JP5882064B2 - 安定化された逆転写酵素融合タンパク質 - Google Patents
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Description
この出願は、2009年3月4日に出願された米国仮特許出願第61/157,332号(これは、参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。
この研究は、Department of Health and Human Services, National Institutes of Healthからの助成金番号GM37949−22によって少なくとも部分的に支援された。米国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
RT−PCRと省略される逆転写ポリメラーゼ連鎖反応は、RNAを増幅するための周知の手法である。RT−PCRでは、RNA鎖を相補DNA(cDNA)に逆転写し、次いでそれを、ポリメラーゼ連鎖反応においてDNAポリメラーゼを用いて増幅する。このプロセスの第1工程では、DNAプライマーとともにデオキシリボヌクレオチドホスフェートおよび逆転写酵素を用いてRNA鋳型からcDNAを生成する。
1つの局面において、本発明は、安定化タンパク質(stabilizer protein)に接続された耐熱性逆転写酵素を含む安定化された(stabilized)逆転写酵素(RT)融合タンパク質を提供する。安定化された逆転写酵素融合タンパク質の1つの実施形態において、耐熱性逆転写酵素は、細菌の逆転写酵素である。さらなる実施形態において、細菌の逆転写酵素は、グループIIイントロン由来逆転写酵素である。細菌の耐熱性逆転写酵素の例としては、Thermosynechococcus elongatus逆転写酵素およびGeobacillus stearothermophilus逆転写酵素が挙げられる。別の実施形態において、耐熱性逆転写酵素は、高い忠実度のcDNA合成を示す。なおも別の実施形態において、耐熱性逆転写酵素は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号5からなる群より選択される配列と実質的に類似のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む。
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中の本発明の説明において使用される用語は、特定の実施形態だけを記載するためのものであって、本発明を限定することを意図していない。本明細書中で述べられるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参考として援用される。
本発明の説明および添付の請求項において使用されるとき、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が別途明らかに示さない限り、複数形も同様に含むと意図される。さらに、終点による数値の範囲の詳述は、その範囲内に含まれるすべての数を含む(例えば、1〜5は、1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5などを含む)。
本発明は、安定化タンパク質に接続された耐熱性逆転写酵素を含む安定化された逆転写酵素融合タンパク質を提供する。多くの実施形態において、耐熱性逆転写酵素は、リンカーペプチドを介して安定化タンパク質に接続される。しかしながら、耐熱性逆転写酵素および安定化タンパク質は、互いに直接融合され得る。融合タンパク質を構成するポリペプチドは、好ましくは、N末端とC末端とが連結される。しかしながら、この逆転写酵素および安定化タンパク質は、いずれかの順序で共に接続され得る。例えば、この2つのペプチド配列は、C末端からN末端に、またはN末端からC末端に接続され得る。いくつかの実施形態において、リンカーペプチドは、逆転写酵素および安定化タンパク質の接続性のC末端とN末端との間に含められる。
本発明は、耐熱性逆転写酵素を含む逆転写酵素融合タンパク質を提供する。用語「逆転写酵素」(すなわち、RNA依存性DNAポリメラーゼ)とは、逆転写酵素活性を有する酵素(すなわち、RNA鋳型からのDNAの合成を触媒する酵素)の群のことを指す。一般に、そのような酵素としては、レトロウイルスの逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素および細菌の逆転写酵素(例えば、グループIIイントロン由来逆転写酵素)ならびにそれらの変異体、バリアントまたは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。細菌の逆転写酵素の例としては、Lactococcus lactis逆転写酵素、Thermosynechococcus elongatus逆転写酵素またはGeobacillus stearothermophilus逆転写酵素が挙げられる。さらなる細菌の逆転写酵素は、多くのクラスの逆転写酵素(すなわち、とりわけ、レトロン(retrons)、グループIIイントロンおよび多様性を生み出すレトロエレメント)を記載している、Simonら、Nucleic Acids Research,36,p.7219−29(2008)およびKojima and Kanehisa,Molecular Biology and Evolution,25,p.1395−04(2008)によって記載されている。逆転写酵素は、主に、RNAをcDNAに転写するために使用されており、次いで、そのcDNAは、さらなる操作のためにベクターにクローニングされ得るか、または様々な増幅方法(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列に基づく増幅(NASBA)、転写媒介性増幅(TMA)、自家持続配列複製(3SR)、多様なプライマー伸長反応、5’RACE、化学修飾の検出、またはRNA鋳型を用いたDNAの合成を必要とする他の手法)において使用され得る。
