JP5875578B2

JP5875578B2 - 光線力学治療用ナノ粒子

Info

Publication number: JP5875578B2
Application number: JP2013506005A
Authority: JP
Inventors: 正孝坂根; 徹船山; 功原; 英一小関
Original assignee: Shimadzu Corp; University of Tsukuba NUC
Current assignee: Shimadzu Corp; University of Tsukuba NUC
Priority date: 2011-03-23
Filing date: 2012-03-22
Publication date: 2016-03-02
Anticipated expiration: 2032-03-22
Also published as: JPWO2012128326A1; WO2012128326A1

Description

本発明は、光線力学治療（PDT；Photo Dynamic Therapy）用ナノ粒子に関する。

１．腫瘍細胞に集積するナノ粒子
ポリ乳酸を疎水性ブロックとする両親媒性ブロックポリマーの分子集合体（ラクトソーム）をキャリアとし、蛍光色素を内包したナノ粒子が開発されている（特許文献１）。ラクトソームは、腫瘍組織周辺の未成熟な血管組織から漏れ出ること（ＥＰＲ(Enhanced Permeability and Retention)効果）により、腫瘍細胞に集積することができる。

２．脊椎腫瘍の治療
脊椎は悪性腫瘍の骨転移の中でも好発部位である。ガンの骨転移は、癌性疼痛、病的骨折、神経圧迫などによる歩行障害や排尿・***障害を引き起こし、末期癌患者の生活の質（QOL）を著しく低下させる。
転移性骨腫瘍の治療法としては、脊椎の不安定性や脊髄圧迫による麻痺が発生している場合には外科的摘出が検討される。
転移性脊椎腫瘍に対する低侵襲の手術方法としては、主に疼痛緩和のために転移椎体へのセメント注入やラジオ波照射などが臨床応用されている。
一方、転移性脊椎腫瘍の手術にはレーザーは臨床応用されていない。

転移性脊椎腫瘍に対するレーザーと光感受性物質を併用した光線力学療法に関し、動物モデルを用いた研究が報告されている（非特許文献１）。この研究においては、動物モデルとして乳癌脊椎転移モデル、光感受性物質としてＢＰＤ−ＭＡ (Benzoporphyrin derivative Monoacid Ring A; Verteporfin)、レーザーとして６９０ｎｍの波長の半導体レーザーが使用されている。

３．早期肺癌の治療
早期肺癌の治療法として、腫瘍に取り込まれる発光物質（例えばポルフィリン誘導体）を事前に注入し、手術中に腫瘍範囲を同定し、腫瘍に取り込まれた発光物質の発光部位をレーザー照射することにより、腫瘍取り残しを最小限とする試みが臨床応用されている。

４．インドシアニングリーンによる細胞毒性
インドシアニングリーンが、光酸化を受けることによってヒト大腸癌細胞に対する細胞毒性を呈することが報告されている（非特許文献２）。
また、インドシアニングリーンが、近赤外光によって励起されて一重項酸素を発生し、この一重項酸素によりインドシアニングリーンが分解され、得られた分解物がブタ網膜色素上皮細胞に対する細胞毒性を呈することが報告されている（非特許文献３）。
さらに、インドシアニングリーンが、ヒト乳がん細胞に対する細胞毒性を呈することが報告されている（非特許文献４）。

国際公開第２００９／１４８１２１号パンフレット

ジャーナル・オブ・オルソペディック・リサーチ（Journal of Orthopaedic Research）、２００５年、第２３巻、ｐ．９９５−１００３ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（British Journal of Cancer）、１９９９年、第８０巻、ｐ．３６０−３６３インベスティゲイティブ・オフサルモロジー・アンド・ビジュアル・サイエンス（Investigative Ophthalmology & Visual Science）、２００８年５月、第４９巻、第５号、ｐ．１７７７−１７８３フォトダイアグノシス・アンド・フォトダイナミック・セラピー（Photodiagnosis and Photodynamic Therapy）、２００９年、第６巻、第２号、ｐ．１１７−１２１

悪性腫瘍の外科的摘出は、安全な切除縁で拡大摘出することを基本としているが、転移性脊椎腫瘍のように神経や血管の近傍に位置する腫瘍の場合は十分な切除縁がとれないことが多く、局所再発の一因となりうる、という問題がある。さらに、転移性脊椎腫瘍のような手術は、術後に追加の放射線療法かホルモン療法など残存腫瘍を制御できる補助療法が行われることを前提とするものであり、従来の外科的手術療法単独による局所制御は難しい、という問題がある。

非特許文献１に報告されている方法においては、光感受性物質を全身投与するためレーザー照射の影響が転移巣に加えて脊髄まで及ぶため、治療による医原性下肢麻痺の発生を防ぎ得ない、という問題がある。

腫瘍にとりこまれる発光物質（ポルフィリン等）の発光部位をレーザー照射する方法においては、注射後患者を長時間（例えば一週間）暗室に待機させる必要があることや、腫瘍に取り込まれたポルフィリンの発光が微弱である、等の問題がある。

本発明の目的は、悪性腫瘍等、特に転移性脊椎腫瘍の外科的摘出すべき部位を特異的に且つ十分な発光強度で視覚化することによって正確に確定するとともに、確定したその部位を効果的に処理することができるシステムを構築可能な光線力学治療用ナノ粒子を提供することにある。

本発明者らは、レーザー照射によって細胞毒性物質を生じるポリ乳酸結合インドシアニングリーンなどの蛍光色素をラクトソームに内包させたナノ粒子を光力学治療に採用することによって、上記本発明の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、以下の発明を含む。
（１）２０個以上のサルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と、１０個以上の乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーＡ１、及びレーザー照射により細胞毒性を生じさせる近赤外蛍光色素Ｂを含む光線力学治療用ナノ粒子。

（２）
前記近赤外蛍光色素Ｂが、前記レーザー光による励起により生じた活性酸素による自己酸化によって、細胞毒性を有する分解物を与えるものである、（１）に記載の光線力学治療用ナノ粒子。

本発明のナノ粒子は、分子集合体（ラクトソーム；lactosome）をキャリア剤とし、且つ近赤外蛍光色素を有するものである。キャリア剤を有する態様として、下記（３）及び（５）がある。本明細書においては、便宜上、下記（３）及び（５）の態様のいずれについても、分子集合体に近赤外蛍光色素が「内包される」と表現する場合がある。

例えば近赤外蛍光色素Ｂがシアニン化合物である場合、レーザー光により励起されて生じた活性酸素によって、オレフィン性二重結合部分で酸化され、ジオキセタン中間体を経て、細胞毒性を有する分解物であるカルボニル化合物を生じる。

（３）
前記近赤外蛍光色素Ｂが、１０個以上の乳酸単位と、近赤外蛍光基とを少なくとも有する近赤外蛍光標識ポリマーＢ１であり、且つ、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１とともに自己集合することにより分子集合体を形成している、（１）又は（２）に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
（４）
前記近赤外蛍光標識ポリマーＢ１における近赤外蛍光基が、下記式（I）：
（式中、Ｒ_１は、置換されていてもよい炭化水素基であり、Ｒ_２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基であり；Ｒ_３及びＲ_３’は、水素であるか、又はそれらが互いに連結して環状構造を形成するものであり；Ｘは水素又はハロゲンであり；Ａ⁻は陰イオンであり、ｍは０又は１であり；環Ｂ及び環Ｄは、それぞれ同一又は異なっていてもよい含窒素縮合芳香族複素環である。）で示されるものである、（３）に記載の光線力学治療用ナノ粒子。

（５）
前記近赤外蛍光標識ポリマーＢ１における近赤外蛍光基がインドシアニングリーンに由来する基である、（３）又は（４）に記載の光線力学治療用ナノ粒子。

（６）
前記近赤外蛍光色素Ｂが、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１の自己集合により形成された分子集合体に内包された近赤外蛍光分子Ｂ２である、（１）又は（２）に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
（７）
前記近赤外蛍光分子Ｂ２が、下記式（I’）：
（式中、Ｒ_１及びＲ_２’は、それぞれ、同一又は異なっていてもよく、置換されていてもよい炭化水素基であり；Ｒ_３及びＲ_３’は、水素であるか、又はそれらが互いに連結して環状構造を形成するものであり；Ｘはハロゲンであり；Ａ⁻は陰イオンであり、ｍは０又は１であり；環Ｂ及び環Ｄは、同一又は異なっていてもよい含窒素縮合芳香族複素環である。）で示されるシアニン化合物である、（６）に記載の光線力学治療用ナノ粒子。

