JP5925075B2 - A protein that binds to Staphylococcus aureus and a method for measuring Staphylococcus aureus using the protein. - Google Patents
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Description
黄色ブドウ球細菌に結合するタンパク質及びそのタンパク質を利用した黄色ブドウ球細菌の測定方法に関する。 The present invention relates to a protein that binds to Staphylococcus aureus and a method for measuring Staphylococcus aureus using the protein.
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、通性嫌気性のグラム陽性球菌であり、ブドウの房のような複数の細菌が集団を形成する菌である。黄色ブドウ球菌は、他の細菌と比較して高濃度の食塩存在下でも増殖が可能であり、またカタラーゼ活性、ブドウ糖発酵性を持つなどの生化学的特徴を利用して分離・同定される。 S. aureus is a facultative anaerobic Gram-positive cocci and is a bacterium in which a plurality of bacteria such as a bunch of grapes form a population. Staphylococcus aureus can be grown in the presence of a high concentration of sodium chloride compared to other bacteria, and can be isolated and identified using biochemical characteristics such as catalase activity and glucose fermentability.
また、黄色ブドウ球菌は、黄色ブドウ球菌は人体の皮膚表面、毛孔等に存在し、特に鼻腔内に存在する常在細菌として知られる。そして、黄色ブドウ球菌は、ヒトの皮膚に常在するブドウ球菌の中では比較的毒性が高く、健常者に対しても疾病を起こし得る細菌である。 Staphylococcus aureus is known as a resident bacterium that exists on the skin surface, pores, and the like of the human body, particularly in the nasal cavity. Staphylococcus aureus is a bacterium that is relatively toxic among staphylococci resident in human skin and can cause illness even in healthy individuals.
近年、医療施設等でメチシリン、バンコマイシン等といった薬剤に対する耐性を獲得した黄色ブドウ球菌が次々と発見され、このような薬剤耐性菌による日和見感染が多発しており、疾病罹患患者のみならず医療従事者に対しても脅威となりつつある。そして、黄色ブドウ球菌を測定するためのキットが多数存在している。 In recent years, Staphylococcus aureus that has acquired resistance to drugs such as methicillin and vancomycin has been discovered one after another in medical facilities, and opportunistic infections due to such drug-resistant bacteria have frequently occurred, and not only patients with diseases but also medical workers Is becoming a threat. There are many kits for measuring S. aureus.
ファージとは細菌に感染するウイルスであり、このようなファージが有する、細菌に結合するといった特徴を採用し、ファージそのもの又はファージを構成するタンパク質の一部を用いて大腸菌を測定する技術が開発されている（特許文献１〜３）。
Phage is a virus that infects bacteria, and the technology of measuring E. coli using the phage itself or a part of the protein that composes the phage has been developed by adopting the characteristics of such phages that bind to bacteria. (
上述のように、黄色ブドウ球菌を測定するためのキットは多数存在しているものの、その多くは黄色ブドウ球菌に対して特異的に結合する抗体を用いたものである。このようなキットを用いて黄色ブドウ球菌を高い精度で測定するには、高度な技術、高価な機器、長期にわたる測定期間等を必要とするために、医療現場における使用には向いていない。また、高価な機器は黄色ブドウ球菌の測定以外の用途と併用することが殆どであり、黄色ブドウ球菌による汚染を避けるために、過度の努力が必要ともなる。 As described above, although there are many kits for measuring S. aureus, many of them use antibodies that specifically bind to S. aureus. In order to measure Staphylococcus aureus with high accuracy using such a kit, high technology, expensive equipment, a long measurement period, and the like are required, so that it is not suitable for use in a medical field. In addition, expensive equipment is mostly used in conjunction with applications other than the measurement of Staphylococcus aureus, and excessive efforts are required to avoid contamination with Staphylococcus aureus.
そこで、簡便で且つ安価に黄色ブドウ球菌を測定するためには、黄色ブドウ球菌を高い感度で測定できるような分子が必要となるが、黄色ブドウ球菌に対して吸着・感染する機構を有するファージの探索に着目してみると、大腸菌に吸着するファージの研究は進んでいるものの、黄色ブドウ球菌といった大腸菌以外の細菌に吸着するファージの研究は殆ど行われていない。 Therefore, in order to measure Staphylococcus aureus easily and inexpensively, a molecule capable of measuring Staphylococcus aureus with high sensitivity is required, but a phage having a mechanism for adsorbing and infecting Staphylococcus aureus Focusing on the search, although research on phages adsorbed on E. coli is progressing, research on phages adsorbed on bacteria other than E. coli such as Staphylococcus aureus has not been conducted.
また、黄色ブドウ球菌を特異的に認識する上で、黄色ブドウ球菌細胞表層のどのような成分が重要であるかと言う知見もない。 In addition, there is no knowledge of what components of the surface layer of S. aureus are important in specifically recognizing S. aureus.
本発明の主な目的は、黄色ブドウ球菌を簡便で、且つ、安価に測定するのに有用な分子を探索し、簡便で、且つ、安価に黄色ブドウ球菌を測定する方法を提供することである。さらに、本発明に主な目的は、黄色ブドウ球菌を特異的に測定する方法を提供することである。 The main object of the present invention is to search for molecules useful for measuring S. aureus in a simple and inexpensive manner, and to provide a simple and inexpensive method for measuring S. aureus. . Furthermore, the main object of the present invention is to provide a method for specifically measuring S. aureus.
本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、黄色ブドウ球菌に吸着するファージを発見した。斯かるファージについて更に解析を行った結果、ファージの尾部が黄色ブドウ球菌と吸着する部位であることを見出し、その吸着部位が少なくともファージ尾部を構成するタンパク質のカルボキシル末端側に存在することを特定した。 As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventors have discovered a phage that adsorbs to S. aureus. As a result of further analysis of such phage, it was found that the tail of the phage was a site that adsorbs to Staphylococcus aureus, and that the adsorption site was present at least on the carboxyl terminal side of the protein constituting the phage tail. .
更に、発明者らは、上述のタンパク質が、黄色ブドウ球菌のペプチドグリカン層に存在するテイコ酸と結合することも見出した。 Furthermore, the inventors have also found that the above-mentioned protein binds to teichoic acid present in the peptidoglycan layer of S. aureus.
また、発明者らは、斯かるタンパク質を用いることで、検体中に存在する黄色ブドウ球菌を高感度、簡便、短時間、且つ安価な方法にて測定が出来る方法を開発した。 In addition, the inventors have developed a method capable of measuring Staphylococcus aureus present in a sample by a highly sensitive, simple, short time and inexpensive method by using such a protein.
本発明は、このような知見に基づいて完成したものであり、下記に示す態様を広く包含するものである。 The present invention has been completed on the basis of such findings, and widely encompasses the embodiments described below.
項１ 配列番号１〜７の何れかに示すアミノ酸配列を含む、黄色ブドウ球菌に吸着するタンパク質又はその変異体。 Item 1 A protein or variant thereof that adsorbs to S. aureus, comprising the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 7.
項２ 上記項１に記載のタンパク質又はその変異体を認識する抗体。
項３ 上記項１に記載のタンパク質又はその変異体のうちの少なくとも一種と、担体とを含む支持体。
Item 3 A support comprising at least one of the protein according to
項４ 上記項３に記載の支持体を有する黄色ブドウ球菌測定キット。
Item 4 A kit for measuring S. aureus having the support according to
項５ 上記項１に記載するタンパク質又はその変異体をコードする核酸。
Item 5 A nucleic acid encoding the protein according to
項６ 上記項５に記載の核酸を含むベクター。
Item 6 A vector comprising the nucleic acid according to
項７ 上記項６に記載のベクターを保持する宿主。
Item 7 A host carrying the vector according to
項８ 以下の工程Ａ及びＢを含む、上記項１に記載のタンパク質又はその変異体を製造する方法：
（Ａ）上記項７に記載の宿主を培養する工程Ａ。
（Ｂ）工程Ａの後、上記項１に記載のタンパク質又はその変異体を含む画分を、該宿主又は培養液から回収する工程Ｂ。
Item 8 A method for producing the protein or variant thereof according to
(A) A step of culturing the host according to
(B) A step B of recovering a fraction containing the protein or variant thereof according to
項９ 下記の工程１及び２を含む、試料中の黄色ブドウ球菌を検出する方法。
（１）上記項３に記載の支持体と前記試料とを混合して、前記黄色ブドウ球菌と該支持体との複合体を形成させる工程１、
（２）工程１の後、混合後の試料中の前記複合体を測定する工程２。
Item 9 A method for detecting S. aureus in a sample, comprising the
(1)
(2)
項１０ 上記工程１において、上記項３に記載の支持体と、前記黄色ブドウ球菌との複合体を、該黄色ブドウ球菌の細胞表面のテイコ酸を介して形成させる、上記項９に記載の方法。
項１１ 配列番号１〜７の何れかに示すアミノ酸配列を含む、黄色ブドウ球菌由来のテイコ酸に結合するタンパク質又はその変異体。 Item 11 A protein or variant thereof that binds to teichoic acid derived from Staphylococcus aureus, comprising the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 7.
項１２ 上記項１１に記載のタンパク質又はその変異体を認識する抗体。
Item 12 An antibody that recognizes the protein according to
項１３ 上記項１１に記載のタンパク質又はその変異体のうちの少なくとも一種と、担体とを含む支持体。
Item 13 A support comprising at least one of the protein according to
項１４ 上記項１３に記載の支持体を有する黄色ブドウ球菌由来のテイコ酸測定キット。 Item 14 A kit for measuring teichoic acid derived from Staphylococcus aureus having the support according to Item 13.
