JP5892540B2 - 生体内にて標的組織に指向する放射標識化合物およびその利用 - Google Patents

生体内にて標的組織に指向する放射標識化合物およびその利用 Download PDF

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Description

本発明は、生体内にて標的組織に指向する放射標識化合物およびその利用に関するものである。
放射線療法は、主に、癌（悪性腫瘍）を治療するために放射線を照射する治療法であり、単独で、あるいは化学療法、ホルモン療法などと組み合わされて用いられている。近年、インビボでの治療および診断に用いるための種々の放射性リガンドが研究されており、例えば、放射線治療の対象である癌の治療を目的として、放射標識された抗体を用いた放射性薬剤（ゼヴァリン（登録商標））が開発されている。
また、生体内に投与された放射標識化合物を用いる技術として、陽電子放射断層画像撮影法（ＰＥＴ）が知られている。ＰＥＴは、目的の分子の挙動を調べることができる「分子イメージング」技術の１つであり、種々の疾患の早期発見や、有効かつ副作用の少ない医薬の短期間での開発に有用であると考えられている。ＰＥＴは、陽電子が電子と衝突することによって放射されるγ線を用いて断層画像を撮影する技術であり、標識した目的の分子（いわゆる、分子プローブ）を生体に投与し、標識されている放射性核種が別の原子核に崩壊していく際に放出する陽電子と、その近傍に存在する電子との衝突によって放出されるγ線を検出する。これによって、目的の分子の存在部位を定量的に調べることができる。このようなＰＥＴは、臨床的な分子イメージング技術として広く利用されている。例えば、［１８Ｆ］で標識したフルオロデオキシグルコースを用いたＰＥＴががん検診に利用されている。
放射性薬剤は、生体内に投与することによって、放射線を標的腫瘍細胞に直接照射することができるので、新たな抗腫瘍効果を提供し得る。また、ＰＥＴは、医薬品開発および臨床診断に用いられている、優れた分子イメージング技術である。このように、生体内に投与された放射標識化合物を用いる技術は非常に有望である。
Lewis et al., Bioconjugate Chemistry (1994), 5(6): 565-576
ゼヴァリンは、標的タンパク質に対する抗体に共有結合させたキレーターを介して、β線を放出する放射性の金属核種を標識した化合物である。ＰＥＴに適用するために抗体、タンパク質などの生体高分子を放射標識する場合もまた、リンカーを介してキレーター（例えば、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸））を生体高分子に導入し、キレーター部分に金属核種を結合させる方法が採用されている（例えば、非特許文献１参照）。
しかし、非特許文献１記載の技術では、キレーターが生体高分子と非特異的に反応するので、生体高分子の活性部位にキレーターが導入されたことによって生体高分子の活性の低下が生じる。また、このような技術では、生体高分子にキレーターの化学的修飾を施す必要があり、手間がかかる。さらに、用いられるキレーターは、元々生体内に存在しない物質であり、放射標識した生体高分子を薬剤等に利用するためには、キレーター自体の生体での安全性を評価することが必要となる。
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体内にて臨床的に利用可能な放射標識化合物をキレーターによって化学修飾することなく提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために独自の観点から鋭意検討を重ね、生体分子の１つであるタンパク質の特定領域が、放射性の金属核種を生体内にて標的組織に指向させるに好適な結合能を有していることを見出したことに基づいて、本発明を完成するに至った。
本発明にかかる化合物は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物であり、第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでおり、該アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種が、該アミノ酸領域に保持されていることを特徴としている。
上記構成を有していることにより、本発明にかかる化合物は、放射性の金属核種を担持した状態で生体内にて目的の部位に送達され得る。
本発明にかかる化合物において、上記アミノ酸領域は、該化合物が適用される生体において天然に存在するタンパク質のフラグメントであることが好ましい。また、標的組織に発現している上記タンパク質は、第１のポリペプチドのレセプタータンパク質であることが好ましい。このような構成を有していることにより、本発明にかかる化合物は、投与された生体に対して毒性を示す危険性が低い。
本発明にかかる化合物において、上記アミノ酸領域は、Ｘ１−Ｈｉｓ（Ｘ１はＰｒｏ以外の任意のアミノ酸を表す。）を含んでいることが好ましく、Ｘ２−Ｘ１−ＨｉｓまたはＸ２−Ｘ１−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ（Ｘ１はＰｒｏ以外の任意のアミノ酸を表し、Ｘ２はＭｅｔ、ＡｓｐまたはＧｌｕを表す。）を含んでいることがより好ましい。このような構成のアミノ酸領域を含んでいることによって、放射性金属６４Ｃｕとの錯形成が首尾よく行われるので、半減期が比較的長い６４Ｃｕを放射性の金属核種として用いることができる。
本発明にかかる化合物において、上記アミノ酸領域は、Ｍｅｔ−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ４−Ｘ５−Ｃｙｓ（Ｘ３はＴｈｒ，Ｓｅｒ，ＨｉｓまたはＡｓｎを表し、Ｘ４はＡｌａ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｓｅｒ，Ａｓｐ，ＧｌｙまたはＧｌｕを表し、Ｘ５はＧｌｙ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ，ＧｌｎまたはＧｌｕを表す。）を含んでいてもよい。また、本発明にかかる化合物において、上記アミノ酸領域は、Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓを含んでいてもよい。
本発明にかかる化合物において、第２のポリペプチドは、ＤＡＨ、ＤＡＨＫ、ＤＴＨ、ＤＴＨＫ、ＥＡＨ、ＥＡＨＫ、ＭＴＣＡＮＣ、ＤＡＨＫＭＴＣＡＧＣ、ＤＡＨＫＧＭＴＣＡＮＣ、ＤＡＨＫＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＤＡＨＫＧＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＤＴＨＫＭＴＣＡＧＣ、ＤＴＨＫＧＭＴＣＡＮＣ、ＤＴＨＫＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＤＴＨＫＧＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＥＡＨＫＭＴＣＡＧＣ、ＥＡＨＫＧＭＴＣＡＮＣ、ＥＡＨＫＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＥＡＨＫＧＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＨＧＤＨＭＨＮＨＤＴＫであり得る。
本発明にかかる化合物において、上記アミノ酸領域は、第２のポリペプチドのＮ末端部分を構成していることが好ましい。また、本発明にかかる化合物において、第２のポリペプチドは３〜１５個のアミノ酸からなってもよい。このような構成を有していることにより、本発明にかかる化合物は、血液脳関門を通過しやすくなり、送達すべき部位が頭部であっても適用可能となる。
