JP5901827B1 - 有機酸生成の酒酵母株およびそれを用いた清酒の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(F1)配列番号1のアミノ酸配列において、アミノ酸残基Xが、ヒスチジン、リシンまたはアルギニンの塩基性アミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチド
(配列番号1)
FTXYQISGYKRYQVT
前記変異工程が、前記VID24遺伝子における配列番号3の塩基配列で示される部分領域について、塩基NNNを、グリシン残基のコドンから、塩基性アミノ酸残基であるヒスチジン残基、リシン残基またはアルギニン残基のコドンに変異させる工程であることを特徴とする。
(配列番号3)
TTTACANNNTACCAGATATCAGGATACAAACGCTATCAGGTAACA
(配列番号3)
TTTACANNNTACCAGATATCAGGATACAAACGCTATCAGGTAACA
(F1)配列番号1のアミノ酸配列において、アミノ酸残基Xが、ヒスチジン、リシンまたはアルギニンの塩基性アミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチド
(配列番号1)
FTXYQISGYKRYQVT
本発明の有機酸生成の酒酵母株は、前述のように、VID24遺伝子が前記(F1)のペプチドを含む変異VID24タンパク質をコードする変異VID24遺伝子であることを特徴とする。
(F1)配列番号1のアミノ酸配列において、アミノ酸残基Xが、ヒスチジン(H)、リシン(K)またはアルギニン(R)の塩基性アミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチド
(配列番号1)
FTXYQISGYKRYQVT
(F2)配列番号2のアミノ酸配列において、アミノ酸残基Xが、H、KまたはRの塩基性アミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチド
(配列番号2)
MINNPKVDSVAEKPKAVTSKQSEQAASPEPTPAPPVSRNQYPITFNLTSTAPFHLHDRHRYLQEQDLYKCASRDSLSSLQQLAHTPNGSTRKKYIVEDQSPYSSENPVIVTSSYNHTVCTNYLRPRMQFTXYQISGYKRYQVTVNLKTVDLPKKDCTSLSPHLSGFLSIRGLTNQHPEISTYFEAYAVNHKELGFLSSSWKDEPVLNEFKATDQTDLEHWINFPSFRQLFLMSQKNGLNSTDDNGTTNAAKKLPPQQLPTTPSADAGNISRIFSQEKQFDNYLNERFIFMKWKEKFLVPDALLMEGVDGASYDGFYYIVHDQVTGNIQGFYYHQDAEKFQQLELVPSLKNKVESSDCSFEFA
(f1)配列番号3の塩基配列において、塩基NNNが、塩基性アミノ酸残基であるヒスチジン残基、リシン残基またはアルギニン残基をコードするコドンであるポリヌクレオチド
(配列番号3)
TTTACANNNTACCAGATATCAGGATACAAACGCTATCAGGTAACA
(f2)配列番号4の塩基配列において、塩基NNNが、塩基性アミノ酸残基であるヒスチジン残基、リシン残基またはアルギニン残基をコードするコドンであるポリヌクレオチド
(配列番号4)
ATGATCAATAATCCTAAGGTAGACAGTGTAGCGGAGAAACCCAAAGCTGTGACATCAAAGCAGTCGGAGCAAGCGGCTTCGCCAGAACCAACACCAGCCCCCCCTGTTTCTAGAAATCAGTATCCGATCACGTTCAACTTGACTTCAACCGCACCCTTTCATCTTCATGACCGTCATCGCTACTTACAAGAGCAAGATCTTTACAAGTGCGCTTCTAGGGATTCGTTGTCTTCCCTGCAGCAACTCGCCCATACACCTAATGGGTCGACAAGGAAGAAATATATTGTTGAGGACCAATCTCCCTATAGTTCGGAAAATCCAGTCATTGTGACCTCTTCCTATAACCATACGGTTTGCACAAACTACTTAAGACCAAGAATGCAGTTTACANNNTACCAGATATCAGGATACAAACGCTATCAGGTAACAGTTAACTTAAAGACTGTAGATTTGCCAAAGAAAGATTGCACGTCGCTGTCCCCTCATTTATCTGGATTTTTGTCGATAAGAGGACTCACGAACCAACACCCGGAAATCAGTACATATTTTGAAGCCTACGCGGTAAACCACAAGGAATTAGGGTTCTTGTCCTCTAGTTGGAAAGATGAACCTGTTTTAAACGAATTCAAAGCCACAGACCAAACAGACTTAGAACACTGGATAAATTTCCCCTCCTTTAGACAGCTTTTCCTGATGAGCCAAAAAAACGGTCTCAACTCAACTGACGACAATGGCACTACAAATGCAGCCAAGAAGTTGCCTCCACAGCAGCTTCCTACTACACCAAGCGCAGACGCTGGTAACATATCAAGAATTTTTAGCCAAGAGAAACAATTTGACAACTACTTGAACGAACGGTTTATATTTATGAAATGGAAGGAAAAATTTTTGGTACCAGATGCCCTATTAATGGAAGGTGTAGACGGCGCATCTTATGATGGGTTTTATTACATTGTCCATGATCAAGTTACCGGGAACATTCAAGGGTTTTACTATCATCAAGATGCTGAAAAGTTCCAACAGCTGGAATTAGTACCATCTTTGAAAAATAAAGTCGAGTCCAGTGATTGTTCTTTTGAGTTTGCTTGA
本発明の清酒の製造方法は、前記本発明の有機酸生成の酒酵母株を用いることを特徴とする。
本発明の有機酸生成の酒酵母株の製造方法は、前述のように、酒酵母株について、そのVID24遺伝子を変異VID24遺伝子に変異させる変異工程を含み、
前記変異工程が、前記VID24遺伝子における配列番号3の塩基配列で示される部分領域について、塩基NNNを、グリシン残基のコドンから、塩基性アミノ酸残基であるヒスチジン残基、リシン残基またはアルギニン残基のコドンに変異させる工程であることを特徴とする。
(配列番号3)
TTTACANNNTACCAGATATCAGGATACAAACGCTATCAGGTAACA
本発明の有機酸生成の酒酵母株のスクリーニング方法は、酵母株を、生存率5〜25%となるように変異原を用いて処理する変異工程と、
前記変異処理後の酵母株から、下記条件(1)および(2)を満たす酵母株を、有機酸生成の酒酵母株として選択する選択工程とを含むことを特徴とする。
(1)変異原を用いて処理する前と比較して、アルコール生成量が0.9倍〜1.2倍である。
(2)変異原を用いて処理する前と比較して、リンゴ酸生成量が1.7倍〜3倍であり、かつ、コハク酸生成量が1.2倍〜1.6倍である。
培地:YPD寒天培地、YPD培地に相当する栄養源豊富な培地、YM寒天培地(独立行政法人製品評価技術基盤機構推奨培地、http://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/cultures/cultures.html:平成27年7月14日付)
培養温度:30℃前後(例えば、25℃±7℃)
培養時間:数日間(例えば、1〜10日間)
培養方法:静置培養
生存率の調整方法:EMS処理中に、前記混合液から数分ごとにサンプリングし、前記条件で培養を行い、目的となる生存率のものを選択する。
本発明の変異VID24遺伝子は、VID24遺伝子における配列番号3の塩基配列で示される部分領域において、塩基NNNが、塩基性アミノ酸残基であるヒスチジン残基、リシン残基またはアルギニン残基のコドンであることを特徴とする。
(配列番号3)
TTTACANNNTACCAGATATCAGGATACAAACGCTATCAGGTAACA
(配列番号4)
