JP5908405B2 - 多機能性対立遺伝子 - Google Patents
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Description
ヌル対立遺伝子および条件的対立遺伝子、ならびにヌルとCOINの特徴を併せ持つ対立遺伝子を作製するための方法と組成物が提供される。様々な実施形態において、1回の標的化工程においてゲノム中に多機能性対立遺伝子を操作するための方法と組成物が提供される。遺伝的操作されたヒト以外の動物におけるノックアウトの相補性解析のための方法と組成物が提供される。これには、1回の標的化工程を含む方法が含まれる。
(項目1)
(a)細胞の核酸の標的遺伝子に対して核酸構築物を誘導するための標的化アーム;
(b)前記標的遺伝子の転写に関してセンス方向の動作配列、およびセンス方向またはアンチセンス方向の薬剤選択カセット(DSC);
(b)アンチセンス方向の、目的のヌクレオチド配列(NSI)およびCOIN;ならびに、
(c)(i)前記動作配列と前記DSCとを欠失し、かつ
(ii)センス方向の前記NSIとアンチセンス方向の前記COINとを含む、
条件的対立遺伝子を形成させるための、第1のリコンビナーゼに対して暴露されると組み換わる組み換え可能なユニット;
を含む核酸構築物であって、
ここでは、前記組み換え可能なユニットに、前記第1のリコンビナーゼにより認識される類似するリコンビナーゼ認識部位の2つの第1の対、第2のリコンビナーゼにより認識される類似するリコンビナーゼ認識部位の2つの第2の対、および第3のリコンビナーゼにより認識される類似するリコンビナーゼ認識部位の1つの第3の対が含まれ;ここでは、リコンビナーゼ認識部位の前記第1の対、前記第2の対、および前記第3の対が、異なるリコンビナーゼにより認識される、核酸構築物。
(項目2)
前記条件的対立遺伝子が、第2の部位特異的リコンビナーゼに対してさらに暴露されると、前記NSIを欠失し、前記COINをセンス方向で有する対立遺伝子を形成するように組み換わる、項目1に記載の核酸構築物。
(項目3)
ヒト以外の細胞を修飾するための方法であって、前記方法は:
項目1に記載の核酸構築物で細胞中の目的のヌクレオチド配列を標的化して、標的化された細胞を形成させる工程、
前記標的化された細胞を第1のリコンビナーゼに対して暴露して、条件的対立遺伝子を形成させる工程、および
前記条件的対立遺伝子を、NSIを切り出し、COINをセンス方向で配置する第2のリコンビナーゼに対して暴露する工程
を包含する、方法。
(項目4)
前記細胞中の前記NSIが、1つの表現型と関係がある1つのエキソンまたは1つのヌクレオチド配列である、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記細胞中の前記目的のヌクレオチド配列が項目1に記載の核酸構築物により置き換えられる、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記標的化された細胞が形成させた後であるが、前記第1のリコンビナーゼに対して暴露させる前に、前記表現型が最初に決定される、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記第1のリコンビナーゼに対して暴露した後に、前記表現型が2回目に決定される、項目6に記載の方法。
(項目8)
薬剤選択カセット(DSC)、レポーター、COIN、目的のヌクレオチド配列(NSI)、ならびに前記レポーター、前記DSC、前記COIN、および前記NSIの間に並べられた5対のリコンビナーゼ部位を含む核酸構築物であって;
ここで、どのリコンビナーゼ部位の対も、任意の他の対とは同一ではなく、リコンビナーゼ部位の第1の2つの対は同じ第1のリコンビナーゼにより認識され、リコンビナーゼ部位の第2の2つの対は同じ第2のリコンビナーゼにより認識され、そしてリコンビナーゼ部位の第5の対は第3のリコンビナーゼにより認識され;
ここで、前記第1のリコンビナーゼ、前記第2のリコンビナーゼ、および前記第3のリコンビナーゼは同じではなく、転写方向に関して、前記レポーターはセンス方向であり、前記NSIはアンチセンス方向であり、前記COINはアンチセンス方向であり、そして前記DSCはセンス方向またはアンチセンス方向であり;そして、
