JP5888852B2 - Cell production using immunodeficient animals - Google Patents
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本発明は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの体内において、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から奇形腫を介して組織様構造体に分化させて目的とする細胞を製造する方法である。 The present invention aims to differentiate embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells) into tissue-like structures via teratomas in the body of severe combined immunodeficiency (SCID) mice. A method for producing cells.
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）といった多能性幹細胞は、体を構成する全ての細胞になることができる。そのため、再生医療の材料として大変な注目を集めている。 Pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells) can be all cells constituting the body. Therefore, it has attracted a great deal of attention as a material for regenerative medicine.
また、神経細胞や心筋細胞のような、個人からの採取が困難な細胞を分化誘導できるため、オーダーメードの調剤や創薬、あるいは薬効・安全性試験のセンサーとしても有用である。 In addition, since cells that are difficult to collect from individuals, such as nerve cells and cardiomyocytes, can be induced to differentiate, it is also useful as a sensor for custom-made dispensing, drug discovery, or efficacy / safety tests.
上記のような多能性幹細胞の有効性を発揮するためには、目的に合致した細胞種を分化誘導する必要があるが、これまでは、ほぼ唯一の手段として、体外培養下での分化誘導方法が研究、検討されてきた。 In order to demonstrate the effectiveness of pluripotent stem cells as described above, it is necessary to induce differentiation of cell types that match the purpose, but until now, as the only means, induction of differentiation under in vitro culture Methods have been studied and studied.
現在までに、数多くの体外分化誘導方法が提案されてきたが、依然として有効な誘導方法が確立されている細胞種は少なく、特定の神経細胞や心筋細胞など一部の細胞を除き、確定した分化誘導方法が存在していない。さらに、体外で分化誘導された細胞の機能は、体内で発生した細胞に比して著しく劣ることが多い。 To date, a number of in vitro differentiation induction methods have been proposed, but there are still few cell types for which effective induction methods have been established, with the exception of certain cells such as specific neurons and cardiomyocytes. There is no guidance method. Furthermore, the function of cells induced to differentiate outside the body is often significantly inferior to cells generated in the body.
本発明者は、マウスｉＰＳ 細胞から間葉系細胞を体外で分化誘導し、純化する方法を発表した（非特許文献１）が、内分泌系の細胞など、周辺環境の影響を強く受けながら発生する細胞を作製するためには、本来の環境を再現する必要があり、必然的にこれを分化誘導する培養系が複雑化するという問題がある。さらに、体外での分化誘導には成長因子、分化誘導因子、細胞外マトリクスをはじめとした分化促進因子を長期間、多量に添加する必要があることが多く、現状の方法論ではベネフィット（利益）に対するコスト（費用）が過大であるという問題もあった。 The present inventor has announced a method for inducing differentiation and purifying mesenchymal cells from mouse iPS cells in vitro (Non-Patent Document 1), which occurs while being strongly influenced by the surrounding environment such as endocrine cells. In order to produce cells, it is necessary to reproduce the original environment, and there is a problem that the culture system for inducing differentiation of the cells necessarily becomes complicated. In addition, differentiation in vitro often requires the addition of growth factors such as growth factors, differentiation-inducing factors, and extracellular matrix in a large amount for a long period of time. There was also a problem that the cost (expense) was excessive.
本発明の目的は、多能性幹細胞から種々の細胞を簡便に得る方法を提供しようというものである。 An object of the present invention is to provide a method for easily obtaining various cells from pluripotent stem cells.
本発明は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにｉＰＳ細胞を移植した後、２〜６週間飼育して、当該重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの体内で奇形腫を形成させたのち、該奇形腫を体外に取り出し、奇形腫を酵素処理して細胞を分散させ該細胞に蛍光色素結合抗マウスＣＤ１０５抗体または蛍光色素結合抗抗ヒトＣＤ２７１抗体を加えて結合させて、前記抗体の蛍光陽性細胞を分取することを特徴とする間葉系細胞の製法である。
さらに、本発明は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにＰｄｘ１遺伝子の転写調節領域と赤色蛍光タンパク質ＲＦＰ遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子から構成されるＰｄｘ１−ＲＦＰ遺伝子をゲノム中に含むＥＳ細胞を移植した後、２〜６週間飼育して当該重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの体内で奇形腫を形成させたのち、該奇形腫を体外に取り出し、奇形腫を酵素処理して細胞を分散させ、ＲＦＰ陽性の細胞を分取することを特徴とする膵島細胞の製法である。
The present invention is, after transplanting iPS cells into severe combined immunodeficient (SCID) mice were bred 2-6 weeks, after having formed teratomas in vivo of the severe combined immunodeficiency (SCID) mice, the Take out the teratoma out of the body, disperse the cells by enzyme treatment of the teratoma, add fluorescent dye-conjugated anti- mouse CD 105 antibody or fluorescent dye-conjugated anti-human CD271 antibody to the cells and bind them, A method for producing mesenchymal cells characterized by sorting cells.
Furthermore, the present invention transplants ES cells containing in the genome a Pdx1-RFP gene composed of a transcriptional regulatory region of the Pdx1 gene, a red fluorescent protein RFP gene and a puromycin resistance gene into a severe combined immunodeficiency (SCID) mouse. Then, after bred for 2-6 weeks to form teratomas in the body of the severe combined immunodeficiency (SCID) mouse , the teratomas are taken out of the body, the teratomas are treated with enzymes to disperse the cells, This is a method for producing islet cells characterized by sorting out RFP-positive cells.
また、本発明は、前記免疫不全動物が重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスであり、前記多能性幹細胞がマウスｉＰＳ細胞であり、分化細胞がマウス膵島細胞であることを特徴とする。 Further, the present invention is characterized in that the immunodeficient animal is a severe combined immunodeficiency (SCID) mouse, the pluripotent stem cell is a mouse iPS cell, and the differentiated cell is a mouse islet cell.
本発明は、多能性幹細胞を免疫不全動物に移植し、体内で奇形種を形成させたのち、該奇形種から目的の細胞を分取するので、体外における細胞の分化誘導に必須である特別な分化誘導因子は一切必要ないという明白な利点がある。また、奇形腫の中では、組織様の構造体として分化するため、従来の体外培養系では誘導が困難であった細胞を容易に獲得できる。 In the present invention, a pluripotent stem cell is transplanted into an immunodeficient animal and a malformed species is formed in the body, and then a target cell is collected from the malformed species. Therefore, the present invention is essential for inducing differentiation of cells outside the body. There is an obvious advantage that no differentiation factor is required. Further, since teratomas differentiate as tissue-like structures, cells that were difficult to induce in conventional in vitro culture systems can be easily obtained.
さらに、「すでに形成されている細胞を選択する」という単純な原理に基づくため、複雑な分化誘導方法の開発を待つことなく、即時的に必要な細胞を必要数得ることが期待できるという利点がある。 Furthermore, since it is based on the simple principle of “selecting already formed cells”, there is an advantage that the necessary number of cells can be obtained immediately without waiting for the development of a complicated differentiation induction method. is there.
