JP5890222B2 - 培養軟骨組織材料 - Google Patents

Description

本発明は、軟骨に関する疾患や事故等により受けた軟骨、骨の損傷部位を修復する際に用いることができる培養軟骨組織材料に関する。

軟骨に関する変形性関節症等の疾患やスポーツ外傷、事故等による軟骨の欠損等の損傷部位を治療するためにいわゆる再生医療を適用する取り組みが行われている。再生医療は、生体が有している治癒能力では回復できなくなった生体組織を、細胞、担体及び成長因子等を用いてその形態や機能を元の組織と同じに近い状態に治す医療技術である。
軟骨組織を再生するためには、軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞が播種培養された軟骨組織再生材料が必要である。

培養により調製された人工軟骨組織を移植する方法として種々の形態が検討されている。代表的な例としては、例えば非特許文献１には、患者から採取した軟骨細胞を単層培養してその数を増やした後、細胞懸濁液として、軟骨欠損部位に移植する方法が開示されている。この方法では、移植物が散逸しないように、移植後に移植部位を骨膜のパッチで被覆している。

また、特許文献１には、患者から採取した軟骨細胞をアテロコラーゲンのスキャフォールド（足場材料）内に播種し、培養した後、ペースト状のコラーゲンゲルとして、移植する方法が開示されている。
特許文献２には、哺乳動物から採取した軟骨から軟骨由来細胞を単離し、単離した軟骨由来細胞を、該哺乳動物種由来の血清、又は血漿存在下で培養する人工軟骨組織の製造方法が開示されている。

マッツ ブリットバーグ、「自家軟骨移植による膝関節軟骨欠損部の治療」、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、米国、マサチューセッツ内科外科学会、１９９４年１０月６日発行、３３１号、ｐ．８８９−８９５ （ＭＡＴＳ ＢＲＩＴＴＢＥＲＧ，Ｎ．Ｅｎｇｌ.Ｊ.Ｍｅｄ、"Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｅｐ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｋｎｅｅ ｗｉｔｈ Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ"、ＵＳＡ、 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ,１９９４，３３１，ｐ．８８９−８９５）

特開２００１−２２４６７８号公報 特開２００７−３０１３８７号公報

しかしながら、非特許文献１に記載の方法は、自発的治癒に比べると効果はあるものの、細胞の止まりが悪く、高い治癒効果を得にくい。さらにこの方法は、軟骨細胞を単層培養することにより軟骨化させる方法なので、生体内の軟骨とは異なるものである。すなわち、軟骨細胞本来の形質が一部消失（脱分化）するため、移植物に要求される事柄が「再分化」、「基質の生合成」、「欠損部位の修復」と多くなる欠点があり、必然的に修復に時間を要する。そのため、治療期間内における移植細胞の散逸も多い。また、体積の大きな軟骨組織材料を作製することが不可能であるため、軟骨の損傷範囲が大きい場合には対応できなかった。

特許文献１に記載された発明は、Ｉ型コラーゲンが主体であるコラーゲンゲルと軟骨細胞を組み合わせたものである。そのため、基質であるＩＩ型コラーゲンにＩ型コラーゲンが混在する比率が少なくとも１０％以上もあり、Ｉ型コラーゲンを殆ど含まない生体軟骨組織とは全く異なるという問題があった。また、移植後に移植部位を骨膜のパッチで被覆する必要がある。さらに、この発明では、生体内の軟骨とは異なるペースト状態で軟骨を用いるため、その強度は本来の軟骨に比べて非常に弱く、本来の軟骨になるまでに長期間を要することや、関節の荷重部位軟骨への適応が困難である。

特許文献２に記載された人工軟骨組織は、他の従来技術と同様に本来の軟骨とは異なる問題がある。またこの人工軟骨組織は、細胞のみで組織体を作製する方法でありスキャフォールドを使用しないため、厚さが２ｍｍ以上となると中心部の細胞が壊死してしまうので実用性のある厚さのある培養組織を作製することができないという欠点があった。すなわちこの人工軟骨組織も作製できる組織体の大きさに限界があり、実際の症例で求められている最小幅部のサイズが２ｍｍ以上の軟骨組織を作製することができなかった。

