JP5895465B2 - 細胞培養容器の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞を培養するための細胞培養容器の製造方法に関する。

近年、再生医療分野において患者から採取した細胞を生体外で培養してシート状の細胞集合体（以下、細胞シートという。）を作製し、この細胞シートを生体内へ移植することで医療効果を高める試みがなされている。細胞シートを回収するツールとしては、例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどの温度応答性ポリマーを表面に固定したフィルムを、シャーレなどの容器の底面に粘着剤を用いて貼付したものが報告されている（特許文献１参照）。

細胞を培養するための容器を製造する際に、容器とフィルムとを接合する方法としては、特許文献１のような粘着剤を用いる方法のほか、インサート射出成形法を用いる方法がある。例えば、特許文献２では、インサート射出成形法によって、表面に親水性膜である酸化ケイ素を蒸着したプラスチックフィルムと、シャーレとを接合している。

特開２０１０−９８９７９号公報 実開平５−８８２９９号公報

インサート射出成形法により容器とフィルムとを接合する方法は、ラベラーを用いて粘着剤付フィルムを容器に貼付する接合方法と比較して、安価であり、単位時間当たりの製造数も多くなるので好ましい。しかしながら、温度応答性ポリマーなどの機能性高分子膜を備えたフィルムと、容器となる支持部材とを接合する手段として、特許文献２のようなインサート射出成形法を採用した場合には、上記高分子膜の機能が、射出成形の型の熱や圧力により低下することが確認された。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、温度応答性ポリマーなどの機能性高分子膜を有する機能性基体を、インサート射出成形法により容器部材と接合する際に、機能性高分子膜の機能の低下が生じ難い、細胞培養容器の製造方法を提供することを目的とする。

ところで、放射線の照射により重合反応させて形成された温度応答性ポリマーなどの機能性高分子膜の表面には、未反応のモノマー、オリゴマー、プレポリマー、固定化されていないポリマーなどが残留する。そのため、温度応答性ポリマーなどの機能性高分子膜が形成された機能性基体は、その残留物を除去するために洗浄される。本発明者らは、この洗浄のタイミングを調整することで、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、以下のようなものを提供する。

（１） 細胞及び培地を収容するための容器部を備え、上記容器部は、容器本体部材と、基材上に、所定の機能を備えた表面を有する機能性高分子層が少なくとも形成された機能性基体と、を備え、上記機能性基体は、上記機能性高分子層の表面が細胞及び培地を収容するための空間側に向くように、容器本体部材に接合されている、細胞培養容器の製造方法であって、
基材上に、放射線照射により重合して機能性高分子を形成し得るモノマーを少なくとも含む溶液を塗布し、塗膜を形成させた後、該塗膜に放射線を照射して、機能性高分子層を形成する機能性基体作製工程と、上記容器本体部材又はその部分部材を形成するための射出成形型に、上記機能性基体作製工程において作製された機能性基体を、機能性高分子層の表面が上記型の内壁に接し、かつ、基材側の表面が鋳型空間に露出するように配置し、型締めした後、鋳型空間内に溶融状態の樹脂を充填し、固化させることにより、上記容器本体部材又はその部分部材と、上記機能性基体とを接合させる機能性基体接合工程と、上記機能性基体接合工程において接合された機能性基体を洗浄する機能性基体洗浄工程と、を含むことを特徴とする細胞培養容器の製造方法。

本発明の細胞培養容器の製造方法によれば、温度応答性ポリマーなどの機能性高分子膜を有する機能性基体と、容器部材とを接合する際に、インサート射出成形法を採用した場合であっても、機能性高分子膜の機能の劣化が生じ難い。

本発明において製造される細胞培養容器（フラスコ型）の一例を示す図である。図１Ａは、斜視図であり、図１Ｂは、Ｉ−Ｉ´断面図であり、図１Ｃは、ＩＩ−ＩＩ´断面図である。 本発明において製造される細胞培養容器（ディッシュ型）の一例を示す図である。図２Ａは、斜視図であり、図２Ｂは、ＩＩＩ−ＩＩＩ´断面図である。 容器部分部材と、機能性基体とを接合した後に、他の部材を組み合わせてフラスコ型の容器部を完成させる一例を示す斜視図である。 本発明における機能性基体の一例を示す断面図である。 インサート射出成形法による機能性基体の接合の一例を説明するための摸式的断面図である。

