JP5878113B2 - Nucleic acid amplification method and kit for nucleic acid amplification reaction - Google Patents
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Description
本発明は、エマルションを利用した核酸増幅方法、および核酸増幅反応用キットに関する。 The present invention relates to a nucleic acid amplification method using an emulsion and a kit for nucleic acid amplification reaction.
癌細胞には、その癌に特異的な遺伝子変異が存在することが知られている。この癌特異的な遺伝子変異を高感度で検出することができれば、血液検査や細胞診のような低襲侵の検査による癌の早期発見や治療・再発のモニタリングへの応用が可能となる。しかし、遺伝子変異の検出に現在利用されているシーケンス法やPCR法では、感度が、数個から100個の細胞群の中から１個の癌細胞を検出できる程度(感度１〜20％)でしかない。これに対して、血液検査や細胞診に求められる感度は、１万個の細胞群の中から１個の癌細胞を検出できるレベル(感度0.01％)である。それゆえ、癌特異的な遺伝子変異の検出に基づいた血液検査や細胞診は未だ実用化されていない。 It is known that cancer cells have genetic mutations specific to the cancer. If this cancer-specific gene mutation can be detected with high sensitivity, it will be possible to apply it to early detection of cancer and monitoring of treatment / recurrence by low-invasive tests such as blood tests and cytology. However, with the sequencing method and PCR method currently used for detection of gene mutations, the sensitivity is such that one cancer cell can be detected from a group of several to 100 cells (sensitivity 1 to 20%). There is only. On the other hand, the sensitivity required for blood tests and cytodiagnosis is a level (sensitivity 0.01%) at which one cancer cell can be detected from a group of 10,000 cells. Therefore, blood tests and cytodiagnosis based on detection of cancer-specific gene mutations have not yet been put into practical use.
他方で、近年、エマルションを利用した核酸増幅方法が開発されている。この方法では、油中水型エマルションの分散相(水相)を、核酸増幅反応における独立した微小反応場として利用することにより、効率的な核酸増幅が行われる(例えば、特許文献１〜３参照)。また、この方法は、分散相の各コンパートメントに増幅対象の核酸を１分子含むよう条件を設定することで、１分子遺伝子増幅に応用することも可能である。この１分子遺伝子増幅は、所定の核酸の検出を高感度に行うことが可能な技術として注目されている。 On the other hand, in recent years, a nucleic acid amplification method using an emulsion has been developed. In this method, efficient nucleic acid amplification is performed by using the dispersed phase (water phase) of the water-in-oil emulsion as an independent minute reaction field in the nucleic acid amplification reaction (see, for example, Patent Documents 1 to 3). ). This method can also be applied to single molecule gene amplification by setting conditions so that each compartment of the dispersed phase contains one molecule of nucleic acid to be amplified. This single molecule gene amplification is attracting attention as a technique capable of detecting a predetermined nucleic acid with high sensitivity.
上記の核酸増幅方法では、油中水型エマルションを作製するために界面活性剤が用いられている。そのような界面活性剤としては、Tween(商標)80やSpan(商標)80などの非イオン界面活性剤が用いられているが、最近では直鎖状シリコーン系界面活性剤のセチルジメチコンコポリオールがよく用いられている(特許文献１〜３参照)。このような界面活性剤の膜で水相を包み込むことにより、核酸増幅反応において独立した反応場となる微小カプセルが形成される。 In the above nucleic acid amplification method, a surfactant is used to produce a water-in-oil emulsion. As such surfactants, nonionic surfactants such as Tween (trademark) 80 and Span (trademark) 80 are used, but recently, a linear silicone surfactant cetyl dimethicone copolyol has been used. It is often used (see Patent Documents 1 to 3). By encapsulating the aqueous phase with such a surfactant film, microcapsules are formed which become independent reaction fields in the nucleic acid amplification reaction.
しかし、エマルションを利用した核酸増幅方法では、高温処理を伴う反応の間に微小カプセルが破壊されたり、微小カプセル間で融合したりするという問題があった。このように微小カプセルが熱に対して不安定であると、増幅産物を利用した所定の核酸の検出感度に多大な影響を及ぼし得る。 However, the nucleic acid amplification method using an emulsion has a problem that the microcapsules are destroyed or fused between the microcapsules during the reaction involving the high temperature treatment. Thus, if the microcapsule is unstable with respect to heat, it may greatly affect the detection sensitivity of a predetermined nucleic acid using an amplification product.
そこで、本発明者は、熱安定性に優れた微小カプセルを含むエマルションを利用した核酸増幅方法、および核酸増幅反応用キットを提供することを課題とした。そして、本発明者は、エマルションにおいて熱安定性に優れた微小カプセルを形成させることが可能な界面活性剤について鋭意検討した結果、所定のシリコーン系界面活性剤を用いることにより、熱安定性に優れた微小カプセルを含む油中水型エマルションを調製できることを見出して、本発明を完成した。 Then, this inventor made it the subject to provide the nucleic acid amplification method using the emulsion containing the microcapsule excellent in thermal stability, and the kit for nucleic acid amplification reaction. And as a result of earnestly examining the surfactant capable of forming microcapsules excellent in thermal stability in the emulsion, the present inventor has excellent thermal stability by using a predetermined silicone surfactant. The present invention was completed by finding that a water-in-oil emulsion containing microcapsules could be prepared.
すなわち、本発明は、
核酸、該核酸とハイブリダイズするプライマー、および核酸増幅反応用試薬を含む水性組成物を調製する工程と、
上記の水性組成物と、シリコーン系界面活性剤および油を含む油性組成物とを混合することにより、該水性組成物を内包する微小カプセルを含む油中水型エマルションを調製する工程と、
上記の微小カプセル内で核酸増幅反応を行う工程と
を含み、
上記のシリコーン系界面活性剤が、ドデシル鎖およびポリオキシエチレン鎖を有する分岐状または架橋型オルガノポリシロキサンあるいはこれらの混合物である
核酸増幅方法を提供する。
That is, the present invention
Preparing an aqueous composition comprising a nucleic acid, a primer that hybridizes with the nucleic acid, and a reagent for nucleic acid amplification reaction;
Preparing a water-in-oil emulsion containing microcapsules enclosing the aqueous composition by mixing the aqueous composition and an oily composition containing a silicone surfactant and oil;
Performing a nucleic acid amplification reaction in the above microcapsules,
There is provided a nucleic acid amplification method wherein the silicone surfactant is a branched or crosslinked organopolysiloxane having a dodecyl chain and a polyoxyethylene chain, or a mixture thereof.
また、本発明は、油中水型エマルション調製用試薬として、シリコーン系界面活性剤および油を含み、該シリコーン系界面活性剤が、ドデシル鎖およびポリオキシエチレン鎖を有する分岐状または架橋型オルガノポリシロキサンあるいはこれらの混合物である核酸増幅反応用試薬キットを提供する。 In addition, the present invention also includes a silicone surfactant and an oil as a reagent for preparing a water-in-oil emulsion, and the silicone surfactant contains a branched or cross-linked organopolysiloxane having a dodecyl chain and a polyoxyethylene chain. A reagent kit for nucleic acid amplification reaction, which is siloxane or a mixture thereof, is provided.
本発明によれば、エマルション中の微小カプセルは、核酸増幅反応における高温処理にも十分に耐えるので、微小カプセルの破壊および微小カプセル間の融合が防止される。したがって、本発明は、所定の核酸を増幅し、高感度で検出したい場合に好適に用いることができる。 According to the present invention, the microcapsules in the emulsion sufficiently withstand the high-temperature treatment in the nucleic acid amplification reaction, so that the destruction of the microcapsules and the fusion between the microcapsules are prevented. Therefore, the present invention can be suitably used when a predetermined nucleic acid is amplified and detected with high sensitivity.
