｅａｓｙ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用してＨＣＣ８２７およびＨＣＣ８２７ＧＲ細胞からゲノムＤＮＡを単離した。メーカーの使用説明書（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍａｐｐｉｎｇ ５００Ｋ Ａｓｓａｙ Ｍａｎｕａｌ、ただし、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈサーモサイクラーを「Ｂｌｏｃｋ」モードに設定し、すべての変性サイクルを９２℃で行った）に従って、Ｈｕｍａｎ Ｍａｐｐｉｎｇ２５０Ｋ Ｓｔｙ一塩基多型（ＳＮＰ）アレイ用にサンプルを処理し、各サンプルにつき４回のＰＣＲ反応を行い、１２０μｇのＰＣＲ産物を断片化し、標識し、各アレイにハイブリダイズさせた。以前に確立された方法に従ってｄＣｈｉｐソフトウェアを使用して、ＨＣＣ８２７およびＧＲクローンの遺伝子コピー数の差異の比較を行った（３３）。   Genomic DNA was isolated from HCC827 and HCC827GR cells using the DNeasy tissue kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA). Human Mapping250K Sty single nucleotide polymorphism (SNP) according to manufacturer's instructions (Affymetrix Mapping 500K Assay Manual, but with MJ Research thermocycler set to “Block” mode and all denaturation cycles performed at 92 ° C.) Samples were processed for arrays and four PCR reactions were performed for each sample, and 120 μg of PCR product was fragmented, labeled, and hybridized to each array. Comparison of gene copy number differences of HCC827 and GR clones was performed using dChip software according to previously established methods (33).

定量ＰＣＲ
ＰＲＩＳＭ７５００配列検出キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用した定量リアルタイムＰＣＲを使用してＭＥＴの相対的コピー数を測定した。検量線法を使用して、コピー数が正常細胞および癌細胞間でほぼ同じＬｉｎｅ−１反復エレメントである基準に対する細胞株および腫瘍ＤＮＡサンプル中のＭＥＴ遺伝子コピー数を計算した（３３）。正常なヒトゲノムＤＮＡの連続希釈による検量線に基づいて定量した。すべての標本を３回反復して分析した。ＰＣＲプライマーは要求に応じて入手可能である。 Quantitative PCR
Relative copy number of MET was determined using quantitative real-time PCR using PRISM7500 sequence detection kit (Applied Biosystems) and QuantTectSYBR Green PCR Kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA). The standard curve method was used to calculate the MET gene copy number in cell line and tumor DNA samples against a reference where the copy number is approximately the same Line-1 repeat element between normal and cancer cells (33). Quantification was based on a calibration curve from serial dilutions of normal human genomic DNA. All specimens were analyzed in triplicate. PCR primers are available upon request.

異種移植片
Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｂｏｓｔｏｎによる承認を得たプロトコルに基づくＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の基準に従ってインビボ試験にヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ、６〜８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、世話をした。２％Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ（Ｂａｘｔｅｒ）酸素混合物吸入を使用してマウスに麻酔をかけた。５×１０６個のＨＣＣ８２７またはＨＣＣ８２７ＧＲ５肺癌細胞の懸濁液（０．２ｍｌのＰＢＳ中）を各マウスの脇腹の右下四半分に皮下接種した。週に２回、カリパスを使用して腫瘍を測定し、式（長さ×幅２×０．５２）を使用して体積を計算した。毎日、体重および全身状態についてマウスをモニターした。大きさの平均が１０００ｍｍ３に達したときに腫瘍を収集した。 Xenografts Animal Care and Use Committee of the Children's Hospital Boston based protocol approved by Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) , Charles River Laboratories). Mice were anesthetized using 2% Isoflurane (Baxter) oxygen mixture inhalation. A suspension of 5 × 10 6 HCC827 or HCC827GR5 lung cancer cells (in 0.2 ml PBS) was inoculated subcutaneously into the lower right quadrant of each mouse flank. Twice a week, tumors were measured using calipers and volume was calculated using the formula (length x width 2 x 0.52). Mice were monitored daily for body weight and general condition. Tumors were collected when the average size reached 1000 mm 3 .

