JP5871448B2 - オリゴヌクレオチド - Google Patents
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Description
N-アセチルトランスフェラーゼ2 X14672
第V因子Leiden AY364535
第II因子 AF493953
MTHFR NM_005957
鎌状赤血球貧血症 AY356351
トラコーマクラミジア X07547
アデノウイルス AJ293905
A型インフルエンザ AY130766
肺炎連鎖球菌 X52474
MRSA AJ810121
a)温度に対する蛍光シグナル強度の負の導関数(-dF/dT)のグラフを温度に対して作るために、蛍光シグナルを連続的に観察しながらハイブリッドを含有する溶液の温度をゆっくりと上げる。ハイブリッドの融解温度(Tm)はピークとして現れ、ポリヌクレオチド標的の配列についての情報を与える。本発明のオリゴヌクレオチドの融解分析により得られたTmを使用して、多型性標的を識別することができる。同様に、その溶液を高温からゆっくりと冷却し、アニーリング温度を決定することにより分析を行うことができる。
b)ハイブリッドの溶液を所定の温度に保ち、蛍光のレベルを観察した。一般に、所定の温度は、完全にマッチしたハイブリッドの融解温度と1つまたは2つのミスマッチを有するハイブリッドの融解温度との中間になるように選択される。観察された蛍光シグナルのレベルは、ハイブリッドが解離したか、していないかを示し、それでポリヌクレオチド標的の配列についての情報を与える。多型性標的はエンドポイント形式およびリアルタイム形式で識別することができる。
オリゴヌクレオチドプローブの設計および合成
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、典型的には長さ約18〜25ヌクレオチドに設計されているか、または完全に相補的な標的配列にハイブリダイズしたときに約55〜60℃のTmを有する。蛍光体は、C6 FAM dU(サウサンプトン大学、英国)またはフルオレセインdT(Glen Research、スターリング、バージニア州)のいずれかを使用してプローブ配列中の内部残基に結合している。C6 FAM dU(図1)の場合、6-カルボキシフルオレセイン(FAM)は、当業者に周知のDNA合成法により、ウラシル塩基の5位に結合している。蛍光体は、固相オリゴヌクレオチド合成のときにホスホルアミダイトとしてプローブに組み込むことができる(Brownら、2001、Brownら、2003)。他の蛍光修飾は、Glen Researchの8-アミノアルキル-dAおよび5-アミノアルキル-dCなどのモノマーを使用して合成後に行うこともできる。本発明のオリゴヌクレオチドは、プローブをリアルタイムPCRアッセイに組み込んだときにTaq介在性伸長を阻止するために3'-リン酸構成要素または他のブロッキング剤を有することがある。
PCRの体積は、典型的には20μlであり、試料2μl、1×PCR緩衝液、0.5μMプライマー、Taqポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)1ユニット、3mM総MgCl2、5ng/μl BSA(Roche Diagnostics)、1mM dNTP(Amersham Pharmacia Biotech)、および150nMプローブを含む。オリゴヌクレオチドを使用するアッセイに採用される緩衝液は、尿の直接分析には10×PCR緩衝液(TaKaRa、1.5mM MgCl2を含む)、10×HEPES#7(100mM HEPES(pH8.3)、250mM KCl)であり、唾液の直接分析および精製/処理された試料には10×HEPES#8(100mM HEPES(pH8.3)、500mM KCl)である。標的のホモジニアスな増幅および検出は、LightCycler装置(Roche Diagnostics)を使用して行うことができる。3段階の熱プロトコールでリアルタイムPCR検出および標的定量を実現することができ、そのプロトコールでは、最初の変性反応ステップ(95℃、1分間)に続いて、変性(95℃、5秒間)、プライマーのアニーリング(55℃、10秒間)、および産物の伸長(72℃、10秒間)を含む50サイクルを用いて標的を増幅する。蛍光の取得は3段階アッセイの各サイクルに1回、各プライマーのアニーリングステップの終わりに行う。あるいは、2段階熱プロトコールを使用して標的を迅速に増幅することもでき、そのプロトコールでは、最初の変性ステップ(95℃、1分間)に続いて、変性(95℃、5秒間)およびアニーリング/伸長期を組み合わせたもの(65℃、10秒間)を含む50サイクルを用いて標的を増幅する。2段階増幅の間は蛍光を取得しない。