項１５ 上記項１１に記載するタンパク質又はその変異体をコードする核酸。
Item 15 A nucleic acid encoding the protein or variant thereof according to
項１６ 上記項１５に記載の核酸を含むベクター。 Item 16 A vector comprising the nucleic acid according to Item 15.
項１７ 上記項１６に記載のベクターを保持する宿主。 Item 17 A host carrying the vector according to Item 16.
項１９ 以下の工程Ａ及びＢを含む、上記項１１に記載のタンパク質又はその変異体を製造する方法：
（Ａ）上記項１７に記載の宿主を培養する工程Ａ。
（Ｂ）工程Ａの後、上記項１１に記載のタンパク質又はその変異体を含む画分を、該宿主又は培養液から回収する工程Ｂ。
Item 19 A method for producing the protein or variant thereof according to
(A) A step of culturing the host according to item 17 above.
(B) A step B of recovering a fraction containing the protein or variant thereof according to
以下に本発明について詳細に説明する。なお、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学及び分子生物学的技術であれば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００１； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． “Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ．ＮＹ等の文献を参照すればよい。 The present invention is described in detail below. Various techniques used for carrying out the present invention can be easily and surely implemented by those skilled in the art based on known literatures and the like, except for the technique that clearly indicates the source. For example, in genetic engineering and molecular biology techniques, Sambrook and Russell, “Molecular Cloning A LABORATORY MANUAL”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001; Ausubel, F .; M.M. et al. “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, New York,. References such as NY may be referred to.
本発明の黄色ブドウ球菌に吸着するタンパク質又はその変異体は、特に黄色ブドウ球菌を測定する方法として有用である。その際、斯かるタンパク質又はその変異体のうちの少なくとも一種と、担体とを含む支持体を用いることによって、試料中の黄色ブドウ球菌を高価な機器を用いることなく、高感度で短時間に測定することができるので、簡便で、且つ、安価に黄色ブドウ球菌の測定方法が提供される。 The protein adsorbing to S. aureus or a variant thereof of the present invention is particularly useful as a method for measuring S. aureus. At that time, by using a support containing at least one of such proteins or variants thereof and a carrier, S. aureus in a sample can be measured with high sensitivity and in a short time without using an expensive instrument. Therefore, a method for measuring S. aureus can be provided easily and inexpensively.
従って、本発明の黄色ブドウ球菌に吸着するタンパク質又はその変異体を用いた黄色ブドウ球菌の測定方法は、医療現場等で即座に黄色ブドウ球菌の測定が可能であるために非常に有用である。また、本発明の測定方法は、ディスポーザブル器具を用いて測定することも可能である。 Therefore, the method for measuring Staphylococcus aureus using the protein adsorbing to Staphylococcus aureus or a variant thereof of the present invention is very useful because it can be measured immediately at medical sites. The measurement method of the present invention can also be measured using a disposable instrument.
また、本発明のタンパク質又はその変異体は、特に黄色ブドウ球菌に由来するテイコ酸の測定に有用である。 The protein of the present invention or a variant thereof is particularly useful for measuring teichoic acid derived from Staphylococcus aureus.
＜本発明のタンパク質又はその変異体＞
本発明のタンパク質又はその変異体は、黄色ブドウ球菌に吸着する。また、本発明のタンパク質又はその変異体には、黄色ブドウ球菌に由来するテイコ酸に結合するものも包含される。
<The protein of the present invention or a variant thereof>
The protein of the present invention or a variant thereof is adsorbed to S. aureus. The protein of the present invention or a variant thereof also includes those that bind to teichoic acid derived from S. aureus.
・黄色ブドウ球菌への吸着する本発明のタンパク質又はその変異体
本発明のタンパク質又はその変異体は、黄色ブドウ球菌に吸着する。ここで、『吸着』とは結合とほぼ同義である。結合の態様は特に限定はされず、例えば、疎水的結合等といった比較的弱い結合で、積極的に結合を解除する操作によって結合しない状態となるような態様の結合も含まれる。
-The protein of the present invention or its variant adsorbed to Staphylococcus aureus The protein of the present invention or its variant adsorbs to Staphylococcus aureus. Here, “adsorption” is almost synonymous with bonding. The mode of binding is not particularly limited, and includes, for example, a mode of binding that is a relatively weak bond such as a hydrophobic bond and is not bonded by an operation of positively releasing the bond.
中でも、上述の黄色ブドウ球菌に吸着するタンパク質又はその変異体は、黄色ブドウ球菌に対して特異的に結合することが特に好ましい。「特異的」とは、たとえば黄色ブドウ球菌以外の表皮ブドウ球菌、腐性ブドウ球菌、ミュータンス菌等といった結合候補が存在するときに、黄色ブドウ球菌を優先的に結合対象として認識し、結合することを意味する。 Especially, it is especially preferable that the protein adsorbed to the above-mentioned S. aureus or a variant thereof specifically binds to S. aureus. “Specific” means that when there are binding candidates such as Staphylococcus epidermidis, rot staphylococci, mutans, etc. other than Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus is preferentially recognized and bound. Means that.
本発明のタンパク質又はその変異体と黄色ブドウ球菌との結合は、公知の方法によって確認することができ、例えば後述する＜試験例＞に記載の方法を、各種条件の点で適宜変更しつつ、採用すればよい。 The binding between the protein of the present invention or a mutant thereof and Staphylococcus aureus can be confirmed by a known method. For example, while appropriately changing the method described in <Test Example> described below in terms of various conditions, Adopt it.
本発明のタンパク質又はその変異体が吸着する黄色ブドウ球菌には、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン低度耐性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）等といった、薬剤耐性を獲得した黄色ブドウ球菌も含まれる。 The Staphylococcus aureus to which the protein of the present invention or a variant thereof is adsorbed includes drug resistance such as methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), vancomycin-resistant Staphylococcus aureus (VRSA), vancomycin low-resistant Staphylococcus aureus (VISA) and the like. S. aureus that has acquired
これらの黄色ブドウ球菌の具体的な株としては、ＳＡ７株、ＳＡ１４株、ＳＡ１７株、ＳＡ２１株、ＳＡ２８株、ＳＡ３２株、ＳＡ３４株、ＳＡ３９株、ＳＡ４２株、ＭＲＳＡ１３株、ＭＲＳＡ１５株、ＭＲＳＡ２４株、ＮＣＴＣ１０４４２株、８５／２０８２株、ＮＹＹＣ１０４２株、ＭＲ１０８株等が挙げられる。 Specific examples of these Staphylococcus aureus strains are SA7, SA14, SA17, SA21, SA28, SA32, SA34, SA39, SA42, MRSA13, MRSA15, MRSA24, NCTC10442. Strain, 85/2082 strain, NYYC1042 strain, MR108 strain and the like.
上述のタンパク質の例として、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。配列番号１に示すアミノ酸配列とは、黄色ブドウ球菌に吸着するファージの尾部を構成するタンパク質（以後、本発明においてＯＲＦ１６タンパク質と称することがある。）のカルボキシル末端のアミノ酸配列である。 As an example of the above-mentioned protein, a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be mentioned. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence at the carboxyl terminus of a protein constituting the tail of a phage adsorbed to S. aureus (hereinafter sometimes referred to as ORF16 protein in the present invention).
ここで、『変異体』とは上述の黄色ブドウ球菌に対して吸着する能力を有する範囲の変異体に限られる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む黄色ブドウ球菌に吸着するタンパク質の変異体としては、配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、且つ、黄色ブドウ球菌に吸着するタンパク質を挙げることができる。 Here, the “mutant” is limited to a range of mutants having an ability to adsorb to the aforementioned S. aureus. For example, the variant of the protein adsorbed to S. aureus comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, most preferably the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. A protein having an identity of 99% or more and adsorbing to S. aureus can be mentioned.
アミノ酸配列の『同一性』とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対する同一のアミノ酸配列の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列の同一性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。 “Identity” of amino acid sequences refers to the degree of amino acid sequences of two or more comparable amino acid sequences with respect to each other. Therefore, the higher the identity of two amino acid sequences, the higher the identity or similarity of those sequences.
アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。 The level of amino acid sequence identity is determined, for example, using FASTA, a sequence analysis tool, using default parameters.
若しくは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｋａｒｌｉｎ Ｓ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ．“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８７：２２６４−２２６８（１９９０）、Ｋａｒｌｉｎ Ｓ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ．”Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９０：５８７３−７（１９９３））を用いて決定できる。このようなＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている。ＢＬＡＳＴＸを用いる際のパラメーターとしては、例えば、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とすればよい。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を参照すればよい。 Or, Karlin and Altschul by the algorithm BLAST (Karlin S, Altschul SF "Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes" Proc.Natl Acad Sci USA.87:. 2264-2268 (1990), Karlin S , Altschul SF. “Applications and statics for multiple high-scoring segments in molecular sequences.” Natl Acad Sci USA. 0: 5873-7 (1993)) can be determined using. A program called BLASTX based on such a BLAST algorithm has been developed. The parameters for using BLASTX may be, for example, score = 50 and wordlength = 3. Specific methods of these analysis methods are known, and the website of the National Center of Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) may be referred to.
なお、ここでいう変異導入とは、置換、欠失、挿入等である。具体的な変異導入については、公知の方法を採用することができ、特に限定はされないが、例えば置換であれば保存的な置換技術を採用すればよい。「保存的な置換技術」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。 Here, the term “mutation introduction” refers to substitution, deletion, insertion, and the like. For specific mutagenesis, a known method can be employed, and is not particularly limited. For example, a conservative substitution technique may be employed for substitution. “Conservative substitution technique” means that an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain.