以下、図面を参照しながら本発明の特徴を説明する。本発明は、以下に説明する形態に限定されることはなく、技術思想を逸脱しない範囲において適宜、変更を加えて実施することが可能である。また、以下に示す各図は模式的に示した図であり、理解を容易にするために適宜、誇張して示すことがあり、実際のものとは縮尺が異なる場合がある。

［細胞培養容器］
本発明において製造される細胞培養容器は、細胞及び培地を収容するための容器部を少なくとも備え、更に適宜、蓋などを備える。細胞培養容器の好ましい実施形態の一例を図１に示す。図１Ａに示す容器部１００は、底部１０１と、該底部１０１の周縁に立設された側壁部１０２と、側壁部１０２の上端部に接合された、底部１０１に対向配置される天部１０３とを備えている。また、容器部１００には、液体用の通孔１０４が設けられている。すなわち、容器部１００は、側壁部１０２の一部に通孔１０４が穿設され、通孔１０４の周縁から容器の外側に延びる首部１０５を備えており、いわゆる「フラスコ型」と呼ばれる形状を有している。首部１０５には、蓋１１０を係止するための係止部（図示せず）が形成されており、該係止部を介して蓋１１０が着脱可能に装着される。該蓋１１０により、細胞培養容器１の内側は閉じられた状態となり、安定して細胞培養を行なうことができる。通孔１０４より細胞や培地を供給したり、底部１０１の上面から剥離した機能性基体２０を回収したりすることができる。

図１Ｂは、容器部１００のＩ−Ｉ´断面図であり、図１Ｃは、容器部１００のＩＩ−ＩＩ´断面図である。容器部１００の、底部１０１と、側壁部１０２と、天部１０３とに囲まれた部分には、細胞及び培地を収容するための空間１２０が形成されている。空間１２０に面する内壁面の一部分（図１に示す細胞培養容器では底部１０１の面上）に、機能性基体２０が接合されている。該機能性基体２０は、細胞及び培地を収容するための空間１２０側に機能性高分子層の表面が向くように配置されている。

細胞培養容器の好ましい実施形態の他の例を図２に示す。図２Ａに示す容器部２００は、機能性基体２０を備えている。容器部２００は、底部２０１と、該底部２０１の周縁に立設された側壁部２０２とを備え、上方向が開放されている、いわゆる「ディッシュ型」と呼ばれる形状を有している。

図２Ｂは、容器部２００のＩＩＩ−ＩＩＩ´断面図である。容器部２００の底部２０１の細胞及び培地を収容するための空間２２０側の面上（内底面上）には、機能性基体２０が接合されている。該機能性基体２０は、細胞及び培地を収容するための空間２２０側に機能性高分子層の表面が向くように配置されている。

図１では「フラスコ型」、図２では「ディッシュ型」の形状の細胞培養容器を示しているが、本発明において製造される細胞培養容器は、細胞及び培地を収容できる形状であれば、特に限定されず、例えば、いわゆる「ビーカー型」、「ボトル型」と呼ばれる形状であってもよい。

本発明では、容器部のうち、機能性基体を除いた部分を「容器本体部材」と称する。例えば、図１の容器部１００において、容器本体部材とは、底部１０１、側壁部１０２、天部１０３、及び首部１０５から構成される部分であり、図２の容器部２００において、容器本体部材とは、底部２０１及び側壁部２０２から構成される部分である。

本発明の製造方法では、容器本体部材又はその一部である部材（以下、「容器部分部材」という場合がある）の表面に、機能性基体が配置されるように、インサート射出成形法により、容器本体部材又は容器部分部材と、機能性基体とを接合させる。まず、容器部分部材と、機能性基体とを接合させた場合には、その後の工程において、容器部分部材と、他の部材とを接合させて、容器部を完成させる。