3段階および2段階増幅の後に、反応物を直ちに変性させ(95℃、O秒間)、冷却(35℃、30秒間)してから、蛍光を連続的に取得する融解曲線分析を行う(35〜95℃で変化速度0.2℃/s)。LightCyclerソフトウェア(バージョン3.5)を使用して温度に対する蛍光の負の導関数(y軸は-dF/dT)を温度(x軸)に対してプロットすることにより、融解ピークを構築する。標的は、オリゴヌクレオチドプローブのピークの融解温度(Tm)を使用して信頼性高く検出および同定することができる。
以下は、標的配列の検出および多型標的の同定に使用されたプローブの例である。対応する標的を増幅するために使用されたプライマー配列を提供する。この実施例は、本発明の二重標識および多重標識プローブと比較するための単一標識オリゴヌクレオチドプローブを含む。
NAT2*4 5'GGTCCAGGTACCAGATTCCTCTC (配列番号4)
NAT2*5A 5'GGTCCAAGTACCAGATTCCTCTC (配列番号5)
NAT2*4 5'CTTAAATATATTTTTCAGCACTTC (配列番号9)
NAT2*5C 5'CTTAAATATATTTCTCAGCACTTC (配列番号10)
NAT2*4 5'GTAAGGGATTCATCACCAGG (配列番号14)
NAT2*7 5'GTAAGGGATCCATCACCAGG (配列番号15)
NATRAA TAATAATAAAAAATGTATTTTAAAGATGGC (配列番号17)
NATRTA TAATAATAATAAATGTATTTTAAAGATGGC (配列番号18)
NATRTC TAATAATAATAAATGTCTTTTAAAGATGGC (配列番号19)
NATRAC TAATAATAAAAAATGTCTTTTAAAGATGGC (配列番号20)
FVG 5'GGACAGGCGAGGAATACAG (配列番号24)
FVA 5'GGACAGGCAAGGAATACAG (配列番号25)
HbS 5'CCACAGGAGTCAGGTGCAC (配列番号29)
HbWT 5'CCTCAGGAGTCAGGTGCAC (配列番号30)
HbC 5'CCTTAGGAGTCAGGTGCAC (配列番号31)
HYBCHRC 5'CTTGGTATACATTTGCAGGCTTG (配列番号35)
模倣体 5'CTTGGTATACATTTACAGGCTTG (配列番号36)
第V因子Leiden(G1691A)多型の分析は、FVG11(5'CTGTAFTCCTCGCCFGTCC(配列番号60))(配列中、Fは蛍光標識ヌクレオチドであり、下線部ヌクレオチドは多型の位置である)などのオリゴヌクレオチドプローブを使用した融解分析により行うことができる。プローブからのPCR伸長は3'リン酸でブロックする。第V因子SNPを含む標的配列は、FVF1.3(5'GGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATC(配列番号22))およびFVR3.5(5'GCCCCATTATTTAGCCAGGAGACCTAACATG(配列番号23))などのプライマーを使用して増幅することができる。完全に相補的な「野生型」対立遺伝子およびミスマッチ(C:A)の「突然変異」対立遺伝子は、プローブのTmに基づいて信頼性高く検出および同定することができる(表1参照)。FVG1プローブは、以下のいずれかの配列を有する第V遺伝子(Genbank受託番号AY364535)の部分にハイブリダイズするように設計されている。
FVG 5'GGACAGGCGAGGAATACAG (配列番号24)
FVA 5'GGACAGGCAAGGAATACAG (配列番号25)
HYBCHRC 5'CTTGGTATACATTTGCAGGCTTG (配列番号35)
模倣体 5'CTTGGTATACATTTACAGGCTTG (配列番号36)
HYBNGRC 5'GAAGCCGTAGCGGAAGCAGA (配列番号59)