例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。 For example, substitution with amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine, and histidine is a conservative substitution technique. In addition, amino acid residues having acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid; amino acid residues having non-charged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, and cysteine; alanine, valine, leucine, isoleucine, Amino acid residues with non-polar side chains such as proline, phenylalanine, methionine, and tryptophan; amino acid residues with β-branched side chains such as threonine, valine, and isoleucine, and aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan, and histidine Similarly, substitutions between amino acid residues are conservative substitutions.
本発明の黄色ブドウ球菌に吸着するタンパク質の他の態様として、配列番号２〜７の何れかに示すアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。配列番号２〜７に示すアミノ酸配列は、図１に示すように配列番号１に示すアミノ酸配列を含むものである。また、これらのタンパク質の変異体も、本発明の黄色ブドウ球菌に吸着するタンパク質又の他の態様として含まれる。 As another aspect of the protein adsorbed to Staphylococcus aureus of the present invention, a protein comprising the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2 to 7 can be mentioned. The amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 7 include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, as shown in FIG. Moreover, the variant of these proteins is also contained as a protein adsorb | sucking to the Staphylococcus aureus of this invention, or another aspect.
このような配列番号２〜７に示すアミノ酸配列を含むタンパク質の変異体も、上述の配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質の変異体と同様に定義される。 Such a variant of the protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 to 7 is also defined in the same manner as the variant of the protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 described above.
本発明の黄色ブドウ球菌に吸着するタンパク質又はその変異体は、溶液の状態としても、４℃で比較的安定であるため、このような温度で長期間保存することが可能である。なお、保存時には、アザイドといった防腐剤等を添加しても良い。また、当該タンパク質は、凍結乾燥して保存してもよい。 The protein or variant thereof adsorbed to S. aureus of the present invention is relatively stable at 4 ° C. even in a solution state, and can be stored at such a temperature for a long time. During storage, a preservative such as azide may be added. The protein may be stored by lyophilization.
この様な本発明のタンパク質又は変異体は、装飾ブドウ球菌に吸着する能力を有することから、後述するような黄色ブドウ球菌の測定に特に有用に用いることが可能である。 Such a protein or variant of the present invention has an ability to adsorb to decorative staphylococci, and thus can be particularly useful for the measurement of S. aureus as described below.
・黄色ブドウ球菌由来のテイコ酸と結合する本発明のタンパク質又は変異体 The protein or variant of the present invention that binds to teichoic acid derived from Staphylococcus aureus
上述した本発明のタンパク質又はその変異体は、黄色ブドウ球菌由来のテイコ酸にも結合する。 The above-described protein of the present invention or a variant thereof also binds to teichoic acid derived from S. aureus.
結合の態様は特に限定はされず、例えば、疎水的結合等といった比較的弱い結合で、積極的に結合を解除する操作によって結合しない状態となるような態様の結合も含まれる。 The mode of binding is not particularly limited, and includes, for example, a mode of binding that is a relatively weak bond such as a hydrophobic bond and is not bonded by an operation of positively releasing the bond.
本発明のタンパク質又はその変異体と黄色ブドウ球菌由来のテイコ酸との結合は、公知の方法によって確認することができ、例えば後述する＜試験例＞に記載の方法を、各種条件の点で適宜変更しつつ、採用すればよい。 The binding between the protein of the present invention or a variant thereof and teichoic acid derived from Staphylococcus aureus can be confirmed by a known method. For example, the method described in <Test Example> described below is appropriately used in terms of various conditions. It is sufficient to adopt while changing.
テイコ酸の由来となる黄色ブドウ球菌は、上述の通りである。 Staphylococcus aureus from which teichoic acid is derived is as described above.
本発明のタンパク質又はペプチドが結合するテイコ酸は、黄色ブドウ球菌のペプチドグリカン層に存在するものである。より具体的には、ペプチドグリカン層に存在する糖鎖の中のＮアセチルムラミン酸の６位に、自身のリン酸基を介して結合する糖鎖であり、具体的には、以下の化学式（１）にて示されるものが挙げられる。 The teichoic acid to which the protein or peptide of the present invention binds is present in the peptidoglycan layer of S. aureus. More specifically, it is a sugar chain that binds to the 6-position of N acetylmuramic acid in the sugar chain present in the peptidoglycan layer via its own phosphate group. Specifically, the following chemical formula ( The thing shown by 1) is mentioned.
式（１）中、Ｒ１はそれぞれ同一又は異なって、α−又はβ−Ｎアセチルグルコサミンであり、共に４位と酸素原子が結合している。 In formula (1), R 1 s are the same or different and are α- or β-N acetylglucosamine, both of which are bonded to the 4-position and an oxygen atom.
式（１）中、Ｒ２はそれぞれ同一又は異なって、水素原子又はＤ−アラニンであり、当該Ｄ−アラニンのカルボキシル基と、酸素原子が結合している。 In Formula (1), R 2 is the same or different and is a hydrogen atom or D-alanine, and a carboxyl group of the D-alanine and an oxygen atom are bonded to each other.
式（１）中、ＮＨＡｃはアセチルアミノ基であり、ＮＨ基とアセチル基が結合していることを示す。 In formula (1), NHAc is an acetylamino group, which indicates that the NH group and the acetyl group are bonded.
上述したテイコ酸は、脂質が結合したリポテイコ酸とは異なるものである。 The teichoic acid described above is different from lipoteichoic acid to which lipids are bound.
＜本発明の抗体＞
本発明の抗体は、上述の本発明のタンパク質又はその変異体を認識する抗体である。
<Antibody of the present invention>
The antibody of the present invention is an antibody that recognizes the above-mentioned protein of the present invention or a variant thereof.
斯かる抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、これらの抗体を含む抗血清も本発明の抗体に含まれる。また、斯かる抗体は、放射性同位体、蛍光物質、発光物質等といった標識分子にて修飾が施された標識化抗体であってもよい。 Such an antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and antisera containing these antibodies are also included in the antibody of the present invention. Such an antibody may be a labeled antibody modified with a labeling molecule such as a radioisotope, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like.
本発明の抗体の入手方法は特に限定はされず、上述の本発明のタンパク質又はその変異体を基に、公知の方法を採用すれば、当業者であれば容易に本発明の抗体を入手することができる。また、標識化抗体も上述の抗体を基にして、公知の方法を採用すれば当業者は容易に製造できる。 The method for obtaining the antibody of the present invention is not particularly limited, and those skilled in the art can easily obtain the antibody of the present invention by adopting a known method based on the above-described protein of the present invention or a variant thereof. be able to. A labeled antibody can also be easily produced by those skilled in the art by adopting a known method based on the above-mentioned antibody.
本発明の抗体は、抗体が有する上述のタンパク質への特異的な結合能力を利用して、黄色ブドウ球菌に吸着するファージの検出に好適に使用される。また、黄色ブドウ球菌へのファージの吸着を阻害する効果も有する。 The antibody of the present invention is suitably used for detecting a phage adsorbed to S. aureus by utilizing the specific binding ability of the antibody to the above-mentioned protein. It also has the effect of inhibiting the adsorption of phages to S. aureus.
また、本発明の抗体は、黄色ブドウ球菌に由来するテイコ酸の検出に好適に使用される。テイコ酸とは、上記の黄色ブドウ球菌由来のテイコ酸との結合にて説明したとおりである。 Moreover, the antibody of the present invention is suitably used for detection of teichoic acid derived from Staphylococcus aureus. The teichoic acid is as described in connection with the above-described teichoic acid derived from S. aureus.
＜本発明の支持体＞
本発明の支持体は、上述の本発明のタンパク質又はその変異体のうちの少なくとも一種と担体を含むものである。
<Support of the present invention>
The support of the present invention comprises at least one of the above-described protein of the present invention or a variant thereof and a carrier.
本発明の支持体は、上記担体と上述の本発明のタンパク質又はその変異体とを結合させれば当業者であれば容易に入手できる。具体的なの結合方法は、公知の方法を採用すればよく、例えば、一般的にタンパク質に対する架橋剤として多用されているＮ−スクシンイミジルアミド、Ｎ−マレインイミド等の架橋剤を用いる方法が挙げられる。さらに、担体と上述のタンパク質またはその変異体との間には、当該タンパク質又はその変異体が黄色ブドウ球菌と吸着、及び／又は黄色ブドウ球菌に由来するテイコ酸との結合する機能を弱めない範囲において、適宜ペプチド等のリンカーを有していてもよい。 The support of the present invention can be easily obtained by those skilled in the art by combining the above carrier with the above-described protein of the present invention or a variant thereof. A specific binding method may be a known method. For example, a method using a crosslinking agent such as N-succinimidylamide or N-maleimide generally used as a crosslinking agent for proteins is generally used. Can be mentioned. Furthermore, between the carrier and the above-mentioned protein or variant thereof, a range in which the protein or variant thereof does not weaken the function of adsorbing with S. aureus and / or binding with teichoic acid derived from S. aureus. In addition, it may have a linker such as a peptide as appropriate.
担体とは本発明のタンパク質又はその変異体の黄色ブドウ球菌への吸着能力、及び／又は黄色ブドウ球菌に由来するテイコ酸との結合能力を弱めない範囲であれば、特に限定はされないが、例えば、ラテックス粒子、シリカビーズ等が挙げられる。 The carrier is not particularly limited as long as it does not weaken the ability to adsorb the protein of the present invention or a variant thereof to S. aureus and / or the ability to bind to teichoic acid derived from S. aureus. , Latex particles, silica beads and the like.