本発明の核酸増幅方法（以下、単に「方法」ともいう）では、まず、核酸、該核酸とハイブリダイズするプライマー、および核酸増幅反応用試薬を含む水性組成物を調製する。 In the nucleic acid amplification method of the present invention (hereinafter also simply referred to as “method”), first, an aqueous composition containing a nucleic acid, a primer that hybridizes with the nucleic acid, and a reagent for nucleic acid amplification reaction is prepared.
本発明の実施形態において、核酸は、増幅の対象となる鋳型核酸であれば特に限定されず、DNAおよびRNAのいずれであってもよい。また、核酸の由来は特に限定されず、天然由来の核酸であってもよいし、合成核酸であってもよい。例えば、本発明の方法では、ゲノムDNA、mRNA、cDNA、cRNAなども鋳型核酸として用いることができる。核酸の形態は特に限定されず、直鎖状または環状の核酸であってもよいし、また、１本鎖または２本鎖の核酸であってもよい。 In the embodiment of the present invention, the nucleic acid is not particularly limited as long as it is a template nucleic acid to be amplified, and may be either DNA or RNA. The origin of the nucleic acid is not particularly limited, and may be a naturally-derived nucleic acid or a synthetic nucleic acid. For example, in the method of the present invention, genomic DNA, mRNA, cDNA, cRNA and the like can also be used as template nucleic acids. The form of the nucleic acid is not particularly limited, and may be a linear or circular nucleic acid, or a single-stranded or double-stranded nucleic acid.
本発明の実施形態において、核酸は、単一の塩基配列を有する１種類の核酸であってもよいし、種々の塩基配列をそれぞれ有する複数種類の核酸(例えば、cDNAライブラリーなど)であってもよい。 In the embodiment of the present invention, the nucleic acid may be a single type of nucleic acid having a single base sequence, or a plurality of types of nucleic acids (eg, cDNA libraries) each having various base sequences. Also good.
本発明の実施形態において、水性組成物中の核酸の濃度は特に限定されず、核酸増幅反応の条件などに応じて適宜設定できる。１分子の核酸の増幅を行う場合、核酸濃度は、後述するエマルション中の微小カプセル内に１分子の核酸が含まれるような濃度(例えば、１zM〜１pM程度)とすることが望ましい。 In the embodiment of the present invention, the concentration of the nucleic acid in the aqueous composition is not particularly limited and can be appropriately set according to the conditions of the nucleic acid amplification reaction. When a single molecule of nucleic acid is amplified, the nucleic acid concentration is preferably set to a concentration (for example, about 1 zM to 1 pM) such that one molecule of nucleic acid is contained in a microcapsule in an emulsion described later.
本発明の実施形態において、核酸とハイブリダイズするプライマー(以下、単に「プライマー」という)は、核酸の一部の領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、核酸増幅反応に用いることができるオリゴヌクレオチドであれば特に限定されない。ここで、ストリンジェントな条件とは、プライマーと鋳型核酸との間に少なくとも90％以上、好ましくは少なくとも95％以上の配列同一性があるときに、該プライマーが鋳型核酸に特異的にハイブリダイズできる条件である。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHでの所定の塩基配列の熱的融点(thermal melting point：Tm)よりも、約５℃低くなるように選択される。このTmは、(規定されたイオン強度、pHおよび核酸組成の下で)鋳型核酸の塩基配列に相補的なプライマーの50%が平衡してハイブリダイズする温度である。 In an embodiment of the present invention, a primer that hybridizes with a nucleic acid (hereinafter simply referred to as “primer”) is an oligo that can hybridize with a partial region of the nucleic acid under stringent conditions and can be used in a nucleic acid amplification reaction. If it is a nucleotide, it will not specifically limit. Here, the stringent condition is that the primer can specifically hybridize to the template nucleic acid when the sequence identity between the primer and the template nucleic acid is at least 90% or more, preferably at least 95% or more. It is a condition. Generally, stringent conditions are selected to be about 5 ° C. lower than the thermal melting point (Tm) of a given base sequence at a defined ionic strength and pH. This Tm is the temperature at which 50% of the primer complementary to the base sequence of the template nucleic acid equilibrates and hybridizes (under defined ionic strength, pH and nucleic acid composition).
プライマーは、増幅対象の核酸の塩基配列に基づいて適宜設計できる。また、プライマーは、核酸増幅法の種類に応じて設計されることが好ましい。プライマーの長さは、通常５〜50ヌクレオチド、好ましくは10〜40ヌクレオチドである。なお、プライマーは、当該技術において公知の核酸合成方法により製造することができる。 Primers can be appropriately designed based on the base sequence of the nucleic acid to be amplified. The primer is preferably designed according to the type of nucleic acid amplification method. The length of the primer is usually 5 to 50 nucleotides, preferably 10 to 40 nucleotides. The primer can be produced by a nucleic acid synthesis method known in the art.
本発明の実施形態において、プライマーは、公知の標識物質で標識されていてもよい。プライマーの標識は、放射活性同位体または非放射活性物質を用いて行うことができる。放射活性同位体としては、32P、33P、35S、3Hおよび125Iが挙げられる。非放射活性物質としては、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはジゴキシゲニンのようなリガンド、ハプテン、色素、および、化学発光性、生物発光性、蛍光またはリン光性の試薬のような発光性試薬が挙げられる。 In the embodiment of the present invention, the primer may be labeled with a known labeling substance. The labeling of the primer can be performed using a radioactive isotope or a non-radioactive substance. Radioactive isotopes include 32 P, 33 P, 35 S, 3 H and 125 I. Non-radioactive substances include ligands such as biotin, avidin, streptavidin or digoxigenin, haptens, dyes, and luminescent reagents such as chemiluminescent, bioluminescent, fluorescent or phosphorescent reagents. .
本発明の実施形態において、核酸増幅反応用試薬は特に限定されず、採用する核酸増幅反応に応じて適切な試薬を用いればよい。例えば、核酸増幅反応としてPCR法を採用する場合は、試薬としてdNTPおよびDNAポリメラーゼが挙げられ、RT-PCR法を採用する場合は、試薬としてdNTPおよび逆転写酵素が挙げられる。また、核酸増幅反応を良好に進行させるために、緩衝剤および無機塩をさらに添加して、水性組成物のpHおよびイオン強度を調整することが好ましい。緩衝剤としては、例えばTris-HClなどが挙げられる。また、無機塩としては、NaCl、KClなどが挙げられる。なお、当該技術においては、種々の核酸増幅反応に応じた試薬および試薬キットが公知であり、一般に入手可能である。 In the embodiment of the present invention, the reagent for nucleic acid amplification reaction is not particularly limited, and an appropriate reagent may be used depending on the nucleic acid amplification reaction to be employed. For example, when the PCR method is employed as the nucleic acid amplification reaction, the reagents include dNTP and DNA polymerase, and when the RT-PCR method is employed, the reagents include dNTP and reverse transcriptase. In order to proceed the nucleic acid amplification reaction well, it is preferable to further add a buffer and an inorganic salt to adjust the pH and ionic strength of the aqueous composition. Examples of the buffer include Tris-HCl. Moreover, NaCl, KCl, etc. are mentioned as an inorganic salt. In this technique, reagents and reagent kits corresponding to various nucleic acid amplification reactions are known and generally available.