本発明の安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、安定化タンパク質も含む。安定化タンパク質は、本明細書中で定義されるとき、融合タンパク質の全体的な安定性を高めるように機能する、融合タンパク質の一部を形成するタンパク質である。安定性には、タンパク質がそのコンフォメーションおよび活性を保持する能力が含まれる。さらに、安定化タンパク質は、好ましくは、溶解性向上タンパク質に関して本明細書中でさらに記載されるように、融合タンパク質の溶解性を向上する。これは、発現が不十分であり、通常RNPにおいて堅固に結合されているイントロンRNAの非存在下では不溶性であると見出されているグループIIイントロンRTに関して特に有益であり得る(Velloreら、Appl.Environ.Microbiol.70,7140−7147,2004;Ngら、Gene 393,137−144,2007)。有効な安定化タンパク質は、独立したフォールディングドメインを含むタンパク質、および/またはタンパク質が凝集する性質に影響し得るミスフォールドした長命の中間体に折り畳まれないタンパク質を含む。独立したフォールディングドメインを提供し得るタンパク質は、Janinら、Progress in Biophysics and Molecular Biology,42,p.21−78(1983)によって記載されており、ミスフォールドした長命の中間体に折り畳まれないタンパク質は、Idiculaら、Protein Science,14,p.582−592(2005)によって記載されている。例えば、安定化タンパク質は、50以上のアミノ酸を含むタンパク質であり得る。他の実施形態において、安定化タンパク質は、100以上のアミノ酸を含む、より大きなタンパク質であり得る。本明細書中に提供されるマルトース結合タンパク質およびNusAタンパク質によって例証されるように、安定化タンパク質はまた、約250アミノ酸〜約400アミノ酸のサイズを有し得る。安定化タンパク質は、耐熱性タンパク質でもあり得る。
いくつかの実施形態において、安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、安定化タンパク質と耐熱性逆転写酵素との間に位置するリンカーペプチドも含む。好ましくは、リンカーペプチドは、切断不可能なリンカーペプチドである。「〜の間に位置する」とは、本明細書中の融合タンパク質に関して記載されるとき、リンカーペプチドが、安定化タンパク質および逆転写酵素の各々のNまたはC末端に化学結合(例えば、アミド結合)によって接続されていることを意味する。例えば、リンカーペプチドは、アミド結合を介して、安定化タンパク質のC末端領域および耐熱性逆転写酵素のN末端領域に接続され得る。切断不可能とは、リンカーペプチドが、プロテアーゼによる切断に直ちに感受性でないことを意味する。
本発明は、RNA(例えば、mRNA、rRNA、tRNAおよびmiRNA)からcDNAを調製するための方法も提供し、その方法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)などの他の方法に必要とされる。本明細書中で使用されるとき、用語「RT−PCR」とは、RNA配列の複製および増幅のことを指す。この方法では、逆転写は、例えば、米国特許第5,322,770号に記載されているように、PCRにつなげられる。RT−PCRでは、酵素の逆転写酵素活性に起因して、RNA鋳型をcDNAに変換し、次いで、同じまたは異なる酵素の重合活性を用いて増幅する。
安定化された逆転写酵素融合タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターは、組換え宿主細胞における安定化された逆転写酵素融合タンパク質の高レベル発現のために使用され得る。発現ベクターとしては、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特異的に設計されたプラスミド、またはウイルスが挙げられ得るが、これらに限定されない。適切な細胞型において組換え安定化された逆転写酵素融合配列を発現させるために種々の発現ベクターが使用され得る。例えば、細菌ベクター、哺乳動物ベクター、真菌ベクターおよび昆虫ベクターが、それぞれ細菌、哺乳動物細胞、真菌細胞および昆虫細胞における発現のために使用され得る。