そこで本発明は、生体内に存在する軟骨組織と略同じ状態の軟骨組織を作製することが可能であり、且つ体積の大きな培養軟骨組織材料を提供することを課題とする。

以下、本発明について説明する。
請求項１に記載の発明は、軟骨再生に用いられる軟骨細胞を含む培養軟骨組織材料であって、１×１０^７ｃｅｌｌ／ｃｍ^３〜１×１０^９ｃｅｌｌ／ｃｍ^３の濃度の軟骨細胞と生体吸収性高分子との混合体であり、最小部の厚さが２．２ｍｍ〜１００ｍｍ、軟骨細胞と生体吸収性高分子との体積比が７：３〜９．５：０．５、グリコサミノグリカン産生量が単位細胞あたり０．００１ｎｇ〜０．２ｎｇ、Ｉ型コラーゲンとＩＩ型コラーゲンとの含有比が１０：９０〜１：９９、であり、組織乾燥重量１ｍｇ当たり０．０１ｍｇ〜０．６５ｍｇのＩＩ型コラーゲンを含む、ことを特徴とする培養軟骨組織材料である。

本発明によれば、生体内に存在する軟骨組織と略同じ状態の軟骨組織を作製することが可能であるため治療期間が短く、さらに、大きな軟骨組織材料を作製することが可能である。従って従来は困難とされていた軟骨欠損の治療にも応用することができる。

培養軟骨組織材料の作製方法Ｓ１０の一部を説明する図である。 培養軟骨組織材料の作製方法Ｓ１０の一部を説明する他の図である。 培養軟骨組織材料の作製方法Ｓ２０の一部を説明する図である。 培養軟骨組織材料の作製方法Ｓ２０の一部を説明する他の図である。 図５（ａ）は平面視における組織材料の拡大図、図５（ｂ）は断面における組織材料の拡大図である。 図６（ａ）は組織を顕微鏡下で観察した図である。図６（ｂ）は図６（ａ）の一部を拡大した図である。

本発明の上記した作用及び利得は、次に説明する発明を実施するための形態から明らかにされる。ただし本発明はこれら実施形態に限定されるものではない。

１つの実施形態に係る培養軟骨組織材料は、生体吸収性高分子多孔体、及びこの生体吸収性高分子多孔体中に培養された「軟骨細胞」を有して構成されている。以下、それぞれについて説明する。なお、説明の中で「軟骨細胞に分化する幹細胞」のことを「軟骨細胞分化幹細胞」と記載することがある。

生体吸収性高分子多孔体は細胞の播種時に多孔質体であり、そのときの孔径は１８０μｍ〜３５００μｍであり、平均孔径が３５０μｍ〜２０００μｍの連通した小孔構造を有し、気孔率が６０％〜９５％とされている。また、生体吸収性高分子多孔体の圧縮強度は０．０５ＭＰａ〜１．０ＭＰａとなるように構成されている。ここで、生体吸収性高分子多孔体の孔の孔径とは、１０μｍを下回るような液体のみを通す微小気孔は考慮に入れず、生体吸収性高分子多孔体全体において１０μｍ以上の気孔の８０％以上が孔径１８０μｍ〜３５００μｍであることを意味している。なお、「気孔率」は、使用された生体吸収性高分子の原料塊の重量に対する同体積の生体吸収性高分子多孔体の重量から算出された値である。
気孔率が６０％よりも小さいと後述するような、軟骨細胞、又は軟骨細胞分化幹細胞の培養をするための効率が低くなり、９５％を超えると生体吸収性高分子多孔体自体の強度が低下する。従って、気孔率は８０％〜９０％であることがさらに好ましい。また、孔径が１８０μｍより小さいと軟骨細胞、又は軟骨細胞分化幹細胞を生体吸収性高分子多孔体内に導入することが困難となり、生体吸収性高分子多孔体の内部まで十分に軟骨細胞、又は軟骨細胞分化幹細胞を播種することができない。一方、孔径が３５００μｍよりも大きいと生体吸収性高分子多孔体自体の強度が低下してしまう。
また、平均孔径は５４０μｍ〜１２００μｍであることが好ましい。

上記圧縮強度について、圧縮強度が０．０５ＭＰａよりも小さいと生体吸収性高分子多孔体が、軟骨細胞、又は軟骨細胞分化幹細胞の伸展応力で収縮してしまう。一方、１．０ＭＰａを超える生体吸収性高分子多孔体を作製することは技術的に困難がある。なお、ここで「圧縮強度」とは直径１０ｍｍ×高さ２ｍｍの円柱状の試験体をクロスヘッドスピード１ｍｍ／分で圧縮させた際の圧縮破壊強度を意味する。

生体吸収性高分子多孔体の全体としての形状は特に限定されることはないが、移植される損傷部位の形状に見合った形状とすることができる。ただし汎用的な生体吸収性高分子として立方体、直方体、半球、円板等、各種基本的な形状が準備されていてもよい。多孔体の最小部の厚さ（培養の際に上下方向となる大きさ）は好ましくは２．２ｍｍ〜１００ｍｍ、さらに好ましくは３ｍｍ〜１００ｍｍである。厚さが１００ｍｍを超えると細胞を導入したり、長期間培養したりすることが難しくなる。