ここで、リコンビナーゼ部位の前記第1の2つの対とリコンビナーゼ部位の前記第2の2つの対は、前記第1のリコンビナーゼに対して暴露されると、修飾された対立遺伝子が形成するように並べられており、ここで、リコンビナーゼ部位の前記第1の2つの対が前記レポーターの切り出し、前記DSCの切り出し、前記NSIのセンス方向への反転を誘導し、前記COINがアンチセンス方向で維持され、かつ(a)リコンビナーゼ部位の前記第2の2つの対が、前記第2のリコンビナーゼに対して暴露されると、前記NSIが切り出され、前記COINがセンス方向で配置されるように並べられているか;または(b)リコンビナーゼ部位の前記第2の2つの対が、前記第2のリコンビナーゼに対して暴露されると、前記NSIがアンチセンス方向で配置され、前記COINがセンス方向で配置されるように並べられているかのいずれかである、核酸構築物。
(項目9)
リコンビナーゼ部位の前記第5の対が、前記第3のリコンビナーゼに対して暴露され、かつ前記第1のリコンビナーゼまたは前記第2のリコンビナーゼに対して暴露されないときに、前記第5のリコンビナーゼが前記COIN、前記NSI、および前記DSCを切り出し、そして前記レポーターを前記センス方向で維持するように並べられている、項目8に記載の核酸構築物。
(項目10)
前記核酸構築物が1つの遺伝子に挿入される、項目8に記載の核酸構築物であって、前記遺伝子の転写方向に関して5’から3’へ、前記構築物が、センス方向のレポーター、センス方向またはアンチセンス方向のDSC、アンチセンス方向のNSI、およびアンチセンス方向のCOINを含む、核酸構築物。
(項目11)
前記DSCがセンス方向である、項目10に記載の核酸構築物。
(項目12)
前記核酸構築物が1つの遺伝子に挿入される、項目8に記載の核酸構築物であって、前記遺伝子の転写方向に関して5’から3’へ、前記構築物が、アンチセンス方向のCOIN、アンチセンス方向のNSI、センス方向またはアンチセンス方向のDSC、およびセンス方向のレポーターを含む、核酸構築物。
(項目13)
前記DSCがセンス方向である、項目12に記載の核酸構築物。
(項目14)
前記核酸構築物が1つの遺伝子に挿入される、項目8に記載の核酸構築物であって、前記遺伝子の転写方向に関して5’から3’へ、前記構築物が、アンチセンス方向のNSI、センス方向またはアンチセンス方向のDSC、センス方向のレポーター、およびアンチセンス方向のCOINを含む、核酸構築物。
(項目15)
前記DSCがセンス方向である、項目14に記載の核酸構築物。
(項目16)
前記核酸構築物が1つの遺伝子に挿入される、項目8に記載の核酸構築物であって、前記遺伝子の転写方向に関して5’から3’へ、前記構築物が、センス方向のレポーター、センス方向またはアンチセンス方向のDSC、アンチセンス方向のNSI、およびアンチセンス方向のCOINを含む、核酸構築物。
(項目17)
前記DSCがセンス方向である、項目16に記載の核酸構築物。
(項目18)
前記核酸構築物が1つの遺伝子に挿入される、項目8に記載の核酸構築物であって、前記遺伝子の転写方向に関して5’から3’へ、前記構築物が、アンチセンス方向のCOIN、アンチセンス方向のNSI、センス方向またはアンチセンス方向のDSC、およびセンス方向のレポーターを含む、核酸構築物。
(項目19)
前記DSCがセンス方向である、項目18に記載の核酸構築物。
(項目20)
前記核酸構築物が1つの遺伝子に挿入される、項目8に記載の核酸構築物であって、前記遺伝子の転写方向に関して5’から3’へ、前記構築物が、アンチセンス方向のNSI、センス方向またはアンチセンス方向のDSC、センス方向のレポーター、およびアンチセンス方向のCOINを含む、核酸構築物。
他の実施形態が、以下の詳細な説明を検討することにより記載され、これらは当業者に明らかであろう。
本発明は、記載される特定の方法および実験条件に限定されない。なぜなら、そのような方法および条件を変えることができるからである。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけのものであり、限定とは意図されない。そのため、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定される。
遺伝的方法による遺伝子機能の研究により、自然界に存在している変異体または突然変異体対立遺伝子の発見、あるいはそのような変異体および突然変異体対立遺伝子の意図的な作製が実現した。後者は、無作為な突然変異誘発と、それに続いて行われる表現型に基づくスクリーニング、その後の原因となる突然変異の解明(「順遺伝学」と呼ばれているプロセス)によるか、または突然変異を特異的「標的」遺伝子または遺伝子座の中に提供する遺伝子操作方法論(「逆遺伝学」と呼ばれているアプローチ)のいずれかにより進められる。