本発明にかかる化合物を製造する方法は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に、第２のポリペプチドを付加する工程を包含し、第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでおり、該アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種を、該アミノ酸領域に保持させる工程をさらに包含することを特徴としている。
本発明にかかる製造方法において、第２のポリペプチドを付加する上記工程は、ペプチド固相合成法を用いて第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドを合成することによって行われてもよく、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの融合タンパク質を遺伝子工学的に生成することによって行われてもよい。遺伝子工学的な手法を採用した場合、第１のポリペプチドのＮ末端に目的のアミノ酸領域を予め付加しておくことができるので、タンパク質を調製した後にキレーターを化学的に修飾するという手間を省くことができる。また、目的のアミノ酸領域を付加する部位を特定の箇所に限定することが非常に容易である。さらに、このような方法を用いれば、細胞表面の膜タンパク質の標識が容易になり、細胞の標識を容易に行い得る。
本発明にかかる組成物は、放射性の金属核種を生体内にて標的組織に指向させるために、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物を含有しており、第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでいることを特徴としている。本発明にかかる組成物は、上記アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種を、さらに含有していてもよい。
本発明にかかる組成物は、陽電子放射断層画像撮影による診断に用いられても、放射線治療に用いられてもよい。
本発明にかかる撮影方法は、生体内における陽電子放射断層画像を撮影するために、生体内に投与された化合物が放出する陽電子に基づいて生成されるガンマ線量を生体から検出する工程を包含し、該化合物は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物であり、該化合物において、第１のポリペプチドは、測定されるべき標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでおり、該アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種が、該アミノ酸領域に保持されていることを特徴としている。
本発明にかかるスクリーニング方法は、放射線治療に用いる化合物をスクリーニングするために、生体内に投与された化合物が放出する陽電子に基づいて生成されるガンマ線量を生体から検出する工程を包含し、該候補化合物は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物であり、該候補化合物において、第１のポリペプチドは、測定されるべき標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでおり、該アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種が、該アミノ酸領域に保持されていることを特徴としている。
本発明にかかる検出方法は、サンプル中の目的のタンパク質を検出するために、サンプルを化合物とともにインキュベートする工程、および該化合物が放出する陽電子に基づいて生成されるガンマ線量を検出する工程を包含し、該化合物は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物であり、該化合物において、第１のポリペプチドは、目的の膜タンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでおり、該アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種が、該アミノ酸領域に保持されていることを特徴としている。
本発明にかかる標識方法は、細胞を標識するために、細胞を化合物とともにインキュベートする工程、および該化合物が放出する陽電子に基づいてガンマ線量を生成している細胞を検出する工程を包含し、該化合物は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物であり、該化合物において、第１のポリペプチドは、標識されるべき細胞に発現している膜タンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでおり、該アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種が、該アミノ酸領域に保持されていることを特徴としている。
本発明にかかるさらなる標識方法は、細胞を標識するために、膜タンパク質とそのＮ末端に付加された第２のポリペプチドとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて細胞を形質転換する工程、および第２のポリヌクレオチドに放射性の金属核種を保持させる工程を包含し、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでいることを特徴としている。
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。
本発明によれば、生体高分子であるタンパク質を放射標識する際に、従来のような毒性が不明である低分子化合物（キレーター）などの化学修飾が不要である。また、ＤＯＴＡ等のキレーターを用いた放射標識では、所望の部位に所望の数の放射標識を導入することが極めて困難であったが、本発明を用いれば、タンパク質のＮ末端を特異的に放射標識することが可能になり、タンパク質を標識する金属核種の個数を限定することが可能になった。
本発明の化合物を投与したラットにおける、全身のＰＥＴ画像を示す図である。 本発明の化合物を投与したラットにおける、腹部のＰＥＴ画像を示す図である。 本発明の化合物を投与したヌードマウスにおける、全身のＰＥＴ画像を示す図である。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
〔１〕本発明の化合物
本発明は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されている構成を有している化合物を提供する。
〔１−１〕ポリペプチドおよびポリヌクレオチド
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。ポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよく、遺伝子工学的に生成されてもよい。
用語「単離された」ポリペプチドは、その天然の環境から取り出されたポリペプチドが意図される。例えば、宿主細胞（形質転換体）中で発現された組換えポリペプチドは、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドと同様に、単離されているとみなされる。