これらの担体の中でも、上述の本発明のタンパク質又はその変異体の位置の少なくとも一種と共に用いて支持体とした際に、斯かる支持体だけでは凝集を起こさない傾向であり、当該タンパク質又はその変異体が黄色ブドウ球菌と吸着、及び／又は黄色ブドウ球菌に由来するテイコ酸と結合し、斯かる支持体と黄色ブドウ球菌、及び／又は黄色ブドウ球菌に由来するテイコ酸とが複合体を形成して凝集を起こすものが好ましい。このような働きを示す担体として、例えば、ラテックス粒子、シリカビーズ等が挙げられる。なお、当該ラテックス粒子としては、例えば、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社より販売されているＰｏｌｙｂｅａｄ等を採用すればよい。 Among these carriers, when used as a support together with at least one of the positions of the above-described protein of the present invention or a variant thereof, such a support alone does not tend to cause aggregation. The body binds to Staphylococcus aureus and / or binds to teichoic acid derived from S. aureus, and the support and S. aureus and / or teichoic acid derived from S. aureus form a complex. Those that cause aggregation are preferred. Examples of the carrier exhibiting such a function include latex particles and silica beads. As the latex particles, for example, Polybead sold by Polysciences may be employed.
担体の粒子径は、特に限定はされず、通常は０．１〜３．０μｍ程度とすればよい. The particle diameter of the carrier is not particularly limited, and may be usually about 0.1 to 3.0 μm.
本発明の支持体は、凍結乾燥して保存してもよい。当該支持体の使用時には、適当な溶液に溶解して使用することも可能である。従って、例えば、後述するような＜本発明のキット＞の構成物品として好適に用いることができ、さらに後述するような＜本発明の測定方法＞にも好適に用いることができる。 The support of the present invention may be stored by lyophilization. When the support is used, it can be dissolved in an appropriate solution. Therefore, for example, it can be suitably used as a component of a <kit of the present invention> as described later, and can also be suitably used in a <measurement method of the present invention> as described later.
＜本発明のキット＞
本発明のキットは、黄色ブドウ球菌を測定するためのものである。また、本発明のキットには、黄色ブドウ球菌に由来するテイコ酸を測定するものも含まれる。特に、後述する＜本発明の測定方法＞に、特に好適に用いることができる。斯かるキットには、上述の本発明の支持体を構成物品として含む。
<Kit of the present invention>
The kit of the present invention is for measuring S. aureus. The kit of the present invention includes a kit for measuring teichoic acid derived from Staphylococcus aureus. In particular, it can be particularly suitably used in the <measurement method of the present invention> described later. Such a kit includes the above-described support of the present invention as a component.
例えば、本発明のキットを用いて、黄色ブドウ球菌を定量的に測定するのであれば、異なる所定量の黄色ブドウ球菌を含む標準物質を本発明のキットの構成物品として含んでいることが好ましい。 For example, if S. aureus is quantitatively measured using the kit of the present invention, it is preferable that a standard substance containing a different predetermined amount of S. aureus is included as a component of the kit of the present invention.
同様に、本発明のキットを用いて、黄色ブドウ球菌に由来するテイコ酸を定量的に測定するのであれば、異なる所定量の黄色ブドウ球菌に由来するテイコ酸を含む標準物質を、本発明のキットの構成成分として含んでいることが好ましい。 Similarly, if teichoic acid derived from Staphylococcus aureus is quantitatively measured using the kit of the present invention, a standard substance containing teichoic acid derived from a different predetermined amount of Staphylococcus aureus is used. It is preferably contained as a component of the kit.
その他、黄色ブドウ球菌、及び／又は黄色ブドウ球菌に由来するテイコ酸の測定に用いるバッファー、希釈液、密着シール、トレイ、プレート等が本発明にのキットの構成物品として含まれていても良い。 In addition, a buffer, a diluent, a tight seal, a tray, a plate, and the like used for measurement of S. aureus and / or teichoic acid derived from S. aureus may be included as components of the kit of the present invention.
＜本発明の核酸＞
本発明の核酸は、上述の本発明のタンパク質又はその変異体をコードする核酸である。このような核酸は、当該タンパク質又はその変異体のアミノ酸配列を基に、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ技術を用いることで決定される。また、後述する＜宿主＞との相性を踏まえたコドンを適宜選択することが好ましい。
<Nucleic acid of the present invention>
The nucleic acid of the present invention is a nucleic acid encoding the above-described protein of the present invention or a variant thereof. Such a nucleic acid is determined by using in silico technology based on the amino acid sequence of the protein or a variant thereof. In addition, it is preferable to select a codon based on compatibility with <host> described later.
このような核酸はリボヌクレオチドであっても、デオキシヌクレオチドであってもよく、二本鎖の形状であっても一本鎖の形状であってもよい。 Such nucleic acids may be ribonucleotides or deoxynucleotides and may be in the form of double strands or single strands.
本発明の核酸は、上述の本発明のタンパク質又はその変異体の製造に特に好適に用いることができる。したがって、本発明の核酸には、特に製造時に当該タンパク質を検出すること等を目的として、各種タグポリペプチドをコードする核酸が付加されていてもよい。 The nucleic acid of the present invention can be particularly preferably used for the production of the above-described protein of the present invention or a variant thereof. Therefore, nucleic acids encoding various tag polypeptides may be added to the nucleic acid of the present invention, particularly for the purpose of detecting the protein during production.
具体的なタグポリペプチドとして、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＭＢＰタグ、ＧＳＴタグ、ＧＦＰタグ、Ｚタグ、ストレプタグ等が挙げられる。 Specific tag polypeptides include His tag, FLAG tag, HA tag, myc tag, MBP tag, GST tag, GFP tag, Z tag, and strep tag.
これらのタグポリペプチドは、単独で付加されていても、二種以上を組み合わせて付加されていてもよい。なお、上記の核酸は、上述した本発明のタンパク質又はその変異体をコードする核酸の内部に挿入される形で付加されていても、３′末端側に付加されていても、の５′末端側付加されていてもよい。 These tag polypeptides may be added alone or in combination of two or more. In addition, the above-mentioned nucleic acid may be added in the form inserted into the nucleic acid encoding the above-described protein of the present invention or a variant thereof, or may be added to the 3 ′ end side. The side may be added.
このような本発明の核酸は、公知の方法を用いて製造することができ、例えば適当なプライマーを用意してＰＣＲによって得る方法や、核酸合成装置を用いて化学的に合成する方法などが挙げられる。 Such a nucleic acid of the present invention can be produced using a known method. For example, a method of preparing an appropriate primer by PCR, a method of chemically synthesizing using a nucleic acid synthesizer, and the like can be mentioned. It is done.
＜本発明のベクター＞
本発明のベクターは、上述の本発明のタンパク質又はその変異体をコードする核酸を含むベクターである。斯かるベクターには、上述の核酸以外に斯かる核酸がコードするアミノ酸を好適に発現させるために各種の機能的な塩基配列を含んでいてもよい。
<Vector of the present invention>
The vector of the present invention is a vector comprising a nucleic acid encoding the above-described protein of the present invention or a variant thereof. Such a vector may contain various functional base sequences in order to suitably express the amino acid encoded by the nucleic acid in addition to the above-described nucleic acid.
このような機能的な塩基配列としては、例えば、上述の本発明のタンパク質又はその変異体の発現を制御するためのプロモーター配列、エンハンサー配列、リプレッサー配列、インスレーター配列等が挙げられる。これらの配列は、後述する＜本発明の宿主＞にて記載する宿主にて、効率的に機能するものを適宜採用すればよい。 Examples of such a functional base sequence include a promoter sequence, an enhancer sequence, a repressor sequence, and an insulator sequence for controlling the expression of the above-described protein of the present invention or a mutant thereof. These sequences may be appropriately selected from those that function efficiently in the host described in <Host of the Present Invention> described later.
本発明のベクターは、上述の本発明のタンパク質又はその変異体の製造に特に好適に用いることができる。 The vector of the present invention can be particularly suitably used for the production of the above-described protein of the present invention or a variant thereof.
＜本発明の宿主＞
本発明の宿主は、上述の本発明のタンパク質またはその変異体をコードする核酸を含むベクターを保持する宿主である。
<Host of the present invention>
The host of the present invention is a host that holds a vector containing a nucleic acid encoding the above-described protein of the present invention or a variant thereof.
「ベクターを保持する」とは、宿主内に上述のベクターそのものがそのままの形状にて存在する態様、宿主のゲノムＤＮＡにベクターの核酸が取り込まれて存在する態様等が挙げられる。 Examples of “holding a vector” include a mode in which the above-described vector itself exists in the host as it is, a mode in which the vector nucleic acid is incorporated into the host genomic DNA, and the like.
本発明の宿主は、一般的にタンパク質を製造するのに好適な公知の宿主を適宜採用すればよく、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞等が挙げられる。 As the host of the present invention, a known host that is generally suitable for producing a protein may be appropriately employed, and examples thereof include Escherichia coli, yeast, insect cells, mammalian cells and the like.
本発明の宿主は、上述の宿主に上述の本発明にのベクターを導入すればよい。具体的な導入方法は、特に限定はされず、公知の方法を用いればよい。例えば、塩化カルシウム法や塩化ルビジウム法で作成したコンピテントセルを用いる方法、エレクトロポーレーション法等を宿主等の性質に合わせて適宜選択すればよい。 The host of the present invention may be obtained by introducing the above-described vector of the present invention into the above-mentioned host. A specific introduction method is not particularly limited, and a known method may be used. For example, a method using a competent cell prepared by a calcium chloride method or a rubidium chloride method, an electroporation method, or the like may be appropriately selected according to the properties of the host or the like.
本発明の宿主は、上述の本発明のタンパク質又はその変異体の製造に特に好適に用いることができる。 The host of the present invention can be particularly preferably used for the production of the above-described protein of the present invention or a variant thereof.
