JP5911823B2 - 良性の家族性新生児痙攣(bfnc)および他の癲癇において突然変異されたkcnq2およびkcnq3−カリウムチャンネル遺伝子 - Google Patents
良性の家族性新生児痙攣(bfnc)および他の癲癇において突然変異されたkcnq2およびkcnq3−カリウムチャンネル遺伝子 Download PDFInfo
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Description
本出願は、それに対して優先権を主張し、引用して本明細書に一体化させる1997年10月24日出願のシリアルナンバー60/063,147に関する。
本発明の遺伝子ならびに関連遺伝子の命名法は時間とともに変化してきた。ヒトからの本発明の遺伝子の二つは今日ではKCNQ2およびKCNQ3と言われる。これらは元来は、おのおの、KVEBN1およびKVEBN2と命名されてきた。二つの組の名称は同等であり相互交換的に使用することができるが、認められている命名法は今日ではKCNQ2およびKCNQ3であり、これらの名称を本明細書中で用いる。また、関連する遺伝子KCNQ1は元来は文献中ではKVLQT1と呼ばれていたが、再度、認められている名称が今日ではKCNQ1であって、この名称を本明細書中で用いる。
発明の背景を明らかにし、実施に関連するさらなる詳細を提供するために用いられる刊行物および他の資料は引用して本明細書に一体化させ、おのおの、便宜のために添付した引用のリストにグループ分けされる。
配列番号:1は、KCNQ2についてのcDNA配列である。
配列番号:2は、KCNQ2についてのアミノ酸配列である。
配列番号:3は、nKQT1についてのアミノ酸配列である。
配列番号:4は、KCNQIについてのアミノ酸配列である。
配列番号:5は、KCNQ2のアミノ酸544をコードする2つのエキソンを中断するイントロンの3’末端のイントロン/エキソン接合におけるヌクレオチド配列である。
配列番号:6は、KCNQ3についてのcDNA配列である。
配列番号:7は、KCNQ3についてのアミノ酸配列である。
配列番号:8−9は、体細胞ハイブリッドパネル遺伝子型タイプ分けで用いられるプライマーである(実施例7)。
配列番号:10−11は、染色体8照射ハイブリッドパネルを遺伝子型に分けるプライマーである(実施例8)。
配列番号:12−17は、全長cDNAを得るためにRACEを実行するのに使用されるプライマーである(実施例9)。
配列番号:18−19は、KCNQ3についてのSSCP変異体を同定したPCR断片を調製するのに使用されるプライマーである。
配列番号:20−21は、2つの核酸の間の%相同性の計算を示すための仮説的核酸配列である。
配列番号:22−53は、KCNQ2の一部を増幅するためのプライマーである。
配列番号:54−87は、KCNQ3の一部を増幅するためのプライマーである。
配列番号:89は、配列番号:88によってコードされる部分的マウスKCNQ2である。
配列番号:90は、マウスKCNQ3である。
配列番号:91は、配列番号:90によってコードされるマウスKCNQ3である。
配列番号:92は、KCNQ3で見出される別のエキソンである。
配列番号:93−94は、ヒトKCNQ3の5’末端を増幅するためのマウス配列をベースとするためのプライマ−である。
配列番号:95は、ヌクレオチド2736後にGGGCC挿入を持つ突然変異したヒトKCNQ2である。
配列番号:96は、配列番号:95によってコードされる突然変異したヒトKCNQ2である。
配列番号:97−99は、KCNQ2の一部を増幅するためのプライマーである。
配列番号:100−114は、KCNQ2についてのイントロン/エキソン配列である(図7A−O)。
配列番号:115−129は、KCNQ3についてのイントロン/エキソン配列である(図8A−O)。
1)一本鎖立体配座分析(SSCP)(Oritaら、1989);2)変性グラジエントゲル電気泳動(DGGE)(Wartellら、1990;Sheffieldら、1989);3)RNase保護アッセイ(Finkelsteinら、1990;Kinszlerら、1991);4)対立遺伝子−特異的オリゴヌクレオチド(ASO)(Connerら、1983);5)E.coli mutS蛋白質のごとき、ヌクレオチドミスマッチを認識する蛋白質の使用(Modrich、1991);および6)対立遺伝子−特異的PCR(RuanoおよびKidd、1989)。対立遺伝子−特異的PCRでは、それらの3’末端において特定のKCNQ2またはKCNQ3突然変異にハイブリダイズするプライマーを用いる。特定の突然変異が存在しなければ、増幅産物は観察されない。欧州特許出願公開番号第0332435号およびNewtonら、1989に開示されているごとくAmplification Refractary Mutation System (ARMS)を用いることができる。クローニング、配列決定および増幅によって遺伝子の挿入および欠失を検出することもできる。加えて、遺伝子または周囲のマーカー遺伝子用の制限断片長多形(RFLP)プローブを用いて、対立遺伝子の改変または多形断片における挿入のスコア取りをすることができる。かかる方法は、特に、その個体で見出される突然変異の存在につき、罹患個体の親族をスクリーニングするのに有用である。当該分野で公知の挿入および欠失を検出するためには他の技術を用いることができる。