不十分にしか働かないタンパク質の発現および溶解性は、時折、マルトース結合タンパク質(MalE)またはN利用物質A(NusA)のような高度に可溶性のタンパク質の融合によって改善され得る(Nallamsettyら、Protein Expression and Purification 45,175−182,2005)。さらに、MalEタグによってアミロースアフィニティークロマトグラフィを介したタンパク質の精製が容易になる。それゆえ、本発明者らは、グループIIイントロンRTが、MalE融合物として発現され、精製され得るかを試験した。はじめに、MalEタグを、発現ベクターpMal−c2tにおいてTEVプロテアーゼで切断可能なリンカーを介して上記RTのN末端に融合した(図12B)。T.elongatusグループIIイントロンRTのうちのいくつかに対するMalE−RT融合タンパク質は、大腸菌において十分発現し、核酸を除去するポリエチレンイミン(PEI)沈殿の後のアミロースアフィニティークロマトグラフィおよびヘパリンSepharoseクロマトグラフィを含む手順によって精製することができた。さらに、精製の直後にアッセイされた未切断のMalE−RT融合タンパク質は、高い耐熱性RT活性を有した。しかしながら、これらのタンパク質の収率は、Thermosynechococcusタンパク質の場合、<0.2mg/lだった。さらに、MalEタグが、TEVプロテアーゼを用いた切断によって除去されたとき、そのRTは、直ちに不溶性の沈殿物を形成した一方、そのタグが未切断で放置された場合、MalE−RT融合タンパク質は、RT活性を失い続け、氷上で保存されるかまたは50%グリセロール中で急凍されたときであっても数日中に分解された。溶解性タグの存在下で正しく折り畳まれたタンパク質は、そのタグが切断された後も溶解性のままの傾向があるので(Nallamsettyら、Protein Expression and Purification 45,175−182,2005)、後者の知見は、驚くべきものだった。付着されたMalEタグを有するときは活性であるが有しないときは活性でなかったグループIIイントロンRTは、例外と思われる。この安定化タンパク質が耐熱性逆転写酵素に付着されたままでなければならないという知見は、安定化タンパク質が、耐熱性逆転写酵素を溶解性かつ活性に維持する際に積極的な役割を果たすことを示唆する。
熱安定性を評価するために、本発明者らは、まず、Thermosynechococcus elongatus由来の融合物MalE−RF−TeI4c、TeI4h*およびTeI4f、ならびにGeobacillus stearothermophilus由来のMalE−RF−GsI1およびGsI2のRT活性を25〜77℃の温度においてアッセイした。これらの最初のアッセイは、鋳型−プライマー基質としてポリ(rA)/オリゴ(dT)42を使用し、高分子量材料への32P−dTTPの重合を定量化することによって行われた。高温でもポリ(rA)鋳型にアニールしたままであるように、比較的長い42ntのdTプライマーを用いた(Tmの計算値=69℃)。N末端MalE−RFタグを有するLtrAタンパク質および有しないLtrAタンパク質を、中温性のRTコントロールとして平行してアッセイした(図11)。LtrAタンパク質は、MalEの剛性融合タグを有しても有しなくても約35℃の至適温度を有したのに対し、他の5つのMalE−RF−RTは、45〜61℃の範囲のより高い至適温度を有した。2つの最も活性かつ耐熱性のRTであるMalE−RF−GsI2およびMalE−RF−TeI4cは、61℃という至適温度を有し、70℃において実質的な活性を保持した(このアッセイは、プライマー−鋳型の塩基対形成の安定性によって制限され得る)。この2つのRTのうち、MalE−RF−TeI4cは、最も高い活性を有し、線形の範囲内に残すために、他のRT(100nM,5分)よりも低いタンパク質濃度(50nM)かつ短い時間(90秒)でアッセイされた。マルトース(10μM〜1mM)を含めること(これは、MalEタグのコンフォメーションに影響し得る)が、RT活性に対してあったとしてもわずかに影響するだけであることが、MalE−RF−TeI4cタンパク質を用いた試験によって示された。
タグおよびリンカーの最適な特性を測定するために、本発明者らは、MalE−RF−TeI4c RTのバリアントを構築した。MalE−RT−TeI4c RT(左のバー)およびバリアントタンパク質(右のバー)を精製し、上に記載したようにポリ(rA)/オリゴ(dT)42を用いてRT活性についてアッセイした(図13A)。MalE−RT−TeI4cは、アラニンに変更された3つの荷電アミノ酸残基を含む改変MalEタグ(MalE(mod))およびRTのN末端に連結された5アラニン残基のリンカーを有する。5アラニン残基リンカーが除去されたかまたは1または2アラニン残基に短縮されたバリアントは、改変MalEタグを野生型MalE(MalE(WT))で置き換えたバリアントのような、実質的なRT活性であるが低下したRT活性を有した(図13A)。MalE(WT)タグの後に、TEVプロテアーゼ切断部位が欠失したpMal−c2tリンカーを有するTeI4cのバリアントもまた、実質的なRT活性であるが低下したRT活性を有した(図13A)。野生型MalEタグがTeI4c RTのC末端に付着されたバリアントは、大腸菌において十分に発現せず、これはおそらく、新生TeI4c RTが、MalΕタグの事前の発現なしでは適切に折り畳むことができないことを反映している。最後に、MalΕの代わりにNusA(N利用物質タンパク質)へのN末端の剛性融合を有するバリアントは、実質的な耐熱性RT活性を有した(図13AおよびB)。