本発明は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにｉＰＳ細胞を移植した後、２〜６週間飼育して、当該重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの体内で奇形腫を形成させたのち、該奇形腫を体外に取り出し、奇形腫を酵素処理して細胞を分散させ該細胞に蛍光色素結合抗マウスＣＤ１０５抗体または蛍光色素結合抗抗ヒトＣＤ２７１抗体を加えて結合させて、前記抗体の蛍光陽性細胞を分取することを特徴とする間葉系細胞の製法である。
さらに、本発明は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにＰｄｘ１遺伝子の転写調節領域と赤色蛍光タンパク質ＲＦＰ遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子から構成されるＰｄｘ１−ＲＦＰ遺伝子をゲノム中に含むＥＳ細胞を移植した後、２〜６週間飼育して当該重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの体内で奇形腫を形成させたのち、該奇形腫を体外に取り出し、奇形腫を酵素処理して細胞を分散させ、ＲＦＰ陽性の細胞を分取することを特徴とする膵島細胞の製法である（以下では、前記ｉＰＳ細胞およびＰｄｘ１遺伝子の転写調節領域と赤色蛍光タンパク質ＲＦＰ遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子から構成されるＰｄｘ１−ＲＦＰ遺伝子をゲノム中に含むＥＳ細胞を多能性幹細胞といい、前記間葉系細胞および膵島細胞を分化細胞ということがある）。
The present invention is, after transplanting iPS cells into severe combined immunodeficient (SCID) mice were bred 2-6 weeks, after having formed teratomas in vivo of the severe combined immunodeficiency (SCID) mice, the Take out the teratoma out of the body, disperse the cells by enzyme treatment of the teratoma, add fluorescent dye-conjugated anti- mouse CD 105 antibody or fluorescent dye-conjugated anti-human CD271 antibody to the cells and bind them, A method for producing mesenchymal cells characterized by sorting cells.
Furthermore, the present invention transplants ES cells containing in the genome a Pdx1-RFP gene composed of a transcriptional regulatory region of the Pdx1 gene, a red fluorescent protein RFP gene and a puromycin resistance gene into a severe combined immunodeficiency (SCID) mouse. Then, after bred for 2-6 weeks to form teratomas in the body of the severe combined immunodeficiency (SCID) mouse , the teratomas are taken out of the body, the teratomas are treated with enzymes to disperse the cells, This is a method for producing pancreatic islet cells characterized by sorting out RFP-positive cells (hereinafter referred to as Pdx1- consisting of the transcriptional regulatory region of iPS cells and Pdx1 gene, red fluorescent protein RFP gene and puromycin resistance gene ). ES cells containing the RFP gene in the genome are called pluripotent stem cells, and the mesenchymal cells and islet cells There is the fact that differentiated cells).
図１は、本発明の方法を模式的に示した図であり、図１（１）は培養器中で培養されている多能性幹細胞１、図１（２）は免疫不全マウス２に多能性幹細胞１を移植していること、図１（３）は移植された免疫不全マウス３の体内で奇形腫４が形成されていること、図１（４）は奇形腫４から分離された，成熟した目的の分化細胞５をそれぞれ示す図である。 FIG. 1 is a diagram schematically showing the method of the present invention. FIG. 1 (1) shows pluripotent stem cells 1 cultured in an incubator, and FIG. Fig. 1 (3) shows that teratoma 4 is formed in the body of the transplanted immunodeficient mouse 3, and Fig. 1 (4) shows that teratoma 4 has been isolated. FIG. 2 is a diagram showing mature target differentiated cells 5, respectively.
本発明において、免疫不全動物としては、人為的または先天的にＴ細胞機能免疫またはＢ細胞機能免疫あるいはそれらの双方の機能が著しく低下しているか、欠除している哺乳動物（ヒトを除く）であれば使用することができ、取り扱いの容易なラットまたはマウスが好ましい。 In the present invention, as an immunodeficient animal, mammals (excluding humans) in which T cell functional immunity and / or B cell functional immunity, or both of these functions are significantly reduced or absent, are artificially or congenitally. Any rat or mouse that can be used and is easy to handle is preferred.
かかる免疫不全のラットまたはマウスとしては、Ｆ３４４/ＮＪｃｌ−ｒｎｕ/ｒｎｕラットのようなＴ細胞機能欠如ラット、ＢＡＬＢ/ｃＡＪｃｌ−ｎｕ/ｎｕマウスのようなＴ細胞機能欠如マウス、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスのようなＴ細胞機能およびＢ細胞機能の双方が欠如したマウスがあげられる。 Such immunodeficient rats or mice include rats lacking T cell function such as F344 / NJcl-rnu / rnu rats, mice lacking T cell function such as BALB / cAJcl-nu / nu mice, severe combined immunodeficiency (SCID). ) Mice that lack both T cell function and B cell function, such as mice.
これらのうち、奇形腫形成の容易さ、飼育条件を考慮すると、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスやＢＡＬＢ/ｃＡＪｃｌ−ｎｕ/ｎｕマウスなどの免疫不全動物が好ましい。 Among these, in view of ease of teratoma formation and rearing conditions, immunodeficient animals such as severe combined immunodeficiency (SCID) mice and BALB / cAJcl-nu / nu mice are preferred.
図２は、本発明で用いられる免疫不全動物の体内で奇形種を形成しうる多能性幹細胞の１例である未分化のマウスｉＰＳ細胞６を示す写真である。 FIG. 2 is a photograph showing an undifferentiated mouse iPS cell 6 which is an example of a pluripotent stem cell capable of forming a malformed species in the body of an immunodeficient animal used in the present invention.
本発明において、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（以下、単に免疫不全動物という）の体内で奇形種を形成しうるｉＰＳ細胞、Ｐｄｘ１遺伝子の転写調節領域と赤色蛍光タンパク質ＲＦＰ遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子から構成されるＰｄｘ１−ＲＦＰ遺伝子（以下、Ｐｄｘ１−ＲＦＰ遺伝子という）をゲノム中に含むＥＳ細胞は、ヒト細胞であってもよく、マウス、ラット、ウサギ、山羊、羊その他の哺乳動物由来の細胞であってもよく、さらには公知のもののほか、市販の細胞であっても好適に使用することができ、たとえば、ｉＰＳ細胞としては、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｔｅｒｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８などの転写因子を導入した細胞があげられ、ＥＳ細胞としては、ＲＦ８細胞、ＪＩ細胞、ＣＧＲ８細胞、ＭＧ１．１９細胞があげられ、市販されているマウスＥＳ細胞としては１２９ＳＶ由来、Ｃ５７／ＢＬ６由来、ＤＢＡ／１由来の細胞が挙げられる。またヒトＥＳ細胞としては、ＫｈＥＳ−１細胞、ＫｈＥＳ−２細胞、ＫｈＥＳ−３細胞が挙げられ、またサルＥＳ細胞としてはカニクイザルＥＳ細胞が挙げられる。これらのうち、胚様体を形成しうる細胞は、胚様体を経由して、より高い成功率で間葉系細胞に誘導することができるので好ましい。 In the present invention, iPS cells capable of forming a malformed species in the body of severe combined immunodeficiency (SCID) mice (hereinafter simply referred to as immunodeficient animals) , the transcriptional regulatory region of the Pdx1 gene, the red fluorescent protein RFP gene and the puromycin resistance gene The ES cell containing the Pdx1-RFP gene (hereinafter referred to as Pdx1-RFP gene ) composed of the following may be a human cell, a mouse, rat, rabbit, goat, sheep or other mammalian cell In addition to known ones, commercially available cells can also be used suitably. For example, as iPS cells, Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Tert, Nanog, Oct3 / 4, Sox2, Lin28 and other cells introduced with transcription factors, ES cells include R Examples include F8 cells, JI cells, CGR8 cells, and MG1.19 cells. Examples of commercially available mouse ES cells include cells derived from 129SV, C57 / BL6, and DBA / 1. Further, examples of human ES cells include KhES-1 cells, KhES-2 cells, and KhES-3 cells, and examples of monkey ES cells include cynomolgus monkey ES cells. Among these, cells capable of forming embryoid bodies are preferable because they can be induced into mesenchymal cells with a higher success rate via embryoid bodies.