＜本発明の製造方法＞
本発明の製造方法は、下記の工程Ａ及びＢを含む、本発明のタンパク質又はその変異体を製造方法である。
<Production method of the present invention>
The production method of the present invention is a method for producing the protein of the present invention or a variant thereof, comprising the following steps A and B.
（Ａ）上述の本発明の宿主を培養する工程Ａ。
（Ｂ）工程Ａの後、本発明のタンパク質又はその変異体を含む画分を、該宿主又は培養液から回収する工程Ｂ。
(A) Step A of culturing the host of the present invention described above.
(B) A step B of recovering a fraction containing the protein of the present invention or a mutant thereof from the host or the culture solution after the step A.
工程Ａについて
本発明の製造方法における工程Ａは、上述の本発明の宿主を培養する工程である。
Step A Step A in the production method of the present invention is a step of culturing the above-described host of the present invention.
宿主の培養方法は、宿主の性質によって区々ではあり、宿主に最適化した公知の方法をそのまま採用すればよい。 The host culture method varies depending on the nature of the host, and a known method optimized for the host may be employed as it is.
工程Ｂについて
本発明の製造方法における工程Ｂは、工程Ａの後、前記宿主又はその培養液から、本発明のタンパク質又はその変異体を回収する工程である。
Step B Step B in the production method of the present invention is a step of recovering the protein of the present invention or a mutant thereof from the host or a culture solution thereof after Step A.
本発明のタンパク質又はその変異体が宿主外に分泌されるものであれば、その培養液をそのまま当該画分として回収すればよい。また、宿主内に蓄積されるのであれば宿主を公知の界面活性剤にて化学的手段よる破砕及び／又は超音波処理、フレンチプレス法等の物理的手段による破砕後の破砕液を当該画分として回収すればよい。 If the protein of the present invention or a variant thereof is secreted outside the host, the culture solution may be recovered as it is as the fraction. In addition, if it accumulates in the host, the host is crushed with a known surfactant and / or crushed by chemical means and / or crushed by physical means such as sonication, French press, etc. Can be recovered as
工程Ｂの後、上述の本発明のタンパク質又はその変異体を含む画分を、適宜精製工程に供してもよい。具体的な精製方法は特に限定されないが、公知の方法を採用すればよい。 After step B, the above-described fraction containing the protein of the present invention or a variant thereof may be appropriately subjected to a purification step. Although the specific purification method is not specifically limited, What is necessary is just to employ | adopt a well-known method.
例えば、上述の本発明のタンパク質又はその変異体を含む画分を塩化セシウム、スクロース、グリセロール、ＯｐｔｉＰｒｅｐ、Ｐｅｒｃｏｌ等の成分を各種濃度又は線形グラジエント濃度勾配にて含有する緩衝液と、超遠心分離処理を採用した密度勾配遠心分離法に供して、本発明に係るタンパク質又はその変異体以外の成分を除去する方法；上述の画分に熱処理を与えて、主に夾雑タンパク質等を変性させて、本発明のタンパク質又はその変異体以外の成分を除去する方法；上述の画分に対して硫酸アンモニウム、エタノール酢酸、アセトン等を作用させて、主に夾雑タンパク質を変性させることによって、本発明に係るタンパク質又はその変異体以外の成分を除去する方法；上述の画分に対して硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコールを加えて沈殿を生じさせる事で、本発明のタンパク質又はその変異体以外の成分を除去する方法；上述の画分に対してクロマトグラフィー法を採用して、本発明のタンパク質又はその変異体以外の成分を除去する方法等が挙げられ、これらの方法は単独で採用しても、二種類以上を組み合わせて採用しても良い。 For example, a fraction containing the above-described protein of the present invention or a variant thereof is subjected to ultracentrifugation with a buffer containing components such as cesium chloride, sucrose, glycerol, OptiPrep, and Percol in various concentrations or a linear gradient gradient A method of removing components other than the protein according to the present invention or a variant thereof by subjecting to a density gradient centrifugation method employing the above; the above-mentioned fraction is subjected to heat treatment to mainly denature contaminating proteins, etc. A method for removing components other than the protein of the invention or a variant thereof; the protein according to the present invention or the like according to the present invention by denature mainly contaminating proteins by acting ammonium sulfate, ethanolacetic acid, acetone or the like on the above-mentioned fraction A method for removing components other than the mutant; sodium sulfate, ammonium sulfate, A method for removing components other than the protein of the present invention or a mutant thereof by adding ethylene glycol to cause precipitation; a chromatographic method is employed for the above-mentioned fraction, and the protein of the present invention or a mutation thereof Examples thereof include methods for removing components other than the body, and these methods may be employed alone or in combination of two or more.
上述したクロマトグラフィーの具体的な種類は、特に限定されないが、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等を挙げることができ、これらのクロマトグラフィーは単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。 Specific types of the chromatography described above are not particularly limited, and examples thereof include cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, affinity chromatography, size exclusion gel filtration chromatography, reverse phase chromatography, and hydrophobic chromatography. These chromatographies may be used alone or in combination of two or more.
本発明のタンパク質又はその変異体をコードする核酸が、上述したタグポリペプチドをコードする核酸を含む場合には、当該タグポリペプチドとの相互作用に基づいたアフィニティカラムを用いることが好ましい。 When the nucleic acid encoding the protein of the present invention or a variant thereof includes a nucleic acid encoding the above-described tag polypeptide, it is preferable to use an affinity column based on the interaction with the tag polypeptide.
例えば、タグポリペプチドがＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ等である場合には場合、それぞれ抗ＦＬＡＧ抗体、抗ＨＡ抗体、抗ｍｙｃ抗体等といった、タグポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を担持するポリマーを含むアフィニティクロマトグラフィーを用いることが好ましい。このようなアフィニティクロマトグラフィーを用いる場合の溶出液としては、当該ペプチドを高濃度で含有する緩衝液、又はＧｌｙｓｉｎ−ＨＣｌ緩衝液のような、ｐＨが１〜５程度の酸性緩衝液を用いることが好ましい。 For example, when the tag polypeptide is a FLAG tag, HA tag, myc tag, etc., an antibody that specifically binds to the tag polypeptide, such as an anti-FLAG antibody, an anti-HA antibody, an anti-myc antibody, etc., respectively. It is preferable to use affinity chromatography including a polymer to be supported. As an eluent when using such affinity chromatography, it is preferable to use a buffer containing a high concentration of the peptide or an acidic buffer having a pH of about 1 to 5 such as a Glysin-HCl buffer. preferable.
また、タグポリペプチドがＭＢＰタグである場合には、マルトース等といった糖類を担持するポリマーを含むアフィニティクロマトグラフィーを用いることが好ましい。このようなアフィニティクロマトグラフィーを用いる場合の溶出液としては、糖類を高濃度で含む緩衝液を用いることが好ましい。 In addition, when the tag polypeptide is an MBP tag, it is preferable to use affinity chromatography including a polymer supporting a saccharide such as maltose. As an eluent when using such affinity chromatography, it is preferable to use a buffer containing a high concentration of saccharides.
さらに、タグポリペプチドがＨｉｓタグである場合には、ヒスチジン残基とキレート結合が可能となるニッケル、コバルト等の金属錯体を担持するポリマーを採用したアフィニティクロマトグラフィーを用いることが好ましい。このようなアフィニティクロマトグラフィーを用いる場合の溶出液としては、イミダゾールを高濃度で含有する緩衝液を用いることが好ましい。 Furthermore, when the tag polypeptide is a His tag, it is preferable to use affinity chromatography that employs a polymer carrying a metal complex such as nickel or cobalt that can be chelated with a histidine residue. As an eluent when using such affinity chromatography, it is preferable to use a buffer containing imidazole at a high concentration.
上述したタグポリペプチドは、本発明のタンパク質又は変異体を精製した後に適当なプロテアーゼ等を用いて切断除去してもよい。 The tag polypeptide described above may be cleaved and removed using a suitable protease after purifying the protein or variant of the present invention.
＜本発明の測定方法＞
本発明の黄色ブドウ球菌を測定する方法は、下記の工程１及び２を含む、試料中の黄色ブドウ球菌を測定する方法である。
<Measurement method of the present invention>
The method for measuring S. aureus of the present invention is a method for measuring S. aureus in a sample, comprising the following
（１）上述の本発明の支持体と、黄色ブドウ球菌を含む試料とを混合して、前記黄色ブドウ球菌と該支持体との複合体を形成させる工程１、
（２）工程１の後、混合後の試料中の前記複合体を測定する工程２。
(1)
(2)
本発明の測定方法において、検出対象とする黄色ブドウ球菌は、＜本発明のタンパク質＞の欄にて前述した黄色ブドウ球菌である。 In the measurement method of the present invention, S. aureus to be detected is S. aureus described above in the section <Protein of the present invention>.
本発明の測定方法において、黄色ブドウ球菌を含む試料とは、特に限定はされないが、例えば、黄色ブドウ球菌への感染が疑われる生体から採取されるものであり、黄色ブドウ球菌を含む任意の体液（例えば、血液、血清、血漿、尿、鼻汁液、唾液、粘液質、胃液、***、涙、汗など）、皮膚、毛髪、細胞（特に、有核細胞）、生検、鼻腔スワブ、口腔スワブ又は組織標本等が挙げられる。 In the measurement method of the present invention, the sample containing S. aureus is not particularly limited. For example, any body fluid collected from a living body suspected of being infected with S. aureus and containing S. aureus. (Eg, blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, mucus, gastric fluid, semen, tears, sweat, etc.), skin, hair, cells (especially nucleated cells), biopsy, nasal swab, oral swab or Examples include tissue specimens.
