JP5904649B2 - Anticancer agent containing SOCS activator as active ingredient - Google Patents
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Description
本発明は、Jak1を介するがSTAT3非依存的な経路を抑制する物質からなるSOCS活性化剤、および当該SOCS活性化剤を有効成分とする抗癌剤に関する。詳細にはSOCS活性化剤がSOCS遺伝子が組み込まれたベクターである抗癌剤に関するものである。 The present invention relates to a SOCS activator comprising a substance that suppresses a STAT3-independent pathway via Jak1, and an anticancer agent comprising the SOCS activator as an active ingredient. Specifically, the present invention relates to an anticancer agent in which the SOCS activator is a vector having a SOCS gene incorporated therein.
近年、様々な癌においてサイトカインシグナル伝達制御の破綻が報告されている。その１つとして、STAT3の持続的活性化が発癌あるいは癌細胞の増殖亢進と関係していることが示唆されている。Jak/STAT系のサイトカインシグナル伝達の抑制分子としてSOCS(suppressor of cytokine signaling)が知られている。SOCSファミリーであるSOCS-1はJakを介した様々なサイトカインシグナルを抑制し、SOCS-3はIL-6に代表とされるgp130を介したサイトカインシグナルを抑制することが報告されている。肝癌、白血病などの種々の悪性疾患においてSOCS遺伝子のメチル化による発現低下や遺伝子変異による機能欠損が報告されており、SOCSの発現異常はSTAT3の持続的活性化を引き起こし、癌細胞の増殖亢進に関わることが示唆されている。 In recent years, failure of cytokine signaling control has been reported in various cancers. One of them has been suggested that sustained activation of STAT3 is related to carcinogenesis or increased proliferation of cancer cells. SOCS (suppressor of cytokine signaling) is known as a molecule that suppresses cytokine signaling in the Jak / STAT system. It has been reported that SOCS-1 which is a SOCS family suppresses various cytokine signals via Jak, and SOCS-3 suppresses gp130-mediated cytokine signals typified by IL-6. Decreased expression due to SOCS gene methylation and functional deficiency due to gene mutations have been reported in various malignant diseases such as liver cancer and leukemia. Abnormal expression of SOCS causes sustained activation of STAT3, leading to increased proliferation of cancer cells It is suggested to be involved.
癌の１つである悪性胸膜中皮腫は、アスベスト暴露が主要な原因とされているが、非常に予後が悪く、特異的治療法もない疾患である。また、悪性胸膜中皮腫は発症までおよそ40年かかるとされており、今後、患者数は増加すると予測されている。悪性胸膜中皮腫の効果的な治療法の確立が望まれている。 Malignant pleural mesothelioma, which is one of the cancers, is a disease that is mainly caused by asbestos exposure but has a very poor prognosis and no specific treatment. Malignant pleural mesothelioma is estimated to take about 40 years to develop, and the number of patients is expected to increase in the future. Establishment of an effective treatment method for malignant pleural mesothelioma is desired.
SOCS-3遺伝子のプロモーター領域におけるメチル化を検出することにより癌を診断する方法、およびSOCS-3の活性を増強させることによる癌治療方法が開示されている（特許文献１）。また、SOCS-3遺伝子を肝細胞癌に導入することにより、FAKリン酸化が抑制され、かつ、FAKの発現量が低下することが報告されている（非特許文献１）。 A method for diagnosing cancer by detecting methylation in the promoter region of the SOCS-3 gene and a method for treating cancer by enhancing the activity of SOCS-3 have been disclosed (Patent Document 1). In addition, it has been reported that introduction of SOCS-3 gene into hepatocellular carcinoma suppresses FAK phosphorylation and decreases the expression level of FAK (Non-patent Document 1).
本発明は、SOCS活性化剤を有効成分とする新規抗癌剤を提供すること、さらにかかる抗癌剤をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a novel anticancer agent containing a SOCS activator as an active ingredient, and to provide a method for screening such an anticancer agent.
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ね、SOCS-3がJak1を介したSTAT3非依存的な経路を抑制していることを初めて確認し、SOCS活性化剤が有効な抗癌剤となることを見出し、本発明を完成した。 The inventors of the present invention have made extensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and confirmed for the first time that SOCS-3 suppresses a STAT3-independent pathway via Jak1, and an anticancer agent in which the SOCS activator is effective. As a result, the present invention was completed.
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．Jak1を介するがSTAT3非依存的な経路を抑制する物質を含むSOCS活性化剤。
２．前項１に記載のSOCS活性化剤を有効成分とする、抗癌剤。
３．Jak1を介するがSTAT3非依存的な経路を抑制する物質が、SOCS-3遺伝子である、前項２に記載の抗癌剤。
４．SOCS活性化剤が、SOCS-3遺伝子が組み込まれたアデノウイルスベクターである、前項２または３に記載の抗癌剤。
５．FAKの発現を抑制する、および／または、FAKの活性化を抑制する機能を有する、前項２〜４のいずれか１に記載の抗癌剤。
６．抗アポトーシスタンパク質の発現を抑制する、および／または、細胞周期をG0/G1期で停止させる機能を有する、前項２〜５のいずれか１に記載の抗癌剤。
７．癌が細胞内で、Jak1および／またはSTAT3を持続的に活性化している、前項２〜６のいずれか１に記載の抗癌剤。
８．癌が悪性胸膜中皮腫である、前項２〜７のいずれか１に記載の抗癌剤。
９．被検物質から、SOCSを活性化し、Jak1の活性化を抑制する物質を選択することを含む、抗癌剤のスクリーニング方法。
That is, this invention consists of the following.
1. A SOCS activator containing a substance that suppresses a STAT3-independent pathway via Jak1.
2. An anticancer agent comprising the SOCS activator according to item 1 as an active ingredient.
3. 3. The anticancer agent according to 2 above, wherein the substance that suppresses a STAT3-independent pathway via Jak1 is a SOCS-3 gene.
4). 4. The anticancer agent according to 2 or 3 above, wherein the SOCS activator is an adenoviral vector into which the SOCS-3 gene is incorporated.
5. 5. The anticancer agent according to any one of 2 to 4 above, which has a function of suppressing FAK expression and / or suppressing FAK activation.
6). 6. The anticancer agent according to any one of items 2 to 5, which has a function of suppressing the expression of an anti-apoptotic protein and / or stopping the cell cycle at the G0 / G1 phase.
7). 7. The anticancer agent according to any one of 2 to 6 above, wherein Jak1 and / or STAT3 are continuously activated in the cell.
