JP5912151B2 - Glucagon analog - Google Patents
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Description
本発明は、グルカゴン類似体、並びに例えば、過剰食物摂取、肥満、及び過剰体重の処置におけるそれらの医学的な使用に関する。 The present invention relates to glucagon analogs and their medical use in the treatment of, for example, excess food intake, obesity, and excess weight.
プレプログルカゴンは、グルカゴン(Glu)、グルカゴン様ペプチド‐1(GLP‐1)、グルカゴン様ペプチド‐2(GLP‐2)、及びオキシントモジュリン(OXM)を含めた多くの構造的に関連したプログルカゴン由来ペプチドを形成するように組織内で別々に処理された158個のアミノ酸の前駆体ポリペプチドである。これらの分子は、グルコースの恒常性、インシュリン分泌、胃内容排出及び腸の成長、並びに摂食の調整を含めたさまざまな生理機能にかかわっている。 Preproglucagon has many structurally related proglucagons including glucagon (Glu), glucagon-like peptide-1 (GLP-1), glucagon-like peptide-2 (GLP-2), and oxyntomodulin (OXM). A 158 amino acid precursor polypeptide that has been processed separately in tissue to form a derived peptide. These molecules are involved in a variety of physiological functions, including glucose homeostasis, insulin secretion, gastric emptying and intestinal growth, and feeding regulation.
グルカゴンは、プレプログルカゴンの第53〜81アミノ酸に相当する、配列His‐Ser‐Gln‐Gly‐Thr‐Phe‐Thr‐Ser‐Asp‐Tyr‐Ser‐Lys‐Tyr‐Leu‐Asp‐Ser‐Arg‐Arg‐Ala‐Gln‐Asp‐Phe‐Val‐Gln‐Trp‐Leu‐Met‐Asn‐Thr(配列番号1)を持つ29個のアミノ酸のペプチドである。オキシントモジュリン(OXM)は、配列Lys‐Arg‐Asn‐Arg‐Asn‐Asn‐Ile‐Ala(配列番号2)を持つ「介在ペプチド1」若しくはIP‐1と呼ばれるオクタペプチド・カルボキシ末端伸長(プレプログルカゴンの第82〜89アミノ酸)を伴ったグルカゴンの完全な29個のアミノ酸配列を含んでいる37個のアミノ酸のペプチドである;よって、ヒト・オキシントモジュリンの完全な配列は、His‐Ser‐Gln‐Gly‐Thr‐Phe‐Thr‐Ser‐Asp‐Tyr‐Ser‐Lys‐Tyr‐Leu‐Asp‐Ser‐Arg‐Arg‐Ala‐Gln‐Asp‐Phe‐Val‐Gln‐Trp‐Leu‐Met‐Asn‐Thr‐Lys‐Arg‐Asn‐Arg‐Asn‐Asn‐Ile‐Ala(配列番号3)である。GLP‐1の主要な生物学的に活性な断片は、30個のアミノ酸であって、プレプログルカゴンの第98〜127アミノ酸に相当するC末端がアミド化されたペプチドとして産生される。 Glucagon has the sequence His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg- It is a 29 amino acid peptide with Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO: 1). Oxint modulin (OXM) is an octapeptide carboxy-terminal extension (prepro) called “intervening peptide 1” or IP-1 with the sequence Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala (SEQ ID NO: 2). A 37 amino acid peptide containing the complete 29 amino acid sequence of glucagon with the 82-89 amino acids of glucagon); thus the complete sequence of human oxyntomodulin is His-Ser- Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met- Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-I Is an e-Ala (SEQ ID NO: 3). The main biologically active fragment of GLP-1 is produced as a peptide with 30 amino acids, the C-terminal corresponding to amino acids 98-127 of preproglucagon being amidated.
グルカゴンは、肝細胞上のグルカゴン受容体に結合し、肝臓がグリコーゲン分解によって‐グリコーゲンの形で保存された‐グルコースの放出を引き起こすことによって血中のグルコースレベルを維持するのに役立っている。これらの蓄えが使い果たされたとき、グルカゴンは、糖新生によって追加のグルコースを合成するように肝臓を刺激する。このグルコースが血流内に放出され、低血糖の発生を予防する。 Glucagon binds to glucagon receptors on hepatocytes and serves to maintain blood glucose levels by causing the liver to release glucose by glycogenolysis-conserved in the form of glycogen-. When these stores are exhausted, glucagon stimulates the liver to synthesize additional glucose by gluconeogenesis. This glucose is released into the bloodstream to prevent the occurrence of hypoglycemia.
OXMは、食物摂取に対応し、且つ、食事のカロリー量に比例して血液中に放出される。OXMが、ヒトの食欲を抑制し、そして食物摂取を阻害することが明らかにされた(Cohenら、Journal of Endocrinology and Metabolism、第88号、4696〜4701頁、2003年;WO 2003/022304)。オキシントモジュリンで処理したラットがペアフィード・ラットに比べてわずかな体重増加しか示さなかったので、(GLP‐1のそれと同様である)オキシントモジュリンの食欲抑制作用に加えて(Bloom, Endocrinology 2004, 145, 2687)、OXMはさらに別の機構によって体重に作用しているはずである。OXMによる肥満齧歯動物の処置はさらに、それらの耐糖能を改善し(Parlevlietら、Am J Physiol Endocrinol Metab、第294号、E142〜7頁、2008年)、且つ、体重増加を抑制する(WO 2003/022304)。 OXM corresponds to food intake and is released into the blood in proportion to the caloric content of the meal. OXM has been shown to suppress human appetite and inhibit food intake (Cohen et al., Journal of Endocrinology and Metabolism, 88, 4696-4701, 2003; WO 2003/022304). In addition to the appetite suppressive effect of oxyntomodulin (similar to that of GLP-1), rats treated with oxyntomodulin showed only a slight weight gain compared to pair-fed rats (Bloom, Endocrinology 2004 , 145, 2687), OXM must act on body weight by yet another mechanism. Treatment of obese rodents with OXM further improves their glucose tolerance (Parlevliet et al., Am J Physiol Endocrinol Metab, 294, E142-7, 2008) and suppresses weight gain (WO 2003/022304).
OXMは、グルカゴン受容体とGLP‐1受容体の両方を、GLP‐1受容体よりもグルカゴン受容体を二倍強力に活性化するが、それは、天然のグルカゴン及びGLP‐1がそれらのそれぞれの受容体に対するほど強力でない。GLP‐1受容体よりもグルカゴン受容体に関して強い優先傾向があるとはいえ、グルカゴンもまた両方の受容体を活性化することができる。その一方、GLP‐1はグルカゴン受容体を活性化することができない。オキシントモジュリンの作用機序は十分に理解されていない。特に、ホルモンの効果が伝達されるのが、グルカゴン受容体やGLP‐1受容体を通じてだけなのか、1若しくは複数のいまだ同定されていない受容体を通じてだけなのか知られていない。 OXM activates both the glucagon receptor and the GLP-1 receptor two times more potently than the GLP-1 receptor, because natural glucagon and GLP-1 Not as powerful against the receptor. Although there is a strong preference for the glucagon receptor over the GLP-1 receptor, glucagon can also activate both receptors. On the other hand, GLP-1 cannot activate the glucagon receptor. The mechanism of action of oxyntomodulin is not well understood. In particular, it is not known whether hormonal effects are transmitted only through the glucagon receptor or GLP-1 receptor or only through one or more unidentified receptors.
他のペプチドが、グルカゴン受容体とGLP‐1の両方に結合し、そして活性化すること(Hjortら、Journal of Biological Chemistry、第269号、30121〜30124頁)、及び体重増加を抑制し、且つ、食物摂取を低減すること(WO 2006/134340;WO 2007/100535;WO 2008/101017)が知られている。 Other peptides bind to and activate both glucagon receptor and GLP-1 (Hjort et al., Journal of Biological Chemistry, No. 269, 30121-30124) and inhibit weight gain, and It is known to reduce food intake (WO 2006/134340; WO 2007/100535; WO 2008/101017).
肥満は、世界的に高まっている健康問題に分類され、そして様々な疾患、特に心血管疾患(CVD)、2型糖尿病、閉塞型睡眠時無呼吸症、特定のタイプの癌、及び骨関節炎と関連している。その結果、肥満は平均余命を短くすることがわかった。世界保健機構による2005年の予測によれば、世界中で4億人の成人(年齢>15歳)が肥満体に分類される。米国では、現在、肥満は、喫煙に次いで2番目に多い予防可能な死因であると考えられている。 Obesity is classified as a globally increasing health problem and includes various diseases, particularly cardiovascular disease (CVD), type 2 diabetes, obstructive sleep apnea, certain types of cancer, and osteoarthritis. Related. As a result, obesity has been found to shorten life expectancy. According to the World Health Organization's 2005 prediction, 400 million adults (age> 15 years) are classified as obese worldwide. In the United States, obesity is currently considered the second most common preventable cause of death after smoking.
肥満の増加は、糖尿病の増加を促進するので、2型糖尿病を患っている人の約90%が肥満に分類され得る。世界中には2億4600万人が糖尿病を患っていて、2025年までには、3億8000万人が糖尿病を患うであろうと推定されている。多くの人が、高い/異常なLDL及びトリグリセリド、そして低いHDLを含めた付加的な心血管疾患の危険因子を有する。 Since an increase in obesity promotes an increase in diabetes, about 90% of people with type 2 diabetes can be classified as obese. It is estimated that 246 million people worldwide have diabetes and that by 2025 380 million people will have diabetes. Many have additional cardiovascular disease risk factors including high / abnormal LDL and triglycerides, and low HDL.
糖尿病を患っている人は、糖尿病を患っていない人に比べて心血管疾患を発症する可能性が2〜4倍高いので、心血管疾患が糖尿病の最も一般的な合併症になっている。心血管疾患は、糖尿病を患っている人の死亡率の約50%の割合を占める。肥満や2型糖尿病の高い発生率及び有病率と共に、糖尿病を患っている若年成人は、糖尿病を患っていない若年成人に比べて冠動脈性心疾患(CHD)の割合が12〜40倍高く、これらの代謝異常に関連する罹患率と死亡率が、効果的な処置の選択肢の医学的な必要性を浮き彫りにしている。 Cardiovascular disease has become the most common complication of diabetes because people with diabetes are two to four times more likely to develop cardiovascular disease than people without diabetes. Cardiovascular disease accounts for approximately 50% of the mortality rate of people suffering from diabetes. Along with the high incidence and prevalence of obesity and type 2 diabetes, young adults with diabetes have a 12-40 times higher proportion of coronary heart disease (CHD) than young adults without diabetes, The morbidity and mortality associated with these metabolic disorders highlights the medical need for effective treatment options.
従って、肥満を処置すること、及び耐糖能を改善することの医学的な必要性が大いにある。 Thus, there is a great medical need for treating obesity and improving glucose tolerance.
第1の態様では、本発明は、式R1‐X‐Z‐R2
{式中、
R1が、H、C1‐4アルキル、アセチル、ホルミル、ベンゾイル又はトリフルオロアセチルであり;
In a first aspect, the present invention provides a compound of formula R 1 -XZR 2
{Where
R 1 is H, C 1-4 alkyl, acetyl, formyl, benzoyl or trifluoroacetyl;
R2が、OH又はNH2であり;
Xが、以下の式(I):
His‐Ser‐Gln‐Gly‐Thr‐Phe‐Thr‐Ser‐Asp‐Tyr‐Ser‐Leu‐Tyr‐Leu‐Asp‐Ser‐Arg‐Arg‐Ala‐Lys‐Asp‐Phe‐Ile‐Glu‐Trp‐Leu‐Glu‐Ser‐Ala(配列番号4)
R 2 is OH or NH 2 ;
X is the following formula (I):
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Leu-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Alag-Ala-Lys-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp- Leu-Glu-Ser-Ala (SEQ ID NO: 4)
を有するペプチドであるか;又は式(I)と異なる場合には、以下の:
2位の残基が:Aib、D‐Serから選択され;
16位の残基が:Arg、His、Lys、Glu、Gly、Aspから選択され;
Or, if different from formula (I), the following:
The residue at position 2 is selected from: Aib, D-Ser;
The residue at position 16 is selected from: Arg, His, Lys, Glu, Gly, Asp;
17位の残基が:Lys、Leuから選択され;
18位の残基が:Lys、His、Ala、Ser、Tyrから選択され;
20位の残基が:Gln、His、Arg、Glu、Aspから選択され;
21位の残基が:Gluであり;
23位の残基が:Val、Leuから選択され;
24位の残基が:Gln、Leu、Ala、Lys、Arg、Aspから選択され;
The residue at position 17 is selected from: Lys, Leu;
The residue at position 18 is selected from: Lys, His, Ala, Ser, Tyr;
The residue at position 20 is selected from: Gln, His, Arg, Glu, Asp;
The residue at position 21 is: Glu;
The residue at position 23 is selected from: Val, Leu;
The residue at position 24 is selected from: Gln, Leu, Ala, Lys, Arg, Asp;
27位の残基が:Met、Cys、Lys、Arg、Leuから選択され;
28位の残基が:Asn、Arg、Lys、Glu、Ala、Leu、Aspから選択され;及び
The residue at position 27 is selected from: Met, Cys, Lys, Arg, Leu;
The residue at position 28 is selected from: Asn, Arg, Lys, Glu, Ala, Leu, Asp; and
29位の残基が:Thr、Glu、Lysから選択される;
のうちの最大4ヶ所によって式(I)と異なっているペプチドであり;そして
Zが、存在しないか、又はAla、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr及びOrnから成る群から選択される1〜20個のアミノ酸単位から成るペプチド配列である。}を有する化合物、又は医薬的に許容し得るその塩を提供する。
The residue at position 29 is selected from: Thr, Glu, Lys;
Wherein Z is absent or Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Cys, Glu, Lys, Arg, Dbu, Dpr and It is a peptide sequence consisting of 1-20 amino acid units selected from the group consisting of Orn. }, Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
いくつかの実施形態では、式(I)と異なる場合には、Xが、以下の:
2位の残基が:Aib、D‐Serから選択され;
16位の残基が:Arg、His、Lys、Glu、Glyから選択され;
17位の残基が:Lys、Leuから選択され;
18位の残基が:Lys、His、Ala、Ser、Tyrから選択され;
23位の残基が:Val、Leuから選択され;
27位の残基が:Met、Cys、Lys、Arg、Leuから選択され;
28位の残基が:Asn、Arg、Lys、Glu、Ala、Leuから選択され;及び
In some embodiments, when different from formula (I), X is:
The residue at position 2 is selected from: Aib, D-Ser;
The residue at position 16 is selected from: Arg, His, Lys, Glu, Gly;
The residue at position 17 is selected from: Lys, Leu;
The residue at position 18 is selected from: Lys, His, Ala, Ser, Tyr;
The residue at position 23 is selected from: Val, Leu;
The residue at position 27 is selected from: Met, Cys, Lys, Arg, Leu;
The residue at position 28 is selected from: Asn, Arg, Lys, Glu, Ala, Leu; and
29位の残基が:Thr、Glu、Lysから選択される;
のうちの最大4ヶ所によって式(I)と異なる。
The residue at position 29 is selected from: Thr, Glu, Lys;
It differs from Formula (I) by a maximum of four places.