生体吸収性高分子は、一定期間体内でその形態を維持でるものであれば特に限定することなく用いることができる。例えば、従来から用いられているポリグリコール酸、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体、ポリ−ε−カプロラクトン、乳酸−ε−カプロラクトン共重合体、ポリアミノ酸、ポリオルソエステル及びそれらの共重合体中から選択される少なくとも一種を例示することができる。その中でもポリグリコール酸、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体が、米国食品医薬庁（ＦＤＡ）から人体に無害な高分子として承認されていること及びその実績の面から最も好ましい。生体吸収性高分子材料の重量平均分子量は５０００〜２００００００であることが好ましく、より好ましくは１００００〜５０００００である。

このような生体吸収性高分子を用いることにより、細胞懸濁液を生体吸収性高分子多孔体１１の内部にまで適切に浸透させることができ、安定して無駄なく播種すべき細胞を多孔体中に導入して播種することが可能となる。そしてこれを培養することで培養軟骨組織材料を得ることができる。

生体吸収性高分子を多孔体とする方法は特に限定されないが、例えば、有機溶媒に生体吸収性高分子材料が溶解された溶液にその有機溶媒には溶解せず且つ生体吸収性高分子材料を溶解しない液で溶解する、粒径が１００μｍ〜２０００μｍの粒子状物質を略均一に混合し凍結する。その後に乾燥して有機溶媒を取り除くことによって粒子状物質を含有した孔径が５μｍ〜５０μｍの小孔構造を有する生体吸収性高分子多孔体を作製する。そして、この生体吸収性高分子多孔体をミル等で粉砕してから粒子状物質を生体吸収性高分子を溶解しない液で溶解して取り除いた後、篩にかけて１００μｍ〜３０００μｍの平均粒径の顆粒状の生体吸収性高分子多孔体とし、これらの顆粒状の生体吸収性高分子多孔体物質を所定形状の容器内に入れて加圧し加熱する作製方法を挙げることができる。

次に１つの実施形態に係る培養軟骨組織材料の作製方法Ｓ１０（以下、「作製方法Ｓ１０」と記載することがある。）について説明する。

作製方法Ｓ１０は、増幅培養工程Ｓ１１、細胞懸濁液作製工程Ｓ１２、組織再生材料作製工程Ｓ１３、軟骨組織培養工程Ｓ１４を備えている。以下、それぞれについて説明する。

作製方法Ｓ１０に先立って、細胞を採取しておく。採取される細胞は、軟骨細胞、又は軟骨細胞に分化する幹細胞である（「軟骨細胞分化幹細胞」と記載することがある。）。採取される軟骨細胞及び軟骨細胞分化幹細胞は、軟骨細胞であればこれを直接用いればよく、軟骨細胞分化幹細胞であれば、骨髄由来間葉系幹細胞、間葉系細胞及び滑膜細胞などの軟骨細胞に分化し得る又はそれらの修復を促進し得る能力を有する幹細胞であればよい。これには例えば、骨盤（腸骨）や手足の長管骨（大腿骨、脛骨）の骨髄及び／又は骨膜、滑膜、脂肪、歯槽骨等の骨髄、口蓋又は歯槽骨等の骨膜等から採取される細胞を挙げることができる。
これらを採取する方法は通常医科で行われている方法が特に限定されずに使用でき、中でも採取の際、皮膚、筋肉の剥離切開が最小ですむ簡易な手術で行うことが可能な腸骨等の骨髄、口蓋又は歯槽骨等の骨膜等を採取源とすることが好ましい。

また、採取される軟骨細胞及び軟骨細胞分化幹細胞は最終的に治療対象者となる本人からの他、生死を問わない他人、又はウシ、ブタ、ウマ、トリ等の動物から採取することもできる。ただし他人や動物から採取する際には免疫拒絶反応が起こることを考慮して、最終工程において液体窒素による急凍結処理による脱細胞化等の脱抗原免疫化処理を行っておくことが必要である。このようなものによれば移植対象である本人への負担を減ずることができる。

増幅培養工程Ｓ１１は、上記のように採取された軟骨細胞又は軟骨細胞分化幹細胞を公知の方法で組織培養用の培養容器を用いて１週間〜２週間増幅培養させる工程である。培養に用いられる培地は、公知の培地を使用できるが、例えば自己血清、ウシ胎児血清を含有した細胞培養用のαＭＥＭ培地を好適に使用できる。このとき、間葉系幹細胞の場合には、特定の成長因子（例えばｂＦＧＦ）を作用させると、高い多分化能力を保ったまま増殖され、軟骨の分化を促進させることができる。

