JP5875578B2 - 光線力学治療用ナノ粒子 - Google Patents
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Description
ポリ乳酸を疎水性ブロックとする両親媒性ブロックポリマーの分子集合体(ラクトソーム)をキャリアとし、蛍光色素を内包したナノ粒子が開発されている(特許文献1)。ラクトソームは、腫瘍組織周辺の未成熟な血管組織から漏れ出ること(EPR(Enhanced Permeability and Retention)効果)により、腫瘍細胞に集積することができる。
脊椎は悪性腫瘍の骨転移の中でも好発部位である。ガンの骨転移は、癌性疼痛、病的骨折、神経圧迫などによる歩行障害や排尿・***障害を引き起こし、末期癌患者の生活の質(QOL)を著しく低下させる。
転移性骨腫瘍の治療法としては、脊椎の不安定性や脊髄圧迫による麻痺が発生している場合には外科的摘出が検討される。
転移性脊椎腫瘍に対する低侵襲の手術方法としては、主に疼痛緩和のために転移椎体へのセメント注入やラジオ波照射などが臨床応用されている。
一方、転移性脊椎腫瘍の手術にはレーザーは臨床応用されていない。
早期肺癌の治療法として、腫瘍に取り込まれる発光物質(例えばポルフィリン誘導体)を事前に注入し、手術中に腫瘍範囲を同定し、腫瘍に取り込まれた発光物質の発光部位をレーザー照射することにより、腫瘍取り残しを最小限とする試みが臨床応用されている。
インドシアニングリーンが、光酸化を受けることによってヒト大腸癌細胞に対する細胞毒性を呈することが報告されている(非特許文献2)。
また、インドシアニングリーンが、近赤外光によって励起されて一重項酸素を発生し、この一重項酸素によりインドシアニングリーンが分解され、得られた分解物がブタ網膜色素上皮細胞に対する細胞毒性を呈することが報告されている(非特許文献3)。
さらに、インドシアニングリーンが、ヒト乳がん細胞に対する細胞毒性を呈することが報告されている(非特許文献4)。
(1) 20個以上のサルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と、10個以上の乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーA1、及びレーザー照射により細胞毒性を生じさせる近赤外蛍光色素Bを含む光線力学治療用ナノ粒子。
前記近赤外蛍光色素Bが、前記レーザー光による励起により生じた活性酸素による自己酸化によって、細胞毒性を有する分解物を与えるものである、(1)に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
前記近赤外蛍光色素Bが、10個以上の乳酸単位と、近赤外蛍光基とを少なくとも有する近赤外蛍光標識ポリマーB1であり、且つ、前記両親媒性ブロックポリマーA1とともに自己集合することにより分子集合体を形成している、(1)又は(2)に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
(4)
前記近赤外蛍光標識ポリマーB1における近赤外蛍光基が、下記式(I):
前記近赤外蛍光標識ポリマーB1における近赤外蛍光基がインドシアニングリーンに由来する基である、(3)又は(4)に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
前記近赤外蛍光色素Bが、前記両親媒性ブロックポリマーA1の自己集合により形成された分子集合体に内包された近赤外蛍光分子B2である、(1)又は(2)に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
(7)
前記近赤外蛍光分子B2が、下記式(I’):
前記近赤外蛍光分子B2がインドシアニングリーン分子である、(6)又は(7)に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
前記ナノ粒子が、10個以上の乳酸単位を少なくとも有する疎水性ポリマーA2をさらに含むものである、(1)〜(8)のいずれかに記載の光線力学治療用ナノ粒子。
前記ナノ粒子が、20〜200nmの粒子径を有する、(1)〜(9)のいずれかに記載の光線力学治療用ナノ粒子。
(11)
前記近赤外蛍光色素Bの濃度が、前記ナノ粒子を構成するポリマー及び前記赤外蛍光色素Bの合計に対し0.1〜50mol%である、(1)〜(10)のいずれかに記載の光線力学治療用ナノ粒子。