本発明の黄色ブドウ球菌を測定する方法には、定性的に測定する方法も、定量的に測定する方法も含まれる。ここで、『定性的に測定する』とは、試料中に黄色ブドウ球菌が存在するか否かといった、試料中の黄色ブドウ球菌の存在の有無を判断する方法である。 The method for measuring S. aureus of the present invention includes a method for qualitative measurement and a method for quantitative measurement. Here, “qualitatively measure” is a method for determining the presence or absence of S. aureus in a sample, such as whether or not S. aureus is present in the sample.
このような方法は、例えば、黄色ブドウ球菌に感染した生体内から採取した鼻水や血液等の試料中に含まれる黄色ブドウ球菌の量に対応する実測値を、所定の値と比較して高い値であれば、試料中に黄色ブドウ球菌が存在すると判断し、逆に低い値であれば存在し無いと判断する方法が挙げられる。ここで、実測値の求め方は、下記の工程２の欄にて詳述する。
Such a method is, for example, that a measured value corresponding to the amount of Staphylococcus aureus collected in a sample such as a runny nose or blood collected from a living body infected with Staphylococcus aureus is a high value compared to a predetermined value. If so, a method of determining that Staphylococcus aureus is present in the sample and conversely determining that it is not present if the value is low can be mentioned. Here, how to obtain the actual measurement value will be described in detail in the column of
他の『定性的に測定する』方法としては、目視によって試料中の黄色ブドウ球菌の存在の有無を判断する方法も挙げられる。この具体的な方法については、下記の工程２の欄にて詳述する。
As another “qualitative measurement” method, there is a method of visually determining the presence or absence of Staphylococcus aureus in a sample. This specific method will be described in detail in the
また、『定量的に測定する』とは、試料中の黄色ブドウ球菌の具体的な存在量を測定することを意味する。 “Quantitatively measuring” means measuring a specific abundance of S. aureus in a sample.
例えば、予め各種の量が規定された黄色ブドウ球菌の標準物質の実測値と、斯かる各種標準物質中の黄色ブドウ球菌の量を基にして２者の関係を示す検量線を作成し、黄色ブドウ球菌を含むと考えられる試料の実測値と該検量線を基にして、試料中の黄色ブドウ球菌の具体的な量を算出する方法が挙げられる。なお、実測値の求め方は、下記の工程２の欄にて詳述する。
For example, a calibration curve indicating the relationship between the two is prepared based on the actual measurement values of S. aureus standard substances in which various amounts are defined in advance and the amounts of S. aureus in such various standard substances. A method for calculating a specific amount of Staphylococcus aureus in the sample based on the actual measurement value of the sample considered to contain staphylococci and the calibration curve can be mentioned. The method for obtaining the actual measurement value will be described in detail in the
工程１について
本発明の黄色ブドウ球菌を測定する方法における工程１は、上述の本発明の支持体と、黄色ブドウ球菌を含む試料とを混合して、前記黄色ブドウ球菌と該支持体との複合体を形成する工程である。混合に係る操作には、振とうする操作が含まれていてよく、ピペッティング操作が含まれていてもよい。
複合体の形成にかかる時間は、特に限定されず、前記支持体、特に支持体中に含まれる本発明のタンパク質又はその変異体と試料中の黄色ブドウ球菌が接触して、前記複合体が形成されればよく、通常は４５〜６０秒程度とすればよい。また、複合体形成時の温度も特に限定はされないが、通常は室温程度であればよい。 The time required for the formation of the complex is not particularly limited, and the complex is formed by contacting the support, particularly the protein of the present invention contained in the support or a variant thereof, with S. aureus in the sample. What is necessary is just to set it as about 45-60 seconds normally. Further, the temperature at the time of forming the complex is not particularly limited, but it is usually only about room temperature.
工程１において、形成される複合体とは、図２に示すように、前記少なくとも1つ以上の本発明のタンパク質又はその変異体を有する支持体に複数の黄色ブドウ球菌が結合することで、前記担体と黄色ブドウ球菌が連鎖的に結合し、凝集体となる。
In
なお、複合体の形成は、黄色ブドウ球菌の細胞表面に存在するテイコ酸を介して形成されていることが好ましい。 The complex is preferably formed via teichoic acid present on the cell surface of S. aureus.
工程２について
本発明の黄色ブドウ球菌を測定する方法における工程２は、工程１の後、混合後の試料中の前記複合体を測定する工程である。
具体的な測定方法は特に限定はされないが、例えば、上述のように黄色ブドウ球菌を『定性的に測定』する場合には、試料中の複合体の凝集を目視で測定すればよい。また、黄色ブドウ球菌を測定する方法としては、試料に対してレーザー光等といった光を当てて、試料全体の濁度、光の散乱度等を実測値として測定すればよい。この場合、それぞれある一定以上の濁度、散乱度等が実測値として得られた試料中には、黄色ブドウ球菌が存在すると判断することができる。 The specific measurement method is not particularly limited. For example, when staphylococcus aureus is "qualitatively measured" as described above, the aggregation of the complex in the sample may be measured visually. In addition, as a method for measuring S. aureus, light such as laser light may be applied to the sample, and the turbidity of the entire sample, the degree of light scattering, etc. may be measured as measured values. In this case, it can be determined that Staphylococcus aureus is present in samples in which turbidity, scattering degree, etc. above a certain level are obtained as measured values.
また、上述のように黄色ブドウ球菌を『定量的に測定』する場合も、試料に対してレーザー光等といった光を当てて得られる濁度又は光散乱度を実測し、その値を基に実測値と黄色ブドウ球菌の存在量との関係における検量線を作成し、試料の実測値を基に試料中の黄色ブドウ球菌の量を算出すればよい。 In addition, when staphylococcus aureus is “quantitatively measured” as described above, turbidity or light scattering obtained by irradiating the sample with light such as laser light is measured and measured based on that value. A calibration curve in the relationship between the value and the abundance of Staphylococcus aureus may be created, and the amount of Staphylococcus aureus in the sample may be calculated based on the actual measurement value of the sample.
以下に本発明をさらに詳細に説明する。但し、本発明が以下に示す試験例に限定されないのは言うまでも無い。 The present invention is described in further detail below. However, it goes without saying that the present invention is not limited to the following test examples.
なお、本発明には黄色ブドウ球菌に由来するテイコ酸を測定する方法も包含される。具体的には、上述した本発明のペプチド又はその変異体、それと担体とを含む支持体、若しくはそれを認識する抗体を用いて、公知の方法と適宜組み合わせることによって測定できる。公知の方法としては、例えば、上記タンパク質又はその変異体を用い、ビアコア等の分子間相互作用測定装置を利用した測定方法、上記支持体を用い、その凝集を利用した比色法による定量、上記抗体利用し、ＥＬＡＳＡ等の免疫測定法による定量が挙げられる。 The present invention also includes a method for measuring teichoic acid derived from Staphylococcus aureus. Specifically, it can be measured by appropriately combining with the known method using the above-mentioned peptide of the present invention or a variant thereof, a support containing it and a carrier, or an antibody recognizing it. Known methods include, for example, a measurement method using an intermolecular interaction measuring apparatus such as Biacore using the protein or a variant thereof, a quantification by a colorimetric method using the support and an aggregation thereof, Examples include quantification using an antibody and an immunoassay method such as ELASA.
＜試験例＞
培地、試薬、及び菌株
本実施例にて使用した培地及び試薬は全てベクトンディッキンソンアンドカンパニー（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）及びナカライテスク （Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）からそれぞれ購入して用いた。菌株の入手先等は表１に示す通りである。
<Test example>
Media, Reagents, and Strains The media and reagents used in this example were all purchased from Becton Dickinson and Company (Sparks, MD) and Nacalai Tesque (Kyoto, Japan). The sources of strains are as shown in Table 1.
＜実験例１：黄色ブドウ球菌に対するファージの単離＞
黄色ブドウ球菌に対するファージは、高知県高知市及び安芸市の下水処理場における流入水から、公知の方法を用いて単離・精製を行った。ここで、２種類の黄色ブドウ球菌に対するファージが得られ、それぞれをＳ１３′、Ｓ２４−１と命名した。
<Experimental Example 1: Isolation of phages against Staphylococcus aureus>
The phages against S. aureus were isolated and purified from the inflow water at sewage treatment plants in Kochi City and Aki City, Kochi Prefecture using a known method. Here, phages against two types of Staphylococcus aureus were obtained and designated as S13 ′ and S24-1.
なお、得られた２種類のファージは、尾部を保有する形態であるＰｏｄｏｖｉｒｉｄａｅファミリーに属するファージであった。 The two types of phages obtained were phages belonging to the Podobiridae family, which has a tail.
これらのファージの解析を行ったところ、共に１９ｋｂｐ程度のゲノムサイズを有するものの、構造タンパク質に違いがあり、またＳ１３′は、黄色ブドウ球菌の８９株中７４株を宿主とし（８３．１％）、Ｓ２４−１では同じ８９株中８５株を宿主とした（９５．５％）。詳細な結果を、表２に示す。 When these phages were analyzed, both had a genome size of about 19 kbp, but there were differences in the structural proteins, and S13 ′ had 74 strains out of 89 strains of S. aureus as a host (83.1%). In S24-1, 85 out of 89 strains were used as hosts (95.5%). Detailed results are shown in Table 2.
これら２種類のファージのゲノムを、さらに詳細に解析したところ、ＯＲＦ１６の領域において、相同性が明らかに欠いていることを見出した。 When the genomes of these two types of phages were analyzed in more detail, it was found that homology was clearly lacking in the ORF16 region.