図14は、耐熱性グループIIイントロンRTのうちの2つ(MalΕ−RF−TeI4cおよびMalE−RF−GsI2)を、55℃で活性であると報告されている商業的に入手可能なRTであるSuperScript III(InvitrogenTM)(Potterら、Focus(Invitrogen Newsletter)25.1,19−24,2003)と比較して、インビトロで転写されたRNA鋳型(その3’末端にDNAプライマーがアニールしたもの)を用いた種々の温度におけるcDNA合成のアッセイを示している。一方の鋳型は、AflIIIで消化されたpBS KS(+)から合成された531ntインビトロ転写物(32P標識された37ntのDNAプライマーがアニールしたもの)であり(図14A〜C)、他方は、32P標識された44ntのDNAプライマーを有する1.2kb kanR RNA(配列番号21;図15に示されるもの)だった(図14D〜E)。この反応物を、示されている温度で30分間インキュベートし、生成物を変性6%ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって解析した。各パネルにおいて、上および下のオートラジオグラムは、それぞれ全長産物および伸長されていないかまたは部分的に伸長されたプライマーを含むゲルの一部を示しており、棒グラフは、全長cDNAまで伸長したプライマーのパーセンテージを示している。
ゲル解析に加えて、本発明者らは、qRT−PCRを使用して、1.2kb RNA鋳型を用い、MalE−RF−TeI4cおよびSuperScript III RTによって合成されたcDNAの量を比較した。本発明者らは、まず、50〜75℃の温度において生成された全長cDNAの量を比較した(図16)。qPCR用のcDNAは、鋳型として5×108コピーのkanR RNA、200nM MalE−RT−TeI4cまたは200UのSuperScript III RTを含む反応物中で、6つの異なる温度において30分間合成された。SuperScript IIIを用いた反応は、製造者の仕様書に従って行った。dNTPを除くすべての成分を含む反応混合物を、所望の温度において2分間プレインキュベートし、dNTPを加えることによって開始した。30分後、その反応を、ドライアイス上で直ちに凍結することによって終結した。各cDNA合成の5μlを、TaqMan(登録商標)Gene Expression混合物、ならびにカナマイシンRNAのnt188−257および562−634に位置する2つの順方向、逆方向および二重標識のプライマープローブ混合物を含むqPCR反応に使用した。そのRNAの5’末端に最も近いプライマーセット(nt188−257)を用いたとき、MalE−RF−TeI4c RTに対するサイクル閾値(CT)値は、試験されたすべての温度においてSuperScript III RTに対するものよりも著しく低かった(図16)ことから、MalE−RF−TeI4cが、RNA鋳型の5’末端付近まで伸長したcDNAをより多く合成したことが示唆される。特に、合成されたcDNAの量の差は、SuperScript IIIの活性が急速に低下する55〜65℃の温度において最も著明だった。
TeI4h*およびTeI4c RT(すなわち、天然のグループIIイントロンRTであって、安定化されたRT融合タンパク質ではない)の固有の忠実度を、大腸菌プラスミドアッセイにおいてレトロホーミングを起こしたイントロンの配列を決定することによって、まず評価した(表2)。37および48℃におけるTeI4h*−ΔORFイントロンRNAのレトロホーミングを促進するTeI4h*RNAに対する最大エラー頻度は、それぞれ1.6×10−5および4.1×10−6だった。TeI4c RTは、1つのグループIIイントロン(TeI3c)が別のもの(TeI4c)に挿入され、両方のイントロンを効率的に動けるようにし得る配置である、「ツイントロン(twintron)」の外側のイントロンによってコードされる。48℃におけるTeI3cまたはTeI4cのレトロホーミングを促進するTeI4c RTに対する最大エラー頻度は、1.1×10−5および2.2×10−5だった。これらのエラー頻度は、37℃において約10−5という、Ll.LtrBイントロンのレトロホーミングを促進するLl.LtrBイントロンRT(LtrA)に対して以前に推定されたものに匹敵する(Conlanら、Nucl.Acids Res.33,5262−5270,2005)。
pMalE−TeI4c、pMalE−TeI4f、pMalE−TeI4h*は、tacプロモーターの後ろにクローニングされた、融合されるN末端MalEタグを有する、示される可動性のグループIIイントロンのRT ORFを、発現ベクターpMal−c2t内に含む。後者は、pMal−c2x(New England Biolabs,Ipswich MA)の誘導体であり、MalEと発現されるタンパク質との間のXa因子プロテアーゼ切断部位が、TEVプロテアーゼ切断部位によって置き換えられたものである(Kristellyら、Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.59,1859−1862,2003)。TeI4h*RTは、RT−5におけるYAGDモチーフがYADDに変更されている、天然TeI4h RTの誘導体である。pET11(TeI4f)、pUC19(TeI4c)またはpACD2X(TeI4h*)にクローニングされたT.elongatusのBP1株由来のグループIIイントロンを含む組換えプラスミドが、以前に報告されている。