いくつかの実施形態では、式(I)と異なる場合には、Xが、以下の:
2位の残基が:Aib、D‐Serから選択され;
16位の残基が:Arg、His、Lys、Glu、Glyから選択され;
17位の残基が:Lys、Leuから選択され;
18位の残基が:Lys、His、Ala、Ser、Tyrから選択され;及び
23位の残基が:Val、Leuから選択される;
のうちの最大4ヶ所によって式(I)と異なる。
In some embodiments, when different from formula (I), X is:
The residue at position 2 is selected from: Aib, D-Ser;
The residue at position 16 is selected from: Arg, His, Lys, Glu, Gly;
The residue at position 17 is selected from: Lys, Leu;
The residue at position 18 is selected from: Lys, His, Ala, Ser, Tyr; and the residue at position 23 is selected from: Val, Leu;
It differs from Formula (I) by a maximum of four places.
いくつかの実施形態では、式(I)と異なる場合には、Xが、以下の:
2位の残基が:Aib、D‐Serから選択され;
23位の残基が:Val、Leuから選択され;
27位の残基が:Met、Cys、Lys、Arg、Leuから選択され;
28位の残基が:Asn、Arg、Lys、Glu、Ala、Leuから選択され;及び
In some embodiments, when different from formula (I), X is:
The residue at position 2 is selected from: Aib, D-Ser;
The residue at position 23 is selected from: Val, Leu;
The residue at position 27 is selected from: Met, Cys, Lys, Arg, Leu;
The residue at position 28 is selected from: Asn, Arg, Lys, Glu, Ala, Leu; and
29位の残基が:Thr、Glu、Lysから選択される;
のうちの最大4ヶ所によって式(I)と異なる。
The residue at position 29 is selected from: Thr, Glu, Lys;
It differs from Formula (I) by a maximum of four places.
先の定義との整合性を維持しながら、Xが、以下の残基のセット:
20‐Lys、24‐Glu;
20‐Lys、24‐Glu、29‐Ala;
20‐Lys、23‐Ile、24‐Glu;
27‐Glu、28‐Ser、29‐Ala;
29‐Ala;
20‐Gln;
23‐Val;
24‐Gln;
29‐Thr;
27‐Met、28‐Asn、29‐Thr;
20‐Gln、23‐Val、24‐Gln;
20‐Glu、24‐Lys;若しくは
28‐Arg、
のうちの1つ又は複数を含んでなることが望まれることもある。
While maintaining consistency with the previous definition, X is the following set of residues:
20-Lys, 24-Glu;
20-Lys, 24-Glu, 29-Ala;
20-Lys, 23-Ile, 24-Glu;
27-Glu, 28-Ser, 29-Ala;
29-Ala;
20-Gln;
23-Val;
24-Gln;
29-Thr;
27-Met, 28-Asn, 29-Thr;
20-Gln, 23-Val, 24-Gln;
20-Glu, 24-Lys; or 28-Arg,
It may be desired to comprise one or more of the above.
例えば、Xは、以下の配列:
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAQDFIEWLESA(配列番号5);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFVEWLESA(配列番号6);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFlQWLESA(配列番号7);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWLEST(配列番号8);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWLMNT(配列番号9);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAQDFVQWLESA(配列番号10);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAEDFIKWLESA(配列番号11);又は、
For example, X is the following sequence:
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAQDFIEWLESA (SEQ ID NO: 5);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFVEWLESA (SEQ ID NO: 6);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFlQWLESA (SEQ ID NO: 7);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWEST (SEQ ID NO: 8);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWLMNT (SEQ ID NO: 9);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAQDFVQWLESA (SEQ ID NO: 10);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAEDFIKWLESA (SEQ ID NO: 11); or
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWLERA(配列番号12)、
を有していてもよい。
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWLERA (SEQ ID NO: 12),
You may have.
本発明は、本発明の化合物をコードする核酸(DNA若しくはRNAであってもよい)、そのような核酸を含んでなる発現ベクター、及びそのような核酸又は発現ベクターを含んでいる宿主細胞をさらに提供する。 The invention further comprises a nucleic acid (which may be DNA or RNA) encoding a compound of the invention, an expression vector comprising such a nucleic acid, and a host cell comprising such a nucleic acid or expression vector. provide.
更なる態様では、本発明は、本明細書中に規定されるグルカゴン類似体ペプチド、又はその塩若しくは誘導体を含んでなる組成物、そのようなグルカゴン類似体ペプチドをコードする核酸、そのような核酸を含んでなる発現ベクター、又は担体との混合物の状態でそのような核酸若しくは発現ベクターを含んでいる宿主細胞を提供する。好ましい実施形態では、前記組成物は医薬的に許容し得る組成物であり、且つ、前記担体は医薬的に許容し得る担体である。前記グルカゴン・ペプチド類似体は、グルカゴン類似体の医薬的に許容し得る酸付加塩であってもよい。 In a further aspect, the invention provides a glucagon analog peptide as defined herein, or a composition comprising a salt or derivative thereof, a nucleic acid encoding such a glucagon analog peptide, such nucleic acid Or a host cell containing such a nucleic acid or expression vector in a mixture with a carrier. In a preferred embodiment, the composition is a pharmaceutically acceptable composition and the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier. The glucagon peptide analog may be a pharmaceutically acceptable acid addition salt of a glucagon analog.
記載した化合物には、体重増加を予防するか又は体重減少を促進する際の使用が見出された。「予防すること」は、処置の不存在と比較した場合に、体重増加を阻害するか又は低減することを意味するが、必ずしも体重増加の完全な停止を含意するわけではない。前記ペプチドは、食物摂取の減少及び/又はエネルギー消費の増加を引き起こし、その結果として体重に対して観察された効果をもたらし得る。体重に対するそれらの効果とは無関係に、本発明の化合物は、循環LDLレベルを下げることや、HDL/LDL比を高めることができる、耐糖能及び循環コレステロールレベルに有益な効果を有し得る。よって、本発明の化合物は、過剰体重によって引き起こされる又は特徴づけられるあらゆる身体状態の直接的又は間接的な治療法、例えば肥満、病的な肥満、肥満に関連した炎症、肥満に関連した胆嚢疾患、肥満誘発型睡眠時無呼吸症の処置及び/又は予防などに使用できる。それらはさらに、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、耐糖能異常、2型糖尿病、高血圧症、アテローム形成性脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠動脈性心疾患、又は脳卒中の処置に使用できる。これらの身体状態におけるそれらの効果は、体重に対するそれらの効果の結果としてであっても、それらの効果に関連していてもよく、又はそれとは無関係であってもよい。 The described compounds have found use in preventing weight gain or promoting weight loss. “Preventing” means inhibiting or reducing weight gain as compared to the absence of treatment, but does not necessarily imply a complete cessation of weight gain. The peptides can cause a decrease in food intake and / or an increase in energy expenditure, resulting in an observed effect on body weight. Regardless of their effect on body weight, the compounds of the present invention may have beneficial effects on glucose tolerance and circulating cholesterol levels that can lower circulating LDL levels and increase HDL / LDL ratios. Thus, the compounds of the present invention provide direct or indirect treatment of any physical condition caused by or characterized by overweight, such as obesity, morbid obesity, obesity-related inflammation, obesity-related gallbladder disease It can be used for the treatment and / or prevention of obesity-induced sleep apnea. They are further used to treat metabolic syndrome, insulin resistance, glucose intolerance, type 2 diabetes, hypertension, atherogenic dyslipidemia, atherosclerosis, arteriosclerosis, coronary heart disease, or stroke it can. Their effects on these physical conditions may be as a result of their effects on body weight, may be related to their effects, or may be independent of them.
よって、本発明は、それを必要としている人における、先に記載の身体状態の処置の際の本発明の化合物の使用を提供する。 Thus, the present invention provides the use of a compound of the present invention in the treatment of a physical condition as described above in a person in need thereof.
本発明はさらに、医療処置方法での使用のための、特に先に記載したような身体状態の処置方法での使用のための本発明の化合物も提供する。 The present invention further provides a compound of the invention for use in a medical treatment method, in particular for use in a method of treatment of a physical condition as described above.
本発明はさらに、先に記載したような身体状態の処置のための薬剤の調製における本発明の化合物の使用も提供する。 The present invention further provides the use of a compound of the present invention in the preparation of a medicament for the treatment of a physical condition as described above.
既に記載したように、本発明は、先に記載した核酸配列を、その発現を指示する配列と任意に組み合わせて含んでなる発現ベクター、及びその発現ベクターを含んでいる宿主細胞まで広がる。好ましくは、宿主細胞は、本発明の化合物を発現し、そして分泌できる。より一層更なる態様では、本発明は、前記化合物の製造方法であって、その化合物を発現するのに好適な条件下で宿主細胞を培養し、そしてこうして産生された化合物を精製することを含んでなる方法を提供する。 As already described, the present invention extends to an expression vector comprising the nucleic acid sequence described above in any combination with a sequence that directs its expression, and to a host cell containing the expression vector. Preferably, the host cell can express and secrete a compound of the invention. In a still further aspect, the present invention provides a method for producing said compound comprising culturing host cells under conditions suitable for expressing said compound and purifying the compound thus produced. To provide a method.
本発明は、医療処置での使用のための、本発明の核酸、本発明の発現ベクター、又は本発明の化合物を発現し、そして分泌できる宿主細胞をさらに提供する。前記の核酸、発現ベクター、及び宿主細胞が、その化合物自体を用いて処置し得る本明細書中に記載の障害のいずれかの処置のために使用され得ることは理解される。そのため、本発明の化合物を含んでなる治療用組成物、本発明の化合物の投与、又はいずれかの治療のためのその使用は、文脈が他のものを求めている場合を除いて、本発明の核酸、発現ベクター又は宿主細胞の同等な使用を包含すると解釈されるべきである。 The present invention further provides host cells capable of expressing and secreting the nucleic acids of the invention, the expression vectors of the invention, or the compounds of the invention for use in medical procedures. It will be appreciated that the nucleic acids, expression vectors, and host cells described above can be used for the treatment of any of the disorders described herein that can be treated with the compound itself. Thus, a therapeutic composition comprising a compound of the present invention, administration of a compound of the present invention, or use thereof for any treatment, except where the context calls for others, Should be construed to encompass the equivalent use of other nucleic acids, expression vectors or host cells.
発明の詳細な説明
この明細書を通して、天然アミノ酸についての慣習的な一文字表記及び三文字表記、並びにその他のアミノについての一般に認められている三文字表記、例えばAib(α‐アミノイソ酪酸)、Orn(オルニチン)、Dbu(2,4‐ジアミノ酪酸)及びDpr(2,3‐ジアミノプロパン酸)などが使用される。
Detailed Description of the Invention Throughout this specification, conventional one-letter and three-letter code for natural amino acids, and other commonly accepted three-letter codes for amino, such as Aib (α-aminoisobutyric acid), Orn ( Ornithine), Dbu (2,4-diaminobutyric acid), Dpr (2,3-diaminopropanoic acid) and the like are used.
「天然グルカゴン」という用語は、配列H‐His‐Ser‐Gln‐Gly‐Thr‐Phe‐Thr‐Ser‐Asp‐Tyr‐Ser‐Lys‐Tyr‐Leu‐Asp‐Ser‐Arg‐Arg‐Ala‐Gln‐Asp‐Phe‐Val‐Gln‐Trp‐Leu‐Met‐Asn‐Thr‐OH(配列番号1)を有する天然ヒト・グルカゴンを指す。 The term “natural glucagon” refers to the sequence H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln. -Refers to natural human glucagon with Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH (SEQ ID NO: 1).
「オキシントモジュリン」及び「OXM」という用語は、配列H‐His‐Ser‐Gln‐Gly‐Thr‐Phe‐Thr‐Ser‐Asp‐Tyr‐Ser‐Lys‐Tyr‐Leu‐Asp‐Ser‐Arg‐Arg‐Ala‐Gln‐Asp‐Phe‐Val‐Gln‐Trp‐Leu‐Met‐Asn‐Thr‐Lys‐Arg‐Asn‐Arg‐Asn‐Asn‐Ile‐Ala‐OH(配列番号3)を有する天然ヒト・オキシントモジュリンを指す。 The terms “oxyntomodulin” and “OXM” refer to the sequence H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg- Natural human with Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-OH (SEQ ID NO: 3) -Refers to oxyntomodulin.
本発明は、先に規定した化合物を提供する。誤解を避けるために、本明細書中に示した定義において、配列Xは、変動を認めると記述された位置において式(I)と異なっているだけであることが一般に意図される。配列X内のアミノ酸は、従来のN末端からC末端の向きに1から29まで連続して付番されると考えられる。従って、X内の「位置」についての言及は、天然ヒト・グルカゴン及びその他の分子内の位置に対して言及しなくてはならないと解釈されるべきである。 The present invention provides a compound as defined above. For the avoidance of doubt, in the definitions given herein, it is generally intended that sequence X only differs from formula (I) at the positions described as allowing variation. The amino acids in sequence X are considered to be numbered consecutively from 1 to 29 in the conventional N-terminal to C-terminal direction. Thus, references to “positions” within X should be construed as referring to positions within native human glucagon and other molecules.
本発明の化合物は、ペプチド配列X内に1若しくは複数の分子内架橋を持っていてもよい。そのような架橋のそれぞれは、Xの線形配列内で通常3アミノ酸離れているXの2つのアミノ酸残基の側鎖間(すなわち、アミノ酸Aとアミノ酸A+4の間)で形成される。 The compound of the present invention may have one or more intramolecular bridges in the peptide sequence X. Each such bridge is formed between the side chains of two amino acid residues of X that are normally 3 amino acids apart (ie, between amino acid A and amino acid A + 4) within the linear sequence of X.
より特に、架橋は、残基対16と20、17と21、20と24、又は24と28の側鎖間で形成され得る。2つの側鎖は、イオン性相互作用を通して又は共有結合によって互いに連結されることができる。よって、これらの残基対は、イオン性相互作用によって塩橋を形成するために逆帯電した側鎖を備えていてもよい。例えば、前記残基の一方がGlu又はAspであり得、それと同時にもう一方がLys又はArgであり得る。 More particularly, a bridge may be formed between the side chains of residue pairs 16 and 20, 17 and 21, 20 and 24, or 24 and 28. The two side chains can be linked to each other through ionic interactions or by covalent bonds. Thus, these residue pairs may have oppositely charged side chains to form a salt bridge by ionic interactions. For example, one of the residues may be Glu or Asp and at the same time the other may be Lys or Arg.
LysとGlu及びLysとAspの対合はまた、反応して、ラクタム環を形成することもできる。同様に、TyrとGlu又はTyrとAspは、ラクトン環を形成することができる。 The pairing of Lys and Glu and Lys and Asp can also react to form a lactam ring. Similarly, Tyr and Glu or Tyr and Asp can form a lactone ring.