動作配列を含む1セットの機能的エレメント(これにより除去または不活化を確認する)の導入によりゲノム中のヌクレオチド配列の除去または不活化を可能にし、それにより真のノックアウトを生じ、対立遺伝子中でのその発現が条件的であり(すなわち、特定の分子事象または合図に依存する)、報告可能である1つ以上の条件的エレメントもまた含む、多機能性対立遺伝子(MFA)アプローチが提供される。
Hprt1 MFA
Hprt1は、マウスにおいてX連鎖である遺伝子であり、Hprt1ヌルES細胞は、ヌクレオ塩基アナログである6−チオグアニン(6−TG)に対して耐性がある。この特性が、容易であり、堅調な表現型の試験を提供する。なぜなら、Hprt1について野生型である細胞は6−TGの存在下で死滅し、一方、Hprt1についてヌルである細胞は生き残るからである。さらに、男性の胚盤胞に由来する(典型的な場合にそうであり、標的化のために現在使用されているES細胞株の大部分もまたそのような場合である)ES細胞を標的化する場合は、わずかに1回の標的化が、Hprt1MFA/Y ES細胞を作製するために必要である。Hprt1MFA/Y ES細胞を作製するためには、標的化ベクター中のMFAは、図5(上)に示す対立遺伝子に従い、米国特許第6,586,251号およびValenzuelaら(2003)のHigh−throughput engineering of the mouse genome coupled with high−resolution expression analysis,Nature Biotech.21(6):652−659(この特許および論文は、言及により本明細書中に組み込まれたこととなる)に記載されているVELOCIGENE(登録商標)法にしたがって、標準的な遺伝子操作方法論および細菌による相同組み換えによって調製される。Hprt1MFA対立遺伝子は、エキソン3を囲むように設計され、エキソン3と、NSIのように、そのすぐ5’および3’にある保存されているイントロン配列を定義する(図9)。これを選択する理由は、エキソン3がフレーム2(f2)の中で始まり、フレーム0(f0)の中で終わることにある。延長線上で考えると、前にあるエキソン(すなわち、エキソン2)はフレーム2(f2)で終わり、次にくるエキソン(すなわち、エキソン4)はフレーム0(f0)で始まる。これは、このNSIがアンチセンス方向に反転させられると、エキソン2がエキソン4に関してフレームアウトすることを意味する。なぜなら、エキソン2はf2の中で終わり、エキソン4はf0の中で始まるからである。この様式では、Hprt1MFA対立遺伝子中に動作配列(SA−lacZ−polyA(図10))の何らかの転写履歴が存在し、最終的なmRNA(このmRNAにはエキソン3は含まれず、ナンセンス配列をコードする)から動作配列を除去するスプライシングも存在する場合には、Hprt1ヌルのmRNAと表現型が効率よく生じる。逆に、Hprt1COIN−INV対立遺伝子(Hprt1COIN対立遺伝子を最初に作製するための、FLPまたはFLPの変異体でのHprt1MFAの処理により、その後、Hprt1COIN−INVを作製するためのCreでの処理により作製された)については、COINエレメントのSA−eGFP−polyAの転写履歴が存在し(図10)、そして最終的なmRNA(このmRNAにはエキソン3は含まれず、したがって、ナンセンス配列をコードする)からSA−eGFP−polyA配列を除去するスプライシングもまた存在する場合には、Hprt1ヌルであるmRNAおよび表現型が効率よく生じる。
Hprt1 MFAの結果
センス方向のLacZレポーター(SA(adml)−gtx−LacZ−pA)、ネオマイシンDSC(Neo)、アンチセンス方向のNSI(これには、Hprt1の重要なエキソン(ec)(エキソン3)と隣接している進化の過程で保存されてきたイントロン配列が含まれる)、およびCOIN(Gtx−SA−HA−myc3−TM−T2A−GFP−pA)を有しているMFAを、図16Aに示すリコンビナーゼ部位の並びで構築した。MFAをF1H4 ES細胞にエレクトロポレーションし、G418に対する耐性について選択した。続いて、G418耐性コロニーを、標的化を決定するために遺伝子型分類した。スクリーニングした全部で96個のコロニーから5つの標的化されたクローン(Hprt1MFA/Y)を得た。Hprt1ヌルである細胞について予想されたとおり(Doetschman,T.ら(1987)Targeted correction of mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells,Nature 330:576−578)、5個のこれらのクローンの全てが、10μMの6−TGを補充した標準的なES細胞培地中で培養された場合に生き残り、増殖することが明らかになった(これは、利用される標準的な6−TG生存分析である)。対照的に、もとの細胞株F1H4、ならびに試験した標的化されないクローンの全ては、6−TGの存在下で増殖することはできなかった。これらの結果は、以前に報告されたものと一致する(Doetschmanら(1987))。