本発明の実施形態においては、増幅反応後の核酸を検出する場合、検出方法に応じた試薬をさらに用いてもよい。そのような検出用試薬としては、例えば、蛍光を発するインターカレーター(例えばSYBR(登録商標)Greenなど)、5'末端および3'末端をそれぞれ蛍光物質およびクエンチャー物質で修飾したプローブ(例えばTaqMan(登録商標)プローブなど)が挙げられる。 In the embodiment of the present invention, when detecting the nucleic acid after the amplification reaction, a reagent corresponding to the detection method may be further used. Examples of such a detection reagent include a fluorescent intercalator (e.g., SYBR (registered trademark) Green), and a probe (e.g., TaqMan (5 Registered trademark) probe).
次いで、本発明の方法では、上記の水性組成物と、シリコーン系界面活性剤および油を含む油性組成物とを混合することにより、該水性組成物を内包する微小カプセルを含む油中水型エマルションを調製する。 Next, in the method of the present invention, a water-in-oil emulsion containing microcapsules enclosing the aqueous composition by mixing the aqueous composition and an oily composition containing a silicone surfactant and oil. To prepare.
本発明の方法では、シリコーン系界面活性剤として、ドデシル鎖およびポリオキシエチレン鎖を有する分岐状または架橋型オルガノポリシロキサンあるいはこれらの混合物を用いる。ドデシル鎖およびポリオキシエチレン鎖を有する分岐状オルガノポリシロキサンは、直鎖状のドデシル鎖およびポリオキシエチレン鎖を分岐鎖として有するシリコーンである。そのようなシリコーンとしては、INCI名(International Nomenclature of Cosmetic Ingredient labeling name)で表してラウリルPEG-9ポリジメチルシロキシエチルジメチコンが特に好ましい。また、ドデシル鎖およびポリオキシエチレン鎖を有する架橋型オルガノポリシロキサンは、直鎖状のドデシル鎖を分岐鎖として有するシリコーン鎖がポリオキシエチレン鎖を介して架橋されたシリコーンである。そのようなシリコーンとしては、INCI名で表して(PEG-15／ラウリルジメチコン)クロスポリマー、(PEG-10／ラウリルジメチコン)クロスポリマーおよび(PEG-15／ラウリルポリジメチルシロキシエチルジメチコン)クロスポリマーが挙げられ、特に(PEG-15／ラウリルポリジメチルシロキシエチルジメチコン)クロスポリマーが好ましい。なお、これらのシリコーン系界面活性剤は信越化学工業株式会社から入手可能である。 In the method of the present invention, a branched or crosslinked organopolysiloxane having a dodecyl chain and a polyoxyethylene chain or a mixture thereof is used as the silicone surfactant. The branched organopolysiloxane having a dodecyl chain and a polyoxyethylene chain is a silicone having a linear dodecyl chain and a polyoxyethylene chain as a branched chain. As such silicone, lauryl PEG-9 polydimethylsiloxyethyl dimethicone represented by INCI name (International Nomenclature of Cosmetic Ingredient labeling name) is particularly preferable. The crosslinked organopolysiloxane having a dodecyl chain and a polyoxyethylene chain is a silicone in which a silicone chain having a linear dodecyl chain as a branched chain is crosslinked via a polyoxyethylene chain. Such silicones include (PEG-15 / lauryl dimethicone) crosspolymer, (PEG-10 / lauryl dimethicone) crosspolymer and (PEG-15 / lauryl polydimethylsiloxyethyl dimethicone) crosspolymer represented by the INCI name. In particular, (PEG-15 / lauryl polydimethylsiloxyethyl dimethicone) crosspolymer is preferred. These silicone surfactants are available from Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.
本発明の実施形態において、油としては、上記のシリコーン系界面活性剤を溶解するが、水には不溶であり、熱に安定な性質を有する油が好ましい。そのような油としては、例えばｎ−ヘキサデカン、ミネラルオイル、炭素数10〜20のオレフィン系炭化水素およびシリコーンオイルなどが挙げられる。 In the embodiment of the present invention, the oil is preferably an oil that dissolves the above-mentioned silicone surfactant but is insoluble in water and has heat-stable properties. Examples of such oils include n-hexadecane, mineral oil, olefinic hydrocarbons having 10 to 20 carbon atoms, and silicone oil.
油性組成物中のシリコーン系界面活性剤の濃度は、水性組成物を内包する微小カプセルを含むエマルションが得られる濃度であれば特に限定されないが、通常１〜３０％(v/v)であり、好ましくは５〜１５％(v/v)である。上記の２種類のシリコーン系界面活性剤の混合物を用いる場合は、それぞれの界面活性剤濃度の値の和が上記の範囲にあればよい。 The concentration of the silicone-based surfactant in the oil-based composition is not particularly limited as long as it is a concentration capable of obtaining an emulsion containing microcapsules enclosing the aqueous composition, but is usually 1 to 30% (v / v), Preferably it is 5 to 15% (v / v). When a mixture of the above two types of silicone surfactants is used, the sum of the respective surfactant concentration values may be in the above range.
本発明の実施形態において、水性組成物と油性組成物との混合比は、体積比で表して通常１：0.1〜100であり、このましくは１：１〜10である。なお、上記の水性組成物と油性組成物との混合方法は、該水性組成物を内包する微小カプセルを含むエマルションが得られる方法であれば特に限定されない。例えば、水性組成物と油性組成物とを１つの容器に入れ、これに物理的処理を施して混合する方法が挙げられる。そのような物理的処理としては、攪拌処理(ボルテックスミキサー、マグネティックスターラーなどを用いる)、ホモジナイズ処理、超音波処理などが挙げられる。あるいは、Ｔ字型、Ｙ字型、十字型などの分岐部を有するマイクロ流路を用いて、水性組成物と油性組成物とを混合してもよい。マイクロ流路を用いる混合方法では、水性組成物と油性組成物とを互いに異なる流路から流して分岐部で両者を合流させることにより、分散相(水性組成物)が連続相(油性組成物)で剪断されて、油中水型エマルションが調製される。図４に、本発明の実施形態で用いられる十字型分岐部を有するマイクロ流路を示す。図４のマイクロ流路では、油性組成物を左右の流路から流し、水性組成物を上の流路から流すことにより、水性組成物が油性組成物で剪断されることで、油中水型エマルションを調製することができる。 In the embodiment of the present invention, the mixing ratio of the aqueous composition and the oily composition is usually 1: 0.1 to 100, preferably 1: 1 to 10 in volume ratio. In addition, the mixing method of said aqueous composition and oil-based composition will not be specifically limited if it is a method with which the emulsion containing the microcapsule which includes this aqueous composition is obtained. For example, there is a method in which an aqueous composition and an oily composition are put in one container and subjected to physical treatment and mixed. Examples of such physical treatment include stirring treatment (using a vortex mixer, magnetic stirrer, etc.), homogenizing treatment, ultrasonic treatment, and the like. Or you may mix an aqueous composition and an oil-based composition using the micro flow path which has branch parts, such as T shape, Y shape, and a cross shape. In the mixing method using a micro flow channel, the dispersed phase (aqueous composition) is a continuous phase (oil composition) by flowing the aqueous composition and the oil composition from different flow paths and joining both at a branch part. To prepare a water-in-oil emulsion. FIG. 4 shows a microchannel having a cross-shaped branch used in the embodiment of the present invention. In the micro flow path of FIG. 4, the oil-based composition is flowed from the left and right flow paths, and the aqueous composition is flowed from the upper flow path, whereby the aqueous composition is sheared by the oil-based composition. An emulsion can be prepared.