8). 8. The anticancer agent according to any one of 2 to 7 above, wherein the cancer is malignant pleural mesothelioma.
9. A method for screening an anticancer agent, comprising selecting a substance that activates SOCS and suppresses activation of Jak1 from a test substance.
本発明の抗癌剤は、細胞内でJak1および／またはSTAT3が持続的に活性化している癌において、Jak1を介したSTAT3非依存的な経路を抑制することによって、効果的に癌細胞の増殖を抑制することができる。また、かかる抗癌剤は、FAKの発現を抑制する、および／または、FAKの活性化を抑制し、抗アポトーシスタンパク質の発現を抑制する、および／または、細胞周期をG0/G1期で停止させることにより、効果的に癌細胞の増殖を抑制し、癌を治療することができるものである。 The anticancer agent of the present invention effectively suppresses the proliferation of cancer cells by suppressing the STAT3-independent pathway via Jak1 in cancers in which Jak1 and / or STAT3 are continuously activated in cells. can do. In addition, such an anticancer agent suppresses the expression of FAK and / or suppresses the activation of FAK, suppresses the expression of anti-apoptotic protein, and / or stops the cell cycle at the G0 / G1 phase. It can effectively suppress cancer cell proliferation and treat cancer.
SOCS (suppressor of cytokine signaling)とは、Jak/STAT系のサイトカインシグナル伝達の抑制分子であり、SOCSファミリーの代表的な分子として、SOCS-1、SOCS-2、SOCS-3が挙げられる。本発明者らは、SOCS活性化剤が、STAT3を介した経路のみならず、Jak1を介したSTAT3非依存的な経路を効果的に抑制することが可能であることを、初めて見出した。 SOCS (suppressor of cytokine signaling) is a molecule that suppresses cytokine signaling in the Jak / STAT system, and representative molecules of the SOCS family include SOCS-1, SOCS-2, and SOCS-3. The present inventors have found for the first time that SOCS activators can effectively suppress not only STAT3-mediated pathways, but also STAT3-independent pathways via Jak1.
本発明のSOCS活性化剤は、SOCSの機能を活性化させる作用を有するものを意味し、特にSOCS-3の機能を活性化させる作用を有するものが好ましく、Jak1を介するがSTAT3非依存的な経路を抑制する物質からなる。SOCS機能の活性化とは、例えばSOCSの発現量を増加させることなどである。Jak1を介するがSTAT3非依存的な経路を抑制する物質は、このような機能を有する物質であれば特に制限されないが、好ましくはSOCS-3遺伝子である。また、SOCS活性化剤はJak1を介するがSTAT3非依存的な経路を抑制する物質を含むものであれば特に制限されないが、例えば、SOCS-3遺伝子を組み込まれてなるベクターなどが挙げられる。 The SOCS activator of the present invention means one having an action of activating the function of SOCS, and in particular, one having an action of activating the function of SOCS-3 is preferable. It consists of substances that suppress the pathway. The activation of the SOCS function is, for example, increasing the expression level of SOCS. A substance that suppresses a STAT3-independent pathway via Jak1 is not particularly limited as long as it has such a function, but is preferably a SOCS-3 gene. In addition, the SOCS activator is not particularly limited as long as it contains a substance that suppresses a STAT3-independent pathway via Jak1, but examples thereof include a vector in which a SOCS-3 gene is incorporated.
タンパク質チロシンキナーゼのJanusキナーゼファミリー（Jak）は、細胞の増殖や免疫応答に関与する機能のサイトカイン依存的制御に役割を担うものである。現在、4つの既知の哺乳類Jakファミリーメンバーが存在する：Jakl、Jak2 、Jak3およびTYK2 （タンパク質チロシンキナーゼ2としても知られる）。本発明のSOCS活性化剤は、これらのJakファミリーの機能を阻害することができ、特にJak1阻害を介したSTAT3非依存的な細胞増殖経路を抑制することができる。 The Janus kinase family of protein tyrosine kinases (Jak) plays a role in cytokine-dependent control of functions involved in cell proliferation and immune responses. There are currently four known mammalian Jak family members: Jakl, Jak2, Jak3 and TYK2 (also known as protein tyrosine kinase 2). The SOCS activator of the present invention can inhibit the functions of these Jak families, and in particular, can suppress the STAT3-independent cell growth pathway via Jak1 inhibition.
本発明のSOCS活性化剤は、STAT3を介した経路のみならず、Jak1を介したSTAT3非依存的な経路を効果的に抑制することが可能である。本発明のSOCS活性化剤は、Jak1のリン酸化を阻害することによりJak1の機能を阻害すると考えられる。 The SOCS activator of the present invention can effectively suppress not only a pathway via STAT3 but also a pathway independent of STAT3 via Jak1. The SOCS activator of the present invention is considered to inhibit the function of Jak1 by inhibiting phosphorylation of Jak1.
さらに本発明は、SOCS活性化剤を有効成分とする抗癌剤にも及ぶ。本発明の抗癌剤は、FAKの発現を抑制する、および／または、FAKの活性化を抑制する機能を有するものである。さらに、本発明の抗癌剤は、抗アポトーシスタンパク質の発現を抑制する、および／または、細胞周期をG0/G1期で停止させる機能を有するものである。 Furthermore, the present invention extends to an anticancer agent containing a SOCS activator as an active ingredient. The anticancer agent of the present invention has a function of suppressing the expression of FAK and / or suppressing the activation of FAK. Furthermore, the anticancer agent of the present invention has a function of suppressing the expression of anti-apoptotic proteins and / or stopping the cell cycle at the G0 / G1 phase.