蛍光インサイチュハイブリダイゼーション
Ｖｙｓｉｓ（Ｄｅｓ Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬ）から購入したＤ７Ｓ５２２プローブおよび７番染色体セントロメアプローブ（ＣＥＰ７）を使用して蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行った。キシレン中で脱パラフィンし、エタノール中で脱水することによって、異種移植片からまたは患者標本から作製した５ミクロン（５ｐｍ）の腫瘍切片を調製した。Ｔｒｉｓ塩基およびＥＤＴＡ（ＴＥ）中に浸漬させ、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で洗浄し、Ｄｉｇｅｓｔ−Ａｌｌ（Ｚｙｍｅｄ）で消化することにより切片を消化した。ホルマリンを使用して切片を固定し、エタノール中で脱水した。切片およびプローブ（Ｄ７Ｓ５２２およびＣＥＰ７）の同時変性を完了し、切片を３７度で２〜３晩ハイブリダイズさせた。Ｔｗｅｅｎ−２０溶液と一緒にクエン酸ナトリウム緩衝液およびリン酸緩衝液を使用してハイブリダイゼーション後の洗浄を行い、ＤＡＰＩ対比染色の上にカバースリップを被せた。Ｄ７Ｓ５２２プローブはＨＣＣ８２７ＧＲ細胞の小さなアンプリコン中に含有される（図１Ｆ）。各腫瘍標本から１００個の細胞を分析し、Ｄ７Ｓ５２２およびＣＥＰ７シグナルの数を定量した。細胞を、（１）ＣＥＰ７と比較してＤ７Ｓ５２２のコピーがさらに＜１、（２）ＣＥＰ７と比較してＤ７Ｓ５２２のコピーがさらに＞２、または（３）ＣＥＰ７と比較してＤ７Ｓ５２２のコピーがさらに＞３、に分類した。 Fluorescence in situ hybridization Fluorescence in situ hybridization (FISH) was performed using the D7S522 probe purchased from Vysis (Des Plaines, IL) and the chromosome 7 centromere probe (CEP7). 5 micron (5 pm) tumor sections made from xenografts or from patient specimens were prepared by deparaffinization in xylene and dehydration in ethanol. Sections were digested by soaking in Tris base and EDTA (TE), washing in phosphate buffer (PBS), and digesting with Digest-All (Zymed). Sections were fixed using formalin and dehydrated in ethanol. Co-denaturation of sections and probes (D7S522 and CEP7) was completed and sections were hybridized at 37 degrees for 2-3 nights. A post-hybridization wash was performed using sodium citrate buffer and phosphate buffer along with Tween-20 solution, and a coverslip was placed over the DAPI counterstain. The D7S522 probe is contained in a small amplicon of HCC827GR cells (FIG. 1F). 100 cells from each tumor specimen were analyzed and the number of D7S522 and CEP7 signals was quantified. Cells were (1) more copies of D7S522 compared to CEP7, (2) more copies of D7S522 compared to CEP7, or (3) more copies of D7S522 compared to CEP7> It was classified into three.

患者
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ Ａｐｐｒｏｖｅｄ ＳｔｕｄｉｅｓのもとでＤａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）、愛知県がんセンター中央病院（名古屋、日本）、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ、Ｃｈｉｎａ）から、およびＢｅｌｌａｒｉａ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂｏｌｏｇｎａ、Ｉｔａｌｙ）から、ゲフィチニブおよびエルロチニブ治療患者の腫瘍切片を入手した。すべての患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。エクソン特異的増幅（エクソン１８〜２１）を使用して、その後サブクローニングおよび直接配列決定法によって、または変性ＨＰＬＣ（ＤＨＰＬＣ）を併用したＳｕｒｖｅｙｏｒ（商標）エンドヌクレアーゼ、分画、および以前に公表された方法（１２、７）を使用した配列決定の使用によって、各標本におけるＥＧＦＲ変異の存在を確認した。ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ変異の検出は、ＤＨＰＬＣを併用したＳｕｒｖｅｙｏｒ（商標）エンドヌクレアーゼを使用して、またはＣｙｃｌｅａｖｅリアルタイムＰＣＲアッセイ（１０、３２、１２）を使用することによって行った。いずれの方法も１〜５％の対立遺伝子頻度でＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ変異を検出することができる。 Under the patient Institutional Review Board Approved Studies, from Dana Faber Cancer Institute / Brigham and Women's Hospital (Boston, MA), Aichi Cancer Center Central Hospital (H Nagoya, Japan, U Tumor sections of gefitinib and erlotinib treated patients were obtained from Bellaria Hospital (Bologna, Italy). Written informed consent was obtained from all patients. Surveyor ™ endonuclease, fractionation, and previously published methods using exon specific amplification (exons 18-21) followed by subcloning and direct sequencing methods or in combination with denaturing HPLC (DHPLC) The presence of EGFR mutations in each specimen was confirmed by the use of sequencing using (12,7). Detection of the EGFR T790M mutation was performed using Surveyor ™ endonuclease in combination with DHPLC or by using Cycle real-time PCR assay (10, 32, 12). Either method can detect the EGFR T790M mutation with an allele frequency of 1-5%.

（実施例２）
ＭＥＴ誘導はＥＧＦＲキナーゼ阻害剤耐性を引き起こす
ＭＥＴのリガンドであるＨＧＦ（肝細胞成長因子）でＨＣＣ８２７細胞を処理することによって、ＭＥＴ活性を誘導した。ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤ゲフィチニブを同時投与した。図１０の左上パネルは、ゲフィチニブ存在下でＨＣＣ８２７細胞を異なる濃度のＨＧＦ（２、１０および５０ｎｇ／ｍｌ）で処理し、ＭＴＳ生存アッセイに供したときに作製した生存曲線を示す。５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦによる処理は顕著に生存の改善を引き起こす。 (Example 2)
MET induction causes EGFR kinase inhibitor resistance MET activity was induced by treating HCC827 cells with HGF (hepatocyte growth factor), a ligand for MET. The EGFR kinase inhibitor gefitinib was co-administered. The upper left panel of FIG. 10 shows the survival curve generated when HCC827 cells were treated with different concentrations of HGF (2, 10 and 50 ng / ml) in the presence of gefitinib and subjected to the MTS survival assay. Treatment with 50 ng / ml HGF significantly improves survival.