また、突然変異体KCNQ2またはKCNQ3遺伝子または遺伝子産物は、血清、便、尿および唾液、痰のごとき他のヒト身体試料で検出することもできる。組織中の突然変異体遺伝子または遺伝子産物の検出につき前記した同一の技術を他の身体試料に適用することができる。かかる身体試料をスクリーニングするこによって、単純な初期診断をBFNC、ローランド癲癇、JMEにつき達成することができる。
本発明は以下の定義を使用する。
「ポリヌクレオチドの増幅」はポリメラーゼ鎖反応(PCR)、リガーゼ増幅(またはリガーゼ鎖反応、LCR)およびQ−ベータレプリカ−ゼの使用に基づく増幅方法のごとき方法を使用する。また、ストランド置換増幅(SDA)、好熱性SDAおよび核酸配列ベースの増幅(3SRまたはNASBA)が有用である。これらの方法はよく知られており、当該分野で広く実施されている。たとえば、米国特許第4683195号および第4683202号およびInnisら、1990(PCRについて);WuおよびWallace、1989(LCRについて);米国特許第5270184号および第5455166号およびWalkerら、1992(SDAについて);Spargoら、1996(好熱性SDAについて)および米国特許第5409818号、Fahyら1991およびCompton、1991(3SRおよびNASBAについて)参照。PCRを実施するための試薬およびハードウェアは商業的に入手可能である。KCNQ2またはKCNQ3領域からの配列を増幅するのに有用なプライマーは、好ましくは、KCNQ2またはKCNQ3領域あるいはその中の標的領域に近接してそれをはさむ領域中の配列に相補的であり、それに特異的にハイブリダイズする。増幅によって生成したKCNQ2またはKCNQ3配列は直接的に配列決定することができる。別法としてしかしながらあまり望ましくはないが、増幅された配列は配列分析に先立ってクローン化することができる。酵素的に増幅されたゲノムセグメントの直接的クローニングおよび配列分析のための方法は、Scharfら、1986によって記載されている。
「KCNQ3対立遺伝子」とは、KCNQ3遺伝子座の正常対立遺伝子ならびにBFNCおよび/またはJMEを引き起こす変異を担うKCNQ3の対立遺伝子を言う。
「作動可能に連結した」とは、そのように記載されている構成要素がその意図したように機能する相互関係にある近接位置を言う。例えば、プロモーターが、その転写または発現に影響するならば、該プロモーターはコーディング配列に作動可能に連結している。
融合蛋白質は、典型的には、後記するごとくいずれかの組換え核酸方法によって作成されるか、あるいは化学的に合成することができる。ポリペプチドの合成の技術は、例えば、Merrifield、1963に記載されている。
「組換え核酸」は天然に生じる、または配列の2つの分離されたセグメントの人工的組み合わせによって作成された核酸である。この人工的組み合わせは、しばしば、化学的合成手段によって、あるいは核酸の単離されたセグメントの人工的操作によって、たとえば遺伝子工学技術によって達成される。それは、典型的には配列認識部位を導入または除去しつつ、通常は同一または保存されたアミノ酸をコードする冗長なコドンで置き換えてなされる。あるいは、それは所望の機能の核酸セグメントを連結して機能の所望の組み合わせを生じさせて行われる。
「実質的相同性または同様性」。核酸またはその断片は、もし他の核酸(またはその相補的ストランド)と(適当なヌクレオチド挿入または欠失をもって)最適に整列させた場合に、少なくとも約60%のヌクレオチド塩基、通常は少なくとも約70%、より通常には少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約90%、より好ましくは少なくとも約95−98%のヌクレオチド塩基におけるヌクレオチド配列同一性があれば、もう1つのものに対して「実質的に相同」(「または実質的に同様」)である。
Matrix−0 BLOSUM62
マッチ−0または1(1)を概観
ミスマッチ−0、−1、−2または−3(−2)のペナルティー
オープンギャップペナルティー−0、1、2、3、4または5(5)
伸長ギャップペナルティー−0または1(1)
Gap x_dropoff−0または50(50)
予想−10
「実質的相同性」または「実質的同一性」なる用語は、ポリペプチドに言及する場合、問題とするポリペプチドまたは蛋白質が天然に生じる蛋白質またはその一部と少なくとも約30%同一性、通常は少なくとも70%同一性、より通常には少なくとも約80%同一性、好ましくは少なくとも約90%同一性、より好ましくは少なくとも約95%同一性を呈することを示す。
本発明の実施は、特記しない限り、化学の通常の技術、分子生物学、微生物学、組換えDNA、遺伝学および免疫学を使用する。例えば、Maniatisら、1982;Sambrookら、1989;Ausubelら、1992、Glover、1985;Anand、1992;GuthrieおよびFink、1991参照。ヒト染色体1のマッピングを含めた、ヒト遺伝子マッピングのための技術および材料についての一般的記載は、例えば、WhiteおよびLalouel、1988に提供される。