本発明におけるSOCS活性化剤は、SOCS遺伝子がベクターに組み込まれてなるものが好ましい。ベクターの種類に応じて、ベクターに搭載されるSOCS遺伝子はDNAまたはRNAであり得る。SOCS遺伝子には、SOCS-1、SOCS-2 、SOCS-3、SOCS-4、SOCS-5、SOCS-6、SOCS-7およびCIS遺伝子が含まれるが、癌治療にはSOCS-1、SOCS-2およびSOCS-3遺伝子であることが望ましい。SOCS-1、SOCS-2およびSOCS-3遺伝子は、以下の(a)〜(c)より選択されるいずれか１の塩基配列を有するものであることが好ましい：(a) 配列番号１，３，５，７または９で表される塩基配列；(b) 配列番号１，３，５，７または９で表される塩基配列において１個以上のヌクレオチドが置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなり、かつSOCS-1、SOCS-2およびSOCS-3と等価な機能を有するタンパク質をコードする塩基配列；(c) 配列番号１，３，５，７または９で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつSOCS-1、SOCS-2およびSOCS-3と等価な機能を有するタンパク質をコードする塩基配列。また、SOCS-1、SOCS-2およびSOCS-3は、以下の(a)〜(c)より選択されるいずれか１のタンパク質である：(a) 配列番号２，４，６，８または１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；(b) ２，４，６，８または１０で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつSOCS-1、SOCS-2およびSOCS-3と等価な機能を有するタンパク質；(c) 配列番号２，４，６，８または１０で表されるアミノ酸配列と４０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつSOCS-1、SOCS-2およびSOCS-3と等価な機能を有するタンパク質。SOCS-1、SOCS-2およびSOCS-3と等価な機能を有するタンパク質とは、Jak/STAT系のサイトカインシグナル伝達の抑制分子として作用するタンパク質を意味する。 The SOCS activator in the present invention is preferably one in which a SOCS gene is incorporated into a vector. Depending on the type of vector, the SOCS gene carried on the vector can be DNA or RNA. SOCS genes include SOCS-1, SOCS-2, SOCS-3, SOCS-4, SOCS-5, SOCS-6, SOCS-7 and CIS genes, but for cancer treatment, SOCS-1, SOCS- 2 and SOCS-3 genes are preferred. The SOCS-1, SOCS-2 and SOCS-3 genes preferably have any one of the base sequences selected from the following (a) to (c): (a) SEQ ID NOS: 1 and 3 , 5, 7 or 9; (b) one or more nucleotides are substituted, deleted, inserted and / or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9; (C) a nucleotide sequence encoding a protein having a function equivalent to that of SOCS-1, SOCS-2 and SOCS-3; (c) represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9 A base sequence that encodes a protein that hybridizes with a DNA comprising a base sequence under stringent conditions and has a function equivalent to SOCS-1, SOCS-2, and SOCS-3. In addition, SOCS-1, SOCS-2 and SOCS-3 are any one protein selected from the following (a) to (c): (a) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10 (B) an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by 2, 4, 6, 8 or 10; A protein having a function equivalent to SOCS-1, SOCS-2 and SOCS-3; (c) 40% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10 And a protein having a function equivalent to SOCS-1, SOCS-2 and SOCS-3. A protein having a function equivalent to SOCS-1, SOCS-2, and SOCS-3 means a protein that acts as a suppressor molecule for cytokine signal transduction in the Jak / STAT system.
SOCSおよびSOCS遺伝子はヒト由来のものが好ましいが、これらに限定されるものではなく、ヒト以外の、ラット、マウス、ハムスター、ウマ、ウシなどの他の動物のものをも含む。SOCS-1およびSOCS-1遺伝子としては、たとえば、GenBank Accession No. NP_003736（配列番号２）に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、GenBank Accession No. NM_003745（配列番号１）に記載の塩基配列を有する核酸が挙げられる。SOCS-2およびSOCS-2遺伝子としては、たとえば、GenBank Accession No.NP_003868（配列番号４）に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、GenBank Accession No. NM_003877（配列番号３）に記載の塩基配列を有する核酸が挙げられる。SOCS-3およびSOCS-3遺伝子としては、たとえばGenBank Accession No. NP_003946（配列番号６）、NP_031733（配列番号８）、NP_446017（配列番号１０）に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、GenBank Accession No.NM_003955（配列番号５）、NM_007707（配列番号７）、NM_053565（配列番号９）に記載の塩基配列を有する核酸が挙げられる。 The SOCS and SOCS genes are preferably derived from humans, but are not limited thereto, and include those of other animals such as rats, mice, hamsters, horses, cows, and the like other than humans. Examples of SOCS-1 and SOCS-1 genes include a protein having the amino acid sequence described in GenBank Accession No. NP_003736 (SEQ ID NO: 2), and a nucleic acid having the base sequence described in GenBank Accession No. NM_003745 (SEQ ID NO: 1). Is mentioned. Examples of SOCS-2 and SOCS-2 genes include a protein having the amino acid sequence described in GenBank Accession No. NP_003868 (SEQ ID NO: 4), and a nucleic acid having the base sequence described in GenBank Accession No. NM_003877 (SEQ ID NO: 3). Is mentioned. SOCS-3 and SOCS-3 genes include, for example, GenBank Accession No. NP_003946 (SEQ ID NO: 6), NP_031733 (SEQ ID NO: 8), NP_446017 (SEQ ID NO: 10), a protein having the amino acid sequence, GenBank Accession No. NM_003955 Examples include nucleic acids having the base sequences described in (SEQ ID NO: 5), NM_007707 (SEQ ID NO: 7), and NM_053565 (SEQ ID NO: 9).
ベクターとしては、例えばプラスミドベクター、その他のnaked DNA、ウイルスベクターが挙げられるが、ウイルスベクターを用いることが好ましい。ウイルスベクターとしては、例えばアデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、エプスタイン-バーウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、マイナス鎖RNAウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、パピローマウイルスベクターなどが挙げられる（Soifer, H. et al., 2001, Hum. Gene Ther. 12: 1417-1428; Kay, M. et al., 2001, Nat. Med. 7: 33-40）。これらのウイルスベクターは、当業者の公知の方法により調製することが可能である。ウイルスベクターは、それぞれの種類に応じて、遠心分離等により精製することができる。 Examples of the vector include a plasmid vector, other naked DNA, and a viral vector, and it is preferable to use a viral vector. Examples of viral vectors include adenovirus vectors, vaccinia virus vectors, Epstein-Barr virus vectors, baculovirus vectors, herpes virus vectors, minus-strand RNA virus vectors, Sindbis virus vectors, papilloma virus vectors, and the like (Soifer, H et al., 2001, Hum. Gene Ther. 12: 1417-1428; Kay, M. et al., 2001, Nat. Med. 7: 33-40). These viral vectors can be prepared by methods known to those skilled in the art. Viral vectors can be purified by centrifugation or the like depending on the type.