本発明において用いられる多能性幹細胞は、未分化マーカーであるアルカリオスファターゼ活性、Ｏｃｔ―４、Ｎｏｎｏｇなどが陽性であるものが好ましく、とりわけ複数のマーカーが陽性であるものが好ましい。 The pluripotent stem cells used in the present invention are preferably positive for alkaline phosphatase activity, Oct-4, Nonog, etc., which are undifferentiated markers, and particularly those in which a plurality of markers are positive.
本発明によれば、ｉＰＳ細胞またはＰｄｘ１−ＲＦＰ遺伝子をゲノム中に含むＥＳ細胞の免疫不全動物への移植、移植した免疫不全動物の体内での奇形腫形成、奇形腫の取り出し、奇形腫を酵素処理して分散させた細胞を、蛍光色素結合抗マウスＣＤ１０５抗体または蛍光色素結合抗抗ヒトＣＤ２７１抗体（以下、これら２つの蛍光抗体を総称して蛍光色素結合抗ＣＤ抗体という）を加えて結合させて、前記抗体の蛍光陽性細胞を分取するか、またはＲＦＰ陽性の細胞を分取することによって、目的とする間葉系細胞または膵島細胞を得ることができる。 According to the present invention, transplantation of iPS cells or ES cells containing the Pdx1-RFP gene in their genome into immunodeficient animals, formation of teratomas in the transplanted immunodeficient animals, extraction of teratomas, enzyme conversion of teratomas The treated and dispersed cells are bound by adding fluorescent dye-conjugated anti- mouse CD 105 antibody or fluorescent dye-conjugated anti-human CD271 antibody (hereinafter these two fluorescent antibodies are collectively referred to as fluorescent dye-conjugated anti-CD antibody). Thus, the target mesenchymal cell or pancreatic islet cell can be obtained by sorting fluorescence-positive cells of the antibody or by sorting RFP-positive cells.
本発明において、多能性幹細胞の免疫不全動物への移植は、多能性幹細胞を培養し、得られた培養細胞を細胞乖離液で細胞毎に乖離させ、ついで細胞を分取したのち、細胞を免疫不全動物に移植することにより実施できる。 In the present invention, transplantation of pluripotent stem cells to an immunodeficient animal involves culturing pluripotent stem cells, separating the obtained cultured cells for each cell with a cell lysate, and then sorting the cells, Can be carried out by transplanting into an immunodeficient animal.
細胞の乖離は、組織または細胞培養において使用される細胞乖離液を使用することができ、たとえば０．２５％程度のトリプシンと１ｍＭ濃度のＥＤＴＡの混合液のほか、トリプルエクスプレス（商品名）、アキュターゼ（商品名、イノベイティブセルテクノロジー社製）などの、市販のものを用いることができる。乖離させた細胞の分取はたとえば、遠心分離などにより実施することができる。 For cell detachment, a cell lysate used in tissue or cell culture can be used. For example, in addition to a mixed solution of about 0.25% trypsin and 1 mM EDTA, Triple Express (trade name), Accutase Commercially available products such as (trade name, manufactured by Innovative Cell Technology) can be used. The separation of the dissociated cells can be performed by, for example, centrifugation.
移植は、多能性幹細胞を生理的食塩水またはＰＢＳに懸濁させ、注射器などを用いて免疫不全動物の、筋肉組織や腹腔など適当な部位に注入することによって実施することができる。 Transplantation can be performed by suspending pluripotent stem cells in physiological saline or PBS and injecting them into an appropriate site such as muscle tissue or abdominal cavity of an immunodeficient animal using a syringe or the like.
多能性幹細胞の移植は、免疫不全動物の１個所に行ってもよく、両大腿部の数個所あるいは大腿部と腹腔など、同部位または部位を変えて複数個所に行ってもよい。 Transplantation of pluripotent stem cells may be performed in one place of an immunodeficient animal, or may be carried out in several places at different positions such as several places on both thighs or thighs and abdominal cavity.
移植に際しては、多能性幹細胞の細胞数が、約１×１０６〜１×１０７個程度を用いるのが好ましい。 When transplanting, it is preferable to use about 1 × 10 6 to 1 × 10 7 pluripotent stem cells.
移植した免疫不全動物の体内での奇形腫形成は、当該動物を無菌下に通常の飼育を行うことによって実施することができる。 Teratoma formation in the body of a transplanted immunodeficient animal can be carried out by carrying out normal rearing of the animal under aseptic conditions.
奇形腫形成は、用いる細胞の種類や移植した細胞数によっても異なるが、概ね２〜６週間程度であるのが好ましい。 Although teratoma formation varies depending on the type of cells used and the number of transplanted cells, it is preferably about 2 to 6 weeks.
図３は、重症複合免疫不全マウス（ＳＣＩＤ）の両大腿部から回収された２つの奇形腫７を示す写真である。 FIG. 3 is a photograph showing two teratomas 7 recovered from both thighs of severe combined immunodeficient mice (SCID).
本発明において、奇形腫の取り出しは、免疫不全動物から、適当な外科的方法によって、目的の奇形腫を採取すればよく、特に制限はない。 In the present invention, the teratoma can be removed from the immunodeficient animal by collecting the target teratoma by an appropriate surgical method, and is not particularly limited.
本発明において、目的細胞の分取は、取り出された奇形腫を培養液中で、細胞乖離液で処理し、分散させた細胞を、蛍光色素結合抗ＣＤ抗体を加えて結合させて、前記抗体の蛍光陽性細胞を分取するか、またはＲＦＰ陽性の細胞を分取することによって実施することができる。 In the present invention, the target cells are separated by treating the extracted teratomas with a cell lysate in a culture solution, and then dispersing the dispersed cells by adding a fluorescent dye-conjugated anti-CD antibody to bind the antibody. This can be done by sorting out the fluorescence-positive cells of the cells or by sorting out the RFP-positive cells .