（８）
前記近赤外蛍光分子Ｂ２がインドシアニングリーン分子である、（６）又は（７）に記載の光線力学治療用ナノ粒子。

（９）
前記ナノ粒子が、１０個以上の乳酸単位を少なくとも有する疎水性ポリマーＡ２をさらに含むものである、（１）〜（８）のいずれかに記載の光線力学治療用ナノ粒子。

（１０）
前記ナノ粒子が、２０〜２００ｎｍの粒子径を有する、（１）〜（９）のいずれかに記載の光線力学治療用ナノ粒子。
（１１）
前記近赤外蛍光色素Ｂの濃度が、前記ナノ粒子を構成するポリマー及び前記赤外蛍光色素Ｂの合計に対し０．１〜５０ｍｏｌ％である、（１）〜（１０）のいずれかに記載の光線力学治療用ナノ粒子。
上記（１１）において、ナノ粒子を構成するポリマー及び赤外蛍光色素Ｂの合計とは、ポリマーＡ１及び色素Ｂの合計、又はポリマーＡ１、ポリマーＡ２及び色素Ｂの合計である。
（１２）
骨又は脊椎に存在する血管病変を治療するための、（１）〜（１１）のいずれかに記載の光線力学治療用ナノ粒子。
（１３）
ヒト乳がん細胞を治療するための、（１）〜（１２）のいずれかに記載の光線力学治療用ナノ粒子。

本発明のナノ粒子は、血管病変部位を正確に確定しレーザー照射によりその部位を処理するシステムを構築することができる。このシステムにおいては、本発明のナノ粒子を血管内に注入し、血管病変部位を処理する際に、血管病変部位に特異的に集積したナノ粒子から発せられた近赤外蛍光により正確に確定された部位のみにレーザーの焦点をあわせる。このため、血管病変部位に正確に照射でき、周囲正常組織へのダメージが軽減され、低侵襲で血管病変部位の処理を行う。

さらに、本発明のナノ粒子は、細胞毒性物質を血管病変部位に効率的に作用させるシステムを構築することができる。このシステムにおいては、内部に近赤外蛍光色素を封入したナノ粒子を血管内に注入し、細胞毒性物質を発生させる際に、正確に確定された血管病変の位置にレーザーの焦点を合わせるため、レーザー照射により、血管病変部位に到達したナノ粒子に内包された近赤外蛍光色素のみを励起し、細胞毒性物質を血管病変に効率的に作用させる。

（１４）
２０個以上のサルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と、１０個以上の乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーＡ１、及び近赤外蛍光色素Ｂを含むナノ粒子であって、レーザー光による前記近赤外蛍光色素Ｂの励起により活性酸素を生じるナノ粒子と、
血管病変の位置を示す画像データを取得するための手段、画像データに基づいてレーザー光の照射位置を血管病変に合わせる手段、及びナノ粒子に対してレーザー光を照射する手段を備えた装置と
を有する、血管病変の光線力学治療システム。

本発明の光線力学治療用ナノ粒子によると、悪性腫瘍等、特に転移性脊椎腫瘍の外科的摘出すべき部位を特異的に且つ十分な発光強度で視覚化することによって正確に確定するとともに、確定したその部位を効果的に処理することができるシステムを構築することができる。

ＩＣＧラクトソームを投与した脊椎移転乳癌ラットモデルの蛍光イメージングの結果である。ＩＣＧを投与した脊椎移転乳癌ラットモデルの蛍光イメージングの結果である。ＩＣＧラクトソームを投与した脊椎移転乳癌ラットモデルの、癌細胞移植７日後（Rat 6）における摘出した椎体の明視野像及び蛍光イメージング像、及び、下肢麻痺出現後（Rat 7）における摘出した椎体の明視野像及び蛍光イメージング像である。図３のRat 6の椎体の断面像、及びRat 7の椎体の断面像である。レーザー（Laser）処理群及びＰＤＴ処理群について、下肢運動機能（BBB scale）とラット作製後の日数（Days）との関係を示す。レーザー（Laser）処理群及びＰＤＴ処理群について、生存率とラット作製後の日数（Days）との関係を示す。レーザー（Laser）処理群、ＰＤＴ−低濃度ＩＣＧラクトソーム処理群及びＰＤＴ−高濃度ＩＣＧラクトソーム処理群について、下肢運動機能（BBB scale）とラット作製後の日数（Day）との関係を示す。コントロール群、ＩＣＧラクトソーム群、レーザー（Laser）群及びＰＤＴ群について、乳癌細胞を経過観察した顕微鏡写真である。コントロール（Control）群、ＩＣＧラクトソーム（ICG lactosome）群、レーザー（Laser）群及びＰＤＴ群についての、乳癌細胞のWST-1アッセイの結果である。

［１．ナノ粒子］
本発明におけるナノ粒子は、少なくとも両親媒性ブロックポリマーＡ１の凝集により、或いは自己集合的な配向会合により成り立つ分子集合体（ラクトソーム）をキャリア剤とする、近赤外蛍光色素Ｂを有する構造体である。

本発明におけるナノ粒子は、親媒性ブロックポリマーＡ１が、近赤外蛍光色素Ｂとしての近赤外蛍光標識ポリマーＢ１とともに分子集合体を形成したもの；両親媒性ブロックポリマーＡ１及び疎水性ポリマーＡ２が、近赤外蛍光色素Ｂとしての近赤外蛍光標識ポリマーＢ１とともに分子集合体を形成したもの；両親媒性ブロックポリマーＡ１の分子集合体に、近赤外蛍光色素Ｂとしての近赤外蛍光分子Ｂ２が内包されたもの；両親媒性ブロックポリマーＡ１及び疎水性ポリマーＡ２の分子集合体に、近赤外蛍光色素Ｂとしての近赤外蛍光分子Ｂ２が内包されたものを含む。

本発明における分子集合体はミセルを構成する。両親媒性ブロックポリマーＡ１は、自己組織化によって、疎水性ブロック鎖がコア部を形成する。一方、近赤外蛍光色素Ｂは、当該疎水コア部に位置する。

［１−１．両親媒性ブロックポリマーＡ１］
本発明の両親媒性ブロックポリマーＡ１は、以下の親水性ブロック及び疎水性ブロックを有する。両親媒性ブロックポリマーＡ１は、ナノ粒子のキャリア剤となる分子集合体の基本的要素である。両親媒性ブロックポリマーＡ１は、下記の１種又は複数種を組み合わせて用いることができる。以下、本発明において、用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及びそれらの修飾及び／又は化学的変更による誘導体を含む概念で用いる。さらに、本明細書において、アミノ酸は、α−、β−、γ−アミノ酸を含む。好ましくは、αアミノ酸である。

［１−１−１．親水性ブロック鎖］
本発明において、親水性ブロック鎖が有する「親水性」という物性の具体的な程度としては、特に限定されるものではないが、少なくとも、親水性ブロック鎖が、後述の特定の疎水性ブロック鎖に対して、相対的に親水性が強い領域であり、当該親水性ブロック鎖が当該疎水性ブロック鎖とコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の親水性を有していれば良い。或いは、当該両親媒性ブロックポリマーが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、好ましくは粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の親水性を有していれば良い。

親水性ブロック鎖は、サルコシンに由来する単位を親水性必須構成単位として含み、且つ前記親水性必須構成単位を２０個以上有する親水性分子鎖である。具体的には、親水性分子鎖は、サルコシン単位を２０個、好ましくは３０個以上有する親水性ポリペプチド鎖が含まれる。

サルコシンとはすなわちＮ−メチルグリシンである。
サルコシン単位以外の構成単位を有する場合、そのような構成単位としては特に限定されないが、例えばサルコシン単位以外のアミノ酸（親水性アミノ酸及びその他のアミノ酸を含む）単位やアルキレンオキシド単位が挙げられる。そのようなアミノ酸単位の例としては、好ましくは、αアミノ酸である。例えば、セリン、スレオニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。アルキレンオキシド単位の例としては、具体的には、エチレンオキシド単位（ポリエチレングリコール単位）、プロピレンオキシド単位（プロピレングリコール）などが挙げられる。また、アルキレンオキシド単位においては、水素が置換されていてもよい。

親水性ブロック鎖において、その鎖を構成する構成単位の種類・比率は、ブロック鎖全体が上述したような親水性となるように、当業者によって適宜決定される。

親水性ブロック鎖は、例えば構成単位数５００程度を上限として設計することができる。本発明においては、しばしば、３０〜３００、より好ましくは５０〜２００程度の構成単位数を有する親水性ブロック鎖が合成されうる。構成単位数が５００程度を超えると、分子集合体を形成した場合に、当該形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。構成単位数が３０を下回ると、分子集合体の形成自体が困難となる傾向にある。

親水性ブロック鎖においては、同じ構成単位のすべてが連続していてもよいし、非連続であってもかまわない。親水性ブロック鎖において、上記特定の単位以外の他の構成単位を含む場合、他の構成単位の種類・比率は、ブロック鎖全体が上述したような親水性となるように、当業者によって適宜決定される。またその場合、後述の基本特性を損なわないように分子設計されることが好ましい。