特に好ましいウイルスベクターの１つはアデノウイルスベクターである。本発明において、アデノウイルスベクターは適宜公知のベクターを用いることができ、in vivoまたはin vitroでDNAやRNAなどの核酸配列を種々のタイプの細胞へ導入するビヒクルとしての機能を達成しうるものであれば良い。本発明におけるアデノウイルスベクターは、例えば外来遺伝子発現の向上のため、または抗原性の減弱などのために野生型ウイルスの遺伝子が改変されていてよい。アデノウイルスベクターとして、例えば、ヒトを宿主とする2型、5型、11型、35型の各アデノウイルスベクター、ヒト以外を宿主とするサルアデノウイルスベクター、チンパンジーアデノウイルスベクター、マウスアデノウイルスベクター、イヌアデノウイルスベクター、ヒツジアデノウイルスベクターおよびトリアデノウイルスベクターなどが挙げられる。アデノウイルスベクターは、特定の細胞でのみ増殖するもの、例えば、E1欠損型アデノウイルスベクターや制限増殖型アデノウイルスベクターであってもよい。E1欠損型アデノウイルスベクターは、293細胞（細胞内にE1を有する）でのみ繁殖することができ、制限増殖型アデノウイルスベクターは、例えば特定の癌細胞でのみ増殖することができる。 One particularly preferred viral vector is an adenoviral vector. In the present invention, a known vector can be used as appropriate as an adenovirus vector, and it can achieve a function as a vehicle for introducing a nucleic acid sequence such as DNA or RNA into various types of cells in vivo or in vitro. I just need it. In the adenoviral vector of the present invention, the wild-type viral gene may be modified, for example, to improve foreign gene expression or to reduce antigenicity. As an adenovirus vector, for example, each of adenovirus vectors of type 2, 5, 11, and 35 having a human host, a simian adenovirus vector having a non-human host, a chimpanzee adenovirus vector, a mouse adenovirus vector, Examples include canine adenovirus vectors, sheep adenovirus vectors, and avian adenovirus vectors. The adenovirus vector may be one that grows only in specific cells, for example, an E1-deficient adenovirus vector or a restricted propagation adenovirus vector. The E1-deficient adenovirus vector can be propagated only in 293 cells (having E1 in the cell), and the restricted growth adenovirus vector can be propagated only in, for example, specific cancer cells.
上記ベクターには適宜プロモーターを搭載することができる。例えば、サイトメガロウイルス (CMV) プロモーターは入手可能な最も強力な転写制御配列の１つであり、CMVプロモーターを含むベクターは臨床の遺伝子治療にも広く用いられている (Foecking, M.K, and Hofstetter H. Gene 1986; 45: 101-105)。また、CMV immediately early エンハンサーおよびニワトリβアクチンプロモーターを含むキメラプロモーターであるCAGプロモーター (Niwa, H. et al. (1991) Gene. 108: 193-199) は、CMVプロモーター以上に強い発現が可能であり好適に用いられる。 The above vector can be appropriately loaded with a promoter. For example, the cytomegalovirus (CMV) promoter is one of the strongest transcriptional control sequences available, and vectors containing the CMV promoter are widely used in clinical gene therapy (Foecking, MK, and Hofstetter H Gene 1986; 45: 101-105). The CAG promoter (Niwa, H. et al. (1991) Gene. 108: 193-199), a chimeric promoter including the CMV immediately early enhancer and the chicken β-actin promoter, can be expressed more strongly than the CMV promoter. Preferably used.
本発明のベクターは、適宜公知の方法によって作製することができる。１または複数の制限酵素の認識配列を各々制限酵素で消化し、ベクターに導入する外来遺伝子を、シャトルベクターを介して、またはシャトルベクターを介することなく、インビトロライゲーションにより導入することができる。アデノウイルスベクターの作製方法は、例えば斎藤らにより開発されたCOS-TPC法 (Miyake, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1320-1324 (1996)) を用いることができる。また、種々の改変型アデノウイルスベクターの作製方法が知られている（H. Mizuguchi et al., Hum. Gene Ther., 9, 2577-2583 (1998); H. Mizuguchi et al., Hum. Gene Ther., 10, 2013-2017 (1999); H. Mizuguchi et al., Gene Ther., 8, 730-735 (2001); H. Mizuguchi, T. Hayakawa. Gene, 285, 69-77 (2002); H. Mizuguchi, T. Hayakawa. Cancer Gene Ther., 9, 236-242 (2002); H. Mizuguchi et al., Gene Ther., 9, 769-776 (2002); H. Mizuguchi et al., BioTechniques, 30, 1112-1116 (2001); H. Mizuguchi et al., J. Gene Med., 4, 240-247 (2002)）。アデノウイルス作製サービスは商業的にも提供されている（例えばBDバイオサイエンス・クロンテック社、Avior Therapeutics社等）。 The vector of the present invention can be appropriately produced by a known method. A foreign gene to be introduced into a vector can be introduced by in vitro ligation via a shuttle vector or without a shuttle vector by digesting the recognition sequence of one or more restriction enzymes with a restriction enzyme. As a method for producing an adenovirus vector, for example, the COS-TPC method (Miyake, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1320-1324 (1996)) developed by Saito et al. Can be used. In addition, various modified adenoviral vector production methods are known (H. Mizuguchi et al., Hum. Gene Ther., 9, 2577-2583 (1998); H. Mizuguchi et al., Hum. Gene Ther., 10, 2013-2017 (1999); H. Mizuguchi et al., Gene Ther., 8, 730-735 (2001); H. Mizuguchi, T. Hayakawa. Gene, 285, 69-77 (2002) ; H. Mizuguchi, T. Hayakawa. Cancer Gene Ther., 9, 236-242 (2002); H. Mizuguchi et al., Gene Ther., 9, 769-776 (2002); H. Mizuguchi et al., BioTechniques, 30, 1112-1116 (2001); H. Mizuguchi et al., J. Gene Med., 4, 240-247 (2002)). Adenovirus production services are also provided commercially (for example, BD Biosciences Clontech, Avior Therapeutics, etc.).
本発明のベクター、例えばアデノウイルスベクターは以下の工程を含む製造方法により作製することができる。
１）SOCS遺伝子の非翻訳領域に、適当なプロモーター配列を含む発現コンストラクトを構築する工程；
２）上記１）の発現コンストラクトを含むシャトルベクターを構築する工程；
３）アデノウイルスゲノムを準備する工程；
４）アデノウイルスゲノムを制限酵素で切断し、２）で作製した遺伝子発現シャトルベクターをアデノウイルスゲノムにライゲーションする工程。
The vector of the present invention, such as an adenovirus vector, can be produced by a production method including the following steps.
1) A step of constructing an expression construct containing an appropriate promoter sequence in the untranslated region of the SOCS gene;
2) constructing a shuttle vector containing the expression construct of 1) above;
3) preparing an adenovirus genome;
4) cleaving the adenovirus genome with a restriction enzyme and ligating the gene expression shuttle vector prepared in 2) to the adenovirus genome.