生成されたポリペプチドは、当該ポリペプチドと特異的に結合し得る抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、容易に精製され得る。抗体アフィニティークロマトグラフィーの使用に加えて、目的のポリペプチドは、広範な公知のタンパク質精製技術（例えば、硫安分画、溶媒沈殿、免疫沈降法、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、等電点沈殿、エレクトロフォーカシング、電気泳動法など）を単独または組み合わせて用いて精製され得る。なお、アフィニティークロマトグラフィーに用いられる抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、当該分野に周知の方法によって作製され得る（例えば、ペプチド抗体）。
また、本発明において、精製手順を簡便化する目的で、ポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含んでいてもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のタグ標識ポリペプチド、およびＧＳＴなどが挙げられる。このような付加的なポリペプチドは、当該分野に周知の方法によって、ポリペプチドの精製後に首尾よく切断され得る。
当業者は、目的のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を容易に取得し得る。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。また、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合した「ポリヌクレオチド」は「オリゴヌクレオチド」と交換可能に使用される。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」または「塩基配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号Ｘに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号Ｘの各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態にて存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドは、非翻訳領域の配列またはベクター配列などの配列を含むものであってもよい。また、コードされるポリペプチドに、上述したような付加的なポリペプチドを含ませるために、ポリヌクレオチドは、その５’側または３’側において、タグ標識をコードするポリヌクレオチドとインフレームで連結されていてもよい。
〔１−２〕第１のポリペプチド
本発明の化合物において、第１のポリペプチドは、本発明の化合物を生体内にて標的組織に指向させる機能を担っている。第１のポリペプチドと特異的に結合するタンパク質が発現している組織を標的とすることによって、本発明の化合物は生体内にて所望の部位に送達され得る。すなわち、第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであることを特徴としている。
第１のポリペプチドと特異的に結合するタンパク質としては、第１のポリペプチドのレセプターが挙げられるが、これに限定されない。本発明の化合物の送達が生体内の特定部位に限定されることが所望される場合、上記タンパク質として、目的の部位において特異的に発現しているタンパク質が選択されればよい。このようなタンパク質としては、膜タンパク質が好ましいが、組織特異的に発現している細胞外マトリクスタンパク質であってもよい。当業者は、本発明の化合物が指向されるべき組織を選択した際に、その組織に特異的に発現しているタンパク質を、当該分野の技術常識に基づいて容易に選択し得、この選択されたタンパク質に特異的に結合するポリペプチドを容易に選択し得る。すなわち、当業者は、当該分野の技術常識に基づいて、標的組織に応じて第１のポリペプチドを容易に選択し得る。
本明細書中で使用される場合、第１のポリペプチドのアナログは、第１のポリペプチドのレセプターとの特異的な結合能力を有しているが、第１のポリペプチドと異なる化学構造を有する化合物をいう。すなわち、第１のポリペプチドと特異的に結合するタンパク質は、第１のポリペプチドのアナログと特異的に結合するタンパク質でもあり得る。
後述する実施例において、ソマトスタチンのアナログの１つであるオクトレオチドを用いて本発明を例証しているが、第１のポリペプチドのアナログとしてはこれに限定されない。また、ソマトスタチンのアナログは、ソマトスタチン受容体の５つのサブタイプ（ＳＳＴＲ１〜５）の少なくとも１つに対する特異的な結合能力を有している化合物であればよく、ソマトスタチンのアナログとしては、例えば、オクトレオチドおよびオクトレオチド類縁体が挙げられ、オクトレオチド類縁体として、例えば、〔Ｔｙｒ３〕−オクトレオチド、バプレオチド（Vapreotide）、ランレオチド（Lanreotide）、〔Ｔｙｒ３〕−オクトレオテート（Octreotate）、〔Ｔｙｒ３,Ｔｙｒ8〕−オクトレオチド、等が挙げられる（参考文献として、Storch et al., The Journal of Nuclear Medicine, Vol.46, No.9, 2005、Reubi et al., European Journal of Nuclear Medicine, Vol.27, No.3, 2000参照）。なお、このような化合物に対して化学修飾（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の修飾）を施した化合物もまた、本発明における「アナログ」に含まれる。上述したように、当業者は、当該分野の技術常識に基づいて、標的組織に応じて第１のポリペプチドを容易に選択し得、その上で、比較的長時間にわたって生体内情報を観察することを目的とする場合には、当該分野の技術常識に基づいて、生理学的半減期がより長い（すなわち、生体内での代謝または排出の速度が比較的緩やかである）アナログを容易に選択し得る。
また、第１のポリペプチドのさらなる例としては、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）の受容体に直接結合するエクセナチド（exenatide）、サブスタンスＰ受容体アンタゴニストであるスパンタイド（spantide）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）等が挙げられる。ＥＧＦ、ＩＦＮ等のアミノ酸配列は当該分野において周知であり、当業者は容易に入手し得る。
〔１−３〕第２のポリペプチド
本発明の化合物において、第２のポリペプチドは、本発明の化合物が標的組織に到達するまでの間、放射性の金属核種を担持する機能を担っている。第２のポリペプチドが放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を有していることによって、第２のポリペプチドはこのような機能を首尾よく発揮することができる。すなわち、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでいることを特徴としている。生体内に投与されるべき本発明の化合物が生体内にて毒性を示す危険性を低減させるために、第２のポリペプチドは生体分子（すなわち天然に存在するタンパク質）のフラグメントであることが好ましい。
一実施形態において、本発明の化合物は、生体内にて標的組織に指向する放射標識化合物である。本実施形態において、放射性の金属核種が、上記アミノ酸領域に保持されている。このような構成を有していることによって、本発明の化合物は、放射性の金属核種を標的組織へ送達することができるので、放射線治療用の薬剤として非常に有用である。また、本発明の化合物は、放射性の金属核種によって生成されるガンマ線量に基づく情報（例えば生体内での物質の動態に関する情報）を提供し得るので、陽電子放射断層画像撮影用の分子プローブ（いわゆるＰＥＴプローブ）として用いることによってＰＥＴ画像診断に非常に有用である。