本発明において製造される細胞培養容器（フラスコ型）の容器部の組み立て方法の一例を、図３を参照しながら説明する。まず、底部１０１と側壁部１０２とからなる容器部分部材３０１の内底面上に、機能性基体２０が配置されるように、インサート射出成形法により、容器部分部材３０１と、機能性基体２０とを接合させる。次いで、天部１０３に対応する天部材３０２を接合させることにより、容器部を形成する。容器部分部材３０１と、天部材３０２との接合は、細胞培養の目的に応じて、必要な場合には、培養液が漏出しないように液密に行なわれる。

本発明における容器部や蓋を形成する材料は、特に限定されず、細胞培養において一般的に用いられる材料を用いることができる。例えは、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂などの樹脂材料、表面親水化処理を施した上記の少なくとも１種を含む樹脂材料、ガラスや石英などの無機材料が挙げられ、これらの中でも樹脂材料が好ましい。樹脂材料としては、ポリスチレン樹脂又はポリエチレンテレフタレート樹脂であることが好ましい。

＜機能性基体＞
本発明における機能性基体の好ましい実施形態の一例を図４に示す。図４は、機能性基体を厚さ方向に沿って切断した断面図である。図４に示す機能性基体２０は、基材２１上に、所定の機能を備えた表面を有する機能性高分子層２２が形成されている。

機能性基体は、フィルム状であってもよいし、シート状であってもよい。フィルム状の機能性基体は、ロール状に巻き取り可能な可撓性を有することが好ましい。ロール・ツー・ロール法による大量生産が可能となるからである。

機能性基材の形は、接合させる部材の領域の形に応じて任意に選択することができる。例えば、三角形、四角形（正方形、長方形、平行四辺形、菱形など）、五角形、六角形、七角形、八角形などの多角形、円形、楕円形などの形状であってもよい。

（基材）
機能性基体を構成する基材は、一方の表面に後述する機能性高分子層を形成することが可能であり、細胞培養の際に耐え得る耐水性を有していれば、特に限定されず、機能性高分子層に応じて種々の材料を選択して形成することができる。基材の材料としては、典型的には、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、アクリルなどが挙げられる。また、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクタン、もしくはその共重合体のような生分解性ポリマーであってもよい。好ましくは、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリカーボネートである。ポリエチレンテレフタレートは、低価格コストで入手することができ、量産に適した材料である点において好ましい。ポリスチレンは、細胞毒性が低い材料である点で好ましい。製膜方法は、特に限定されず、例えば、溶液流延法、溶融押出法、カレンダー法などの従来公知の方法を用いることができる。また、上記方法によりあらかじめシート状に製膜された市販の基材を用いてもよい。

基材の機能性高分子層が形成される側の表面は、易接着処理されていてもよい。易接着処理としては、例えば、ポリエステル、アクリル酸エステル、ポリウレタン、ポリエチレンイミン、シランカップリング剤、ペルフルオロオクタンスルホン酸（ＰＦＯＳ）などの易接着剤による処理が挙げられる。

基材の形状は、特に限定されず、作製したい機能性基体の最終的な形状に応じて、適宜、選択するとよく、例えば、シート状、フィルム状などが挙げられる。機能性基体と接合させる容器部の底部の形状に沿うものが好ましい。作業性が良好となるからである。通常は、平坦な形状である。基材の厚みは、特に限定されないが、取り扱い性を考慮すると、好ましくは２０〜５００μｍ、より好ましくは５０〜２５０μｍである。また、この範囲であれば、連続帯状で供給して加工することも可能である。

（機能性高分子層）
機能性高分子層を構成する高分子としては、所望の機能を有するものであれば、特に限定されないが、好ましくは、所定の刺激によって細胞接着性から細胞非接着性へと変化し得る表面を有する刺激応答性ポリマーが挙げられる。刺激応答性ポリマーとしては、例えば、温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー、イオン応答性ポリマー、光応答性ポリマーなどが挙げられる。なかでも温度応答性ポリマーが、刺激の付与が容易であることから好ましい。