制限酵素認識部位を追加するプライマーを用いてRT ORFをPCR増幅し、次いで、そのPCR産物をpMal−c2tの対応する部位(TeI4c RT,EcoRIおよびPstI部位;TeI4f RT,BamHI部位;TeI4h*RT,BamHIおよびPstI部位)にクローニングすることによって、これらの最初の構築物からpMalE−RTプラスミドを得た。Accuprimeポリメラーゼ(Invitrogen,Makarovaら、BioTechniques 29,970−972,2000)を用いるQuikChange PCR法によって、TEVプロテアーゼによって切断可能なリンカー(TVDEALKDAQTNS3N10LENLYFQG;配列番号19)を剛性リンカー(TVDAALAAAQTAAAAA;配列番号20)で置き換えることによってpMalE−RF−タンパク質(例えば、pMalE−RF−TeI4c)と表示される組換えプラスミドを、対応するpMalE−RTプラスミドから得た。
pMalE−RTまたはpMalE−RF−RT構築物の発現の場合は、大腸菌Rosetta2/pRARE(Novagen,EMD Biosciences,Gibbstown NJ)またはScarabXpress/pRARE T7lac(Scarabgenomics,Madison WI)を、その発現プラスミドで形質転換し、TBまたはLB培地中で中対数期(O.D.600=0.8)まで37℃で生育した。イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG;最終1mM)を中対数期の細胞に加えることによって(pMalE−RF−TeI4c、TeI4f、TeI4h*、GsI1およびGsI2)、または自己誘導培地(0.2%ラクトース、0.05%グルコース、0.5%グリセロール、24mM(NH4)2SO4、50mM KH2PO4、50mM Na2HPO4を含むLB)中で細胞を生育することによって(pMalE−LtrAおよびpMalE−RF−LtrA)、発現を誘導した。いずれの場合も、誘導は、18〜25℃において約24時間であり、その後、細胞を遠心分離によってペレットにし、緩衝液A(20mM Tris−HCl,pH7.5、0.5M KClまたはNaCl、1mM EDTA、1mMジチオトレイトール(DTT))に再懸濁し、−80℃で凍結した。
種々の温度におけるRT活性を、鋳型−プライマーとしてポリ(rA)/オリゴ(dT)42を用いて32P−dTTPの組み込みを定量化することによってアッセイした。RT(50nMのMalE−RF−TeI4c RTまたは100nMの他のすべてのRT)を、種々の温度(25〜77℃の範囲)において1×RT緩衝液(75mM KCl、10mM MgCl2、20mM Tris−HCl,pH7.5および1mM DTT)中で100nMポリ(rA)/オリゴ(dT)42とともにプレインキュベートし、5μCi[α−32P]−dTTP(3,000Ci/mmol;Perkin Elmer,Waltham MA)を加えることによって、反応を開始した。その反応物を線形の範囲内の時間にわたってインキュベートし、250mMの最終濃度になるようにEDTAを加えることによって反応を停止した。反応産物をWhatman DE81クロマトグラフィペーパー(10×7.5cmシート;GE Healthcare)上にスポットし、0.3M NaClおよび0.03Mクエン酸ナトリウムで3回洗浄し、PhosphorImager(Typhoon Trio Variable Mode Imager;GE Healthcare)でスキャンすることにより、結合した放射能を定量化した。
qPCR解析用のcDNAを、1×RT緩衝液(75mM KCl、10mM MgCl2、20mM Tris−HCl,pH7.5)、1mM DTT、5×108コピーのkanR RNA、200nM MalE−RF−TeI4c RTおよび1mM dNTPを含む20μl反応物中で30分間、個別の実験について指定された温度において生成した。SuperScript III(Invitrogen)を用いた類似反応を、製造者の仕様書に従って行った。反応物を種々の温度において2分間インキュベートし、dNTPを加えることによって反応を開始した。30分間インキュベートした後、その反応物をドライアイス上で直ちに凍結することによって反応を停止した。qPCRに対して5μlのcDNA反応物を使用した。
P078カナマイシンRT−1107R 5’−GGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAAC−3’;配列番号29(Tm=80℃) 。
順方向−−P029kan−188F:5’−GGGTATAAATGGGCTCGCG−3’;配列番号30 。
5’GGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCG−3’;配列番号33 。
順方向−−P001kan−562F:5’−CGCTCAGGCGCAATCAC−3’;配列番号34 。
5’CGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGG−3’;配列番号37 。
