JP5926242B2 - エンドリボヌクレアーゼ組成物およびその使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、出願のそれぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる、2010年5月10出願の米国仮特許出願第61/333,163号、2010年7月19日出願の米国仮特許出願第61/365,627号および2010年11月12日出願の米国仮特許出願第61/413,287号の利益を請求している。
本発明は、国立衛生研究所により付与される助成番号第T32 GM07232および全米科学財団により付与される助成番号MCB−0950971のもと、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府が本発明には一定の権利を有する。
Carteら(2008)Genes Dev.22:3489;米国特許公開第2010/0093026。
本明細書で用いられる場合、「ポリリボヌクレオチド」はリボヌクレオチドの重合形態を指し、RNA、RNAを含有するデオキシリボヌクレオチド、DNAを含有するリボヌクレオチドを含む。ポリリボヌクレオチドは、場合によっては、1つまたは複数の修飾ヌクレオチド(例えば、デオキシノシン、デオキシウリジンまたはヒドロキシメチルデオキシウリジン)を含む。場合によっては、ポリリボヌクレオチドはリボヌクレオチドのみから成る(すなわち、デオキシリボヌクレオチドを含まない)。場合によっては、ポリリボヌクレオチドは、リボヌクレオチドおよび1つまたは複数の修飾リボヌクレオチドを含むが、 デオキシリボヌクレオチドは含まない。その他の場合には、ポリリボヌクレオチドはリボヌクレオチドを含み、1つまたは複数の修飾リボヌクレオチドおよび1つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド(修飾デオキシリボヌクレオチドも含む)を含んでもよい。場合によっては、ポリリボヌクレオチドが1つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドを含むとき、そのポリリボヌクレオチドにおいて、デオキシリボヌクレオチドは全部で約50%から約40%、約40%から約30%、約30%から約20%、約20%から約10%、約10%から約1%または1%未満のヌクレオチドを含む。
本開示は、標的ポリリボヌクレオチドにおいて配列を検出する方法を提供する。本方法は、ポリリボヌクレオチドにおいて特定の配列の存在を検出する目的に有用であり、したがって、特定の配列を含むポリリボヌクレオチドを検出する目的に利用することができる。例えば、本方法は、試料中(例えば、生物学的試料中)の病原体のポリリボヌクレオチドの有無を検出する目的に利用することができる。
本開示は、細胞における標的RNAの産生を調節する方法を提供する。本方法は、一般には、遺伝子修飾された宿主細胞を誘導プロモーターを活性化する薬剤と接触させることを伴うが、ここで、その遺伝子修飾された宿主細胞は、一般に、基質ポリリボヌクレオチドにおいて配列特異的な開裂部位で開裂を触媒する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターによって遺伝子修飾され、酵素をコードするヌクレオチド配列は、誘導プロモーターに操作可能な形で結合され、誘導プロモーターが活性化すると、酵素が細胞で産生され、前駆体RNAから前記標的RNAを開裂する。
本開示は、核酸の混合ポピュレーションから標的核酸を単離する方法を提供する。本方法は一般に以下のステップを伴う:a)核酸の混合ポピュレーションを固定化された配列特異的な、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼと接触させるステップであって、ここで、核酸の混合ポピュレーションは、固定化された配列特異的な、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼによって特異的に結合される「タグ」(または「認識」)ヌクレオチド配列を含む標的核酸を含んでいるため、タグヌクレオチド配列 (「タグ付けされた標的核酸」)を含む標的核酸は、固定化された配列特異的な、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼに結合し、タグ付けされた標的核酸/固定化された配列特異的な、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ複合体を形成し、接触ステップは溶液(「結合溶液」)中で進行するステップ;およびb)溶液に最終濃度が約100mMから約500mM (例えば、約100mMから約150mM、約150mMから約200mM、約200mMから約250mM、 約250mMから約300mM、約300mMから約350mM、約350mMから約400mM、約400mMから約450mMまたは約450mMから約500mM)になるようにイミダゾールを添加し、それにより、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼを酵素的に再活性化し、 エンドリボヌクレアーゼが酵素的に活性となって、 「タグ」ヌクレオチド配列から標的核酸を開裂し、それにより標的核酸が放出されるようにする反応溶液を形成するステップ。図9は標的RNAを単離するための主題方法の代表的な実施形態の概略図である。
本開示は、配列特異的エンドリボヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態において、 本開示は、標的ポリリボヌクレオチド内の認識配列に結合するが、該標的ポリリボヌクレオチドを開裂しない配列特異的エンドリボヌクレアーゼを提供する。すなわち、この配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、標的ポリリボヌクレオチドの加水分解において酵素的に不活性である。一部の実施形態において、本開示は、標的ポリリボヌクレオチド内の認識配列に結合し、該認識配列内または付近にある標的ポリリボヌクレオチドを開裂する配列特異的エンドリボヌクレアーゼを提供する。すなわち、この配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、標的ポリリボヌクレオチドの加水分解において酵素的に活性である。.