温度応答性ポリマーとしては、例えば、細胞を培養する温度では細胞接着性を示し、作製した細胞シートを剥離する時の温度では細胞非接着性を示すものを用いるとよい。例えば、温度応答性ポリマーは、臨界溶解温度未満の温度では周囲の水に対する親和性が向上し、ポリマーが水を取り込んで膨潤して表面に細胞を接着し難くする性質（細胞非接着性）を示し、同温度以上の温度ではポリマーから水が脱離することでポリマーが収縮して表面に細胞を接着しやすくする性質（細胞接着性）を示すものがよい。このような臨界溶解温度は、下限臨界溶解温度と呼ばれる。下限臨界溶解温度Ｔが０℃〜８０℃、さらに好ましくは０℃〜５０℃である温度応答性ポリマーを用いることが好ましい。Ｔが０℃〜８０℃であると、細胞を安定的に培養できるからである。

本発明において好適に使用できる温度応答性ポリマーとしては、具体的にはアクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーが挙げられ、より具体的にはポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（Ｔ＝２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（Ｔ＝約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）などが挙げられる。また、これらのポリマーを形成するためのモノマーが２種以上組み合わされて重合された共重合体であってもよい。

これらのポリマーを形成するためのモノマーとしては、放射線照射によって重合し得るモノマーを用いることができる。モノマーとしては例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体、ビニルエーテル誘導体などが挙げられ、これらの１種以上を使用してよい。モノマーを一種類単独で使用した場合、基材上に形成されるポリマーはホモポリマーとなり、モノマーを複数種組み合わせて使用した場合、基材上に形成されるポリマーはヘテロポリマーとなるが、どちらの形態も本発明に包含される。

また、必要に応じて、上記以外の他のモノマー類を更に加えて共重合してよい。更に本発明に使用する上記ポリマーとその他のポリマーとのグラフト又はブロック共重合体、あるいは本発明のポリマーと他のポリマーとの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質が損なわれない範囲で架橋することも可能である。

ｐＨ応答性ポリマー、イオン応答性ポリマー、光応答性ポリマーなどは、作製しようとする細胞シートに適したものを適宜、選択することができる。

刺激応答性ポリマー層は、刺激応答性ポリマーを所定の厚さとなるように、基材の表面に固定化することにより形成される。刺激応答性ポリマー層の厚みは、例えば、０．５ｎｍ〜３００ｎｍの範囲内であることが好ましく、１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であることがより好ましい。膜厚を０．５ｎｍ〜３００ｎｍの範囲とすることで細胞の接着と剥離の両立が容易となる。なお、刺激応答性ポリマー層には、その機能を損なわない範囲で、界面活性剤などの各種添加剤が配合されていてもよい。

［細胞培養容器の製造方法］
放射線の照射により重合反応させて形成された温度応答性ポリマーなどの機能性高分子の層の表面には、未反応のモノマー、オリゴマー、プレポリマー、固定化されていないポリマーなどが残留する。これらの残留物は品質保証の観点から除去することが好ましい。そのため、温度応答性ポリマーなどの機能性高分子の層が形成された機能性基体は、その残留物を除去するために洗浄される。本発明者らは、従来、この洗浄後の機能性基体を、機能性高分子層の表面と射出成形型の内壁とが接するように、該射出成形型に配置し、インサート射出成形法により、機能性基体と、容器本体部材又は容器部分部材とを接合していた。しかしながら、この方法によれば、射出成形の際の型の熱や圧力に起因すると思われる機能性基体の機能の低下が生じていた。これに対して、本発明によれば、温度応答性ポリマーなどの機能性高分子膜を有する機能性基体と、容器本体部材とを接合する際に、インサート射出成形法を採用した場合であっても、機能性高分子膜の機能の劣化が生じ難い。以下、本発明の細胞培養容器の製造方法について、詳細に説明する。