HyBAdCRC 5'AGGCTGGTGCACACGGACCACGTC (配列番号69)
HyBAdDRC 5'AGGCTGGTGCACTCTGACCACGTC (配列番号70)
INFRC 5'AGCTCTGTCCATGTTATTTGGATCCC (配列番号67)
SP1RC 5'GATAGCTTTCTCCAAGTGGAAGACCCC (配列番号65)
FIIRC 5'GACTCTCAGCGAGCCTCAATGC (配列番号116)
FIIMM 5'GACTCTCAGCAAGCCTCAATGC (配列番号117)
FIIRC 5'CAAAGACACTTGCTTCACTGGTC (配列番号113)
FIIMM 5'CAAAGACACTTTCTTCACTGGTC (配列番号114)
FIIRC 5'CAAAGACACTTGCTTCACTGGTC (配列番号110)
FIIMM 5'CAAAGACACTTTCTTCACTGGTC (配列番号129)
上記のMTHFR(A1928C)プライマーおよびプローブを用いて、(DNA精製せずに)一連の唾液試料を分析した。水の中に約50%の唾液を含む口すすぎ液をアッセイに直接含めた。口腔用綿棒を水中で絞り出したものも直接分析することができる。HYBA1928Cプローブは、A対立遺伝子およびC対立遺伝子とホモ接合型の試料で、それぞれ約51.5℃および61℃のTmを有する単一の融解ピークを発生する(図2)。A対立遺伝子およびC対立遺伝子にヘテロ接合型の唾液試料は、51.5℃および61℃のピークの両方を発生することで明らかに同定される。DNA精製の必要なしにポリヌクレオチド標識の検出および同定を直接実現した。
クラミジア潜在プラスミド標的は、プライマーCHF3-1(配列番号33)およびCHR4-1(配列番号34)を使用して増幅することができる。アッセイは、最初の変性(95℃、1分間)に続いて、変性(95℃、5秒間)、プライマーのアニーリング(55℃、10秒間)、および産物の伸長(72℃、10秒間)を含む50サイクルのPCRからなる3段階LightCyclerプロトコールを採用する。増幅した標的は、HYBCH(配列番号61)またはHYBCH6プローブ(配列番号104)の含有、ならびに変性(95℃、0秒間)、冷却(35℃、30秒間)、および変化速度0.2℃/sを用いた95℃への低速加熱を含む融解曲線分析により検出および特徴付けする。クラミジアDNAの存在下で、HYBCHおよびHYBCH6プローブは、それぞれ約56℃および60.5℃のTmで明らかな融解ピークを発生する。本発明のオリゴヌクレオチドを使用したアッセイは、精製DNA、ニートな尿、処理された(Becton Dickinson、オックスフォード、英国)尿およびスワブ、ならびにスワブから直接ピペットで吸い取った液体試料中のクラミジアの存在を検出した(図4)。
プライマーFVF1.3(配列番号22)およびFVR3.5(配列番号23)を使用して、DNA精製せずに、第V因子標的は唾液試料から直接増幅する。アッセイは、最初の変性(95℃、1分間)に続いて、変性(95℃、1秒間)、アニーリング/伸長期を組み合わせたもの(65℃、5秒間)を含む50サイクルのPCRからなる2段階LightCyclerプロトコールを採用する。増幅した標的は、FVG1(配列番号21)またはFVG11(配列番号60)オリゴヌクレオチドプローブの含有、ならびに変性(95℃、O秒間)、冷却(35℃、30秒間)、および変化速度0.2℃/sを用いた95℃への低速加熱を含む融解曲線分析により検出および特徴付けする。第V因子のアッセイは、16分間という短時間で完了することができる。ホモ接合型野生型試料は、FVG1およびFVG11プローブを採用した場合にそれぞれ約59℃および55℃のTmを有する単一融解ピークをもたらす。ホモ接合型突然変異試料は、FVG1およびFVG11プローブが採用された場合にそれぞれ約49.5℃および45℃のTmを有する単一融解ピークを発生する。ヘテロ接合型第V因子の試料は、単一標識FVG1プローブを使用したときに59℃および49.5℃両方の融解ピークを生じ、二重標識FVG11プローブを採用したときに55℃および45℃の両方のピークを発生する(図6)。このアッセイは、精製DNA、スワブ試料、および口腔すすぎ液で効率的に機能する。FVG1およびFVG11プローブを使用して、450を超えるゲノム試料が第V因子の多型に関して信頼性高く分類された。