なお、水性組成物と油性組成物との混合物は、その全体がエマルションとなっていてもよいし、微小カプセルを含むエマルションの層と、残存した油性組成物の層との二層に分離していてもよい。また、微小カプセルは、エマルション中に均一に分散していてもよいし、沈殿していてもよい。 The mixture of the aqueous composition and the oily composition may be an emulsion as a whole, or is separated into two layers: an emulsion layer containing microcapsules and a remaining oily composition layer. May be. The microcapsules may be uniformly dispersed in the emulsion or may be precipitated.
上記の混合により、水性組成物を内包する微小カプセルを含む油中水型エマルションが得られる。得られた微小カプセルは、水性組成物の微小粒子が上記のシリコーン界面活性剤の膜で覆われた構造をしている。微小カプセルは該シリコーン界面活性剤の膜によって熱に安定となるので、核酸増幅反応中に微小カプセル間で融合することが防止される。したがって、エマルション中の微小カプセルのそれぞれは、核酸増幅反応において、独立した微小反応場を提供する。なお、該微小カプセルのサイズは特に限定されず、核酸増幅の目的に応じて適宜設定できるが、直径で通常１〜500μmであり、好ましくは10〜200μmである。 By the above mixing, a water-in-oil emulsion containing microcapsules enclosing the aqueous composition is obtained. The obtained microcapsules have a structure in which microparticles of the aqueous composition are covered with the above-mentioned silicone surfactant film. Since the microcapsules are thermally stabilized by the silicone surfactant film, fusion between the microcapsules is prevented during the nucleic acid amplification reaction. Thus, each of the microcapsules in the emulsion provides an independent microreaction field in the nucleic acid amplification reaction. The size of the microcapsules is not particularly limited and can be appropriately set according to the purpose of nucleic acid amplification. However, the diameter is usually 1 to 500 μm, preferably 10 to 200 μm.
本発明の実施形態においては、当該技術において公知の方法により、上記の微小カプセルを硬化する工程を任意に行ってもよい。しかし、本発明の方法で得られる微小カプセルは、通常の核酸増幅反応の加熱条件に十分耐えるので、微小カプセルを硬化する工程は通常は必要ではない。 In the embodiment of the present invention, the step of curing the microcapsules may be optionally performed by a method known in the art. However, since the microcapsules obtained by the method of the present invention sufficiently withstand the heating conditions of a normal nucleic acid amplification reaction, a step of curing the microcapsules is usually not necessary.
そして、本発明の方法では、上記で得られたエマルションに含まれる微小カプセル内で核酸増幅反応を行う。本発明の実施形態において、核酸増幅反応自体は、上記の微小カプセル内を反応場とすること以外は、当該技術において公知の核酸増幅方法と特に異なるところはない。したがって、採用する核酸増幅反応の種類に応じて、必要な器具や装置を用いて反応を行えばよい。 In the method of the present invention, the nucleic acid amplification reaction is performed in the microcapsules contained in the emulsion obtained above. In the embodiment of the present invention, the nucleic acid amplification reaction itself is not particularly different from the nucleic acid amplification methods known in the art except that the inside of the microcapsules is used as a reaction field. Therefore, the reaction may be performed using necessary instruments and devices according to the type of nucleic acid amplification reaction to be employed.
本発明の実施形態において、核酸増幅反応のサンプルとして、上記で得られたエマルションの一部または全部を用いることができる。また、微小カプセルがエマルション中で沈殿している場合は、微小カプセルが堆積している層を回収し、これをサンプルとして用いてもよい。 In the embodiment of the present invention, a part or all of the emulsion obtained above can be used as a sample for nucleic acid amplification reaction. When the microcapsules are precipitated in the emulsion, the layer on which the microcapsules are deposited may be collected and used as a sample.
本発明の実施形態において、核酸増幅反応の種類は特に限定されず、目的に応じて公知の核酸増幅法から適宜選択することができる。そのような核酸増幅法としては、例えばPCR法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、リアルタイムRT-PCR法、NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)法、LCR(Ligase Chain Reaction)法、3SR(Self-sustained Sequence Reaction)法、SDA(Standard Displacement Amplification)法、TMA(Transcription Mediated Amplification)法、RCA(Rolling Circle Amplification)法などが挙げられる。なお、反応条件は、核酸増幅法の種類、プライマーの塩基配列などによって異なるが、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第２版) Sambrook, J.ら、Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1989))などに記載の方法を参照して適宜設定することができる。 In the embodiment of the present invention, the type of nucleic acid amplification reaction is not particularly limited, and can be appropriately selected from known nucleic acid amplification methods according to the purpose. Examples of such nucleic acid amplification methods include PCR, RT-PCR, real-time PCR, real-time RT-PCR, NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), LCR (Ligase Chain Reaction), 3SR (Self -Sustained Sequence Reaction (SDA) method, SDA (Standard Displacement Amplification) method, TMA (Transcription Mediated Amplification) method, RCA (Rolling Circle Amplification) method and the like. The reaction conditions vary depending on the type of nucleic acid amplification method, the base sequence of the primer, and the like. For example, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition) Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) )) Etc., and can be set as appropriate.
本発明の方法は、任意に、増幅産物を検出する工程をさらに含んでいてもよい。検出方法は特に限定されず、核酸増幅の目的に応じて公知の方法から適宜選択することができる。本発明の方法では、蛍光標識プローブを利用した核酸増幅反応後の微小カプセルを観察および／または撮影することにより、蛍光を発する微小カプセルを、所望の核酸増幅がなされた微小カプセルとして計数する方法が好適に用いられる。 The method of the present invention may optionally further comprise a step of detecting the amplification product. The detection method is not particularly limited, and can be appropriately selected from known methods according to the purpose of nucleic acid amplification. In the method of the present invention, there is a method in which microcapsules emitting fluorescence are counted as microcapsules that have undergone desired nucleic acid amplification by observing and / or photographing microcapsules after a nucleic acid amplification reaction using a fluorescently labeled probe. Preferably used.
上記のとおり、本発明の方法において得られる微小カプセルは、優れた熱安定性により、核酸増幅反応後もその形状を維持するので、本発明の方法は、例えばKRAS遺伝子の変異の検出のような非常に高い検出感度(感度0.01％程度)が要求される検査や実験に好適に用いることができる。 As described above, the microcapsules obtained in the method of the present invention maintain their shape even after the nucleic acid amplification reaction due to excellent thermal stability, so that the method of the present invention can be used, for example, to detect mutations in the KRAS gene. It can be suitably used for inspections and experiments that require extremely high detection sensitivity (sensitivity of about 0.01%).
本発明の範囲には、核酸増幅反応用試薬キット(以下、「試薬キット」ともいう)も含まれる。本発明の試薬キットは、油中水型エマルション調製用試薬として、ドデシル鎖およびポリオキシエチレン鎖を有する分岐状または架橋型オルガノポリシロキサンあるいはこれらの混合物であるシリコーン系界面活性剤、および油を含む。なお、シリコーン系界面活性剤および油の具体的な種類、エマルションの調製方法、利用可能な核酸増幅反応の種類などについては、これまでに述べたことと同様である。また、本発明の試薬キットは、上記の核酸増幅反応用試薬、緩衝剤、無機塩、検出用試薬などをさらに含んでいてもよい。 The scope of the present invention includes a reagent kit for nucleic acid amplification reaction (hereinafter also referred to as “reagent kit”). The reagent kit of the present invention contains, as a reagent for preparing a water-in-oil emulsion, a silicone-based surfactant that is a branched or crosslinked organopolysiloxane having a dodecyl chain and a polyoxyethylene chain, or a mixture thereof, and oil. . The specific types of silicone surfactant and oil, the preparation method of the emulsion, the types of available nucleic acid amplification reactions, and the like are the same as described above. The reagent kit of the present invention may further contain the above-mentioned nucleic acid amplification reaction reagent, buffer, inorganic salt, detection reagent and the like.