ATGATCAATAATCCTAAGGTAGACAGTGTAGCGGAGAAACCCAAAGCTGTGACATCAAAGCAGTCGGAGCAAGCGGCTTCGCCAGAACCAACACCAGCCCCCCCTGTTTCTAGAAATCAGTATCCGATCACGTTCAACTTGACTTCAACCGCACCCTTTCATCTTCATGACCGTCATCGCTACTTACAAGAGCAAGATCTTTACAAGTGCGCTTCTAGGGATTCGTTGTCTTCCCTGCAGCAACTCGCCCATACACCTAATGGGTCGACAAGGAAGAAATATATTGTTGAGGACCAATCTCCCTATAGTTCGGAAAATCCAGTCATTGTGACCTCTTCCTATAACCATACGGTTTGCACAAACTACTTAAGACCAAGAATGCAGTTTACANNNTACCAGATATCAGGATACAAACGCTATCAGGTAACAGTTAACTTAAAGACTGTAGATTTGCCAAAGAAAGATTGCACGTCGCTGTCCCCTCATTTATCTGGATTTTTGTCGATAAGAGGACTCACGAACCAACACCCGGAAATCAGTACATATTTTGAAGCCTACGCGGTAAACCACAAGGAATTAGGGTTCTTGTCCTCTAGTTGGAAAGATGAACCTGTTTTAAACGAATTCAAAGCCACAGACCAAACAGACTTAGAACACTGGATAAATTTCCCCTCCTTTAGACAGCTTTTCCTGATGAGCCAAAAAAACGGTCTCAACTCAACTGACGACAATGGCACTACAAATGCAGCCAAGAAGTTGCCTCCACAGCAGCTTCCTACTACACCAAGCGCAGACGCTGGTAACATATCAAGAATTTTTAGCCAAGAGAAACAATTTGACAACTACTTGAACGAACGGTTTATATTTATGAAATGGAAGGAAAAATTTTTGGTACCAGATGCCCTATTAATGGAAGGTGTAGACGGCGCATCTTATGATGGGTTTTATTACATTGTCCATGATCAAGTTACCGGGAACATTCAAGGGTTTTACTATCATCAAGATGCTGAAAAGTTCCAACAGCTGGAATTAGTACCATCTTTGAAAAATAAAGTCGAGTCCAGTGATTGTTCTTTTGAGTTTGCTTGA
本発明の変異VID24タンパク質は、VID24タンパク質における配列番号1のアミノ酸配列で示される部分領域において、アミノ酸残基Xが、塩基性アミノ酸残基であるヒスチジン残基、リシン残基またはアルギニン残基であることを特徴とする。
(F1)配列番号1のアミノ酸配列において、アミノ酸残基Xが、ヒスチジン、リシンまたはアルギニンの塩基性アミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチド
(配列番号1)
FTXYQISGYKRYQVT
(F2)配列番号2のアミノ酸配列において、アミノ酸残基Xが、ヒスチジン、リシンまたはアルギニンの塩基性アミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチド
(配列番号2)
MINNPKVDSVAEKPKAVTSKQSEQAASPEPTPAPPVSRNQYPITFNLTSTAPFHLHDRHRYLQEQDLYKCASRDSLSSLQQLAHTPNGSTRKKYIVEDQSPYSSENPVIVTSSYNHTVCTNYLRPRMQFTXYQISGYKRYQVTVNLKTVDLPKKDCTSLSPHLSGFLSIRGLTNQHPEISTYFEAYAVNHKELGFLSSSWKDEPVLNEFKATDQTDLEHWINFPSFRQLFLMSQKNGLNSTDDNGTTNAAKKLPPQQLPTTPSADAGNISRIFSQEKQFDNYLNERFIFMKWKEKFLVPDALLMEGVDGASYDGFYYIVHDQVTGNIQGFYYHQDAEKFQQLELVPSLKNKVESSDCSFEFA
本発明の有機酸生成の酒酵母株が、親株と比較して、優れた有機酸生成能を有することを確認した。
清酒醸造用酵母K−901を親株として使用した。3重量% EMS含有カリウムリン酸緩衝液にK−901を懸濁し、撹拌しながら30℃で60分間インキュベートして変異処理を施した。前記変異処理後の親株(以下、「変異処理株」という)をYPD寒天培地で生育させたところ、生存率(前記親株の生存率を100%とした場合の相対値)は、約10%であった。前記変異処理株のうち生存した900株を選抜し、小仕込み試験を行い、親株よりも多酸性を示す19株を選抜し、これら19株から、さらに、親株と同程度以上のエタノール生成能を示す8株を選抜した(試験例1)。