上述したように、本発明の化合物は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されている構成を有している。本発明の化合物が放射線治療に用いられる場合、第２のポリペプチドに保持されている放射性の金属核種が標的組織へ送達されればよいので、第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであれば特に限定されない。なお、第２のポリペプチドは、第１のポリペプチドと上記タンパク質との結合を阻害しない部位に付加されていることが重要であり、第２のポリペプチドは、第１のポリペプチドのＮ末端に付加されている。
上述したように、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでいる。このようなアミノ酸領域は、本発明の化合物が適用される生体において天然に存在するタンパク質のフラグメントであることが好ましい。このような構成を有することによって、本発明が生体に対して毒性を示す危険性を大いに低減し得る。また、このような構成を有する第２のポリペプチドは、本発明の化合物が適用される生体において天然に存在するタンパク質そのものであってもよいといえる。
また、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域は、第２のポリペプチド中に複数含まれていてもよい。この場合、複数の上記アミノ酸領域は、互いに同一であっても異なってもよい。
１つの局面において、上記アミノ酸領域としては、Ｘ１−Ｈｉｓ（Ｘ１はＰｒｏ以外の任意のアミノ酸を表す。）を含んでいることが好ましく、Ｘ２−Ｘ１−ＨｉｓまたはＸ２−Ｘ１−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ（Ｘ１はＰｒｏ以外の任意のアミノ酸を表し、Ｘ２はＭｅｔ、ＡｓｐまたはＧｌｕを表す。）を含んでいることがより好ましい。このような構成のアミノ酸領域を含んでいることによって、半減期が比較的長い６４Ｃｕを放射性の金属核種として用いることができ、ＰＥＴプローブとしての用途に好適である。なお、このような構成のアミノ酸領域は２価の金属イオンを結合させる際に特に好適に利用され、このような構成のアミノ酸領域と親和性が高い放射性の金属核種は、６４Ｃｕ、６５Ｚｎ、７２Ｚｎ、５６Ｃｏ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、６０Ｃｏ、１０９Ｃｄ、１１３Ｃｄ、５６Ｎｉ、５９Ｎｉ、６３Ｎｉが挙げられ、いずれも好適に利用され得る。また、２価の金属イオンを結合させる際に利用され得るアミノ酸領域として、Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓを含んでいる構成が挙げられる。このような構成のアミノ酸領域と親和性が高い放射性の金属核種は、６４Ｃｕ、６５Ｚｎ、７２Ｚｎ、５６Ｎｉ、５９Ｎｉ、６３Ｎｉが挙げられ、いずれも好適に利用され得る。
他の局面において、上記アミノ酸領域としては、Ｍｅｔ−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ４−Ｘ５−Ｃｙｓ（Ｘ３はＴｈｒ，Ｓｅｒ，ＨｉｓまたはＡｓｎを表し、Ｘ４はＡｌａ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｓｅｒ，Ａｓｐ，ＧｌｙまたはＧｌｕを表し、Ｘ５はＧｌｙ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ，ＧｌｎまたはＧｌｕを表す。）を含んでいることが好ましく、Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｃｙｓを含んでいることがより好ましい。このような構成のアミノ酸領域は１価の金属イオンを結合させる際に特に好適に利用され、ＰＥＴプローブとしての用途に好適である。このような構成のアミノ酸領域と親和性が高い放射性の金属核種は、６４Ｃｕ、６５Ｚｎ、７２Ｚｎ、５６Ｃｏ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、６０Ｃｏ、１０９Ｃｄ、１１３Ｃｄ、１９４Ｈｇが挙げられ、いずれも好適に利用され得る。
また、本発明の化合物を送達すべき部位が頭部（特に脳内）の場合、血液脳関門を通過する能力の観点から、第２のポリペプチドの長さは短いことが好ましく、３〜１５個のアミノ酸からなることがより好ましい。この場合、第２のポリペプチドが上記アミノ酸領域からなるペプチドであってもよい。
本発明の化合物において、上記アミノ酸領域は、第２のポリペプチド中に含まれていればよいが、第２のポリペプチドのＮ末端部分を構成している（すなわち、上記アミノ酸領域が第２のポリペプチドのＮ末端に露出している）ことによって、放射性の金属核種をより強く保持することができ、品質安定性を高めることができる。
本発明の化合物において好適に利用される、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域としては、ＤＡＨ、ＤＡＨＫ、ＤＴＨ、ＤＴＨＫ、ＥＡＨ、ＥＡＨＫ、ＭＴＣＡＮＣ、ＤＡＨＫＭＴＣＡＧＣ、ＤＡＨＫＧＭＴＣＡＮＣ、ＤＡＨＫＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＤＡＨＫＧＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＤＴＨＫＭＴＣＡＧＣ、ＤＴＨＫＧＭＴＣＡＮＣ、ＤＴＨＫＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＤＴＨＫＧＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＥＡＨＫＭＴＣＡＧＣ、ＥＡＨＫＧＭＴＣＡＮＣ、ＥＡＨＫＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＥＡＨＫＧＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＨＧＤＨＭＨＮＨＤＴＫが挙げられるがこれらに限定されない。また、第２のポリペプチドがこれらのアミノ酸領域からなってもよい。
後述する実施例において、ソマトスタチンを第１のポリペプチドとして、そのアナログの１つであるオクトレオチドのＮ末端に、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓからなる第２のポリペプチドを付加した化合物を用いて、本発明を例証している。ソマトスタチンのレセプターが特異的に発現している膵臓および下垂体へ本発明の化合物が集積していることより、これらの部位に対する放射線治療が可能であることがわかる。別の実施例において、エクセナチドのＮ末端に、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓからなる第２のポリペプチドを付加した化合物を用いて、本発明を例証している。オクトレオチドを用いた実施例と同様に、ＧＬＰ−１受容体が高発現している膵臓へ本発明の化合物が集積している。また、スパンタイドのＮ末端にＡｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓからなる第２のポリペプチドを付加した化合物（Asp-Ala-His-Lys-D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Leu）も同様に用いられ得る。もちろん、第１のポリペプチドが薬剤としての機能を有していてもよく、この場合は、第１のポリペプチドの機能と金属核種の機能とによる相乗効果が期待され得る。さらに、本発明者らは、オクトレオチドまたはエクセナチドのＮ末端に、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓからなる第２のポリペプチドを付加した化合物を生成している。
Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓのアミノ酸配列は、ヒトアルブミンに存在し、この領域が、２価の金属イオンを結合することが知られている（参考文献として、Malgorzata Rozga et al., J. Biol. Inorg. Chem. (2007), 12: 913-918、David Bar-Or et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2001), 284(3): 856-862、Leonard T.R. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2007), 357: 543-548、Catherine Harford and Bibudhendra Sarkar, Acc. Chem. Res. (1997), 30: 123-130、Peter J. Sadler et al., Eur. J. Biochem. (1994), 220: 193-200参照）。また、Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓのアミノ酸配列は、Cu, Zn superoxide dismutase（Ｃｕ，ＺｎＳＯＤ）に存在し、この領域が、２価の金属イオンを結合することが知られている（参考文献として、J Inorg Biochem. (2008) 102(9): 1700-10、J. Mol. Biol. (2009) 386: 406-418等参照）。さらに、上記Ｍｅｔ−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ４−Ｘ５−Ｃｙｓのアミノ酸配列は、P-type ATPase （ＣｏｐＡ）に存在し、この領域が、１価の金属イオンを結合することが知られている（参考文献として、Biochemistry (2005) 44: 13144-13150、J Biol Chem. (2001) 276: 30315-30325、Biochem. Biophys. Res. Comm. (2007) 357: 543-548、Genome Res. (2002) 12: 255-271、J Biol Chem. (2007) 282: 8622-8631、Biochem. J. (2008) 411: 571-579等参照）。
しかし、これらの文献には、放射性の金属核種との結合が記載も示唆もされていないばかりか、放射標識化合物が教示も示唆もされていない。また、結合した２価の金属イオンを容易に解離することも記載されている。よって、これらの知見に基づいて、当業者は、生体内にて臨床的に利用可能な放射標識化合物に容易に想到し得ない。特に、生体内に存在する領域を用いる以上、その生体内にて天然に存在しているタンパク質と競合して互いに機能を阻害しかねないことを考慮すると、当業者は、本発明の化合物の構成に容易に想到し得ない。このように、当業者は、従来知られている知見から、放射性の金属核種を担持した状態で生体内にて目的の部位に送達され得る化合物を容易に構成し得ない。
なお、上述したように、ＰＥＴ用の分子プローブまたは放射性薬剤として用いられている放射標識化合物では、ＤＯＴＡ等のキレーターが用いられている。このことは、放射性金属の結合にキレーターが極めて優れていることを示している。後述する実施例において例証した結果は、ＤＯＴＡを用いて作製した化合物を用いた結果に匹敵するものであり、このような優れた効果を、キレーターを用いることなく実現し得ることは、当業者が予測し得るものではない。
そもそも、化合物を放射標識する際に用いられる放射金属核種の量は少量であり、そのために反応液中の放射金属核種の濃度は極めて低濃度になる（例えば、６４Ｃｕの場合、１０００ＭＢｑで７ｎｇであり、３００ＭＢｑを１００μＬに溶解して反応させるとその濃度は０．３μＭ程度である。）。そこに１〜１０ｎｍｏｌｅ程度のペプチドを添加して反応させるので、放射標識の反応は非常に低濃度の環境下で行われる。これにも関わらず、本発明の化合物の標識反応が首尾よく進行することは、当業者に容易に予測し得るものではない。もちろん、当業者は、標識反応が首尾よく進行させるための構成（すなわち、本発明の構成）に容易に想到し得ない。
なお、本発明の目的は、生体内にて標的組織に指向する放射標識化合物を提供することにあるのであって、具体的に記載したポリペプチドに限定されるものではない。また、このような化合物の作製方法については、下記方法以外によって取得される放射標識化合物もまた本発明の技術的範囲に属することに留意すべきである。
〔２〕本発明の化合物の製造方法
本発明はまた、上述した化合物を製造する方法を提供する。本発明の製造方法は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に、第２のポリペプチドを付加する工程と、第２のポリペプチド中に放射性の金属核種を保持させる工程を包含していればよい。化合物について上述したように、第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでいる。すなわち、第２のポリペプチド中に放射性の金属核種を保持させる工程は、上記アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種を、該アミノ酸領域に保持させる工程といえる。第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドについては、上記〔１−２〕および〔１−３〕を参照のこと。
一実施形態において、第２のポリペプチドを付加する工程は、ペプチド固相合成法を用いて第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドを合成することによって行われる。他の実施形態において、第２のポリペプチドを付加する工程は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの融合タンパク質を遺伝子工学的に生成することによって行われる。
第１のポリペプチドが天然に存在するタンパク質（またはそのフラグメント）である場合、本発明の化合物は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの融合タンパク質として遺伝子工学的に生成されることが好ましく、第１のポリペプチドが合成ペプチド（例えば天然に存在するタンパク質を改変した合成物）である場合、ペプチド固相合成法を用いて合成されることが好ましい。
送達すべき部位が頭部（特に脳内）である化合物を製造する場合、上述したように、第２のポリペプチドの長さは短いことが好ましい。このような短いペプチドを第２のポリペプチドとして用いる場合は、第１のポリペプチドが天然に存在するタンパク質（またはそのフラグメント）であっても、ペプチド固相合成法が用いられてもよい。
遺伝子工学的なポリペプチド生成は、形質転換体を用いるものであっても、インビトロ翻訳を用いるものであってもよく、形質転換体（例えば、原核生物細胞および真核生物細胞）は、目的のポリペプチドを一過性に発現するものであっても安定的に発現するものであってもよい。目的のポリペプチドを一過性に発現させれば、目的のポリペプチドを迅速に調製し得、安定的に発現させれば、目的のポリペプチドを大量に調製し得る。