本発明の実施形態において、シリコーン系界面活性剤および油は、それぞれ別個の試薬として含まれていてもよいし、両者を混合した油性組成物として含まれていてもよい。なお、シリコーン系界面活性剤および油を混合する場合の比率は、これまでに述べたとおりである。 In the embodiment of the present invention, the silicone-based surfactant and the oil may be included as separate reagents, respectively, or may be included as an oily composition in which both are mixed. The ratio in the case of mixing the silicone surfactant and oil is as described above.
以下に、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples, but the present invention is not limited to these examples.
試験例１ 微小カプセルの熱安定性の検討(１)
（１）実験準備
本試験例で使用した試薬は次のとおりである。シリコーン系界面活性剤として、KSG-320Z(INCI名：(PEG-15／ラウリルポリジメチルシロキシエチルジメチコン)クロスポリマー；信越化学工業株式会社)を用いた。対照として、直鎖型シリコーン系界面活性剤のAbil(登録商標)WE09(INCI名：セチルジメチコンコポリオール；Evonik社)を用いた。界面活性剤を溶解させる油としてｎ−ヘキサデカン(和光純薬工業株式会社)を用いた。水相として蒸留水を用いた。
Test Example 1 Examination of thermal stability of microcapsules (1)
(1) Preparation for experiment The reagents used in this test example are as follows. KSG-320Z (INCI name: (PEG-15 / lauryl polydimethylsiloxyethyl dimethicone) crosspolymer; Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) was used as the silicone surfactant. As a control, a linear silicone surfactant Abil (registered trademark) WE09 (INCI name: cetyl dimethicone copolyol; Evonik) was used. N-hexadecane (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as the oil for dissolving the surfactant. Distilled water was used as the aqueous phase.
本試験例で使用した機器は次のとおりである。エマルションの調製には、ボルテックスミキサーを用いた。加熱機器としてドライブロックバスTHB-1(アズワン株式会社)を使用した。なお、各サンプルの加熱処理は1.5 mLエッペンチューブ内で行っている。微小カプセルの顕微鏡観察用の機器類として、観察用チャンバーにマツナミ沈渣用プレート MUR-300 (３窓タイプ、間隙70μm；松浪ガラス工業株式会社)を用い、顕微鏡として蛍光顕微鏡IX71(オリンパス株式会社)を使用した。微小カプセルの直径は、IX71で撮影した写真に基づいてImage-Pro 6.0J(Media Cybernetics社)により解析した。 The equipment used in this test example is as follows. A vortex mixer was used to prepare the emulsion. A drive lock bath THB-1 (As One Co., Ltd.) was used as a heating device. The heat treatment for each sample is performed in a 1.5 mL Eppendorf tube. As an instrument for microscopic observation of microcapsules, the microscope chamber IX71 (Olympus Co., Ltd.) is used as a microscope, using the MUR-300 (3-window type, gap 70 μm; Matsunami Glass Industrial Co., Ltd.) used. The diameter of the microcapsules was analyzed by Image-Pro 6.0J (Media Cybernetics) based on the photos taken with IX71.
（２）実験手順
（i）微小カプセルを含むエマルションの調製
まず、油性組成物の調製を次のように行なった。ｎ−ヘキサデカンを2.7 mLずつ、２本の15 mLチューブに分注した。そして、それぞれのチューブに界面活性剤WE09およびKSG-320Zを300μLずつ加えて、よく混合した(界面活性剤の終濃度は５%)。得られた油性組成物を１mLずつ２本のエッペンチューブに分注した。続いて、水相の準備を次のように行った。蒸留水１mLをエッペンチューブに取った。蒸留水を100μLずつ、先に分注した油性組成物１mLが入ったエッペンチューブに添加した(水と油性組成物との体積比は１：10)。そして、油性組成物と水とが入ったエッペンチューブをボルテックスミックスで攪拌(max、１秒×３回)して、エマルションを得た。これを室温にて15分以上静置して、微小カプセルがチューブの底に沈降していることを確認した。
(2) Experimental procedure (i) Preparation of emulsion containing microcapsules First, an oily composition was prepared as follows. n-hexadecane was dispensed in two 15 mL tubes, each 2.7 mL. Then, 300 μL of surfactants WE09 and KSG-320Z were added to each tube and mixed well (the final concentration of the surfactant was 5%). 1 mL of the obtained oily composition was dispensed into two Eppendorf tubes. Subsequently, the aqueous phase was prepared as follows. 1 mL of distilled water was taken in an Eppendorf tube. Distilled water was added in an amount of 100 μL to an Eppendorf tube containing 1 mL of the oily composition dispensed previously (volume ratio of water to oily composition was 1:10). Then, an Eppendorf tube containing the oily composition and water was stirred with a vortex mix (max, 1 second × 3 times) to obtain an emulsion. This was allowed to stand at room temperature for 15 minutes or more, and it was confirmed that the microcapsules had settled at the bottom of the tube.
（ii）微小カプセルの直径の測定
まず、加熱前の微小カプセルの直径を次のようにして計測した。チューブの底に溜まった微小カプセルを含む層の一部(20μL)を取り、沈渣用プレートに全量アプライした。これを、蛍光顕微鏡IX71(倍率×40)にて観察および撮影した。Image-Pro 6.0Jを用いて、撮影した写真から微小カプセルの直径を計測した。続いて、エマルションの加熱処理を次のようにして行なった。エッペンチューブに残った微小カプセルをそのままの状態でドライブロックバスにて95℃で２時間加熱した。加熱後、微小カプセルを含む層の一部(20μL)を取り、沈渣用プレートに全量アプライした。これを、蛍光顕微鏡IX71(倍率×40)にて観察および撮影した。Image-Pro 6.0Jを用いて、撮影した写真から微小カプセルの直径を計測した。加熱の前後で計測した直径のデータについて、Excel(登録商標)(Microsoft社)を用いてヒストグラム解析を行った。微小カプセルの熱耐性を、熱処理後の直径の変化に基づいて評価した。
(Ii) Measurement of diameter of microcapsule First, the diameter of the microcapsule before heating was measured as follows. A part (20 μL) of the layer containing the microcapsules accumulated at the bottom of the tube was taken and applied in full to the sediment plate. This was observed and photographed with a fluorescence microscope IX71 (magnification × 40). Using Image-Pro 6.0J, the diameter of the microcapsule was measured from the photographed photo. Subsequently, the heat treatment of the emulsion was performed as follows. The microcapsules remaining in the Eppendorf tube were heated as they were at 95 ° C. for 2 hours in a drive lock bath. After heating, a part (20 μL) of the layer containing the microcapsules was taken and applied in full to the sediment plate. This was observed and photographed with a fluorescence microscope IX71 (magnification × 40). Using Image-Pro 6.0J, the diameter of the microcapsule was measured from the photographed photo. Histogram analysis was performed on the diameter data measured before and after heating using Excel (registered trademark) (Microsoft). The heat resistance of the microcapsules was evaluated based on the change in diameter after heat treatment.