本開示は、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼを提供し、ここで、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、配列に特異的な形でポリリボヌクレオチド内の標的配列に結合する。主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、配列に特異的な形で標的ポリリボヌクレオチドに結合するが、該標的ポリリボヌクレオチドを開裂しない。主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ は、前述したように、標的RNAを核酸の混合ポピュレーションから単離するのに有用である。
本開示は、主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼを含む組成物を提供する。主題の組成物は、主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ以外に、1つまたは複数の:塩、例えば、NaCl、MgCl、KCl、MgSO4など;緩衝剤、例えば、トリス緩衝液、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジンN’−(2−エタンスルホン酸)(HEPES)、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸 (MES)、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸ナトリウム塩(MES)、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、N−トリス[ヒドロキシメチル]メチル−3−アミノプロパンスルホン酸 (TAPS)など;可溶化剤;洗浄剤、例えば、Tween−20などの非イオン性洗浄剤;プロテアーゼ阻害剤;などを含むことができる。
一部の実施形態においては、主題の酵素的に活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、検出を可能にする部分を含む。例えば、主題の酵素的に活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、検出を可能にする共有または非共有結合された部分を含むことができる。
本開示は、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼを含む組成物を提供する。主題の組成物は、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ以外に、1つまたは複数の:塩、例えば、NaCl、MgCl、KCl、MgSO4など;緩衝剤、例えば、トリス緩衝液、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジンN’−(2−エタンスルホン酸)(HEPES)、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸 (MES)、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸ナトリウム塩(MES)、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸 (MOPS)、N−トリス[ヒドロキシメチル]メチル−3−アミノプロパンスルホン酸 (TAPS)など;可溶化剤;洗浄剤、例えば、Tween−20などの非イオン性洗浄剤;プロテアーゼ阻害剤;などを含むことができる。
主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼ(例えば、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ;主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ)は、任意の既知の方法、例えば、タンパク質合成のための従来の合成方法;組換えDNA方法;などによって産生することができる。
本開示は、主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列 (例えば、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ;主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ)を含む核酸を提供する。一部の実施形態において、核酸は発現ベクターであり、該発現ベクターは、配列特異的エンドリボヌクレアーゼの、例えば、細胞内での産生をもたらす。
本開示は、標的ポリリボヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのキットも提供する。本開示は、基質ポリリボヌクレオチドの配列特異的開裂を実施するためのキットを提供する。本開示は、標的ポリリボヌクレオチドにおけるRNA配列の検出を実施するためのキットを提供する。本開示は、標的RNAの単離を実施するためのキットを提供する。本開示は、 標的RNAに結合するポリペプチドの単離を実施するためのキットを提供する。
