JP5895465B2 - 細胞培養容器の製造方法 - Google Patents
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Description
基材上に、放射線照射により重合して機能性高分子を形成し得るモノマーを少なくとも含む溶液を塗布し、塗膜を形成させた後、該塗膜に放射線を照射して、機能性高分子層を形成する機能性基体作製工程と、上記容器本体部材又はその部分部材を形成するための射出成形型に、上記機能性基体作製工程において作製された機能性基体を、機能性高分子層の表面が上記型の内壁に接し、かつ、基材側の表面が鋳型空間に露出するように配置し、型締めした後、鋳型空間内に溶融状態の樹脂を充填し、固化させることにより、上記容器本体部材又はその部分部材と、上記機能性基体とを接合させる機能性基体接合工程と、上記機能性基体接合工程において接合された機能性基体を洗浄する機能性基体洗浄工程と、を含むことを特徴とする細胞培養容器の製造方法。
本発明において製造される細胞培養容器は、細胞及び培地を収容するための容器部を少なくとも備え、更に適宜、蓋などを備える。細胞培養容器の好ましい実施形態の一例を図1に示す。図1Aに示す容器部100は、底部101と、該底部101の周縁に立設された側壁部102と、側壁部102の上端部に接合された、底部101に対向配置される天部103とを備えている。また、容器部100には、液体用の通孔104が設けられている。すなわち、容器部100は、側壁部102の一部に通孔104が穿設され、通孔104の周縁から容器の外側に延びる首部105を備えており、いわゆる「フラスコ型」と呼ばれる形状を有している。首部105には、蓋110を係止するための係止部(図示せず)が形成されており、該係止部を介して蓋110が着脱可能に装着される。該蓋110により、細胞培養容器1の内側は閉じられた状態となり、安定して細胞培養を行なうことができる。通孔104より細胞や培地を供給したり、底部101の上面から剥離した機能性基体20を回収したりすることができる。
本発明における機能性基体の好ましい実施形態の一例を図4に示す。図4は、機能性基体を厚さ方向に沿って切断した断面図である。図4に示す機能性基体20は、基材21上に、所定の機能を備えた表面を有する機能性高分子層22が形成されている。
機能性基体を構成する基材は、一方の表面に後述する機能性高分子層を形成することが可能であり、細胞培養の際に耐え得る耐水性を有していれば、特に限定されず、機能性高分子層に応じて種々の材料を選択して形成することができる。基材の材料としては、典型的には、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリスチレン(PS)、ポリカーボネート(PC)、TAC(トリアセチルセルロース)、ポリイミド(PI)、ナイロン(Ny)、低密度ポリエチレン(LDPE)、中密度ポリエチレン(MDPE)、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、アクリルなどが挙げられる。また、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクタン、もしくはその共重合体のような生分解性ポリマーであってもよい。好ましくは、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリカーボネートである。ポリエチレンテレフタレートは、低価格コストで入手することができ、量産に適した材料である点において好ましい。ポリスチレンは、細胞毒性が低い材料である点で好ましい。製膜方法は、特に限定されず、例えば、溶液流延法、溶融押出法、カレンダー法などの従来公知の方法を用いることができる。また、上記方法によりあらかじめシート状に製膜された市販の基材を用いてもよい。
機能性高分子層を構成する高分子としては、所望の機能を有するものであれば、特に限定されないが、好ましくは、所定の刺激によって細胞接着性から細胞非接着性へと変化し得る表面を有する刺激応答性ポリマーが挙げられる。刺激応答性ポリマーとしては、例えば、温度応答性ポリマー、pH応答性ポリマー、イオン応答性ポリマー、光応答性ポリマーなどが挙げられる。なかでも温度応答性ポリマーが、刺激の付与が容易であることから好ましい。