（３）実験結果
図１に、各界面活性剤を用いて作製した微小カプセルの加熱前後での直径変化を示したヒストグラムを示した。図１より、架橋型シリコーン系界面活性剤KSG-320Zを用いて作製した微小カプセルでは、加熱前後でピーク形状にほとんど変化が見られなかった。これに対して、WE09を用いて作製した微小カプセルでは、加熱前後でピークのばらつきが確認できた。すなわち、WE09を用いて作製した微小カプセルは、加熱により直径が大きく推移していた。
したがって、微小カプセルの耐熱性という点においては、KSG-320Zの方がより優れていると判断される。
(3) Experimental results FIG. 1 shows a histogram showing the change in diameter of the microcapsules produced using each surfactant before and after heating. From FIG. 1, in the microcapsule produced using the crosslinkable silicone-based surfactant KSG-320Z, the peak shape hardly changed before and after heating. On the other hand, in the microcapsules produced using WE09, the peak variation was confirmed before and after heating. That is, the diameter of the microcapsules produced using WE09 was greatly changed by heating.
Therefore, it is judged that KSG-320Z is superior in terms of the heat resistance of the microcapsules.
試験例２ 微小カプセルの熱安定性の検討(２)
（１）実験準備
本試験例で使用した試薬は次のとおりである。シリコーン系界面活性剤として、KF-6038(INCI名：ラウリルPEG-9ポリジメチルシロキシエチルジメチコン；信越化学工業株式会社)を用いた。対照として、Abil(登録商標)WE09(Evonik社)を用いた。界面活性剤を溶解させる油としてｎ−ヘキサデカン(和光純薬工業株式会社)を用いた。水相として蒸留水を用いた。
Test Example 2 Examination of thermal stability of microcapsules (2)
(1) Preparation for experiment The reagents used in this test example are as follows. KF-6038 (INCI name: lauryl PEG-9 polydimethylsiloxyethyl dimethicone; Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) was used as a silicone surfactant. As a control, Abil (registered trademark) WE09 (Evonik) was used. N-hexadecane (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as the oil for dissolving the surfactant. Distilled water was used as the aqueous phase.
本試験例で使用した機器は次のとおりである。エマルションの調製には、十字型マイクロ流路(流路の幅および高さ 100μm；フロイドウェア社製)、油相および水相を流路へアプライするためのディスポシリンジ(テルモ株式会社)、シリンジ内の液を流路側へ送るためのシリンジポンプSPE-1(アズワン株式会社)およびNE-1010X(株式会社ニューロサイエンス)、微小カプセルを作製している様子をモニタリングするための金属顕微鏡BM-3400TTR(株式会社WRAYMER)を使用した。加熱機器としてドライブロックバスTHB-1(アズワン株式会社)を使用した。また、微小カプセルの顕微鏡観察用の機器類として、観察用チャンバーにマツナミ沈渣用プレート MUR-300 (３窓タイプ、間隙70μm；松浪ガラス工業株式会社)を用い、観察にはBM-3400TTRを使用した。微小カプセルの直径は、撮影した写真に基づいて、BM-3400TTRに付属している計測モードで計測した。 The equipment used in this test example is as follows. For the preparation of the emulsion, a cross-shaped microchannel (width and height of the channel: 100 μm; manufactured by Floydware), a disposable syringe (Terumo Corporation) for applying the oil phase and the aqueous phase to the channel, and in the syringe Syringe pump SPE-1 (As One Co., Ltd.) and NE-1010X (Neuroscience Co., Ltd.) for feeding the liquid of the liquid to the flow path side, metal microscope BM-3400TTR (stock) for monitoring the production of microcapsules Company WRAYMER). A drive lock bath THB-1 (As One Co., Ltd.) was used as a heating device. In addition, as a device for microscopic observation of microcapsules, a plate MUR-300 (3-window type, gap 70 μm; Matsunami Glass Industry Co., Ltd.) was used for observation chamber, and BM-3400TTR was used for observation. . The diameter of the microcapsule was measured in the measurement mode attached to the BM-3400TTR based on the photograph taken.
（２）実験手順
（i）微小カプセルを含むエマルションの調製
まず、油性組成物(油相)の調製を次のように行なった。ｎ−ヘキサデカンを2.7 mLずつ、２本の15 mLチューブに分注した。そして、それぞれのチューブに界面活性剤WE09およびKF-6038を300μLずつ加えて、よく混合した(界面活性剤の終濃度は５%となった)。得られた油性組成物を３mLプラスティック製シリンジに充填した。続いて、水相の準備を次のように行った。蒸留水１mLをエッペンチューブに取り、１mLディスポシリンジに充填した。そして、十字型マイクロ流路を用いて、微小カプセルを含むエマルションを作製した。十字型マイクロ流路を金属顕微鏡に固定し、油相が入ったシリンジと水相が入ったシリンジとをそれぞれ十字型マイクロ流路にセットした。油相から送液を開始し、流路内に油相が浸入したことを確認した後、水相を送液した。流路出口から油相および微小カプセルが流れていることを、顕微鏡のモニターおよび目視により確認した後、1.5 mLエッペンチューブに微小カプセルを回収した。
(2) Experimental procedure (i) Preparation of emulsion containing microcapsules First, an oily composition (oil phase) was prepared as follows. n-hexadecane was dispensed in two 15 mL tubes, each 2.7 mL. Then, 300 μL of surfactants WE09 and KF-6038 were added to each tube and mixed well (the final concentration of the surfactant was 5%). The obtained oily composition was filled into a 3 mL plastic syringe. Subsequently, the aqueous phase was prepared as follows. 1 mL of distilled water was taken into an Eppendorf tube and filled into a 1 mL disposable syringe. And the emulsion containing a microcapsule was produced using the cross-shaped microchannel. The cross-shaped microchannel was fixed to a metal microscope, and a syringe containing an oil phase and a syringe containing an aqueous phase were set in the cross-shaped microchannel, respectively. Liquid feeding was started from the oil phase, and after confirming that the oil phase had entered the flow path, the aqueous phase was fed. After confirming that the oil phase and the microcapsules were flowing from the outlet of the flow path by monitoring with a microscope and visually, the microcapsules were collected in a 1.5 mL Eppendorf tube.
（ii）微小カプセルの直径の測定
まず、加熱前の微小カプセルの直径を次のようにして計測した。回収した微小カプセルの一部(20μL)を取り、沈渣用プレートに全量アプライした。これを、金属顕微鏡BM-3400TTR (倍率×40)にて観察および撮影した。Image-Pro 6.0Jを用いて、撮影した写真から微小カプセルの直径を計測した。続いて、エマルションの加熱処理を次のようにして行なった。エッペンチューブに残った微小カプセルをそのままの状態でドライブロックバスにて95℃で２時間加熱した。加熱後、微小カプセルを含む層の一部(20μL)を取り、沈渣用プレートに全量アプライした。これを、蛍光顕微鏡IX71(倍率×40)にて観察および撮影した。BM-3400TTRに付属している計測モードで、撮影した写真から微小カプセルの直径を計測した。加熱の前後で計測した直径のデータについて、Excel(登録商標)(Microsoft社)を用いてヒストグラム解析を行った。微小カプセルの熱耐性を、熱処理後の直径の変化に基づいて評価した。
(Ii) Measurement of diameter of microcapsule First, the diameter of the microcapsule before heating was measured as follows. A portion (20 μL) of the collected microcapsules was taken and applied in full to the sediment plate. This was observed and photographed with a metallographic microscope BM-3400TTR (magnification × 40). Using Image-Pro 6.0J, the diameter of the microcapsule was measured from the photographed photo. Subsequently, the heat treatment of the emulsion was performed as follows. The microcapsules remaining in the Eppendorf tube were heated as they were at 95 ° C. for 2 hours in a drive lock bath. After heating, a part (20 μL) of the layer containing the microcapsules was taken and applied in full to the sediment plate. This was observed and photographed with a fluorescence microscope IX71 (magnification × 40). In the measurement mode attached to the BM-3400TTR, the diameter of the microcapsule was measured from the photograph taken. Histogram analysis was performed on the diameter data measured before and after heating using Excel (registered trademark) (Microsoft). The heat resistance of the microcapsules was evaluated based on the change in diameter after heat treatment.