上記(11)において、ナノ粒子を構成するポリマー及び赤外蛍光色素Bの合計とは、ポリマーA1及び色素Bの合計、又はポリマーA1、ポリマーA2及び色素Bの合計である。
(12)
骨又は脊椎に存在する血管病変を治療するための、(1)〜(11)のいずれかに記載の光線力学治療用ナノ粒子。
(13)
ヒト乳がん細胞を治療するための、(1)〜(12)のいずれかに記載の光線力学治療用ナノ粒子。
20個以上のサルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と、10個以上の乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーA1、及び近赤外蛍光色素Bを含むナノ粒子であって、レーザー光による前記近赤外蛍光色素Bの励起により活性酸素を生じるナノ粒子と、
血管病変の位置を示す画像データを取得するための手段、画像データに基づいてレーザー光の照射位置を血管病変に合わせる手段、及びナノ粒子に対してレーザー光を照射する手段を備えた装置と
を有する、血管病変の光線力学治療システム。
本発明におけるナノ粒子は、少なくとも両親媒性ブロックポリマーA1の凝集により、或いは自己集合的な配向会合により成り立つ分子集合体(ラクトソーム)をキャリア剤とする、近赤外蛍光色素Bを有する構造体である。
本発明の両親媒性ブロックポリマーA1は、以下の親水性ブロック及び疎水性ブロックを有する。両親媒性ブロックポリマーA1は、ナノ粒子のキャリア剤となる分子集合体の基本的要素である。両親媒性ブロックポリマーA1は、下記の1種又は複数種を組み合わせて用いることができる。以下、本発明において、用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及びそれらの修飾及び/又は化学的変更による誘導体を含む概念で用いる。さらに、本明細書において、アミノ酸は、α−、β−、γ−アミノ酸を含む。好ましくは、αアミノ酸である。
本発明において、親水性ブロック鎖が有する「親水性」という物性の具体的な程度としては、特に限定されるものではないが、少なくとも、親水性ブロック鎖が、後述の特定の疎水性ブロック鎖に対して、相対的に親水性が強い領域であり、当該親水性ブロック鎖が当該疎水性ブロック鎖とコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の親水性を有していれば良い。或いは、当該両親媒性ブロックポリマーが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、好ましくは粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の親水性を有していれば良い。
サルコシン単位以外の構成単位を有する場合、そのような構成単位としては特に限定されないが、例えばサルコシン単位以外のアミノ酸(親水性アミノ酸及びその他のアミノ酸を含む)単位やアルキレンオキシド単位が挙げられる。そのようなアミノ酸単位の例としては、好ましくは、αアミノ酸である。例えば、セリン、スレオニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。アルキレンオキシド単位の例としては、具体的には、エチレンオキシド単位(ポリエチレングリコール単位)、プロピレンオキシド単位(プロピレングリコール)などが挙げられる。また、アルキレンオキシド単位においては、水素が置換されていてもよい。
本発明において、疎水性ブロック鎖が有する「疎水性」という物性の具体的な程度としては、特に限定されるものではないが、少なくとも、疎水性ブロック鎖が、上記の親水性ブロック鎖に対して、相対的に疎水性が強い領域であり、当該親水性ブロック鎖とコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の疎水性を有していれば良い。或いは、当該両親媒性ブロックポリマーが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、好ましくは粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の疎水性を有していれば良い。