図１０の右上パネルは、ゲフィチニブ存在下でＨＣＣ８２７細胞においてＨＧＦがＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ活性化を維持することを示す。ＨＣＣ８２７細胞をゲフィチニブ単独でまたはＨＧＦと一緒に６時間処理し、その後溶解した。溶解産物を規定の抗体を用いてウェスタンブロット分析により分析した。結果は、ＡＫＴタンパク質レベルは比較的一定であったが、ゲフィチニブ（ＴＫＩ）処理によって起こったＡＫＴリン酸化の減少はＨＧＦ処理によって少なくとも部分的に回復したことを示す。   The upper right panel of FIG. 10 shows that HGF maintains PI3K / AKT activation in HCC827 cells in the presence of gefitinib. HCC827 cells were treated with gefitinib alone or with HGF for 6 hours and then lysed. Lysates were analyzed by Western blot analysis using defined antibodies. The results show that although AKT protein levels were relatively constant, the decrease in AKT phosphorylation caused by gefitinib (TKI) treatment was at least partially restored by HGF treatment.

図１０の下パネルは、ＨＧＦおよびゲフィチニブを同時投与した場合の細胞の生存を示す。５０ｔ０Ｋ細胞を１０ｃｍのペトリ皿に接種し、規定の条件で１０日間処理した。ゲフィチニブは１μＭで使用し、ＨＧＦは５０、１０、または２ｎｇ／ｍｌで使用した。次いでプレートをクリスタルバイオレットで染色し、生存細胞を視覚化した。未処理のウェルは最多の生存細胞集団を示し、ゲフィチニブのみで処理した細胞は最多の細胞死を示した。ゲフィチニブ処理された細胞の生存は、ＨＧＦ濃度の増加とともに増加した。   The lower panel of FIG. 10 shows cell survival when HGF and gefitinib were co-administered. 50t0K cells were inoculated into 10 cm Petri dishes and treated for 10 days under defined conditions. Gefitinib was used at 1 μM and HGF was used at 50, 10 or 2 ng / ml. Plates were then stained with crystal violet to visualize viable cells. Untreated wells showed the most viable cell population and cells treated with gefitinib alone showed the most cell death. The survival of gefitinib-treated cells increased with increasing HGF concentration.

総合すると、データは、ＨＣＣ８２７細胞においてリガンドに誘導されるＭＥＴ活性化がＥＧＦＲ ＴＫＩに対する耐性を誘導することを示す。   Taken together, the data show that ligand-induced MET activation induces resistance to EGFR TKI in HCC827 cells.

参考文献   References

均等物
本発明はとりわけ、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を使用する癌治療の方法を提供する。対象発明の特定の実施形態が論じられたが、上記の詳述は例示であって制限するものではない。本明細書の概説によって、本発明の多くの変形形態が当業者に明らかになるであろう。本発明の全範囲は、均等物および明細書の全範囲とともに、前述の変形形態とともに、特許請求の範囲を参照することにより決定されるべきである。 Equivalents The present invention provides, inter alia, methods of cancer treatment using anti-ErbB therapeutics and anti-MET therapeutics. While specific embodiments of the subject invention have been discussed, the above detailed description is illustrative and not restrictive. Many variations of the present invention will become apparent to those skilled in the art upon review of this specification. The full scope of the invention should be determined by reference to the claims, along with their full scope of equivalents and the specification, along with the variations described above.

参照による組み込み
本明細書で述べられたすべての刊行物および特許は、以下に記載の項目を含めて、個々の刊行物または特許が具体的および個々に参照により組み込まれることを示すように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書中の任意の定義を含む本出願が支配する。 INCORPORATION BY REFERENCE All publications and patents mentioned in this specification are referenced to indicate that each publication or patent is specifically and individually incorporated by reference, including the items set forth below. Is incorporated herein in its entirety. In case of conflict, the present application, including any definitions herein, will control.

Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）（ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）および／またはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）（ｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）により維持されているものなどの公開データベース中のエントリに関連するアクセション番号を参照する任意のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列もまた、参照によりその全体が組み込まれる。   The Institute for Genomic Research (TIGR) (www.tigr.org) and / or National Center for Biotechnology Information (NCBI) (an entry in the database such as those published in www.ncbi.nlm.nih.gov). Any polynucleotide and polypeptide sequences that refer to the accession numbers associated with are also incorporated by reference in their entirety.