プローブ配列、蛍光体の位置、および二重/三重標識の影響を研究するために、本発明のオリゴヌクレオチドからの蛍光発光の量を一本鎖状態および二本鎖状体で測定した。典型的にはTaKaRa緩衝液中で150nMのプローブを150nMの完全に相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、本発明のオリゴヌクレオチドのSN比を決定した。変性(95℃、0秒間)、冷却(35℃、30秒間)、および変化速度0.2℃/sを用いた95℃への低速加熱を含むLightCycler融解曲線プロトコールを使用して、蛍光測定を行った。蛍光値は、解離状態およびハイブリダイズした状態のそれぞれについてプローブのTm±10℃の温度での融解曲線から得た(図7)。温度が発光の量に及ぼす影響の一部を除くことを試みて、蛍光測定をこの所定の温度範囲で行った。ハイブリダイズした蛍光値および解離した蛍光値は、SN比の尺度と、発光に及ぼすプローブのハイブリダイゼーションの影響の指標を与え(表2)、ここで、SN比は、ハイブリダイズしているときのシグナルを解離しているときのシグナルで割ったものとして計算する。プローブのSN比は高度に再現性であり、運転間および装置間で低い変動を示すことが見出された。
グアニン塩基が効率的な蛍光のクエンチャーであるとすると、プローブが解離状態の場合にGに隣接する蛍光体は効率的に消光されると予想することができ、蛍光発光はプローブのハイブリダイゼーション時にかなり増加すると予想することができる。G(の5'、3'、または両方の位置)に隣接して内部蛍光体を有する全てのプローブは、標的のハイブリダイゼーション時にシグナルの増強を示した(表2)。C9*2C(配列番号55)、136A(配列番号83)、およびHYBA1928C(配列番号112)オリゴヌクレオチドプローブは、蛍光標識が2つのGヌクレオチドの間に位置するプローブのよい例である。C9*2CのSN比は、蛍光体が1つのGにのみ隣接しているが、一般に非常にGに富む2D64C*プローブ(配列番号51)に匹敵する。A/Tに富むDdeFL1*4プローブ(配列番号6)も類似のSN比を示し、蛍光体に隣接した単一のGヌクレオチドを有する。G残基に隣接して蛍光体を配置することは、大きなピーク高およびSN比を発生するために必要ではないものの、その可能性が高い。蛍光体があらゆる配列環境に位置するときに、プローブは効率的なハイブリダイゼーションシグナルを生じることから、プローブ内の適切な位置にG残基が不在であることは問題ではない。この例は本発明のオリゴヌクレオチドと同様に単一標識オリゴヌクレオチドを示しているが、それにもかかわらず、標的のハイブリダイゼーション時に配列に依存しない蛍光増強を起こすのは標的配列の独立性であり、蛍光体の間の相互作用ではないことを実証している。
標的配列中のグアニン残基が蛍光消光を起こす能力を有するならば、標的のハイブリダイゼーション時にC残基に隣接する蛍光体からの発光が減少すると予想することができる。しかし、HYBNG(配列番号58)、171R(配列番号85)、C19m1A(配列番号39)、SCT1(配列番号26)、およびSP2(配列番号80)などの、蛍光体がC残基に隣接する全てのヌクレオチドプローブは、プローブのハイブリダイゼーション時に蛍光増強を示した。HEPB(配列番号45)およびFVG2(5'GTATFCCTCGCCTGTCCAG(配列番号87))などの高度にCに富むオリゴヌクレオチドプローブでさえも、一本鎖の場合よりも標的にハイブリダイズした場合に高レベルの蛍光を発光する。プローブのハイブリダイゼーション時の蛍光増強は、分子モデリングにより予測されるように標的配列にグアニンヌクレオチドが存在することに依存しないと思われる。分子モデリングは、蛍光体が二本鎖DNAと相互作用しないことを示している。
蛍光体がA残基とT残基との間に位置するオリゴヌクレオチドプローブも、標的のハイブリダイゼーション時に蛍光発光の増強を示す。NAT2*6(配列番号88)、HYBNAT3S(配列番号16)、およびFVGI(配列番号21)プローブは、蛍光体で標識された塩基がAおよびTヌクレオチドに隣接しているプローブのよい例である。人工的に構築したポリTプローブ(5'TTTTTTTTTTTFTTTTTTTTTTT(配列番号37))は、プローブ鎖および標的鎖の両方にGヌクレオチドが完全に不在であるにもかかわらず、一本鎖状態の場合に比べて標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光発光のレベル増大を示す。これらのオリゴヌクレオチドは、単一の蛍光体を有するため、本発明のオリゴヌクレオチドではない。それにもかかわらず、これらのオリゴヌクレオチドはプローブの蛍光性質が配列に依存しないことを示す。