細胞乖離液としては、前記多能性幹細胞を細胞乖離液で乖離させる際に使用したものを好適に使用することができる。細胞乖離液の反応は奇形腫の大きさにもよるが、概ね３時間程度でよく、反応後、ダルベッコ変法イーグル培地に最終濃度１０％以上になるようにウシ胎児血清を添加したものを加え、酵素反応を停止させる。分化細胞の分取は、たとえば遠心チューブに移し、１，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離することにより実施することができる。 As the cell detachment solution, the one used when the pluripotent stem cells are separated from the cell detachment solution can be preferably used. The reaction of the cell lysate depends on the size of the teratoma, but it may take about 3 hours. After the reaction, add Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with fetal calf serum to a final concentration of 10% or more. Stop the enzymatic reaction. Differentiated cells can be collected, for example, by transferring them to a centrifuge tube and centrifuging at 1,000 rpm for 10 minutes.
目的細胞が間葉系細胞の場合には、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＭＭＰ−１１などの細胞表面マーカーの発現を確認すればよい。あるいは表面抗原であるＣＤ１０５（イー・バイオサイエンス社）、ＣＤ２７１（ミルテニー・バイオテク社）、ＣＤ２９（サンタクルズ・バイオテクノロジー社）に対する抗体を使用し、免疫染色、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリーによって目的細胞が間葉系細胞であることを確認することもできる。 If purpose cells of mesenchymal cells, PDGFRα, PDGFRβ, may be confirmed expression of cell surface markers, such as MMP-11. Or the surface is an antigen CD105 (E. Bioscience), CD271 (Miltenyi Biotec), CD29 using antibodies against the (Santa Cruz Biotechnology), immunostaining, western blotting, target cells by flow cytometry Can be confirmed to be mesenchymal cells.
また、目的細胞が膵島β細胞の場合には、Ｐｄｘ１−ＲＦＰ遺伝子をゲノム中に含むＥＳ細胞のＲＦＰ陽性（発現）に基づいて目的細胞を確認することができる。
かくして、分化細胞の中から目的とする細胞を得ることができる。
When the target cell is an islet β cell, the target cell can be confirmed based on the RFP positive (expression) of the ES cell containing the Pdx1-RFP gene in the genome .
Thus, the target cell can be obtained from the differentiated cells.
実施例１
マウスｉＰＳ細胞からの間葉系細胞の製造
京都大学で作製され、理化学研究所から譲受けたマウスｉＰＳ細胞株ｉＰＳＭＥＦＮｇ２０Ｄ１７株を培養し、コンフルエントに達したｉＰＳ細胞を細胞乖離液、トリプルエクスプレス（商品名、インビトロジェン社製）で乖離させ、等量の１０％ＦＣＳ-ＤＭＥＭを添加し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した後、上清を吸引除去し、沈殿した細胞を分取した。
Example 1
Manufacture of mesenchymal cells from mouse iPS cells The mouse iPS cell line iPSMEFNg20D17 produced at Kyoto University and transferred from RIKEN is cultured. , Manufactured by Invitrogen), an equal amount of 10% FCS-DMEM was added, and the mixture was centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes, and then the supernatant was removed by suction, and the precipitated cells were collected.
分取した細胞を１×１０７個／ｍｌとなるようＰＢＳ（-）に懸濁し、２６Ｇ注射針および１ｍｌ注射筒を用いてＳＣＩＤマウスの大腿部皮下に移植した。２週間後、マウスから形成された奇形腫を回収し、Ｉ型コラゲナーゼを用いた酵素処理により細胞の分散を行った。 The sorted cells were suspended in PBS (−) so as to be 1 × 10 7 cells / ml, and transplanted subcutaneously into the thigh of SCID mice using a 26 G injection needle and a 1 ml syringe. Two weeks later, the teratomas formed from the mice were collected, and the cells were dispersed by an enzyme treatment using type I collagenase.
分散した細胞液をＰＢＳにて洗浄後、１０％ウシ胎児血清含ＤＭＥＭ培地にて培養を行った。培養後、生存細胞の接着を確認し、培養上清とともに死細胞や狭雑物を除去した。ついで、０．２５％トリプシン（インビトロジェン社製）―０．０２％ ＥＤＴＡ混合液で細胞を剥がし、遠心処理により生存細胞のペレットを得た。目的細胞の分離に際して、細胞ペレットを２％ウシ胎児血清およびＨＥＰＥＳを含むＤＭＥＭ培地（以下、ＦＡＣＳバッファーという）に懸濁し、ＰＥ（赤色蛍光色素）結合抗マウスＣＤ１０５ラットＩｇＧ抗体を添加して、４℃にて1時間振とう培養を行った。 The dispersed cell solution was washed with PBS and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. After culturing, the adhesion of viable cells was confirmed, and dead cells and contaminants were removed together with the culture supernatant. Subsequently, the cells were detached with a 0.25% trypsin (manufactured by Invitrogen) -0.02% EDTA mixture, and a pellet of viable cells was obtained by centrifugation. Upon separation of target cells, the cell pellet was suspended in DMEM medium (hereinafter referred to as FACS buffer) containing 2% fetal bovine serum and HEPES, PE (red fluorescent dye) -conjugated anti-mouse CD105 rat IgG antibody was added, and 4 Shaking culture was performed at ° C for 1 hour.
１時間後、液量の２０倍量となる１０％ウシ胎児血清含ＤＭＥＭ培地を加え、洗浄、遠心分離と上清除去の操作を２回行った。 After 1 hour, 10% fetal bovine serum-containing DMEM medium that was 20 times the volume of the solution was added, and washing, centrifugation, and supernatant removal were performed twice.
処理後の細胞を０．５ｍｌのＦＡＣＳバッファーに懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ）にて解析し、赤色蛍光陽性かつ緑色蛍光陰性の画分を分離することによって本発明方法による間葉系細胞を得た。
得られた細胞は、間葉系細胞の形体を示し、優れた増殖能力を示した。
The treated cells are suspended in 0.5 ml of FACS buffer, analyzed by flow cytometry (FACSVantage), and the mesenchymal cells according to the method of the present invention are separated by separating the red fluorescence positive and green fluorescence negative fractions. Obtained.
The obtained cells showed mesenchymal cell morphology and showed excellent proliferation ability.
図４は、マウスｉＰＳ細胞から形成された奇形腫を酵素処理し、特異的な抗体で目的細胞を分離していることを示す図および写真である。図４（１）は、酵素処理した奇形種の細胞をＦＡＣＳバッファーに懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ）にて解析した結果を示すヒストグラム８であり、図４（１）中、Ｐ２領域は赤色蛍光陽性の存在領域を示す。図４（２）は赤色蛍光陽性の画分として分離された、マウスｉＰＳ細胞由来の間葉系細胞９を示す写真である。 FIG. 4 is a diagram and a photograph showing that teratomas formed from mouse iPS cells are treated with enzymes and target cells are separated with specific antibodies. FIG. 4 (1) is a histogram 8 showing the result of suspending an enzyme-treated malformed cell in a FACS buffer and analyzing by flow cytometry (FACSVantage). In FIG. 4 (1), the P2 region is red. The region where fluorescence is positive is shown. FIG. 4 (2) is a photograph showing mouse iPS cell-derived mesenchymal cells 9 isolated as a red fluorescence positive fraction.