また、ポリ乳酸は、優れた生分解性を有することから代謝が早く、生体内において血管病変以外への組織への集積性が低い。このため、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体は、血管病変への特異的な集積性という点で非常に有用である。
そして、ポリ乳酸は、低沸点溶媒への溶解性に優れるものであることから、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から分子集合体を得る際に、有害な高沸点溶媒の使用を回避することが可能である。このため、このような分子集合体は、生体への安全性という点で非常に有用である。
さらに、ポリ乳酸の鎖長を調整することは、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体の形状制御及び大きさ制御の一要因として寄与する点で好ましい。このため、このような構成ブロックを用いることは、得られる分子集合体形状の用途性に優れるという点で非常に有用である。
疎水性ブロック鎖において、乳酸単位以外の構成単位を有する場合も、これらの優れた諸特性を有するように分子設計することが好ましい。
例えば、疎水性ブロック鎖における当該乳酸単位が、L−乳酸単位のみで構成されてもよいし、D−乳酸単位のみで構成されてもよいし、L−乳酸単位とD−乳酸単位との両者から構成されてもよい。疎水性ブロック鎖は、上記例示のものから選ばれた1種が単独で使用されてもよいし、複数種が組み合わされて使用されてもよい。
近赤外蛍光色素Bは、キャリア剤に内包される要素である。具体的には、ポリマーに近赤外蛍光基が結合した態様を有するもの(近赤外蛍光標識ポリマーB1)及び近赤外蛍光分子そのもの(近赤外蛍光分子B2)から選ばれる。
近赤外蛍光標識ポリマーB1は、以下の標識部及びポリマー部を少なくとも有する。近赤外蛍光標識ポリマーB1は、上記両親媒性ブロックポリマーA1とともに自己集合により分子集合体を形成することができる要素である。近赤外蛍光標識ポリマーB1は、下記の1種又は複数種を組み合わせて使用することができる。
標識部は、本発明の近赤外蛍光色素Bに上述の特性を付与する部分であり、具体的には、近赤外蛍光分子に由来する基(近赤外蛍光基)である。例えば、シアニン系蛍光分子や量子ドットなどに由来する基が用いられる。シアニン系色素に由来する基は、レーザー光により励起されて生じた活性酸素によって、自らのオレフィン性二重結合部分で酸化され、ジオキセタン中間体を経て、細胞毒性を有するアルデヒドなどのカルボニル化合物に分解される。シアニン系色素に由来する基の一例は、以下の一般式(I)で表される。
R1における炭化水素基は、炭素数1〜20、好ましくは炭素数2〜5のアルキル基でありうる。
R2における炭化水素基は、炭素数1〜20、好ましくは炭素数2〜5のアルキレン基でありうる。
R1及びR2における置換基は、アニオン性であってもよい置換基であり、カルボキシル基、カルボキシレート基、金属カルボキシレート基、スルホニル基、スルホネート基、金属スルホネート基、又は水酸基でありうる。前記金属は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属でありうる。
A−は陰イオンであり、mは0又は1である。mが0の場合、R1及びR2のいずれか一方がアニオン性基であり、分子全体としてベタイン構造をとる。mが1の場合、A−は、Cl−、Br−、I−等のハロゲンイオン、CIO4 −、BF4 −、PF6 −、SbF6 −、SCN−等でありうる。
環Bの好ましい態様としては、以下に示す構造が挙げられる。
ポリマー部は、複数の乳酸単位を有する。例えば、乳酸単位を主たる構成成分とするもの(すなわちポリ乳酸基)であってもよいし、乳酸単位を疎水性ブロックとし、さらにそれに対する親水性ブロックを有するもの(すなわち両親媒性ブロックポリマー基)であってもよい。本発明における分子集合体は、生体適合性、安定性及び生分解性に優れ、構成ポリマーが低沸点溶媒への溶解性に優れるという諸特性を有するものであることが好ましい。従って、ポリマー部の構成は、これらの優れた諸特性を有するように分子設計されることが好ましい。
近赤外蛍光分子B2は、上記両親媒性ブロックポリマーA1を基礎的要素とする分子集合体に内包されることができる要素である。