サルコシン（すなわちＮ−メチルグリシン）は水溶性が高く、また、サルコシンのポリマーはＮ置換アミドを有することから通常のアミド基に比べてシス−トランス異性化が可能であり、さらに、Ｃ^α炭素まわりの立体障害が少ないことから、高い柔軟性を有するものである。このようなポリペプチドを構成ブロック鎖として用いることは、当該ブロック鎖に高い親水性と高い柔軟性とを併せ持つという基本特性が備わる点で非常に有用である。

［１−１−２．疎水性ブロック鎖］
本発明において、疎水性ブロック鎖が有する「疎水性」という物性の具体的な程度としては、特に限定されるものではないが、少なくとも、疎水性ブロック鎖が、上記の親水性ブロック鎖に対して、相対的に疎水性が強い領域であり、当該親水性ブロック鎖とコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の疎水性を有していれば良い。或いは、当該両親媒性ブロックポリマーが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、好ましくは粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の疎水性を有していれば良い。

本発明において、疎水性ブロック鎖は、１０個以上の乳酸単位を有するものである（本明細書においては、乳酸単位を基本単位とするこの疎水性ブロック鎖を、単にポリ乳酸と記載することがある）。好ましくは、疎水性ブロック鎖は、２０個以上の乳酸単位を有する。この疎水性ブロック鎖においては、乳酸単位のすべてが連続していてもよいし、非連続であってもかまわない。疎水性分子鎖において、乳酸単位以外の構成単位の種類・比率は、ブロック鎖全体が上述したような疎水性となるように、当業者によって適宜決定される。

この疎水性ブロック鎖において、乳酸単位以外の構成単位を有する場合、そのような構成単位の種類・比率は、ブロック鎖全体が上述したような疎水性であることを満たせば特に限定されるものではないが、後述の諸特性を有するように分子設計されたものであることが好ましい。

疎水性ブロック鎖において、乳酸単位以外の構成単位を有する場合、そのような構成単位は、乳酸以外のヒドロキシル酸及びアミノ酸（疎水性アミノ酸及びその他のアミノ酸を含む）からなる群から選択することができる。ヒドロキシル酸としては、特に限定されないが、グリコール酸、ヒドロキシイソ酪酸などが挙げられる。疎水性アミノ酸は、その多くが、脂肪族側鎖、芳香族側鎖などを有する。天然アミノ酸では、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、チロシン、及びトリプトファンなどが挙げられる。非天然アミノ酸では、特に限定されないが、グルタミン酸メチルエステル、グルタミン酸ベンジルエステル、アスパラギン酸メチルエステル、アスパラギン酸エチルエステル、アスパラギン酸ベンジルエステルなどのアミノ酸誘導体が挙げられる。

疎水性ブロック鎖の構成単位数の上限としては特に限定されないが、１００程度である。本発明においては、しばしば、１０〜８０、好ましくは２０〜５０程度の構成単位数を有する疎水性ブロック鎖が合成されうる。構成単位数が１００程度を超えると、分子集合体を形成した場合に、当該形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。構成単位数が１０を下回ると、分子集合体の形成自体が困難となる傾向にある。

ポリ乳酸は、優れた生体適合性及び安定性を有するものである。このため、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体は、生体、特に人体への応用性という点で非常に有用である。
また、ポリ乳酸は、優れた生分解性を有することから代謝が早く、生体内において血管病変以外への組織への集積性が低い。このため、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体は、血管病変への特異的な集積性という点で非常に有用である。
そして、ポリ乳酸は、低沸点溶媒への溶解性に優れるものであることから、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から分子集合体を得る際に、有害な高沸点溶媒の使用を回避することが可能である。このため、このような分子集合体は、生体への安全性という点で非常に有用である。
さらに、ポリ乳酸の鎖長を調整することは、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体の形状制御及び大きさ制御の一要因として寄与する点で好ましい。このため、このような構成ブロックを用いることは、得られる分子集合体形状の用途性に優れるという点で非常に有用である。
疎水性ブロック鎖において、乳酸単位以外の構成単位を有する場合も、これらの優れた諸特性を有するように分子設計することが好ましい。

疎水性ブロック鎖は、光学純度の観点から、さらに以下のバリエーションを有することができる。
例えば、疎水性ブロック鎖における当該乳酸単位が、Ｌ−乳酸単位のみで構成されてもよいし、Ｄ−乳酸単位のみで構成されてもよいし、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との両者から構成されてもよい。疎水性ブロック鎖は、上記例示のものから選ばれた１種が単独で使用されてもよいし、複数種が組み合わされて使用されてもよい。

当該乳酸単位がＬ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との両者から構成される場合、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との重合順番は限定されない。Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位とが１個又は２個ずつ交互に重合されていてもよいし、ランダムに重合されていてもよいし、ブロック重合されていてもよい。

従って、当該乳酸単位がＬ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との両者から構成される場合、それぞれの乳酸単位の含有量は特に限定されない。すなわち、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位とが異なる量で含有されていてもよいし、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位とが同量含有されていてもよい。この場合、当該１０個以上の乳酸単位が全体として光学純度０％のラセミ体であり得る。

［１−２．近赤外蛍光色素Ｂ］
近赤外蛍光色素Ｂは、キャリア剤に内包される要素である。具体的には、ポリマーに近赤外蛍光基が結合した態様を有するもの（近赤外蛍光標識ポリマーＢ１）及び近赤外蛍光分子そのもの（近赤外蛍光分子Ｂ２）から選ばれる。

本発明における近赤外蛍光色素Ｂは、検出によりイメージングを可能にする特性を有する。近赤外領域（７００〜１３００ｎｍ）では、水素結合を有する各置換基の吸収が存在するものの、その吸収は比較的小さい。このため、近赤外光は生体組織を透過しやすい特性を有する。このような近赤外光の特性を利用すれば、ナノ粒子が集積された部位の情報を正確に得ることが可能である。

さらに、本発明においては、近赤外蛍光色素の光線化学反応を利用する。この観点によると、本発明における近赤外蛍光色素Ｂは、レーザー光により励起され、細胞毒性物質を生じる特性を有しうる。本発明における細胞毒性物質は、少なくとも活性酸素（例えば一重項酸素）を含み、その他のフリーラジカル、及び近赤外蛍光色素Ｂの分解物を含みうる。例えば活性酸素は、標的細胞へ細胞毒性を与えるが、さらに、近赤外蛍光色素Ｂの自己酸化を誘発し、細胞毒性を有する分解物を生じさせる特性も有しうる。従って、本発明における近赤外蛍光色素Ｂは、ナノ粒子自身の特異的集積性により治療部位を可視化するとともに、可視化された部位へのレーザー照射で生じる物質により標的細胞へ細胞毒性を与える効果も生じさせることができる。

［１−２−１．近赤外蛍光標識ポリマーＢ１］
近赤外蛍光標識ポリマーＢ１は、以下の標識部及びポリマー部を少なくとも有する。近赤外蛍光標識ポリマーＢ１は、上記両親媒性ブロックポリマーＡ１とともに自己集合により分子集合体を形成することができる要素である。近赤外蛍光標識ポリマーＢ１は、下記の１種又は複数種を組み合わせて使用することができる。

［１−２−１−１．標識部］
標識部は、本発明の近赤外蛍光色素Ｂに上述の特性を付与する部分であり、具体的には、近赤外蛍光分子に由来する基（近赤外蛍光基）である。例えば、シアニン系蛍光分子や量子ドットなどに由来する基が用いられる。シアニン系色素に由来する基は、レーザー光により励起されて生じた活性酸素によって、自らのオレフィン性二重結合部分で酸化され、ジオキセタン中間体を経て、細胞毒性を有するアルデヒドなどのカルボニル化合物に分解される。シアニン系色素に由来する基の一例は、以下の一般式（I）で表される。

上記式（Ｉ）中、Ｒ_１は、置換されていてもよい炭化水素基であり、Ｒ_２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基である。
Ｒ_１における炭化水素基は、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数２〜５のアルキル基でありうる。
Ｒ_２における炭化水素基は、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数２〜５のアルキレン基でありうる。
Ｒ_１及びＲ_２における置換基は、アニオン性であってもよい置換基であり、カルボキシル基、カルボキシレート基、金属カルボキシレート基、スルホニル基、スルホネート基、金属スルホネート基、又は水酸基でありうる。前記金属は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属でありうる。

Ｒ_３及びＲ_３’は、水素であるか、又はそれらが互いに連結して環状構造を形成するものである。Ｒ_３及びＲ_３’は互いに連結して環状構造をとることにより、蛍光色素の分子構造をリジッド化しうる。

Ｘは水素又はハロゲンである。ハロゲンは、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩでありうる。
Ａ⁻は陰イオンであり、ｍは０又は１である。ｍが０の場合、Ｒ_１及びＲ_２のいずれか一方がアニオン性基であり、分子全体としてベタイン構造をとる。ｍが１の場合、Ａ⁻は、Ｃｌ⁻、Ｂｒ⁻、Ｉ⁻等のハロゲンイオン、ＣＩＯ_４ ⁻、ＢＦ_４ ⁻、ＰＦ_６ ⁻、ＳｂＦ_６ ⁻、ＳＣＮ⁻等でありうる。