本発明の細胞培養容器の製造方法は、機能性基体作製工程と、機能性基体接合工程と、機能性基体洗浄工程とを含むことを特徴とする。

＜機能性基体作製工程＞
機能性基体作製工程では、基材上に、放射線照射により重合して機能性高分子を形成し得るモノマーを少なくとも含む溶液を塗布し、塗膜を形成した後、該塗膜に放射線を照射して、機能性高分子層を形成することにより、機能性基体を作成する。以下、この機能性基体作製工程について、機能性高分子層が温度応答性ポリマー層の場合を例に挙げて、具体的に説明する。

はじめに上述の基材を準備する。基材は、枚葉状態のものを用いても、ロール状態のものを用いてもよい。次に、重合により温度応答性ポリマーとなる上述のモノマーを溶媒に溶解させた温度応答性ポリマー層形成用塗工液を調製する。そして、慣用の方法にしたがって、該塗工液を基材の表面に塗工して塗膜を形成させる。その後、放射線を照射することにより塗膜中のモノマーを重合させ、ポリマーを形成させるとともに、基材の表面とポリマーとの間にグラフト化反応を生じさせて、温度応答性ポリマー層を形成する。このようにして、本発明における機能性基体を作製する。

上記溶媒は、モノマーを溶解しうるものであれば特に限定されないが、常圧下において沸点１２０℃以下、特に６０〜１１０℃のものが好ましい。具体的にはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、水などが挙げられ、これらは組み合わせて使用してもよい。その他の溶媒、例えば１−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、２−ブトキシエタノール、及びエチレン（若しくはジエチレン）グリコール又はそのモノエチルエーテルなども使用可能である。必要に応じて、上記溶液にはその他添加剤を配合してもよい。

塗工液中のモノマーの含有量は、１〜７０重量％であることが好ましい。また、塗布用組成物中には、モノマーに加えて、複数個のモノマーが重合したオリゴマー又はプレポリマーが含まれてもよい。オリゴマー又はプレポリマーが含まれる場合には、その大きさは、ダイマー以上のものであれば特に限定されず、分子量約３，３００（典型的には２８分子ポリマー）より大きいものが好ましく、分子量５，７００以上のものがより好ましい。

塗工液を基材の表面に塗工する方法は、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、グラビア印刷法、フレキソ印刷法、オフセット印刷法などの印刷による方法、ロールコート、リバースコート、コンマコート、ナイフコート、ダイコート、グラビアコートなどのコーティングによる方法が挙げられる。

温度応答性ポリマー層の被覆量は、グラフトされたポリマーが刺激応答性を発揮する必要な塗布量であればよく、例えば、５〜８０μｇ／ｃｍ^２であり、１０〜５０μｇ／ｃｍ^２であることが好ましい。ポリマー被覆量が８０μｇ／ｃｍ^２を超過すると細胞接着性が低下する場合があり、逆に被覆量が５μｇ／ｃｍ^２未満だと細胞剥離性が低下する場合がある。

モノマーを重合させるために使用する放射線としては、例えば、α線、β線、γ線、電子線、紫外線などが挙げられる。所望のグラフトポリマーを作製するために、エネルギー効率が良い点においてγ線と電子線が好ましく、特に、生産性の面では電子線が好ましい。紫外線は、適当な重合開始剤やシランカップリング剤などのアンカー剤と組合せることで使用できる。放射線の線量の範囲は、電子線であれば５Ｍｒａｄ〜５０Ｍｒａｄが好ましく、γ線であれば０．５Ｍｒａｄ〜５Ｍｒａｄが好ましい。照射工程前後に、必要に応じて塗膜を乾燥させ、上記溶媒を除去する。

＜機能性基体接合工程＞
機能性基体接合工程では、上記容器本体部材又はその部分部材を形成するための射出成形型に、上記機能性基体作製工程において作製された機能性基体を、機能性高分子層の表面が上記型の内壁に接し、かつ、基材側の表面が鋳型空間に露出するように配置し、型締めした後、鋳型空間内に溶融状態の樹脂を充填し、固化させることにより、上記容器本体部材又はその部分部材と、上記機能性基体とを接合させる。以下、この機能性基体接合工程の好ましい実施形態の一例を、図５を参照しながら具体的に説明する。

