JP5890222B2 - 培養軟骨組織材料 - Google Patents
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Description
軟骨組織を再生するためには、軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞が播種培養された軟骨組織再生材料が必要である。
特許文献2には、哺乳動物から採取した軟骨から軟骨由来細胞を単離し、単離した軟骨由来細胞を、該哺乳動物種由来の血清、又は血漿存在下で培養する人工軟骨組織の製造方法が開示されている。
請求項1に記載の発明は、軟骨再生に用いられる軟骨細胞を含む培養軟骨組織材料であって、1×107cell/cm3〜1×109cell/cm3の濃度の軟骨細胞と生体吸収性高分子との混合体であり、最小部の厚さが2.2mm〜100mm、軟骨細胞と生体吸収性高分子との体積比が7:3〜9.5:0.5、グリコサミノグリカン産生量が単位細胞あたり0.001ng〜0.2ng、I型コラーゲンとII型コラーゲンとの含有比が10:90〜1:99、であり、組織乾燥重量1mg当たり0.01mg〜0.65mgのII型コラーゲンを含む、ことを特徴とする培養軟骨組織材料である。
気孔率が60%よりも小さいと後述するような、軟骨細胞、又は軟骨細胞分化幹細胞の培養をするための効率が低くなり、95%を超えると生体吸収性高分子多孔体自体の強度が低下する。従って、気孔率は80%〜90%であることがさらに好ましい。また、孔径が180μmより小さいと軟骨細胞、又は軟骨細胞分化幹細胞を生体吸収性高分子多孔体内に導入することが困難となり、生体吸収性高分子多孔体の内部まで十分に軟骨細胞、又は軟骨細胞分化幹細胞を播種することができない。一方、孔径が3500μmよりも大きいと生体吸収性高分子多孔体自体の強度が低下してしまう。
また、平均孔径は540μm〜1200μmであることが好ましい。
これらを採取する方法は通常医科で行われている方法が特に限定されずに使用でき、中でも採取の際、皮膚、筋肉の剥離切開が最小ですむ簡易な手術で行うことが可能な腸骨等の骨髄、口蓋又は歯槽骨等の骨膜等を採取源とすることが好ましい。
組織再生材料作製工程S13は、載置工程S131、細胞懸濁液導入工程S132、及び反転工程S133を有している。図1、図2に組織再生材料作製工程S13を説明する図を示した。
具体的には、生体吸収性高分子多孔体の体積1cm3〜50000cm3の範囲において、底面積が0.5cm2〜200cm2であることが好ましい。0.5cm2未満又は200cm2を超えると保持板に吊り下げた状態で播種することが難しくなる。
従って、培養軟骨組織材料は、上記したように、組織再生材料10から培養の過程を経た後における、生体吸収性高分子と、この生体吸収性高分子中に培養されて含まれる軟骨組織とにより構成されている。すなわち、本実施形態では、培養軟骨組織材料は、上記した組織再生材料についてここに含まれる軟骨細胞、軟骨細胞分化幹細胞から分化した軟骨細胞を培養することにより作製された材料である。
これら軟骨細胞の増幅・分化(培養)は公知の方法により行うことができる。例えば増殖培養液により増幅させることができる。また、増殖させた後に軟骨分化用培養液を用いて分化、培養することが可能である。
ここで仮載置板2は撥水性のある板、保持板1は親水性のある板により構成されているので、細胞懸濁液で満たされた生体吸収性高分子多孔体の上記したような保持、離脱が適切に行われる。
<実施例1>
実施例1は次のような過程を経て培養軟骨組織材料D1を作製し、移植工程により移植を行った。
(細胞採取工程及び増幅培養工程による細胞A1の準備)
ヒト滑膜から採取した組織をコラゲナーゼ処理した細胞を20%FBS、αMEM培地で有核細胞数1×104cell/mlの濃度で懸濁した後、直径10cmの培養皿へ10ml播種した。37℃にて5%炭酸ガス存在下で増殖培養した。3日目で培地を交換し、非接着細胞(造血系細胞)を除いた。以後3日に1回培地を交換した。bFGFは5日目から3ng/mlで培地に添加した。10日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン(0.05%)+EDTA(0.2mM)で5分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をCoulterカウンター(Z1シングル、コールター社製)で計測し、5000cell/cm2の密度で細胞を播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的(コンフルエント)になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