表2のデータは、プローブの機能性がプローブまたは標的配列内のグアニン残基の存在に依存しないことを実証している。しかし、高いSN比と蛍光体のすぐ隣のプローブ位置にGが存在することの間に関連がある可能性がある。単一標識プローブについて、大きなSN比の多数は、蛍光体がグアニン塩基に隣接するプローブに由来する。しかし、単一標識の最大のSN比は、AヌクレオチドおよびCヌクレオチドが隣接する蛍光体を有するオリゴヌクレオチドから得られた(配列番号85)。
LightcCycler融解曲線分析は、標的の配列がオリゴヌクレオチドプローブの機能性にほとんどまたは全く影響を及ぼさないことを強く示唆している。オリゴヌクレオチドプローブの蛍光体がハイブリダイゼーション時に溶液中に突出する結果、二本鎖DNAと相互作用しないならば、蛍光体は、標的のGヌクレオチドにより消光されずにプローブの高度にCに富む領域内に位置することができる。今日まで設計された全ての単一標識および二重標識オリゴヌクレオチドプローブは、プローブ配列および蛍光体で標識された塩基に隣接するヌクレオチドに関係なく、一本鎖状態に比べてハイブリダイゼーション時に増大したレベルの蛍光を示す。
プローブ配列、蛍光体の位置、および多重蛍光体の影響を検討するために単一標識、二重標識、および三重標識プローブのピーク高も測定した。プローブ比較のためのピーク高の測定は、運転間変動および装置間変動が原因でSN比よりもやや信頼性に欠ける。しかし、1回のLightCycler実験で発生した融解ピークは、プローブの配列を信頼性高く比較するために採用することができる。150nMのプローブを、典型的にはTaKaRa緩衝液中の150nMの完全相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。蛍光測定は、変性(95℃、0秒間)、冷却(35℃、30秒間)、および変化速度0.2℃/sを用いた95℃への低速加熱を含むLightCycler融解曲線プロトコールを使用して行った。LightCyclerソフトウェアのバージョン3.5だけで得られた融解ピークのデータを表3に含めた。LightCyclerソフトウェアのバージョン3.01は、ユーザが蛍光のゲインを手動で設定する必要がある。バージョン3.5のソフトウェアは最高レベルの発光を示す試料に対する蛍光レベルを自動的に測定する。
第V因子標的配列は、プライマーFVF1(5'GACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAG(配列番号92))およびFVR3(5'CCATTATTTAGCCAGGAGAC(配列番号93))を使用して増幅した。アッセイは、最初の変性(95℃、1分間)に続いて、変性(95℃、O秒間)、プライマーのアニーリング(55℃、10秒間)、および産物の伸長(72℃、10秒間)を含む50サイクルのPCRからなる3段階LightCyclerプロトコールを採用した。増幅した標的は、FV3(5'CTGTATTCCTCGCCTGTCCF(配列番号94))またはFV5(5'FCTGTATTCCTCGCCTGTCC(配列番号95))末端標識プローブの包含、ならびに変性(95℃、O秒間)、冷却(35℃、30秒間)、0.1℃/sの変化速度を用いた95℃への低速加熱を含む融解曲線分析により検出および特徴付けした。3'標識FV3プローブは完全に非機能性であり、融解曲線分析でピークを生じなかった。プローブの発光スペクトルの測定により効率的なオリゴヌクレオチド合成および蛍光体の結合を立証した。5'-FAM結合を有するFV5プローブは、標的のハイブリダイゼーション時に蛍光発光の減少を示した。FV5プローブは、-dF/dTプロットにおいて逆向きの融解ピークを発生し(図10)、そのピークは、ホモ接合型およびヘテロ接合型試料の同定を可能にした。5'-標識プローブ由来の逆向きの融解ピークは、単一標識FVG1第V因子プローブから得られたピーク高と類似の強度であった(図10)。
5'CTGTATTCCTCGCCTGTCC3' (第V因子プローブ配列;配列番号140)