図５は、インサート射出成形法により、容器部分部材と、機能性基体とを接合させてフラスコ型の細胞培養容器を製造する方法を順次示す摸式的断面図である。型締め時に、容器部分部材３０１に対応する鋳型空間４０４を形成する、凸型４０１と凹型４０２とを組み合わせる射出成形型に、機能性基体２０を、機能性高分子層２２側の最外層（図５では、機能性高分子層）の面が射出成形型の内壁面の一部の領域を覆い、かつ、基材２１側の最外層（図５では、基材）の面の少なくとも一部（図５では、全部）が鋳型空間４０４に露出するように装着した（図５Ａ）後、型締めする。次いで、ゲート４０３を通じて、樹脂を、射出圧を加えて型内に充填する（図５Ｂ）。充填後、樹脂を固化させてから型を開き、機能性基体２０と、容器部分部材３０１とが接合されたもの得る（図５Ｃ）。

本発明では、機能性高分子層の表面に残留した未反応のモノマー、オリゴマー、プレポリマー、固定化されていないポリマーなどの残留物が、射出成形時の熱や圧力から機能性高分子層を保護する保護層のごとく作用するため、射出成形後においても機能性高分子層の機能が維持されるのではないかと考えられる。

＜機能性基体洗浄工程＞
機能性基体洗浄工程では、上記機能性基体接合工程において接合された機能性基体を洗浄する。上記したように、グラフト重合後の機能性高分子層の表面上には、共有結合により固定化されたポリマー分子だけでなく、固定化されていない遊離のポリマーや、未反応のモノマーなどが存在している。本発明では、従来の方法とは異なり、この洗浄を上記機能性基体接合工程後に行なう。この洗浄工程では、これら遊離ポリマーや未反応物を除去する。洗浄方法は特に限定されないが、典型的には浸漬洗浄、高圧洗浄、揺動洗浄、シャワー洗浄、スプレー洗浄、超音波洗浄などが挙げられる。また洗浄液としては、典型的には各種水系、アルコール系、炭化水素系、塩素系、酸・アルカリ洗浄液が挙げられる。洗浄方法と洗浄液との組み合わせも、特に限定されず、機能性基体に応じて、適宜、選択することができる。なお、本発明は、上記機能性基体接合工程前に機能性基体の洗浄を全く行なわないことに限定されるものではなく、本発明の効果を奏する範囲内で、上記機能性基体接合工程前に機能性基体の洗浄を行なってもよい。すなわち、本発明は、上記機能性基体接合工程前に機能性基体の洗浄を行なうことを何ら除外するものではない。

＜その他の工程＞
最後に、天部材３０２を容器部分部材３０１の開放端に接合し、容器部１００を完成させる（図５Ｄ）。その後は、蓋を閉じ、必要に応じて、エタノール滅菌、エチレンオキサイドガス（ＥＯＧ）滅菌、紫外線照射滅菌、γ線照射滅菌などの滅菌処理を施す。これらのなかでも、γ線照射滅菌は、全生物種を死滅させられるという点で好適である。

以下、実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら制限を受けるものではない。

［参考例１］
＜細胞培養容器の作製＞
基材として、ポリスチレンフィルム（厚さ：５０μｍ、旭化成ケミカルズより入手）を準備した。該ポリスチレンフィルムの一方の面にコロナ処理を施し、該面を親水化させた。次に、Ｎ−イソプロアクリルアミドを最終濃度４０重量％になるようにイソプロプルアルコールに溶解させて温度応答性ポリマー層形成用塗工液を作製した。上記ポリスチレンフィルムの親水化させた面上に、上記塗工液をグラビアダイレクト法により全面塗布した（塗布量：１．１ｇ／ｃｍ^２、搬送速度：５ｍ／ｍｉｎ）。その後、４０℃の熱風乾燥機内（２ｍ）を通過させ、乾燥させた後、電子線を照射（電子線照射線量：１２０ｋＧｙ）して、Ｎ−イソプロアクリルアミドをグラフト重合させ、ポリスチレンフィルムの表面にポリ−Ｎ−イソプロアクリルアミドを固定化した。ハンドプレス機を用いて、台形形状に切り抜き、台形形状の機能性基体を得た。得られた機能性基体の温度応答性ポリマー層の面を、２０℃の水中に４時間浸漬させた後、乾燥させた。