細胞懸濁液作製工程Ｓ１２は、増幅培養工程Ｓ１１で増幅培養された細胞を含む細胞懸濁液を作製する工程である。すなわち、軟骨分化用培養液に当該幹細胞を懸濁することにより細胞懸濁液を作製する。ここで用いられる培養液、軟骨分化用培養液は公知のものを用いることができる。作製される細胞懸濁液は、細胞密度が５×１０^６ｃｅｌｌ／ｍｌ〜１×１０^８ｃｅｌｌ／ｍｌとされていることが好ましい。

組織再生材料作製工程Ｓ１３は、細胞懸濁液作製工程Ｓ１２で作製した細胞懸濁液を生体吸収性高分子多孔体に導入して細胞を播種し接着させ、組織再生材料を作製する工程である。組織再生材料は、細胞が播種された生体吸収性高分子を意味する。ここで用いられる生体吸収性高分子は上記したものでよい。
組織再生材料作製工程Ｓ１３は、載置工程Ｓ１３１、細胞懸濁液導入工程Ｓ１３２、及び反転工程Ｓ１３３を有している。図１、図２に組織再生材料作製工程Ｓ１３を説明する図を示した。

載置工程Ｓ１３１は、図１（ａ）に示したように、保持板１上に生体吸収性高分子多孔体１１を載置する工程である。ここで保持板１は接触角が水に対して１５°〜９０°の樹脂板又はガラス板であることが好ましい。このような保持板１は、従来から細胞を静置培養する容器として用いられている、シャーレ、フラスコ、マルチウェル等に使用されているガラス材料や、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート等の樹脂材料を板状に加工して用いることができる。これらの材料は疎水性が高いことがあるので必要に応じて、生体吸収性高分子多孔体１１を接触させる面を、プラズマ（コロナ放電）処理等の化学的な方法で極性基を導入し親水性を高め、接触角が水に対して１５°〜９０°となるようにしておくことが好ましい。また、接触させる面にセラミックス皮膜を形成させておいてもよい。接触させる面は平滑であることが好ましいが、高さ数百μｍの溝や筋状突起等が設けられていてもよい。

載置工程Ｓ１３１により保持板１の面に生体吸収性高分子多孔体１１が載置された姿勢となり、次に細胞懸濁液導入工程Ｓ１３２で、図１（ｂ）に示したように生体吸収性高分子多孔体１１に細胞懸濁液作製工程Ｓ１２で作製した細胞懸濁液１２が、例えば滴下や注入等の方法によって導入される。これにより、図２（ａ）に示したように、細胞懸濁液１２が生体吸収性高分子多孔体１１内に浸透するとともに、生体吸収性高分子多孔体１１が細胞懸濁液１２により全体が満たされた状態となる。このとき、生体吸収性高分子多孔体１１の体積に対して細胞懸濁液１２の量が多すぎると、後述の反転工程Ｓ１３３が行い難くなったり、培養の効率が低下したりする傾向があるため、生体吸収性高分子多孔体１１全体を浸し且つ生体吸収性高分子多孔体１１から過剰に漏れ出ない量の細胞懸濁液を導入することが好ましい。

次に、反転工程Ｓ１３３により、図２（ａ）で示した状態から、保持板１が上、細胞懸濁液１２が含まれた生体吸収性高分子多孔体１１が下となるように反転させ、図２（ｂ）に示したような姿勢とする。すなわち、重力方向から見て保持板１が生体吸収性高分子多孔体１１の上側となり、且つ保持板１の重さが生体吸収性高分子多孔体１１に加わらない状態で気体中で静止させる。この状態で静止を維持し、導入された細胞を生体吸収性高分子多孔体１１の孔の内壁に接着させて播種が完了する。これが組織再生材料１０である。生体吸収性高分子多孔体に細胞を接着させるために気体中で静止させる時間は、生体吸収性高分子多孔体の材質や播種する細胞の種類により異なるが、一般的には２０分〜３００分である。

また、本実施形態のように生体吸収性高分子多孔体１１が下となるような姿勢で組織再生材料を作製する場合における生体吸収性高分子多孔体１１の形状は、反転工程Ｓ１３３を経て、重力方向から見て保持板１が上側となり且つ保持板１の重さが生体吸収性高分子多孔体１１に加わらない状態で気体中で静止させ細胞を播種することが可能であれば特に限定されない。ただし、そのときの生体吸収性高分子多孔体１１の底面積（保持板１に接する面の面積）は、厚さに対して十分な大きさの面積を有する形状であることが好ましい。
具体的には、生体吸収性高分子多孔体の体積１ｃｍ^３〜５００００ｃｍ^３の範囲において、底面積が０．５ｃｍ^２〜２００ｃｍ^２であることが好ましい。０．５ｃｍ^２未満又は２００ｃｍ^２を超えると保持板に吊り下げた状態で播種することが難しくなる。