特に、20位及び24位の残基は、分子内架橋を形成できることもある。これらの位置の好適な残基対の例には: In particular, residues at positions 20 and 24 may be able to form intramolecular bridges. Examples of suitable residue pairs at these positions include:
20‐Asp、24‐Lys;
20‐Glu、24‐Lys;
20‐Asp、24‐Arg;
20‐Glu、24‐Arg;
20‐Lys、24‐Asp;
20‐Arg、24‐Asp;
20‐Lys、24‐Glu;及び
20‐Arg、24‐Glu;
が挙げられる。
20-Asp, 24-Lys;
20-Glu, 24-Lys;
20-Asp, 24-Arg;
20-Glu, 24-Arg;
20-Lys, 24-Asp;
20-Arg, 24-Asp;
20-Lys, 24-Glu; and 20-Arg, 24-Glu;
Is mentioned.
いずれかの特定の理論に縛られることを望むものではないが、そのような分子内架橋が、分子のαヘリックス構造を安定させるので、GLP‐1受容体における、そしてもしかするとグルカゴン受容体においても同様に、効力及び/又は選択性を増強すると信じられている。 While not wishing to be bound by any particular theory, such an intramolecular bridge stabilizes the α-helical structure of the molecule, so it is also at the GLP-1 receptor and possibly at the glucagon receptor. Similarly, it is believed to enhance potency and / or selectivity.
12位のLeuの存在は、GLP‐1受容体における効力及び/又は選択性を増強する。 The presence of Leu at position 12 enhances potency and / or selectivity at the GLP-1 receptor.
(例えばIleによる)23位における置換は、GLP‐1受容体における効力及び/又は選択性を増強し得る。 Substitution at position 23 (eg, with Ile) may enhance potency and / or selectivity at the GLP-1 receptor.
(例えばGluによる)24位における置換もまた、GLP‐1受容体における効力及び/又は選択性を増強し得る。 Substitution at position 24 (eg, with Glu) may also enhance potency and / or selectivity at the GLP-1 receptor.
いずれかの特定の理論に縛られることを望むものではないが、天然グルカゴンの17位及び18位のアルギニン残基は、顕著な選択性をグルカゴン受容体に与えるように思われる。これらの位置のうちの1つ又は複数における多数の置換は、GLP‐1受容体における効力及び/又は選択性を増強することができる。17位のLys又はLeuは、グルカゴン受容体における効力を増強し得る。分子内架橋を形成する可能性のために、Lysが、とりわけ21位に陰性荷電残基(例えばAsp)が存在しているときに特に有効であり得る。18位の疎水性残基(例えばAla)は、GLP‐1受容体及びグルカゴン受容体の両方における効力を増強し得るが、この位置におけるその他の変更(例えばLys、His、Ser又はTyr)であっても類似効果を得ることができる。 While not wishing to be bound by any particular theory, the arginine residues at positions 17 and 18 of natural glucagon appear to confer significant selectivity to the glucagon receptor. Multiple substitutions at one or more of these positions can enhance potency and / or selectivity at the GLP-1 receptor. Lys or Leu at position 17 can enhance potency at the glucagon receptor. Due to the possibility of forming intramolecular bridges, Lys may be particularly effective especially when a negatively charged residue (eg Asp) is present at position 21. A hydrophobic residue at position 18 (eg Ala) may enhance efficacy at both GLP-1 and glucagon receptors, but other changes at this position (eg Lys, His, Ser or Tyr). Even similar effects can be obtained.
いずれかの特定の理論に縛られることを望むものではないが、天然グルカゴンの27、28及び29位の残基は、グルカゴン受容体における顕著な選択性を与えるように思われる。天然グルカゴン配列に関するこれらの位置のうちの1つ、2つ又は3つすべての置換は、グルカゴン受容体における効力の顕著な低減の可能性なしに、GLP‐1受容体における効力及び/又は選択性を増強し得る。特定の例には、27位のGlu、28位のSer及び29位のAlaが含まれる。 While not wishing to be bound by any particular theory, residues 27, 28 and 29 of natural glucagon appear to confer significant selectivity at the glucagon receptor. Substitution of one, two, or all three of these positions with respect to the native glucagon sequence will result in potency and / or selectivity at the GLP-1 receptor without the possibility of a significant reduction in potency at the glucagon receptor. Can be enhanced. Specific examples include Glu at position 27, Ser at position 28, and Ala at position 29.
(例えばLeu、Lys又はGluによる)27位の天然のMet残基の置換はさらに、酸化の可能性を低下させ、それで化合物の化学的安定性を増強する。 Replacement of the natural Met residue at position 27 (eg, by Leu, Lys or Glu) further reduces the potential for oxidation and thus enhances the chemical stability of the compound.
(例えばArg、Lys、Glu、Ala、Ser又はLeuによる)28位の天然のAsn残基の置換はさらに、酸性溶液中での脱アミド化の可能性を低下させ、それで化合物の化学的安定性を増強する。 Replacement of the natural Asn residue at position 28 (eg by Arg, Lys, Glu, Ala, Ser or Leu) further reduces the possibility of deamidation in acidic solution, so that the chemical stability of the compound To strengthen.
GLP‐1受容体における効力及び/又は選択性はまた、両親媒性螺旋構造を形成する可能性がある残基を導入することによっても、グルカゴン受容体における効力の顕著な損失の可能性なしに増強され得る。これは、16、20、24、及び28位のうちの1つ又は複数に荷電残基を導入することによって達成され得る。よって、20及び24位の残基はすべてが荷電残基であり得、20、24、及び28位の残基はすべてが荷電残基であり得、又は16、20、24、及び28位の残基はすべてが荷電残基であり得る。例えば、20位の残基はLys、His、Arg又はGluであり得る。24位の残基は、Glu、Lys又はArgであり得る。28位の残基はArg、Lys又はGluであり得る。例えば、化合物は、20位と24位の両方において独立にLys又はGluを持つことができ、そして28位のSer又はArgをさらに持つことができる。 Efficacy and / or selectivity at the GLP-1 receptor can also be achieved by introducing residues that may form amphiphilic helix structures without the potential for a significant loss of potency at the glucagon receptor. Can be enhanced. This can be accomplished by introducing a charged residue at one or more of positions 16, 20, 24, and 28. Thus, the residues at positions 20 and 24 can all be charged residues, the residues at positions 20, 24, and 28 can all be charged residues, or at positions 16, 20, 24, and 28. The residues can all be charged residues. For example, the residue at position 20 can be Lys, His, Arg, or Glu. The residue at position 24 can be Glu, Lys or Arg. The residue at position 28 can be Arg, Lys or Glu. For example, a compound can have Lys or Glu independently at both positions 20 and 24, and can further have Ser or Arg at position 28.
20及び24位の天然のGln残基の一方又は両方の置換はさらに、酸性溶液中の脱アミド化の可能性を低減し、それで化合物の化学的安定性を増強する。 Substitution of one or both of the natural Gln residues at positions 20 and 24 further reduces the possibility of deamidation in acidic solution, thus enhancing the chemical stability of the compound.
化合物は、例えばWO99/46283に記載のとおり、例えばグルカゴン類似体ペプチドの立体構造及び/又は二次構造を安定させるために、そして/あるいはグルカゴン類似体ペプチドに酵素分解に対してより抵抗性をもたせるために、1〜20個のアミノ酸から成るC末端ペプチド配列Zを含んでなることもできる。 The compounds are, for example, as described in WO 99/46283, for example to stabilize the conformation and / or secondary structure of the glucagon analogue peptide and / or to make the glucagon analogue peptide more resistant to enzymatic degradation For this purpose, it can also comprise a C-terminal peptide sequence Z consisting of 1 to 20 amino acids.
存在する場合、Zは、1〜20個のアミノ酸残基、例えば1〜15個の範囲内、より好ましくは1〜10個の範囲内、特に1〜7個の範囲内のアミノ酸残基、例えば1、2、3、4、5、6又は7個のアミノ酸残基、例えば6個のアミノ酸残基など、から成るペプチド配列を表す。ペプチド配列Z内のそれぞれアミノ酸残基は、独立に、Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu(2,4‐ジアミノ酪酸)、Dpr(2,3‐ジアミノプロパン酸)及びOrn(オルニチン)から選択され得る。好ましくは、前記アミノ酸残基は、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr及びOrnから選択され、より好ましくはGlu、Lys、及びCysだけから選択され得る。先に触れたアミノ酸はD型又はL型の立体配置のいずれかをとることができるが、好ましくはL型の立体配置をとっている。特に好ましい配列Zは、4、5、6又は7個の連続したリジン残基(すなわちLys3、Lys4、Lys5、Lys6又はLys7)であり、そして特に5又は6個の連続したリジン残基から成る配列である。Zのその他の代表的な配列は、WO01/04156に示されている。あるいは、配列ZのC末端残基は、Cys残基であってもよい。これは、化合物の修飾(例えばペグ化)を助けることができる。そのような実施形態では、配列Zは、例えば長さが1アミノ酸(すなわち、Z=Cys)だけでも、長さが2、3、4、5、6アミノ酸又はさらに多くのアミノ酸であってもよい。そのため、他のアミノ酸がペプチドXと端末のCys残基の間のスペーサーとして機能する。 When present, Z is 1-20 amino acid residues, such as in the range of 1-15, more preferably in the range of 1-10, in particular in the range of 1-7, such as It represents a peptide sequence consisting of 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7 amino acid residues, such as 6 amino acid residues. Each amino acid residue in peptide sequence Z is independently Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Cys, Glu, Lys, Arg, Dbu (2,4-diaminobutyric acid), Dpr (2,3-diaminopropane). Acid) and Orn (ornithine). Preferably, the amino acid residue is selected from Ser, Thr, Tyr, Cys, Glu, Lys, Arg, Dbu, Dpr and Orn, more preferably Glu, Lys, and Cys. The amino acids mentioned above can take either the D or L configuration, but preferably have the L configuration. Particularly preferred sequences Z are 4, 5, 6 or 7 consecutive lysine residues (ie Lys 3 , Lys 4 , Lys 5 , Lys 6 or Lys 7 ), and in particular 5 or 6 consecutive lysines. A sequence consisting of residues. Other representative sequences of Z are shown in WO01 / 04156. Alternatively, the C-terminal residue of sequence Z may be a Cys residue. This can aid in modification (eg, pegylation) of the compound. In such embodiments, the sequence Z may be, for example, only 1 amino acid in length (ie, Z = Cys), 2, 3, 4, 5, 6 amino acids in length, or more amino acids. . Therefore, other amino acids function as a spacer between peptide X and the terminal Cys residue.
ペプチド配列Zは、(配列Lys‐Arg‐Asn‐Arg‐Asn‐Asn‐Ile‐Alaを持っている)ヒトOXMのIP‐1部分の対応する配列と25%以下の配列同一性しかない。 Peptide sequence Z has no more than 25% sequence identity with the corresponding sequence of the IP-1 part of human OXM (which has the sequence Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Ala).
別のポリペプチド配列(例えばIP‐1)に関する所定のペプチド又はポリペプチド配列の「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」は、2つが互いに整列された場合にもう一方のポリペプチドの対応する配列内の対応するアミノ酸残基と同一である所定のペプチド配列内のアミノ酸残基のパーセンテージとして計算され、必要であれば、最適な整列のためにギャップが導入される。%同一性の値は、WU‐BLAST‐2(Altschulら、Methods in Enzymology、第266号:460〜480頁(1996年))によって測定されてもよい。WU‐BLAST‐2はいくつかの検索パラメーターを使用するが、その大部分は初期値に設定される。調整可能なパラメーターは、以下の値:重複スパン=1、重複フラクション=0.125、ワード閾値(T)=11に設定される。%アミノ酸配列同一性値は、参照配列の残基総数(整列スコアを最大にするためにWU‐BLAST‐2によって参照配列内に導入されたギャップは無視される)で割って、100を掛けた、WU‐BLAST‐2によって測定された合致している同一残基数によって決定される。 A “percent (%) amino acid sequence identity” of a given peptide or polypeptide sequence with respect to another polypeptide sequence (eg, IP-1) is within the corresponding sequence of the other polypeptide when the two are aligned with each other. Is calculated as the percentage of amino acid residues in a given peptide sequence that are identical to the corresponding amino acid residues, and if necessary, gaps are introduced for optimal alignment. The% identity value may be measured by WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996)). WU-BLAST-2 uses several search parameters, most of which are set to initial values. The adjustable parameters are set to the following values: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11. The% amino acid sequence identity value is divided by the total number of residues in the reference sequence (gap introduced in the reference sequence by WU-BLAST-2 to maximize alignment score is ignored) multiplied by 100 , Determined by the number of matching identical residues measured by WU-BLAST-2.
よって、IP‐1の8個のアミノ酸と最適に整列させたとき、Zは、IP‐1の対応するアミノ酸と同一であるアミノ酸を2個以下しか持たない。 Thus, when optimally aligned with the eight amino acids of IP-1, Z has no more than two amino acids that are identical to the corresponding amino acids of IP-1.
本発明の化合物内のアミノ酸側鎖のうちの1つ又は複数が、親油性置換基に結合することもできる。この親油性置換基は、アミノ酸側鎖の原子に共有結合されてもよく、あるいはスペーサーによってアミノ酸側鎖に結合されてもよい。 One or more of the amino acid side chains in the compounds of the invention can also be attached to a lipophilic substituent. The lipophilic substituent may be covalently bonded to an amino acid side chain atom or may be bonded to the amino acid side chain by a spacer.
理論に縛られることを望むものではないが、親油性置換基が血流中でアルブミンに結合し、それよって酵素的分解からの本発明の化合物を保護することで化合物の半減期を延長できると考えられている。スペーサーは、存在する場合には、化合物と親油性置換基の間の間隔を提供するために使用される。 Without wishing to be bound by theory, it is possible that a lipophilic substituent binds to albumin in the bloodstream, thereby extending the half-life of the compound by protecting the compound of the invention from enzymatic degradation. It is considered. Spacers, if present, are used to provide spacing between the compound and the lipophilic substituent.
親油性置換基は、エステル、スルホニルエステル、チオエステル、アミド又はスルホンアミドを介してアミノ酸側鎖又はスペーサーに取り付けられ得る。従って、好ましくは、親油性置換基としては、エステル、スルホニルエステル、チオエステル、アミド又はスルホンアミドの一部を形成するアシル基、スルホニル基、N原子、O原子又はS原子が挙げられることは理解される。好ましくは、親油性置換基内のアシル基は、アミノ酸側鎖又はスペーサーとアミド又はエステルの一部を形成する。 The lipophilic substituent can be attached to the amino acid side chain or spacer via an ester, sulfonyl ester, thioester, amide or sulfonamide. Accordingly, it is understood that preferably the lipophilic substituent includes an acyl group, a sulfonyl group, an N atom, an O atom, or an S atom that forms part of an ester, sulfonyl ester, thioester, amide or sulfonamide. The Preferably, the acyl group in the lipophilic substituent forms part of an amide or ester with the amino acid side chain or spacer.