本発明の抗癌剤の対象となる癌は、例えば、中皮腫、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌、膵臓癌、胃癌、乳癌、肺癌、頭頚部癌、神経膠芽腫、白血病、リンパ腫または多発性骨髄腫であり、好適には中皮腫が挙げられ、特に悪性胸膜中皮腫が挙げられる。 Examples of the cancer that is the target of the anticancer agent of the present invention include mesothelioma, prostate cancer, kidney cancer, hepatocellular carcinoma, pancreatic cancer, gastric cancer, breast cancer, lung cancer, head and neck cancer, glioblastoma, leukemia, lymphoma, or multiple Malignant myeloma, preferably mesothelioma, particularly malignant pleural mesothelioma.
また、本発明の抗癌剤の対象となる癌は、細胞内でJak1および／またはSTAT3が持続的に活性化しているものであることが好ましい。STAT（Signal Transducer and Activator for Transcription）は、リガンド依存的にJakファミリーメンバーによってリン酸化され、核内に移行し、標的遺伝子の転写を活性化する公知の転写因子である。STATの活性化とは、STATがリン酸化され、核内へ移行し、標的遺伝子の転写を活性化することを示す。STATとしては、現在、STAT1〜STAT6がクローニングされており、そのうちの１つがSTAT3である。STAT3は、幾つかのヒトの腫瘍および腫瘍細胞系において持続的に活性化されていると考えられている。STAT3の活性化にはリン酸化チロシン残基を介するSTAT3の二量体形成が必要であり、この二量体形成にはチロシンのリン酸化が必要である。 Moreover, it is preferable that the cancer that is the target of the anticancer agent of the present invention is one in which Jak1 and / or STAT3 are continuously activated in the cells. STAT (Signal Transducer and Activator for Transcription) is a known transcription factor that is phosphorylated by a Jak family member in a ligand-dependent manner, moves into the nucleus, and activates transcription of a target gene. The activation of STAT means that STAT is phosphorylated, translocates into the nucleus, and activates transcription of the target gene. Currently, STAT1 to STAT6 have been cloned as STAT, one of which is STAT3. STAT3 is thought to be persistently activated in several human tumors and tumor cell lines. Activation of STAT3 requires dimer formation of STAT3 through phosphorylated tyrosine residues, and this dimer formation requires tyrosine phosphorylation.
STAT3が持続的に活性化している癌は、癌由来の細胞からタンパク質を抽出し、抽出したタンパク質について抗チロシンリン酸化STAT3抗体によるウェスタンブロット法を用いて選別することができる。例えば抗チロシンリン酸化STAT3抗体はcell signaling technology社から入手することができ、ウェスタンブロット法は公知の手法に従って行えばよい。
また、STAT3の活性化はサイトカインによるものであることが知られている。したがって、STAT3の活性化の働きを担うサイトカインの分泌量を、癌由来細胞について確認することによっても、STAT3を持続的に活性化している癌を特定することが可能である。サイトカインの例としては、IL-6または、gp130をコレセプターとするOncostatin M、LIFもしくはLeptinなどが挙げられる。IL-6の濃度を測定する方法としては、ELISA法を用いて測定すればよい。IL-6濃度測定のためのELISA法は、Quantikine colorimetric sandwich ELISA（R&D Systems社）を用いて行うことができる。
Cancers in which STAT3 is continuously activated can be selected by extracting proteins from cancer-derived cells and using Western blotting with anti-tyrosine phosphorylated STAT3 antibodies. For example, an anti-tyrosine phosphorylated STAT3 antibody can be obtained from cell signaling technology, and the Western blot method may be performed according to a known method.
In addition, it is known that the activation of STAT3 is due to cytokines. Therefore, it is possible to identify a cancer in which STAT3 is continuously activated by confirming the secretion amount of cytokine responsible for STAT3 activation in cancer-derived cells. Examples of cytokines include Oncostatin M, LIF, or Leptin with IL-6 or gp130 as a co-receptor. What is necessary is just to measure using the ELISA method as a method of measuring the density | concentration of IL-6. The ELISA method for measuring IL-6 concentration can be performed using Quantikine colorimetric sandwich ELISA (R & D Systems).
Jak1が持続的に活性化している癌は、癌由来の細胞からタンパク質を抽出し、抽出したタンパク質について抗Jak1抗体を用いて免疫沈降法を行い、リン酸化Jak1を抗リン酸化チロシン抗体を用いて検出することにより、選別することができる。例えば、抗Jak1抗体はBD Transduction laboratories社から、抗リン酸化チロシン抗体はclone 4G10をUpstate社から入手することができ、ウェスタンブロット法は公知の手法に従って行えばよい。 For cancers in which Jak1 is continuously activated, protein is extracted from cancer-derived cells, and the extracted protein is subjected to immunoprecipitation using an anti-Jak1 antibody, and phosphorylated Jak1 is purified using an anti-phosphotyrosine antibody. By detecting, it can sort. For example, anti-Jak1 antibody can be obtained from BD Transduction laboratories, and anti-phosphotyrosine antibody clone 4G10 can be obtained from Upstate. Western blotting can be performed according to a known technique.
本発明の抗癌剤は、通常、それ自体公知の薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、その他の添加剤、具体的には水、植物油、エタノール又はベンジルアルコールのようなアルコール、ポリエチレングリコール、グリセロールトリアゼテートゼラチン、ラクトース、デンプン等のような炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ワセリン等と混合して錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、注射剤、液剤、懸濁剤等の形態により経口又は非経口的に投与することができる。本発明の抗癌剤の投与経路は特に制限されるものではないが、胸腔内投与が好ましい。 The anticancer agent of the present invention is usually a pharmacologically acceptable carrier, excipient, diluent, extender, disintegrant, stabilizer, preservative, buffer, emulsifier, fragrance, colorant known per se. , Sweeteners, thickeners, flavoring agents, solubilizers, other additives, specifically water, vegetable oils, alcohols such as ethanol or benzyl alcohol, polyethylene glycol, glycerol triazetate gelatin, lactose, starch, etc. Orally or parenterally in the form of tablets, capsules, elixirs, microcapsules, injections, solutions, suspensions, etc., mixed with carbohydrates such as magnesium stearate, talc, petrolatum, etc. Can do. The administration route of the anticancer agent of the present invention is not particularly limited, but intrathoracic administration is preferable.