Claims (50)

ＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連し、かつ、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた処置に耐性である癌に罹患している被験体を処置するための組み合わせ薬であって、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を含み、ここで、該被験体は、ＭＥＴ遺伝子増幅を有しており；そして、該抗ＥｒｂＢ治療剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、またはＢＩＢＷ２９９２のうちのいずれか一つから選択され；そして、該抗ＭＥＴ治療剤は、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２またはＯＡ−５Ｄ５のうちいずれか一つから選択される組み合わせ薬。 A combination drug for treating a subject suffering from cancer associated with ErbB gene amplification and resistant to treatment with an anti-ErbB therapeutic agent, comprising: an anti-ErbB therapeutic agent and an anti-MET therapeutic agent wherein, where said subject has a MET gene amplification; and the anti-ErbB therapeutic agent, gefitinib, erlotinib, lapatinib, selected from any one of PF00299804 or, BIBW2992; and The anti-MET therapeutic agent is any one of PHA-665,752, SU11274, PF-02341066, XL-880, MGCD265, XL184, ARQ197, MP-470, SGX-523, JNJ38887705, AMG102 or OA-5D5. Combination drug selected from two. 前記癌が、肺癌、脳の癌、乳癌、頭頸部癌、大腸癌、卵巣癌、胃癌、または膵癌である、請求項１に記載の組み合わせ薬。   The combination drug according to claim 1, wherein the cancer is lung cancer, brain cancer, breast cancer, head and neck cancer, colon cancer, ovarian cancer, stomach cancer, or pancreatic cancer. 前記癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項２に記載の組み合わせ薬。   The combination drug according to claim 2, wherein the cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC). 前記ＥｒｂＢ遺伝子増幅が、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４の遺伝子増幅から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み合わせ薬。   The combination drug according to any one of claims 1 to 3, wherein the ErbB gene amplification is selected from gene amplification of EGFR, ErbB2, ErbB3, or ErbB4. 前記ＥｒｂＢ遺伝子増幅が、ＥＧＦＲ遺伝子増幅である、請求項４に記載の組み合わせ薬。   The combination drug according to claim 4, wherein the ErbB gene amplification is EGFR gene amplification. 前記癌が、ＥｒｂＢキナーゼ阻害剤を用いた処置に耐性である、請求項１に記載の組み合わせ薬。 The combination according to claim 1 , wherein the cancer is resistant to treatment with an ErbB kinase inhibitor. 前記癌が、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いた処置に耐性である、請求項６に記載の組み合わせ薬。 The combination drug according to claim 6 , wherein the cancer is resistant to treatment with an EGFR kinase inhibitor. 前記抗ＥｒｂＢ治療剤および前記抗ＭＥＴ治療剤が、前記被験体に同時に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組み合わせ薬。   The combination drug according to claim 1, wherein the anti-ErbB therapeutic agent and the anti-MET therapeutic agent are administered simultaneously to the subject. 前記抗ＥｒｂＢ治療剤および前記抗ＭＥＴ治療剤が、同時製剤として前記被験体に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組み合わせ薬。   The combination drug according to claim 1, wherein the anti-ErbB therapeutic agent and the anti-MET therapeutic agent are administered to the subject as a simultaneous preparation. 前記組み合わせ薬が、少なくとも１つの追加の処置と組み合わせて前記被験体に投与されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組み合わせ薬。 10. A combination according to any one of claims 1 to 9 , characterized in that the combination is administered to the subject in combination with at least one additional treatment. 前記追加の処置が、以下のうちの１つまたは複数である、請求項１０に記載の組み合わせ薬：追加の治療剤の投与、照射、光ダイナミック療法、レーザー療法、または手術。 Said additional treatment is one or more of the following, the combination drug according to claim 1 0: administration of additional therapeutic agents, irradiation, photodynamic therapy, laser therapy, or surgery. 前記被験体が哺乳動物である、請求項１に記載の組み合わせ薬。   The combination drug according to claim 1, wherein the subject is a mammal. 前記哺乳動物がヒトである、請求項１２に記載の組み合わせ薬。 13. A combination drug according to claim 12 , wherein the mammal is a human. ＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している被験体を処置するための組み合わせ薬であって、該被験体は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた処置に対する耐性を発生しており、そして該被験体は、ＭＥＴ遺伝子増幅を有しており、該組み合わせ薬は、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を含み、ここで、該抗ＥｒｂＢ治療剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、またはＢＩＢＷ２９９２のうちのいずれか一つから選択され；そして、該抗ＭＥＴ治療剤は、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２またはＯＡ−５Ｄ５のうちいずれか一つから選択される、組み合わせ薬。 A combination drug for treating a subject suffering from cancer associated with ErbB gene amplification, wherein the subject has developed resistance to treatment with an anti-ErbB therapeutic agent, and the subject has a MET gene amplification, the combination drug may comprise an anti-ErbB therapeutic and anti-MET therapeutics, wherein the anti-ErbB therapeutic agent, gefitinib, erlotinib, lapatinib, PF00299804, or of BIBW2992 And the anti-MET therapeutic agent is PHA-665,752, SU11274, PF-02341066, XL-880, MGCD265, XL184, ARQ197, MP-470, SGX-523, JNJ38887705, Either AMG102 or OA-5D5 It is selected, the combination drug. ＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している被験体を処置するための組み合わせ薬であって、
抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤を含み、ここで該被験体は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて処置されており、そしてＭＥＴ遺伝子増幅を発生させており、ここで、該抗ＥｒｂＢ治療剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、またはＢＩＢＷ２９９２のうちのいずれか一つから選択され；そして、該抗ＭＥＴ治療剤は、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２またはＯＡ−５Ｄ５のうちいずれか一つから選択される、組み合わせ薬。 A combination drug for treating a subject suffering from a cancer associated with ErbB gene amplification comprising:
Comprise an anti-MET therapeutic and anti-ErbB therapeutic agent, wherein the said subject is treated with anti-ErbB therapeutic agents, and has caused the MET gene amplification, wherein the anti-ErbB therapeutic agent , Gefitinib, erlotinib, lapatinib, PF00299804, or BIBW2992; and the anti-MET therapeutic agent is PHA-665,752, SU11274, PF-02341066, XL-880, MGCD265, XL184 , ARQ197, MP-470, SGX-523, JNJ38887705, AMG102 or OA-5D5. 抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中のＥｒｂＢリン酸化を低減するための組み合わせ薬であって、抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤を含み、該癌は、ＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連しており、ここで、該抗ＥｒｂＢ治療剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、またはＢＩＢＷ２９９２のうちのいずれか一つから選択され；そして、該抗ＭＥＴ治療剤は、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２またはＯＡ−５Ｄ５のうちいずれか一つから選択される、組み合わせ薬。 A combination drug for reducing ErbB phosphorylation in cancer cells that has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic agent and includes MET gene amplification, comprising an anti-MET therapeutic agent and an anti-ErbB therapeutic agent, wherein the cancer comprises It is associated with ErbB gene amplification, wherein the anti-ErbB therapeutic agent, gefitinib, erlotinib, lapatinib, selected from any one of PF00299804 or, BIBW2992; and, the anti MET therapeutic agent, PHA-665,752, SU11274, PF-02341066, XL-880, MGCD265, XL184, ARQ197, MP-470, SGX-523, JNJ38887705, AMG102 or OA-5D5 . 抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中のＰＩ３Ｋ媒介シグナル伝達を低減するための組み合わせ薬であって、抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤を含み、該癌は、ＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連しており、ここで、該抗ＥｒｂＢ治療剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、またはＢＩＢＷ２９９２のうちのいずれか一つから選択され；そして、該抗ＭＥＴ治療剤は、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２またはＯＡ−５Ｄ５のうちいずれか一つから選択される、組み合わせ薬。 A combination drug for reducing PI3K-mediated signal transduction in cancer cells that has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic agent and includes MET gene amplification, comprising the anti-MET therapeutic agent and the anti-ErbB therapeutic agent, is related to the ErbB gene amplification, wherein the anti-ErbB therapeutic agent, gefitinib, erlotinib, lapatinib, PF00299804, or is selected from any one of BIBW2992; the antibody MET therapeutic agent , PHA-665,752, SU11274, PF-02341066, XL-880, MGCD265, XL184, ARQ197, MP-470, SGX-523, JNJ38887705, AMG102 or OA-5D5 medicine. 抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中のＥｒｂＢ媒介シグナル伝達を低減するための組み合わせ薬であって、抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤を含み、該癌は、ＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連しており、ここで、該抗ＥｒｂＢ治療剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、またはＢＩＢＷ２９９２のうちのいずれか一つから選択され；そして、該抗ＭＥＴ治療剤は、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２またはＯＡ−５Ｄ５のうちいずれか一つから選択される、組み合わせ薬。 A combination drug for reducing ErbB-mediated signal transduction in cancer cells that has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic agent and includes MET gene amplification, comprising an anti-MET therapeutic agent and an anti-ErbB therapeutic agent, is related to the ErbB gene amplification, wherein the anti-ErbB therapeutic agent, gefitinib, erlotinib, lapatinib, PF00299804, or is selected from any one of BIBW2992; the antibody MET therapeutic agent , PHA-665,752, SU11274, PF-02341066, XL-880, MGCD265, XL184, ARQ197, MP-470, SGX-523, JNJ38887705, AMG102 or OA-5D5 medicine. 抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞の、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する感受性を回復させるための組み合わせ薬であって、抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤を含み、該癌は、ＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連しており、ここで、該抗ＥｒｂＢ治療剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、またはＢＩＢＷ２９９２のうちのいずれか一つから選択され；そして、該抗ＭＥＴ治療剤は、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２またはＯＡ−５Ｄ５のうちいずれか一つから選択される、組み合わせ薬。 