親油性置換基には、4〜30個のC原子を持つ炭化水素鎖が含まれ得る。好ましくは、それは8又は12個のC原子を持ち、そして好ましくは、それは24個以下のC原子、又は20個以下のC原子を持つ。炭化水素鎖は、直鎖であっても分岐鎖であってもよく、且つ、飽和であっても不飽和であってもよい。当然のことながら、炭化水素鎖は、アミノ酸側鎖又はスペーサーへの結合部の一部を形成する部分、例えばアシル基、スルホニル基、N原子、O原子又はS原子により好ましくは置換される。最も好ましくは、炭化水素鎖はアシルによって置換され、従って、炭化水素鎖はアルカノイル基、例えばパルミトイル、カプロイル、ラウロイル、ミリストイル又はステアロイルの一部となり得る。 Lipophilic substituents can include hydrocarbon chains having 4 to 30 C atoms. Preferably it has 8 or 12 C atoms, and preferably it has no more than 24 C atoms, or no more than 20 C atoms. The hydrocarbon chain may be a straight chain or a branched chain, and may be saturated or unsaturated. Of course, the hydrocarbon chain is preferably substituted by a moiety that forms part of the linkage to the amino acid side chain or spacer, such as an acyl group, sulfonyl group, N atom, O atom or S atom. Most preferably, the hydrocarbon chain is substituted by acyl, and therefore the hydrocarbon chain can be part of an alkanoyl group such as palmitoyl, caproyl, lauroyl, myristoyl or stearoyl.
従って、親油性置換基は、以下に示した式を持つこともできる。
Aは、例えばアシル基、スルホニル基、NH、N‐アルキル、O原子又はS原子であり得るが、好ましくはアシルであり得、nは、3〜29の整数であるが、好ましくは少なくとも7であるか又は少なくとも11であり、そして好ましくは23未満であり、より好ましくは19未満である。 A may be, for example, an acyl group, a sulfonyl group, NH, N-alkyl, O atom or S atom, but preferably may be acyl, and n is an integer from 3 to 29, but preferably at least 7. Is or is at least 11, and preferably less than 23, more preferably less than 19.
炭化水素鎖はさらに置換されることもできる。例えば、それは、NH2、OH及びCOOHから選択される最大3つの置換基によりさらに置換されることもできる。炭化水素鎖がさらに置換されるのであれば、好ましくは、それは1つの置換基だけでさらに置換される。あるいは又は加えて、炭化水素鎖は、例えば以下に示したような、シクロアルカン又はヘテロシクロアルカンを含むこともできる: The hydrocarbon chain can be further substituted. For example, it can be further substituted with a maximum of three substituents selected from NH 2 , OH and COOH. If the hydrocarbon chain is further substituted, preferably it is further substituted with only one substituent. Alternatively or in addition, the hydrocarbon chain may comprise a cycloalkane or heterocycloalkane, for example as shown below:
好ましくは、シクロアルカン又はヘテロシクロアルカンは、六員環である。最も好ましくは、それはピペリジンである。 Preferably, the cycloalkane or heterocycloalkane is a 6-membered ring. Most preferably it is piperidine.
あるいは、親油性置換基は、シクロペンタノフェナントレン骨格に基づいていてもよく、それは部分的に又は完全に不飽和であっても、飽和されていてもよい。それぞれの骨格の炭素原子は、Me又はOHにより置換されていてもよい。例えば、親油性置換基は、コリル(cholyl)、デオキシコリル又はリトコリルであってもよい。 Alternatively, the lipophilic substituent may be based on a cyclopentanophenanthrene skeleton, which may be partially or fully unsaturated or saturated. The carbon atom of each skeleton may be substituted with Me or OH. For example, the lipophilic substituent may be cholyl, deoxycholyl or lithocryl.
以上のように、親油性置換基は、スペーサーによってアミノ酸側鎖に結合されることもできる。存在している場合には、スペーサーは、親油性置換基とアミノ酸側鎖に取り付けられる。スペーサーは、エステル、スルホニルエステル、チオエステル、アミド又はスルホンアミドによって独立に親油性置換基とアミノ酸側鎖に取り付けられることもできる。従って、それは、アシル、スルフォニル、N原子、O原子又はS原子から独立に選択される2つの部分を含むこともできる。スペーサーは、以下の式: As described above, the lipophilic substituent can be bonded to the amino acid side chain by a spacer. When present, the spacer is attached to the lipophilic substituent and the amino acid side chain. Spacers can also be attached to lipophilic substituents and amino acid side chains independently by esters, sulfonyl esters, thioesters, amides or sulfonamides. Thus, it can also comprise two moieties independently selected from acyl, sulfonyl, N atom, O atom or S atom. The spacer has the following formula:
{式中、B及びDは、それぞれ独立に、アシル、スルフォニル、NH、N‐アルキル、O原子又はS原子から選択され、好ましくはアシル及びNHから選択される。}を持つこともできる。好ましくは、nは、1〜10の整数であり、好ましくは1〜5の整数である。スペーサーは、C1‐6アルキル、C0‐6アルキル・アミン、C0‐6アルキル・ヒドロキシ及びC0‐6アルキル・カルボキシから選択される1若しくは複数の置換基によりさらに置換されることもできる。 {Wherein B and D are each independently selected from acyl, sulfonyl, NH, N-alkyl, O atom or S atom, preferably selected from acyl and NH. }. Preferably, n is an integer of 1 to 10, preferably an integer of 1 to 5. The spacer may be further substituted with one or more substituents selected from C 1-6 alkyl, C 0-6 alkyl amine, C 0-6 alkyl hydroxy and C 0-6 alkyl carboxy. .
あるいは、スペーサーは、先の式の2以上の反復単位を持つこともできる。B、D、及びnは、各反復単位に関してそれぞれ独立に選択される。隣接している反復単位は、それらのそれぞれのB及びD部分を介して互いに共有結合され得る。例えば、隣接している反復単位のB及びD部分は、一緒にエステル、スルホニルエステル、チオエステル、アミド又はスルホンアミドを形成し得る。スペーサーの各末端の遊離B及びDユニットは、先に記載のように、アミノ酸側鎖や親油性置換基に取り付けられる。 Alternatively, the spacer can have more than one repeating unit of the previous formula. B, D, and n are independently selected for each repeating unit. Adjacent repeating units can be covalently linked to each other through their respective B and D moieties. For example, the B and D moieties of adjacent repeating units can together form an ester, sulfonyl ester, thioester, amide or sulfonamide. The free B and D units at each end of the spacer are attached to amino acid side chains or lipophilic substituents as described above.
好ましくは、スペーサーには、5つ以下、4つ以下、又は3つ以下の反復単位しかない。最も好ましくはスペーサーには、2つの反復単位しかないか、又は単一ユニットである。 Preferably, the spacer has no more than 5, no more than 4, or no more than 3 repeating units. Most preferably the spacer has only two repeating units or is a single unit.
スペーサー(又は反復単位があるのであれば、スペーサーの1つ又は複数の反復単位)は、例えば、天然のアミノ酸であっても、非天然のアミノ酸であってもよい。当然のことながら、官能性側鎖を持つアミノ酸に関して、B及び/又はDは、アミノ酸の側鎖内の部分であってもよい。スペーサーは、どの天然のアミノ酸であっても、どの非天然のアミノ酸であってもよい。例えば、スペーサー(又は反復単位があるのであれば、スペーサーの1つ又は複数の反復単位)は、Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、α‐Glu、γ‐Glu、Asp、Ser、Thr、Gaba、Aib、β‐Ala、5‐アミノペンタノイル、6‐アミノヘキサノイル、7‐アミノヘプタノイル、8‐アミノオクタノイル、9‐アミノノナノイル又は10‐アミノデカノイルであり得る。 The spacer (or one or more repeating units of the spacer, if present) may be, for example, a natural amino acid or a non-natural amino acid. Of course, for amino acids having a functional side chain, B and / or D may be a moiety within the side chain of the amino acid. The spacer can be any natural amino acid or any non-natural amino acid. For example, the spacer (or one or more repeating units of the spacer, if present) is Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Cys, Phe, Tyr, Trp, His, Lys. Arg, Gln, Asn, α-Glu, γ-Glu, Asp, Ser, Thr, Gaba, Aib, β-Ala, 5-aminopentanoyl, 6-aminohexanoyl, 7-aminoheptanoyl, 8-amino It can be octanoyl, 9-aminononanoyl or 10-aminodecanoyl.
例えば、スペーサーは、γ‐Glu、Gaba、β‐Ala及びα‐Glyから選択される単一アミノ酸であり得る。 For example, the spacer can be a single amino acid selected from γ-Glu, Gaba, β-Ala and α-Gly.
親油性置換基は、本発明の化合物のあらゆるアミノ酸側鎖に結合され得る。好ましくは、アミノ酸側鎖としては、スペーサー又は親油性置換基とエステル、スルホニルエステル、チオエステル、アミド若しくはスルホンアミドを形成するためのカルボキシ、ヒドロキシル、チオール、アミド又はアミン基が挙げられる。例えば、親油性置換基は、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Ser、Thr、Tyr、Trp、Cys又はDbu、Dpr若しくはOrnに結合させ得る。好ましくは、親油性置換基はLysに結合させる。しかしながら、親油性置換基が加えられる場合、本明細書中に提供した式中にLysと示したあらゆるアミノ酸が、Dbu、Dpr又はOrnによって置き換えられてもよい。 The lipophilic substituent can be attached to any amino acid side chain of the compounds of the invention. Preferably, the amino acid side chain includes a carboxy, hydroxyl, thiol, amide or amine group to form an ester, sulfonyl ester, thioester, amide or sulfonamide with a spacer or lipophilic substituent. For example, the lipophilic substituent may be attached to Asn, Asp, Glu, Gln, His, Lys, Arg, Ser, Thr, Tyr, Trp, Cys or Dbu, Dpr or Orn. Preferably, the lipophilic substituent is attached to Lys. However, when a lipophilic substituent is added, any amino acid designated Lys in the formulas provided herein may be replaced by Dbu, Dpr or Orn.
親脂質置換基とスペーサーの例は、以下の式に示されている:
ここで、本発明の化合物からのLysは、アミド部分を介することによってγ‐Glu(スペーサー)に共有結合で取り付けられる。パルミトイルは、アミド部分を介してγ‐Gluスペーサーに共有結合で取り付けられる。 Here, Lys from a compound of the invention is covalently attached to γ-Glu (spacer) via an amide moiety. Palmitoyl is covalently attached to the γ-Glu spacer via the amide moiety.
あるいは又は加えて、本発明の化合物内の1つ又は複数のアミノ酸側鎖は、例えば溶解性、及び/又は生体内(例えば血清中での)半減期、及び/又は生物学的利用能を増強するために、重合体部分に結合させることもできる。そのような修飾はさらに、治療用タンパク質やペプチドのクリアランス(例えば腎クリアランス)を低減することが知られている。 Alternatively or in addition, one or more amino acid side chains within the compounds of the invention may enhance, for example, solubility and / or in vivo (eg, in serum) half-life, and / or bioavailability. In order to do so, it can also be bonded to the polymer portion. Such modifications are further known to reduce the clearance (eg, renal clearance) of therapeutic proteins and peptides.
重合体部分は、水溶性(両親媒性(amphiphillc)又は親水性)であり、無毒性であり、且つ、医薬的に不活性であることが好ましい。好適な重合体部分には、ポリエチレングリコール(PEG)、PEGのホモポリマー若しくはコポリマー、PEGのモノメチル置換重合体(mPEG)、又はポリオキシエチレン・グリセロール(POG)が含まれる。例えば、Int. J. Hematology、第68号:1頁(1998年);Bioconjugate Chem.、第6号:150頁(1995年);及びCrit. Rev. Therap. Drug Carrier Sys.、第9号:249頁(1992年)を参照のこと。 The polymer portion is preferably water soluble (amphiphillc or hydrophilic), non-toxic and pharmaceutically inert. Suitable polymer moieties include polyethylene glycol (PEG), homopolymers or copolymers of PEG, monomethyl substituted polymers of PEG (mPEG), or polyoxyethylene glycerol (POG). For example, Int. J. Hematology, 68: 1 (1998); Bioconjugate Chem., 6: 150 (1995); and Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Sys., 9: See page 249 (1992).
他の好適な重合体残基には、ポリ‐アミノ酸、例えばポリ‐リシン、ポリ‐アスパラギン酸及びポリ‐グルタミン酸などが含まれる(例えば、Gombotzら(1995年)、Bioconjugate Chem.、第6号:332〜351頁;Hudeczら(1992年)、Bioconjugate Chem.、第3号、49〜57頁;Tsukadaら(1984年)、J. Natl. Cancer Inst.、第73号:721〜729頁;及びPratesiら(1985年)、Br. J. Cancer、第52号:841〜848頁を参照のこと)。 Other suitable polymer residues include poly-amino acids such as poly-lysine, poly-aspartic acid and poly-glutamic acid (see, eg, Gombotz et al. (1995) Bioconjugate Chem., No. 6: 332-351; Hudecz et al. (1992), Bioconjugate Chem., 3, 49-57; Tsukada et al. (1984), J. Natl. Cancer Inst., 73: 721-729; and Pratesi et al. (1985), Br. J. Cancer, 52: 841-848).
重合体部分は、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。それは、500〜40000Da、例えば500〜10000Da、1000〜5000Da、10000〜20000Da、又は20000〜40000Daの分子量を持ち得る。 The polymer portion may be linear or branched. It can have a molecular weight of 500-40000 Da, such as 500-10000 Da, 1000-5000 Da, 10000-20000 Da, or 20000-40000 Da.
化合物は2つ以上のそのような部分を含んでなることもできるが、その場合、そのような部分全部の総分子量は一般に、先に与えられた範囲内に収まる。 A compound can also comprise more than one such moiety, in which case the total molecular weight of all such moieties generally falls within the ranges given above.
重合体部分は、アミノ酸側鎖のアミノ、カルボキシル又はチオール基に(共有結合によって)連結され得る。好ましい例は、Cys残基のチオール基やLys残基のイプシロン・アミノ基であり、そしてAsp及びGlu残基のカルボキシル基もまた使用され得る。 The polymer moiety can be linked (covalently) to the amino, carboxyl or thiol group of the amino acid side chain. Preferred examples are the thiol group of Cys residues and the epsilon amino group of Lys residues, and the carboxyl groups of Asp and Glu residues can also be used.
当業者(The skilled reader)は、連結反応を実施するのに使用できる好適な技術をよく知っている。例えば、メトキシ基を保有するPEG部分は、Nektar Therapeutics ALからの市販されている試薬を使用したマレイミド結合によってCysチオール基と連結できる。また、WO2008/101017及び好適な化学の詳細について先に引用した引用文献も参照のこと。 The skilled reader is well aware of suitable techniques that can be used to perform the ligation reaction. For example, a PEG moiety bearing a methoxy group can be linked to a Cys thiol group by a maleimide linkage using a commercially available reagent from Nektar Therapeutics AL. See also WO 2008/101017 and references cited above for details of suitable chemistry.