また、得られた間葉系細胞を検体として、ＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、間葉系細胞マーカーであるＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎの発現を認めた。 Further, when RT-PCR was performed using the obtained mesenchymal cells as a specimen, expression of PDGFRα, PDGFRβ, and Vimentin as mesenchymal cell markers was observed.
なお、ＲＴ-ＰＣＲに際しては、予め作成したマウスβ―ａｃｔｉｎ、Ｆｌｋ−１、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ遺伝子の配列に特異的なプライマーを用いて行った。マウスβ―ａｃｔｉｎ、Ｆｌｋ−１、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ遺伝子の配列は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ）に公開されている。 RT-PCR was performed using primers specific for the sequences of mouse β-actin, Flk-1, PDGFRα, PDGFRβ, and Vimentin gene prepared in advance. The sequences of mouse β-actin, Flk-1, PDGFRα, PDGFRβ, and Vimentin gene are disclosed in Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez).
ＲＴ−ＰＣＲについて、細胞をＴＲＩｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）で処理し、クロロホルムと混合して１５，０００回転で１０分間遠心することによりＲＮＡを含む水層を分離した。ＲＮＡを含む水層を同量のイソプロパノールと混合し、再度１５，０００回転で１０分間遠心することでＲＮＡの沈殿物を得た。沈殿物は氷冷した８０％エタノールで洗浄し、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水に溶解した後に逆転写反応に使用した。逆転写反応はＨｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を使用して実施した。ＰＣＲ反応液は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（登録商標、タカラバイオ社製）を用いて作成し、ＲＴ-ＰＣＲ定量用チューブ（ミクロアンプ オプチカル８−チューブストリップ、商品名、アプライド、バイオシステムズ社製）に分注した。ＰＣＲ反応はＴＡＫＡＲＡ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ社製）を使用し、９４℃で２分間の変性反応の後、９４℃で２０秒間、５８℃で２０秒間のアニーリング、７２℃で２０秒間の増幅反応を３５回繰り返し、ＴＡＥバッファーを用いたアガロース電気泳動にて結果を解析した。 For RT-PCR, cells were treated with TRIzol reagent (Invitrogen), mixed with chloroform, and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes to separate an aqueous layer containing RNA. The aqueous layer containing RNA was mixed with the same amount of isopropanol and centrifuged again at 15,000 rpm for 10 minutes to obtain an RNA precipitate. The precipitate was washed with ice-cooled 80% ethanol, dissolved in RNase free water, and used for the reverse transcription reaction. The reverse transcription reaction was performed using a high capacity cDNA transcription kit (Invitrogen). A PCR reaction solution was prepared using Platinum Taq DNA polymerase (registered trademark, manufactured by Takara Bio Inc.) and placed in a tube for RT-PCR quantification (Microamp Optical 8-tube strip, trade name, Applied, manufactured by Biosystems). Dispensed. PCR reaction was performed using TAKARA PCR Thermal Cycler Dice Gradient (Takara Bio Inc.), denaturation reaction at 94 ° C for 2 minutes, annealing at 94 ° C for 20 seconds, 58 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 20 seconds. The amplification reaction was repeated 35 times, and the results were analyzed by agarose electrophoresis using TAE buffer.
実施例２
ヒトｉＰＳ細胞からの間葉系細胞の製造
京都大学で作製され、理化学研究所から譲受けたヒトｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１株を培養し、コンフルエントに達したｉＰＳ細胞をＣｅｌｌ Ｌｉｆｔｅｒ (コーニング社製)で乖離させ、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した後、上清を吸引除去し、沈殿した細胞を分取した。
Example 2
Manufacture of mesenchymal cells from human iPS cells Human iPS cell line 253G1 prepared at Kyoto University and transferred from RIKEN is cultured, and confluent iPS cells are dissociated with Cell Lifter (Corning) After centrifugation at 1,500 rpm for 10 minutes, the supernatant was removed by aspiration, and the precipitated cells were collected.
分取した細胞を約１×１０７個／ｍｌとなるよう５００μｌのマトリゲル（ＢＤファルコン株式会社製）に懸濁し、２６Ｇ注射針および１ｍｌ注射筒を用いてＳＣＩＤマウスの大腿部皮下に移植した。１ヶ月後、マウスから形成された奇形腫を回収し、Ｉ型コラゲナーゼを用いた酵素処理により細胞の分散を行った。 The sorted cells were suspended in 500 μl of Matrigel (manufactured by BD Falcon Co., Ltd.) at about 1 × 10 7 cells / ml and transplanted subcutaneously into the thigh of a SCID mouse using a 26G injection needle and a 1 ml syringe. . One month later, the teratomas formed from the mice were collected, and the cells were dispersed by an enzyme treatment using type I collagenase.
分散した細胞液をＰＢＳにて洗浄後、１０％ウシ胎児血清含ＤＭＥＭ培地にて培養を行った。培養後、生存細胞の接着を確認し、培養上清とともに死細胞や狭雑物を除去した。ついで、０．２５％トリプシン（インビトロジェン社製）―０．０２％ ＥＤＴＡ混合液で細胞を剥がし、遠心処理により生存細胞のペレットを得た。目的細胞の分離に際して、細胞ペレットをＦＡＣＳバッファーに懸濁し、ＡＰＣ（橙色蛍光色素）結合抗ヒトＣＤ２１７ウサギＩｇＧ抗体を添加して、４℃にて１時間振とう培養を行った。 The dispersed cell solution was washed with PBS and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. After culturing, the adhesion of viable cells was confirmed, and dead cells and contaminants were removed together with the culture supernatant. Subsequently, the cells were detached with a 0.25% trypsin (manufactured by Invitrogen) -0.02% EDTA mixture, and a pellet of viable cells was obtained by centrifugation. Upon separation of the target cells, the cell pellet was suspended in FACS buffer, APC (orange fluorescent dye) -conjugated anti-human CD217 rabbit IgG antibody was added, and cultured with shaking at 4 ° C. for 1 hour.
１時間後、液量の２０倍量となる１０％ウシ胎児血清含ＤＭＥＭ培地を加え、洗浄、遠心分離と上清除去の操作を２回行った。 After 1 hour, 10% fetal bovine serum-containing DMEM medium that was 20 times the volume of the solution was added, and washing, centrifugation, and supernatant removal were performed twice.
処理後の細胞を０．５ｍｌのＦＡＣＳバッファーに懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ）にて解析し、赤色蛍光陽性の画分を分離することによって本発明方法による間葉系細胞を得た。得られた細胞は、間葉系細胞の形体を示し、優れた増殖能力を示した。 The cells after the treatment were suspended in 0.5 ml of FACS buffer, analyzed by flow cytometry (FACSVantage), and a red fluorescence positive fraction was separated to obtain mesenchymal cells according to the method of the present invention. The obtained cells showed mesenchymal cell morphology and showed excellent proliferation ability.