（３）実験結果
図２に、各界面活性剤を用いて作製した微小カプセルの加熱前後での直径変化を示したヒストグラムを示した。図２より、分岐状シリコーン系界面活性剤KF-6038を用いて作製した微小カプセルでは、加熱前後でピーク形状は大きくずれていなかった。これに対して、WE09を用いて作製した微小カプセルでは、加熱前後でピークのばらつきが確認できた。これは、加熱により微小カプセルの形状が維持できず、微小カプセル間で融合もしくは微小カプセルが***しているためと推測される。
したがって、微小カプセルの耐熱性という点においては、KF-6038の方がより優れていると判断される。
(3) Experimental Results FIG. 2 shows a histogram showing the diameter change before and after heating of the microcapsules produced using each surfactant. From FIG. 2, in the microcapsule produced using the branched silicone surfactant KF-6038, the peak shape was not greatly deviated before and after heating. On the other hand, in the microcapsules produced using WE09, the peak variation was confirmed before and after heating. This is presumably because the shape of the microcapsules cannot be maintained by heating, and the microcapsules are fused or divided.
Therefore, KF-6038 is judged to be superior in terms of the heat resistance of the microcapsules.
実施例１ 微小カプセルを含むエマルションを利用したリアルタイムRT-PCR
（１）実験準備
本実施例で使用した試薬は次のとおりである。シリコーン系界面活性剤として、KF-6038(INCI名：ラウリルPEG-9ポリジメチルシロキシエチルジメチコン；信越化学工業株式会社)を用いた。界面活性剤を溶解させる油としてｎ−ヘキサデカン(和光純薬工業株式会社)を用いた。水性組成物として、Bcr-AblのRT-PCR反応液を使用した。核酸増幅反応用試薬として、QuantiFast Probe RT-PCR Kit(QIAGEN社)を用いた。鋳型核酸として、ヒト白血病細胞株K562のtotal RNA (Bcr-Abl遺伝子 5copy／反応液(20μL)を含む)を用いた。プライマーとして、ENF501 (CCGCTGACCATCAAYAAGGA：配列番号１、10μM)およびENR561 (CACTCAGACCCTGAGGCTCAA：配列番号２、10μM)の組み合わせを用いた。また、TaqMan(登録商標)プローブとして、BcrAbl-DQ-Dye-1 (FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGA-DQ：配列番号３、10μM)を用いた。なお、FAMは蛍光色素、DQはダーククエンチャーである。
Example 1 Real-time RT-PCR using an emulsion containing microcapsules
(1) Preparation for experiment The reagents used in this example are as follows. KF-6038 (INCI name: lauryl PEG-9 polydimethylsiloxyethyl dimethicone; Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) was used as a silicone surfactant. N-hexadecane (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as the oil for dissolving the surfactant. As an aqueous composition, an RT-PCR reaction solution of Bcr-Abl was used. As a reagent for nucleic acid amplification reaction, QuantiFast Probe RT-PCR Kit (QIAGEN) was used. As a template nucleic acid, total RNA of human leukemia cell line K562 (containing 5 copies of Bcr-Abl gene / reaction solution (20 μL)) was used. A combination of ENF501 (CCGCTGACCATCAAYAAGGA: SEQ ID NO: 1, 10 μM) and ENR561 (CACTCAGACCCTGAGGCTCAA: SEQ ID NO: 2, 10 μM) was used as a primer. In addition, BcrAbl-DQ-Dye-1 (FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGA-DQ: SEQ ID NO: 3, 10 μM) was used as a TaqMan (registered trademark) probe. FAM is a fluorescent dye and DQ is a dark quencher.
本実施例で使用した機器は次のとおりである。エマルションの調製には、十字型マイクロ流路(流路の幅および高さ 100μm；フロイドウェア社製)、油相および水相を流路へアプライするためのディスポシリンジ(テルモ株式会社)、シリンジ内の液を流路側へ送るためのシリンジポンプSPE-1(アズワン株式会社)およびNE-1010X(株式会社ニューロサイエンス)、微小カプセルを作製している様子をモニタリングするための金属顕微鏡BM-3400TTR(株式会社WRAYMER)を使用した。核酸増幅反応には、リアルタイムRT-PCRシステムABI7500(Applied Biosystems社)および96ウェルプレートを使用した。また、微小カプセルの顕微鏡観察用の機器類として、観察用チャンバーにマツナミ沈渣用プレート MUR-300 (３窓タイプ、間隙70μm；松浪ガラス工業株式会社)を用い、観察には蛍光顕微鏡BZ-9000(株式会社キーエンス)を使用した。なお、蛍光としてFAMを検出した。微小カプセルの解析には、BZ-9000に付属の画像解析ソフトウェアBZ-1を使用した。 The equipment used in this example is as follows. For the preparation of the emulsion, a cross-shaped microchannel (width and height of the channel: 100 μm; manufactured by Floydware), a disposable syringe (Terumo Corporation) for applying the oil phase and the aqueous phase to the channel, and in the syringe Syringe pump SPE-1 (As One Co., Ltd.) and NE-1010X (Neuroscience Co., Ltd.) for feeding the liquid of the liquid to the flow path side, metal microscope BM-3400TTR (stock) for monitoring the production of microcapsules Company WRAYMER). For the nucleic acid amplification reaction, a real-time RT-PCR system ABI7500 (Applied Biosystems) and a 96-well plate were used. In addition, as a device for microscopic observation of microcapsules, the MUR-300 (3 window type, 70 μm gap; Matsunami Glass Industrial Co., Ltd.) plate for pine sediment is used in the observation chamber, and the fluorescence microscope BZ-9000 ( Keyence Corporation) was used. In addition, FAM was detected as fluorescence. For analysis of microcapsules, image analysis software BZ-1 attached to BZ-9000 was used.
（２）実験手順
本実施例では、同一サンプルを用いてN=3で行なった。
（i）微小カプセルを含むエマルションの調製
まず、油性組成物(油相)の調製を次のように行なった。ｎ−ヘキサデカン2.7 mLを15 mLチューブに分注した。そして、チューブに界面活性剤KF-6038を300μL加えて、よく混合した(界面活性剤の終濃度は５%となった)。得られた油性組成物を３mLプラスティック製シリンジに充填した。続いて、水性組成物(水相)の調製を次のように行った。1.5 mLエッペンチューブに、K562細胞のtotal RNA (Bcr-Abl遺伝子 5copy／反応液(20μL)を含む)を５μL、10μM ENF501プライマーおよびENR561プライマーを６μLずつ、10μM TaqManプローブを６μL、およびQuantiFast Probe RT-PCR Kitのマスターミックスを50μL加え、dH2Oで全量を100μLにした。得られた水相を１mLディスポシリンジに充填した。
(2) Experimental procedure In this example, N = 3 was performed using the same sample.