ペプチド合成
本願発明の化合物は、標準的な合成方法、遺伝子組み換え発現系、又はその他の最先端の方法のいずれかによって製造され得る。よって、グルカゴン類似体は、例えば以下の:
Peptide Synthesis The compounds of the present invention can be produced by any of the standard synthetic methods, recombinant expression systems, or other state-of-the-art methods. Thus, glucagon analogs are for example:
(a)固相法又は液相法を用いて段階的に若しくは断片組立によってペプチドを合成し、そして最終的なペプチド生成物を単離及び精製する段階; (A) synthesizing peptides stepwise or by fragment assembly using solid phase or liquid phase methods and isolating and purifying the final peptide product;
(b)宿主細胞内でペプチドをコードする核酸構築物を発現させ、そして発現産物を宿主細胞培養物から回収する段階;又は (B) expressing a nucleic acid construct encoding the peptide in the host cell and recovering the expression product from the host cell culture; or
(c)ペプチドをコードする核酸構築物の無細胞試験管内発現をおこない、そして発現産物を回収する段階; (C) performing a cell-free in vitro expression of the nucleic acid construct encoding the peptide and recovering the expression product;
を含んでなる方法、あるいは、ペプチドの断片を得るための(a)、(b)、及び(c)の方法のいずれかの組み合わせと、それに続いて断片をつなぎ合わせてペプチドを得、そしてそのペプチドを回収すること、を含めた多くのやり方で合成され得る。 Or a combination of any of the methods of (a), (b), and (c) to obtain a peptide fragment, followed by joining the fragments to obtain a peptide, and It can be synthesized in many ways, including recovering the peptide.
固相又は液相ペプチド合成を用いて本発明の類似体を合成することが好ましい。これに関連して、参考文献は、WO98/11125、そして中でもFields, GBら、2002年、「Principles and practice of solid-phase peptide synthesis」:Synthetic Peptides(第2版)中、及び本明細書中の実施例に与えられている。 It is preferred to synthesize analogs of the invention using solid phase or liquid phase peptide synthesis. In this context, references are available in WO 98/11125, and in particular, Fields, GB et al., 2002, “Principles and practice of solid-phase peptide synthesis”: Synthetic Peptides (2nd edition), and in this specification. Given in the examples.
組み換え発現のために、通常、本発明の核酸断片は、好適なベクター内に挿入されて、本発明の核酸断片を保有するクローニングベクター又は発現ベクターを形成する;そのような新規ベクターもまた本発明の不可欠な要素である。適用の目的及びタイプにより、ベクターは、プラスミド、ファージ、コスミド、ミニ染色体、又はウイルスの形態であり得るが、特定の細胞において一時的に発現されるだけである裸のDNAもまた重要なベクターである。本発明の好ましいクローニングベクター及び発現ベクター(プラスミドベクター)は、自動複製が可能であり;それにより、その後のクローニングのための高レベルの発現又は高レベルの複製のための高いコピー数を可能にする。 For recombinant expression, the nucleic acid fragment of the present invention is usually inserted into a suitable vector to form a cloning vector or expression vector carrying the nucleic acid fragment of the present invention; such novel vectors are also of the present invention. Is an indispensable element. Depending on the purpose and type of application, the vector may be in the form of a plasmid, phage, cosmid, minichromosome, or virus, but naked DNA that is only transiently expressed in certain cells is also an important vector. is there. Preferred cloning and expression vectors (plasmid vectors) of the present invention are capable of automatic replication; thereby allowing high levels of expression for subsequent cloning or high copy numbers for high levels of replication. .
一般的な概要では、発現ベクターは、5’→3’の方向で、且つ、作動できるように連結された状態で以下の要素を含んでなる:本発明の核酸断片の発現を駆動するためのプロモーター、任意には(細胞外相又は該当する場合にはペリプラズマ内への)分泌を可能にするリーダーペプチドをコードする核酸配列、本発明のペプチドをコードする核酸断片、及び任意にはターミネータをコードする核酸配列。それらは、追加の要素、例えば選択マーカーや複製開始点などを含んでもよい。生産株又は細胞株の中で発現ベクターを操作する場合、ベクターが宿主細胞ゲノム内に組み込まれることができるのは好ましいことであり得る。当業者は、好適なベクターに非常に詳しいので、それらの具体的な必要性に従ってベクターを設計できる。 In general terms, an expression vector comprises the following elements in a 5 '→ 3' orientation and operably linked: for driving expression of the nucleic acid fragment of the invention. Coding a promoter, optionally a nucleic acid sequence encoding a leader peptide that enables secretion (into the extracellular phase or periplasm, if applicable), a nucleic acid fragment encoding the peptide of the invention, and optionally a terminator Nucleic acid sequence. They may contain additional elements such as selection markers and origins of replication. When manipulating an expression vector in a production or cell line, it may be preferable that the vector can be integrated into the host cell genome. Those skilled in the art are very familiar with suitable vectors and can design vectors according to their specific needs.
本発明のベクターは、本発明の化合物を産生するように宿主細胞を形質転換するために使用される。(本発明の不可欠な要素でもある)そのような形質転換細胞は、本発明の核酸断片及びベクターの伝播のために使用される、又は本発明のペプチドの遺伝子組み換え産生のために使用される培養細胞又は細胞株であることができる。 The vectors of the present invention are used to transform host cells to produce the compounds of the present invention. Such transformed cells (which are also an integral part of the invention) are used for the propagation of the nucleic acid fragments and vectors of the invention or used for the genetic production of the peptides of the invention. It can be a cell or cell line.
本発明の好ましい形質転換細胞は、微生物、例えば細菌(例えばエシェリキア(Escherichia)属(例えばE.コリ(E. coli))、バチルス(Bacillus)属(例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis))、サルモネラ(Salmonella)属、若しくはマイコバクテリウム(Mycobacterlum)属(好ましくは非病原性のもの、例えばM.ボビス(M. bovis)BCG)、酵母(例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)など)、及び原虫などである。あるいは、形質転換細胞は、多細胞生物に由来することもある、すなわち、それは、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、又は哺乳動物細胞であってもよい。クローニング及び/又は最適化された発現を目的として、形質転換細胞が本発明の核酸断片を複製することができるのが好ましい。核酸断片を発現する細胞は、本発明の有用な実施形態である;それらは本発明のペプチドの小規模又は大規模な調製のために使用できる。 Preferred transformed cells of the present invention are microorganisms such as bacteria (eg, Escherichia (eg, E. coli), Bacillus (eg, Bacillus subtilis), Salmonella ( Salmonella, or Mycobacterlum (preferably non-pathogenic, such as M. bovis BCG), yeast (such as Saccharomyces cerevisiae), and protozoa Alternatively, the transformed cell may be derived from a multicellular organism, i.e. it may be a fungal cell, an insect cell, a plant cell or a mammalian cell, cloned and / or optimized. For the purpose of expression, it is preferred that the transformed cell is capable of replicating the nucleic acid fragment of the invention. Cells is a useful embodiment of the present invention; they can be used for small-scale or large-scale preparation of the peptides of the present invention.
形質転換細胞によって本発明のペプチドを製造するとき、必須ではないが、発現産物が培地中に分泌されると都合がよい。 When producing the peptides of the present invention by transformed cells, it is not essential, but it is convenient if the expression product is secreted into the medium.
有効性
GLP‐1又はグルカゴン(Glu)受容体への関連化合物の結合を、アゴニスト活性の指標として使用できるが、一般に、関連受容体へのかかる化合物の結合によって引き起こされる細胞内シグナル伝達を計測する生物学的アッセイを使用することが好ましい。例えば、グルカゴン作動薬によるグルカゴン受容体の活性化は、細胞サイクリックAMP(cAMP)形成を刺激する。同様に、GLP‐1作動薬によるGLP‐1受容体の活性化は、細胞cAMP形成を刺激する。よって、これらの2つの受容体のうちの一方を発現している好適な細胞におけるcAMPの産生は、関連する受容体活性を観察するのに使用できる。従って、それぞれ一方の受容体を発現しているが、もう一方を発現していない細胞型の好適な対の使用は、両タイプの受容体に対するアゴニスト活性を測定するのに使用できる。
Efficacy Binding of related compounds to GLP-1 or glucagon (Glu) receptors can be used as an indicator of agonist activity, but generally measures intracellular signaling caused by binding of such compounds to related receptors It is preferred to use biological assays. For example, activation of glucagon receptors by glucagon agonists stimulates cellular cyclic AMP (cAMP) formation. Similarly, activation of the GLP-1 receptor by GLP-1 agonists stimulates cellular cAMP formation. Thus, the production of cAMP in suitable cells expressing one of these two receptors can be used to observe the associated receptor activity. Thus, the use of a suitable pair of cell types each expressing one receptor but not the other can be used to measure agonist activity for both types of receptors.
当業者は好適なアッセイ形式を認識し、そして実施例が以下に提供されている。GLP‐1受容体及び/又はグルカゴン受容体は、実施例に記載のとおり受容体の配列を持つことができる。例えば、アッセイには、一次受入番号GI:4503947のヒト・グルカゴン受容体(グルカゴンR)及び/又は一次受入番号GI:166795283のヒト・グルカゴン様ペプチド1受容体(GLP‐1R)を使用することもできる(前駆タンパク質の配列に関する場合には、シグナル配列を欠いた成熟タンパク質をアッセイに利用することはもちろん理解されるべきである)。 Those skilled in the art will recognize suitable assay formats and examples are provided below. The GLP-1 receptor and / or glucagon receptor can have the receptor sequence as described in the Examples. For example, the assay may use the human glucagon receptor (glucagon R) with primary accession number GI: 4503947 and / or the human glucagon-like peptide 1 receptor (GLP-1R) with primary accession number GI: 166795283. (It should of course be understood that the mature protein lacking the signal sequence is used in the assay when it relates to the sequence of the precursor protein).
所定の受容体における作動薬の効力の数的評価基準としてEC50値が使用されることもある。EC50値は、特定のアッセイにおいてその化合物の最大活性の半分を達成するのに必要とされる化合物の濃度の評価基準である。よって、例えば、特定のアッセイにおいて天然グルカゴンのEC50[GLP‐1R]より低いEC50[GLP‐1R]を有する化合物は、グルカゴンよりもGLP‐1Rにおいてさらに高い効力を有すると考えることができる。 EC 50 values may be used as a numerical measure of agonist efficacy at a given receptor. The EC 50 value is a measure of the concentration of a compound that is required to achieve half of the compound's maximum activity in a particular assay. Thus, for example, a compound having EC 50 [GLP-1R] lower EC 50 [GLP-1R] of native glucagon in a particular assay may be considered to have a higher potency in GLP-1R than glucagon.
この明細書に記載の化合物は、通常、Glu‐GLP‐1二重作動薬である、すなわち、それらはグルカゴン受容体とGLP‐1受容体の両方においてcAMP形成を刺激することができる。それぞれの受容体の刺激は独立したアッセイにより計測され、その後互いに比較できる。 The compounds described herein are usually Glu-GLP-1 dual agonists, that is, they can stimulate cAMP formation at both glucagon and GLP-1 receptors. The stimulation of each receptor is measured by an independent assay and can then be compared to each other.
所定の化合物に関するGLP‐1受容体についてのEC50値(EC50[GLP‐1R])とグルカゴン受容体についてのEC50値(EC50[グルカゴンR])を比較することによって、その化合物の相対グルカゴン選択性(%)が求められる: By comparing the EC 50 value for the GLP-1 receptor (EC 50 [GLP-1R]) with the EC 50 value for the glucagon receptor (EC 50 [glucagon R]) for a given compound, the relative Glucagon selectivity (%) is required:
相対グルカゴンR選択性[化合物]=(1/EC50[グルカゴンR])x100/(1/EC50[グルカゴンR]+1/EC50[GLP‐1R]) Relative glucagon R selectivity [compound] = (1 / EC 50 [glucagon R]) × 100 / (1 / EC 50 [glucagon R] + 1 / EC 50 [GLP-1R])
相対GLP‐1R選択性も同様に求められる:
相対GLP‐1R選択性[化合物]=(1/EC50[GLP‐1R])x100/(1/EC50[グルカゴンR]+1/EC50[GLP‐1R])
Relative GLP-1R selectivity is similarly determined:
Relative GLP-1R selectivity [compound] = (1 / EC 50 [GLP-1R]) × 100 / (1 / EC 50 [glucagon R] + 1 / EC 50 [GLP-1R])
化合物の相対的選択性は、GLP‐1又はグルカゴン受容体に対するその効果をもう片方の受容体に対するその効果と直接比較することを可能にする。例えば、より高い化合物の相対GLP‐1選択性は、グルカゴン受容体と比較したときにGLP‐1受容体に対してその化合物がより効果的であるということである。 The relative selectivity of the compound makes it possible to directly compare its effect on the GLP-1 or glucagon receptor with its effect on the other receptor. For example, the relative GLP-1 selectivity of a higher compound is that the compound is more effective against the GLP-1 receptor when compared to the glucagon receptor.
以下で記載したアッセイを使用して、我々は、ヒト・グルカゴンに関する相対GLP‐1選択性が約5%であることを求めた。 Using the assay described below, we determined that the relative GLP-1 selectivity for human glucagon was about 5%.
本発明の化合物は、ヒト・グルカゴンに比べてより高い相対GLP‐1R選択性を有する。よって、特定のレベルのグルカゴンRアゴニスト活性に関して、化合物は、グルカゴンに比べてより高いレベルのGLP‐1Rアゴニスト活性(すなわち、GLP‐1受容体においてより優れた効力)を示す。当然のことながら、グルカゴン受容体及びGLP‐1受容体における特定の化合物の絶対効力は、適当な相対GLP‐1R選択性が達成されている限り、天然ヒト・グルカゴンより高くても、より低くても、又はほぼ同等であってもよい。 The compounds of the present invention have higher relative GLP-1R selectivity compared to human glucagon. Thus, for a particular level of glucagon R agonist activity, the compound exhibits a higher level of GLP-1R agonist activity (ie, better potency at the GLP-1 receptor) compared to glucagon. Of course, the absolute potency of a particular compound at the glucagon and GLP-1 receptors is lower, even higher than native human glucagon, as long as appropriate relative GLP-1R selectivity is achieved. Or may be approximately equivalent.
それにもかかわらず、本願発明の化合物は、ヒト・グルカゴンより低いEC50[GLP‐1R]を有することもある。化合物は、グルカゴンより低いEC50[GLP‐1R]を有することもある一方で、ヒト・グルカゴンのものより10倍弱高い、ヒト・グルカゴンのものより5倍弱高い、又はヒト・グルカゴンのものより2倍弱高いEC50[グルカゴンR]を維持している。 Nevertheless, the compounds of the present invention may have a lower EC 50 [GLP-1R] than human glucagon. The compound may have a lower EC 50 [GLP-1R] than glucagon, but less than 10 times higher than that of human glucagon, less than 5 times higher than that of human glucagon, or higher than that of human glucagon Maintains EC 50 [Glucagon R] slightly higher than twice.
本発明の化合物は、ヒトグルカゴンのものより2倍弱であるEC50[グルカゴンR]を有することができる。化合物は、ヒト・グルカゴンのものの2倍弱であるEC50[グルカゴンR]を有することができ、且つ、ヒト・グルカゴンのそれの半分未満、ヒト・グルカゴンのものの5分の1未満、又はヒト・グルカゴンのものの10分の1未満であるEC50[GLP‐1R]を有する。 The compounds of the invention can have an EC 50 [glucagon R] that is less than twice that of human glucagon. The compound can have an EC 50 [glucagon R] that is less than twice that of human glucagon and less than half that of human glucagon, less than one fifth that of human glucagon, or human It has an EC 50 [GLP-1R] that is less than one-tenth of that of glucagon.