3'ATGGACATAAGGAGCGGACAGGTCC5' (標的配列;配列番号141)
オリゴヌクレオチドプローブ配列に追加の蛍光体を組み込むと、ハイブリダイズした(シグナル)状態および一本鎖(ノイズ)状態の両方でプローブ発光が増加することによって、SN比が維持されると予想することができる。あるいは、FAM色素同士が近接している場合に相互に実際に消光することができることから、多数の蛍光体でプローブを標識することがSN比を低下させるおそれがある。しかし、プローブのSN比および融解ピーク高はオリゴヌクレオチドプローブ配列内に2つ以上のFAM色素を含ませることによりかなり改善された。上記の全てのプローブは、チミンヌクレオチドを置き換えるためにC6 FAM dUまたはGlenフルオレセインdTのいずれかを利用し、これらのプローブの蛍光体は少なくとも3つのヌクレオチドで分離されている。本発明のオリゴヌクレオチドに追加の蛍光体(例えば3または4個のFAM標識)を含ませると、SN比および融解ピーク高がさらに増大することがある。しかし、蛍光体で標識された塩基は最小数のヌクレオチドで分離し、非放射エネルギー移動による蛍光体同士の直接消光を避けなければならない。この非FRET消光は、色素同士の短距離「接触」により起こることがあり、励起スペクトルと発光スペクトルとの重複を必要としない。FRET消光も、励起スペクトルと発光スペクトルとの重複によりFAM標識の間で起こることがある。本発明のオリゴヌクレオチドプローブを設計する場合の好ましい間隔は3〜6である。しかし、蛍光体が少なくとも2つの未標識ヌクレオチドで分離されている全てのプローブは、標的のハイブリダイゼーション時に蛍光のかなりの増加を示す。11ヌクレオチドよりも大きい間隔は試験していないが、その間隔は二本鎖中のそれらの相対的な角配置に応じて効率的なシグナルを生じることがある(表7参照)。
HYBCH2 5'CAAGCCTGCAAAFGTATACCAAG (配列番号32)
HYBCH 5'CAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG (配列番号61)
HYBCH3 5'CAAGCCFGCAAAFGFATACCAAG (配列番号96)
HYBCH4 5'CAAGCCFGCAAAFGFAFACCAAG (配列番号97)
HYBCH2 5'CAAGCCTGCAAAFGTATACCAAG (配列番号32)
HYBCH 5'CAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG (配列番号61)
HYBCH5 5'CAAGCCFGCAAAFGTAFACCAAG (配列番号102)
HYBCH6 5'GTAAFCAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG (配列番号104)
HYBCH2 5'CAAGCCTGCAAAFGTATACCAAG (配列番号32)
HYBCH7 5'CAAGCCFGCAAATGTATACCAAG (配列番号105)
HYBCH8 5'CAAGCCTGCAAATGTAFACCAAG (配列番号106)
HYBCH 5'CAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG (配列番号61)
HYBCH9 5'CAAGCCTGCAAAFGTAFACCAAG (配列番号107)
HYBCH10 5'CAAGCCFGCAAATGTAFACCAAG (配列番号108)
HYBCH5 5'CAAGCCFGCAAAFGTAFACCAAG (配列番号102)
HYBCH11 5'GTAAFCAAGCCFGCAAAFGTAFACCAAG (配列番号126)
3つの単一標識第V因子オリゴヌクレオチドプローブを同一の配列の二重標識および三重標識プローブと比較した。二重標識および三重標識オリゴヌクレオチドプローブに存在する全ての蛍光体を複数の単一標識プローブで表した。TaKaRa PCR緩衝液および合計3mMのMgCl2中の150nMのオリゴヌクレオチドプローブに150nMのFVG(配列番号24)逆ホモログオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせた。変性(95℃、5秒間)、冷却(35℃、30秒間)、および0.2℃/sで95℃への低速加熱を含むLightCyclerプロトコールを使用して融解ピークを発生させた。単一標識プローブ、二重標識プローブ、および三重標識プローブのピーク高およびSN比を表6に示す。