遺伝子工学的な生成は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが機能的に挿入されたベクターを用いて行われ得る。本明細書中において使用される場合、「機能的に挿入される」は、適切なオープンリーディングフレームおよび方向に従ってベクター中に挿入されることが意図される。遺伝子工学的な生成に用いられるベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。このようなベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
組換え発現に用いられるべきベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に目的の遺伝子（ポリヌクレオチド）を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、選択したプロモーター配列と目的の遺伝子とを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。また、発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を培養した後にその培養物または培養上清から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）を用いて、目的タンパク質を回収／精製することができる。
発現ベクターは、従来公知の選択マーカーを含むことが好ましい。また、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されず、従来公知の方法が好適に用いられ得る。
なお、遺伝子工学的なポリペプチド生成を行うために、当業者は、目的のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列に関する情報を、任意の配列データベースから容易に取得し得る。また、当業者は、当該分野の技術常識に基づいて、必要な遺伝子ライブラリーを容易に構築し、そこから所望のヌクレオチド配列を有する遺伝子を容易に調製し得る。さらに、当業者は、当該分野の技術常識に基づいて、得られた遺伝子の所望の部位に、目的のアミノ酸領域をコードするポリヌクレオチドを挿入した遺伝子を容易に調製することができる。
上述したように、本発明の化合物において、上記アミノ酸領域は、第２のポリペプチドのＮ末端部分を構成している（すなわち、上記アミノ酸領域が第２のポリペプチドのＮ末端に露出している）ことが好ましい。当業者は、当該分野における技術常識を用いて、上記アミノ酸領域を第２のポリペプチドのＮ末端部分に構成することができる。例えば、ペプチド固相合成法が用いられる場合は、目的のアミノ酸を第２のポリペプチドのＮ末端に順次合成すればよい。また、遺伝子工学的なポリペプチド生成の場合は、開始メチオニンに続いて上記アミノ酸領域を構成してもよく、上記アミノ酸領域のＮ末端側に酵素による切断部位を設けた第２のポリペプチドと第１のポリペプチドとの融合タンパク質を生成した後に、所定の酵素を用いて切断処理を行ってもよい。このような切断処理は当該分野において周知である。
〔３〕本発明の組成物
上述したように、本発明の化合物を用いれば、放射性の金属核種を生体内にて標的組織に指向させることができるので、陽電子放射断層画像撮影による診断や放射線治療に特に有用である。
すなわち、本発明は、放射性の金属核種を生体内にて標的組織に指向させるための組成物を提供する。本発明の組成物は、溶液または懸濁液のいずれかの形態にて調製されていても、液体（例えば、緩衝液）に溶解もしくは懸濁するために適切な固体形態として調製されていてもよい。
本発明の組成物は、放射性の金属核種を生体内にて標的組織に指向させるために必要な構成として、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物を含有しており、第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでいる。第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドについては、上記〔１−２〕および〔１−３〕を参照のこと。
このように、本発明の組成物は、放射性の金属核種を保持する前の化合物を含有していても、放射性の金属核種を保持した化合物を含有していてもよい。前者の場合、本発明の組成物は、生体内にて標的組織に指向する放射標識化合物を調製するための組成物であり得る。
なお、本発明の組成物は、キットとして提供されてもよい。「組成物」は各種成分が一物質中に含有されている形態であり、「キット」は各種成分の少なくとも１つが別物質中に含有されている形態であるが、本明細書中で使用される場合、「有効成分を含有している組成物」は「有効成分を備えているキット」を包含する。キット形態の場合、後述する化合物を有効成分として備えていればよく、組成物として含まれ得る成分をさらに備えていてもよい。すなわち、本発明の組成物は、「放射性の金属核種を保持する前の化合物」と「放射性の金属核種」とを別々に備えたキットであり得る。
本明細書中で使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは各材料を使用するための指示書を備える。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、キットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であり得る。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。キットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。さらに、キットは、用途に応じて必要な器具をあわせて備えていてもよい。
〔４〕本発明のさらなる利用
上述したように、本発明の化合物および組成物は、放射性の金属核種を生体内にて標的組織に指向させる能力に基づいて、陽電子放射断層画像撮影による診断に用いられ得る。すなわち、本発明は、生体内における陽電子放射断層画像を撮影する方法を提供する。本方法は、生体内に投与された化合物が放出する陽電子に基づいて生成されるガンマ線量を生体から検出する工程を包含することを特徴としており、上記化合物が本発明の化合物であればよい。また、上記化合物は、本発明の組成物として提供されてもよい。上記検出する工程においては、通常、陽電子断層撮像装置を用いたイメージング（画像化）が用いられるので、生体に対して低侵襲であるという利点がある。このような方法は、医師による診断を補助するためのデータ収集方法であり得る。
なお、本方法は診断方法としても利用可能であるが、ヒトに適用される場合は、医師が行う工程（例えば、生体内に化合物を投与する工程、医師が判断する工程）を包含することが意図されない。本方法が非ヒト哺乳動物に適用される場合は、獣医師が行う工程を包含してもよく、この場合の投与は、種々の経路による注入が好ましいが、これに限定されない。また、投与量も、必要に応じて適宜設計され得る。
さらに、本発明の化合物および組成物は、放射性の金属核種を生体内にて標的組織に指向させる能力に基づいて、放射線治療に用いられ得る。このことは、放射線治療に用いられ得る物質のスクリーニングが可能であることを示す。すなわち、本発明は、放射線治療に用いる化合物をスクリーニングする方法を提供する。本方法は、上述した生体内における陽電子放射断層画像を撮影する方法と同様に、生体内に投与された化合物が放出する陽電子に基づいて生成されるガンマ線量を生体から検出する工程を包含することを特徴としており、上記化合物が本発明の化合物であればよい。また、上記化合物は、本発明の組成物として提供されてもよい。本方法において、上述した化合物の製造方法に従って第１のポリペプチドを複数種調製し、それぞれ放射性の金属核種を生体内にて標的組織に指向させる能力を相互に比較して、より優れたものを選択することによって、目的のスクリーニングが達成される。この場合、既に知られている放射線治療剤を陽性コントロールとして用いることにより、スクリーニングの精度がより向上する。また、本方法は、生成されるガンマ線量を、放射線治療の標的となる組織から検出することがより好ましい。
