JP5911683B2 - 顕微鏡および顕微鏡検査法 - Google Patents
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Description
(参考文献)
[1]チェンら(Chen et al.)、Opt.Express 16、18764(2008)
[2]ウォンら(Wong et al.)Appl.Opt.48、3237(2009)
[3]TOF Kamera mit Lock−In pixeln(ピクセル・ロックイン式カメラ):http://www.mesa−imaging.ch/
[4]Gated−Intensifier−Kamera(ゲート付き増感カメラ);たとえばtautec pico star
[5]スエダら(Sueda et al.)Opt.Express 12、3548(2004)
[6]国際特許公開第2009/008838号パンフレット
[7]欧州特許第500717号明細書、「2光子顕微鏡」
[8]エー レリーおよびジェー メルツ(A.Leray and J.Mertz)Opt.Express 14、10565(2006)
加えて、焦点体積からの放射を時間的に変調させるために、有利には、位相だけでなく一般的に場モード切換えを利用することも可能であり、ここでは焦点体積の外では光線が時間的に変調されない。この場合も当該の目的のために高速のモードスイッチについて論じるべきである。
好ましい改善形態は従属請求項の対象である。
(実施形態1)
第1の実施形態では、偏光に依存する位相偏移を様々な空間的領域に、好ましくは対物レンズの瞳に導入する受動要素において位相が形成されることが出発点である。高速の時間的変調を生じさせるために、たとえばEOMまたは別の適切な要素、たとえばネマチック結晶(ただしネマチック結晶は比較的緩慢に応答する)によって、あるいは経路分岐によって異なる偏光を生じ、この経路がAOM/AOTFによって高速に切り換えられる構造体によって、偏光が時間的に操作される。
ここに例として示された受動位相要素は、それぞれ二重屈折結晶の組合せからなる。図示されているのは、分割された半波長板の形の位相板Pと、位相が偏光方向に依存しない、たとえばガラスとして構成された構成要素である。
図1bには、位相板Pの様々な変更形態が示されており、λ/2半体とガラス半体への半体分割がP1に示されており、対向するλ/2四分の一体とガラス四分の一体への四分割がP2に、外側のλ/2リングと内側のガラスコアがP3に、反対に外側のガラスリングと内側のλ/2コアがP4に示されている。
それぞれのλ/2部分の異常軸の向きが矢印により示されている。偏光された光線がこの矢印の方向に平行にこの要素を通過すると、ガラス部分に比べて半波長の位相シフトがλ/2部分内で生じる。一方、その偏光が矢印の方向に垂直に向いていれば、位相遅延は生じない。
プレートPを通る半分の位相変化により、光線はFMMに典型的な場変調を受ける。
図1cは、図1aと同様にEOMと受動位相要素に基づく光学的高速モードスイッチを示す。
従来技術(たとえばチェンら(Chen et al.)[1])とは逆に、この場合はファイバと動作的に接続された受動位相要素を使用することにより、使用されるEOMの電磁的絶縁を行うことができ、このため有利には、EOMの高周波で放射される電磁界による測定構成体への影響が回避される。EOMは有利には、レーザモジュール中に別個に収納することができる。
(実施形態2a)
別の有利な実施形態では、本発明によれば、2つのモードがすでに存在し、EOM、AOMまたはAOTFによってこれらのモード間で切り換えられる解決策が実現される。この原理は、これまで文書に記載された従来技術から大きく異なるものである。なぜならこの場合は、焦点内の切換えが光学的位相の切換えによって行われるのではなく、2つの光学的場モードの切換えによって行われるからである。その際に、等価の出発状態および終了状態がもたらされるが、それぞれ焦点場構造によって特徴付けられる一方の構成から他方の構成への移行は、インコヒーレントに行われる。
光を偏向させるためにPBSの後方にミラーM1〜M4が設けられている。
M2とM3の間に、特定の偏光方向について光線分布のドーナツモードDMを生じる位相要素(SPPスパイラル位相板[5])が配置されており、このドーナツモードDMはM4の後方のPBSで、PBSを通過した成分と再び統合される。
doi:10.1088/1367−2630/6/1/071
PII:S1367−2630(04)80050−8