FVG1 5'CTGTAFTCCTCGCCTGTCC (配列番号21)
FVG1ALT 5'CTGTATTCCTCGCCFGTCC (配列番号101)
FVG1ALT2 5'CTGTATTCCFCGCCTGTCC (配列番号128)
FVG11 5'CTGTAFTCCTCGCCFGTCC (配列番号60)
FVG111 5'CTGTAFTCCFCGCCFGTCC (配列番号127)
一連のオリゴヌクレオチドプローブを合成し、二重標識オリゴヌクレオチドプローブにおける蛍光体標識塩基同士の間に必要な最小の間隔を決定した。プローブは、蛍光体標識塩基同士の間に0から9ヌクレオチドを有した。TaKaRa PCR緩衝液および合計3mMのMgCl2中で150nMのMODRC(5'CCCCCCTTTTTTTTTTTTTCCCCCC(配列番号139))逆ホモログオリゴヌクレオチドを150nMのオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせた。変性(95℃、5秒間)、冷却(35℃、30秒間)、および0.2℃/sで95℃への低速加熱を含むLightCyclerプロトコールを使用して融解ピークを発生させた。SN比および融解ピーク高を表7に示す。標識塩基の間に0および1個のヌクレオチドを有するプローブは、近接する蛍光体により起きる接触消光により、かなり減少した蛍光レベルを示した。これらのプローブの両方は負(逆方向)の融解ピークを示し、ここで、一本鎖状態に比べて標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光レベルは減少した。蛍光体標識塩基を分離している2から9ヌクレオチドを有する全てのプローブは、標的のハイブリダイゼーション時に正の融解ピークおよび蛍光増強を示した。7および8ヌクレオチドで分離された蛍光体を有するプローブは、やや減少したレベルの蛍光と2〜6および9個の間隔のプローブに比べて小さな融解ピークとを示した。二本鎖DNAと同じ表面に多数の蛍光体を有するプローブは、ある程度の接触消光に遭遇することによって、ピーク高およびSN比の減少を示すことがある。8ヌクレオチドの間隔がFVG11(配列番号60)、HYBMRSA(配列番号99)、およびHYBA1928C(配列番号112)プローブで採用され、大きな融解ピークおよびSN比を発生することから、これらの角配置の影響は配列特異的でありうる。オリゴヌクレオチドプローブが遊離のプローブに比べて標的のハイブリダイゼーション時に高レベルの蛍光発光を生じるためには、蛍光体標識塩基を分離している少なくとも2つのヌクレオチドが必要である。
アミノ-dAおよびアミノ-dCモノマー(Glen Research、スターリング、バージニア州)を使用し、FAMで合成後標識を行ってFAM dAおよびFAM dCオリゴヌクレオチドプローブを合成した。FAM dCおよびFAM dAを有する単一標識および二重標識プローブを合成し、単一標識および二重標識C6 FAM dUオリゴヌクレオチドプローブと比較した(表8)。TaKaRa PCR緩衝液および合計3mMのMgCl2中で150nMの適切な逆ホモログオリゴヌクレオチド(FVGまたはGLENARC)を150nMのオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。変性(95℃、5秒間)、冷却(35℃、30秒間)、および0.2℃/sで95℃への低速加熱を含むLightCyclerプロトコールを使用して融解ピークを発生させた。
FVG 5'GGACAGGCGAGGAATACAG (配列番号24)
GLENARC 5'CTGTATACCTTGCCTGTCC (配列番号91)
本発明のオリゴヌクレオチドを使用するアッセイのPCR段階の後で、プローブは増幅産物と競合して標的配列とハイブリダイズする。この競合により、プローブ/標的の相互作用の可能性が減り、融解ピーク高が制限される。標的ハイブリダイゼーションがプローブ側に傾くならば、融解ピーク高は増大することができる。これは、プローブの濃度を増加させること、またはPCR競合鎖の存在度を減少させることのいずれかによって実現することができる。