ここで生体吸収性高分子多孔体１１が比較的大きな孔を有していれば、細胞懸濁液１２を生体吸収性高分子多孔体１１の内部にまで適切に浸透させることができる。そして、最終的に細胞懸濁液を上記のように重力方向から見て保持板１が生体吸収性高分子多孔体１１の上側となり、且つ保持板１の重さが生体吸収性高分子多孔体１１に加わらない状態で気体中に静止させることにより、生体吸収性高分子多孔体１１から細胞懸濁液１２が漏れないように保持することができる。従って、細胞懸濁液１２を安定して無駄なく導入して細胞を生体吸収性高分子多孔体中に播種することが可能となる。

軟骨組織培養工程Ｓ１４は、組織再生材料作製工程Ｓ１３で作製された組織再生材料１０から培養軟骨組織材料を作製する工程である。軟骨組織培養工程Ｓ１４では、組織再生材料１０に播種された細胞が軟骨細胞であればこれを培養して増幅させる。また、組織再生材料１０に播種された細胞が軟骨細胞分化幹細胞であれば、これを軟骨細胞に分化して培養することにより軟骨細胞を増幅させる。
従って、培養軟骨組織材料は、上記したように、組織再生材料１０から培養の過程を経た後における、生体吸収性高分子と、この生体吸収性高分子中に培養されて含まれる軟骨組織とにより構成されている。すなわち、本実施形態では、培養軟骨組織材料は、上記した組織再生材料についてここに含まれる軟骨細胞、軟骨細胞分化幹細胞から分化した軟骨細胞を培養することにより作製された材料である。
これら軟骨細胞の増幅・分化（培養）は公知の方法により行うことができる。例えば増殖培養液により増幅させることができる。また、増殖させた後に軟骨分化用培養液を用いて分化、培養することが可能である。

次に他の実施形態に係る培養軟骨組織材料の作製方法Ｓ２０（以下、「作製方法Ｓ２０」と記載することがある。）を説明する。本実施形態のうち、上記した製造方法Ｓ１０で説明したものと共通する部分については同じ符号を付して説明を省略する。

作製方法Ｓ２０は、作製方法Ｓ１０の組織再生材料作製工程Ｓ１３の代わりに組織再生材料作製工程Ｓ２３を備えている。当該組織再生材料作製工程Ｓ２３は、仮載置工程Ｓ２３１、細胞懸濁液導入工程Ｓ２３２、挟持工程Ｓ２３３、及び保持工程Ｓ２３４を含んで構成されている。図３、図４に組織再生材料作製工程Ｓ２３を説明する図を示した。

仮載置工程Ｓ２３１は、図３（ａ）のように撥水性が高い板状部材である仮載置板２に生体吸収性高分子多孔体１１を載置する工程である。仮載置板２は接触角が水に対して９０°より大きい樹脂板又はガラス板であることが好ましい。

細胞懸濁液導入工程Ｓ２３２は、上記した細胞懸濁液導入工程Ｓ１３２と同様、生体吸収性高分子多孔体１１に細胞懸濁液１２が導入される。これにより、図３（ｂ）に示したように、細胞懸濁液１２が浸透して生体吸収性高分子多孔体１１全体に満たされた状態となる。

挟持工程Ｓ２３３は、図４（ａ）に示したように、細胞懸濁液で満たされた生体吸収性高分子多孔体１１を仮載置板２との間に挟むように保持板１の面に生体吸収性高分子多孔体１１を接触させる工程である。

保持工程Ｓ２３４は、図４（ｂ）に示したように、生体吸収性高分子多孔体１１を接触させた保持板１を引き上げ、生体吸収性高分子多孔体１１を保持板１側に保持させ、仮載置板２から離脱させる工程である。これにより、生体吸収性高分子多孔体１１は上記１つの実施形態と同様に、重力方向から見て保持板１が生体吸収性高分子多孔体１１の上側となり、且つ保持板１の重さが生体吸収性高分子多孔体１１に加わらない状態で気体中で静止させる。この状態で静止を維持し、導入された細胞を生体吸収性高分子多孔体１１の内壁に接着させて播種が完了する。これが組織再生材料１０とされる。
ここで仮載置板２は撥水性のある板、保持板１は親水性のある板により構成されているので、細胞懸濁液で満たされた生体吸収性高分子多孔体の上記したような保持、離脱が適切に行われる。