ポリリボヌクレオチドの直接配列決定を実施するための主題のキットには、少なくとも主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼが含まれ、該配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼは精製されている。一部の実施形態において、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、FRET検出のためにアクセプター分子またはドナー分子に結合される。
基質ポリリボヌクレオチドの配列特異的開裂を実施するための主題のキットには、少なくとも精製された配列特異的エンドリボヌクレアーゼおよび/または配列特異的エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が含まれる。基質ポリリボヌクレオチドの配列特異的開裂を実施するための主題のキットには、精製された配列特異的エンドリボヌクレアーゼ(および/または配列特異的エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸)に加えて、1つまたは複数の追加成分を含むことができる。適切な追加成分としては、例えば、緩衝剤;ポジティブコントロールとしての役割を果たすポリリボヌクレオチド基質;ポリリボヌクレオチドのサイズ標準;ネガティブコントロールの基質;などが挙げられる。成分はそれぞれ別の容器に入れることができる。キットは1つまたは複数のポジティブコントロールおよびネガティブコントロールをさらに含むことができる。
標的ポリリボヌクレオチドにおける配列の検出を実施するための(例えば、ポリリボヌクレオチドの検出を実施するための)主題のキットには、既知の配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。一部の実施形態において、キットには、既知の配列を含み、検出可能部分、例えば、免疫アッセイ;蛍光タンパク質;ルシフェリン;などを使って検出可能なポリペプチド、を含むオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。キットは、オリゴヌクレオチドプローブと二本鎖を形成することが可能なヌクレオチド配列を含むポジティブコントロールのポリリボヌクレオチドをさらに含むことができる。キットは、オリゴヌクレオチドプローブおよび標的ポリリボヌクレオチドによって形成された二本鎖を特異的に検出して開裂する酵素的に活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼをさらに含むことができる。キットは、1つまたは複数の緩衝剤;検出可能部分を検出するための成分;テストストリップ;などをさらに含むことができる。キットは、1つまたは複数のポジティブコントロールおよびネガティブコントロールをさらに含むことができる。
標的RNAの単離(例えば、精製)を実施するための主題のキットは、以下を1つまたは複数含むことができる:1)主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ;2)「タグ」ヌクレオチド配列、すなわち配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼにより特異的に結合されるヌクレオチド配列を含む発現構築体(ここで選択した標的RNAをコードするヌクレオチド配列は、「タグ」 ヌクレオチド配列挿入された3’とすることができる);および 3)イミダゾール。配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼは、不溶性支持体上に固定化することができる。キットは、固定化された配列特異的な、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼと核酸の混合ポピュレーションを接触させるための液体組成物をさらに含むことができる。キットは、洗浄緩衝剤をさらに含むことができる。キットは、1つまたは複数のポジティブコントロールおよびネガティブコントロールをさらに含むことができる。ポジティブコントロールは、タグ付けされたRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含むことができ、タグは、配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼによって特異的に結合される。成分はそれぞれ別の容器に入れることができる。
本開示は、標的ポリリボヌクレオチドのヌクレオチド配列を直接決定するための方法を提供する。したがって、例えば、本方法は標的ポリリボヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するために、標的ポリリボヌクレオチドのポリデオキシリボヌクレオチドの相補対の合成を必要としない。