(I) Preparation of emulsion containing microcapsules First, an oily composition (oil phase) was prepared as follows. 2.7 mL of n-hexadecane was dispensed into a 15 mL tube. Then, 300 μL of surfactant KF-6038 was added to the tube and mixed well (the final concentration of the surfactant was 5%). The obtained oily composition was filled into a 3 mL plastic syringe. Subsequently, an aqueous composition (aqueous phase) was prepared as follows. In a 1.5 mL Eppendorf tube, 5 μL of K562 cell total RNA (including 5 copies of Bcr-Abl gene / reaction solution (20 μL)), 6 μL of 10 μM ENF501 primer and ENR561 primer, 6 μL of 10 μM TaqMan probe, and QuantiFast Probe RT- 50 μL of the PCR Kit master mix was added, and the total volume was adjusted to 100 μL with dH 2 O. The obtained aqueous phase was filled into a 1 mL disposable syringe.
十字型マイクロ流路を用いて、微小カプセルを含むエマルションを次のようにして作製した。十字型マイクロ流路を顕微鏡に固定し、油相が入ったシリンジと水相が入ったシリンジとをそれぞれ十字型マイクロ流路にセットした。油相から送液を開始し、流路内に油相が浸入したことを確認した後、水相を送液した。流路出口から油相および微小カプセルが流れていることを、顕微鏡のモニターおよび目視により確認した後、1.5 mLエッペンチューブに微小カプセルを回収した。 Using a cross-shaped microchannel, an emulsion containing microcapsules was prepared as follows. The cruciform microchannel was fixed to a microscope, and a syringe containing an oil phase and a syringe containing an aqueous phase were respectively set in the cruciform microchannel. Liquid feeding was started from the oil phase, and after confirming that the oil phase had entered the flow path, the aqueous phase was fed. After confirming that the oil phase and the microcapsules were flowing from the outlet of the flow path by monitoring with a microscope and visually, the microcapsules were collected in a 1.5 mL Eppendorf tube.
（ii）核酸増幅反応
回収した微小カプセルの一部(25μL)を取り、96ウェルプレートに分注した。これをABI7500にセットし、次の反応条件でリアルタイムRT-PCR反応を行なった。
＜反応条件＞
50℃で10分間を１サイクル、
94℃で５分間を１サイクル、および
(94℃で10秒間、60℃で10秒間および72℃で30秒間)を38サイクル。
(Ii) Nucleic acid amplification reaction A part (25 μL) of the collected microcapsules was taken and dispensed into a 96-well plate. This was set in ABI7500, and real-time RT-PCR reaction was performed under the following reaction conditions.
<Reaction conditions>
1 cycle for 10 minutes at 50 ℃
1 cycle at 94 ° C for 5 minutes, and
38 cycles (94 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 10 seconds and 72 ° C for 30 seconds).
核酸増幅後の反応液中の微小カプセルについて、次のようにして蛍光分析を行った。反応終了後の微小カプセルをクリーンベンチ内で新しいエッペンチューブへ移した。そして、微小カプセルを25μLずつ、２枚のグラスチャンバーにアプライして蛍光顕微鏡(倍率×100)にて微小カプセルの蛍光を観察および撮影した。撮影条件は、対物レンズ10倍、露光時間3.0秒、モノクロ12 bitであった。この条件で、チャンバーのほぼ全域をカバーする範囲(縦16枚×横20枚＝計320枚)を自動撮影した。撮影終了後、320枚の写真を１枚にジョイントし、ダイナミックセルカウント機能により、全ての微小カプセルの蛍光輝度を測定してヒストグラム解析した。 The microcapsules in the reaction solution after nucleic acid amplification were subjected to fluorescence analysis as follows. After completion of the reaction, the microcapsules were transferred to a new Eppendorf tube in a clean bench. Then, 25 μL each of the microcapsules was applied to two glass chambers, and the fluorescence of the microcapsules was observed and photographed with a fluorescence microscope (magnification × 100). The shooting conditions were an objective lens of 10 times, an exposure time of 3.0 seconds, and monochrome 12 bit. Under these conditions, a range that covers almost the entire chamber (16 vertical x 20 horizontal = 320 total) was automatically photographed. After photographing, 320 photographs were joined into one, and the fluorescence intensity of all the microcapsules was measured by the dynamic cell count function, and the histogram analysis was performed.
（３）実験結果
図３に、320枚の写真を１枚にジョイントした写真およびその拡大図を示す。図３のうち、３Ａはチャンバー全体像であり、３Ｂは拡大図である。なお、図中の矢印は、蛍光を発していた微小カプセルを示す。撮影した写真より、作製した微小カプセルの直径を全て計測し、各種の情報を下表にまとめた。
(3) Experimental Results FIG. 3 shows a photograph in which 320 photographs are joined to one sheet and an enlarged view thereof. In FIG. 3, 3A is an overall image of the chamber, and 3B is an enlarged view. In addition, the arrow in a figure shows the microcapsule which has emitted the fluorescence. All the diameters of the produced microcapsules were measured from the photographed photographs, and various information was summarized in the table below.
蛍光を発していた微小カプセルの数について、予想される数と実測数とを比較すると、概ね予想通りの数値を返した。この結果では、5copy／μg total RNAを検出できることを示している。従来のRT-PCR法の感度が100 copy／μg total RNAを検出できる程度であるのに対して、本発明の方法では理論的に1copy／μg total RNAを検出することができることが分かった。 When the expected number of the number of microcapsules emitting fluorescence was compared with the actually measured number, a numerical value almost as expected was returned. This result indicates that 5 copy / μg total RNA can be detected. It was found that the sensitivity of the conventional RT-PCR method is such that 100 copies / μg total RNA can be detected, whereas the method of the present invention can theoretically detect 1 copy / μg total RNA.
Claims (6)
前記水性組成物と、シリコーン系界面活性剤および油を含む油性組成物とを混合することにより、前記水性組成物を内包する微小カプセルを含む油中水型エマルションを調製する工程と、
前記微小カプセル内で核酸増幅反応を行う工程と
を含み、
前記シリコーン系界面活性剤が、ドデシル鎖およびポリオキシエチレン鎖を有する分岐状または架橋型オルガノポリシロキサンあるいはこれらの混合物である
核酸増幅方法。 Preparing an aqueous composition comprising a nucleic acid, a primer that hybridizes with the nucleic acid, and a reagent for nucleic acid amplification reaction;
Preparing a water-in-oil emulsion containing microcapsules enclosing the aqueous composition by mixing the aqueous composition with an oily composition containing a silicone surfactant and oil;
Performing a nucleic acid amplification reaction in the microcapsule,
A nucleic acid amplification method, wherein the silicone-based surfactant is a branched or crosslinked organopolysiloxane having a dodecyl chain and a polyoxyethylene chain, or a mixture thereof.
前記シリコーン系界面活性剤が、ドデシル鎖およびポリオキシエチレン鎖を有する分岐状または架橋型オルガノポリシロキサンあるいはこれらの混合物である
核酸増幅反応用試薬キット。 As a reagent for preparing a water-in-oil emulsion, a silicone surfactant and an oil are included,
A reagent kit for nucleic acid amplification reaction, wherein the silicone surfactant is a branched or crosslinked organopolysiloxane having a dodecyl chain and a polyoxyethylene chain, or a mixture thereof.
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