＜実験例２：ＯＲＦ１６について＞
上述のＯＲＦ１６領域が、２種類のファージ間の宿主域の違いに関与すると判断し、大腸菌（ＢＬ２１株）を用いてＳ２４−１のＯＲＦ１６遺伝子を発現させた。分子量７７．４ｋＤａ、アミノ酸数６４２ａａ、等電点が６．４のタンパク質であることが明らかとなった。
<Experimental example 2: About ORF16>
The ORF16 region described above was judged to be involved in the difference in host range between the two types of phages, and the SRF-1 ORF16 gene was expressed using E. coli (BL21 strain). It was revealed that the protein had a molecular weight of 77.4 kDa, an amino acid number of 642 aa, and an isoelectric point of 6.4.
また、当該タンパク質（以後、ＯＲＦ１６タンパク質と呼ぶことがある）に対する抗ウサギ血清を用いた実験により、ＯＲＦ１６タンパク質がＳ２４−１の構造タンパク質であることが判明した。 Further, an experiment using anti-rabbit serum against the protein (hereinafter sometimes referred to as ORF16 protein) revealed that the ORF16 protein is a structural protein of S24-1.
そして、当該抗ウサギ血清を用いた実験により、ＯＲＦ１６タンパク質はＳ２４−１の尾部に存在する領域であること（免疫電子顕微鏡像）、及びＯＲＦ１６タンパク質はＳ２４−１と黄色ブドウ球菌との吸着が阻害されること（中和活性）も明らかとなった。 Then, according to the experiment using the anti-rabbit serum, the ORF16 protein is a region existing in the tail of S24-1 (immunoelectron micrograph), and the ORF16 protein inhibits the adsorption of S24-1 and Staphylococcus aureus. (Neutralizing activity) was also revealed.
＜実験例３：ＯＲＦ１６タンパク質の黄色ブドウ球菌との結合部位＞
従ってＯＲＦ１６タンパク質は、Ｓ２４−１の尾部に存在する黄色ブドウ球菌に対する結合部位であることが明らかとなった。より詳細にＯＲＦ１６タンパク質中の黄色ブドウ球菌に対する結合部位を明らかにするために、ＯＲＦ１６タンパク質及びその欠損変異体の黄色ブドウ球菌との結合実験を行った。各種欠損変異体は、図１に示すＯＲＦ１６Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、及びＯＲＦ１６Ｒ１〜５である。
<Experimental Example 3: Binding site of ORF16 protein to Staphylococcus aureus>
Therefore, it was revealed that the ORF16 protein is a binding site for S. aureus existing in the tail of S24-1. In order to clarify the binding site for Staphylococcus aureus in ORF16 protein in more detail, binding experiments with Staphylococcus aureus of ORF16 protein and deletion mutants thereof were performed. Various deletion mutants are ORF16F1, F3, F5, and ORF16R1-5 shown in FIG.
具体的には、ＯＲＦ１６タンパク質及びその各種欠損変異体を、上述のように大腸菌ＢＬ２１株を用いて発現し、精製したものを、過剰量の黄色ブドウ球菌ＳＡ１４株と１分間インキュベートし、その後のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって確認して、当該タンパク質及びその変異体のバンド消失が消失したものを、黄色ブドウ球菌を結合したと判定した。なお、作成したＯＲＦ１６タンパク質及びそれらの欠損変異体は、全て溶解性を有するタンパク質であった。 Specifically, the ORF16 protein and various deletion mutants thereof were expressed using E. coli BL21 strain as described above, purified, and incubated with an excessive amount of S. aureus SA14 strain for 1 minute, and then samples Was confirmed by SDS-PAGE, and the disappearance of the band disappearance of the protein and its mutant was determined to be bound to Staphylococcus aureus. All of the prepared ORF16 proteins and their defective mutants were soluble proteins.
また、陰性対照実験として、菌体を含まないもの及び黄色ブドウ球菌に代わりに腸球菌（Ｅ．ｆｅａｃａｌｉｓ）ＥＦ２４株を用いた実験も行った。結果を表３に示す。 In addition, as a negative control experiment, an experiment using no E. coli and E. fecalalis EF24 strain instead of Staphylococcus aureus was also conducted. The results are shown in Table 3.
以上の結果から、ＯＲＦ１６タンパク質、そのＮ末端側の１００アミノ酸残基を欠失させたＯＲＦ１６Ｆ１、そのＮ末端側の３０２アミノ酸残基を欠失させたＯＲＦ１６Ｆ３、及びそのＮ末端側の５０４アミノ酸残基を欠失させたＯＲＦ１６Ｆ５では、黄色ブドウ球菌に結合するものの、ＯＲＦ１６タンパク質の中でも、少なくともＣ末端側の１０１アミノ酸を欠失させたＯＲＦ１６Ｒ１〜５では、黄色ブドウ球菌には結合しないという結果が得られた。
From the above results, ORF16 protein, ORF16F1 from which the N-
従って、ＯＲＦ１６のＣ末端側の１０１アミノ酸の領域（図１におけるＯＲＦ１６ＸＸ）が、黄色ブドウ球菌に結合する領域であることが判明した。このような配列は、本発明において配列番号１にて示される配列である。 Therefore, it was found that the region of 101 amino acids on the C-terminal side of ORF16 (ORF16XX in FIG. 1) is a region that binds to S. aureus. Such a sequence is the sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the present invention.
＜実験例４：黄色ブドウ球菌の検出＞
上述のＯＲＦ１６タンパク質及びその各種欠損変異体をビーズに結合させた。具体的には、アフィニティビーズキット（品名アフィニティビーズ：住友ベークライト社）を用い、マニュアルに沿った方法にて結合させた。
<Experimental Example 4: Detection of Staphylococcus aureus>
The above-mentioned ORF16 protein and various deletion mutants thereof were bound to beads. Specifically, using an affinity bead kit (product name affinity beads: Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), binding was carried out according to the method in accordance with the manual.
２５μＬのビーズを結合させたＯＲＦ１６タンパク質（１０ｍｇ／ｍＬ）と、２５μＬの黄色ブドウ球菌ＳＡ１４株（５９５ｎｍの吸光度が０．１の濃度に希釈したもの。）と９６ウェルプレートにて１分間インキュベートした。なお、ＯＲＦ１６タンパク質は、ＰＢＳにて２倍希釈、４倍希釈したものも同時に実験に供し、陰性対照として、ＢＳＡとビーズを結合したもの、ビーズのみのものを用いた。 Incubated for 1 minute in a 96-well plate with ORF16 protein (10 mg / mL) bound with 25 μL of beads and 25 μL of S. aureus SA14 strain (absorbance at 595 nm diluted to a concentration of 0.1). For the ORF16 protein, those diluted 2-fold or 4-fold with PBS were also used in the experiment at the same time, and as a negative control, a BSA-bead-bound one or a bead-only one was used.
また、黄色ブドウ球菌もＰＢＳとＴＢＳにて２倍希釈、４倍希釈したものも同時に実験に供し、陰性対照として腸球菌ＥＦ２４株を用いた。結果を図３に示す。 In addition, S. aureus that had been diluted 2-fold or 4-fold with PBS and TBS was simultaneously subjected to the experiment, and Enterococcus EF24 strain was used as a negative control. The results are shown in FIG.
ビーズが結合したＯＲＦ１６タンパク質と黄色ブドウ球菌ＳＡ１４をインキュベートしたものは、凝集体が生じていることが目視にて確認できる。一方で、ＢＳＡとビーズを結合したものや、ビーズのみのもの、さらに腸球菌を用いたものでは、一切凝集体を目視にて確認することはできなかった。 It can be visually confirmed that aggregates are formed in the case of incubating the ORF16 protein to which beads are bound and S. aureus SA14. On the other hand, aggregates could not be visually confirmed at all with BSA and beads bound, with beads alone, or with enterococci.
以上の結果かから、ビーズが結合したＯＲＦ１６タンパク質は、黄色ブドウ球菌を高い特異性で、目視にて測定できることが明らかとなった。 From the above results, it has been clarified that the ORF16 protein to which the beads are bound can visually measure S. aureus with high specificity.
また、凝集体出現の程度は、ビーズが結合したＯＲＦ１６タンパク質及び黄色ブドウ球菌の希釈の程度に従って減少していることも明らかとなった。従って、ビーズが結合したＯＲＦ１６タンパク質を用いることにより、黄色ブドウ球菌の定量的な測定も可能となる。 It was also revealed that the degree of aggregate appearance decreased according to the degree of dilution of the ORF16 protein and S. aureus to which the beads were bound. Therefore, quantitative measurement of Staphylococcus aureus is also possible by using ORF16 protein to which beads are bound.
次いで、黄色ブドウ球菌のどのような成分に対して上記ＯＲＦ１６タンパク質又はその変異体が結合するのかを検討した。 Next, it was examined to which component of S. aureus the ORF16 protein or a variant thereof binds.
＜実験例５：ＯＲＦ１６タンパク質の黄色ブドウ球菌の認識部位の探索＞
上述のＯＲＦ１６タンパク質が結合したビーズを準備した。これに対して、下記の表４の「処理方法」に示す方法によって、黄色ブドウ球菌（ＳＡ１４株）を処理したものを、ウェル中で混合し、凝集が見られるかどうかを検討した。実験条件及び結果を、表４及び図４に示す。
<Experimental example 5: Search for recognition site of S. aureus of ORF16 protein>
Beads to which the above-mentioned ORF16 protein was bound were prepared. On the other hand, by treating with Staphylococcus aureus (SA14 strain) by the method shown in “Processing method” in Table 4 below, the wells were mixed to examine whether aggregation was observed. Experimental conditions and results are shown in Table 4 and FIG.