化合物の相対GLP‐1選択性は、5%〜95%であり得る。例えば、化合物は、5〜20%、10〜30%、20〜50%、30〜70%、又は50〜80%;又は30〜50%、40〜60%、50〜70%又は75〜95%の相対選択性を有し得る。 The relative GLP-1 selectivity of the compound can be between 5% and 95%. For example, the compound may be 5-20%, 10-30%, 20-50%, 30-70%, or 50-80%; or 30-50%, 40-60%, 50-70%, or 75-95. % Relative selectivity.
治療上の使用
本発明の化合物は、2型糖尿病を含めた肥満及び代謝性疾患のための魅力的な処置選択肢を提供し得る。
Therapeutic Use The compounds of the present invention may provide attractive treatment options for obesity and metabolic diseases, including type 2 diabetes.
単純に糖尿病と呼ばれることも多い真性糖尿病は、通常、遺伝的原因と環境的原因の組み合わせによる代謝障害の症候群であり、異常に高い血糖値(高血糖)をもたらす。 Diabetes mellitus, often referred to simply as diabetes, is usually a syndrome of metabolic disorders due to a combination of genetic and environmental causes, resulting in abnormally high blood sugar levels (hyperglycemia).
血糖値は、膵臓のベータ細胞内で作られるホルモンであるインスリンによって制御される。糖尿病は、(1型糖尿病における)インスリン産生膵臓ベータ細胞の破壊によって、そして(2型糖尿病における)ベータ細胞の喪失に続く(妊娠糖尿病における)インスリンの効果に対する耐性によって発症する。両タイプの糖尿病とも高血糖につながり、それが糖尿病の急性徴候:過剰な尿産生、結果として生じる補償性口渇感と水分摂取の増加、視力障害、体重減少、嗜眠、及びエネルギー代謝の変化、の大きな原因となる。 Blood glucose levels are controlled by insulin, a hormone made in the pancreatic beta cells. Diabetes develops by destruction of insulin-producing pancreatic beta cells (in type 1 diabetes) and by resistance to the effects of insulin (in gestational diabetes) following loss of beta cells (in type 2 diabetes). Both types of diabetes lead to hyperglycemia, which is an acute sign of diabetes: excessive urine production, resulting compulsive thirst and increased water intake, visual impairment, weight loss, lethargy, and changes in energy metabolism It becomes a big cause.
メタボリック症候群は、人の代謝的なリスク因子群を特徴とする。それらには、腹部肥満(腹筋内臓周りの過剰な脂肪組織)、アテローム形成性脂質異常症(高いトリグリセリド、低いHDLコレステロール及び/又は高いLDLコレステロールを含めた血液脂質異常であって、それが動脈壁におけるプラークの蓄積を助長する)、高血圧(高血圧症)、インスリン抵抗性及び耐糖能異常、血栓形成促進状態(例えば、高い血中フィブリノゲン又はプラスミノゲンアクチベータインヒビター‐1)、及び炎症促進状態(例えば、高い血中C反応性タンパク質)が含まれる。 Metabolic syndrome is characterized by a group of human metabolic risk factors. They include abdominal obesity (excess adipose tissue around the abdominal viscera), atherogenic dyslipidemia (blood lipid abnormalities, including high triglycerides, low HDL cholesterol and / or high LDL cholesterol, which are arterial walls. Conducive to plaque accumulation), hypertension (hypertension), insulin resistance and impaired glucose tolerance, prothrombotic state (eg, high blood fibrinogen or plasminogen activator inhibitor-1), and pro-inflammatory state (eg, high) Blood C-reactive protein).
メタボリック症候群を患っている人は、2型糖尿病、並びに冠動脈性心疾患及び動脈硬化症のその他の発現(例えば脳卒中や末梢血管疾患)に関連した他の疾患の高いリスクがある。この症候群の主要な潜在するリスク因子は、腹部肥満、インスリン抵抗性及び耐糖能異常、血栓形成促進状態(例えば、高い血中フィブリノゲン又はプラスミノゲンアクチベータインヒビター‐1)、及び炎症促進状態(例えば、高い血中C反応性タンパク質)であると思われる。 People suffering from metabolic syndrome are at high risk of type 2 diabetes and other diseases associated with coronary heart disease and other manifestations of arteriosclerosis (eg stroke and peripheral vascular disease). The main potential risk factors for this syndrome are abdominal obesity, insulin resistance and impaired glucose tolerance, pro-thrombotic conditions (eg, high blood fibrinogen or plasminogen activator inhibitor-1), and pro-inflammatory conditions (eg, high blood) Medium C-reactive protein).
いずれかの特定の理論に縛られることを望むものではないが、本発明の化合物はGluGLP‐1二重作動薬として作用すると信じられている。二重作動薬は、血糖値と食餌摂取に対するGLP‐1の効果と、脂肪代謝に対するグルカゴンの効果を兼ね備えている。そのため、それらは、低血糖の危険なしに、過度の脂肪沈着の排除を加速し、持続可能な体重減少を引き起こし、そして病的なグルコースレベルを正常レベルへと直接的に減少させるように相乗的な様式で作用し、そしてそれらは、GLP‐1作動薬とスルホニル尿素との併用に関連する。 While not wishing to be bound by any particular theory, it is believed that the compounds of the present invention act as GluGLP-1 dual agonists. Dual agonists combine the effects of GLP-1 on blood glucose and food intake and the effects of glucagon on fat metabolism. Thus, they are synergistic to accelerate the elimination of excessive fat deposition, cause sustainable weight loss, and directly reduce pathological glucose levels to normal levels without the risk of hypoglycemia They are associated with the combination of GLP-1 agonists and sulfonylureas.
二重GluGLP‐1作動薬の相乗効果はさらに、例えば高コレステロールやLDLなどの心血管疾患の危険因子の低減、並びに耐糖能の改善をもたらすこともできるが、それは、体重に対するそれらの効果とは完全に独立したものであり得る。 The synergistic effects of dual GluGLP-1 agonists can also lead to reduced risk factors for cardiovascular diseases, such as high cholesterol and LDL, as well as improved glucose tolerance, but what are their effects on body weight? It can be completely independent.
そのため、本発明の化合物は、病的な肥満、並びにこれだけに限定されるものではないが、肥満に関係する炎症、肥満に関係する胆嚢疾患及び肥満誘発性睡眠時無呼吸症を含めた関連疾患及び健康状態を含めて、(例えば食欲、給食、食物摂取、熱量摂取、及び/又はエネルギー消費の制御によって)体重増加を予防するか、体重減少を促進するか、過剰体重を低減するか、又は肥満を処置するための医薬品として使用できる。本発明の化合物はさらに、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、耐糖能異常、2型糖尿病、高血圧症、アテローム形成性脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠動脈性心疾患、及び脳卒中の処置に使用できる。これらは、肥満に関連し得るすべての身体状態である。しかしながら、これらの身体状態に対する本発明の化合物の効果は、体重に対する効果を介して全体又は一部が媒介されていても、それとは無関係であってもよい。 As such, the compounds of the present invention provide morbid obesity and related diseases including, but not limited to, obesity-related inflammation, obesity-related gallbladder disease and obesity-induced sleep apnea Prevent weight gain, promote weight loss, reduce excess weight (eg, by controlling appetite, feeding, food intake, caloric intake, and / or energy expenditure), including health status, or It can be used as a medicine for treating obesity. The compounds of the present invention may further comprise metabolic syndrome, insulin resistance, impaired glucose tolerance, type 2 diabetes, hypertension, atherogenic dyslipidemia, atherosclerosis, arteriosclerosis, coronary heart disease, and stroke. Can be used for treatment. These are all physical conditions that can be associated with obesity. However, the effects of the compounds of the present invention on these physical conditions may be wholly or partly mediated through effects on body weight or independent thereof.
医薬組成物
本発明の化合物又はその塩は、貯蔵又は投与向けに調製された医薬組成物として処方されてもよく、その医薬組成物は、医薬的に許容し得る担体中に治療上有効な量の本発明の化合物又はその塩を通常含んでなる。
Pharmaceutical Compositions A compound of the present invention or a salt thereof may be formulated as a pharmaceutical composition prepared for storage or administration, wherein the pharmaceutical composition is in a therapeutically effective amount in a pharmaceutically acceptable carrier. Or a salt thereof of the present invention.
本発明の化合物の治療上有効な量は、投与経路、処置される哺乳動物のタイプ、及び考慮している特定の哺乳動物の物理的特性に依存する。これらの因子とこの量を決定するためのそれらの相関は、医学分野の熟練した開業医にとって周知である。この量と投与方法は、最適な有効性を達成するために調整されることができ、医学分野の当業者に周知である体重、食餌、併用投薬、及び他の要素といった要因に依存し得る。 The therapeutically effective amount of the compounds of the invention will depend on the route of administration, the type of mammal being treated, and the physical characteristics of the particular mammal under consideration. These factors and their correlation to determine this amount are well known to skilled practitioners in the medical field. This amount and method of administration can be adjusted to achieve optimal effectiveness and can depend on factors such as weight, diet, concomitant medications, and other factors well known to those of ordinary skill in the medical arts.
ヒトでの使用に最も適当である投薬量サイズ及び投薬計画は、本発明によって得られた結果を指針としてよく、適切に設計された臨床試験で確認されてもよい。 Dosage sizes and dosing schedules that are most appropriate for human use may be guided by the results obtained by the present invention and may be ascertained in appropriately designed clinical trials.
有効投薬量及び治療プロトコールは、実験動物における低用量から出発して、次に効果を観察しながら投薬量を増大させ、系統的に投薬計画を変えて、従来の手段によって決定され得る。所定の対象についての最適な用量を決定するとき、臨床医は多数の要因を考慮に入れることができる。そのような考慮事項は、当業者にとって公知である。 Effective dosages and treatment protocols can be determined by conventional means, starting with a low dose in the experimental animal, then increasing the dose while observing the effect, systematically changing the dosing regimen. When determining the optimal dose for a given subject, the clinician can take into account a number of factors. Such considerations are known to those skilled in the art.
「医薬的に許容し得る担体」という用語には、あらゆる標準的な医薬担体が含まれる。治療用途のための医薬的に許容し得る担体は、医薬的技術分野で周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro編、1985年)中に記載されている。例えば、弱酸性の又は生理的pHの無菌の生理的食塩水やリン酸緩衝生理的食塩水を使用してもよい。pH緩衝剤は、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(TRIS)、N‐トリス(ヒドロキシメチル)メチル‐3‐アミノプロパン・スルホン酸(TAPS)、重炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、好ましい緩衝液であるヒスチジン、アルギニン、リジン又は酢酸塩、あるいはそれらの混合物であってもよい。前記用語は、ヒトを含めた動物における使用のためにUS薬局方に掲載されたあらゆる薬剤がさらに包含される。 The term “pharmaceutically acceptable carrier” includes any standard pharmaceutical carrier. Pharmaceutically acceptable carriers for therapeutic use are well known in the pharmaceutical art and are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro, 1985). For example, mildly acidic or physiological pH sterile physiological saline or phosphate buffered physiological saline may be used. pH buffering agents include phosphate, citrate, acetate, tris (hydroxymethyl) aminomethane (TRIS), N-tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropane sulfonic acid (TAPS), ammonium bicarbonate , Diethanolamine, histidine, arginine, lysine or acetate, which are preferred buffers, or a mixture thereof. The term further encompasses any drug listed in the US Pharmacopeia for use in animals, including humans.
「医薬的に許容し得る塩」という用語は、化合物の塩を指す。塩には、酸付加塩や塩基性塩などの医薬的に許容し得る塩が含まれる。酸付加塩の例には、塩酸塩、クエン酸塩、及び酢酸塩が含まれる。塩基性塩の例には、陽イオンがアルカリ金属、例えばナトリウムやカリウム、アルカリ土類金属、例えばカルシウムやアンモニウムイオン+N(R3)3(R4){ここで、R3及びR4は、独立に、任意に置換されたC1‐6‐アルキル、任意に置換されたC2‐6‐アルケニル、任意に置換されたアリール、又は任意に置換されたヘテロアリールを表す。}から選択される塩が含まれる。医薬的に許容し得る塩のその他の例は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第17版、Ed. Alfonso R. Gennaro(編)、Mark Publishing Company、Easton、PA、U.S.A.、1985年、並びにさらに最新の版、及びEncyclopaedia of Pharmaceutical Technologyに記載されている。 The term “pharmaceutically acceptable salt” refers to a salt of a compound. Salts include pharmaceutically acceptable salts such as acid addition salts and basic salts. Examples of acid addition salts include hydrochloride, citrate, and acetate. Examples of basic salts include alkali ions such as sodium or potassium, alkaline earth metals such as calcium or ammonium ions + N (R 3 ) 3 (R 4 ) {where R 3 and R 4 are independent Represents optionally substituted C 1-6 -alkyl, optionally substituted C 2-6 -alkenyl, optionally substituted aryl, or optionally substituted heteroaryl. } Is selected. Other examples of pharmaceutically acceptable salts are described in “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 17th edition, Ed. Alfonso R. Gennaro (eds.), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985, as well as the latest Edition, and in the Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology.
「処置」は、有益な又は所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本願発明の目的のために、有益な又は所望の臨床結果には、検出可能であるか検知不可能であるかにかかわらず、症状の緩和、疾患の範囲の縮小、安定化した(すなわち、悪化しない)病状、疾患進行の遅延又は減速、病状の改善又は緩和、及び(部分的であるか全体的であるかにかかわらず)寛解が含まれるが、これだけに限定されるものではない。「処置」はさらに、処置を受けなかった場合に予想された生存と比較して生存を長引かせることを意味することもできる。「処置」は、障害の発生を予防するか又は病理を変更することを企図して実施される干渉である。従って、「処置」は、治療処置と予防対策(prophylactic or preventative measures)の両方を指す。処置を必要とする人には、既に障害を患っている人、並びに障害を予防すべき状態にある人が含まれる。 “Treatment” is an approach for obtaining beneficial or desired clinical results. For the purposes of the present invention, beneficial or desired clinical results, whether detectable or undetectable, alleviate symptoms, reduce disease range, stabilize (ie, worsen) (Not) disease state, delay or slowing of disease progression, amelioration or alleviation of disease state, and remission (whether partial or total). “Treatment” can also mean prolonging survival as compared to expected survival if not receiving treatment. “Treatment” is interference performed with the intention of preventing the occurrence of a disorder or altering the pathology. Thus, “treatment” refers to both therapeutic treatment and prophylactic or preventative measures. Persons in need of treatment include those who are already suffering from a disorder as well as those who are in a condition to prevent the disorder.