近赤外蛍光分子B2は、例えば、シアニン系蛍光分子や量子ドットなどが用いられる。シアニン系蛍光分子は、シアニン系蛍光分子は、レーザー光により励起されて生じた活性酸素によって、自らのオレフィン性二重結合部分で酸化され、ジオキセタン中間体を経て、細胞毒性を有するアルデヒドなどのカルボニル化合物に分解される。シアニン系蛍光分子の一例は、以下の一般式(I’)で表される。
上記式(I’)中、R1及びR2’は、それぞれ、同一又は異なっていてもよく、置換されていてもよい炭化水素基である。
R1及びR2’における炭化水素基は、炭素数1〜20、好ましくは炭素数2〜5のアルキル基でありうる。R1及びR2’における置換基は、アニオン性であってもよい置換基であり、カルボキシル基、カルボキシレート基、金属カルボキシレート基、スルホニル基、スルホネート基、金属スルホネート基、又は水酸基でありうる。前記金属は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属でありうる。
A−は陰イオンであり、mは0又は1である。mが0の場合、R1及びR2のいずれか一方がアニオン性基であり、分子全体としてベタイン構造をとる。mが1の場合、A−は、Cl−、Br−、I−等のハロゲンイオン、CIO4 −、BF4 −、PF6 −、SbF6 −、SCN−等でありうる。
環Bの好ましい態様としては、以下に示す構造が挙げられる。
’)、及び、環Bが含窒素三環式芳香族複素環、環Cが含窒素二環式芳香族複素環であるIC7−2(VIII’)の構造式を以下に示す。
近赤外蛍光色素Bの濃度は、ナノ粒子を構成するポリマー及び前記赤外蛍光色素Bの合計に対し、例えば、0.1〜50mol%、又は0.5〜20mol%でありうる。また、上記範囲の下限は、1mol%、5mol%又は10mol%であってもよい。上記範囲の上限は、10mol%、5mol%又は1mol%であってもよい。
本発明においては、分子集合体はさらに疎水性ポリマーA2を含むことができる。
10以上の乳酸単位を少なくとも有する疎水性ポリマーである。好ましくは、疎水性ポリマーA2は、15個以上の乳酸単位を少なくとも有する。ここで、疎水性ポリマーA2が有する「疎水性」という物性の具体的な程度としては特に限定されるものではないが、少なくとも、上記の両親媒性ポリマーA1の親水性ブロックに対して、相対的に疎水性が強い。
疎水性ポリマーA2の構成単位や鎖長は、基本的に、上述の両親媒性ブロックポリマーA1における疎水性ブロック鎖や、近赤外蛍光標識ポリマーB1におけるポリマー部の分子設計における場合と同様の観点で決定することができる。このようにすることによって、分子集合体において、疎水性ポリマーA2と、両親媒性ブロックポリマーA1の疎水性ブロック鎖及び/又は近赤外蛍光標識ポリマーB1におけるポリマー部との親和性に優れるという効果も得られる。
[1−4−1.ナノ粒子の大きさ]
本発明のナノ粒子の大きさは、例えば粒子径10〜500nm、好ましくは20〜200nm である。ここで「粒子径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒径、すなわち中心粒径をいう。粒子径が10nmより小さいものは作成が難しく、500nmより大きいものは、特に生体内へ注射により投与する場合に、注射剤として好ましくない場合がある。
本発明のナノ粒子の大きさを測定するための方法は特に限定されるものではなく、当業者によって適宜選択されるものである。例えば、透過型電子顕微鏡(Transmission Electron Microscope;TEM)による観察法や、動的光散乱(Dynamic Light Scattering;DLS)法などが挙げられる。DLS法においては、溶液中でブラウン運動している粒子の移動拡散係数を測定する。
分子集合体の大きさを制御する手段の例として、両親媒性ブロックポリマーA1の鎖長を制御することが挙げられる。好ましくは、両親媒性ブロックポリマーA1における疎水性ブロックの重合度を調整することができる。
他の例においては、近赤外蛍光色素Bとしての近赤外蛍光標識ポリマーB1のポリマー部や、疎水性ポリマーA2の重合度を調整することができる。
さらなる他の例においては、疎水性ポリマーA2の配合量を制御することができる。疎水性ポリマーA2は、分子集合体の疎水性コアを増大させる効果がある。しかも、その配合量を調整することにより、分子集合体の大きさの連続的制御を可能にする。従って、この手段は、ラクトソームの微妙な大きさの調整ができる点で好ましい。