ジョナサン リーチ(Jonathan Leach、エリック ヤオ(Eric Yao)およびJ Pagetto(J Pagett)「Observation of the vortex structure of a non−integer vortex beam」からのスパイラル位相板の例を示す。
提案された解決策は従来技術とは、特に、この場合は光場が瞳内でその個別成分に分解されて、位相変調器を介して様々な空間的部分内で影響を受けるのではなく、異なる2つの焦点野の間で時間的に変化する切換えが行われる点で異なる。これによって実際の変換について一連の利点が得られる。もっとも重要な利点は、第一に、達成可能な変調速度である。
ここに図示されているのは、たとえば4つの好ましくはコリメートされた光線L1〜4の例によるモード変調のためのマルチスポット変形形態であり、光線はもっぱら顕微鏡M内で焦点面の方向に集束される。
2つのモードの切換えは、たとえば音響光学的変調器(AOM)によって非常に高速に行うこともできる。
PBSの後に通過する光路内には、戻ってくる光線をPBSを通って別の顕微鏡Mの方向に偏向させることができるようにするための位相回転に役立つ四分の一波長板QWPの後方にAOMが配置されており、その0次および1次の光路内に反射要素Sが配置されており、この反射要素Sは光を同じ方向でAOMに逆反射する。
本発明のこの実施形態は、上述の実施形態2aの有利な変形形態である。
使用される検出技術の説明:
ロックイン技術
ロックイン技術(LIT)は、時間的に変調された信号を位相に依存して測定することに基づいており、基本位置が周波数基準を形成する。典型的には試料が特定の周波数で励起され、LIが基準周波数において信号を測定する。
基準位相に対して固定した関係で、LI増幅器がその固有の内部測定位相を(通例、いわゆる位相ロックループによって)形成する。
図4aは、浸透深度/散乱光抑制を高めるための顕微鏡構造を示し、概略的な光路内に、レーザLから試料Pの方向に、照明光路と検出光路とを分離するためのダイクロイックハーフミラーDが設けられている。
さらに光学的変調器m1、m2、位相調整用の要素Ph、フィルタF、焦点変調器FMならびに減算演算器O−が図示されている。
変調器m1、m2は、有利にはEOMのような光学的変調器とすることができ、m1は直接変調され、m2はPhを介して位相シフトを受け、これにより、互いに位相差(ΔΦ)を有する2つの部分信号が検出され、混合され、低域フィルタによってフィルタリングされる。したがって有利には、焦点が完璧な状態と、弱め合う干渉によって焦点が妨害されていて焦点がずれた状態とを互いに減算できる(−演算器)ようにするために、調整された相対位相、理想的には2つの検出成分間で90°の相対位相で光学的復調が行われる。
検出光路における光学的変調:
本発明によればAOMを用いて、光線切換えが復調のために利用される。
しかしこの場合は、検出器d1とd2の間で周波数ωで、有利には図2に示したようなAOD(A)によって切り換えられるが、この場合はこの切換えが検出の際に行われる。
これによりビームスプリッタが使用されず、信号強度のそれぞれ半分が失われることがない。
図6〜8には、別の有利な実施形態が補足して示されている。第1の補足は、位相板自体の構造に関するものである。これは元々は、半波長板と等方的に作用するプレートとの組合せからなると説明された。ただし一般的に、別の組合せも考えられる。
これはたとえば様々な二重屈折結晶からなり、広帯域の波長領域に対して同じ光学的特性(同じ位相遅延)を有する、いわゆる「アクロマチック波長板」または「アクロマチック遅延板」によって実現することができる。ここでは、たとえば少なくとも2つのガラスからなるプレートを使用することにより、等方性の部分プレートの位相経過がこれに適合される。
1)格段に小型であり、顕微鏡での取扱いにおいて格別の利点を有する音響光学的要素を切換えのために用いること、
2)レーザモジュールからLSMの走査ヘッドに光を供給するのにファイバを直接使用することができること、
から得られる。
これに関する測定は、顕微鏡内で、または外部のモニタダイオードによって実施することができる。
ダイオードによって測定される強度変動は、とりわけ周波数fac 1とfac 2の最大振幅を調整するための制御量として使用される。
図7は、ファイバ光学系F1、F2と組み合わせたAODにより、適切な位相板PPを用いて位相スイッチを形成するために偏光を高速に切り換えることを示す。2つの切換状態の強度を調整するための実施形態が図示されている。
これは、ファイバ端部または出力結合ユニットを対応して回転することによって行われる。その際、PBSの後方でそれぞれF1とF2について、信号収率に基づいてPBSにおける最適の位置に調整することができる。