本開示は、ポリリボヌクレオチドを配列に特異的な形で開裂する方法を提供する。本方法は、一般に、ポリリボヌクレオチド基質の配列特異的な開裂に有利な条件下で、酵素的に活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ (例えば、Csy4エンドリボヌクレアーゼ)と基質ポリリボヌクレオチドを接触させることを伴う。ポリリボヌクレオチドを配列に特異的な形で開裂する主題方法は、1)基質ポリリボヌクレオチドから親和性タグを欠失する;2)5’端、例えば、基質ポリリボヌクレオチドがin vitroでmRNAに転写された位置に均一性を有する産生ポリリボヌクレオチドのポピュレーションを生成する;および3)in vitroまたはin vivoで細胞の遺伝子発現を調節する目的に利用することができる。
「基質ポリリボヌクレオチド」および「標的ポリリボヌクレオチド」という用語は、本明細書では同義的に用いられ、配列特異的エンドリボヌクレアーゼによって、配列に特異的な形で結合されるポリリボヌクレオチドを指す。基質ポリリボヌクレオチドは、一本鎖とすることができる。場合によっては、基質ポリリボヌクレオチドは二本鎖である。
配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂するエンドリボヌクレアーゼとしては、金属イオンに依存しない形で基質ポリリボヌクレオチドを開裂(加水分解)する酵素的に活性なポリペプチドが挙げられる。
配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、約15℃から約100℃の範囲、例えば、約15℃〜約17℃、約17℃〜約20℃、約20℃〜 約25℃、約25℃〜約30℃、約30℃〜約40℃、約40℃〜約50℃、約50℃〜約60℃、約60℃〜約70℃、約70℃〜約80℃、約80℃〜約90℃、約90℃〜約100℃の範囲の温度で、配列に特異的な形で、基質ポリリボヌクレオチドを加水分解することができる。
材料および方法
野生型Csy4、点変異体およびセレノメチオニン(SeMet)置換Csy4を、 Rosetta 2(DE3)細胞で、His6−マルトース結合タンパク質(MBP)融合タンパク質または His6融合タンパク質のいずれかとして発現させ、Niアフィニティークロマトグラフィーにより精製した後、His(MBP)タグのタンパク質分解による除去を行い、さらなるNi−アフィニティーステップを実施し、サイズ排除クロマトグラフィーにかけた。pre−crRNAをin vitroで、T7ポリメラ−ゼを使って転写し、変性ゲル上で精製した。30℃で30分間、RNAをCsy4と一緒に2:1の割合でインキュベートした後、サイズ排除クロマトグラフィーにかけて複合体を形成した。複合体をハンギングドロップ法を使って、200mMクエン酸ナトリウム(pH5.0)、100mM塩化マグネシウム、20%(w/v)ポリ(エチレングリコール)(PEG)−4000(野生型(WT)複合体)または150mM酢酸ナトリウム(pH4.6)、17%PEG4000または160mM酢酸ナトリウム(pH4.6)、18%PEG4000(S22C含有複合体)で結晶化した。SeMet置換結晶を使って、WT Csy4−RNA複合体の構造を、多波長異常分散(MAD)法により決定した。Csy4(S22C)−RNA複合体の構造を、分子置換により決定した。
CRISPRが媒介する免疫は、配列決定されたゲノムにおいてCRISPR遺伝子座が存在することから、古細菌ゲノムの約90%および細菌ゲノムの約40%で発生すると考えられている。HorvathおよびBarrangou, Science 327,167−170(2010);Jansenら、Molecular Microbiology 43, 1565−1575 (2002);Sorekら、Nat Rev Microbiol 6, 181− 186 (2008);MarraffiniおよびSontheimer, Nat Rev Genet 11,181−190 (2010)。既知の8種のCRISPR/Casサブタイプに属すCRISPR系(Cas)タンパク質は、1次配列レベルで非常に相違しているため、機能的相同体を識別しにくくしている。Haftら,PLoS Comput Biol 1, e60(2005);Makarovaら, Biology Direct 1, 1−26 (2006)。シュードモナス・アエルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)UCBPP−PA14(以降、Pa14)は、エルシニア属のCRISPR/Cas系が潜んでいるグラム陰性日和見病原体であり、2個のCRISPR要素が両側に位置する6個の遺伝子を含む(図1A)。Cas1は、CRISPR含有生物体の間で普遍的に見出せ、Cas3は、ほとんどのサブタイプで顕著であるが、Csy1〜4は、エルシニア属に特有である。どちらのCRISPR要素も、〜32のヌクレオチド固有のスペーサー(その一部は、バクテリオファ−ジまたはプラスミドに見られる配列と一致する) が間に挿入されている、どちらのCRISPR内でも(1個のヌクレオチドを除き)同一の28ヌクレオチド反復の特徴的な配列を含む。Grissaら,BMC Bioinformatics 8, 172(2007)。多くの生物体では、CRISPR遺伝子座は、長い単一単位として転写され、転写後に処理されて、各々が反復要素から派生した配列が両側を占める1つの固有配列を含むcrRNAを作り出していることが明らかにされた。Brounsら,Science 321, 960−964(2008);Carteら,Genes and Development 22,3489−3496(2008);Tangら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 7536− 7541(2002);Lillestolら,Archaea 2,59−72(2006);Lillestolら, Mol Microbiol 72, 259−272(2009); Tangら,Molecular Microbiology 55,469−481(2005)。