抗生物質が以下の濃度:アンピシリン,100μg/ml;クロラムフェニコール,25μg/ml;テトラサイクリン,25μg/mlで加えられたLB培地において生育された大腸菌HMS174(DE3)(NovagenTM)において、レトロホーミングアッセイを行った。イントロンドナープラスミドであるpACD2Xの誘導体(San Filippoら、Journal of Molecular Biology,324,933−951,2002)は、capRマーカーを有し、T7lacプロモーターを使用することにより、両脇に短い5’ エキソンおよび3’エキソン(それぞれE1およびE2)を伴うΔORFイントロン(I−ΔORF)ならびにDIV内のT7プロモーター、その後に続くRT ORF(これはE2の下流に存在する)を発現する。レシピエントプラスミドであるpBRR−tetの誘導体(Guoら、Science 289,452−457,2000;Karbergら、Nature Biotech.19,1162−1167,2001)は、ampRマーカーを有し、プロモーターを有しないtetR遺伝子の上流にクローニングされたイントロンに対する標的部位(ライゲーションされたE1−E2配列)を含む。後者は、T7プロモーターを有するイントロンの挿入によって活性化され、それにより、TetR+AmpRコロニーに対する選択が可能となる。これらのアッセイの場合、細胞を、CapRドナープラスミドおよびAmpRレシピエントプラスミドで同時形質転換し、クロラムフェニコールおよびアンピシリンを含む5mlのLB培地に接種し、振盪しながら(200rpm)37℃で一晩生育した。少量(50μl)の一晩培養物を、同じ抗生物質を含む5mlの新鮮LB培地に接種し、上記のとおり1時間生育した。次いで、その細胞を、個別の実験について表1のレジェンドに明記された条件下においてIPTGで1時間誘導した。次いで、その培養物を氷上に置き、氷冷LBで希釈し、アンピシリンまたはアンピシリン+テトラサイクリンを含むLB寒天上に種々の希釈でプレーティングした。そのプレートを37℃で一晩インキュベートした後、(TetR+AmpR)/AmpRコロニーという比として可動性効率を計算した。
(項目1) 安定化タンパク質に接続された耐熱性逆転写酵素を含む、安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
(項目2) 上記耐熱性逆転写酵素が、細菌の逆転写酵素を含む、項目1に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
(項目3) 上記細菌の逆転写酵素が、グループIIイントロン由来逆転写酵素を含む、項目2に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
(項目4) 上記細菌の逆転写酵素が、Thermosynechococcus elongatus逆転写酵素またはGeobacillus stearothermophilus逆転写酵素である、項目3に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
(項目5) 上記耐熱性逆転写酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号5からなる群より選択される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む、項目1に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
(項目6) 上記安定化タンパク質が、親和性タンパク質または溶解性向上タンパク質を含む、項目1に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
(項目7) 上記安定化タンパク質が、マルトース結合タンパク質またはN利用物質Aタンパク質を含む、項目6に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
(項目8) 上記安定化タンパク質が、荷電アミノ酸を無荷電アミノ酸と置き換えることによって改変されている、項目6に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
(項目9) 上記耐熱性逆転写酵素が、リンカーペプチドによって上記安定化タンパク質に接続されている、項目1に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
(項目10) 上記リンカーペプチドが、切断不可能なリンカーペプチドである、項目9に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
(項目11) 上記切断不可能なリンカーペプチドが、剛性リンカーペプチドである、項目10に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
(項目12) 上記リンカーペプチドが、1アミノ酸から20アミノ酸からなる、項目10に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
(項目13) 上記リンカーペプチドが、1アミノ酸から5アミノ酸からなる、項目10に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
(項目14) 上記リンカーペプチドが、3アミノ酸から5アミノ酸からなる、項目10に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
(項目15) 上記剛性リンカーペプチドが、配列番号12からなる、項目11に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