また、本発明の抗癌剤は、ヒト用医薬としての使用は勿論、他の哺乳動物用医薬としても使用可能である。投与量は疾患の種類及び程度、投与する有効成分並びに投与経路、患者の年齢、性別、体重等により変わりうるが、注射剤の形での投与の場合、通常、成人1日当たり、約1×105から1×1012 pfu、好ましくは約1×109から1×1011 pfuを投与する。また、本発明の抗癌剤は上記各種癌の予防、治療の為に単独で投与する以外に、各種癌の予防、治療に有用な別の薬剤と併用することもできる。 Further, the anticancer agent of the present invention can be used not only as a pharmaceutical for humans but also as a pharmaceutical for other mammals. The dosage may vary depending on the type and extent of the disease, the active ingredient to be administered and the administration route, the age, sex, weight, etc. of the patient, but in the case of administration in the form of an injection, usually about 1 × 10 per adult Administer 5 to 1 × 10 12 pfu, preferably about 1 × 10 9 to 1 × 10 11 pfu. Moreover, the anticancer agent of the present invention can be used in combination with another drug useful for the prevention and treatment of various cancers, in addition to administration alone for the prevention and treatment of the above various cancers.
さらに本発明は、SOCSを活性化し、かつJak1の活性化を抑制する物質を、被検物質から選択することを含む、抗癌剤のスクリーニング方法にも及ぶ。本発明のスクリーニング方法は、具体的には、癌細胞を被検物質の存在下で培養する工程、被検物質の非存在下と比較して、被検物質の存在下でSOCSが活性化され、かつJak1の活性化が抑制されている場合に、当該被検物質を選択する工程；を含む方法である。当該被検物質は、抗癌剤として選択することができる。 Furthermore, the present invention extends to a method for screening an anticancer agent, comprising selecting from a test substance a substance that activates SOCS and suppresses Jak1 activation. Specifically, in the screening method of the present invention, SOCS is activated in the presence of a test substance, compared to the step of culturing cancer cells in the presence of the test substance, in the absence of the test substance. And the step of selecting the test substance when the activation of Jak1 is suppressed. The test substance can be selected as an anticancer agent.
本スクリーニング方法において、細胞の培養はそれ自体公知の方法によって行えばよい。癌細胞は悪性胸膜中皮腫細胞株H226を使用すればよく、SOCSの活性化およびJak1の活性化抑制の確認は、抗SOCS抗体および抗Jak1抗体などを用いてウェスタンブロット等を行い、タンパク質量やリン酸化の程度を確認するなどして行うことができる。抗SOCS抗体としては抗SOCS-3抗体を用いることができ、抗SOCS-3抗体は、IBL社から入手することができる。 In this screening method, the cells may be cultured by a method known per se. The cancer cell may be the malignant pleural mesothelioma cell line H226. Confirmation of activation of SOCS and inhibition of Jak1 activation is performed by Western blot etc. using anti-SOCS antibody and anti-Jak1 antibody, etc. Or by confirming the degree of phosphorylation. An anti-SOCS-3 antibody can be used as the anti-SOCS antibody, and the anti-SOCS-3 antibody can be obtained from IBL.
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention, this invention is not limited to these.
（実施例１）
（１）IL-6自己分泌
各種細胞株（悪性胸膜中皮腫細胞株H28、H226、H2052、H2452；肺癌細胞株A549）を0.5% FBS含有RPMI培地にて24時間培養し、細胞上清中のIL-6濃度をELISA法にて測定した。ELISA法は、Quantikine colorimetric sandwich ELISA（R&D Systems社）を用いた。
(Example 1)
(1) IL-6 autocrine Various cell lines (malignant pleural mesothelioma cell lines H28, H226, H2052, H2452; lung cancer cell line A549) were cultured in 0.5% FBS-containing RPMI medium for 24 hours, and in the cell supernatant The IL-6 concentration was measured by ELISA. The ELISA method used was a Quantikine colorimetric sandwich ELISA (R & D Systems).
結果を図１（ａ）に示す。細胞株H226において最もIL-6濃度が高値であった。 The results are shown in FIG. IL-6 concentration was the highest in cell line H226.
（２）IL-6刺激によるSTAT3およびJak1の活性化
細胞株H226を0.5% FBS含有RPMI培地にて24時間培養した後に、100ng/ml IL-6およびsIL-6R（可溶性IL-6R受容体）を加え、37℃で10分間刺激した。なお、可溶性IL-6受容体は、IL-6刺激を効率よく与えるためのタンパク質であり、特にIL-6受容体の発現の低い細胞に対してIL-6と同時に添加することで効果的にIL-6刺激を与えることができる。細胞からタンパク質を抽出しリン酸化STAT3およびリン酸化Jak1について、抗チロシンリン酸化STAT3抗体（cell signaling technology社製）、抗STAT3抗体（santa cruz biotechnology社製）、抗GAPDH抗体（santa cruz biotechnology社製）を用いてウェスタンブロット法を行った。Jak1については、細胞より抽出したタンパク質に対して抗Jak1抗体（BD Transduction laboratories社製）を用いて免疫沈降法を行い、リン酸化Jak1は抗リン酸化チロシン抗体clone 4G10（Upstate社）を、Jak1は抗Jak1抗体を用いてウェスタンブロット法にて検出した。
(2) Activation of STAT3 and Jak1 by IL-6 stimulation After culturing cell line H226 in RPMI medium containing 0.5% FBS for 24 hours, 100 ng / ml IL-6 and sIL-6R (soluble IL-6R receptor) And stimulated at 37 ° C. for 10 minutes. Soluble IL-6 receptor is a protein that efficiently provides IL-6 stimulation, and is effective when added simultaneously with IL-6, especially for cells with low IL-6 receptor expression. IL-6 stimulation can be given. Proteins are extracted from cells and phosphorylated STAT3 and phosphorylated Jak1 with anti-tyrosine phosphorylated STAT3 antibody (manufactured by cell signaling technology), anti-STAT3 antibody (manufactured by santa cruz biotechnology), anti-GAPDH antibody (manufactured by santa cruz biotechnology) Was used for Western blotting. For Jak1, immunoprecipitation was performed on the protein extracted from the cells using an anti-Jak1 antibody (BD Transduction laboratories). Phosphorylated Jak1 was an anti-phosphotyrosine antibody clone 4G10 (Upstate). Detection was performed by Western blotting using an anti-Jak1 antibody.
結果を図１（ｂ）に示す。コントロール（IL-6刺激なし）と比べてリン酸化STAT3およびリン酸化Jak1の亢進がみられた。また、IL-6刺激なしでもSTAT3のリン酸化がみられ、細胞株H226では、STAT3が持続的に活性化していると考えられた。 The results are shown in FIG. Increased phosphorylated STAT3 and phosphorylated Jak1 were observed compared to controls (no IL-6 stimulation). Moreover, phosphorylation of STAT3 was observed even without IL-6 stimulation, and STAT3 was considered to be continuously activated in cell line H226.