環Ｂ及び環Ｄは、同一又は異なっていてもよい含窒素縮合芳香族複素環である。たとえば、含窒素二環式や三環式芳香族複素環でありうる。好ましくは、環Ｂ及び環Ｄは、同一である。
環Ｂの好ましい態様としては、以下に示す構造が挙げられる。

環Ｄの好ましい態様としては、以下に示す構造が挙げられる。

上記式において、Ｒ_４及びＲ_５は、いずれも水素でありうる。又は、Ｒ_４及びＲ_５は、それらが互いに連結してアリール環を形成しうる。前記アリール環は、置換されてよいベンゼン環でありうる。

本発明において好ましい蛍光基は、下記構造式（II）で示される、インドシアニン化合物由来の基である。

本発明における蛍光基の具体例として、環Ｂ及び環Ｄがいずれも含窒素三環式芳香族複素環であるＩＣＧ基（III）、ＩＣ７−１基（IV）及びＩＲ８２０基（V）、環Ｂ及び環Ｄがいずれも含窒素二環式芳香族複素環であるＩＲ７８３基（VI）及びＩＲ８０６基（VII）、及び、環Ｂが含窒素三環式芳香族複素環、環Ｃが含窒素二環式芳香族複素環であるＩＣ７−２基（VIII）が挙げられる。これら基の構造式を以下に示す。

上記式（III）で表されるＩＣＧ基は、８１０ｎｍ付近の近赤外光レーザーの照射を受けると励起され、定常状態に戻る際に活性酸素やフリーラジカルを放出し、さらに細胞毒性を有する分解物を生じる。

［１−２−１−２．ポリマー部］
ポリマー部は、複数の乳酸単位を有する。例えば、乳酸単位を主たる構成成分とするもの（すなわちポリ乳酸基）であってもよいし、乳酸単位を疎水性ブロックとし、さらにそれに対する親水性ブロックを有するもの（すなわち両親媒性ブロックポリマー基）であってもよい。本発明における分子集合体は、生体適合性、安定性及び生分解性に優れ、構成ポリマーが低沸点溶媒への溶解性に優れるという諸特性を有するものであることが好ましい。従って、ポリマー部の構成は、これらの優れた諸特性を有するように分子設計されることが好ましい。

ポリ乳酸基は、５〜５０、好ましくは１５〜３５の乳酸単位を主たる構成成分とする。乳酸単位のすべてが連続していてもよいし、非連続であってもかまわない。上記範囲内で、標識ポリマーＢ１全体の長さが上述の両親媒性ブロックポリマーＡ１の長さを超えないように分子設計される。好ましくは、両親媒性ブロックポリマーＡ１における疎水性ブロックの２倍の長さを超えないように分子設計される。

その他、標識ポリマーＢ１のポリマー部の構成単位や鎖長に関しては、基本的に、上述の両親媒性ブロックポリマーＡ１における疎水性ブロック鎖の分子設計における場合と同様の観点で決定することができる。このようにすることによって、分子集合体において、標識ポリマーＢ１と、両親媒性ブロックポリマーＡ１の疎水性ブロック鎖との親和性に優れるという効果も得られる。

標識ポリマーＢ１において、近赤外蛍光基は、ポリマー部の末端構成単位に結合しうる。また、標識ポリマーＢ１は、分子設計上化学的又は生化学的に許容される近赤外蛍光基及びポリマー基以外の構成要素のいかなるものも有しうる。この場合、他の構成要素は、標識ポリマーＢ１が全体として上記定義された「疎水性」の範疇を越える影響を与えない程度で含まれる。

以下に、この態様における標識ポリマーＢ１の具体例を示す。下記式において、ｎは、５〜５０の整数である。下記の化合物は、近赤外蛍光基としてＩＣＧ基を有するものである。

標識ポリマーＢ１が標識両親媒性ブロックポリマーである場合、「疎水性」及び「親水性」の物性の具体的な程度は、上述の両親媒性ブロックポリマーＡ１の分子設計における場合と同様である。また、この場合における標識ポリマーＢ１のポリマー部（すなわち両親媒性ブロックポリマー部）の構成単位や鎖長に関しても、基本的に、上述の両親媒性ブロックポリマーＡ１の分子設計における場合と同様の観点で決定することができる。このようにすることによって、分子集合体において、標識ポリマーＢ１と、両親媒性ブロックポリマーＡ１の疎水性ブロック鎖との親和性に優れるという効果も得られる。

［１−２−２．近赤外蛍光分子Ｂ２］
近赤外蛍光分子Ｂ２は、上記両親媒性ブロックポリマーＡ１を基礎的要素とする分子集合体に内包されることができる要素である。
近赤外蛍光分子Ｂ２は、例えば、シアニン系蛍光分子や量子ドットなどが用いられる。シアニン系蛍光分子は、シアニン系蛍光分子は、レーザー光により励起されて生じた活性酸素によって、自らのオレフィン性二重結合部分で酸化され、ジオキセタン中間体を経て、細胞毒性を有するアルデヒドなどのカルボニル化合物に分解される。シアニン系蛍光分子の一例は、以下の一般式（I’）で表される。

上記式（Ｉ’）に示す構造は、上記式（Ｉ）に示す構造における２価のＲ_２が１価のＲ_２’に置き換わったことを除き、上記式（Ｉ）と同様である。
上記式（Ｉ’）中、Ｒ_１及びＲ_２’は、それぞれ、同一又は異なっていてもよく、置換されていてもよい炭化水素基である。
Ｒ_１及びＲ_２’における炭化水素基は、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数２〜５のアルキル基でありうる。Ｒ_１及びＲ_２’における置換基は、アニオン性であってもよい置換基であり、カルボキシル基、カルボキシレート基、金属カルボキシレート基、スルホニル基、スルホネート基、金属スルホネート基、又は水酸基でありうる。前記金属は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属でありうる。

本発明においてより好ましい蛍光色素は、下記構造式（II’）で示されるインドシアニン化合物である。

本発明における蛍光色素の具体例として、環Ｂ及び環Ｄがいずれも含窒素三環式芳香族複素環であるＩＣＧ（III’）、ＩＣ７−１（IV’）及びＩＲ８２０（V’）、環Ｂ及び環Ｄがいずれも含窒素二環式芳香族複素環であるＩＲ７８３（VI’）及びＩＲ８０６（VII
’）、及び、環Ｂが含窒素三環式芳香族複素環、環Ｃが含窒素二環式芳香族複素環であるＩＣ７−２（VIII’）の構造式を以下に示す。

上記式（III’）で表されるＩＣＧ（インドシアニングリーン）分子は、８１０ｎｍ付近の近赤外光レーザーの照射を受けると励起され、定常状態に戻る際に活性酸素やフリーラジカルを放出し、さらに細胞毒性を有する分解物を生じる。

［１−２−３．近赤外蛍光色素Ｂの濃度］
近赤外蛍光色素Ｂの濃度は、ナノ粒子を構成するポリマー及び前記赤外蛍光色素Ｂの合計に対し、例えば、０．１〜５０ｍｏｌ％、又は０．５〜２０ｍｏｌ％でありうる。また、上記範囲の下限は、１ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％又は１０ｍｏｌ％であってもよい。上記範囲の上限は、１０ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％又は１ｍｏｌ％であってもよい。

［１−３．疎水性ポリマーＡ２］
本発明においては、分子集合体はさらに疎水性ポリマーＡ２を含むことができる。
１０以上の乳酸単位を少なくとも有する疎水性ポリマーである。好ましくは、疎水性ポリマーＡ２は、１５個以上の乳酸単位を少なくとも有する。ここで、疎水性ポリマーＡ２が有する「疎水性」という物性の具体的な程度としては特に限定されるものではないが、少なくとも、上記の両親媒性ポリマーＡ１の親水性ブロックに対して、相対的に疎水性が強い。

疎水性ポリマーＡ２においては、１０個以上の乳酸単位が主たる構成成分であることが好ましい。しかしながら一方で、乳酸単位以外の他の構成単位を有することも許容する。当該乳酸単位はそのすべてが連続していてもよいし、非連続であってもよい。
疎水性ポリマーＡ２の構成単位や鎖長は、基本的に、上述の両親媒性ブロックポリマーＡ１における疎水性ブロック鎖や、近赤外蛍光標識ポリマーＢ１におけるポリマー部の分子設計における場合と同様の観点で決定することができる。このようにすることによって、分子集合体において、疎水性ポリマーＡ２と、両親媒性ブロックポリマーＡ１の疎水性ブロック鎖及び／又は近赤外蛍光標識ポリマーＢ１におけるポリマー部との親和性に優れるという効果も得られる。