(項目16) 上記融合タンパク質が、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9または配列番号10からなる群より選択される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含むアミノ酸配列を有する、項目1に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
(項目17) 上記安定化された逆転写酵素融合タンパク質が、約45°から約65℃の温度において2.0×10−5以下のエラー頻度で逆転写を行うことができる、項目1に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
(項目18) RNA分子からcDNAを調製するための方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)プライマーヌクレオチド配列を該RNA分子に加える工程
(b)1つ以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸またはジデオキシリボヌクレオシド三リン酸、および安定化タンパク質に接続された耐熱性逆転写酵素を含む安定化された逆転写酵素融合タンパク質の存在下において、該RNA分子の全部または一部に相補的なcDNA分子を合成するのに十分な条件下で該RNA分子をインキュベートする工程
を包含する、方法。
(項目19) 上記耐熱性逆転写酵素が、切断不可能なリンカーペプチドによって上記安定化タンパク質に接続されている、項目18に記載の方法。
(項目20) 上記RNAが実質的に減少した量の安定な妨害性の二次構造または三次構造を有する温度範囲内で、逆転写が行われる、項目18に記載の方法。
(項目21) 上記耐熱性逆転写酵素が、グループIIイントロン由来逆転写酵素である、項目18に記載の方法。
(項目22) 上記耐熱性逆転写酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号5からなる群より選択される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含み、上記切断不可能なリンカーが、1アミノ酸から20アミノ酸からなり、そして上記安定化タンパク質が、親和性タンパク質または溶解性向上タンパク質を含む、項目19に記載の方法。
(項目23) 上記逆転写が、約45℃から約65℃の温度において2.0×10−5以下のエラー頻度で行われる、項目18に記載の方法。
(項目24) 配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9または配列番号10からなる群より選択される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸を含む、安定化された逆転写酵素融合タンパク質を生成するためのDNA発現ベクター。
(項目25) 安定化された逆転写酵素融合タンパク質を生成する方法であって、該方法は、以下の工程
(a)項目24に記載のDNA発現ベクターを含む宿主細胞を培養する工程;
(b)該DNA発現ベクターによってコードされる該安定化された逆転写酵素融合タンパク質を発現させる工程;および
(c)該安定化された逆転写酵素融合タンパク質を該宿主細胞から単離する工程
を包含する、方法。
Claims (19)
- プロテアーゼによって切断可能でないリンカーペプチドによって、安定化タンパク質のC末端に接続されたグループIIイントロン由来逆転写酵素を含む、安定化された逆転写酵素融合タンパク質であって、該グループIIイントロン由来逆転写酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号5からなる群より選択される配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含み、該安定化タンパク質が、溶解性向上タンパク質を含む、安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
- 前記安定化タンパク質が、マルトース結合タンパク質またはN利用物質Aタンパク質を含む、請求項1に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
- 前記安定化タンパク質が、荷電アミノ酸を無荷電アミノ酸と置き換えることによって改変されている、請求項1に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
- 前記リンカーペプチドが、剛性リンカーペプチドである、請求項1に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
- 前記リンカーペプチドが、1アミノ酸から20アミノ酸からなる、請求項1に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
- 前記リンカーペプチドが、1アミノ酸から5アミノ酸からなる、請求項1に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
- 前記リンカーペプチドが、3アミノ酸から5アミノ酸からなる、請求項1に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