ナノ粒子の作成法は特に限定されず、所望するナノ粒子の大きさ、特性、担持させる近赤外蛍光色素Bの種類、性質、含有量などに応じて、当業者が適宜選択することができる。必要に応じ、下記のようにナノ粒子を形成した後に、得られたナノ粒子に対して、公知の方法によって表面修飾を行っても良い。
なお、粒子が形成されたことの確認は、電子顕微鏡観察によって行うと良い。
フィルム法は、リポソームの調製に用いられていた方法である。本発明における両親媒性ブロックポリマーは低沸点溶媒への溶解性を有するため、この方法を用いたナノ粒子の調製が可能である。
フィルム法は、次の工程を含む。すなわち、容器(例えばガラス容器)中に、両親媒性ブロックポリマーA1、疎水性ポリマーA2等分子集合体を構成するポリマーと近赤外蛍光色素Bとを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程;前記溶液から前記有機溶媒を除去し、前記容器の内壁にポリマーと近赤外蛍光色素Bとを含むフィルムを得る工程;及び、前記容器中に水又は水溶液を加え、超音波処理又は加温処理を行い、前記フィルム状物質を、近赤外蛍光色素Bを内包する分子集合体に変換してナノ粒子の分散液を得る工程、を含む。さらに、フィルム法は、前記のナノ粒子の分散液を凍結乾燥処理に供する工程を含んでも良い。
分子集合体を構成するポリマー及び近赤外蛍光色素Bの溶解にこのような低沸点溶媒を使用することによって、溶媒の除去が非常に簡単になる。溶媒の除去の方法としては特に限定されることなく、使用する有機溶媒の沸点などに応じ、当業者が適宜決定すればよい。例えば、減圧下における溶媒除去を行ってもよいし、自然乾燥による溶媒除去を行ってもよい。
一方、得られた分散液を凍結乾燥処理しても良い。凍結乾燥処理の方法としては公知の方法を特に限定されることなく用いることができる。たとえば、上記のようにして得られたナノ粒子の分散液を液体窒素などによって凍結させ、減圧下で昇華させることによって行うことができる。これにより、ナノ粒子の凍結乾燥処理物が得られる。すなわち、ナノ粒子を凍結乾燥処理物として保存することが可能になる。必要に応じ、この凍結乾燥物に水又は水溶液を加えて、ナノ粒子の分散液を得ることによって、ナノ粒子を使用に供することができる。水又は水溶液としては特に限定されることなく、生化学的、薬学的に許容することができるものを当業者が適宜選択すればよい。例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。
インジェクション法は、本発明のナノ粒子に限らず、他の多くのナノ粒子の調製に用いられる方法である。この方法においては、有機溶媒、例えばトリフルオロエタノール、エタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどに、分子集合体を構成するポリマーと近赤外蛍光色素Bとを溶解し、得られた溶液を、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などの水系溶媒に分散させ、精製処理、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、フィルタリング、超遠心などの処理を行った後、有機溶媒を除去することによってナノ粒子を調製することができる。このようにして得られたナノ粒子を生体内へ投与する場合であって、有機溶媒に生体に有害なものを用いた場合は、この有機溶媒の除去を厳密に行う必要がある。
ナノ粒子を投与される生体としては特に限定されず、ヒト及び非ヒト動物でありうる。非ヒト動物としては特に限定されないが、ヒト以外の哺乳類、より具体的には、霊長類、齧歯類(マウス、ラットなど)、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びウマなどが挙げられる。
生体内への投与の方法としては特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。従って、投与の方法としては、全身投与及び局所投与とを問わない。すなわち、分子プローブの投与は、注射(針有型、針無型)、内服、外用のいずれの方法によっても行うことができる。投与液中におけるナノ粒子の濃度は、例えば内包物がICG-PLLA30でありキャリアがPSar70-PLLA30の分子集合体であるラクトソームの場合の量に換算して0.5〜100mg/ml、好ましくは0.8〜50mg/ml、より好ましくは1〜20mg/mlでありうる。