図５は、細胞分離時のＦＡＣＳパターンを示す図であり、ヒトｉＰＳ細胞から奇形腫形成を介して作製した間葉系細胞を分離する際に見られたＦＡＣＳの結果を示す図および写真である。図５（１）は橙色蛍光陽性の存在領域を示すヒストグラム１０である。図５（２）は分離した細胞１１の形体を表す写真である。得られた細胞は、間葉系幹細胞の形体を示し、優れた増殖能力を示した。また、得られた間葉系細胞が間葉系幹細胞であることを示すためにｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ解析を行った。 FIG. 5 is a diagram showing a FACS pattern at the time of cell separation, and is a diagram and a photograph showing results of FACS observed when isolating mesenchymal cells prepared from teratoma formation from human iPS cells. . FIG. 5 (1) is a histogram 10 showing the existence region of positive orange fluorescence. FIG. 5 (2) is a photograph showing the shape of the separated cell 11. The obtained cells showed mesenchymal stem cell morphology and showed excellent proliferation ability. In addition, Western blot analysis was performed to show that the obtained mesenchymal cells were mesenchymal stem cells.
図６は、ヒトｉＰＳ細胞から奇形腫形成を介して作製した間葉系細胞の性質を解析した結果を示す図である。解析結果には、未分化のヒトｉＰＳ細胞とヒトｉＰＳ細胞から奇形腫形成を介した間葉系細胞が発現しているマーカー１２が示されている。図中、Ａは未分化のヒトｉＰＳ細胞を解析した結果を示し、ＢはＦＡＣＳにて分離した間葉系細胞を解析した結果を示す図である。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ解析には、定法により作成したアクリルアミドゲル、泳動バッファー、転写バッファーを使用し、Ｅｘｔｒａ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐａｐｅｒ（バイオラッド社製）、ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥヘルスケア社製）を用いて荷電装置（Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｎ ｔｅｔｒａ ｃｅｌｌ、バイオラッド社製）にて電気泳動および転写を行い、抗ＰＤＧＦＲα抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社製）、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社製）、抗Ｉｎｔｅｇｌｉｎβ１抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社製）、抗ＣＤ１０５抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社製）、抗Ｅｃａｄｈｅｒｉｎ抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社製）、抗Ｎａｎｏｇ抗体（リプロセル社製）、抗Ｓｏｘ２抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社製）、抗Ａｃｔｉｎ抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社製）、イムノエンハンサー（東洋紡株式会社製）、およびＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ−ウシＩｇＧ抗体、ＨＲＰ結合抗ヤギＩｇＧ−ウシＩｇＧ抗体、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ−ヤギＩｇＧ抗体を使用し、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍにて発光処理を行い、イメージアナライザー（Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＬＡＳ４０００、ＧＥヘルスケア社製）にて検出を行った。 FIG. 6 is a diagram showing the results of analyzing the properties of mesenchymal cells prepared from human iPS cells via teratoma formation. The analysis results show undifferentiated human iPS cells and markers 12 in which mesenchymal cells are expressed from human iPS cells via teratoma formation. In the figure, A shows the result of analyzing undifferentiated human iPS cells, and B shows the result of analyzing mesenchymal cells separated by FACS. For Western blot analysis, acrylamide gel, electrophoresis buffer, and transfer buffer prepared by a conventional method are used, and a charging device (Mini Protean tetra) is used using an Extra Filter Paper (BioRad) and a PVDF membrane (GE Healthcare). cell, manufactured by Bio-Rad), electrophoresis and transcription, anti-PDGFRα antibody (manufactured by Santa Cruz Biotechnology), anti-Vimentin antibody (manufactured by Santa Cruz Biotechnology), anti-Integrin β1 antibody (manufactured by Santa Cruz Biotechnology), anti-antibody CD105 antibody (manufactured by Santa Cruz Biotechnology), anti-Ecadherin antibody (manufactured by Santa Cruz Biotechnology), anti-Nanog antibody (manufactured by Reprocell), anti-Sox 2 antibody (manufactured by Santa Cruz Biotechnology), anti-actin antibody (manufactured by Santa Cruz Biotechnology), immuno enhancer (manufactured by Toyobo), and HRP-conjugated anti-rabbit IgG-bovine IgG antibody, HRP-conjugated anti-goat IgG-bovine IgG antibody Using an HRP-conjugated anti-mouse IgG-goat IgG antibody, the ECL Plus Western blotting detection system was used for luminescence treatment, and detection was performed using an image analyzer (Image Quant LAS4000, manufactured by GE Healthcare).
図６に示すとおり、同法により作成したヒトｉＰＳ細胞由来細胞（図中ではＢとして示している）は、間葉系幹細胞マーカーであるＰＤＧＦＲα、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｉｎｔｅｇｌｉｎβ１、ＣＤ１０５を発現しており、間葉系幹細胞に分化していることが確認された。 As shown in FIG. 6, human iPS cell-derived cells (shown as B in the figure) prepared by the same method express mesenchymal stem cell markers PDGFRα, Vimentin, Integrinβ1, and CD105. It was confirmed that the cells had differentiated into stem cells.
実施例３
マウスＥＳ細胞からの膵島細胞の製造
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの受精卵から、定法によって、近畿大学にて作成したマウスＥＳ細胞株（ＥＬ−１株）を培養し、コンフルエントに達したところで細胞乖離液、トリプルエクスプレス（商品名、インビトロジェン社製）で乖離させ、等量の１０％ＦＣＳ-ＤＭＥＭを添加し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した後、上清を吸引除去し、沈殿した細胞を分取した。
Example 3
Manufacture of pancreatic islet cells from mouse ES cells A mouse ES cell line (EL-1 strain) prepared at Kinki University was cultured from fertilized eggs of C57BL / 6J mice by a conventional method. After separating with Triple Express (trade name, manufactured by Invitrogen), adding an equal amount of 10% FCS-DMEM, centrifuging at 1,500 rpm for 10 minutes, the supernatant was removed by suction, and the precipitated cells were collected. Sorted.