さらに、本明細書を読んだ当業者であれば、生体内であっても放射性の金属核種を標的組織に指向させることができる本発明の化合物および組成物を用いれば、タンパク質および細胞を首尾よく標識し得るということを、容易に理解する。
１つの局面において、本発明は、サンプル中の目的のタンパク質を検出する方法を提供する。本方法において、目的のタンパク質を含む（あるいは、含む可能性がある）サンプルを、本発明の化合物または組成物とともにインキュベートすることによって、（存在するのであれば）目的のタンパク質が首尾よく放射標識される。本方法は、例えば、イムノブロット法における一次抗体の代りに用いられ得る。サンプル中の目的のタンパク質を検出する方法として、種々の蛍光標識技術が知られている。本発明の化合物が放射性の金属核種を保持していることによって、本方法は、蛍光標識技術と比較して、より低濃度の目的タンパク質を検出し得る。
他の局面において、本発明は、細胞を標識する方法を提供する。本方法において、目的の膜タンパク質を発現している（あるいは、発現している可能性がある）細胞を、本発明の化合物または組成物とともにインキュベートすることによって、（存在するのであれば）目的の膜タンパク質が首尾よく放射標識される。本方法は、例えば、免疫組織化学における一次抗体の代りに用いられ得る。
なお、細胞を標識するという観点において、本発明はさらなる方法を提供する。本方法は、膜タンパク質とそのＮ末端に付加された第２のポリペプチドとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて細胞を形質転換する工程、および第２のポリヌクレオチドに放射性の金属核種を保持させる工程、を包含することを特徴としている。第２のポリペプチドについては、上記〔１−３〕を参照のこと。本方法を用いれば、上記ポリペプチドを、形質転換における選択マーカーとして利用することができるだけでなく、放射性の金属核種を送達することが望まれる細胞に対して、所望の性質を付与することができる。本方法を用いて放射性の金属核種を結合させるためには、放射性の金属核種が結合するアミノ酸領域が細胞外に存在することが好ましい。当業者は、膜タンパク質の配列情報を容易に取得することができるので、所望の部位に目的のアミノ酸領域が挿入された膜タンパク質を容易に構築し得る。また、目的のアミノ酸領域によって膜タンパク質のＮ末端部分を構成する場合は、未成熟な膜タンパク質のＮ末端に存在するシグナルペプチドに続いて目的のアミノ酸領域が構成すればよい。これらを実行するための手順は、当該分野において公知であり、当業者であれば試行錯誤を必要とすることなく行い得る。
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
本発明について、以下の実施例等に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
〔実施例１〕
Fmoc-Thr(tBu)-ol-(2-Cl)トリチル樹脂（０．２５ｍｍｏｌ／ｇ）を出発原料とし、標準的なFmoc固相合成法を用いて、Ｎ末端に金属結合配列を付加したOctreotideを合成し、H-Asp(OtBu)-Ala-His(Trt)-Lys(Boc)-D-Phe-Cys(trt)-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-ol-(2-Cl)Trt樹脂を得た。この樹脂をメタノールで洗浄した後に、減圧乾燥に供した。
乾燥した樹脂５０ｍｇを、トリイソプロピルシラン１０μＬ、エタンジチオール２５μＬ、水２５μＬ、トリフルオロ酢酸９４０μＬを含む溶液を用いて、室温で２時間処理し、脱保護、および樹脂からの切り出しを行った。反応後、冷エーテル５ｍＬを用いて粗ペプチドを沈殿させ、この沈殿をアセトニトリル水溶液に溶解し、逆相ＨＰＬＣに供した。目的の画分を、５％ＤＭＳＯを添加したＰＢＳ緩衝液中にて一晩撹拌し、ジスルフィド結合を形成させた。粗生成物を逆相ＨＰＬＣに供し、目的物であるDAHK−Octreotide（H-Asp-Ala-His-Lys-D-Phe-Cys-Phe-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol）２ｍｇを得た。
次いで、公知の方法を用いて、６４Ｎｉにサイクロトロンでプロトンを照射し、６４ＣｕＣｌ２を得た。DAHK−Octreotide（０．８６ｎｍｏｌ）に６４ＣｕＣｌ２（１６０ＭＢｑ）を、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）２００μＬ中にて、４０℃で１時間反応させた。反応後の溶液を、Ｃ１８固相抽出カラムに供し、目的物である６４Ｃｕ−DAHK−Octreotideをエタノールで溶出した。得られた６４Ｃｕ−DAHK−Octreotideの比放射能は約１６ＧＢｑ／μｍｏｌであった。
得られた６４Ｃｕ−DAHK−Octreotide（０．２ｎｍｏｌ；約３ＭＢｑ）を、２００μＬの生理食塩水に溶解し、１０週齢の雄Spraque Dawley種ラットに、イソフルラン麻酔下にて静脈内投与した。次いで、陽電子断層撮像装置（商品名microPET Focus220 （SIEMENS社製））でこのラットの全身をコンティニュアウスベッドフローモーションにて撮像した。撮像を、投与後９０分後〜１２０分後の間で行い、得られた信号からＯＳＥＭ法を用いて画像を再構成した。
図１には、ラットの全身のＰＥＴ画像を示す。図中の矢印は、上から、下垂体、肝臓、腎臓を示す。図２には、ラットの腹部のＰＥＴ画像を示す。図中の矢印は膵臓を示す。これらの画像から、ソマトスタチン受容体が高発現している下垂体および膵臓へ６４Ｃｕ−DAHK−Octreotideが集積していることが確認された。また、この集積レベルは、ＤＯＴＡを用いて作製した化合物を用いた結果に匹敵するものであった（結果は示さず）。これらのことは、６４Ｃｕ−DAHK−Octreotideが放射性薬剤として利用可能であることを示す。
また、６４Ｃｕ−DAHK−Octreotideを得る際に用いる緩衝液にＨｅｐｅｓ緩衝液を用いることによって、比放射能を約５０ＧＢｑ／μｍｏｌにまで向上させることができた。このことは、本発明の化合物は、極少量であっても有効に利用され得ることを示す。
〔実施例２〕
NovaSyn TGR樹脂（０．２０ｍｍｏｌ／ｇ）を出発原料とし、標準的なFmoc固相合成法を用いて、Ｎ末端に金属結合配列を付加したExenatideを合成し、Asp(OtBu)-Ala-His(Trt)-Lys(Boc)-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-NovaSyn TGR樹脂を得た。この樹脂をメタノールで洗浄した後に、減圧乾燥に供した。
乾燥した樹脂５０ｍｇを、トリイソプロピルシラン１０μＬ、エタンジチオール２５μＬ、水２５μＬ、トリフルオロ酢酸９４０μＬを含む溶液を用いて、室温で２時間処理し、脱保護、および樹脂からの切り出しを行った。反応後、冷エーテル５ｍＬを用いて粗ペプチドを沈殿させ、この沈殿をアセトニトリル水溶液に溶解し、逆相ＨＰＬＣに供し、目的物であるDAHK−Exenatide（Asp-Ala-His-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2）４ｍｇを得た。