図8は、偏光を、したがって位相板後方の位相を、上に図7に基づいて説明した構成要素と関連して図7と同様の動作方式で切り換えるための、EOMを備える別の実施形態を示す。ただしこの場合は、個々の偏光成分への分離が、EOMの後方の偏光スプリッタPBS1によって行われ、PBSの後方で異なる偏光成分がやはり別個のファイバF1、F2に入力結合される。これらの偏光成分は、PBS2においてファイバまたは出力結合FFKの配向によりやはり互いに垂直な偏光で入射される。
Claims (34)
- 照明光線源と、照明光線を試料に集束して集束領域を生成するための顕微鏡対物レンズと、検出光路と、を有する顕微鏡であって、
前記照明光線内に焦点変調器が設けられ、該焦点変調器は、該照明光線を変調周波数ωにより変調して前記集束領域において変調を生じさせ、
焦点変調器として少なくとも1つの調整可能な偏光変更要素および位相板が照明光路内に配置され、該偏光変更要素には、前記位相板が後置され、前記位相板は、位相変調度が異なる少なくとも2つの領域を有し、該少なくとも2つの領域のうちの少なくとも1つは、複屈折性を有し、
前記調整可能な偏光変更要素は、前記変調周波数で前記照明光線の偏光を切換え可能であるかまたは回転可能である、顕微鏡。 - 前記偏光変更要素が、偏光回転要素または偏光切換え要素である、請求項1に記載の顕微鏡。
- 前記偏光回転要素が、電子光学的変調器(EOM)である、請求項2に記載の顕微鏡。
- 前記位相板が、実質的に位相が影響を受けない領域と、位相が影響を受ける領域を有する、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 前記位相が影響を受ける領域が、少なくとも1つの半波長板である、請求項4に記載の顕微鏡。
- 復調のために、ロックイン増幅器が設けられている、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 復調のための音響光学的変調器(AOM)または電子光学的変調器(EOM)、
復調のための光線切換えを行う少なくとも1つの音響光学的変調器(AOM)、または
復調のための動作方式を変更する複数の検出器をさらに備える請求項1乃至6のいずれか1項に記載の顕微鏡。 - 前記偏光変更要素と前記位相板との間に光ファイバが配置されている、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 前記位相板が、空間的光変調器(SLM、Spatial Light Modulator)である、請求項1乃至8のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 前記顕微鏡は、レーザ走査顕微鏡である、請求項1乃至9のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 前記位相板が様々な領域を有し、これらの領域が互いにλ/2の位相変化を有している、請求項1乃至10のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 音響光学的偏向器(デフレクタ)と、
前記音響光学的偏向器の後方に設けられた少なくとも2つの光ファイバとをさらに備え、
前記音響光学的偏向器は、前記照明光線を前記少なくとも2つの光ファイバの入力端に偏向する、請求項1乃至11のいずれか1項に記載の顕微鏡。 - 偏光変更要素の後方に、少なくとも2つの光ファイバに入力結合するための入力結合手段が設けられている、請求項12に記載の顕微鏡。
- 振幅変調により、交互に少なくとも2つの光ファイバに入力結合された少なくとも2つの光成分の時間に依存する重み付けがなされる、請求項12または13に記載の顕微鏡。
- 少なくとも2つの光ファイバへ、それぞれ偏光の向きの異なる入力結合が行われる、請求項12乃至14のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 少なくとも2つの光ファイバの端部または少なくとも2つの光ファイバの出力結合部が、少なくとも2つの偏光部分が互いに異なるように互いに対して配向される、請求項12乃至15のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 異なる向きの偏光成分が、前記位相板を介して試料に達し、該位相板が前記少なくとも2つの光ファイバに後置されている、請求項12乃至16のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 前記位相板の後方に、光の強度を調整可能な偏光器が配置されている、請求項1乃至17のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 前記位相板の後方に、音響光学的偏向器(AOD)または電子光学的変調器(EOM)を制御するためにモニタダイオードが設けられる、請求項1乃至18のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 試料の光を顕微鏡で検出するための方法であって、