本発明に係る培養軟骨組織材料は、１×１０^７ｃｅｌｌ／ｃｍ^３〜１×１０^９ｃｅｌｌ／ｃｍ^３の濃度の軟骨細胞と生体吸収性高分子との混合体であって、最小部の厚さが２．２ｍｍ〜１００ｍｍ、軟骨組織と生体吸収性高分子との体積比が７：３〜９．５：０．５、グリコサミノグリカン産生量が単位細胞あたり０．００１ｎｇ〜０．２ｎｇ、Ｉ型コラーゲンとＩＩ型コラーゲンとの含有比が１０：９０〜１：９９であり、組織乾燥重量１ｍｇ当たり０．０１ｍｇ〜０．６５ｍｇのＩＩ型コラーゲンを含む条件を備える培養軟骨組織材料である。このような１×１０^７ｃｅｌｌ／ｃｍ^３〜１×１０^９ｃｅｌｌ／ｃｍ^３の濃度の軟骨細胞は、生体内の軟骨と略同じ濃度であり、従来の軟骨組織再生のための材料と比較して多い。

本発明に係る培養軟骨組織材料は、軟骨組織と生体吸収性高分子との体積比が７：３〜９．５：０．５である。軟骨組織から見て体積比が７：３よりも少ないと生体吸収性高分子の影響が大きくでるため、分解産物による影響や細胞数が少ないことから、体内の生着効率が低下する。一方、軟骨組織からみて体積比が９．５：０．５を超えると生体吸収性高分子が目的の形状を維持することができずに収縮した細胞塊を形成し、内部の細胞が壊死してしまう虞がある。

本発明に係る培養軟骨組織材料は、グリコサミノグリカン産生量が単位細胞あたり０．００１ｎｇ〜０．２ｎｇ、Ｉ型コラーゲンとＩＩ型コラーゲンとの含有比が１０：９０〜１：９９であり、組織乾燥重量１ｍｇ当たり０．０１ｍｇ〜０．６５ｍｇのＩＩ型コラーゲンを含む。これは生体内の軟骨と略同じである。

以上のような培養軟骨組織材料により、体積の大きな軟骨組織材料とすることができ、これを患者に移植することによって体積の大きな軟骨欠損を修復することが可能となる。従って軟骨の損傷が大きい場合であっても、この軟骨組織材料を移植することによって短期間に軟骨を再生することができる。すなわち、生体吸収性高分子多孔体の大きさに対応する大きなバルク状の軟骨を作製し、これを損傷部位に移植することにより、大きな体積の軟骨を再生できる。また、バルク状の軟骨を砕いて粉状とし、移植箇所に適用しやすくして移植することも可能である。

本発明に係る培養軟骨組織材料は、軟骨として用いる用途の他に、骨に関する疾患や事故により損傷した骨部分に移植し、体内において内軟骨性骨化によって骨の再生を行うために用いてもよい。この場合も生体吸収性高分子は時間とともに消滅する。

以下、実施例について説明する。
＜実施例１＞
実施例１は次のような過程を経て培養軟骨組織材料Ｄ１を作製し、移植工程により移植を行った。
（細胞採取工程及び増幅培養工程による細胞Ａ１の準備）
ヒト滑膜から採取した組織をコラゲナーゼ処理した細胞を２０％ＦＢＳ、αＭＥＭ培地で有核細胞数１×１０^４ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で懸濁した後、直径１０ｃｍの培養皿へ１０ｍｌ播種した。３７℃にて５％炭酸ガス存在下で増殖培養した。３日目で培地を交換し、非接着細胞（造血系細胞）を除いた。以後３日に１回培地を交換した。ｂＦＧＦは５日目から３ｎｇ／ｍｌで培地に添加した。１０日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン（０．０５％）＋ＥＤＴＡ（０．２ｍＭ）で５分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をＣｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｚ１シングル、コールター社製）で計測し、５０００ｃｅｌｌ／ｃｍ^２の密度で細胞を播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的（コンフルエント）になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
これにより、ヒト滑膜から採取した間葉系幹細胞である細胞Ａ１を得た。

（生体吸収性高分子多孔体Ｂ１の準備）
分子量２５００００のＤＬ−乳酸／グリコール酸共重合体をジオキサンに溶解させた後、粒径５００μｍ前後の塩化ナトリウムと混合して凍結乾燥し、粉砕して脱塩することで得られるパウダー状材料を圧縮加熱成型し、γ線滅菌することによって、平均孔径５４０μｍ、気孔率９０％、圧縮強度０．２ＭＰａ、直径９ｍｍで厚さ３ｍｍの生体吸収性合成高分子からなる円盤ブロック状の多孔質体構造を有するポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ブロックの生体吸収性高分子多孔体Ｂ１を得た。