ナノ粒子と組み合わされる装置は、蛍光イメージング手段とレーザー照射手段とを有する。
蛍光イメージング手段は、すなわち、血管病変の位置を示す画像データを取得するための手段である。レーザー照射手段は、すなわち、画像データに基づいてレーザー光の照射位置を血管病変に合わせる手段と、ナノ粒子に対してレーザー光を照射する手段と、を含むものである。
本発明のナノ粒子によって構築されるシステムにおける蛍光イメージング手段、すなわち血管病変の位置を示す画像データを取得するための手段としては、人体などの被写体に投与されたナノ粒子に含まれる近赤外蛍光色素Bに由来する近赤外光を検出し、ナノ粒子が存在する組織の位置や大きさを観測することができるものであればよい。従って、当業者であれば、ナノ粒子に含まれる近赤外蛍光色素Bに由来する近赤外光を可視化することができる手段を適宜選択することができる。
被写体からの光は、レンズ等の光学系を介して撮像装置内に取り込まれ、光学フィルタを介して固体撮影素子に入射する。
光学フィルタとしては、例えば真空蒸着法により金属や誘電体を積層して成膜された薄膜が用いられる。
蓄積された信号電荷は、信号処理回路に出力される。
レーザー光の照射位置を血管病変に合わせる手段は、レーザー照射装置において、励起用光源によって生じたレーザー光を照射可能な状態でターゲットに向けることを可能とするものである。当業者であれば、このような手段は適宜選択することができる。この手段は、レーザー光の照射位置を血管病変に合わせる操作を手動で行うことができるように、例えばレーザー照射口を有するハンドピースとして体現されうる。或いは、この手段は、ハンドピース、及びハンドピースと励起用光源とを接続する可動部材として体現されうる。
レーザー光を照射する手段は、レーザー照射装置において、レーザー光の発生から照射までを行うことが可能なものである。この手段によって照射されるレーザーの波長は例えば700〜1000nm程度、出力は0.01〜60Wでありうる。
当業者であれば、このような手段は適宜選択することができる。具体的には、レーザーを生じさせる励起用光源、レーザー導光手段(具体例として光ファイバー)、レーザー集光手段(具体例としてレンズ)などを含む。
脊椎転移乳癌ラットモデルを、Mantha, et al: J. Neurosurg. Spine, 2005 に記載の方法に準じて作製した。
具体的には、ラット乳癌細胞(CRL-1666)を培養して作成した皮下腫瘍片を、ラット(Fischer 344)のL6椎体に18G針を用いて空けた骨孔内に移植した。
以下のように、ポリサルコシン−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマー(PSar70-PLLA30
)とポリ乳酸結合蛍光化合物(ICG-PLLA30)とから構成される蛍光色素内包ナノ粒子(ICGラクトソームを記載する)を調製した。
本実験例では、L−ラクチドとN−カルボベンゾキシ−1,2−ジアミノエタン塩酸
塩とを用いて、アミノ化ポリL-乳酸(a-PLA)を合成した(スキーム1)。
本実験例では、アミノ化ポリL-乳酸(a-PLA)にICG標識を行い、ポリ乳酸結合蛍光化合物(ICG-PLLA30)を得た(スキーム2)。
本実験例では、サルコシン−NCA(Sar-NCA)とアミノ化ポリL-乳酸(a-PLA)とから、ポリサルコシン−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマー(PSar70-PLLA30)を合成した(スキーム3)。
キャリア剤であるポリ乳酸−ポリサルコシン両親媒性ブロックポリマー(PSar70-PLLA30・ 26H2O, MW=7767)及び蛍光色素ICG-PLLA30それぞれのクロロホルム溶液(0.2 mM)を調製した。蛍光色素ICG-PLLA30については、蛍光色素のモル濃度が1.5 mol%(低濃度ICGラクトソームを調製する場合)もしくは20 mol%(高濃度ICGラクトソームを調製する場合)となるように、ガラス容器内で両溶液の混合液を調製した。その後、フィルム法に従ってラクトソームを作製した。なお、フィルム法は以下の通り行った。混合液から溶媒を減圧留去しガラス容器の壁面にキャリア剤及び蛍光色素を含むフィルムを形成させた。さらに、フィルムを形成したガラス容器内に、水または緩衝液を加え、温度82℃で20分間湯せんした後、室温で30分間放置し、0.2mmのフィルターでろ過し凍結乾燥した。