放射線の照射により重合反応させて形成された温度応答性ポリマーなどの機能性高分子の層の表面には、未反応のモノマー、オリゴマー、プレポリマー、固定化されていないポリマーなどが残留する。これらの残留物は品質保証の観点から除去することが好ましい。そのため、温度応答性ポリマーなどの機能性高分子の層が形成された機能性基体は、その残留物を除去するために洗浄される。本発明者らは、従来、この洗浄後の機能性基体を、機能性高分子層の表面と射出成形型の内壁とが接するように、該射出成形型に配置し、インサート射出成形法により、機能性基体と、容器本体部材又は容器部分部材とを接合していた。しかしながら、この方法によれば、射出成形の際の型の熱や圧力に起因すると思われる機能性基体の機能の低下が生じていた。これに対して、本発明によれば、温度応答性ポリマーなどの機能性高分子膜を有する機能性基体と、容器本体部材とを接合する際に、インサート射出成形法を採用した場合であっても、機能性高分子膜の機能の劣化が生じ難い。以下、本発明の細胞培養容器の製造方法について、詳細に説明する。
機能性基体作製工程では、基材上に、放射線照射により重合して機能性高分子を形成し得るモノマーを少なくとも含む溶液を塗布し、塗膜を形成した後、該塗膜に放射線を照射して、機能性高分子層を形成することにより、機能性基体を作成する。以下、この機能性基体作製工程について、機能性高分子層が温度応答性ポリマー層の場合を例に挙げて、具体的に説明する。
機能性基体接合工程では、上記容器本体部材又はその部分部材を形成するための射出成形型に、上記機能性基体作製工程において作製された機能性基体を、機能性高分子層の表面が上記型の内壁に接し、かつ、基材側の表面が鋳型空間に露出するように配置し、型締めした後、鋳型空間内に溶融状態の樹脂を充填し、固化させることにより、上記容器本体部材又はその部分部材と、上記機能性基体とを接合させる。以下、この機能性基体接合工程の好ましい実施形態の一例を、図5を参照しながら具体的に説明する。
機能性基体洗浄工程では、上記機能性基体接合工程において接合された機能性基体を洗浄する。上記したように、グラフト重合後の機能性高分子層の表面上には、共有結合により固定化されたポリマー分子だけでなく、固定化されていない遊離のポリマーや、未反応のモノマーなどが存在している。本発明では、従来の方法とは異なり、この洗浄を上記機能性基体接合工程後に行なう。この洗浄工程では、これら遊離ポリマーや未反応物を除去する。洗浄方法は特に限定されないが、典型的には浸漬洗浄、高圧洗浄、揺動洗浄、シャワー洗浄、スプレー洗浄、超音波洗浄などが挙げられる。また洗浄液としては、典型的には各種水系、アルコール系、炭化水素系、塩素系、酸・アルカリ洗浄液が挙げられる。洗浄方法と洗浄液との組み合わせも、特に限定されず、機能性基体に応じて、適宜、選択することができる。なお、本発明は、上記機能性基体接合工程前に機能性基体の洗浄を全く行なわないことに限定されるものではなく、本発明の効果を奏する範囲内で、上記機能性基体接合工程前に機能性基体の洗浄を行なってもよい。すなわち、本発明は、上記機能性基体接合工程前に機能性基体の洗浄を行なうことを何ら除外するものではない。
最後に、天部材302を容器部分部材301の開放端に接合し、容器部100を完成させる(図5D)。その後は、蓋を閉じ、必要に応じて、エタノール滅菌、エチレンオキサイドガス(EOG)滅菌、紫外線照射滅菌、γ線照射滅菌などの滅菌処理を施す。これらのなかでも、γ線照射滅菌は、全生物種を死滅させられるという点で好適である。
<細胞培養容器の作製>
基材として、ポリスチレンフィルム(厚さ:50μm、旭化成ケミカルズより入手)を準備した。該ポリスチレンフィルムの一方の面にコロナ処理を施し、該面を親水化させた。次に、N−イソプロアクリルアミドを最終濃度40重量%になるようにイソプロプルアルコールに溶解させて温度応答性ポリマー層形成用塗工液を作製した。上記ポリスチレンフィルムの親水化させた面上に、上記塗工液をグラビアダイレクト法により全面塗布した(塗布量:1.1g/cm2、搬送速度:5m/min)。その後、40℃の熱風乾燥機内(2m)を通過させ、乾燥させた後、電子線を照射(電子線照射線量:120kGy)して、N−イソプロアクリルアミドをグラフト重合させ、ポリスチレンフィルムの表面にポリ−N−イソプロアクリルアミドを固定化した。ハンドプレス機を用いて、台形形状に切り抜き、台形形状の機能性基体を得た。得られた機能性基体の温度応答性ポリマー層の面を、20℃の水中に4時間浸漬させた後、乾燥させた。
上記にて作製したフラスコをクリーンベンチ内で所定時間、紫外線滅菌した。次に、ウシ血管内皮細胞を表面細胞密度が1.0×105cells/cm2になるように、上記滅菌後のフラスコ内の機能性基体上に播種し、37℃、5%CO2条件のCO2インキュベーター内にて24時間培養した。なお、培地には、10%FBS含有DMEM(シグマ社製)を使用した。その後、フラスコを20℃、5%CO2条件のCO2インキュベーターに入れた。20分後にフラスコをCO2インキュベーターから出し、細胞シートが得られることを確認した。