Claims (19)
- (a)細胞の核酸の標的遺伝子に対して核酸構築物を誘導するための標的化アーム;
(b)前記標的遺伝子の転写に関してセンス方向の動作配列、およびセンス方向またはアンチセンス方向の薬剤選択カセット(DSC);
(c)アンチセンス方向の、目的のヌクレオチド配列(NSI)およびCOIN(反転による条件的エレメント);ならびに、
(d)組み換え可能なユニット;
を含む核酸構築物であって、
ここでは、前記組み換え可能なユニットに、第1のリコンビナーゼにより認識される類似するリコンビナーゼ認識部位の第1の対と第2の対、前記第1のリコンビナーゼにより認識される類似するリコンビナーゼ認識部位の前記第1の対または前記第2の対に隣接した、前記動作配列、前記DSCおよび前記NSIを含む第1の組み換え可能なユニット、前記第1のリコンビナーゼにより認識される類似するリコンビナーゼ認識部位の前記第1の対または前記第2の対に隣接した、前記NSIを含む第2の組み換え可能なユニット、第2のリコンビナーゼにより認識される類似するリコンビナーゼ認識部位の第3の対と第4の対、および第3のリコンビナーゼにより認識される類似するリコンビナーゼ認識部位の第5の対が含まれ;ここでは、前記第1のリコンビナーゼ、前記第2のリコンビナーゼ、および前記第3のリコンビナーゼは同じではなく;前記組み換え可能なユニットは、第1のリコンビナーゼに対して曝露されると、前記動作配列と前記DSCを欠失し、かつ、前記NSIをセンス方向で、前記COINをアンチセンス方向で含む条件的対立遺伝子を形成するように組み換わり;そして、前記条件的対立遺伝子は、前記第2のリコンビナーゼに対してさらに曝露されると、前記NSIを欠失し、前記COINをセンス方向で有する対立遺伝子を形成するように組み換わる、核酸構築物。 - ヒト以外の細胞を修飾するための方法であって、前記方法は:
請求項1に記載の核酸構築物で細胞中の目的のヌクレオチド配列を標的化して、標的化された細胞を形成させる工程、
前記標的化された細胞を第1のリコンビナーゼに対して暴露して、条件的対立遺伝子を形成させる工程、および
前記条件的対立遺伝子を、NSIを切り出し、COINをセンス方向で配置する第2のリコンビナーゼに対して暴露する工程
を包含する、方法。 - 前記細胞中の前記NSIが、1つの表現型と関係がある1つのエキソンまたは1つのヌクレオチド配列である、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞中の前記目的のヌクレオチド配列が請求項1に記載の核酸構築物により置き換えられる、請求項3に記載の方法。
- 前記標的化された細胞が形成された後であるが、前記第1のリコンビナーゼに対して暴露させる前に、前記表現型が最初に決定される、請求項4に記載の方法。
- 前記第1のリコンビナーゼに対して暴露した後に、前記表現型が2回目に決定される、請求項5に記載の方法。
- 薬剤選択カセット(DSC)、レポーター、COIN、目的のヌクレオチド配列(NSI)、ならびに前記レポーター、前記DSC、前記COIN、および前記NSIの間に並べられた、リコンビナーゼ部位の第1の対、第2の対、第3の対、第4の対、および第5の対を含む核酸構築物であって;
ここで、どのリコンビナーゼ部位の対も、任意の他の対とは同一ではなく、リコンビナーゼ部位の前記第1の対と前記第2の対は同じ第1のリコンビナーゼにより認識され、リコンビナーゼ部位の前記第3の対と前記第4の対は同じ第2のリコンビナーゼにより認識され、そしてリコンビナーゼ部位の前記第5の対は第3のリコンビナーゼにより認識され;
ここで、前記第1のリコンビナーゼ、前記第2のリコンビナーゼ、および前記第3のリコンビナーゼは同じではなく、転写方向に関して、前記レポーターはセンス方向であり、前記NSIはアンチセンス方向であり、前記COINはアンチセンス方向であり、そして前記DSCはセンス方向またはアンチセンス方向であり;