フェルスター共鳴エネルギー移動 (FRET)を使って、単一分子レベルでRNAの配列を決定することができる。配列決定の対象RNAは、その3’リボースを通じて、固体表面に付着される。RNAは、単一分子レベルでの検出を可能にするのに十分なだけの間隔を、表面上で、近隣のRNA分子から取られなければならない。間隔は、放射光の波長に応じて、回折を制限する方法により決定される。あるいは、超分解能イメージング法を使用する場合、RNA間隔は、回折の限界よりも接近させることができる。第1の配列検出ステップでは、既知の核酸結合特異性のCsy4ファミリータンパク質を、検出ヌクレオチドのプールと一緒に配列決定の対象RNAに添加する。検出ヌクレオチドの1つが、配列決定の対象RNAとの間に4塩基対の二重螺旋を形成できる場合、Csy4タンパク質は、配列決定の対象RNAにのみ結合する。さらに、検出ヌクレオチドは、Csy4タンパク質が安定して結合するためには、配列決定の対象RNA中の4塩基対認識配列の追加の3ヌクレオチド3’と塩基対を形成しなければならない。検出ヌクレオチドには、4ヌクレオチド認識配列の3ヌクレオチドの3’の拡張子が含まれる。検出ヌクレオチドのプールでは、3ヌクレオチド拡張子は、定義された5’ヌクレオチドを有し、その後ろに2つのランダムなヌクレオチド配列部位が続く;または5’の配列部位にランダムなヌクレオチドを有し、その後ろに定義されたヌクレオチドおよびランダムなヌクレオチドが続く;または5’末端に2つのランダムなヌクレオチドを有し、その後に定義されたヌクレオチドが続く。これらのプールのいずれにおいても、定義されたヌクレオチドは、付着した蛍光性分子(その発光または励起スペクトルはヌクレオチドによって定義されている)に基いて既知である。 Csy4タンパク質を、検出ヌクレオチドに付着した蛍光性分子の発光スペクトルとオーバーラップする励起スペクトルを有する量子ドットに付着させる。検出ヌクレオチドとCsy4が結合した後、過剰な試薬を洗い流す。検出ヌクレオチドが配列決定の対象RNAとの間に7ヌクレオチドの二重螺旋を形成した場合に限り、陽性結合事象が検出される。結合が発生した場合、配列決定の対象RNA、検出ヌクレオチドおよびCsy4タンパク質の3要素から成る複合体を、検出ヌクレオチドに付着させた蛍光分子からCsy4タンパク質に付着させた量子ドットへのFRETにより検出することができる。結合のサイクルが終わるごとに、Csy4タンパク質および検出ヌクレオチドを、化学変性および/または熱変性ならびに洗浄を使って試料から除去する。以降の配列決定ステップでは、異なる配列特異性の他のCsy4 タンパク質およびそれらに対応する検出ヌクレオチドを同様の方法で配列決定の対象RNAと一緒にインキュベートする。検出ヌクレオチド上での3ヌクレオチド拡張子の差異は、検出ヌクレオチドの5’末端または3’末端のいずれかでの異なる長さの拡張子など、想定することができる。検出ヌクレオチドは、RNA、DNAまたはこれらのポリマーの化学修飾型、例えば、PNAまたはLNAであってもよい。
生化学的および構造的技法を通じて、基質結合活性は維持しながら、開裂活性を欠くCsy4の点変異体を生成した。1つの例は上述したCsy4(H29A)変異体である。そのままでは触媒的に不活性な異性体Csy4(H29A)変異体を外因性イミダゾールの存在下では、再活性化させることができる。150mM から300mMの間でイミダゾールを反応緩衝液に添加するだけで、野生型に近い開裂活性を刺激するのに十分である。結果を図8に示す。図8は、イミダゾールによる救済を示す開裂活性アッセイである。Csy4H29Aは、kdが1nM未満で、RNA基質に対する結合能は維持しているCsy4の酵素的に不活性な変異体である。
大半の細菌および古細菌に存在するCRISPR免疫系の必須成分(van der Oostら,Trends Biochem Sci. 34, 401−7(2009))、エンドリボヌクレアーゼCasEによる特異的基質認識のための機構を確定した。構造的および生化学的方法を使って、最適な基質開裂のために必要とされる最小RNA配列、7個の塩基対ステムループの後に2つの不対ヌクレオチドが続く20ヌクレオチド配列 (5〜24のCRISPR反復配列)を同定した。サーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)由来のCasEに結合したこのRNA の構造をX線結晶学を使って、2.0Åの分解能で解明した。この構造は、RNAのメジャーグルーブにおける複数の相互作用も含めて、タンパク質とRNAとの間の数多くの配列特異的接触を明らかにした。ステムループの末端塩基対は分断され、A22は螺旋から飛び出し、U23によって塩基がスタックしている。この座位は、 S34およびE38との相互作用により部分的に安定化され、基質認識のための配列特異性も与えている。 末端ヌクレオチド、G24を配置して、元に戻るように反転させ、ステムループと一致するが、残基D18、E24およびK31で構成される結合ポケット内の螺旋のずっと下に常駐し、R27がU23とG24との間にある骨格に接触するようにすることで、 cA22およびU23座位はさらなる安定化する。