該試料が、照明光線源の少なくとも1つの照明光線により、該少なくとも1つの照明光線を集束して集束領域を生成するために顕微鏡対物レンズを介して照射され、該照明光線が、前記集束領域において変調を生じさせるために該照明光線の照明光路内にある焦点変調器を介して変調周波数ωにより変調され、
焦点変調器として少なくとも1つの調整可能な偏光変更要素および位相板が照明光路内に配置され、前記偏光変更要素には、前記位相板が後置され、前記位相板は、位相変調度が異なる少なくとも2つの領域を有し、該少なくとも2つの領域のうちの少なくとも1つは、複屈折性を有し、前記調整可能な偏光変更要素は、前記変調周波数で前記照明光線の偏光を切換え可能であるかまたは回転可能であり、
変調周波数の復調が、検出光路内または検出光路の後で行われ、前記試料における照明光線の位相変調が、前記検出光路において、検出された信号の強度変調に変換される、方法。 - 前記偏光変更要素は、電子光学的変調器(EOM)を含む、請求項20に記載の方法。
- 試料信号の測定により、位相変調度が異なる少なくとも2つの領域を有する位相板間の交換の際に、または空間的光変調器(SLM)を含む位相変調器の調整された変更の際に、測定結果の最適化に役立つ調節が行われる、請求項20または21に記載の方法。
- 前記顕微鏡は、レーザ走査顕微鏡である、請求項20乃至22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記位相板が様々な領域を有し、これらの領域が互いにλ/2の位相変化を有している、請求項20乃至23のいずれか1項に記載の方法。
- 音響光学的偏向器(デフレクタ)と、
前記音響光学的偏向器の後方に設けられた少なくとも2つの光ファイバとをさらに備え、
前記音響光学的偏向器は、前記照明光線を前記少なくとも2つの光ファイバの入力端に偏向する、請求項20乃至24のいずれか1項に記載の方法。 - 偏光変更要素の後方に、少なくとも2つの光ファイバに入力結合するための入力結合手段が設けられている、請求項20乃至25のいずれか1項に記載の方法。
- 振幅変調により、交互に少なくとも2つの光ファイバに入力結合された少なくとも2つの光成分の時間に依存する重み付けがなされる、請求項25または26に記載の方法。
- 少なくとも2つの光ファイバへ、それぞれ偏光の向きの異なる入力結合が行われる、請求項25乃至27のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも2つの光ファイバの端部またはその出力結合部が偏光器において、異なって偏光された2つの光線成分が存在するように互いに向けられる、請求項25乃至28のいずれか1項に記載の方法。
- 異なる向きの偏光成分が、前記位相板を介して試料に達し、該位相板が前記少なくとも2つの光ファイバに後置されている、請求項25乃至29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記位相板の後方に、光の強度を調整可能な偏光器が配置されている、請求項20乃至30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記位相板の後方に、音響光学的偏向器(AOD)または電子光学的変調器(EOM)を制御するためにモニタダイオードが設けられる、請求項20乃至31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの照明光線源は、蛍光励起のためのレーザを含み、
前記位相板は、位相遅延の異なる領域を有し、
前記音響光学的偏向器が、変調された振幅を有する照明光を交互にまたは同時に少なくとも2つの光ファイバの入力端に偏向される、請求項12に記載の顕微鏡。 - 前記照明光線源の少なくとも1つの照明光線は、蛍光励起のためのレーザを含み、
前記検出光路内で変調周波数の復調が行われることは、
試料内における照明の位相変調が、検出光路において強度変調に変換され、該強度変調が復調されることを含み、
前記位相板は、位相遅延の異なる領域を有し、
音響光学的偏向器が、変調された振幅を有する照明光を交互にまたは同時に少なくとも2つの光ファイバの入力端に偏向される、請求項25に記載の方法。
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