ここで、前記リコンビナーゼ部位は、(i)前記第1のリコンビナーゼにより認識されるリコンビナーゼ部位の前記第1の対または前記第2の対に隣接した、前記レポーター、前記DSCおよび前記NSIを含む第1の組み換え可能なユニットと;(ii)前記第1のリコンビナーゼにより認識されるリコンビナーゼ部位の前記第1の対または前記第2の対に隣接した、前記NSIを含む第2の組み換え可能なユニット、を含む組み換え可能なユニットにおいて並べられ;そして、
ここで、リコンビナーゼ部位の前記第1の対、前記第2の対、前記第3の対、および前記第4の対は、前記第1のリコンビナーゼに対して暴露されると、修飾された対立遺伝子が形成するように並べられており、ここで、リコンビナーゼ部位の前記第1の対と前記第2の対が前記レポーターの切り出し、前記DSCの切り出し、前記NSIのセンス方向への反転を誘導し、前記COINがアンチセンス方向で維持され、かつ(a)リコンビナーゼ部位の前記第3の対と前記第4の対が、前記第2のリコンビナーゼに対して暴露されると、前記NSIが切り出され、前記COINがセンス方向で配置されるように並べられているか;または(b)リコンビナーゼ部位の前記第3の対と前記第4の対が、前記第2のリコンビナーゼに対して暴露されると、前記NSIがアンチセンス方向で配置され、前記COINがセンス方向で配置されるように並べられているかのいずれかである、核酸構築物。 - リコンビナーゼ部位の前記第5の対が、前記第3のリコンビナーゼに対して暴露され、かつ前記第1のリコンビナーゼまたは前記第2のリコンビナーゼに対して暴露されないときに、前記第3のリコンビナーゼが前記COIN、前記NSI、および前記DSCを切り出し、そして前記レポーターを前記センス方向で維持するように並べられている、請求項7に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が1つの遺伝子に挿入される、請求項7に記載の核酸構築物であって、前記遺伝子の転写方向に関して5’から3’へ、前記構築物が、センス方向のレポーター、センス方向またはアンチセンス方向のDSC、アンチセンス方向のNSI、およびアンチセンス方向のCOINを含む、核酸構築物。
- 前記DSCがセンス方向である、請求項9に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が1つの遺伝子に挿入される、請求項7に記載の核酸構築物であって、前記遺伝子の転写方向に関して5’から3’へ、前記構築物が、アンチセンス方向のCOIN、アンチセンス方向のNSI、センス方向またはアンチセンス方向のDSC、およびセンス方向のレポーターを含む、核酸構築物。
- 前記DSCがセンス方向である、請求項11に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が1つの遺伝子に挿入される、請求項7に記載の核酸構築物であって、前記遺伝子の転写方向に関して5’から3’へ、前記構築物が、アンチセンス方向のNSI、センス方向またはアンチセンス方向のDSC、センス方向のレポーター、およびアンチセンス方向のCOINを含む、核酸構築物。
- 前記DSCがセンス方向である、請求項13に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が1つの遺伝子に挿入される、請求項7に記載の核酸構築物であって、前記遺伝子の転写方向に関して5’から3’へ、前記構築物が、センス方向のレポーター、センス方向またはアンチセンス方向のDSC、アンチセンス方向のNSI、およびアンチセンス方向のCOINを含む、核酸構築物。
- 前記DSCがセンス方向である、請求項15に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が1つの遺伝子に挿入される、請求項7に記載の核酸構築物であって、前記遺伝子の転写方向に関して5’から3’へ、前記構築物が、アンチセンス方向のCOIN、アンチセンス方向のNSI、センス方向またはアンチセンス方向のDSC、およびセンス方向のレポーターを含む、核酸構築物。
- 前記DSCがセンス方向である、請求項17に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が1つの遺伝子に挿入される、請求項7に記載の核酸構築物であって、前記遺伝子の転写方向に関して5’から3’へ、前記構築物が、アンチセンス方向のNSI、センス方向またはアンチセンス方向のDSC、センス方向のレポーター、およびアンチセンス方向のCOINを含む、核酸構築物。
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