本発明の大量のポリヌクレオチドは、適当な宿主細胞中での複製によって生産することができる。所望の断片につきコードする天然または合成ポリヌクレオチド断片は、組換えポリヌクレオチド構築体、通常は、原核細胞または真核細胞に導入し、そこで複製できるDNA構築体に組み込まれる。通常、ポリヌクレオチド構築体は、酵母または細菌のごとき単細胞宿主中での複製に適しているが、培養された哺乳動物もしくは植物または他の真核生物細胞系への(ゲノム内に組み込まれまたは組み込まれることのない)導入を意図することができる。本発明の方法によって生産された核酸の精製は、例えば、Sambrookら、1989またはAusubelら、1992に記載されている。
発現およびクローニングベクターは選択マーカー、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要な蛋白質をコードする遺伝子を含有するであろう。この遺伝子の存在は該インサートを発現する宿主細胞のみの増殖を保証する。典型的な選択遺伝子は、a)抗生物質または他の毒性物質、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート等に対する耐性を付与する、b)栄養要求性欠乏を補足する、またはc)複雑な倍地から得ることができない非常に重要な栄養素を供給する蛋白質をコードする。例えば、Bacilli用のD−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子。適当な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存し、異なる宿主用の適当なマーカーは当該分野でよく知られている。
本明細書中で開示されたKCNQ2またはKCNQ3遺伝子配列に基づくプローブおよびプライマーを用いて、他の種における相同KCNQ2またはKCNQ3遺伝子配列および蛋白質を同定する。これらの遺伝子配列および蛋白質は、それらが単離された種について、診断/予後後、治療および薬物スクリーニング方法で用いられる。
本発明は種々の薬物スクリーニング技術のうちのいずれかにおいてKCNQ2またはKCNQ3ポリペプチドまたはその結合断片を用いることによって化合物をスクリーニングするのに特に有用である。
かかるテストで使用されるKCNQ2またはKCNQ3ポリペプチドまたは断片は、溶液中で遊離している、固体支持体に付着されている、または細胞表面に保持されているのいずれかであってよい。薬物スクリーニングの1つの方法は、好ましくは競合結合アッセイにおいてポリペプチドまたは断片を発現する組換えポリヌクレオチドで安定に形質転換された真核生物または原核生物宿主細胞を利用する。生存形態または固定された形態いずれかであるかかる細胞は標準的な結合アッセイで使用することができる。例えば、KCNQ2またはKCNQ3ポリペプチドまたは断片およびテストすべき剤の間の複合体の形成につき測定し、あるいはKCNQ2またはKCNQ3ポリペプチドまたは断片および公知のリガンドの間の複合体の形成がテストすべき剤によって干渉される程度を調べることができる。
これらの方法によると、以下のアッセイは薬物候補につきスクリーニングするのに使用できるアッセイの例である。
また、本発明のポリペプチドは、組み合わせライブラリー技術の結果として、開発された化合物をスクリーニングするのに使用することもできる。組み合わせライブラリー技術は、ポリペプチドの活性を変調する能力につき、潜在的な莫大な数の異なる物質をテストする効果的な方法を提供する。かかるライブラリーおよびその使用は当該分野で公知である。ペプチドライブラリーの使用が好ましい。例えば、WO97/02048参照。
公知の医薬上活性な化合物に対するミメティックスの設計は、「リード」化合物に基づく医薬品の開発に対する公知のアプローチである。これは、活性化合物が合成するのに困難であるかまたは費用がかかる場合、あるいは投与の特定の方法に適しない場合、例えば、純粋なペプチドは胃腸管中でプロテアーゼによって迅速に分解される傾向があるので、それらが経口組成物用には不適当な活性剤である場合望ましいであろう。ミメティック設計、合成およびテストは、一般的には、標的特性につき使用に多数の分子をランダムにスクリーニングするのを回避するのに使用される。
一旦ファルマコフォアが見出されると、ある範囲の源からのデータ、たとえば、分光学技術、X−線回析データおよびNMRを用い、その物理的特性、例えば、立体化学、結合、サイズおよび/または電荷に従ってその構造を作成する。コンピュータ解析、同様性マッピング(これは原子間の結合よりもむしろファルマコフォアの電荷および/または容量を作成する)および他の技術はこの作成プロセスで用いることができる。
BFNC、ローランド癲癇またはJMEが個体の病気素因となるKCNQ2またはKCNQ3対立遺伝子の存在を検出するために、血液のごとき生物学的試料を調製し、KCNQ2またはKCNQ3の罹患性対立遺伝子の存在または不存在につき分析する。BFNC、ローランド癲癇またはJMEの存在につき検出するために、あるいは予後インディケータとしては、生物学的試料を調製し、KCNQ2またはKCNQ3の突然変異体対立遺伝子の存在または不存在につき分析する。これらのテストの結果および解釈された情報をテストされた個体へ知らせるためにヘルスケアー供給者に戻される。そのような診断は診断研究所によって行うことができ、あるいは、診断キットを製造し、ヘルスケアー供給者または自己診断のために個人的に個人に販売される。