（実施例２）AdSOCS3の作製
アデノウイルスベクターとして、CAGプロモーターにてLacZ、SOCS3を発現するAdLacZ（コントロール）、AdSOCS3を、一般的な方法で作製した。SOCS-3遺伝子として、GenBank Accession No.NM_003955（配列番号５）に記載の配列からなる核酸を使用し、アデノウイルスベクターとしてヒト5型アデノウイルスベクターを使用した。
(Example 2) Preparation of AdSOCS3 As an adenovirus vector, AdLacZ (control) and AdSOCS3 expressing LacZ and SOCS3 with a CAG promoter were prepared by a general method. A nucleic acid consisting of the sequence described in GenBank Accession No. NM — 003955 (SEQ ID NO: 5) was used as the SOCS-3 gene, and a human type 5 adenovirus vector was used as the adenovirus vector.
（実施例３）
（１）AdSOCS3による細胞増殖抑制効果
細胞株H226を10% FBS含有RPMI培地にて24時間培養した後にJak inhibitor1（低分子JAK2阻害剤）（Calbiochem社製）、DMSO、AdSOCS3、AdLacZを加え、72時間後にMTTアッセイを行った。Jak inhibitor1（低分子JAK2阻害剤）を0.25、1、4μM、DMSOは0.1%で、AdSOCS3、AdLacZは、MOI 10、40、160で添加した。MTTアッセイは、生細胞数測定のため生細胞数測定試薬(nacalai tesque社)を用いた。
(Example 3)
(1) Cell growth inhibitory effect by AdSOCS3 After culturing cell line H226 in RPMI medium containing 10% FBS for 24 hours, Jak inhibitor1 (low molecular weight JAK2 inhibitor) (Calbiochem), DMSO, AdSOCS3, AdLacZ were added. MTT assay was performed after time. Jak inhibitor 1 (low molecular JAK2 inhibitor) was added at 0.25, 1, 4 μM, DMSO at 0.1%, and AdSOCS3, AdLacZ at MOI 10, 40, 160. In the MTT assay, a reagent for measuring the number of living cells (nacalai tesque) was used for measuring the number of living cells.
結果を図２に示す。Jak inhibitor1と比較してAdSOCS3による細胞増殖抑制効果が認められた。 The results are shown in FIG. Compared with Jak inhibitor1, AdSOCS3 showed a cell growth inhibitory effect.
（２）AdSOCS3によるアポトーシス誘導
細胞株H226を10% FBS含有RPMI培地にて24時間培養した後にMOI 40のAdSOCS3、AdLacZを加え、72時間後にAnnexin V-PE Apoptosis Detection Kit I(BD Biosciences社)を用いてFACS解析を行った。また、細胞から抽出したタンパク質に対してcleaved caspase-3およびSOCS-3の発現を、抗cleaved caspase-3抗体（cell signaling technology 社製）および抗SOCS-3抗体（IBL社製）を用いてウェスタンブロット法で調べた。
(2) Induction of apoptosis by AdSOCS3 After culturing cell line H226 in RPMI medium containing 10% FBS for 24 hours, add MOI 40 AdSOCS3 and AdLacZ, and 72 hours later, Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences) FACS analysis was performed. In addition, expression of cleaved caspase-3 and SOCS-3 on proteins extracted from cells was performed using anti-cleaved caspase-3 antibody (cell signaling technology) and anti-SOCS-3 antibody (IBL). The blot method was used.
結果を図３に示す。図３（ａ）はFACS解析の結果を示す。AdSOCS3によるアポトーシスの誘導が認められた。また、cleaved caspase-3の発現をウェスタンブロットで調べた結果（図３（ｂ））、AdSOCS3によるcleaved caspase-3の発現の誘導が認められた。 The results are shown in FIG. FIG. 3A shows the result of FACS analysis. Induction of apoptosis by AdSOCS3 was observed. Further, as a result of examining the expression of cleaved caspase-3 by Western blot (FIG. 3B), induction of cleaved caspase-3 expression by AdSOCS3 was observed.
（３）AdSOCS3による細胞周期制御
細胞株H226を10% FBS含有RPMI培地にて24時間培養した後にMOI 40のAdSOCS3、AdLacZを加え、24時間後にCycle TESTTM PLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson社)を用いてFACS解析を行った。
(3) Cell cycle control by AdSOCS3 After culturing cell line H226 in RPMI medium containing 10% FBS for 24 hours, add AdSOCS3 and AdLacZ of MOI 40, and use Cycle TESTTM PLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson) 24 hours later FACS analysis was performed.
結果を図４に示す。図４（ａ）はFACS解析の結果を示し、図４（ｂ）はFACS解析の結果に基づいて算出した各細胞周期に属する細胞の割合を示す図である。AdSOCS3によるG0/G1 arrestの誘導が認められた。 The results are shown in FIG. FIG. 4A shows the results of FACS analysis, and FIG. 4B shows the proportion of cells belonging to each cell cycle calculated based on the results of FACS analysis. Induction of G0 / G1 arrest by AdSOCS3 was observed.
（４）AdSOCS3によるリン酸化STAT3およびリン酸化Jak1の制御
細胞株H226を0.5% FBS含有RPMI培地にて24時間培養した後に、Jak inhibitor1（低分子JAK2阻害剤）、DMSO、AdSOCS3、AdLacZを加えた。Jak inhibitor1（低分子JAK2阻害剤）1μM、DMSOは0.1%で、AdSOCS3、AdLacZは、MOI 40で添加した。37℃、24時間後に、細胞より抽出したタンパク質に対してリン酸化STAT3、SOCS-3の発現をウェスタンブロット法で調べた。また、膜画分を抗Jak1抗体にて免疫沈降した後に、抗リン酸化チロシン抗体clone 4G10（Upstate社）を用いてウェスタンブロット法を行った。
(4) Control of phosphorylated STAT3 and phosphorylated Jak1 by AdSOCS3 After culturing cell line H226 in RPMI medium containing 0.5% FBS for 24 hours, Jak inhibitor1 (small molecule JAK2 inhibitor), DMSO, AdSOCS3 and AdLacZ were added. . Jak inhibitor 1 (low molecular JAK2 inhibitor) 1 μM, DMSO was added at 0.1%, and AdSOCS3 and AdLacZ were added at MOI 40. After 24 hours at 37 ° C., the expression of phosphorylated STAT3 and SOCS-3 on the protein extracted from the cells was examined by Western blotting. The membrane fraction was immunoprecipitated with anti-Jak1 antibody, and then Western blotting was performed using anti-phosphotyrosine antibody clone 4G10 (Upstate).