疎水性ポリマーＡ２の構成単位数の上限としては、上述の両親媒性ブロックポリマーＡ１の長さを超えないものであれば特に限定されないが、好ましくは、両親媒性ブロックポリマーＡ１における疎水性ブロックの２倍の長さを超えないものとする。従って、疎水性ポリマーＡ２の構成単位数の上限としては、２００程度とすることができる。本発明においては、しばしば、１０〜１６０、好ましくは２０〜１００程度の構成単位数を有する疎水性ポリマーＡ２が合成されうる。構成単位数が２００程度を超えると、分子集合体を形成した場合に、形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。構成単位数が１０を下回ると、疎水性ポリマーＡ２を混合することによる後述の効果（疎水コア体積増大効果及び粒子径制御効果）が小さくなる。

疎水性ポリマーＡ２の配合量は、例えば、両親媒性ブロックポリマーＡ１と疎水性ポリマーＡ２との使用割合が、モル基準で１０：１〜１：１０となる量でありうる。上記範囲よりも疎水性ポリマーＡ２の割合が上回ると、分子集合体自体がその形状を保ちにくくなる傾向にある。また、上記範囲よりも疎水性ポリマーＡ２の割合が下回ると、疎水性ポリマーＡ２を混合することによる後述の効果（疎水コア体積増大効果及び粒子径制御効果）が得られにくくなる傾向にある。

［１−４．ナノ粒子の大きさ］
［１−４−１．ナノ粒子の大きさ］
本発明のナノ粒子の大きさは、例えば粒子径１０〜５００ｎｍ、好ましくは２０〜２００ｎｍである。ここで「粒子径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒径、すなわち中心粒径をいう。粒子径が１０ｎｍより小さいものは作成が難しく、５００ｎｍより大きいものは、特に生体内へ注射により投与する場合に、注射剤として好ましくない場合がある。

［１−４−２．ナノ粒子の大きさ測定］
本発明のナノ粒子の大きさを測定するための方法は特に限定されるものではなく、当業者によって適宜選択されるものである。例えば、透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope;ＴＥＭ）による観察法や、動的光散乱（Dynamic Light Scattering;ＤＬＳ）法などが挙げられる。ＤＬＳ法においては、溶液中でブラウン運動している粒子の移動拡散係数を測定する。

［１−４−３．ナノ粒子の大きさ制御］
分子集合体の大きさを制御する手段の例として、両親媒性ブロックポリマーＡ１の鎖長を制御することが挙げられる。好ましくは、両親媒性ブロックポリマーＡ１における疎水性ブロックの重合度を調整することができる。
他の例においては、近赤外蛍光色素Ｂとしての近赤外蛍光標識ポリマーＢ１のポリマー部や、疎水性ポリマーＡ２の重合度を調整することができる。
さらなる他の例においては、疎水性ポリマーＡ２の配合量を制御することができる。疎水性ポリマーＡ２は、分子集合体の疎水性コアを増大させる効果がある。しかも、その配合量を調整することにより、分子集合体の大きさの連続的制御を可能にする。従って、この手段は、ラクトソームの微妙な大きさの調整ができる点で好ましい。

［１−５．ナノ粒子の形成］
ナノ粒子の作成法は特に限定されず、所望するナノ粒子の大きさ、特性、担持させる近赤外蛍光色素Ｂの種類、性質、含有量などに応じて、当業者が適宜選択することができる。必要に応じ、下記のようにナノ粒子を形成した後に、得られたナノ粒子に対して、公知の方法によって表面修飾を行っても良い。
なお、粒子が形成されたことの確認は、電子顕微鏡観察によって行うと良い。

［１−５−１．フィルム法］
フィルム法は、リポソームの調製に用いられていた方法である。本発明における両親媒性ブロックポリマーは低沸点溶媒への溶解性を有するため、この方法を用いたナノ粒子の調製が可能である。
フィルム法は、次の工程を含む。すなわち、容器（例えばガラス容器）中に、両親媒性ブロックポリマーＡ１、疎水性ポリマーＡ２等分子集合体を構成するポリマーと近赤外蛍光色素Ｂとを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程；前記溶液から前記有機溶媒を除去し、前記容器の内壁にポリマーと近赤外蛍光色素Ｂとを含むフィルムを得る工程；及び、前記容器中に水又は水溶液を加え、超音波処理又は加温処理を行い、前記フィルム状物質を、近赤外蛍光色素Ｂを内包する分子集合体に変換してナノ粒子の分散液を得る工程、を含む。さらに、フィルム法は、前記のナノ粒子の分散液を凍結乾燥処理に供する工程を含んでも良い。

分子集合体を構成するポリマーと近赤外蛍光色素Ｂとを有機溶媒中に含む溶液は、分子集合体を構成するポリマーをあらかじめフィルムの状態でストックしておき、ナノ粒子調製時に、近赤外蛍光色素Ｂを含む溶液を加えてフィルムを溶解することによって調製してもよい。

フィルム法に用いる有機溶媒としては、低沸点溶媒を用いることが好ましい。本発明における低沸点溶媒とは、１気圧における沸点が１００℃以下、好ましくは９０℃以下のものをいう。具体的には、クロロホルム、ジエチルエーテル、アセトニトリル、エタノール、アセトン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ヘキサンなどが挙げられる。
分子集合体を構成するポリマー及び近赤外蛍光色素Ｂの溶解にこのような低沸点溶媒を使用することによって、溶媒の除去が非常に簡単になる。溶媒の除去の方法としては特に限定されることなく、使用する有機溶媒の沸点などに応じ、当業者が適宜決定すればよい。例えば、減圧下における溶媒除去を行ってもよいし、自然乾燥による溶媒除去を行ってもよい。

有機溶媒が除去された後は、容器内壁に分子集合体を構成するポリマーと近赤外蛍光色素Ｂとを含むフィルムが形成される。このフィルムが張り付いた容器中に、水又は水溶液を加える。水又は水溶液としては特に限定されることなく、生化学的、薬学的に許容することができるものを当業者が適宜選択すればよい。例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。

水又は水溶液が加えられた後、加温処理を行う。加温によりフィルムが容器内壁から剥がれる過程で分子集合体を形成する。加温処理は、例えば７０〜１００℃、５〜６０分の条件下で行うことができる。加温処理終了時には、近赤外蛍光色素Ｂが内包された分子集合体（ナノ粒子）が前記の水又は水溶液中に分散された分散液が容器中に調製される。

得られた分散液は、直接生体に投与されることが可能である。すなわち、無溶媒のナノ粒子そのものの状態で保存されなくてもよい。
一方、得られた分散液を凍結乾燥処理しても良い。凍結乾燥処理の方法としては公知の方法を特に限定されることなく用いることができる。たとえば、上記のようにして得られたナノ粒子の分散液を液体窒素などによって凍結させ、減圧下で昇華させることによって行うことができる。これにより、ナノ粒子の凍結乾燥処理物が得られる。すなわち、ナノ粒子を凍結乾燥処理物として保存することが可能になる。必要に応じ、この凍結乾燥物に水又は水溶液を加えて、ナノ粒子の分散液を得ることによって、ナノ粒子を使用に供することができる。水又は水溶液としては特に限定されることなく、生化学的、薬学的に許容することができるものを当業者が適宜選択すればよい。例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。

ここで、凍結乾燥処理前の分散液中には、分子集合体を構成するポリマーと近赤外蛍光色素Ｂとから形成された本発明のナノ粒子以外にも、そのようなナノ粒子の形成に寄与しなかったポリマー及び／又は近赤外蛍光色素Ｂが各々それ自体として残存しうる。このような分散液を凍結乾燥処理に供すると、溶媒が濃縮される過程で、本発明のナノ粒子を形成せず残存していたポリマーと近赤外蛍光色素Ｂとから、さらにナノ粒子を形成することが可能になる。従って、本発明のナノ粒子の調製を効率的に行うことが可能になる。

［１−５−２．インジェクション法］
インジェクション法は、本発明のナノ粒子に限らず、他の多くのナノ粒子の調製に用いられる方法である。この方法においては、有機溶媒、例えばトリフルオロエタノール、エタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどに、分子集合体を構成するポリマーと近赤外蛍光色素Ｂとを溶解し、得られた溶液を、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などの水系溶媒に分散させ、精製処理、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、フィルタリング、超遠心などの処理を行った後、有機溶媒を除去することによってナノ粒子を調製することができる。このようにして得られたナノ粒子を生体内へ投与する場合であって、有機溶媒に生体に有害なものを用いた場合は、この有機溶媒の除去を厳密に行う必要がある。

［１−６．ナノ粒子の投与］
ナノ粒子を投与される生体としては特に限定されず、ヒト及び非ヒト動物でありうる。非ヒト動物としては特に限定されないが、ヒト以外の哺乳類、より具体的には、霊長類、齧歯類（マウス、ラットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びウマなどが挙げられる。
生体内への投与の方法としては特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。従って、投与の方法としては、全身投与及び局所投与とを問わない。すなわち、分子プローブの投与は、注射（針有型、針無型）、内服、外用のいずれの方法によっても行うことができる。投与液中におけるナノ粒子の濃度は、例えば内包物がICG-PLLA₃₀でありキャリアがPSar₇₀-PLLA₃₀の分子集合体であるラクトソームの場合の量に換算して０．５〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．８〜５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜２０ｍｇ／ｍｌでありうる。