今日使用される最もポピュラーな方法は標的増幅である。ここに、標的核酸配列は、ポリメラーゼで増幅する。ポリメラーゼ−駆動増幅を用いる1つの特に好ましい方法はポリメラーゼ鎖反応(PCR)である。ポリメラーゼ鎖反応および他のポリメラーゼ−駆動増幅アッセイは、ポリメラーゼ−駆動増幅サイクルの使用を介してコピー数の100万倍増加を超えて達成することができる。一旦増幅されれば、得られた核酸は配列決定し、またはDNAプローブ用の基質として使用することができる。
BFNC、ローランド癲癇またはJMEの存在は、野生型KCNQ2またはKCNQ3ポリペプチドの改変に基づいて検出することもできる。かかる改変は通常の技術に従い配列分析によって測定することができる。より好ましくは、(ポリクローナルまたはモノクローナル)抗体を用いてKCNQ2またはKCNQ3ペプチドの相違またはその不存在を検出する。抗体を生起させそれを精製する技術は当該分野でよく知られており、いずれかのかかる技術を選択して、本発明で主張する調製を達成することができる。本発明の好ましい具体例において、抗体は、溶液からKCNQ2またはKCNQ3蛋白質を免疫沈降させ、ならびにポリアクリルアミドゲルのウエスタンまたはイムノブロット上のこれらの蛋白質と反応する。もう1つの好ましい具体例において、抗体は、免疫組織化技術を用いて、パラフィンまたは凍結された組織セクション中のKCNQ2またはKCNQ3蛋白質を検出するであろう。
合理的薬物デザインの目標は、注目する生物学的に活性なポリペプチドの構造的アナログまたはそれらが相互反応する小分子(たとえば、アゴニスト、アンタゴニスト、インヒビター)を生産して、例えば、ポリペプチドのより活性または安定な形態である、または例えばイン・ビボでポリペプチドの機能を増強させまたはそれに干渉する薬物を作成することである。例えば、Hodgson、1991参照。1つのアプローチにおいて、X線結晶解析によって、コンピュータモデリングによって、または最も典型的にはアプローチの組み合わせによって、注目する蛋白質(例えば、KCNQ2またはKCNQ3ポリペプチド)の3次元構造をまず決定する。それほど頻繁ではないが、ポリペプチドの構造に関して有用な情報は、相同蛋白質の構造に基づくモデリングによって獲得することができる。合理的薬物デザインの例はHIVプロテアーゼ阻害剤の開発である(Ericksonら、1990)。加えて、ペプチド(例えば、KCNQ2またはKCNQ3ポリペプチド)は、アラニンスキャンによって分析される(Wells、1991)。この技術においては、アミノ酸残基がAlaによって置き換えられ、ペプチドの活性に対するその効果が測定される。ペプチドのアミノ酸残基の各々をこのように分析して、ペプチドの重要な領域を決定する。
本発明によると、各々、突然変異体KCNQ2またはKCNQ3対立遺伝子を担う細胞に対して野生型KCNQ2またはKCNQ3機能を供給する方法も提供される。かかる機能の提供は受容体細胞の正常な機能を可能とするはずである。野生型遺伝子または該遺伝子の一部を、該遺伝子が染色体外にとどまるようにベクター中にて細胞に導入することができる。かかる状況において、遺伝子は染色体外位置から細胞によって発現されるであろう。より好ましいものは、野生型遺伝子またはその一部が、それが細胞中に存在する内因性突然変異体遺伝子と組み換えられるように、突然変異体細胞に導入される状況である。かかる組換えは、遺伝子突然変異の修正の結果となる二重組換え事象を要する。組換えおよび染色体外維持のための遺伝子の導入用ベクターは当該分野で知られており、いずれの適当なベクターも使用することができる。エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈殿およびウイルス導入のごときDNAを細胞に導入する方法は当該分野で公知であり、選択方法は実行者の技量の範囲内である。
遺伝子治療は、例えば、Friedman(1991)またはCulver(1996)によって記載された一般的に認められた方法によって行われる。患者からの細胞をまず前記した診断方法によって分析して細胞中のKCNQ2およびまたはKCNQ3ポリペプチドの生産を確実なものとする。発現制御エレメントに連結したKCNQ2またはKCNQ3遺伝子のコピーを含有し、細胞の内部で複製することができるウイルスまたはプラスミドベクター(さらなる詳細は後記参照)を調製する。該ベクターは細胞の内部で複製することができる。あるいは、該ベクターは複製欠陥であってもよく、遺伝子治療で使用されるヘルパー細胞中で複製される。米国特許第5252479号およびPCT公開出願WO93/07282および米国特許第5691198号;第5747469号;第5436146号および第5753500号に開示されているごとき適当なベクターが公知である。ついで、ベクターを患者に注入する。もしトランスフェクトされた遺伝子が各標的細胞のゲノムに永久的に組み込まれなければ、当該治療は周期的に反復される必要があろう。