表４中、ウェルＮｏ．２〜５は、黄色ブドウ球菌の細胞壁構成成分のうち、タンパク質を変性又は分解させて、それを破壊する目的で行った処理である。ウェルＮｏ．６〜８は、黄色ブドウ球菌の細胞壁構成成分のうち、リポテイコ酸を破壊する目的で行った処理である。そして、ウェルＮｏ．９及び１０は、テイコ酸を破壊する目的で行った処理である。 In Table 4, well no. 2 to 5 are treatments performed for the purpose of denaturing or degrading proteins among cell wall constituents of Staphylococcus aureus and destroying them. Well No. 6-8 are treatments performed for the purpose of destroying lipoteichoic acid among the cell wall constituents of Staphylococcus aureus. And well No. 9 and 10 are treatments performed for the purpose of destroying teichoic acid.
図４はウェル中における凝集を確認するために撮影した写真像である。ここで、ＯＲＦ１６タンパク質が結合したビーズを含まないウェルＮｏ．１１共に、ウェルＮｏ．９及び１０においても凝集が見られなかった。ウェルＮｏ．９及び１０に示すようなＮａＯＨやＨＦによる処理は、細胞壁のペプチドグリカン層に結合しているテイコ酸を遊離させることが知られている。従って、この実験結果から、ＯＲＦ１６タンパク質は黄色ブドウ球菌のペプチドグリカン層に存在するテイコ酸に結合することが示唆された。 FIG. 4 is a photographic image taken to confirm the aggregation in the well. Here, the well no. 11 are well nos. In 9 and 10, no aggregation was observed. Well No. Treatment with NaOH or HF as shown in 9 and 10 is known to release teichoic acid bound to the peptidoglycan layer of the cell wall. Therefore, this experimental result suggested that ORF16 protein binds to teichoic acid present in the peptidoglycan layer of S. aureus.
＜実験例６：ＯＲＦ１６タンパク質と黄色ブドウ球菌構成成分との結合＞
黄色ブドウ球菌（ＳＡ１４株）を下記の表５に示す条件で処理し、その上清とペレットを遠心分離法に供することによって準備した。
<Experimental Example 6: Binding of ORF16 protein to S. aureus constituents>
A staphylococcus aureus (SA14 strain) was treated under the conditions shown in Table 5 below, and the supernatant and pellet were prepared by centrifugation.
表５に示す、それぞれのサンプルと、上述の方法にて作製したＯＲＦ１６タンパク質とを混合し、それをＯＲＦ１６タンパク質に対する抗体を用いたウェスタンブロッティング法に供して、両者の結合を確認する実験を行った。結果を図５に示す。 Each sample shown in Table 5 was mixed with the ORF16 protein prepared by the above-described method, and this was subjected to a Western blotting method using an antibody against the ORF16 protein, and an experiment was conducted to confirm the binding between them. . The results are shown in FIG.
サンプルＮｏ．８及び９において、上清側にＯＲＦ１６が結合していることを示すバンドが観察された。以上の実験結果からも、ＯＲＦ１６タンパク質は、黄色ブドウ球菌のペプチドグリカン層に存在するテイコ酸に結合することが示唆された。 Sample No. In 8 and 9, a band indicating that ORF16 was bound to the supernatant was observed. The above experimental results also suggested that ORF16 protein binds to teichoic acid present in the peptidoglycan layer of S. aureus.
＜実験例６：ＯＲＦ１６タンパク質と黄色ブドウ球菌構成成分との結合＞
テイコ酸（ＷＴＡｓ）、リポテイコ酸（ＬＴＡｓ）、及びペプチドグリカン（Ｐｅｐｔｉｄｅｇｌｙｃａｎ）を調整した。
<Experimental Example 6: Binding of ORF16 protein to S. aureus constituents>
Teichoic acid (WTAs), lipoteichoic acid (LTAs), and peptidoglycan (Peptideglycan) were prepared.
テイコ酸の調整方法は、以下の通りである。黄色ブドウ球菌（ＳＡ１４株）を一晩 液体培養後、遠心によりペレットにした。得られた菌ペレットを液１（５０ｍＭのＭＥＳ，ｐＨ６．５）で洗浄し、１５分超音波処理を行った。その後、液２（４％のＳＤＳ；５０ｍＭのＭＥＳ，ｐＨ６．５）に懸濁し、1時間熱処理を行った。次に、液３（２％のＮａＣｌ；５０ｍＭのＭＥＳ，ｐＨ６．５）で1回洗浄、液１で５回洗浄した。ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を用い、５０℃で一晩処理した後、０．１ＭのＮａＯＨで２日間（室温）処理を行った。ＨＣｌでｐＨ７．０に中和し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で透析を行った。最後に、遠心濃縮器で濃縮を行い、水に対して透析し、凍結乾燥してテイコ酸を作製した。
The method for adjusting teichoic acid is as follows. S. aureus (SA14 strain) was liquid cultured overnight and then pelleted by centrifugation. The obtained bacterial pellet was washed with liquid 1 (50 mM MES, pH 6.5) and sonicated for 15 minutes. Then, it was suspended in liquid 2 (4% SDS; 50 mM MES, pH 6.5), and heat-treated for 1 hour. Next, it was washed once with liquid 3 (2% NaCl; 50 mM MES, pH 6.5) and washed 5 times with
リポテイコ酸はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより購入した。 Lipoteichoic acid was purchased from Sigma-Aldrich.
ペプチドグリカンの調整方法は、以下の通りである。黄色ブドウ球菌（ＳＡ１４）を一晩、液体で培養後、遠心によりペレットにした。得られた菌ペレットを５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で洗浄後、４％のＳＤＳで４０分熱処理を行った。水で５回洗浄後、菌体をガラスビーズでホモジェネートし、菌体を破壊した。ついでＤＮａｓｅとＲＮａｓｅ（３ｈ，３７℃）、トリプシン（一晩，３７℃）で処理後、１％のＳＤＳで熱処理した。水で洗浄２回、８ＭのＬｉＣｌで洗浄1回、１００ｍＭのＥＤＴＡで１回洗浄、水で２回洗浄した。凍結乾燥したサンプルを、４９％のＨＦを用いて２日間（４℃）で処理後、水で５回洗浄を行った。そして、アルカリホスファターゼ（１６ｈ，３７℃）で処理し、熱処理したものを更に水で５回洗浄しサンプルを調整した。 The method for preparing peptidoglycan is as follows. S. aureus (SA14) was cultured overnight in liquid and then pelleted by centrifugation. The obtained bacterial pellet was washed with 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) and then heat-treated with 4% SDS for 40 minutes. After washing 5 times with water, the cells were homogenized with glass beads to destroy the cells. Then, after treatment with DNase, RNase (3 h, 37 ° C.) and trypsin (overnight, 37 ° C.), heat treatment was performed with 1% SDS. Washed twice with water, washed once with 8M LiCl, washed once with 100 mM EDTA, and washed twice with water. The freeze-dried sample was treated with 49% HF for 2 days (4 ° C.) and then washed 5 times with water. Then, the sample was prepared by treatment with alkaline phosphatase (16 h, 37 ° C.) and further washing with heat for 5 times.
上述のテイコ酸、リポテイコ酸、及びペプチドグリカンと、上述のＯＲＦ１６タンパク質結合ビーズとをウェル中で混合し、凝集が生じるかどうかを、目視によって評価した。その結果を図６に示す。 The above-described teichoic acid, lipoteichoic acid, and peptidoglycan were mixed with the above-mentioned ORF16 protein-bound beads in a well, and whether or not aggregation occurred was visually evaluated. The result is shown in FIG.
ＷＴＡｓ（テイコ酸）に対してのみ、ＯＲＦ１６タンパク質結合ビーズが凝集することが観察された。従って、ＯＲＦ１６タンパク質は、黄色ブドウ球菌細胞表層に存在するテイコ酸にのみ結合することが明らかとなった。 It was observed that ORF16 protein-bound beads aggregated only for WTAs (teicoic acid). Therefore, it was revealed that the ORF16 protein binds only to teichoic acid present in the surface layer of S. aureus cells.
これらの実験例から、ＯＲＦ１６タンパク質、中でもＯＲＦ１６タンパク質のＣ末端側の１０１アミノ酸の領域（図１におけるＯＲＦ１６ＸＸ；配列番号１）が、黄色ブドウ球菌細胞表層のテイコ酸に結合することが明らかとなった。 From these experimental examples, it became clear that the region of 101 amino acids on the C-terminal side of ORF16 protein (ORF16XX in FIG. 1; SEQ ID NO: 1) of ORF16 protein binds to teichoic acid on the surface layer of S. aureus cells. .
Claims (9)
配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる黄色ブドウ球菌に吸着する変異体。 A protein adsorbing to Staphylococcus aureus comprising the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 7, or
A variant adsorbing to S. aureus comprising an amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 .
（Ａ）請求項７に記載の宿主を培養する工程Ａ。
（Ｂ）工程Ａの後、請求項１又は２に記載のタンパク質又はその変異体を含む画分を、該宿主又は培養液から回収する工程Ｂ。 A method for producing a protein or variant thereof according to claim 1, comprising the following steps A and B:
(A) A step of culturing the host according to claim 7.
(B) A step B of recovering a fraction containing the protein or variant thereof according to claim 1 or 2 from the host or culture solution after step A.
（１）請求項３に記載の支持体と、前記試料とを混合して、前記黄色ブドウ球菌と、該支持体の複合体を形成する工程１、
（２）工程１の後、混合後の試料中の前記複合体を測定する工程２。 A method for detecting S. aureus in a sample, comprising the following steps 1 and 2.
(1) Step 1 of mixing the support according to claim 3 and the sample to form a complex of the S. aureus and the support,
(2) Step 2 of measuring the complex in the mixed sample after Step 1.
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