実験例1によって作製した脊椎転移乳癌ラットモデルに、癌細胞移植6日後、25mg/mLのインドシアニングリーン水溶液0.2mLを、尾静脈から投与した。
[実験例4−1:低濃度ICGラクトソーム投与]
実験例1によって作製した脊椎転移乳癌ラットモデルに、癌細胞移植6日後、10mg/mLの低濃度ICGラクトソーム分散液0.5mLを、尾静脈から投与した。
[実験例4−2:高濃度ICGラクトソーム投与]
実験例1によって作製した脊椎転移乳癌ラットモデルに、癌細胞移植6日後、5mg/mLの高濃度ICGラクトソーム分散液0.1mLを、尾静脈から投与した。
実験例3及び実験例4−1のラットそれぞれ1検体について、Clairvivo OPT(島津製作所製)(励起:785 nm, 蛍光:845 nm)を用いて蛍光イメージングを行った。その結果を図1(実験例4−1のラットのもの)及び図2(実験例3のラットのもの)に示す。図1に示すように、ICGラクトソームを全身投与した場合、ICGラクトソームが癌移植部位に選択的に集積し、選択的イメージングが可能であることが判った。一方、図2に示すように、ICGのみを全身投与した場合、ICGは投与後短時間で肝臓へ集積し、その後徐々に腸管から***された。
さらに、上記Rat 6の椎体の断面像を図4(Rat 6)に示す。図示されるように、椎体(B)の骨梁構造が破壊されて内部が癌細胞に置換されている。脊柱管内へ病変が僅かに伸展(M)しているが、脊髄(C)を圧迫するまでには至っていなかったことが確認された。
さらに、上記Rat 7の椎体の断面像を図4(Rat 7)に示す。図示されるように、椎体(B)の骨梁構造の破壊が進行し、脊柱管内への病変が増大(M)して脊髄(C)を圧迫していたことが確認された。
レーザー群:実験例1によって作製した脊椎転移乳癌ラットモデル(n=6)を、作製7日後に開腹し、移植部にレーザー照射を行った。
PDT群:実験例4−1によって作製した低濃度ICGラクトソーム投与脊椎転移乳癌ラットモデル(n=6)を、作製7日後に開腹し、移植部にレーザー照射を行った。
レーザー(Laser)群及びPDT群(実験例4−1によって作製した低濃度ICGラクトソーム投与脊椎転移乳癌ラットモデル)について、下肢運動機能とラット作製後の日数との関係を図5に示す。レーザー照射は10J、(1W、10秒間)の条件で行った。図中、横軸はラット作製後の日数、縦軸は運動機能評価尺度(BBB(Basso, Beattie & Bresnahan)スケール)を示す。図示されるように、PDT群ではモデル作製後13日(治療後6日)以降継続的に下肢運動機能が有意に温存されていた(Wilcoxon signedrank test (p<0.05))。
[組織培養プレートの作成]
96ウェルプレートに、Leibovitz’s L-15 450 ml、胎仔牛血清(FBS) 50 ml及びペニシリン−ストレプトマイシン 10 mlを含む完全増殖培地を用意し、CO2非存在下、37℃でインキュベートした。
ヒト乳がん細胞MDA-MB-231を、1〜4列×A〜D行の16ウェルそれぞれに、2×104cell/100μl/well播種し、24時間培養した。
培養後、実験例2で調製した高濃度ICGラクトソーム0.1mgを含むPBSを、組織培養プレートの1ウェルにつき100μl添加し、さらに、近赤外光(810nm)を照射した(照射強度629mW/cm2、照射時間30秒、総照射量18.8J/cm2)。照射には、医療用半導体レーザー装置(オリンパス社製UDL-15)を用いた。
照射直後(0時間後)、24時間後、48時間後、72時間後、96時間後のそれぞれの時点で、WST-1アッセイを行った。WST-1アッセイにおいては、テトラゾリウム塩 WST-1を10μl/wellずつ添加し、培養器内で1時間インキュベートした。マイクロプレートリーダーで発色色素溶液の吸光度を測定した。具体的には、2〜3列×B〜C行の4ウェルにおける平均吸光度を算出(n=16)した。なお、照射後24時間ごとに培地を交換した。
実施例2と同様に組織培養プレートの作成を作成した。
得られた組織培養プレートに対しては、24時間ごとに培地を交換することを除いて処置を行わなかった。
実施例2と同じタイミングで同様のWST-1アッセイを行った。