これにより、ヒト滑膜から採取した間葉系幹細胞である細胞A1を得た。
分子量250000のDL−乳酸/グリコール酸共重合体をジオキサンに溶解させた後、粒径500μm前後の塩化ナトリウムと混合して凍結乾燥し、粉砕して脱塩することで得られるパウダー状材料を圧縮加熱成型し、γ線滅菌することによって、平均孔径540μm、気孔率90%、圧縮強度0.2MPa、直径9mmで厚さ3mmの生体吸収性合成高分子からなる円盤ブロック状の多孔質体構造を有するポリ乳酸グリコール酸共重合体(PLGA)ブロックの生体吸収性高分子多孔体B1を得た。
上記生体吸収性高分子多孔体B1の円盤状の底面をプラズマ処理ポリスチレン60mm培養皿(水に対する接触角70°)の上面に接触させ載置した。軟骨分化用培養液(αMEM、グルコース4.5mg/ml、10−7Mデキサメサゾン、50μg/mlのアスコルビン酸−2−リン酸、10ng/mlのTGF−β、6.25μg/mlのインスリン、6.25μg/mlのトランスフェリン、6.25ng/mlのセレン酸、5.33μg/mlのリノレイン酸、1.25mg/mlのウシ血清アルブミン)に2×107cell/mlの密度で懸濁させた0.19mlの上記細胞A1を生体吸収性高分子多孔体B1に滴下して導入した。そして、培養皿を反転させ逆さまにした状態で37℃、湿度100%、5%CO2条件下で100分間材料に細胞を接着させることで生体吸収性高分子多孔体B1に細胞A1を播種し組織再生材料C1を得た。
その後、軟骨分化細胞液で満たした50ml遠沈管に組織再生材料C1を入れて37℃にて3日間毎に培地を交換しながら4週間培養して培養軟骨組織材料D1を作製した。
得られた組織材料は直径8.8mm、厚さ2.8mmであった。また、病理組織学的に評価し、軟骨基質が多く沈着した成熟した軟骨組織である事を確認した。また、パパイン消化したサンプルをGAG定量キットおよびDNA定量キットで定量し、単位DNAあたりのグリコサミノグリカン量を算定し、別途細胞数とDNA量の関係を計測した結果より単位細胞あたりのグリコサミノグリカン量を定量した。II型コラーゲン、I型コラーゲンはELISAにより定量し、同様に単位細胞あたりの数値として算出した。また、培養軟骨組織を顕微鏡下で観察して縦×横×高さを計測し、体積を算出した。以上の結果から、単位細胞あたりのグリコサミノグリカンは0.03ngであり、I型コラーゲンとII型コラーゲンの比が1:99であった。組織中の細胞密度は8×107cell/cm3であった。
スキッドマウスの背部皮下に培養軟骨組織材料D1を移植し、4週間経過した後に移植体を回収し、病理組織学的に評価した。その結果、移植体は軟骨基質が多く沈着した成熟した軟骨組織であり、実施例1では異所性の軟骨を再生できることが確認できた。
実施例2は次のような過程を経て培養軟骨組織材料D2を作製し、移植工程により移植を行った。
(細胞採取工程及び増幅培養工程による細胞A2の準備)
ウサギ腸骨骨髄液を10%FBS、αMEM培地で有核細胞数1×104cell/mlの濃度で懸濁した後、直径10cmの培養皿へ10ml播種した。37℃にて5%炭酸ガス存在下で増殖培養した。3日目で培地を交換し、非接着細胞(造血系細胞)を除いた。以後3日に1回培地を交換した。bFGFは5日目から3ng/mlで培地に添加した。10日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン(0.05%)+EDTA(0.2mM)で5分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数を血球計算板で計測し、5000cell/cm2の密度で細胞を播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的(コンフルエント)になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