医薬組成物は単位剤形であることができる。そのような形態では、組成物は適当な数量の活性成分を含む単位用量に分割される。単位剤形は、パッケージ化された調製物であることができ、そのパッケージには、個別の分量の調製物、例えばパックされた錠剤、カプセル剤、及びバイアル又はアンプル中の散剤が含まれている。単位剤形はまた、カプセル剤、カシェ剤、それ自体の錠剤であることもできるが、又はそれは、これらのいずれかを適当な数パッケージ化した形態であることもできる。それは、例えばペン形で、単回投与注射剤型で提供することもできる。組成物は、あらゆる好適な投与経路及び手段のために処方され得る。医薬的に許容し得る担体又は希釈剤には、経口投与、直腸投与、経鼻投与、(頬側や舌下を含めた)局所投与、膣投与又は(皮下、筋肉内、静脈内、皮内、及び経皮を含めた)非経口投与に好適な製剤に使用されるものが含まれる。製剤は、都合よく、単位剤形で提供されることができ、そして薬学の技術分野で周知の方法のいずれかによって調製されることができる。 The pharmaceutical composition can be in unit dosage form. In such form, the composition is divided into unit doses containing appropriate quantities of the active component. The unit dosage form can be a packaged preparation, the package containing discrete quantities of preparation, such as packed tablets, capsules, and powders in vials or ampoules. . The unit dosage form can also be a capsule, cachet, its own tablet, or it can be in any suitable number of these packaged forms. It can also be provided in a single dose injection form, for example in pen form. The composition can be formulated for any suitable route and means of administration. Pharmaceutically acceptable carriers or diluents include oral, rectal, nasal, topical (including buccal and sublingual), vaginal or (subcutaneous, intramuscular, intravenous, intradermal) And those used in formulations suitable for parenteral administration (including transdermal). The formulations can conveniently be provided in unit dosage form and can be prepared by any of the methods well known in the pharmaceutical art.
皮下又は経皮様式の投与が、本明細書中に記載した化合物にとって特に好適であり得る。 Subcutaneous or transdermal modes of administration may be particularly suitable for the compounds described herein.
併用療法
本発明の化合物は、糖尿病、肥満又は高血圧症の処置のための作用物質と共に併用療法の一部として投与することもできる。
Combination Therapy The compounds of the present invention can also be administered as part of a combination therapy together with agents for the treatment of diabetes, obesity or hypertension.
そのような場合、2種類の活性物質は、同じ医薬製剤の一部として又は別々の製剤として、一緒に又は別々に与えられることができる。 In such cases, the two active substances can be given together or separately as part of the same pharmaceutical formulation or as separate formulations.
よって、本発明の化合物(又はその塩)は、これだけに限定されるものではないが、メトホルミン、スルホニル尿素、グリニド、DPP‐IV阻害剤、グリタゾン、又はインスリンを含めた他の抗糖尿病薬と組み合わせて使用できる。好ましい実施形態では、化合物又はその塩は、適当な血糖コントロールを達成するためにインスリン、DPP‐IV阻害剤、スルホニル尿素又はメトホルミン、特にスルホニル尿素又はメトホルミンと組み合わせて使用される。よりいっそう好ましい実施形態では、化合物又はその塩は、適当な血糖コントロールを達成するために、インスリン又はインシュリン類似体と組み合わせて使用される。インシュリン類似体の例には、Lantus、Novorapid、Humalog、Novomix、及びActraphane HMが含まれるが、これだけに限定されるものではない。 Thus, the compounds of the invention (or salts thereof) are combined with other antidiabetic agents including, but not limited to, metformin, sulfonylureas, glinides, DPP-IV inhibitors, glitazones, or insulin. Can be used. In a preferred embodiment, the compound or salt thereof is used in combination with insulin, a DPP-IV inhibitor, a sulfonylurea or metformin, particularly a sulfonylurea or metformin, to achieve adequate glycemic control. In an even more preferred embodiment, the compound or salt thereof is used in combination with insulin or an insulin analog to achieve adequate glycemic control. Examples of insulin analogs include, but are not limited to Lantus, Novorapid, Humalog, Novomix, and Actaphane HM.
化合物又はその塩は、これだけに限定されるものではないが、グルカゴン様ペプチド受容体1作動薬、ペプチドYY又はその類似体、カンナビノイド受容体1拮抗薬、リパーゼ阻害剤、メラノコルチン受容体4作動薬、又はメラニン濃縮ホルモン受容体1拮抗薬を含めた抗肥満薬と組み合わせてさらに使用されることができる。 The compound or salt thereof is not limited thereto, but glucagon-like peptide receptor 1 agonist, peptide YY or its analog, cannabinoid receptor 1 antagonist, lipase inhibitor, melanocortin receptor 4 agonist, Or it can be further used in combination with anti-obesity drugs including melanin-concentrating hormone receptor 1 antagonists.
類似体化合物又はその塩は、これだけに限定されるものではないが、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシンII受容体遮断薬、利尿剤、ベータ遮断薬、又はカルシウムチャネル遮断薬を含めた抗高血圧剤と組み合わせて使用されることもできる。 Analog compounds or salts thereof include, but are not limited to, antihypertensive agents including angiotensin converting enzyme inhibitors, angiotensin II receptor blockers, diuretics, beta blockers, or calcium channel blockers. It can also be used in combination.
方法
グルカゴン類似体の一般的合成
固相ペプチド合成を、ポリスチレン樹脂(TentaGel S Ram)上のNMPにおいて標準的なFmocストラテジーを使用したマイクロ波支援合成装置によるSPPSとして実施した。塩基としてのDIPEAと一緒に、HATUをカップリング試薬として使用した。Piperidlne(NMPの20%)は脱保護基に使用した。
Methods General Synthesis of Glucagon Analogs Solid phase peptide synthesis was performed as SPPS with a microwave assisted synthesizer using a standard Fmoc strategy in NMP on polystyrene resin (TentaGel S Ram). HATU was used as a coupling reagent with DIPEA as base. Piperidlne (20% of NMP) was used as a deprotecting group.
擬プロリン:Fmoc‐Phe‐Thr(.Psi.Me、Me pro)‐OH及びFmoc‐Asp‐Ser(.Psi.Me、Me pro)‐OH(NovaBiochemから購入)を適切な場所で使用した。 Pseudoproline: Fmoc-Phe-Thr (.Psi.Me, Me pro) -OH and Fmoc-Asp-Ser (.Psi.Me, Me pro) -OH (purchased from NovaBiochem) were used where appropriate.
切り出し:
未精製ペプチドを、95/2.5/2.5%(v/v)のTFA/TIS/水を用いて室温にて2時間処理することによって樹脂から切り出した。配列内にメチオニンがあるペプチドについては、95/5%(v/v)のTFA/EDTの混合物を使用した。TFAの大部分を減圧下で取り除き、未精製ペプチドを、沈殿させ、ジエチルエーテルで洗浄し、そして周囲温度にて恒量まで乾燥させた。
Cut out:
The crude peptide was excised from the resin by treatment with 95 / 2.5 / 2.5% (v / v) TFA / TIS / water for 2 hours at room temperature. For peptides with methionine in the sequence, a 95/5% (v / v) TFA / EDT mixture was used. Most of the TFA was removed under reduced pressure, and the crude peptide was precipitated, washed with diethyl ether and dried to ambient weight at ambient temperature.
未精製ペプチドのHPLC精製
未精製ペプチドを、PerSeptive Biosystems VISION Workstationによる標準的な逆相HPLCによって精製した。VISION 3.0ソフトウェアを、測定器制御とデータ取得に使用した。ペプチドを、MSを使用して分析し、且つ、HPLCによって測定した場合に90%超まで精製した。
HPLC purification of crude peptide The crude peptide was purified by standard reverse phase HPLC on a PerSeptive Biosystems VISION Workstation. VISION 3.0 software was used for instrument control and data acquisition. The peptide was analyzed using MS and purified to greater than 90% as measured by HPLC.
アシル化グルカゴン類似体の一般的合成
ペプチド骨格を、それがまだ樹脂に取り付けられているペプチドによってリジン残基の側鎖上でアシル化されること、及びアシル化されるべきリジン上のイプシロン・アミンを除いて、側鎖基上で完全に保護されていることを除いて、グルカゴン類似体の一般的合成について先に記載したとおり合成する。アシル化されるべきリジンを、Fmoc‐Lys(ivDde)‐OHの使用によって組み込む。ペプチドのN末端を、NMP中のBoc2Oを使用してBoc基で保護する。ペプチドがまだ樹脂に取り付けられているうちに、ivDde保護基を、NMP中の2% ヒドラジン水和物を使用して選択的に切り出す。そして、保護されていないリジン側鎖を、最初にFmoc‐Glu‐OtBuのようなスペーサー・アミノ酸に結合させ、それを、ピペリジンで脱保護し、先に記載したとおり標準的なペプチドカップリング法を使用して脂肪酸でアシル化する。あるいは、N末端のヒスチジンを、Boc‐His(Boc)‐OHとして始めから組み込むこともできる。樹脂からの切り出しと精製を、先に記載したとおり実施する。
General synthesis of acylated glucagon analogues: The peptide backbone is acylated on the side chain of a lysine residue by a peptide that is still attached to the resin, and the epsilon amine on the lysine to be acylated Is synthesized as described above for the general synthesis of glucagon analogs, except that is fully protected on the side chain group. The lysine to be acylated is incorporated by use of Fmoc-Lys (ivDde) -OH. The N-terminus of the peptide is protected with a Boc group using Boc 2 O in NMP. The ivDde protecting group is selectively excised using 2% hydrazine hydrate in NMP while the peptide is still attached to the resin. The unprotected lysine side chain is then first coupled to a spacer amino acid such as Fmoc-Glu-OtBu, which is deprotected with piperidine and standard peptide coupling methods as described above. Use to acylate with fatty acids. Alternatively, the N-terminal histidine can be incorporated from the beginning as Boc-His (Boc) -OH. Excision and purification from the resin is performed as described above.
ペプチドの安定性の分析
グルカゴン類似体を、固形の化合物として40℃にてインキュベートし、そして0.1MのHCl水溶液(2mg/ml)中の溶液として溶解した。溶液を40℃にてインキュベートした。残留している完全なグルカゴン類似体を、220nMにおけるUVシグナルの積分によってRP‐HPLCにより計測した。残留率(%)は相対安定性の評価基準である。
Analysis of peptide stability The glucagon analog was incubated as a solid compound at 40 ° C. and dissolved as a solution in 0.1 M aqueous HCl (2 mg / ml). The solution was incubated at 40 ° C. The remaining complete glucagon analog was measured by RP-HPLC by integration of the UV signal at 220 nM. Residual rate (%) is an evaluation standard for relative stability.
グルカゴン化合物の固体及び溶液を、分析前に0.2mg/mLの濃度までHPLC溶媒中に希釈し、そして適切な時点にて分析した。 Glucagon compound solids and solutions were diluted in HPLC solvent to a concentration of 0.2 mg / mL prior to analysis and analyzed at appropriate time points.
ヒトグルカゴン受容体及びGLP‐1受容体を発現する細胞株の作出
ヒト・グルカゴン受容体(グルカゴンR)(一次受入番号P47871)又はヒト・グルカゴン様ペプチド1受容体(GLP‐1R)(一次受入番号P43220)のどちらかをコードするcDNAを、それぞれcDNAクローンBC104854(MGC:132514/IMAGE:8143857)又はBC112126(MGC:138331/IMAGE:8327594)からクローン化した。グルカゴンR又はGLP‐1‐RをコードするDNAを、サブクローニングのために端末の制限部位をコードするプライマーを使用してPCRによって増幅した。5’末端プライマーは、効果的な翻訳を確実にするために近コザック・コンセンサス配列をさらにコードした。グルカゴンRとGLP‐1‐RをコードするDNAの忠実度を、DNA配列決定法によって確認した。グルカゴンR又はGLP‐1‐RをコードするPCR産物を、ネオマイシン(G418)耐性マーカーを含んでいる哺乳動物発現ベクター内にサブクローニングした。
Production of cell lines expressing human glucagon receptor and GLP-1 receptor Human glucagon receptor (glucagon R) (primary accession number P47871) or human glucagon-like peptide 1 receptor (GLP-1R) (primary accession number) CDNAs encoding either P43220) were cloned from cDNA clones BC104854 (MGC: 132514 / IMAGE: 8143857) or BC112126 (MGC: 138331 / IMAGE: 8327594), respectively. DNA encoding glucagon R or GLP-1-R was amplified by PCR using primers encoding terminal restriction sites for subcloning. The 5 ′ end primer further encoded a near Kozak consensus sequence to ensure effective translation. The fidelity of DNA encoding glucagon R and GLP-1-R was confirmed by DNA sequencing. PCR products encoding glucagon R or GLP-1-R were subcloned into a mammalian expression vector containing a neomycin (G418) resistance marker.
グルカゴンR又はGLP‐1‐Rをコードする哺乳動物発現ベクターを、標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション法によってHEK293細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後に、限界希釈クローニングのために細胞を播種し、培地中の1mg/mlのG418を用いて選択した。3週間後に、グルカゴンR及びGLP‐1‐Rを発現する細胞の12個の生き残ったコロニーを採取し、増殖させ、以下で記載するとおりグルカゴンR及びGLP‐1‐R有効性アッセイにおいて試験した。化合物プロファイリングのために、1つのグルカゴン‐R発現クローンと1つのGLP‐1‐R発現クローンを選択した。 Mammalian expression vectors encoding glucagon R or GLP-1-R were transfected into HEK293 cells by standard calcium phosphate transfection methods. Forty-eight hours after transfection, cells were seeded for limiting dilution cloning and selected with 1 mg / ml G418 in media. Three weeks later, 12 surviving colonies of cells expressing glucagon R and GLP-1-R were picked, expanded and tested in the glucagon R and GLP-1-R efficacy assay as described below. One glucagon-R expression clone and one GLP-1-R expression clone were selected for compound profiling.
グルカゴン受容体及びGLP‐1‐受容体有効性アッセイ
0.01%のポリ‐L‐リジンをコートした96‐ウェルのマイクロタイタープレート内に1ウェルあたり40000個の細胞の割合で、ヒト・グルカゴン‐R又はヒトGLP‐1‐Rを発現するHEK293細胞を播種し、100μlの成長培地中での培養において1日成長させる。分析の日に、成長培地を取り除き、細胞を200μlのTyrode緩衝液で1回洗浄した。漸増濃度の試験ペプチド、100μMのIBMX、及び6mMのグルコースを含有する100μlのTyrode緩衝液中、37℃にて15分間、細胞をインキュベートした。25μlの0.5M HClを添加することによって反応を停止させ、氷上にて60分間インキュベートした。cAMP含有量を、Perkin‐Elmer製のFlashPlate(登録商標)cAMPキットを使用して推定した。基準化合物(グルカゴン及びGLP‐1)と比較したEC50と相対的有効性を、コンピューター支援曲線適合法によって推定した。
Glucagon Receptor and GLP-1-Receptor Efficacy Assay Human Glucagon- at a rate of 40,000 cells per well in a 96-well microtiter plate coated with 0.01% poly-L-lysine HEK293 cells expressing R or human GLP-1-R are seeded and grown for 1 day in culture in 100 μl growth medium. On the day of analysis, the growth medium was removed and the cells were washed once with 200 μl Tyrode buffer. Cells were incubated for 15 minutes at 37 ° C. in 100 μl Tyrode buffer containing increasing concentrations of test peptide, 100 μM IBMX, and 6 mM glucose. The reaction was stopped by adding 25 μl of 0.5 M HCl and incubated on ice for 60 minutes. cAMP content was estimated using the FlashPlate® cAMP kit from Perkin-Elmer. EC 50 and relative efficacy compared to reference compounds (glucagon and GLP-1) were estimated by computer-aided curve fitting.