分取した細胞を１×１０７個／ｍｌとなるようＰＢＳに懸濁し、制限酵素ＮｓｓＨＩＩ（タカラバイオ社製）で切断処理した１０μｇのＰｄｘ１−ＲＦＰプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社製：同社は米国の非営利団体であり、学術機関向けに遺伝子のバンク事業を行っている。）を混合した。これを電気付荷用容器（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ、バイオラッド社製）に入れ、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（バイオラッド社製）にて２５０Ｖ、９５０μＦの電気を一度印加した。この操作により、Ｐｄｘ１−ＲＦＰプラスミドをＥＬ−１細胞のゲノムＤＮＡ中に取り込ませた。Ｐｄｘ１遺伝子は膵臓で特異的に発現する遺伝子であり、Ｐｄｘ１遺伝子の転写調節領域と赤色蛍光タンパク質ＲＦＰ遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子から構成されるＰｄｘ１−ＲＦＰ遺伝子を有する細胞は、膵島細胞と同様の形質を獲得した時に赤色蛍光を発するという特徴と、ピューロマイシンに対して耐性を示すという特徴を有する。 10 μg of Pdx1-RFP plasmid (manufactured by Addgene) obtained by suspending the sorted cells in PBS to 1 × 10 7 cells / ml and cleaved with restriction enzyme NssHII (manufactured by Takara Bio Inc.) is a non-profit company in the United States. This is a group that conducts gene banking for academic institutions.) This was put in an electric loading container (Gene Pulser Cuvette, manufactured by Bio-Rad), and electricity of 250 V and 950 μF was applied once by Gene Pulser II (manufactured by Bio-Rad). By this operation, the Pdx1-RFP plasmid was incorporated into the genomic DNA of EL-1 cells. The Pdx1 gene is a gene that is specifically expressed in the pancreas, and a cell having a Pdx1-RFP gene composed of a transcriptional regulatory region of the Pdx1 gene, a red fluorescent protein RFP gene, and a puromycin resistance gene has the same trait as an islet cell. It has the characteristics that it emits red fluorescence when acquired, and the resistance to puromycin.
上記のとおり遺伝子を導入したＥＬ−１細胞を、ゼラチンコートを施したプラスチックシャーレ上で４８時間培養した。培養液には、通常のマウスＥＳ細胞用培地を使用した。 The EL-1 cells into which the gene was introduced as described above were cultured for 48 hours on a plastic petri dish coated with gelatin. The culture medium used was a normal mouse ES cell medium.
４８時間後に新しい培養液に交換し、１．５μｇ／ｍｌの濃度でピューロマイシンを加え引き続き培養を行った。以降１週間、２４時間毎にＥＳ培養液を交換し、ピューロマイシン添加を継続した。この培養操作により、ピューロマイシンに耐性を示す、即ちＰｄｘ１−ＲＦＰ遺伝子を有する細胞のみが増殖した。 After 48 hours, the medium was replaced with a new culture medium, and puromycin was added at a concentration of 1.5 μg / ml, followed by culturing. Thereafter, the ES culture medium was changed every 24 hours for 1 week, and puromycin addition was continued. By this culturing operation, only cells that are resistant to puromycin, that is, that have the Pdx1-RFP gene, proliferated.
Ｐｄｘ１−ＲＦＰ導入ＥＬ−１細胞がコンフルエントに達した時点でトリプルエクスプレス（商品名、インビトロジェン社製）にて乖離させ、等量の１０％ＦＣＳ-ＤＭＥＭを添加し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した後、上清を吸引除去し、沈殿した細胞を分取した。５００μｌのＰＢＳ（−）に懸濁後、２６Ｇ注射針および１ｍｌ注射筒を用いてＳＣＩＤマウスの大腿部皮下に移植した。２週間後、マウスから形成された奇形腫を回収し、Ｉ型コラゲナーゲを用いた酵素処理により細胞の分散を行った。 When Pdx1-RFP-introduced EL-1 cells reached confluence, they were separated by Triple Express (trade name, manufactured by Invitrogen), added with an equal amount of 10% FCS-DMEM, and centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes. After separation, the supernatant was removed by aspiration, and the precipitated cells were collected. After suspending in 500 μl of PBS (−), it was transplanted subcutaneously into the thigh of SCID mice using a 26G injection needle and a 1 ml syringe. Two weeks later, the teratomas formed from the mice were collected, and the cells were dispersed by an enzyme treatment using type I collagenage.
マウスＥＳ細胞から形成された奇形腫中のＲＦＰ陽性の膵島細胞が、Ｐｄｘ１遺伝子発現時期依存的にＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）を発現していることを示す図である。図７（１）はマウス奇形腫内でＰｄｘ１−ＲＦＰ陽性細胞が形成されていることを示す写真であり、倍率２００倍で観察された像１３である。および図７（２）および図７（３）は同じくマウス奇形腫内でＰｄｘ１−ＲＦＰ陽性細胞が形成されていることを示す図であり、倍率４００倍で観察された像１４，１５である。 It is a figure which shows that the RFP positive islet cell in the teratoma formed from the mouse | mouth ES cell is expressing RFP (red fluorescent protein) depending on Pdx1 gene expression time. FIG. 7 (1) is a photograph showing that Pdx1-RFP positive cells are formed in the mouse teratoma, and is an image 13 observed at a magnification of 200 times. 7 (2) and 7 (3) are diagrams showing that Pdx1-RFP positive cells are formed in the mouse teratoma, and are images 14 and 15 observed at a magnification of 400 times.
分散した細胞液をＰＢＳにて洗浄後、１０％ウシ胎児血清含ＤＭＥＭ培地にて培養を行った。培養後、生存細胞の接着を確認し、培養上清とともに死細胞や狭雑物を除去した。目的細胞の分離に際して、細胞ペレットをＦＡＣＳバッファーに懸濁した。 The dispersed cell solution was washed with PBS and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. After culturing, the adhesion of viable cells was confirmed, and dead cells and contaminants were removed together with the culture supernatant. Upon separation of the target cells, the cell pellet was suspended in FACS buffer.
処理後の細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ）にて解析し、赤色蛍光陽性の画分を分離することによって本発明方法による膵島細胞を得た。 After treatment, the cells were analyzed by flow cytometry (FACSVantage), and the red fluorescence positive fraction was separated to obtain islet cells according to the method of the present invention.
図８は、マウスＥＳ細胞から形成された奇形腫を酵素処理し、膵島特異的シグナル（Ｐｄｘ１−ＲＦＰ）を利用してＰｄｘ１陽性膵島細胞を分離していることを示すヒストグラム１６であり、Ｐ１の領域がＰｄｘ１陽性細胞の存在する領域である。 FIG. 8 is a histogram 16 showing that Pdx1-positive islet cells are separated using an islet-specific signal (Pdx1-RFP) by enzymatic treatment of teratomas formed from mouse ES cells. The region is a region where Pdx1-positive cells are present.
得られたＲＦＰ陽性の膵島細胞を検体として、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、膵島細胞マーカーであるＧｌｕｃａｇｏｎ、ＩＡＰＰの発現を認めた。 Quantitative RT-PCR was performed using the obtained RFP-positive pancreatic islet cells as samples, and the expression of Glucagon and IAPP, which are islet cell markers, was observed.