これにより、ウサギ腸骨骨髄液から採取した間葉系幹細胞である細胞A2を得た。
分子量250000のDL−乳酸/グリコール酸共重合体をジオキサンに溶解させた後、粒径500μm前後の塩化ナトリウムと混合して凍結乾燥し、粉砕して脱塩することで得られるパウダー状材料を圧縮加熱成型し、γ線滅菌することによって、孔のサイズが平均600μm、有孔率80%、圧縮強度0.6MPa、φ5.3mm×高さ2.5mmの生体吸収性合成高分子材料からなるブロック状の多孔質構造を有するポリ乳酸グリコール酸共重合体(PLGA)ブロックの生体吸収性高分子多孔体B2を得た。
生体吸収性高分子多孔体B2の底面をプラズマ処理ポリスチレン60mm培養皿(水に対する接触角70°)の上面に接触させ載置した。軟骨分化用媒溶液(αMEM、グルコース4.5mg/ml、10−7Mデキサメサゾン、50μg/mlのアスコルビン酸−2−リン酸、10ng/mlのTGF−β、6.25μg/mlのインスリン、6.25μg/mlのトランスフェリン、6.25ng/mlのセレン酸、5.33μg/mlのリノレイン酸、1.25mg/mlのウシ血清アルブミン)に2×107cell/mlの密度で懸濁させた0.15mlの細胞A2を生体吸収性高分子多孔体B2に滴下して導入した。培養皿を反転させ逆さまにした状態で37℃、湿度100%、5%CO2条件下で100分間材料に細胞を接着させることで生体吸収性高分子多孔体B2に細胞A2を播種し組織再生材料C2を得た。
その後、軟骨分化細胞液で満たした50ml遠沈管に組織再生材料C2を入れて37℃にて3日間毎に培地を交換しながら4週間培養して培養軟骨組織材料D2を作製した。
得られた組織材料は直径φ5mm、厚さ2.3mmであった。図5に得られた組織材料の拡大図を示した。図5(a)が平面視、図5(b)が断面である。また、組織を10%ホルマリン中性緩衝溶液で固定した後にパラフィン包埋し、ミクロトームにて厚さ5μmに切り出し、断面部をトルイジンブルー染色し、光学顕微鏡下にて観察し、トルイジンブルー染色にて赤紫色に染まるメタクロマジー(異調性)陽性の軟骨基質が多く沈着した成熟した軟骨組織である事を確認した。図6(a)に顕微鏡下で観察した図を示した。図6(b)は図6(a)にVIで示した部分の拡大図である。また、パパイン消化したサンプルをGAG定量キットおよびDNA定量キットで定量し、単位DNAあたりのグリコサミノグリカン量を算定し、別途細胞数とDNA量の関係を計測した結果より単位細胞あたりのグリコサミノグリカン量を定量した。II型コラーゲン、I型コラーゲンはELISAにより定量し、同様に単位細胞あたりの数値として算出した。また、培養軟骨組織を顕微鏡下で観察して縦×横×高さを計測し、体積を算出した。以上の結果から、単位細胞あたりのグリコサミノグリカンは0.03ngであり、I型コラーゲンとII型コラーゲンの比が1:99であった。組織中の細胞密度は8×107cell/cm3であった。
ウサギ大腿骨の膝関節部にφ6×3mmの軟骨欠損を作製したモデルに対し、培養軟骨組織材料D2をはめ込み、移植後4週目の欠損部の治癒過程を病理組織学的に評価した。その結果、膝関節部に連続性のある軟骨組織が再生し、実施例2に係る治療方法は大腿骨の膝関節部位の軟骨の再生治療を可能とする治療方法であることが確認できた。
2 仮載置板
10 組織再生材料
11 生体吸収性高分子多孔体
12 細胞懸濁液
Claims (1)
- 軟骨再生に用いられる軟骨細胞を含む培養軟骨組織材料であって、
1×107cell/cm3〜1×109cell/cm3の濃度の軟骨細胞と生体吸収性高分子との混合体であり、
最小部の厚さが2.2mm〜100mm、前記軟骨細胞と前記生体吸収性高分子との体積比が7:3〜9.5:0.5、
グリコサミノグリカン産生量が単位細胞あたり0.001ng〜0.2ng、
I型コラーゲンとII型コラーゲンとの含有比が10:90〜1:99、であり、
組織乾燥重量1mg当たり0.01mg〜0.65mgのII型コラーゲンを含む、
ことを特徴とする培養軟骨組織材料。
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