A combination drug for restoring the sensitivity of an anti-ErbB therapeutic agent to cancer cells containing MET gene amplification, and comprising anti-ErbB therapeutic agent, comprising anti-MET therapeutic agent and anti-ErbB therapeutic agent, cancer is associated with ErbB gene amplification, wherein the anti-ErbB therapeutic agent, gefitinib, erlotinib, lapatinib, selected from any one of PF00299804 or BIBW2992,; and the antibody MET treatment The agent is selected from any one of PHA-665,752, SU11274, PF-02341066, XL-880, MGCD265, XL184, ARQ197, MP-470, SGX-523, JNJ38887705, AMG102 or OA-5D5 , Combination drugs. 抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞の成長または増殖を低減するための組み合わせ薬であって、抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤を含み、該癌は、ＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連しており、ここで、該抗ＥｒｂＢ治療剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、またはＢＩＢＷ２９９２のうちのいずれか一つから選択され；そして、該抗ＭＥＴ治療剤は、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２またはＯＡ−５Ｄ５のうちいずれか一つから選択される、組み合わせ薬。 A combination drug for reducing the growth or proliferation of cancer cells that has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic agent and includes MET gene amplification, comprising an anti-MET therapeutic agent and an anti-ErbB therapeutic agent, the cancer comprising: It is associated with ErbB gene amplification, wherein the anti-ErbB therapeutic agent, gefitinib, erlotinib, lapatinib, selected from any one of PF00299804 or, BIBW2992; and, the anti MET therapeutic agent PHA -665,752, SU11274, PF-02341066, XL-880, MGCD265, XL184, ARQ197, MP-470, SGX-523, JNJ38887705, AMG102 or OA-5D5. 抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞のアポトーシスを増大させるための組み合わせ薬であって、抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤を含み、該癌は、ＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連しており、ここで、該抗ＥｒｂＢ治療剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、またはＢＩＢＷ２９９２のうちのいずれか一つから選択され；そして、該抗ＭＥＴ治療剤は、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２またはＯＡ−５Ｄ５のうちいずれか一つから選択される、組み合わせ薬。 A combination drug for increasing apoptosis of cancer cells that has acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic agent and includes MET gene amplification, comprising an anti-MET therapeutic agent and an anti-ErbB therapeutic agent, wherein the cancer comprises an ErbB gene amplification is associated with, wherein the anti-ErbB therapeutic agent, gefitinib, erlotinib, lapatinib, PF00299804 or is selected from any one of BIBW2992,; and the antibody MET therapeutic agent, PHA-665 752, SU11274, PF-02341066, XL-880, MGCD265, XL184, ARQ197, MP-470, SGX-523, JNJ38887705, AMG102 or OA-5D5. 抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞の、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を低減するための組み合わせ薬であって、抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤を含み、該癌は、ＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連しており、ここで、該抗ＥｒｂＢ治療剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、またはＢＩＢＷ２９９２のうちのいずれか一つから選択され；そして、該抗ＭＥＴ治療剤は、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２またはＯＡ−５Ｄ５のうちいずれか一つから選択される、組み合わせ薬。 A combination drug for reducing resistance to an anti-ErbB therapeutic agent of a cancer cell having acquired resistance to an anti-ErbB therapeutic agent and comprising MET gene amplification, comprising an anti-MET therapeutic agent and an anti-ErbB therapeutic agent, cancer is associated with ErbB gene amplification, wherein the anti-ErbB therapeutic agent, gefitinib, erlotinib, lapatinib, selected from any one of PF00299804 or BIBW2992,; and the antibody MET treatment The agent is selected from any one of PHA-665,752, SU11274, PF-02341066, XL-880, MGCD265, XL184, ARQ197, MP-470, SGX-523, JNJ38887705, AMG102 or OA-5D5 , Combination drugs. ＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中の、獲得された抗ＥｒｂＢ治療剤耐性を処置するための組み合わせ薬であって、抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤を含み、該癌は、ＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連しており、ここで、該抗ＥｒｂＢ治療剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、またはＢＩＢＷ２９９２のうちのいずれか一つから選択され；そして、該抗ＭＥＴ治療剤は、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２またはＯＡ−５Ｄ５のうちいずれか一つから選択される、組み合わせ薬。 A combination drug for treating acquired anti-ErbB therapeutic resistance in cancer cells comprising MET gene amplification, comprising an anti-MET therapeutic agent and an anti-ErbB therapeutic agent, wherein the cancer is associated with ErbB gene amplification and it is, here, the anti-ErbB therapeutic agent, gefitinib, erlotinib, lapatinib, selected from any one of PF00299804 or, BIBW2992; and, the anti MET therapeutic agent, PHA-665,752, A combination drug selected from any one of SU11274, PF-02341066, XL-880, MGCD265, XL184, ARQ197, MP-470, SGX-523, JNJ38887705, AMG102 or OA-5D5. 前記癌細胞が哺乳動物癌細胞である、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の組み合わせ薬。 Wherein the cancer cell is a mammalian cancer cell, the combination drug according to any one of claims 1 6-2 3. 前記哺乳動物癌細胞がヒト癌細胞である、請求項２４に記載の組み合わせ薬。 The mammalian cancer cells are human cancer cells, the combination drug according to claim 2 4. 前記癌細胞が細胞株由来である、請求項２４または２５に記載の組み合わせ薬。 Wherein the cancer cell is derived from a cell line, the combination drug according to claim 2 4, or 2 5. 前記癌細胞が初代組織試料由来である、請求項２４または２５に記載の組み合わせ薬。 