（細胞懸濁液作製工程及び組織再生材料作製工程による組織再生材料Ｃ１の作製）
上記生体吸収性高分子多孔体Ｂ１の円盤状の底面をプラズマ処理ポリスチレン６０ｍｍ培養皿（水に対する接触角７０°）の上面に接触させ載置した。軟骨分化用培養液（αＭＥＭ、グルコース４．５ｍｇ／ｍｌ、１０^−７Ｍデキサメサゾン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸−２−リン酸、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β、６．２５μｇ／ｍｌのインスリン、６．２５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、６．２５ｎｇ／ｍｌのセレン酸、５．３３μｇ／ｍｌのリノレイン酸、１．２５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン）に２×１０^７ｃｅｌｌ／ｍｌの密度で懸濁させた０．１９ｍｌの上記細胞Ａ１を生体吸収性高分子多孔体Ｂ１に滴下して導入した。そして、培養皿を反転させ逆さまにした状態で３７℃、湿度１００％、５％ＣＯ_２条件下で１００分間材料に細胞を接着させることで生体吸収性高分子多孔体Ｂ１に細胞Ａ１を播種し組織再生材料Ｃ１を得た。

（軟骨組織培養工程による培養軟骨組織材料Ｄ１の作製）
その後、軟骨分化細胞液で満たした５０ｍｌ遠沈管に組織再生材料Ｃ１を入れて３７℃にて３日間毎に培地を交換しながら４週間培養して培養軟骨組織材料Ｄ１を作製した。
得られた組織材料は直径８．８ｍｍ、厚さ２．８ｍｍであった。また、病理組織学的に評価し、軟骨基質が多く沈着した成熟した軟骨組織である事を確認した。また、パパイン消化したサンプルをＧＡＧ定量キットおよびＤＮＡ定量キットで定量し、単位ＤＮＡあたりのグリコサミノグリカン量を算定し、別途細胞数とＤＮＡ量の関係を計測した結果より単位細胞あたりのグリコサミノグリカン量を定量した。ＩＩ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲンはＥＬＩＳＡにより定量し、同様に単位細胞あたりの数値として算出した。また、培養軟骨組織を顕微鏡下で観察して縦×横×高さを計測し、体積を算出した。以上の結果から、単位細胞あたりのグリコサミノグリカンは０．０３ｎｇであり、Ｉ型コラーゲンとＩＩ型コラーゲンの比が１：９９であった。組織中の細胞密度は８×１０^７ｃｅｌｌ／ｃｍ^３であった。

（移植工程による移植及びその評価）
スキッドマウスの背部皮下に培養軟骨組織材料Ｄ１を移植し、４週間経過した後に移植体を回収し、病理組織学的に評価した。その結果、移植体は軟骨基質が多く沈着した成熟した軟骨組織であり、実施例１では異所性の軟骨を再生できることが確認できた。

＜実施例２＞
実施例２は次のような過程を経て培養軟骨組織材料Ｄ２を作製し、移植工程により移植を行った。
（細胞採取工程及び増幅培養工程による細胞Ａ２の準備）
ウサギ腸骨骨髄液を１０％ＦＢＳ、αＭＥＭ培地で有核細胞数１×１０^４ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で懸濁した後、直径１０ｃｍの培養皿へ１０ｍｌ播種した。３７℃にて５％炭酸ガス存在下で増殖培養した。３日目で培地を交換し、非接着細胞（造血系細胞）を除いた。以後３日に１回培地を交換した。ｂＦＧＦは５日目から３ｎｇ／ｍｌで培地に添加した。１０日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン（０．０５％）＋ＥＤＴＡ（０．２ｍＭ）で５分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数を血球計算板で計測し、５０００ｃｅｌｌ／ｃｍ^２の密度で細胞を播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的（コンフルエント）になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
これにより、ウサギ腸骨骨髄液から採取した間葉系幹細胞である細胞Ａ２を得た。

（生体吸収性高分子多孔体Ｂ２の準備）
分子量２５００００のＤＬ−乳酸／グリコール酸共重合体をジオキサンに溶解させた後、粒径５００μｍ前後の塩化ナトリウムと混合して凍結乾燥し、粉砕して脱塩することで得られるパウダー状材料を圧縮加熱成型し、γ線滅菌することによって、孔のサイズが平均６００μｍ、有孔率８０％、圧縮強度０．６ＭＰａ、φ５．３ｍｍ×高さ２．５ｍｍの生体吸収性合成高分子材料からなるブロック状の多孔質構造を有するポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ブロックの生体吸収性高分子多孔体Ｂ２を得た。