本発明におけるナノ粒子は、血管病変部位への特異的集積性に優れたものである。血管病変部位としては、腫瘍部位、炎症部位、動脈硬化部位、血管新生部位などが挙げられる。本発明におけるナノ粒子は、ＥＰＲ (enhanced permeability and retention) 効果によりこれらの部位の組織へ集積するため、その集積性は血管病変部位の組織の種類によらず、その範囲は多岐にわたる。本発明におけるナノ粒子の投与ターゲットとしては腫瘍（特に悪性腫瘍）又は炎症であることが好ましい。その場所としては、特に、骨又は脊椎であることが好ましい。従って、例えば、骨腫瘍や脊椎腫瘍、炎症性滑膜（例えば関節リウマチによるもの）、骨軟部腫瘍（例えば絨毛性色素性滑膜腫）が投与ターゲットとなる。

ナノ粒子投与から検出開始までの時間は、投与されるナノ粒子が有する近赤外蛍光色素Ｂの種類、及び投与ターゲットの種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。例えば、投与後３〜４８時間、或いは１〜２４時間とすることができる。上記範囲を下回ると、シグナルが強すぎ、投与ターゲットと他の部位（バックグラウンド）とを明確に分けることができない場合がある。また、上記範囲を上回ると、蛍光プローブが投与ターゲットから***されてしまう場合がある。

［２．ナノ粒子と組み合わされる装置］
ナノ粒子と組み合わされる装置は、蛍光イメージング手段とレーザー照射手段とを有する。
蛍光イメージング手段は、すなわち、血管病変の位置を示す画像データを取得するための手段である。レーザー照射手段は、すなわち、画像データに基づいてレーザー光の照射位置を血管病変に合わせる手段と、ナノ粒子に対してレーザー光を照射する手段と、を含むものである。

［２−１．血管病変の位置を示す画像データを取得するための手段］
本発明のナノ粒子によって構築されるシステムにおける蛍光イメージング手段、すなわち血管病変の位置を示す画像データを取得するための手段としては、人体などの被写体に投与されたナノ粒子に含まれる近赤外蛍光色素Ｂに由来する近赤外光を検出し、ナノ粒子が存在する組織の位置や大きさを観測することができるものであればよい。従って、当業者であれば、ナノ粒子に含まれる近赤外蛍光色素Ｂに由来する近赤外光を可視化することができる手段を適宜選択することができる。

好ましい態様において、血管病変の位置を示す画像データを取得するための手段は、被写体に投与されたナノ粒子に含まれる近赤外蛍光色素Ｂに由来する近赤外蛍光を検出し、その可視化像と周辺組織可視光像とを同時に抽出するものである。これにより、本発明のナノ粒子を蛍光造影剤として投与した人体などの被写体において、ナノ粒子が集積した血管病変の部位における可視光像と、集積したナノ粒子からの赤外光像との合成画像を取得することができる。具体的には、以下のように光源、光学フィルタ、固体撮像素子、及び信号処理回路を含む撮像装置が用いられうる。このような手段を有する蛍光イメージング装置の具体例として、HyperEye Medical System（瑞穂医科工業株式会社製）が挙げられる。

光源は、被写体に対し、可視光と、近赤外蛍光色素Ｂの励起光とを照射するものである。具体的には、可視光を発する可視光発光部と、励起光を発する励起光発光部とを有しうる。可視光発光部としては、例えばキセノンランプや白色ＬＥＤであり、励起光発光部としては、ナノ粒子に包含される近赤外蛍光色素Ｂの励起波長（具体的にはＩＣＧの場合は７８０ｎｍにピーク波長）を有する、ＬＥＤ等の半導体発光デバイスでありうる。
被写体からの光は、レンズ等の光学系を介して撮像装置内に取り込まれ、光学フィルタを介して固体撮影素子に入射する。

光学フィルタは、被写体からの可視光成分と赤外蛍光成分とを分離することなく固体撮像素子に入射させるものである。光学フィルタは、可視光、励起光、及び近赤外光の透過性を独立して制御する。具体的には、被写体からの光のうち、可視光及び赤外蛍光を透過し、励起光の透過を阻止する。さらに、光学フィルタは、可視光発光部及び励起光発光部それぞれの発光強度を個別に制御可能でありうる。このような光学フィルタにおいては、可視光に対する透過率は蛍光に対する透過率より低く設定されることにより、微弱な蛍光による赤外光像を可視光像上にて明瞭に表示することができる。
光学フィルタとしては、例えば真空蒸着法により金属や誘電体を積層して成膜された薄膜が用いられる。

固体撮像素子は、上記光学フィルタの透過光に基づいて可視光像と近赤外光像とを撮影するものである。これにより、可視光と近赤外光との同時撮影が可能になる。具体的には、半導体基板上に、受光画素を構成するモザイク状のカラーフィルタが配置されて構成される。カラーフィルタは、着色した有機材料で構成されている。各カラーフィルタの透過特性に応じて、各受光画素が感度を有する光成分が定まる。各受光画素には、入射光のうち各画素に配置されたカラーフィルタの色に対応する可視光成分に応じた信号電荷と、赤外光成分に応じた信号電荷とが合成されて蓄積される。
蓄積された信号電荷は、信号処理回路に出力される。

信号処理回路は、固体撮像素子から出力された信号を処理するものである。具体的には、上記撮像素子の各受光画素から読み出された信号から、可視光像と近赤外光像とに基づく合成画像を表す画像信号を生成する。生成された合成信号は、表示デバイスに入力及び表示される。具体的には、手術部位の可視光像と、ナノ粒子が集積された位置が、内包される色素Ｂの濃度に応じた色調で構成された赤外光像とが合成された合成画像がモニターに表示される。

本発明のナノ粒子は血管病変部位へ特異的に集積するものであるため、上述の蛍光イメージング手段によって、レーザー照射すべき部位、より具体的にはレーザーで処理すべき範囲とその外縁（切除縁）を正確に確定することが可能である。すなわち、上述の蛍光イメージング手段によって、血管病変部位の正確な診断が可能である。

［２−２．画像データに基づいてレーザー光の照射位置を血管病変に合わせる手段］
レーザー光の照射位置を血管病変に合わせる手段は、レーザー照射装置において、励起用光源によって生じたレーザー光を照射可能な状態でターゲットに向けることを可能とするものである。当業者であれば、このような手段は適宜選択することができる。この手段は、レーザー光の照射位置を血管病変に合わせる操作を手動で行うことができるように、例えばレーザー照射口を有するハンドピースとして体現されうる。或いは、この手段は、ハンドピース、及びハンドピースと励起用光源とを接続する可動部材として体現されうる。

［２−３．レーザー光を照射する手段］
レーザー光を照射する手段は、レーザー照射装置において、レーザー光の発生から照射までを行うことが可能なものである。この手段によって照射されるレーザーの波長は例えば７００〜１０００ｎｍ程度、出力は０．０１〜６０Ｗでありうる。
当業者であれば、このような手段は適宜選択することができる。具体的には、レーザーを生じさせる励起用光源、レーザー導光手段（具体例として光ファイバー）、レーザー集光手段（具体例としてレンズ）などを含む。

例えば、励起用光源は上記のレーザー光の照射位置を血管病変に合わせる手段（好ましくは上述のハンドピース）とは別途設けられることができる。この場合、励起用光源で生じたレーザー光を光ファイバーなどでハンドピースに導光し、ハンドピース内で集光し、ターゲットに向けて照射可能な状態とすることができる。或いは、励起用光源は、ハンドピースに内蔵されていてもよい。

レーザー光を照射する手段のより具体的な例としては、半導体レーザー装置（例えば医用半導体レーザー装置ＵＤＬ−１５（オリンパス株式会社製））が挙げられる。

レーザー光照射により、正確に確定されたレーザー照射部位においてナノ粒子中の近赤外蛍光色素Ｂの光線化学反応を誘発することで、周囲の正常組織へのダメージを最小限に抑えつつ、血管病変部位の選択的切除を行うことができる。

［実験例１：脊椎転移乳癌ラットモデルの作製］
脊椎転移乳癌ラットモデルを、Mantha, et al: J. Neurosurg. Spine, 2005 に記載の方法に準じて作製した。
具体的には、ラット乳癌細胞（CRL-1666）を培養して作成した皮下腫瘍片を、ラット（Fischer 344）のL6椎体に18G針を用いて空けた骨孔内に移植した。

［実験例２：ＩＣＧラクトソームの調製］
以下のように、ポリサルコシン−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマー（PSar₇₀-PLLA₃₀
）とポリ乳酸結合蛍光化合物（ICG-PLLA₃₀）とから構成される蛍光色素内包ナノ粒子（ＩＣＧラクトソームを記載する）を調製した。