射出成形機（α−１００Ｃ、ファナック社製）を使用して、ポリスチレン樹脂製の底部材と、周側壁部材と、天部材とを作製した。上記にて得られた機能性基体を底部材に両面テープを用いて貼付した後、周側壁部材と、天部材とを超音波溶着により接合させ、フラスコ型の細胞培養容器（以下、フラスコという）を作製した。

＜細胞の剥離試験＞
上記にて作製したフラスコをクリーンベンチ内で所定時間、紫外線滅菌した。次に、ウシ血管内皮細胞を表面細胞密度が１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２になるように、上記滅菌後のフラスコ内の機能性基体上に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２条件のＣＯ_２インキュベーター内にて２４時間培養した。なお、培地には、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（シグマ社製）を使用した。その後、フラスコを２０℃、５％ＣＯ_２条件のＣＯ_２インキュベーターに入れた。２０分後にフラスコをＣＯ_２インキュベーターから出し、細胞シートが得られることを確認した。

［実施例１］
＜細胞培養容器の作製＞
基材として、ポリスチレンフィルム（厚さ：５０μｍ、旭化成ケミカルズより入手）を準備した。該ポリスチレンフィルムの一方の面にコロナ処理を施し、該面を親水化させた。次に、Ｎ−イソプロアクリルアミドを最終濃度４０重量％になるようにイソプロプルアルコールに溶解させて温度応答性ポリマー層形成用塗工液を作製した。上記ポリスチレンフィルムの親水化させた面上に、上記塗工液をグラビアダイレクト法により全面塗布した（塗布量：１．１ｇ／ｃｍ^２、搬送速度：５ｍ／ｍｉｎ）。その後、４０℃の熱風乾燥機内（２ｍ）を通過させ、乾燥させた後、電子線を照射（電子線照射線量：１２０ｋＧｙ）して、Ｎ−イソプロアクリルアミドをグラフト重合させ、ポリスチレンフィルムの表面にポリ−Ｎ−イソプロアクリルアミドを固定化した。ハンドプレス機を用いて、台形形状に切り抜き、台形形状の機能性基体を得た。

射出成形機（α−１００Ｃ、ファナック社製）のコア金型（凸型）に、上記機能性基体を、該機能性基体の温度応答性ポリマー層の面と上記コア金型の凸面とが対向するように配置した。次に、機能性基体の機能面に対して溶融樹脂が接触しないように、ガイドが付いたキャビティ金型（凹型）を配置し、型締めした後、ポリスチレンペレット（ＳＧＰ１０、ＰＳジャパン株式会社製）を用いて、インサート成形を行なった（樹脂温度：２２０℃、金型温度：２０℃）。このようにして、機能性基体が底部に接合した容器部分部材を得た。

次いで、上記容器部分部材の底部に接合した機能性基体の温度応答性ポリマー層の面を、２０℃の水中に４時間浸漬させた後、乾燥させた。その後、該容器部分部材に、射出成形により作製したポリスチレン樹脂製の天部材を、超音波溶着により接合させ、フラスコ型の細胞培養容器（以下、フラスコという）を作製した。

＜細胞の剥離試験＞
上記にて作製したフラスコをクリーンベンチ内で所定時間、紫外線滅菌した。次に、ウシ血管内皮細胞を表面細胞密度が１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２になるように、上記滅菌後のフラスコ内の機能性基体上に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２条件のＣＯ_２インキュベーター内にて２４時間培養した。なお、培地には、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（シグマ社製）を使用した。その後、フラスコを２０℃、５％ＣＯ_２条件のＣＯ_２インキュベーターに入れた。２０分後にフラスコをＣＯ_２インキュベーターから出し、細胞シートが得られることを確認した。