（細胞懸濁液作製工程及び組織再生材料作製工程による組織再生材料Ｃ２の作製）
生体吸収性高分子多孔体Ｂ２の底面をプラズマ処理ポリスチレン６０ｍｍ培養皿（水に対する接触角７０°）の上面に接触させ載置した。軟骨分化用媒溶液（αＭＥＭ、グルコース４．５ｍｇ／ｍｌ、１０^−７Ｍデキサメサゾン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸−２−リン酸、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β、６．２５μｇ／ｍｌのインスリン、６．２５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、６．２５ｎｇ／ｍｌのセレン酸、５．３３μｇ／ｍｌのリノレイン酸、１．２５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン）に２×１０^７ｃｅｌｌ／ｍｌの密度で懸濁させた０．１５ｍｌの細胞Ａ２を生体吸収性高分子多孔体Ｂ２に滴下して導入した。培養皿を反転させ逆さまにした状態で３７℃、湿度１００％、５％ＣＯ_２条件下で１００分間材料に細胞を接着させることで生体吸収性高分子多孔体Ｂ２に細胞Ａ２を播種し組織再生材料Ｃ２を得た。

（軟骨組織培養工程による培養軟骨組織材料Ｄ２の作製）
その後、軟骨分化細胞液で満たした５０ｍｌ遠沈管に組織再生材料Ｃ２を入れて３７℃にて３日間毎に培地を交換しながら４週間培養して培養軟骨組織材料Ｄ２を作製した。
得られた組織材料は直径φ５ｍｍ、厚さ２．３ｍｍであった。図５に得られた組織材料の拡大図を示した。図５（ａ）が平面視、図５（ｂ）が断面である。また、組織を１０％ホルマリン中性緩衝溶液で固定した後にパラフィン包埋し、ミクロトームにて厚さ５μｍに切り出し、断面部をトルイジンブルー染色し、光学顕微鏡下にて観察し、トルイジンブルー染色にて赤紫色に染まるメタクロマジー（異調性）陽性の軟骨基質が多く沈着した成熟した軟骨組織である事を確認した。図６（ａ）に顕微鏡下で観察した図を示した。図６（ｂ）は図６（ａ）にＶＩで示した部分の拡大図である。また、パパイン消化したサンプルをＧＡＧ定量キットおよびＤＮＡ定量キットで定量し、単位ＤＮＡあたりのグリコサミノグリカン量を算定し、別途細胞数とＤＮＡ量の関係を計測した結果より単位細胞あたりのグリコサミノグリカン量を定量した。ＩＩ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲンはＥＬＩＳＡにより定量し、同様に単位細胞あたりの数値として算出した。また、培養軟骨組織を顕微鏡下で観察して縦×横×高さを計測し、体積を算出した。以上の結果から、単位細胞あたりのグリコサミノグリカンは０．０３ｎｇであり、Ｉ型コラーゲンとＩＩ型コラーゲンの比が１：９９であった。組織中の細胞密度は８×１０^７ｃｅｌｌ／ｃｍ^３であった。

（移植工程による移植及びその評価）
ウサギ大腿骨の膝関節部にφ６×３ｍｍの軟骨欠損を作製したモデルに対し、培養軟骨組織材料Ｄ２をはめ込み、移植後４週目の欠損部の治癒過程を病理組織学的に評価した。その結果、膝関節部に連続性のある軟骨組織が再生し、実施例２に係る治療方法は大腿骨の膝関節部位の軟骨の再生治療を可能とする治療方法であることが確認できた。

１ 保持板
２ 仮載置板
１０ 組織再生材料
１１ 生体吸収性高分子多孔体
１２ 細胞懸濁液

Claims (1)

1. 軟骨再生に用いられる軟骨細胞を含む培養軟骨組織材料であって、
   １×１０^７ｃｅｌｌ／ｃｍ^３〜１×１０^９ｃｅｌｌ／ｃｍ^３の濃度の軟骨細胞と生体吸収性高分子との混合体であり、
   最小部の厚さが２．２ｍｍ〜１００ｍｍ、前記軟骨細胞と前記生体吸収性高分子との体積比が７：３〜９．５：０．５、
   グリコサミノグリカン産生量が単位細胞あたり０．００１ｎｇ〜０．２ｎｇ、
   Ｉ型コラーゲンとＩＩ型コラーゲンとの含有比が１０：９０〜１：９９、であり、
   組織乾燥重量１ｍｇ当たり０．０１ｍｇ〜０．６５ｍｇのＩＩ型コラーゲンを含む、
   ことを特徴とする培養軟骨組織材料。