［実験例２−１：アミノ化ポリL-乳酸の合成］
本実験例では、Ｌ−ラクチドとＮ−カルボベンゾキシ−１，２−ジアミノエタン塩酸
塩とを用いて、アミノ化ポリL-乳酸（a-PLA）を合成した（スキーム１）。

重合開始剤であるＮ−カルボベンゾキシ−１，２−ジアミノエタン塩酸塩（化合物７）（310 mg, 1.60 mmol）に、オクタン酸スズ（6.91 mg）をトルエン（1.0 ｍL）に拡散させたものを加えた。トルエンを減圧留去した後、Ｌ−ラクチド（化合物６）（3.45 g, 24mmol）を加え、Ar雰囲気下、120 ℃にて重合反応を行った。12時間後、反応容器を室温に空冷した。得られた黄白色固体を少量のクロロホルム（10 mL程度）に溶解させた。クロロホルムを冷メタノール（100 mL）に滴下することにより白色沈殿を得た。得られた白色沈殿は遠心分離により回収し、減圧乾燥した。

得られた白色沈殿（500 mg）のジクロロメタン(1 ml)溶液に25v/v%臭化水素／酢酸（2.0 mL）を加え、遮光、乾燥空気下にて2時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を冷メタノール（100 mL）に滴下し、析出してきた沈殿を遠心分離にて回収した。得られた白色沈殿はクロロホルムに溶解させた後、飽和NaHCO₃水溶液にて洗浄し、無水MgSO₄にて脱水操作を行った。セライト(R)濾過によりMgSO₄を除去した後、真空乾燥することにより、白色のアモルファス状粉末のa-PLA（440 mg）を得た。

［実験例２−２：ポリ乳酸結合蛍光化合物（ICG-PLLA₃₀）の合成］
本実験例では、アミノ化ポリL-乳酸（a-PLA）にICG標識を行い、ポリ乳酸結合蛍光化合物（ICG-PLLA₃₀）を得た（スキーム２）。

a-PLAを1.9 mg (1.0 eq)含むDMF溶液に、インドシアニングリーン誘導体（ICG-sulfo-OSu）1mg (1.3 eq)を溶かしたDMF溶液を加え、室温で約20時間攪拌した。その後、溶媒を減圧留去し、LH20カラムにて精製を行い、化合物ICG-PLLA₃₀を得た。

［実験例２−３：ポリサルコシン−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマー（PSar₇₀-PLLA₃₀）の合成］
本実験例では、サルコシン−NCA（Sar-NCA）とアミノ化ポリL-乳酸（a-PLA）とから、ポリサルコシン−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマー（PSar₇₀-PLLA₃₀）を合成した（スキーム３）。

a-PLA（383 mg, 0.17 mmol）とサルコシン−NCA (Sar-NCA) (3.21 g, 27.9 mmol) に、Ar雰囲気下、ジメチルホルムアミド（DMF）（140 mL）を加え、室温にて12時間攪拌した。反応溶液を0 ℃に冷却した後、グリコール酸（72 mg, 0.95 mmol）、Ｏ−（ベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（HATU）（357 mg, 0.94 mmol）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）（245 μL, 1.4 mmol）を加え、室温にて18時間反応させた。

ロータリーエバポレーターによりDMFを減圧溜去した後、LH20カラムにて精製を行った。UV270 nmにてピークが検出されたフラクションを回収・濃縮した。得られた濃縮溶液を0 ℃にてジエチルエーテル中に滴下し、再沈澱することにより、目的物であるPSar₇₀-PLLA₃₀（1.7 g）を得た。

［実験例２−４：蛍光色素内包ナノ粒子の作成］
キャリア剤であるポリ乳酸−ポリサルコシン両親媒性ブロックポリマー（PSar₇₀-PLLA₃₀・ 26H₂O, MW=7767）及び蛍光色素ICG-PLLA₃₀それぞれのクロロホルム溶液（0.2 mM）を調製した。蛍光色素ICG-PLLA₃₀については、蛍光色素のモル濃度が1.5 mol%(低濃度ＩＣＧラクトソームを調製する場合)もしくは20 mol%(高濃度ＩＣＧラクトソームを調製する場合)となるように、ガラス容器内で両溶液の混合液を調製した。その後、フィルム法に従ってラクトソームを作製した。なお、フィルム法は以下の通り行った。混合液から溶媒を減圧留去しガラス容器の壁面にキャリア剤及び蛍光色素を含むフィルムを形成させた。さらに、フィルムを形成したガラス容器内に、水または緩衝液を加え、温度８２℃で２０分間湯せんした後、室温で３０分間放置し、０．２ｍｍのフィルターでろ過し凍結乾燥した。

［実験例３：ラットモデルへのＩＣＧ（ラクトソームを伴わないＩＣＧ単体）投与］
実験例１によって作製した脊椎転移乳癌ラットモデルに、癌細胞移植６日後、２５ｍｇ／ｍＬのインドシアニングリーン水溶液０．２ｍＬを、尾静脈から投与した。

［実験例４：ラットモデルへのＩＣＧラクトソーム投与］
［実験例４−１：低濃度ＩＣＧラクトソーム投与］
実験例１によって作製した脊椎転移乳癌ラットモデルに、癌細胞移植６日後、１０ｍｇ／ｍＬの低濃度ＩＣＧラクトソーム分散液０．５ｍＬを、尾静脈から投与した。
［実験例４−２：高濃度ＩＣＧラクトソーム投与］
実験例１によって作製した脊椎転移乳癌ラットモデルに、癌細胞移植６日後、５ｍｇ／ｍＬの高濃度ＩＣＧラクトソーム分散液０．１ｍＬを、尾静脈から投与した。

［実験例５：蛍光イメージング］
実験例３及び実験例４−１のラットそれぞれ１検体について、Clairvivo OPT（島津製作所製）（励起：785 nm, 蛍光：845 nm）を用いて蛍光イメージングを行った。その結果を図１（実験例４−１のラットのもの）及び図２（実験例３のラットのもの）に示す。図１に示すように、ＩＣＧラクトソームを全身投与した場合、ＩＣＧラクトソームが癌移植部位に選択的に集積し、選択的イメージングが可能であることが判った。一方、図２に示すように、ＩＣＧのみを全身投与した場合、ＩＣＧは投与後短時間で肝臓へ集積し、その後徐々に腸管から***された。

実験例４−１のラットの１検体（Rat 6）について、癌細胞移植７日後、椎体のみを摘出して（すなわち、椎体の前方にできた骨外腫瘍塊は完全に切除した状態で）イメージングを行った。摘出した椎体の明視野像及び蛍光イメージング像を図３（Rat 6）に示す。図示されるように、ＩＣＧラクトソームが移植部位であるL6椎体に集積したことが確認された。
さらに、上記Rat 6の椎体の断面像を図４（Rat 6）に示す。図示されるように、椎体（Ｂ）の骨梁構造が破壊されて内部が癌細胞に置換されている。脊柱管内へ病変が僅かに伸展（Ｍ）しているが、脊髄（Ｃ）を圧迫するまでには至っていなかったことが確認された。

実験例４−１のラットの他の１検体（Rat 7）について、下肢麻痺出現後、椎体のみを摘出して（すなわち、椎体の前方にできた骨外腫瘍塊は完全に切除した状態で）イメージングを行った。摘出した椎体の明視野像及び蛍光イメージング像を図３（Rat 7）に示す。図示されるように、ＩＣＧラクトソームが移植部位であるL6椎体に集積したことが確認された。
さらに、上記Rat 7の椎体の断面像を図４（Rat 7）に示す。図示されるように、椎体（Ｂ）の骨梁構造の破壊が進行し、脊柱管内への病変が増大（Ｍ）して脊髄（Ｃ）を圧迫していたことが確認された。

［比較例１：レーザー照射のみによる手術］
レーザー群：実験例１によって作製した脊椎転移乳癌ラットモデル（ｎ＝６）を、作製７日後に開腹し、移植部にレーザー照射を行った。

［実施例１：ポリ乳酸結合インドシアニングリーン内包ラクトソーム投与モデルに対するレーザー照射による手術］
ＰＤＴ群：実験例４−１によって作製した低濃度ＩＣＧラクトソーム投与脊椎転移乳癌ラットモデル（ｎ＝６）を、作製７日後に開腹し、移植部にレーザー照射を行った。

ＰＤＴ群：実験例４−２によって作製した高濃度ＩＣＧラクトソーム投与脊椎転移乳癌ラットモデル（ｎ＝６）を、作製７日後に開腹し、移植部にレーザー照射を行った。

［下肢機能の推移］
レーザー（Laser）群及びＰＤＴ群（実験例４−１によって作製した低濃度ＩＣＧラクトソーム投与脊椎転移乳癌ラットモデル）について、下肢運動機能とラット作製後の日数との関係を図５に示す。レーザー照射は１０Ｊ、（１Ｗ、１０秒間）の条件で行った。図中、横軸はラット作製後の日数、縦軸は運動機能評価尺度（ＢＢＢ(Basso, Beattie & Bresnahan)スケール）を示す。図示されるように、ＰＤＴ群ではモデル作製後１３日（治療後６日）以降継続的に下肢運動機能が有意に温存されていた（Wilcoxon signedrank test (p<0.05)）。