Claims (35)
- 図6に規定したアミノ酸配列(配列ID番号:101又は配列ID番号:102)に対して少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼであって、His−29の位置にアミノ酸置換を含み、イミダゾールの非存在時には酵素的に不活性であり、イミダゾールの存在時には活性化可能である、変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼ。
- アミノ酸置換がHis29からAla29への置換である、請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼ。
- 検出可能なシグナルを提供する部分を含む、請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼ。
- 検出可能なシグナルを提供する部分が、フルオロフォア、量子ドット、エンドリボヌクレアーゼ以外の酵素、またはナノ粒子から選択される、請求項3に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼ。
- 不溶性支持体上に固定化されてている、請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼ。
- 不溶性支持体がビーズである、請求項5に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼ。
- ヌクレオチド配列5’−GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA−3’(配列ID番号:1)を含むRNA基質に結合する、請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼ。
- ヘアピン構造を有するRNA基質に結合し、ここでヘアピン構造のヌクレオチド1〜5および11〜15が塩基対形成して正規のA型螺旋ステムを形成する、請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼ。
- 請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
- 請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター。
- 変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに操作可能な形で結合されている、請求項10に記載の組換え発現ベクター。
- プロモーターが誘導プロモーターである、請求項11に記載の組換え発現ベクター。
- 請求項10に記載の組換え発現ベクターを含む、in vitroで遺伝子修飾された宿主細胞。
- 核酸の混合ポピュレーション中に存在する標的RNAを精製するためのキットであり、請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼを含むキット。
- 変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼが不溶性支持体上に固定化されている 請求項14に記載のキット。
- 5’から3’の順番で、操作可能な結合で:
a)請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼによって特異的に結合されるRNA基質をコードするヌクレオチド配列;
b)標的RNAをコードする核酸の挿入に適した多重クローニングサイト
を含む組換え発現ベクターをさらに含む、請求項14に記載のキット。 - RNA基質をコードするヌクレオチド配列がプロモーターに操作可能な形で結合されている、請求項16に記載のキット。
- プロモーターが誘導プロモーターである、請求項17に記載のキット。
- RNA基質がヌクレオチド配列5’−GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA−3’(配列ID番号:1)を含む、請求項16に記載のキット。
- 変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼがヘアピン構造を有するRNA基質に結合し、ここでヘアピン構造のヌクレオチド1〜5および11〜15が塩基対形成して正規のA型螺旋ステムを形成する、請求項14に記載のキット。
- 組換え発現ベクターが、多重クローニングサイトに挿入された、標的RNAをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項16に記載のキット。
- a)イミダゾール;
b)1つまたは複数の洗浄緩衝剤;及び
c)ポジティブコントロール発現ベクター