KCNQ2またはKCNQ3活性を有するペプチドは、各々、突然変異体またはミシングKCNQ2またはKCNQ3対立遺伝子を担う細胞に供給することができる。蛋白質は、例えば、公知の発現ベクターを用い、細菌中でのcDNA配列の発現によって生産することができる。別法として、KCNQ2またはKCNQ3ポリペプチドはKCNQ2−またはKCNQ3−生産哺乳動物細胞から抽出することができる。加えて、合成化学の技術を使用してKCNQ2またはKCNQ3蛋白質を合成することができる。かかる技術のいずれも、KCNQ2またはKCNQ3蛋白質を含む本発明の調製物を提供することができる。該調製物は、他のヒト蛋白質が実質的にない。これは微生物中においてまたはイン・ビトロにおいてかなり容易に達成される。
治療剤をテストするための動物は全動物の突然変異誘発後にまたは生殖系細胞もしくは接合体の処理の後に選択することができる。かかる処理は、通常は、第2の動物種からの突然変異体KCNQ2および/またはKCNQ3対立遺伝子の挿入、ならびに破壊された相同遺伝子の挿入を含む。別法として、動物の内因性KCNQ2またはKCNQ3遺伝子は、通常の技術を用いる挿入もしくは欠失突然変異または他の遺伝子変化によって破壊することができる(Capecchi、1989;ValanciusおよびSmithies、1991:Hastyら、1991;Shinkaiら、1992;Mombaertsら、1992;Philpottら、1992;Snouwaertら、1992;Donehowerら、1992)。テスト物質を動物に投与した後、BFNC、ローランド癲癇またはJMEの存在を評価しなければならない。もし、テスト物質がBFNC、ローランド癲癇またはJMEの出現を予防しまたは抑制するならば、テスト物質はBFNC、ローランド癲癇またはJMEの治療用の候補治療剤であろう。これらの動物モデルは潜在的治療産物のための極端に重要なテストビイクルを提供する。
第2の方法は、正常KCNQ2またはKCNQ3遺伝子と欠陥遺伝子との間の差異の検出を助けるためにRNase Aを使用する。この比較は、プローブとしてKCNQ2またはKCNQ3遺伝子の小(〜500bp)制限断片を用いる工程で行われる。まず、遺伝子配列をほぼ500bpの断片に切断する制限酵素でKCNQ2またはKCNQ3遺伝子を消化する。これらの断片を電気泳動ゲル上で分離し、該ゲルから精製し、両方の向きにおいて、SP6ベクター(例えば、pSP64またはpSP65)で個々にクローン化する。KCNQ2またはKCNQ3遺伝子断片のインサートを含有するSP6−ベースのプラスミドを、[α−32P]GTPの存在下で、当該分野でよく知られたSP6転写系を用いてイン・ビトロで転写し、該遺伝子の両鎖の放射性標識RNA転写体を生じさせる。
本発明のKCNQ2およびKCNQ3ポリペプチド、抗体、ペプチドおよび核酸は医薬組成物に処方することができ、これは通常の医薬調合技術に従って調製される。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版(1990、Mack Publishing Company、Easton、Pensilvenia州)参照。該組成物は活性剤または活性剤の医薬上許容される塩を含有することができる。これらの組成物は活性物質の1つに加えて、医薬上許容される賦形剤担体、緩衝剤、安定化剤、または当該分野でよく知られた他の物質を含有することができる。かかる物質は非毒性であるべきで、有効成分の効率に干渉すべきではない。投与(例えば、静脈内投与経口投与、鞘内投与、神経弓上投与または非経口投与)で望まれる調製物の形態に依存して、該担体は種々の形態を取ることができる。
これらの剤を直接的に投与する代わりに、それらを標的細胞中にて例えば、前記したごときウイルスベクター中においてまたは、患者中のインプランテーションに設計された米国特許第5550050号および公開されたPCT出願番号WO92/19195、WO94/25503、WO95/01203、WO95/05452、WO96/02286、WO96/02646、WO96/40871、WO96/40959、WO97/12635に記載されているごとき細胞ベースの送達系にて生産することができる。ベクターを治療すべき特異的細胞に標的化することができるか、あるいはそれは標的細胞に特異的な組織である調節エレメントを含有することができる。細胞ベースの送達系は、所望の標的部位において患者の身体に移植するように設計され、活性剤についてのコーディング配列を含有する。あるいは、該剤は処理すべき細胞中で生産された、あるいは該細胞に標的化された活性化剤によって、活性化形態に変換される前駆体にて投与することができる。たとえば、EP425731AおよびWO90/07936参照。
実施例1
サザンブロット分析
5μgのゲノミックDNAをTaq1で切断し、ナイロン膜に移した。フィルターを、ランダム・プライミング(random priming,Stratagene社製)によって標識したD20S24プラスミド・プローブと、PEG hyb(7%のPEG、10%のSDS、50mMのリン酸ナトリウムおよび200μg/mlの全ヒトDNA)中、65℃にて一晩ハイブリダイズさせた。フィルターを2×SSC、室温にて0.1%のSDSで2回、つづいて0.5×SSC、65℃にて0.1%のSDSで1回洗浄した。
蛍光イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション
形質転換リンパ球からの染色体は、30分間のエチジウムブロマイド処理につづくコルセミド中の3時間の処理を用いて調製した。ついで、細胞をペレット化し、低浸透圧溶液(0.75MのKCl)中に20分間再懸濁させ、つづいて4ないし5滴の新たな固定液(3:1のメタノール:酢酸)を滴下した。再度、細胞をペレット化し、ついで注意深くボルテックス攪拌させて固定液中に再懸濁させた。固定液中で3回洗浄した後に、中期細胞(metaphases)を4℃にて保存した。400ngのプローブをビオチンで標識し、標準的なハイブリダイゼーション手法を用いて中期スプレッド細胞(metaphase spreads)のスライドにハイブリダイズさせた。ついで、プローブをアビジン−FITC(Vector社製)で蛍光標識し、ビオチン−標識抗−アビジン、つづいてアビジン−FITCを用いてシグナルを強めた。ついで、染色体をDAPIを用いて対抗染色(counterstain)し、FITC、DAPIおよび三重バンドパス・フィルターのセットを備えたZeiss Axioplan蛍光顕微鏡を用いて視覚化した。Applied Imaging社(Pittburg, PA)製ソフトウェア、プロベビジョン(Probevision)を用いてコンピュータによってイメージをキャプチャーし、Kodak XL 7700カラーイメージプリンター上に写真を印刷した。
KCNQ2の位置決定
大きな血縁における連鎖解析により、BFNCの原因となる遺伝子が、マーカーD20S20およびD20S19に近い染色体20q13.3(Leppertら、1989)にマッピングされることが示された。最初の報告の後に、2のセンターが、EBN1(1型良性新生児癲癇)遺伝子座と呼ばれる第20染色体上の同じ2の遺伝マーカーに対するBFNCの連鎖を確認した(Rayanら、1991;Malafosseら、1992)。より遠位のマーカーD20S24は、第20染色体連鎖家族においてBFNC表現型と完全な共分離を示した。BFNC遺伝子座に対する遠位のフランキング・マーカーを発見することは成功しなかった。恐らくは、それがテロメアに近接しているためである。このテロメア領域は、物理的遠位と比較した場合にマーカー間の高い組換え頻度によって特徴付けられる(Steinleinら、1992)。事実、Steinleinらは、3つのマーカーD20S19、D20S20およびD20S24が同一の450MbのMluI制限フラグメント上に含まれることを示している(Steinleinら、1992)。
影響された個人における1の染色体において12kbのD20S24プローブが欠失していた一方で、80kbのサイズで、共にほぼ130kbに広がる重複するP1クローンが陽性のFISHシグナルを示し、これは欠失が130kbよりも小さいことを示している(図2)。
KCNQ2クローンの単離および特徴付け
実施例3におけるものと同一のプローブを用いて、胎児脳cDNAライブラリーをスクリーニングすることによって欠失の領域中のcDNAを同定した。単離したcDNAのうちの3は、KCNQ1、長時間QT症候群(Long QT syndrome)およびジャーヴィル・ランゲ・ニールセン心臓音響症候群(Jervell and Lange-Nielsen cardiocauditory syndrome)の原因となる第11染色体のカリウムチャンネル遺伝子に対して有意なホモロジーを示した(Wangら、1996;Altschulら、1990;Neyroudら、1997)。
ノザンブロット分析
KCNQ2のcDNAは脳から作製したノザンブロット上のほぼ1.5、3.8および9.5kbのサイズの転写物にハイブリサイズした。胎児および成人の脳の多重組織ノザン(Multiple Tissue Notherns,Clontech社製)を、KCNQ2の貫膜ドメインS1ないしS6を含有するRACE生成物で釣上げた。1.5および9.5kbの転写物は、成人および胎児の脳の双方で発現しているようであった。3.8kbの転写物は、成人の脳の選択した領域、詳細には側頭葉および被殻において発現していた。
KCNQ2の突然変異分析
KCNQ2の突然変異分析は、我々の12の各BFNC家族からの1の影響された個人に対して行った。S1ないしS6のコード領域およびKCNQ2の3’末端の保存領域を、イントロン内のプライマーを用いるPCRによって増幅させ、4℃にて流す20%のTBEゲルを用いたSSCP(Novex社製)によって分析した。エキソン−イントロン境界は、ゲノミックP1クローンに対するエキソン−エキソンPCRによって得た生成物を配列決定することによってか、あるいは非プロセシング化転写物を含むRACE生成物から直接同定した。SSCP上で見られた変異型を示すPCR産物をクローン化し配列決定するか、あるいはM13リバース・プライマーおよびM13ユニバーサル−テイル・プライマーを用いて再増幅させ、色素−プライマー化学を用いてABI373または377上で直接配列決定した。
体細胞ハイブリッド・パネル遺伝子型決定