初代ラット脂肪細胞における脂肪分解
脂肪分解に対するグルカゴン類似体の効果を、ラット脂肪細胞の初代培養において評価した。脂肪細胞を、健常な若年成人Sprague-Dawleyラットから摘出した副睾丸脂肪から単離した。脂肪塊を、細かく刻み、4%BSA(KRB‐BSA)含有クレブス‐リンゲル緩衝液中のコラゲナーゼ(1mg/ml)と一緒に37℃にて60分間インキュベート及び振盪(220rpm)した。懸濁液を、ナイロン・フイルター(160μmのポアサイズ)を通して濾過し、そして濾液を200xgにて3分間遠心分離した。脂肪細胞の上部浮動層の下の下部媒質を、毛細管ピペットで取り除いた。脂肪細胞を、再懸濁と遠心分離によってKRB‐BSA緩衝液中で3回洗浄した。脂肪細胞を、KRB‐BSA中に再懸濁し、混合し、インキュベートし、そして96‐ウェルプレート(50000細胞/ウェル)内で1mlの全容積中、試験化合物と一緒に37℃にて60分間振盪した。プレートを、インキュベーション後少なくとも10分間氷上に置き、続いて200xgにて3分間遠心分離した。脂肪細胞層下の緩衝液300μlを、96‐ウェルプレート内に回収した。この過程をもう2回繰り返し、そして各培養物から3回分の抽出物を回収し、それを一緒に貯留した。脂肪細胞培養物における脂肪分解によって形成したグリセロールを、脂肪細胞抽出のアリコート(25μl)に遊離グリセロール試薬(200μl)を加え、室温にて15分間インキュベートし、そして540nmにて吸光度を計測するることによって計測した。
Lipolysis in primary rat adipocytes The effect of glucagon analogs on lipolysis was evaluated in primary cultures of rat adipocytes. Adipocytes were isolated from epididymal fat isolated from healthy young adult Sprague-Dawley rats. Fat mass was minced and incubated with collagenase (1 mg / ml) in Krebs-Ringer buffer containing 4% BSA (KRB-BSA) for 60 minutes at 37 ° C. and shaken (220 rpm). The suspension was filtered through a nylon filter (160 μm pore size) and the filtrate was centrifuged at 200 × g for 3 minutes. The lower medium below the upper floating layer of fat cells was removed with a capillary pipette. Adipocytes were washed 3 times in KRB-BSA buffer by resuspension and centrifugation. Adipocytes are resuspended in KRB-BSA, mixed, incubated and shaken with test compound for 60 minutes at 37 ° C. in a total volume of 1 ml in a 96-well plate (50000 cells / well) did. Plates were placed on ice for at least 10 minutes after incubation followed by centrifugation at 200 xg for 3 minutes. 300 μl of buffer below the fat cell layer was collected in a 96-well plate. This process was repeated two more times and three extracts from each culture were collected and pooled together. Glycerol formed by lipolysis in adipocyte cultures, by adding free glycerol reagent (200 μl) to an aliquot of adipocyte extraction (25 μl), incubating for 15 minutes at room temperature, and measuring absorbance at 540 nm Measured.
db/dbマウスにおける経口グルコース負荷試験(OGTT)
db/dbマウスに、一晩断食させ、そしてビヒクル(PBS)又はZP2653(配列番号4)(PBS中に45nmol/kg)の投与(腹腔内)直前に最初の血液サンプル(空腹時血糖値)を採血した。実験中、動物は断食したままにして、混乱した食餌摂取を予防した。15分後に、経口用量のグルコース(5ml/kg中に1g/kg)を与え、そしてt=30分、t=60分、t=120分、及びt=240分にBGレベルを計測した。
Oral glucose tolerance test (OGTT) in db / db mice
db / db mice are fasted overnight and the first blood sample (fasting blood glucose level) immediately before administration (intraperitoneal) of vehicle (PBS) or ZP2653 (SEQ ID NO: 4) (45 nmol / kg in PBS). Blood was collected. During the experiment, the animals were kept fast to prevent confusing food intake. After 15 minutes, an oral dose of glucose (1 g / kg in 5 ml / kg) was given and BG levels were measured at t = 30 minutes, t = 60 minutes, t = 120 minutes, and t = 240 minutes.
ベースライン(t=0)からの差を、それぞれの時点について計算し、そしてAUC0‐240分の値を決定した。一元配置ANOVA及びDunnetts事後検定によるAUC値の統計的分析を、GraphPad Prismバージョン4を用いて実施した。差はp<0.05の水準で有意であると見なした。 The difference from baseline (t = 0) was calculated for each time point and a value of AUC 0-240 minutes was determined. Statistical analysis of AUC values by one-way ANOVA and Dunnetts post-test was performed using GraphPad Prism version 4. Differences were considered significant at the level of p <0.05.
体重増加及びコレステロールに対するZP2653(配列番号4)を用いた食餌誘発性肥満(DIO)マウスの28日間の処置の効果 Effect of 28-day treatment of diet-induced obese (DIO) mice with ZP2653 (SEQ ID NO: 4) on weight gain and cholesterol
薬物処置の4週間前に、C57Bl/6雄マウス(7週齢)(各群に10〜12匹の動物)に高脂肪食(HFD)を与え、そして2000/0800時にライトのオン/オフを用いてそれらの日夜サイクルを逆転した。薬物投与の開始1週間前に、実験動物を、0.1mlのビヒクルの連日注射(皮下)によって処置に適合させ、週に2回のそれらの計量による取り扱いに順化させた。実験開始前日に、マウスを、同じ位の体重(BW)を持つ群に階層化し、そして翌日に、階層化マウス群を、ZP2653(配列番号4)(500nmol/kg)又はビヒクル(PBS、pH7.4、2.5μl/g BW)で処置した(1日2回;皮下)。普通食を維持した非肥満対象群を、DIO群と同じ処置計画でビヒクルを用いて処置した。体重を毎日記録し、そして研究を通じて、体重補正した用量のペプチドを投与するのに使用した。屠殺前、動物に一晩断食させた。次の朝の頸椎脱臼の直前に眼血液サンプル(0.6mlのEDTA)を得た。血液の血漿サンプルを、市販キットを使用したコレステロール、HDL、及びLDLの分析まで−80℃にて保存した。処置期間を通じた体重増加を、処置開始時のその体重を引き算することによって各動物について計算した。 Four weeks prior to drug treatment, C57B1 / 6 male mice (7 weeks old) (10-12 animals in each group) were fed a high fat diet (HFD) and lights turned on / off at 2000/0800 Used to reverse their day-night cycle. One week before the start of drug administration, experimental animals were adapted to treatment by daily injection (subcutaneous) of 0.1 ml vehicle and acclimatized to their metered handling twice a week. The day before the start of the experiment, the mice were stratified into groups with similar body weight (BW), and the next day the stratified mice group was either ZP2653 (SEQ ID NO: 4) (500 nmol / kg) or vehicle (PBS, pH 7. 4, 2.5 μl / g BW) (twice daily; subcutaneous). A non-obese subject group that maintained a normal diet was treated with vehicle in the same treatment regime as the DIO group. Body weight was recorded daily and used to administer body weight corrected doses of peptide throughout the study. Prior to sacrifice, the animals were fasted overnight. An eye blood sample (0.6 ml EDTA) was obtained immediately before the next morning cervical dislocation. Blood plasma samples were stored at −80 ° C. until analysis for cholesterol, HDL, and LDL using commercially available kits. Weight gain over the treatment period was calculated for each animal by subtracting its weight at the start of treatment.
反復測定のある二元ANOVA及びBonferoni事後検定による処置中の体重増加とコレステロールについてのデータの統計的分析を、GraphPad Prismバージョン4を使用して実施した。差はp<0.05の水準で有意であると見なした。 Statistical analysis of data on weight gain and cholesterol during treatment by two-way ANOVA and Bonferoni post-test with repeated measures was performed using GraphPad Prism version 4. Differences were considered significant at the level of p <0.05.
結果
実施例1:ペプチドの安定性
HClストレス溶液中でのインキュベーションの結果を、表2に示す。類似体とグルカゴンの両方が、90%超の純度の回収率で40℃にて5週間にわたり安定していた。しかしながら、化合物の酸性分解の結果は、グルカゴン類似体が天然グルカゴンに比べて6倍安定していることを示している。 The results of incubation in HCl stress solution are shown in Table 2. Both the analog and glucagon were stable for 5 weeks at 40 ° C. with a recovery of purity greater than 90%. However, the results of acidic degradation of the compounds indicate that the glucagon analog is 6 times more stable than natural glucagon.
実施例2:グルカゴン受容体及びGLP‐1受容体に対する有効性
実施例3:脂肪分解アッセイ
GLP‐1作動薬、エキセンジン‐4は、グルカゴン及びOXMとは対照的に初代脂肪細胞培養物における脂肪分解に対して効果がなかった。ZP2653(配列番号4)は、グルカゴンと同等であり、且つ、OXMの50倍強力であった。ZP2653(配列番号4)を用いたDIOマウスの4週間の処置が脂肪沈着を有意に減少させたという知見は、初代脂肪細胞培養物の脂肪代謝で観察された効果(表4)と一致する。 The GLP-1 agonist, exendin-4, had no effect on lipolysis in primary adipocyte cultures, in contrast to glucagon and OXM. ZP2653 (SEQ ID NO: 4) was equivalent to glucagon and 50 times more potent than OXM. The finding that treatment of DIO mice with ZP2653 (SEQ ID NO: 4) for 4 weeks significantly reduced fat deposition is consistent with the effects observed in fat metabolism in primary adipocyte cultures (Table 4).
実施例4:db/dbマウスにおける経口耐糖能に対する効果
ZP2653(配列番号4)は、糖尿病db/dbマウスにおいてOGTT中に計測された耐糖能を有意に改善した(図1)。ZP2653(配列番号4)(45nmol/kg)は、(濃度曲線下面積(AUC)の減少として計測される)耐糖能を77.1%改善した(図1)。
Example 4: Effect on oral glucose tolerance in db / db mice ZP2653 (SEQ ID NO: 4) significantly improved glucose tolerance measured during OGTT in diabetic db / db mice (Figure 1). ZP2653 (SEQ ID NO: 4) (45 nmol / kg) improved glucose tolerance (measured as a decrease in area under the concentration curve (AUC)) by 77.1% (FIG. 1).
実施例5:食餌誘発性肥満マウスにおける体重増加に対する皮下投与の効果
ZP2653(配列番号4)は、普通食(chow)摂取で観察されたのと同じようなレベルまで体重増加を減少させた(図2)。体重増加は、ビヒクル群に比べて統計的に有意に少なかった。
Example 5: Effect of subcutaneous administration on body weight gain in diet-induced obese mice ZP2653 (SEQ ID NO: 4) reduced body weight gain to a level similar to that observed with chow intake (Figure 2). Weight gain was statistically significantly less than in the vehicle group.
実施例6:LDL及びHDLに対する効果
エキセンジン‐4は非常に強力なGLP‐1R作動薬であるが、GluRに対して効果がなく、また先に記載したラット脂肪細胞の脂肪分解アッセイにおいても効果がなかった。それは、db/dbマウスの耐糖能と正常なマウスの食物摂取には強力な効果があったが、総コレステロール、HDL、LDLの血中濃度又はHDL/LDL比に対して効果がなかった(図3、4)。
Example 6: Effect on LDL and HDL Exendin-4 is a very potent GLP-1R agonist but has no effect on GluR and is also effective in the rat adipocyte lipolysis assay described above. There wasn't. It had a strong effect on glucose tolerance in db / db mice and food intake in normal mice, but no effect on blood levels of total cholesterol, HDL, LDL or HDL / LDL ratio (Fig. 3, 4).
対照的に、ZP2653(配列番号4)を用いたDIOマウスの4週間の処置もまた、ビヒクルと比較してLDLコレステロールの血中濃度(P=0.019)並びにHDL/LDL比(P=0.026)に対して有意な効果があった(図3、4)。 In contrast, 4-week treatment of DIO mice with ZP2653 (SEQ ID NO: 4) also resulted in LDL cholesterol blood levels (P = 0.199) as well as HDL / LDL ratio (P = 0) compared to vehicle. .026) had a significant effect (FIGS. 3 and 4).
Claims (8)
{式中、
R1が、H、C1‐4アルキル、アセチル、ホルミル、ベンゾイル又はトリフルオロアセチルであり;
R2が、OH又はNH2であり;
Xが、以下の式(I):
His‐Ser‐Gln‐Gly‐Thr‐Phe‐Thr‐Ser‐Asp‐Tyr‐Ser‐Leu‐Tyr‐Leu‐Asp‐Ser‐Arg‐Arg‐Ala‐Lys‐Asp‐Phe‐Ile‐Glu‐Trp‐Leu‐Glu‐Ser‐Ala
を有するペプチドであるか;又は式(I)と異なる場合には、以下の:
20位の残基がGln、Gluから選択され;
23位の残基がValであり;
24位の残基がGln、Lysから選択される;
のうちの1又はそれ以上の箇所によって式(I)と異なっているペプチドであり;そして
Zが、存在しないか、又は4、5、6又は7個の連続したリジン残基である。}を有する化合物、又は医薬的に許容し得るその塩(但し、該化合物は、
H−HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWLESA−NH 2 ;
H−HSQGTFTSDYSLYLDSRRAQDFIEWLESA−NH 2 ;
H−HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFVEWLESA−NH 2 ;
H−HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIQWLESA−NH 2 ;
H−HSQGTFTSDYSLYLDSRRAQDFVQWLESA−NH 2 ;又は
H−HSQGTFTSDYSLYLDSRRAEDFIKWLESA−NH 2
でない)。 Formula R 1 -XZR 2
{Where
R 1 is H, C 1-4 alkyl, acetyl, formyl, benzoyl or trifluoroacetyl;
R 2 is OH or NH 2 ;
X is the following formula (I):
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Leu-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Alag-Ala-Lys-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp- Leu-Glu-Ser-Ala
Or, if different from formula (I), the following :
The residue at position 20 is selected from Gln, Glu;
23 the residue at position there in the V al;
Residue at position 24 is selected from Gln, Lys;
A peptide that differs from formula (I) by one or more of the following; and Z is absent or is 4, 5, 6 or 7 consecutive lysine residues. Or a pharmaceutically acceptable salt thereof, provided that the compound is
H-HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWLESA-NH 2 ;
H-HSQGTFTSDYSLYLDSRRAQDFIEWLESA-NH 2 ;
H-HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFVEWLESA-NH 2 ;
H-HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIQWLESA-NH 2 ;
H-HSQGTFTSDYSLYLDSRRAQDFVQWLESA-NH 2 ; or
H-HSQGTFTSDYSLYLDSRRAEDFIKWLESA-NH 2
Not)
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWLESA(配列番号4);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAQDFIEWLESA(配列番号5);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFVEWLESA(配列番号6);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFlQWLESA(配列番号7);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAQDFVQWLESA(配列番号10);又は
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAEDFIKWLESA(配列番号11)
を有する、請求項1に記載の化合物。 Said X is the following sequence:
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWLESA (SEQ ID NO: 4);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAQDFIEWLESA (SEQ ID NO: 5);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFVEWLESA (SEQ ID NO: 6);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFlQWLESA (SEQ ID NO: 7);
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAQDFVQWLESA (SEQ ID NO: 10); or HSQGTFTSDYSLYLDSRRAEDFIKWLESA (SEQ ID NO: 11 )
The a compound according to claim 1.
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