次いで、公知の方法を用いて、６４Ｎｉにサイクロトロンでプロトンを照射し、６４ＣｕＣｌ２を得た。DAHK−Exenatide（０．７５ｎｍｏｌ）に６４ＣｕＣｌ２（１７４ＭＢｑ）を、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）１００μＬ中にて、４０℃で１時間反応させた。反応後の溶液を、Ｃ１８固相抽出カラムに供し、目的物である６４Ｃｕ−DAHK−Exenatideをエタノールで溶出した。得られた６４Ｃｕ−DAHK−Exenatideの比放射能は約８０ＧＢｑ／μｍｏｌであった。
得られた６４Ｃｕ−DAHK−Exenatide（０．１ｎｍｏｌ；約１４ＭＢｑ）を、２００μＬの生理食塩水に溶解し、３６週齢の雄Bulb/c ヌードマウスに、イソフルラン麻酔下にて尾静脈内投与した。次いで、陽電子断層撮像装置（商品名microPET Focus220 （SIEMENS社製））でこのマウスの全身を撮像した。撮像を、投与後直後〜９０分後の間で行い、得られた信号からＦＢＰ法を用いて画像を再構成した。
図３には、マウスの全身のＰＥＴ画像を示す。図中の矢印は、膵臓（１）、腎臓（２）、肝臓（３）、膀胱（４）を示す。これらの画像から、ＧＬＰ−１受容体が高発現している膵臓へ６４Ｃｕ−DAHK−Exenatideが集積していることが確認された。
本発明は、疾患の診断、判定および治療に有用であり、医薬分野に大いに貢献する。

Claims (21)

  1. 第１のポリペプチドのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物であって、
    上記化合物は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドからなり、
    第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、
    第２のポリペプチドは、ＤＡＨＫ、ＤＴＨＫおよびＥＡＨＫからなる群より選択され、
    ６４Ｃｕが第２のポリペプチドに保持されている、化合物。
  2. 前記第２のポリペプチドがＤＡＨＫである、請求項１に記載の化合物。
  3. 上記タンパク質が、ソマトスタチン受容体タンパク質であり、第１のポリペプチドが、ソマトスタチン、オクトレオチド、〔Ｔｙｒ３〕−オクトレオチド、バプレオチド、ランレオチド、〔Ｔｙｒ３〕−オクトレオテートおよび〔Ｔｙｒ３,Ｔｙｒ8〕−オクトレオチドからなる群より選択される化合物、またはこれらにＰＥＧ修飾が施された化合物である、請求項１または２に記載の化合物。
  4. 上記タンパク質が、グルカゴン様ペプチド１受容体タンパク質であり、第１のポリペプチドが、エクセナチドまたはＰＥＧ修飾されたエクセナチドである、請求項１または２に記載の化合物。
  5. 上記タンパク質が、サブスタンスＰ受容体タンパク質であり、第１のポリペプチドが、スパンタイドまたはＰＥＧ修飾されたスパンタイドである、請求項１または２に記載の化合物。
  6. 上記タンパク質が、上皮増殖因子受容体タンパク質であり、第１のポリペプチドが、上皮増殖因子またはＰＥＧ修飾された上皮増殖因子である、請求項１または２に記載の化合物。
  7. 上記タンパク質が、インターフェロン受容体タンパク質であり、第１のポリペプチドが、インターフェロンまたはＰＥＧ修飾されたインターフェロンである、請求項１または２に記載の化合物。
  8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物を製造する方法であって、
    第１のポリペプチドのＮ末端に、第２のポリペプチドを付加する工程、および
    ６４Ｃｕを第２のポリペプチドに保持させる工程
    を包含する、製造方法。
  9. 第２のポリペプチドを付加する上記工程が、ペプチド固相合成法を用いて第１のポリペプチドのＮ末端に第２のポリペプチドを合成することによって行われる、請求項８に記載の製造方法。
  10. 第２のポリペプチドを付加する上記工程が、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの融合タンパク質を遺伝子工学的に生成することによって行われる、請求項８に記載の製造方法。
  11. ６４Ｃｕを生体内にて標的組織に指向させるための組成物であって、
    第１のポリペプチドのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物を含有しており、
    上記化合物は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドからなり、
    第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、
    第２のポリペプチドは、ＤＡＨＫ、ＤＴＨＫおよびＥＡＨＫからなる群より選択される、組成物。
  12. 第２のポリペプチドがＤＡＨＫである、請求項１１に記載の組成物。
  13. 第１のポリペプチドが、ソマトスタチン、オクトレオチド、〔Ｔｙｒ３〕−オクトレオチド、バプレオチド、ランレオチド、〔Ｔｙｒ３〕−オクトレオテートおよび〔Ｔｙｒ３,Ｔｙｒ8〕−オクトレオチドからなる群より選択される化合物、エクセナチド、スパンタイド、上皮増殖因子またはインターフェロン、あるいはこれらにＰＥＧ修飾が施された化合物である、請求項１１または１２に記載の組成物。
  14. 陽電子放射断層画像撮影による診断に用いられる、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
  15. 放射線治療に用いられる、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
  16. ６４Ｃｕを、さらに含有している、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
  17. 生体内に投与された放射標識化合物の、生体内における陽電子放射断層画像を撮影する方法であって、
    生体内に投与された、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物が放出する陽電子に基づいて生成されるガンマ線量を生体から検出する工程、および
    上記標的組織の陽電子放射断層画像を撮影する工程
    を包含する、方法。
  18. 生体外のサンプル中の目的のタンパク質を検出する方法であって、
    生体外にてサンプルを請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物とともにインキュベートする工程、および
    該化合物が放出する陽電子に基づいて生成されるガンマ線量を検出する工程
    を包含する、方法。
  19. 生体外にて細胞を標識する方法であって、
    生体外にて細胞を請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物とともにインキュベートする工程、および
    該化合物が放出する陽電子に基づいてガンマ線量を生成している細胞を検出する工程
    を包含する、方法。
  20. 生体外にて細胞を６４Ｃｕで標識する方法であって、
    膜タンパク質とそのＮ末端に付加された第２のポリペプチドとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて細胞を形質転換する工程であって、上記融合タンパク質は上記膜タンパク質および第２のポリペプチドからなる、工程、および
    第２のポリヌクレオチドに６４Ｃｕを保持させる工程
    を包含し、
    第２のポリペプチドは、ＤＡＨＫ、ＤＴＨＫおよびＥＡＨＫからなる群より選択される、方法。
  21. 第２のポリペプチドがＤＡＨＫである、請求項２０に記載の方法。
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