非常に相同性の高い貫膜タンパク質ドメイン中のKCNQ2とKCNQ3との間のイントロン−エキソン境界の推定保存を利用して、利用可能なEST配列からイントロンを横切るプライマー対(プライマーA:5’−TTCCTGATTGTCCTGGGGTGCT−3’(配列番号:8)、プライマーB:5'−TTCATCTTTGGAGCCGAGTTTGC−3’(配列番号:9))を設計した。増幅させたフラグメントはヒト(1.8kb)中ならびにげっ歯類(800bp)ゲノミックDNA中のイントロンを含む。このプライマーを用いて、コリエル(Coriell)パネルを増幅させた。反応は、1.5mMのMgCl2緩衝液中の50ngの鋳型DNAおよび1単位のTaq DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer社製)、10pmolの各プライマー、3nmolの各デオキシリボヌクレオチドを用いて25μL容積で行った。サイクル条件は94℃にて4分間、ついで:94℃にて30秒間の変性、58℃にて30秒間のアニーリングおよび72℃にて1.5分間の伸長の30サイクルにつづく72℃にて10分間の最終伸長であった。PCR産物は1.5%アガロースゲル中で電気泳動した。
第8染色体放射ハイブリッドパネル
HSA8放射ハイブリッドパネル(Lewisら、1995)を、特異的ヒト・イントロン性プライマー(プライマーD:5’−TCCATGTGGTACTCCATGTCTGAA−3’(配列番号:10)、プライマーE:5’−GCACGTCACATTGGGGATGTCAT−3’(配列番号:11))を用いて遺伝子型決定した。PCR産物の長さは190bpであった。反応は、1.5mMのMgCl2緩衝液中の100ngの鋳型DNAおよび1単位のTaqポリメラーゼ(Perkin Elmer社製)、10pmolの各プライマー、3nmolの各デオキシリボヌクレオチドを用いて25μL容積で行った。サイクル条件は、94℃にて4分間、ついで:94℃にて30秒間の変性、62℃にて30秒間のアニーリングおよび72℃にて30秒間の伸長の30サイクルにつづく72℃にて10分間の最終伸長であった。PCR産物は2%アガロースゲル中で電気泳動した。遺伝子型決定データは、RHMAP V2.01プログラム(Boehnkeら、1991)によって解析した。
完全長cDNA
完全長KCNQ3 cDNAを同定するために、利用可能なEST配列からのプライマーを用いてアダプター−連結胎児および成人脳cDNA(Clontech社製)上で5'および3'RACEを行った。RACE実験に用いたプライマーを表3に掲載する。PCR産物をサブクローン化(T/A cloningR Kit,Invitrogen社製)し、双方の鎖をABI377機器上で配列決定した。
ゲノム系統化/イントロン−エキソン境界
BACゲノミックライブラリーを(コリエル・パネルについて記載したごとく)PCRによってスクリーニングし、3の重複するゲノミック・クローンを単離した。ゲノミック・ヒトDNAおよび/またはKCNQ3遺伝子を含むBACゲノミック・クローンに対するエキソン−エキソンPCRによって得た生成物をクローニング(T/A cloningR Kit,Invitrogen社製)し、配列決定(ABI377)することによって、イントロン/エキソン境界を同定した。
SSCP分析ならびに突然変異および多型対立遺伝子の特徴付け
KCNQ3のコード領域の60%を、利用可能な場合にはイントロン内のプライマーを用いるPCRによって増幅させ、Novex ThermoflowTMプロトコール(Novex社製,San Diego,CA)に記載されているごとく4℃にて流す20%TBEゲルを用いるSSCP(Novex社製)によって分析した。SSCP多型を示しているPCR産物をクローン化(T/A cloningR Kit,Invitrogen社製)し、9のクローンを色素−プライマー化学を用いるABI373または377上で配列決定し、SequencherTM3.0プログラムを用いて解析した。
KCNQ3遺伝子の特徴付け
KQT−様ファミリーは、電圧ゲートカリウムチャンネルの最近特徴付けされたファミリーである(Weiら、1996)。現在まで、第20染色体BFNC疾患において突然変異した遺伝子である(本開示で記載する)KCNQ2と、ならびに長時間QT症候群およびジャーヴィル・ランゲ・ニールセン心臓音響症候群の原因となる第11染色体遺伝子(Neyroudら、1997)であるKCNQ1とのみがこのファミリーに属することが知られている。おそらくは他のタイプのIGEに含まれるそのファミリーの新たなメンバーを同定するために、tBLASTx(Altschulら、1990)検索を、発現配列タグ(EST)データベースに対してKCNQ2完全長cDNAを用いて開始した。KCNQ2と有意なホモロジーを示した5のヒトESTクローン(クローンID:1−362079、2−222324、3−363215、4−38822、5−45636;Hillierら、未公開データ)を同定した。興味深いことには、これらのクローンは2の異なるcDNAライブラリー:網膜(1−3)および幼児脳(4−5)(Soaresら、1994)から得られ、2の非重複コンティグ(1−3)および(4−5)に系統化することができた。ここに、2のコンティグが同一の遺伝子、KCNQ3に属することが示された。
KCNQ2またはKCNQ3に対するポリクローナル抗体の生成
KCNQ2またはKCNQ3コード配列のセグメントを、イー・コリ(E.coli)中で融合タンパク質として発現させた。過剰発現させたタンパク質をゲル溶出によって精製し、これを用いて、HarlowおよびLane、1988によって記載されている手法と同様の手法を用いてウサギおよびマウスを免疫化した。この手法は、種々の他のタンパク質に対するAbを生成することが示されている(例えば、Kraemerら、1993を参照されたし)。