96ウェルプレートに、Leibovitz’s L-15 450 ml、胎仔牛血清(FBS) 50 ml、ペニシリン−ストレプトマイシン 10 ml、及び実験例2で調製した高濃度ICGラクトソーム0.1mgを含む完全増殖培地を用意し、CO2非存在下、37℃でインキュベートした。
ヒト乳がん細胞MDA-MB-231を、1〜4列×A〜D行の16ウェルそれぞれに、2×104cell/100μl/well播種し、24時間培養した。
得られた組織培養プレートに対しては、24時間ごとに培地を交換することを除いて処置を行わなかった。
実施例2と同じタイミングで同様のWST-1アッセイを行った。
組織培養プレートのウェルに添加するPBSにICGラクトソームを含ませないことを除いて、実施例2と同じ操作を行った。
PDT群(実施例2)、コントロール群(比較例2)、ICGラクトソーム群(比較例3)及びレーザー群(比較例4)におけるWST-1アッセイ時のウェル内の顕微鏡写真(400倍)を図8に示す。PDT群では48時間以降で細胞数の著明な減少が認められた。
Claims (12)
- 20個以上のサルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と、10個以上の乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーA1、及び700〜1000nmの波長のレーザー光の照射により細胞毒性を生じさせる近赤外蛍光色素Bを含む光線力学治療用ナノ粒子であって、
前記近赤外蛍光色素Bが、10個以上の乳酸単位と、近赤外蛍光基とを少なくとも有する近赤外蛍光標識ポリマーB1であり、且つ、前記両親媒性ブロックポリマーA1とともに自己集合することにより分子集合体を形成しているものである、光線力学治療用ナノ粒子。 - 前記近赤外蛍光色素Bが、前記レーザー光による励起により生じた活性酸素による自己酸化によって、細胞毒性を有する分解物を与えるものである、請求項1に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
- 前記近赤外蛍光標識ポリマーB1における近赤外蛍光基が、下記式(I):
- 前記近赤外蛍光標識ポリマーB1における近赤外蛍光基がインドシアニングリーンに由来する基である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
- 前記ナノ粒子が、10個以上の乳酸単位を少なくとも有する疎水性ポリマーA2をさらに含むものである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
- 20個以上のサルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と、10個以上の乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーA1、10個以上の乳酸単位を少なくとも有する疎水性ポリマーA2、及び700〜1000nmの波長のレーザー光の照射により細胞毒性を生じさせる近赤外蛍光色素Bを含む光線力学治療用ナノ粒子であって、
前記近赤外蛍光色素Bが、前記両親媒性ブロックポリマーA1の自己集合により形成された分子集合体に内包された近赤外蛍光分子B2である、光線力学治療用ナノ粒子。 - 前記近赤外蛍光分子B2が、下記式(I’):
- 前記近赤外蛍光分子B2がインドシアニングリーン分子である、請求項6又は7に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
- 前記ナノ粒子が、20〜200nmの粒子径を有する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
- 前記近赤外蛍光色素Bの濃度が、前記ナノ粒子を構成するポリマー及び前記赤外蛍光色素Bの合計に対し0.1〜50mol%である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
- 骨又は脊椎に存在する血管病変を治療するための、請求項1〜10のいずれか1項に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
- ヒト乳がん細胞を治療するための、請求項1〜11のいずれか1項に記載の光線力学治療用ナノ粒子。
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