の1つまたは複数をさらに含む、請求項14に記載のキット。 - 核酸の混合ポピュレーション中に存在する標的RNAを単離する方法であって、
a)核酸の混合ポピュレーションを、請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼに接触させ、タグ付けされた標的RNA−固定化された変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼ複合体を形成すること、ここで、変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼは不溶性支持体上に固定化されていて、核酸の混合ポピュレーションは、固定化された変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼにより特異的に結合される認識ヌクレオチド配列を含む、タグ付けされた標的RNAを含んでおり、前記接触はイミダゾールを含まない結合溶液中で実行される;
b)結合溶液に最終濃度が100mMから500mMになるようにイミダゾールを添加し、それにより、固定化した変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼを酵素的に再活性化する再活性化溶液を形成し、再活性化され、固定化された変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼによりタグから標的RNAを開裂すること;および
c)放出された標的RNAを回収すること
を含む方法。 - ステップ(a)の後で、かつステップ(b)の前に実行される洗浄ステップをさらに含む、請求項23に記載の方法。
- 標的RNAに結合するポリペプチドを単離する方法であって、
a)固定化された複合体を標的RNAに結合するポリペプチドを含む溶液に接触させること、ここで、前記固定化された複合体は、請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼと、当該変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼが特異的に結合する認識ヌクレオチド配列を含むタグ付けされた標的RNAとを含み、前記接触によってポリペプチドが標的RNAに結合し、前記接触がイミダゾールを含まない結合溶液で実施されるものとする;および
b)結合したポリペプチドを溶出すること
を含む方法。 - 真核細胞における標的RNAの産生を調節する方法であって、遺伝子修飾された宿主細胞と誘導プロモーターを活性化する薬剤とを接触させることを含み、ここで、
前記遺伝子修飾された宿主細胞は、基質ポリリボヌクレオチドにおける配列特異的な開裂部位での開裂を触媒する酵素的に活性な配列特異的Csy4エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターで遺伝子修飾されており、
前記酵素をコードするヌクレオチド配列は誘導プロモーターに操作可能な形で結合されており、誘導プロモーターの活性化により、酵素が細胞内で産生され、前記標的RNAが前駆体RNAから開裂される、方法。 - 標的RNAの種類が調節RNAである、請求項26に記載の方法。
- 前駆体RNAからの前記標的RNAの開裂により、前駆体RNAが不活性化される、請求項26に記載の方法。
- 標的ポリリボヌクレオチドにおける特定配列を検出する方法であって、
a)オリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの二本鎖形成に有利な条件下において、標的ポリリボヌクレオチドを、前記特定配列を含むオリゴヌクレオチドプローブおよび酵素的に活性な配列特異的Csy4エンドリボヌクレアーゼに接触させること、ただし、ここで前記二本鎖はCsy4エンドリボヌクレアーゼにより開裂される;および
b)オリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの特異的結合を検出すること、ただし、ここでオリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの間の二本鎖形成の検出が、標的ポリリボヌクレオチドにおいて特定配列が存在することを表す;
を含む方法。 - 標的ポリリボヌクレオチドが固体支持体上に固定化されている、請求項29に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプローブがペプチドに結合され、前記ペプチドがCsy4エンドリボヌクレアーゼによる二本鎖の開裂時に放出され、検出ステップが放出されたペプチドの検出を含む、請求項29に記載の方法。
- 放出されたペプチドがそのペプチドに対して特異的な抗体への結合によって検出される、請求項29に記載の方法。
- 抗体が固定化されている、請求項32に記載の方法。
- 標的ポリリボヌクレオチドが病原体のポリリボヌクレオチドである、請求項29に記載の方法。
- 酵素的に活性なCsy4エンドリボヌクレアーゼが、配列ID番号:6、8または9のいずれか一つに対して少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項29に記載の方法。
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