K−901Hは、親株と異なり優れた有機酸生成能を有することから、K−901Hについて、この特性に対応する遺伝子変異の解析を行った。その結果、親株のVID24遺伝子に対して、K−901Hは、複数の変異が確認された。そのうちの一つは、配列番号4からなる親株K−901のVID24遺伝子において、NNNがアミノ酸残基GのコドンGGGであるのに対して、配列番号4からなるK−901HのVID24遺伝子は、NNNがアミノ酸残基RのコドンAGG(391番目の塩基GがAに変異)となった点変異の変異VID24遺伝子であることがわかった。
前記実施例1において得られた点変異の前記変異VID24遺伝子を、親株S. cerevisiae 4011(水津、醸協、91、87、1992年)に、遺伝子工学的に導入した。そして、得られた点変異導入株について、発酵試験を行い、エタノール発酵性を損じることなく、有機酸を前記親株よりも向上させることを確認した。
前記親株S. cerevisiae 4011から、一倍体4011a(MATa)を分離し、これにウラシル要求性を付与し、これを宿主GX−11として使用した。前記宿主は、URA3遺伝子について、46番目のアミノ酸残基が終始コドン(アンバーコドン)となっていることを確認済みである。
前記宿主および前記K−901H型の点変異導入株について、前記実施例1と同様にして、エタノール生成能および有機酸生成能等を測定した。その結果、前記点変異導入株は、アルコール生成量(エタノール生成量)に関しては、宿主GX−11の約1.02倍であり、前記宿主と同等のアルコール生成量を維持しており、エタノール発酵性を損じていないことが確認できた。また、前記点変異導入株は、リンゴ酸生成量に関しては、前記宿主の約3.75倍であり、コハク酸生成量に関しては、前記宿主の約1.95倍であり、有機酸生成を宿主よりも向上させることを確認した。この結果から、本発明の有機酸生成の酒酵母株が、宿主と同程度の発酵能を維持しつつ、且つ、宿主よりも優れた有機酸生成能を有すること、また、このような性質が、VID24遺伝子の391番目の塩基の点変異により得られることが確認できた。
Claims (5)
- 酒酵母株について、そのVID24遺伝子を変異VID24遺伝子に変異させる変異工程を含み、
前記変異工程が、前記VID24遺伝子における配列番号3の塩基配列で示される部分領域について、塩基NNNを、グリシン残基のコドンから、塩基性アミノ酸残基であるヒスチジン残基、リシン残基またはアルギニン残基のコドンに変異させる工程であることを特徴とする、有機酸生成の酒酵母株の製造方法。 - VID24遺伝子における配列番号3の塩基配列で示される部分領域において、塩基NNNが、塩基性アミノ酸残基であるヒスチジン残基、リシン残基またはアルギニン残基のコドンであることを特徴とする変異VID24遺伝子。
- 前記変異VID24遺伝子が、配列番号4の塩基配列からなり、塩基NNNが、塩基性アミノ酸残基であるヒスチジン残基、リシン残基またはアルギニン残基のコドンであるG以外のアミノ酸残基をコードするコドンである、請求項2記載の変異VID24遺伝子。
- VID24タンパク質における配列番号1のアミノ酸配列で示される部分領域において、アミノ酸残基Xが、塩基性アミノ酸残基であるヒスチジン残基、リシン残基またはアルギニン残基であることを特徴とする変異VID24タンパク質。
(F1)配列番号1のアミノ酸配列において、アミノ酸残基Xが、ヒスチジン、リシンまたはアルギニンの塩基性アミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチド - 前記変異VID24タンパク質が、下記(F2)のペプチドからなる、請求項4記載の変異VID24タンパク質。
(F2)配列番号2のアミノ酸配列において、アミノ酸残基Xが、ヒスチジン、リシンまたはアルギニンの塩基性アミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチド
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