KCNQ2またはKCNQ3に対して特異的なモノクローナル抗体の生成
モノクローナル抗体は以下のプロトコールに従って生成した。よく知られているごとくグルタルアルデヒドまたはEDCを用いてスカシガイ・ヘモシアニンにコンジュゲートさせた無傷KCNQ2、無傷KCNQ3、KCNQ2ペプチドまたはKCNQ3ペプチド(野生型または突然変異)を含む免疫原でマウスを免疫化した。
望ましい特異性を有するクローンを広げ、マウス中または中空ファイバー系中の腹水として増殖させて、特徴付けおよびアッセイを進めるのに十分な量の抗体を生成させた。
KCNQ2またはKCNQ3についてのサンドイッチ・アッセイ
モノクローナル抗体は、プレート、チューブ、ビーズまたは粒子のごとき固体表面に結合させた。好ましくは、該抗体は96−ウェルELISAプレートのウェル表面に結合させる。KCNQ2またはKCNQ3ペプチド/タンパク質(野生型または突然変異)を含有する100μLの試料(例えば、血清、尿、組織サイトゾル)を固相抗体に添加した。その試料を室温にて2時間インキュベートした。ついで、試料流体をデカンテーションし、固相を緩衝液で洗浄して結合しなかった物質を除去した。(KCNQ2またはKCNQ3ペプチド/タンパク質上の異なる決定基に対する)100μLの第2モノクローナル抗体を固相に添加した。この抗体を検出分子(例えば、125I、酵素、発蛍光団または発色団)で標識し、第2抗体を有する固相を室温にて2時間インキュベートした。第2抗体をデカンテーションし、固相を緩衝液で洗浄して結合しなかった物質を除去した。
KCNQ2またはKCNQ3 K+チャンネルに作用する薬剤をスクリーニングするためのアッセイ
KCNQ2およびKCNQ3が各々カリウムチャンネルを形成するという知見を用いれば、ここに、これらのチャンネルの一方または双方に作用を有するであろう薬剤をスクリーニングするためのアッセイを考案することが可能である。遺伝子を卵母細胞または哺乳動物細胞にトランスフェクトし、前記のごとく発現させた。トランスフェクションに用いた遺伝子がBFNC、ローランド癲癇またはJMEを引起こす突然変異を含む場合には、野生型遺伝子のみを用いたトランスフェクションと比較して、誘導電流における変化が見られた。薬剤候補をトランスフェクト細胞の浴溶液(bathing solution)に添加して、誘導電流に対する該薬剤候補の効果を試験した。野生型KCNQ2または野生型KCNQ3で同時トランスフェクトした細胞で見られる電流に近いように、誘導電流を変化させる薬剤候補は、BNFC、ローランド癲癇、またはJMEを治療するのに有用である。
突然変異につきKCNQ2の各エキソンをスクリーニングするためのプライマー対
ゲノミックKCNQ2をイントロン/エキソン境界で配列決定し、各エキソンを増幅させるのに有用なプライマー対を開発した。これらのプライマー対を表4に示す。エキソン13および17については、エキソン内のプライマーも利用した。幾つかのエキソン/イントロン配列を図7A−Oに示す。
KCNQ3のイントロン配列およびKCNQ3のエキソンを増幅させるためのプライマー対
KCNQ3に対する完全cDNAを得て配列決定したが、完全なゲノミックDNAはいまだ配列決定されていない。しかしながら、イントロンDNAの多くが配列決定されており、この配列情報を利用して各エキソンを増幅させるのに有用であるプライマー対が開発されている。イントロン/エキソン配列を図8A−Oに示す。当業者であれば図8A−Oに示すイントロン配列を用いて他のプライマーも容易に開発できるが、各エキソンを増幅させるための幾つかの有用なプライマー対を表6に示す。
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Claims (3)
- 突然変異体KCNQ3ポリペプチド配列をコードする配列を含む単離された核酸または該単離された核酸の相補体であって、
該核酸は、配列番号:6のヌクレオチド160−2914により規定されたヌクレオチド配列を含み、さらに、該ヌクレオチド配列のヌクレオチド947のTに対応する突然変異を含む該核酸またはその相補体。 - 突然変異体KCNQ3ポリペプチド配列をコードする配列を含む単離された核酸または該単離された核酸の相補体であって、
該核酸は、配列番号:7のコドン48−872を含むKCNQ3ポリペプチド配列をコードし、さらに、該KCNQ3ポリペプチド配列のコドン310に対応する位置でバリンをコードする該核酸またはその相補体。 - ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で請求項1または2記載の核酸に特異的にハイブリダイズする、突然変異体KCNQ3ポリペプチド配列を検出するための核酸プローブであって、
該ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が、配列番号:6のヌクレオチド160−2914によって規定される対応する野生型KCNQ3核酸配列にハイブリダイズすることを妨げる該核酸プローブ。
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