レーザー（Laser）群及びＰＤＴ群（実験例４−１によって作製した低濃度ＩＣＧラクトソーム投与脊椎転移乳癌ラットモデル）について、生存率とラット作製後の日数との関係を図６に示す。図中、横軸はラット作製後の日数（観察期間）、縦軸は生存率を示す。図示されるように、ＰＤＴ群では観察期間の有意な延長効果が得られた（Log-rank test (P<0.05)）。なお、平均観察期間はレーザー群で１７．２日、ＰＤＴ群で２１．０日であった。

レーザー（Laser）群、ＰＤＴ−低濃度ＩＣＧラクトソーム群（実験例４−１によって作製した低濃度ＩＣＧラクトソーム投与脊椎転移乳癌ラットモデル）及びＰＤＴ−高濃度ＩＣＧラクトソーム群（実験例４−２によって作製した高濃度ＩＣＧラクトソーム投与脊椎転移乳癌ラットモデル）について別途得られた、下肢運動機能とラット作製後の日数との関係図を図７に示す。レーザー照射は５Ｊ、（０．５Ｗ、１０秒間）の条件で行った。図中、横軸はラット作製後の日数、縦軸は運動機能評価尺度（ＢＢＢ(Basso, Beattie & Bresnahan)スケール）を示す。図示されるように、ＰＤＴ群ではいずれも有意な下肢麻痺遅延効果が示された。高濃度ＩＣＧラクトソームは、ＩＣＧの蛍光が消光しているが、PDT治療には影響しないと考えられる。

［実施例２：ＰＤＴ群−ヒト乳がん細胞に対するin vitroでの光線力学治療］
［組織培養プレートの作成］
９６ウェルプレートに、Leibovitz’s L-15 450 ml、胎仔牛血清（FBS） 50 ml及びペニシリン−ストレプトマイシン 10 mlを含む完全増殖培地を用意し、ＣＯ_２非存在下、３７℃でインキュベートした。
ヒト乳がん細胞MDA-MB-231を、１〜４列×Ａ〜Ｄ行の１６ウェルそれぞれに、2×104cell/100μl/well播種し、２４時間培養した。

［光線力学治療］
培養後、実験例２で調製した高濃度ＩＣＧラクトソーム0.1mgを含むPBSを、組織培養プレートの１ウェルにつき100μl添加し、さらに、近赤外光（810nm）を照射した（照射強度629mW/cm²、照射時間30秒、総照射量18.8J/cm²）。照射には、医療用半導体レーザー装置（オリンパス社製UDL-15）を用いた。

［WST-1アッセイ］
照射直後（０時間後）、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後のそれぞれの時点で、WST-1アッセイを行った。WST-1アッセイにおいては、テトラゾリウム塩 WST-1を10μl/wellずつ添加し、培養器内で１時間インキュベートした。マイクロプレートリーダーで発色色素溶液の吸光度を測定した。具体的には、２〜３列×Ｂ〜Ｃ行の４ウェルにおける平均吸光度を算出（ｎ＝１６）した。なお、照射後２４時間ごとに培地を交換した。

［比較例２：コントロール群］
実施例２と同様に組織培養プレートの作成を作成した。
得られた組織培養プレートに対しては、２４時間ごとに培地を交換することを除いて処置を行わなかった。
実施例２と同じタイミングで同様のWST-1アッセイを行った。

［比較例３：ＩＣＧラクトソーム群］
９６ウェルプレートに、Leibovitz’s L-15 450 ml、胎仔牛血清（FBS） 50 ml、ペニシリン−ストレプトマイシン 10 ml、及び実験例２で調製した高濃度ＩＣＧラクトソーム0.1mgを含む完全増殖培地を用意し、ＣＯ_２非存在下、３７℃でインキュベートした。
ヒト乳がん細胞MDA-MB-231を、１〜４列×Ａ〜Ｄ行の１６ウェルそれぞれに、2×104cell/100μl/well播種し、２４時間培養した。
得られた組織培養プレートに対しては、２４時間ごとに培地を交換することを除いて処置を行わなかった。
実施例２と同じタイミングで同様のWST-1アッセイを行った。

［比較例４：レーザー群］
組織培養プレートのウェルに添加するPBSにＩＣＧラクトソームを含ませないことを除いて、実施例２と同じ操作を行った。

［実施例２と比較例２〜４のとの比較結果］
ＰＤＴ群（実施例２）、コントロール群（比較例２）、ＩＣＧラクトソーム群（比較例３）及びレーザー群（比較例４）におけるWST-1アッセイ時のウェル内の顕微鏡写真（４００倍）を図８に示す。ＰＤＴ群では４８時間以降で細胞数の著明な減少が認められた。

ＰＤＴ群（実施例２）、コントロール群（比較例２）、ＩＣＧラクトソーム群（比較例３）及びレーザー群（比較例４）におけるWST-1アッセイの結果を図９に示す。Tukey-Kramer法で多重比較検定を行った。図中のアスタリスクは、ｐ値が０．０１より小さいことすなわち統計的有意差があることを示し、n.sは、統計的有意差がないことを示す。ＰＤＴ群（実施例２）においては、４８時間後、７２時間後、及び９６時間後において、レーザー群（比較例４）と統計学的有意差を認めた。コントロール群（比較例２）、ＩＣＧラクトソーム群（比較例３）及びレーザー群（比較例４）の間に、どの時間帯でも統計学的有意差が認められなかった。

Claims

２０個以上のサルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と、１０個以上の乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーＡ１、及び７００〜１０００ｎｍの波長のレーザー光の照射により細胞毒性を生じさせる近赤外蛍光色素Ｂを含む光線力学治療用ナノ粒子であって、
前記近赤外蛍光色素Ｂが、１０個以上の乳酸単位と、近赤外蛍光基とを少なくとも有する近赤外蛍光標識ポリマーＢ１であり、且つ、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１とともに自己集合することにより分子集合体を形成しているものである、光線力学治療用ナノ粒子。
前記近赤外蛍光色素Ｂが、前記レーザー光による励起により生じた活性酸素による自己酸化によって、細胞毒性を有する分解物を与えるものである、請求項１に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
前記近赤外蛍光標識ポリマーＢ１における近赤外蛍光基が、下記式（I）：
（式中、Ｒ_１は、置換されていてもよい炭化水素基であり、Ｒ_２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基であり；Ｒ_３及びＲ_３’は、水素であるか、又はそれらが互いに連結して環状構造を形成するものであり；Ｘは水素又はハロゲンであり；Ａ⁻は陰イオンであり、ｍは０又は１であり；環Ｂ及び環Ｄは、それぞれ同一又は異なっていてもよい含窒素縮合芳香族複素環である。）で示されるものである、請求項１又は２に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
前記近赤外蛍光標識ポリマーＢ１における近赤外蛍光基がインドシアニングリーンに由来する基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
前記ナノ粒子が、１０個以上の乳酸単位を少なくとも有する疎水性ポリマーＡ２をさらに含むものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
２０個以上のサルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と、１０個以上の乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーＡ１、１０個以上の乳酸単位を少なくとも有する疎水性ポリマーＡ２、及び７００〜１０００ｎｍの波長のレーザー光の照射により細胞毒性を生じさせる近赤外蛍光色素Ｂを含む光線力学治療用ナノ粒子であって、
前記近赤外蛍光色素Ｂが、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１の自己集合により形成された分子集合体に内包された近赤外蛍光分子Ｂ２である、光線力学治療用ナノ粒子。
前記近赤外蛍光分子Ｂ２が、下記式（I’）：
（式中、Ｒ_１及びＲ_２’は、それぞれ、同一又は異なっていてもよく、置換されていてもよい炭化水素基であり；Ｒ_３及びＲ_３’は、水素であるか、又はそれらが互いに連結して環状構造を形成するものであり；Ｘはハロゲンであり；Ａ⁻は陰イオンであり、ｍは０又は１であり；環Ｂ及び環Ｄは、同一又は異なっていてもよい含窒素縮合芳香族複素環である。）で示されるシアニン化合物である、請求項６に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
前記近赤外蛍光分子Ｂ２がインドシアニングリーン分子である、請求項６又は７に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
前記ナノ粒子が、２０〜２００ｎｍの粒子径を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
前記近赤外蛍光色素Ｂの濃度が、前記ナノ粒子を構成するポリマー及び前記赤外蛍光色素Ｂの合計に対し０．１〜５０ｍｏｌ％である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
骨又は脊椎に存在する血管病変を治療するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
ヒト乳がん細胞を治療するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の光線力学治療用ナノ粒子。