Wherein the cancer cell is derived from primary tissue samples, the combination drug according to claim 2 4, or 2 5. 前記癌細胞が、肺癌細胞、脳の癌細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、大腸癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞または膵癌細胞からなる群から選択される、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の組み合わせ薬。 Wherein the cancer cells, lung cancer cells, brain cancer cells, breast cancer cells, head and neck cancer cells, colon cancer cells, ovarian cancer cells are selected from the group consisting of gastric cancer cells or pancreatic cells, of claim 1 6-2 3 The combination drug according to any one of the above. 前記癌が任意のＥｒｂＢ誘導性癌である、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の組み合わせ薬。 Wherein the cancer is any ErbB-induced cancer, the combination drug according to any one of claims 1 6-2 3. 前記癌細胞がＥｒｂＢ遺伝子増幅を含む、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の組み合わせ薬。 It said cancer cells comprise ErbB gene amplification, the combination drug according to any one of claims 1 6-2 3. 前記ＥｒｂＢ遺伝子増幅がＥＧＦＲ遺伝子増幅である、請求項３０に記載の組み合わせ薬。 The combination drug according to claim 30 , wherein the ErbB gene amplification is EGFR gene amplification. 前記ＥｒｂＢ遺伝子増幅が少なくとも２倍である、請求項３０に記載の組み合わせ薬。 30. The combination drug of claim 30 , wherein the ErbB gene amplification is at least twice. 前記細胞がＭＥＴ遺伝子増幅を含み、該ＭＥＴ増幅が少なくとも２倍である、請求項１６〜３２のいずれか一項に記載の組み合わせ薬。 It said cell comprises a MET gene amplification, the MET amplification is at least 2-fold, the combination drug according to any one of claims 1 6-3 2. 前記組み合わせ薬が、少なくとも１つの追加の処置様式と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項１６〜３３のいずれか一項に記載の組み合わせ薬。 Wherein the combination drug, characterized in that it is administered in combination with at least one additional treatment modalities, the combination drug according to any of claims 1 6-33. 前記少なくとも１つの追加の処置様式が、前記細胞を１つまたは複数の追加の治療剤と接触させること、照射、光ダイナミック療法、レーザー療法、および手術からなる群から選択される、請求項３４に記載の組み合わせ薬。 35. The method of claim 34 , wherein the at least one additional treatment modality is selected from the group consisting of contacting the cells with one or more additional therapeutic agents, irradiation, photodynamic therapy, laser therapy, and surgery. The listed combination drug. 抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて処置されており、そして、ＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連し、かつ、該抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得した癌に罹患している被験体を、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を用いて処置するための候補として特定することを補助する方法であって、該被験体由来の癌細胞中のＭＥＴ遺伝子増幅を検出するステップを含み、ここで、該抗ＥｒｂＢ治療剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、またはＢＩＢＷ２９９２のうちのいずれか一つから選択され；そして、該抗ＭＥＴ治療剤は、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２またはＯＡ−５Ｄ５のうちいずれか一つから選択される方法。 A subject suffering from a cancer that has been treated with an anti-ErbB therapeutic and is associated with ErbB gene amplification and has acquired resistance to the anti-ErbB therapeutic is treated with an anti-ErbB therapeutic and anti-MET. a method for helping to identify a candidate for treatment with a therapeutic agent, comprising detecting the MET gene amplification in cancer cells from said subject, wherein the anti-ErbB therapeutic agent , Gefitinib, erlotinib, lapatinib, PF00299804, or BIBW2992; and the anti-MET therapeutic agent is PHA-665,752, SU11274, PF-02341066, XL-880, MGCD265, XL184 , ARQ197, MP-470, SGX-523, JNJ38887705 AMG102 or method selected from one of OA-5D5. ＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連し、かつ、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた処置に耐性である癌に罹患している被験体を処置するための組み合わせ薬であって、抗ＥｒｂＢ治療剤、およびＭＥＴのＨＧＦ媒介活性化を阻害する薬剤を含み、ここで、該被験体は、ＭＥＴ遺伝子増幅を有しており；そして、該抗ＥｒｂＢ治療剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、またはＢＩＢＷ２９９２のうちのいずれか一つから選択され；そして、該ＭＥＴのＨＧＦ媒介活性化を阻害する薬剤は、ＡＭＧ１０２またはＯＡ−５Ｄ５のうちいずれか一つから選択される組み合わせ薬。 A combination drug for treating a subject suffering from a cancer associated with ErbB gene amplification and resistant to treatment with an anti-ErbB therapeutic agent, comprising the anti-ErbB therapeutic agent and MET HGF-mediated comprising an agent which inhibits the activation, wherein said subject has a MET gene amplification; and the anti-ErbB therapeutic agent, gefitinib, erlotinib, lapatinib, any of PF00299804 or BIBW2992, And a drug that inhibits HGF-mediated activation of the MET is a combination drug selected from either AMG102 or OA-5D5. 前記薬剤が、ＨＧＦがＭＥＴに結合するのを妨げる抗体である、請求項３７に記載の組み合わせ薬。 38. The combination drug of claim 37 , wherein the drug is an antibody that prevents HGF from binding to MET. 前記抗体が抗ＨＧＦ抗体である、請求項３８に記載の組み合わせ薬。 40. The combination drug according to claim 38 , wherein the antibody is an anti-HGF antibody. 前記抗体が抗ＭＥＴ抗体である、請求項３８に記載の組み合わせ薬。 40. The combination drug according to claim 38 , wherein the antibody is an anti-MET antibody. 前記癌細胞の成長および／または生存がＥｒｂＢによって促進される、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の組み合わせ薬。 