結果を図５に示す。図５（ａ）では、コントロール（刺激なし）と比較してAdSOCS3およびJak inhibitor1によるリン酸化STAT3の抑制がみられた。また図５（ｂ）では、抗Jak1抗体にて免疫沈降した後に抗リン酸化チロシン抗体 clone 4G10で確認した結果を示す。AdSOCS3によるリン酸化Jak1の抑制がみられたが、Jak inhibitor1による抑制はみられなかった。 The results are shown in FIG. In FIG. 5 (a), suppression of phosphorylated STAT3 by AdSOCS3 and Jak inhibitor1 was observed compared to control (no stimulation). FIG. 5 (b) shows the results confirmed with anti-phosphotyrosine antibody clone 4G10 after immunoprecipitation with anti-Jak1 antibody. Inhibition of phosphorylated Jak1 by AdSOCS3 was observed, but inhibition by Jak inhibitor1 was not observed.
（５）AdSOCS3によるリン酸化FAKの制御
細胞株H226を0.5% FBS含有RPMI培地にて24時間培養した後に、AdLacZ+Jak inhibitor1（低分子JAK2阻害剤）、AdLacZ+DMSO、AdLacZ+抗IL-6R抗体、AdSOCS3、AdLacZを加えた。Jak inhibitor1（低分子JAK2阻害剤）1μM、DMSOは0.1%で、抗IL-6R抗体は100μg/mlで、AdSOCS3、AdLacZは、MOI 40で添加した。37℃、72時間後に、細胞より抽出したタンパク質に対して、SOCS-3、リン酸化FAKとFAKを、それぞれ、抗SCOS-3抗体、抗リン酸化FAK抗体と抗FAK抗体を用いてウェスタンブロット法で調べた。
(5) Regulation of phosphorylated FAK by AdSOCS3 After culturing cell line H226 in RPMI medium containing 0.5% FBS for 24 hours, AdLacZ + Jak inhibitor1 (small molecule JAK2 inhibitor), AdLacZ + DMSO, AdLacZ + anti-IL-6R antibody , AdSOCS3 and AdLacZ were added. Jak inhibitor 1 (small molecule JAK2 inhibitor) was added at 1 μM, DMSO was 0.1%, anti-IL-6R antibody was added at 100 μg / ml, and AdSOCS3 and AdLacZ were added at MOI 40. Western blotting method using SOCS-3, phosphorylated FAK and FAK, and anti-SCOS-3 antibody, anti-phosphorylated FAK antibody and anti-FAK antibody, respectively, for proteins extracted from cells after 37 hours at 37 ° C I examined it.
結果を図６に示す。AdSOCS3では他の物質の添加と比較すると、リン酸化FAKの抑制がみられた。 The results are shown in FIG. In AdSOCS3, phosphorylated FAK was suppressed compared to the addition of other substances.
（実施例４）悪性胸膜中皮腫xenograftモデルにおけるAdSOCS3の治療効果
細胞株H226 1×106 cellsを、PBS 75μlおよびマトリゲル(BD Biosciences社)75μlに懸濁し、ICR nu/nuマウスの右胸腔内に注入し、悪性胸膜中皮腫xenograftモデルを作製した。細胞投与後、7日、14日、21日目に、実施例２にて作製したAdSOCS3、AdLacZを5×107 pfuで胸腔内投与し、28日後に胸腔内腫瘍を採取し、総重量を測定した。
(Example 4) Therapeutic effect of AdSOCS3 in malignant pleural mesothelioma xenograft model Cell line H226 1 × 10 6 cells were suspended in 75 μl of PBS and 75 μl of Matrigel (BD Biosciences) in the right thoracic cavity of ICR nu / nu mice. And malignant pleural mesothelioma xenograft model. On days 7, 14, and 21 after cell administration, AdSOCS3 and AdLacZ prepared in Example 2 were intrathoracically administered at 5 × 10 7 pfu, and tumors were collected after 28 days. It was measured.
結果を図７に示す。AdSOCS3投与群の腫瘍重量が有意に低かった（図７（ａ））。また、AdLacZ投与群において腫瘍細胞の結節が認められたが、AdSOCS3投与群では腫瘍がほとんど見られなかった（図７（ｂ）。 The results are shown in FIG. The tumor weight of the AdSOCS3 administration group was significantly low (FIG. 7 (a)). In addition, although nodules of tumor cells were observed in the AdLacZ administration group, almost no tumor was observed in the AdSOCS3 administration group (FIG. 7 (b)).
本発明のSOCS活性化剤を含む抗癌剤によれば、発症の原因にSTAT非依存の経路を含む癌の治療を効果的に行うことができ、有用である。このような癌として悪性胸膜中皮腫が挙げられる。悪性胸膜中皮腫は胸腔内という閉鎖空間でおこる腫瘍であり、本発明のウイルスベクターを用いた腫瘍局所の遺伝子治療が効果を発揮すると考えられ、有用である。 According to the anticancer agent containing the SOCS activator of the present invention, cancer treatment including a STAT-independent pathway as a cause of the onset can be effectively performed, which is useful. Such cancer includes malignant pleural mesothelioma. Malignant pleural mesothelioma is a tumor that occurs in a closed space in the thoracic cavity, and it is thought that gene therapy at the tumor site using the viral vector of the present invention is effective and useful.
Claims (3)
１）SOCS-3遺伝子の非翻訳領域にプロモーター配列を含む発現コンストラクトを構築する工程；
２）上記１）の発現コンストラクトを含む遺伝子発現シャトルベクターを構築する工程；
３）ヒト5型アデノウイルスゲノムを準備する工程；
４）ヒト5型アデノウイルスゲノムを制限酵素で切断し、２）で作製した遺伝子発現シャトルベクターをヒト5型アデノウイルスゲノムにライゲーションする工程。 The manufacturing method of the malignant pleural mesothelioma therapeutic agent of Claim 1 or 2 including the following processes:
1) constructing an expression construct containing a promoter sequence in the untranslated region of the SOCS-3 gene;
2) a step of constructing a gene expression shuttle vector comprising the expression construct of 1) above;
3) preparing a human type 5 adenovirus genome;
4) A step of cleaving the human type 5 adenovirus genome with a restriction enzyme and ligating the gene expression shuttle vector prepared in 2) to the human type 5 adenovirus genome.
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