図９は、マウスＥＳ細胞から形成されたＲＦＰ陽性の膵島細胞が、膵島細胞マーカーであるＧｌｕｃａｇｏｎ、ＩＡＰＰを発現するが、もとのマウスＥＳ細胞は、膵島マーカーを発現していないことを示す図である。図９（１）において、Ｇｌｕｃａｇｏｎの相対発現量は、分化ＥＳ細胞での発現量を１としたときの相対発現量を示し、グラフ１７が、マウスＥＳ細胞のＧｌｕｃａｇｏｎ相対発現量を示し、グラフ１８が、マウスＥＳ細胞から奇形腫を介して形成され、ＦＡＣＳにて分離したＲＦＰ陽性膵島細胞のＧｌｕｃａｇｏｎ相対発現量を示す。 FIG. 9 shows that RFP-positive islet cells formed from mouse ES cells express islet cell markers Glucagon and IAPP, but the original mouse ES cells do not express islet markers. It is. In FIG. 9 (1), the relative expression level of Glucagon represents the relative expression level when the expression level in differentiated ES cells is 1, Graph 17 represents the Glucagon relative expression level of mouse ES cells, and Graph 18 Shows the Glucagon relative expression level of RFP-positive islet cells formed from mouse ES cells via teratomas and separated by FACS.
図９（２）において、ＩＡＰＰの場合は、ＥＳ細胞では全く発現が検出されなかったため、発現量は、Ａｃｔｉｎ遺伝子に対する相対発現量を示したものである。グラフ１９は、マウスＥＳ細胞のＩＡＰＰ相対発現量を示し、グラフ２０は、マウスＥＳ細胞から奇形腫を介して形成され、ＦＡＣＳにて分離したＲＦＰ陽性膵島細胞のＩＡＰＰ相対発現量を示す。 In FIG. 9 (2), in the case of IAPP, since no expression was detected in ES cells, the expression level indicates the relative expression level with respect to the Actin gene. Graph 19 shows the IAPP relative expression level of mouse ES cells, and Graph 20 shows the IAPP relative expression level of RFP-positive islet cells formed from mouse ES cells via teratomas and separated by FACS.
なお、定量的ＲＴ-ＰＣＲに際しては、予め作成したマウスβ―ａｃｔｉｎ、Ｇｌｕｃａｇｏｎ、ＩＡＰＰ遺伝子の配列に特異的なプライマーを用いて行った。マウスβ―ａｃｔｉｎ、Ｇｌｕｃａｇｏｎ、ＩＡＰＰ遺伝子の配列は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ）に公開されている。 The quantitative RT-PCR was performed using primers specific to the sequences of mouse β-actin, Glucagon, and IAPP genes prepared in advance. The sequences of mouse β-actin, Glucagon and IAPP genes are published in Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez).
定量的ＲＴ−ＰＣＲについて、細胞をＴＲＩｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）で処理し、クロロホルムと混合して１５，０００回転で１０分間遠心することによりＲＮＡを含む水層を分離した。ＲＮＡを含む水層を同量のイソプロパノールと混合し、再度１５，０００回転で１０分間遠心することでＲＮＡの沈殿物を得た。沈殿物は氷冷した８０％エタノールで洗浄し、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水に溶解した後に逆転写反応に使用した。逆転写反応はＨｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を使用して実施した。ＰＣＲ反応液は、ＳＹＢＲ II Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ（登録商標、タカラバイオ社製）を用いて作成し、ＲＴ−ＰＣＲ定量用チューブ（ミクロアンプ オプチカル８−チューブストリップ、商品名、アプライド、バイオシステムズ社製）に分注した。ＰＣＲ反応はＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００、アプライド バイオシステムズ社製）を使用し、９５℃で２０秒間の変性反応の後、９５℃で５秒間、６０℃で３０秒間のアニーリングおよび伸張増幅反応を４０回繰り返し、市販の表計算ソフトにて結果を解析した。 For quantitative RT-PCR, cells were treated with TRIzol reagent (Invitrogen), mixed with chloroform, and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes to separate an aqueous layer containing RNA. The aqueous layer containing RNA was mixed with the same amount of isopropanol and centrifuged again at 15,000 rpm for 10 minutes to obtain an RNA precipitate. The precipitate was washed with ice-cooled 80% ethanol, dissolved in RNase free water, and used for the reverse transcription reaction. The reverse transcription reaction was performed using a high capacity cDNA transcription kit (Invitrogen). A PCR reaction solution was prepared using SYBR II Premix EX Taq (registered trademark, manufactured by Takara Bio Inc.), and a tube for RT-PCR quantification (Microamp Optical 8-tube strip, trade name, Applied, manufactured by Biosystems) Dispensed into The PCR reaction was performed using a Real-time PCR device (ABI PRISM 7700, Applied Biosystems), denaturation reaction at 95 ° C. for 20 seconds, annealing at 95 ° C. for 5 seconds, and 60 ° C. for 30 seconds. The reaction was repeated 40 times, and the results were analyzed using commercially available spreadsheet software.
また、得られたＲＦＰ陽性膵島細胞を検体として、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行ったところ、ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅの発現を認めた。ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅはインスリンが産生される際に放出される副産物であり、インスリン産生性の特異的なマーカーとして知られている。 Moreover, when Western blotting was performed using the obtained RFP-positive islet cells as samples, the expression of c-peptide was observed. c-peptide is a by-product released when insulin is produced, and is known as a specific marker for insulin production.
図１０は、マウスＥＳ細胞から形成されたＲＦＰ陽性の膵島細胞がインスリン産生性の特異的なマーカーであるｃ−ｐｅｐｔｉｄｅを発現するが、もとのマウスＥＳ細胞はｃ−ｐｅｐｔｉｄｅを発現していないことを示す図である。 FIG. 10 shows that RFP-positive islet cells formed from mouse ES cells express c-peptide, which is a specific marker of insulin production, but the original mouse ES cells do not express c-peptide. FIG.
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ解析は実施例２と同様の方法で行い、抗ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ抗体（ミリポア社製）およびＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ−ウシＩｇＧ抗体を使用し、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍにて発光処理を行い、イメージアナライザー（Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＬＡＳ４０００、ＧＥヘルスケア社製）にて検出を行った。解析結果では、マウスＥＳ細胞から奇形腫を介して形成され、ＦＡＣＳにて分離したＲＦＰ陽性膵島細胞のｃ−ｐｅｐｔｉｄｅの発現像２１が見られた。 Western blot analysis was performed in the same manner as in Example 2, using an anti-c-peptide antibody (Millipore) and an HRP-conjugated anti-mouse IgG-bovine IgG antibody, and luminescence treatment was carried out using ECL Plus Western blotting detection system. Detection was performed with an image analyzer (Image Quant LAS4000, manufactured by GE Healthcare). As a result of the analysis, an expression image 21 of c-peptide of RFP-positive islet cells formed from mouse ES cells via teratoma and separated by FACS was observed.
１ 培養器中で培養された多能性幹細胞
２ 免疫不全マウス
３ 多能性幹細胞を移植された免疫不全マウス
４ 免疫不全マウスの体内で形成された奇形種
５ 奇形腫から分離された，成熟した目的の分化細胞
６ 未分化のマウスｉＰＳ細胞
1 pluripotent stem cells cultured in an incubator 2 immunodeficient mice 3 immunodeficient mice transplanted with pluripotent stem cells 4 teratomas formed in the body of immunodeficient mice 5 matured isolated from teratomas Target differentiated cells 6 Undifferentiated mouse iPS cells
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