The growth and / or survival of cancer cells is promoted by ErbB, the combination drug according to any one of claims 1 6-2 3. ＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している被験体を処置するための組み合わせ薬であって、該被験体は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた処置に対する耐性を発生させており、そしてＭＥＴレベルおよび／または活性が上昇しており、該組み合わせ薬は、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を含み、ここで、該抗ＥｒｂＢ治療剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、またはＢＩＢＷ２９９２のうちのいずれか一つから選択され；そして、該抗ＭＥＴ治療剤は、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２またはＯＡ−５Ｄ５のうちいずれか一つから選択される組み合わせ薬。 A combination drug for treating a subject suffering from a cancer associated with ErbB gene amplification, wherein the subject has developed resistance to treatment with an anti-ErbB therapeutic agent and MET levels and / or have activity increases, the combination drug may comprise an anti-ErbB therapeutic and anti-MET therapeutics, where said anti-ErbB therapeutic agent, gefitinib, erlotinib, lapatinib, any of the PF00299804 or, BIBW2992 And the anti-MET therapeutic agent is PHA-665,752, SU11274, PF-02341066, XL-880, MGCD265, XL184, ARQ197, MP-470, SGX-523, JNJ38887705, AMG102 or One of OA-5D5 The combination drug is selected from One. ＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している被験体を処置するための組み合わせ薬であって、
抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤を含み、ここで該被験体は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて処置されており、そして該被験体は、ＭＥＴレベルおよび／または活性の上昇を発生させており、ここで、該抗ＥｒｂＢ治療剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、またはＢＩＢＷ２９９２のうちのいずれか一つから選択され；そして、該抗ＭＥＴ治療剤は、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２またはＯＡ−５Ｄ５のうちいずれか一つから選択される、組み合わせ薬。 A combination drug for treating a subject suffering from a cancer associated with ErbB gene amplification comprising:
An anti-MET therapeutic agent and an anti-ErbB therapeutic agent, wherein the subject has been treated with the anti-ErbB therapeutic agent and the subject has developed an increase in MET levels and / or activity , wherein the anti-ErbB therapeutic agent, gefitinib, erlotinib, lapatinib, PF00299804, or is selected from any one of BIBW2992; the antibody MET therapeutic agent, PHA-665,752, SU11274, PF -02341066, XL-880, MGCD265, XL184, ARQ197, MP-470, SGX-523, JNJ38887705, AMG102 or OA-5D5. ＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している被験体を処置するための組み合わせ薬であって、
抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤を含み、ここで該被験体は抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて処置されており、そして該被験体は、該治療剤に対する耐性を発生させており、そしてＭＥＴレベルおよび／または活性が上昇しており、ここで、該抗ＥｒｂＢ治療剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、またはＢＩＢＷ２９９２のうちのいずれか一つから選択され；そして、該抗ＭＥＴ治療剤は、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２またはＯＡ−５Ｄ５のうちいずれか一つから選択される組み合わせ薬。 A combination drug for treating a subject suffering from a cancer associated with ErbB gene amplification comprising:
An anti-MET therapeutic agent and an anti-ErbB therapeutic agent, wherein the subject has been treated with the anti-ErbB therapeutic agent, and the subject has developed resistance to the therapeutic agent, and MET levels and / or have activity rises, wherein the anti-ErbB therapeutic agent, gefitinib, erlotinib, lapatinib, selected from any one of PF00299804 or, BIBW2992; and, the anti MET therapeutic agent, A combination drug selected from any one of PHA-665,752, SU11274, PF-02341066, XL-880, MGCD265, XL184, ARQ197, MP-470, SGX-523, JNJ38887705, AMG102 or OA-5D5. 前記ＭＥＴ活性の上昇が、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化に関連する、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の組み合わせ薬。 45. The combination according to any one of claims 42 to 44 , wherein the increase in MET activity is associated with MET gene amplification or HGF-mediated MET activation. 前記ＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化が、ＨＧＦ発現レベルの上昇またはＨＧＦ活性の上昇に関連する、請求項４５に記載の組み合わせ薬。 46. The combination according to claim 45 , wherein the HGF-mediated MET activation is associated with increased HGF expression levels or increased HGF activity. 前記ＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化が、ＨＧＦ遺伝子増幅に関連する、請求項４６に記載の組み合わせ薬。 48. The combination drug of claim 46 , wherein the HGF-mediated MET activation is associated with HGF gene amplification. 前記抗ＭＥＴ治療剤が、ＭＥＴのＨＧＦ媒介活性化を阻害する薬剤である、請求項４５〜４７いずれか一項に記載の組み合わせ薬。 48. The combination drug according to any one of claims 45 to 47 , wherein the anti-MET therapeutic agent is an agent that inhibits HGF-mediated activation of MET. 前記薬剤が、ＨＧＦがＭＥＴに結合するのを妨げる抗体である、請求項４８に記載の組み合わせ薬。 49. The combination according to claim 48 , wherein the agent is an antibody that prevents HGF from binding to MET. 前記抗体が、抗ＨＧＦ抗体または抗ＭＥＴ抗体である、請求項４９に記載の組み合わせ薬。 The combination drug according to claim 49 , wherein the antibody is an anti-HGF antibody or an anti-MET antibody.
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