［比較例１］
＜細胞培養容器の作製＞
基材として、ポリスチレンフィルム（厚さ：５０μｍ、旭化成ケミカルズより入手）を準備した。該ポリスチレンフィルムの一方の面にコロナ処理を施し、該面を親水化させた。次に、Ｎ−イソプロアクリルアミドを最終濃度４０重量％になるようにイソプロプルアルコールに溶解させて温度応答性ポリマー層形成用塗工液を作製した。上記ポリスチレンフィルムの親水化させた面上に、上記塗工液をグラビアダイレクト法により全面塗布した（塗布量：１．１ｇ／ｃｍ^２、搬送速度：５ｍ／ｍｉｎ）。その後、４０℃の熱風乾燥機内（２ｍ）を通過させ、乾燥させた後、電子線を照射（電子線照射線量：１２０ｋＧｙ）して、Ｎ−イソプロアクリルアミドをグラフト重合させ、ポリスチレンフィルムの表面にポリ−Ｎ−イソプロアクリルアミドを固定化した。ハンドプレス機を用いて、台形形状に切り抜き、台形形状の機能性基体を得た。得られた機能性基体の温度応答性ポリマー層の面を、２０℃の水中に４時間浸漬させた後、乾燥させた。

射出成形機（α−１００Ｃ、ファナック社製）のコア金型（凸型）に、上記機能性基体を、該機能性基体の温度応答性ポリマー層の面と上記コア金型の凸面とが対向するように配置した。次に、機能性基体の機能面に対して溶融樹脂が接触しないように、ガイドが付いたキャビティ金型（凹型）を配置し、型締めした後、ポリスチレンペレット（ＳＧＰ１０、ＰＳジャパン株式会社製）を用いて、インサート成形を行なった（樹脂温度：２２０℃、金型温度：２０℃）。このようにして、機能性基体が底部に接合した容器部分部材を得た。その後、該容器部分部材に、射出成形により作製したポリスチレン樹脂製の天部材を、超音波溶着により接合させ、フラスコ型の細胞培養容器（以下、フラスコという）を作製した。

＜細胞の剥離試験＞
上記にて作製したフラスコをクリーンベンチ内で所定時間、紫外線滅菌した。次に、実施例１と同様の方法により、ウシ血管内皮細胞を上記滅菌後のフラスコ内の機能性基体上に播種したが、細胞シートは得られなかった。

１ 細胞培養容器
２ 細胞培養容器
２０ 機能性基体
２１ 基材
２２ 機能性高分子層
１００ 容器部
１０１ 底部
１０２ 側壁部
１０３ 天部
２００ 容器部
２０１ 底部
２０２ 側壁部
３０１ 容器部分部材
３０２ 天部材

Claims (1)

1. 細胞及び培地を収容するための容器部を備え、
   前記容器部は、容器本体部材と、基材上に、所定の機能を備えた表面を有する機能性高分子層が少なくとも形成された機能性基体と、を備え、
   前記機能性基体は、前記機能性高分子層の表面が細胞及び培地を収容するための空間側に向くように、容器本体部材に接合されている、細胞培養容器の製造方法であって、
   基材上に、放射線照射により重合して機能性高分子を形成し得るモノマーを少なくとも含む溶液を塗布し、塗膜を形成させた後、該塗膜に放射線を照射して、機能性高分子層を形成する機能性基体作製工程と、
   前記容器本体部材又はその部分部材を形成するための射出成形型に、前記機能性基体作製工程において作製された機能性基体を、洗浄することなく、機能性高分子層の表面が前記型の内壁に接し、かつ、基材側の表面が鋳型空間に露出するように配置し、型締めした後、鋳型空間内に溶融状態の樹脂を充填し、固化させることにより、前記容器本体部材又はその部分部材と、前記機能性基体とを接合させる機能性基体接合工程と、
   前記機能性基体接合工程の後に、前記機能性基体接合工程において接合された機能性基体を洗浄する機能性基体洗浄工程と、を含むことを特徴とする細胞培養容器の製造方法。

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