<細胞培養容器の作製>
基材として、ポリスチレンフィルム(厚さ:50μm、旭化成ケミカルズより入手)を準備した。該ポリスチレンフィルムの一方の面にコロナ処理を施し、該面を親水化させた。次に、N−イソプロアクリルアミドを最終濃度40重量%になるようにイソプロプルアルコールに溶解させて温度応答性ポリマー層形成用塗工液を作製した。上記ポリスチレンフィルムの親水化させた面上に、上記塗工液をグラビアダイレクト法により全面塗布した(塗布量:1.1g/cm2、搬送速度:5m/min)。その後、40℃の熱風乾燥機内(2m)を通過させ、乾燥させた後、電子線を照射(電子線照射線量:120kGy)して、N−イソプロアクリルアミドをグラフト重合させ、ポリスチレンフィルムの表面にポリ−N−イソプロアクリルアミドを固定化した。ハンドプレス機を用いて、台形形状に切り抜き、台形形状の機能性基体を得た。
上記にて作製したフラスコをクリーンベンチ内で所定時間、紫外線滅菌した。次に、ウシ血管内皮細胞を表面細胞密度が1.0×105cells/cm2になるように、上記滅菌後のフラスコ内の機能性基体上に播種し、37℃、5%CO2条件のCO2インキュベーター内にて24時間培養した。なお、培地には、10%FBS含有DMEM(シグマ社製)を使用した。その後、フラスコを20℃、5%CO2条件のCO2インキュベーターに入れた。20分後にフラスコをCO2インキュベーターから出し、細胞シートが得られることを確認した。
<細胞培養容器の作製>
基材として、ポリスチレンフィルム(厚さ:50μm、旭化成ケミカルズより入手)を準備した。該ポリスチレンフィルムの一方の面にコロナ処理を施し、該面を親水化させた。次に、N−イソプロアクリルアミドを最終濃度40重量%になるようにイソプロプルアルコールに溶解させて温度応答性ポリマー層形成用塗工液を作製した。上記ポリスチレンフィルムの親水化させた面上に、上記塗工液をグラビアダイレクト法により全面塗布した(塗布量:1.1g/cm2、搬送速度:5m/min)。その後、40℃の熱風乾燥機内(2m)を通過させ、乾燥させた後、電子線を照射(電子線照射線量:120kGy)して、N−イソプロアクリルアミドをグラフト重合させ、ポリスチレンフィルムの表面にポリ−N−イソプロアクリルアミドを固定化した。ハンドプレス機を用いて、台形形状に切り抜き、台形形状の機能性基体を得た。得られた機能性基体の温度応答性ポリマー層の面を、20℃の水中に4時間浸漬させた後、乾燥させた。
上記にて作製したフラスコをクリーンベンチ内で所定時間、紫外線滅菌した。次に、実施例1と同様の方法により、ウシ血管内皮細胞を上記滅菌後のフラスコ内の機能性基体上に播種したが、細胞シートは得られなかった。
2 細胞培養容器
20 機能性基体
21 基材
22 機能性高分子層
100 容器部
101 底部
102 側壁部
103 天部
200 容器部
201 底部
202 側壁部
301 容器部分部材
302 天部材
Claims (1)
- 細胞及び培地を収容するための容器部を備え、
前記容器部は、容器本体部材と、基材上に、所定の機能を備えた表面を有する機能性高分子層が少なくとも形成された機能性基体と、を備え、
前記機能性基体は、前記機能性高分子層の表面が細胞及び培地を収容するための空間側に向くように、容器本体部材に接合されている、細胞培養容器の製造方法であって、
基材上に、放射線照射により重合して機能性高分子を形成し得るモノマーを少なくとも含む溶液を塗布し、塗膜を形成させた後、該塗膜に放射線を照射して、機能性高分子層を形成する機能性基体作製工程と、
前記容器本体部材又はその部分部材を形成するための射出成形型に、前記機能性基体作製工程において作製された機能性基体を、洗浄することなく、機能性高分子層の表面が前記型の内壁に接し、かつ、基材側の表面が鋳型空間に露出するように配置し、型締めした後、鋳型空間内に溶融状態の樹脂を充填し、固化させることにより、前記容器本体部材又はその部分部材と、前記機能性基体とを接合させる機能性基体接合工程と、
前記機能性基体接合工程の後に、前記機能性基体接合工程において接合された機能性基体を洗浄する機能性基体洗浄工程と、を含むことを特徴とする細胞培養容器の製造方法。
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