- 前記リンカーペプチドが、配列番号12からなる、請求項1に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質が、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9または配列番号10からなる群より選択される配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含むアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
- 前記安定化された逆転写酵素融合タンパク質が、45℃から65℃の温度において2.0×10−5以下のエラー頻度で逆転写を行うことができる、請求項1に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
- RNA分子からcDNAを調製するための方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)プライマーヌクレオチド配列を該RNA分子に加える工程
(b)1つ以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸またはジデオキシリボヌクレオシド三リン酸、およびプロテアーゼによって切断可能でないリンカーペプチドによって、安定化タンパク質のC末端に接続されたグループIIイントロン由来逆転写酵素を含む安定化された逆転写酵素融合タンパク質の存在下において、該RNA分子の全部または一部に相補的なcDNA分子を合成するのに十分な条件下で該RNA分子をインキュベートする工程
を包含し、該グループIIイントロン由来逆転写酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号5からなる群より選択される配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含み、該安定化タンパク質が、溶解性向上タンパク質を含む、方法。 - 前記グループIIイントロン由来逆転写酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号5からなる群より選択される配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、ならびに、1アミノ酸から20アミノ酸からなる前記切断可能でないリンカーペプチドを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記逆転写が、45℃から65℃の温度において2.0×10−5以下のエラー頻度で行われる、請求項11に記載の方法。
- 配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9または配列番号10からなる群より選択される配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸を含む、安定化された逆転写酵素融合タンパク質を生成するためのDNA発現ベクターであって、ここで、該ポリペプチドはプロテアーゼによって切断可能でないリンカーペプチドを含む、DNA発現ベクター。
- 安定化された逆転写酵素融合タンパク質を生成する方法であって、該方法は、以下の工程(a)請求項14に記載のDNA発現ベクターを含む宿主細胞を培養する工程;
(b)該DNA発現ベクターによってコードされる該安定化された逆転写酵素融合タンパク質を発現させる工程;および
(c)該安定化された逆転写酵素融合タンパク質を該宿主細胞から単離する工程
を包含する、方法。 - 前記グループIIイントロン由来逆転写酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号5からなる群より選択される配列と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項1に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質が、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9または配列番号10からなる群より選択される配列と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する
ポリペプチドを含むアミノ酸配列を有する、請求項9に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。 - 前記グループIIイントロン由来逆転写酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号5からなる群より選択される配列と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項12に記載の方法。
- 配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9または配列番号10からなる群より選択される配列と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸を含む、請求項14に記載のDNA発現ベクター。
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