非対称PCRは、クラミジア、淋病、第II因子、A1928C、およびC677Tアッセイで対称的増幅に比べてピーク高の増大を生じた。しかし、非対称的増幅はNAT2*5C試験でピーク高を増大させなかった。非対称的PCRは一本鎖標的を発生することから、プローブは相補的PCR鎖とハイブリダイゼーションを競合する必要がなく、融解ピークはオリゴヌクレオチドで得られたピークと類似した強度である可能性がある。対称的増幅が、すでにオリゴヌクレオチドピークと類似した強度の融解ピークを生じるならば(例えばNAT2*5Cアッセイ)、非対称的増幅から利益を得ることはできない。オリゴヌクレオチドに比べてピーク高の減少を示すプローブだけが、アッセイを非対称的試験に変えた場合にピーク高の高まりを示すようである。非対称的PCRは、アッセイが長鎖標的アンプリコンを利用するか、またはプライマー二量体が発生する場合に有利なことがある。
1つのLightCyclerキャピラリーで4つのオリゴヌクレオチドプローブをそれらの相補的オリゴヌクレオチド標的に同時にハイブリダイズさせ、融解ピーク分析を多重で行える可能性を実証した。プローブおよび標的を様々な濃度で採用し、単一標識および二重標識プローブ由来のピーク高を同じにした。ポリT、HYBINF、HYBCH2、およびHYBAdCプローブおよび標的オリゴヌクレオチドをそれぞれ1.2μM、233nM、183nM、および27nMで採用した。TaKaRa PCR緩衝液および合計3mMのMgCl2中で、変性(95℃、5秒間)、冷却(35℃、30秒間)、および0.4℃/sで95℃への加熱を含むLightCyclerプロトコールを使用して融解ピークを発生させた。ポリT、HYBINF、HYBCH2、およびHYBAdCプローブは、それぞれ約49℃、54℃、62℃、および68℃のTmで明確な融解ピークを発生した(図17)。2つの二対立遺伝子(biallelic)SNPの同時分析を可能にするオリゴヌクレオチドプローブを使用して、Tmに基づき少なくとも4つの標的配列を検出および同定することができる。スペクトルが異なる蛍光色素をさらに使用して多重分析の可能性を高めることができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、臨床試料中の感染性病原体の存在または不在を決定するために採用することができる。特異的融解ピークの発生は、試料中に特定の感染因子が存在することを示す。しかし、融解ピークが全く存在しないことは、病原体の欠如を信頼性高く示すわけではない。尿などの臨床試料は高レベルのPCR阻害剤を含有するおそれがあり、その阻害剤が陽性試料中の病原体の検出を阻止するおそれがある。病原体の不在により陰性である反応を、PCR阻害により融解ピークを発生しない反応と区別するために、増幅対照が必要である。
プライマーFVF1.3(配列番号22)およびFVR3.5(配列番号23)を使用した一連のDNA標準から第V因子標的を増幅させた。DNA標準は、100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、および10pg/μlのヒトゲノムDNAを有した。アッセイには、最初の変性(95℃、1分間)に続いて、変性期(95℃、0秒間)およびアニーリング期(50℃、10秒間)および伸長期(72℃、10秒間)を含む50サイクルのPCRからなる3段階LightCyclerプロトコールを採用した。FVG1(配列番号21)またはFVG11(配列番号60)を含むこと、およびPCRのアニーリング期の間の蛍光取得により、増幅した標的を検出および特徴付けた。閾値レベル(CT)を超えて蛍光発光が増加するサイクル数を測定することにより、DNA標的の定量が可能になる(図19)。リアルタイムPCRアッセイの間に得られたCT値は、標的配列の初発コピー数に直接比例し、標準曲線を構築するために使用することができ、その標準曲線から「未知」試料を定量することができる。唾液試料は、典型的には約1ng/μlのヒトゲノムDNAを含有することが見出された。
それぞれ2つの内部位置で蛍光体で標識された4つの第V因子オリゴヌクレオチドプローブを合成した。これらのプローブは以下の通りである。
FVG11TAM5'CTGTAXTCCTCGCCXGTCC(配列番号144)(配列中、XはTAMRAで標識されたdT残基である)、
FVG1IROX5'CTGTAXTCCTCGCCXGTCC(配列番号145)(配列中、XはROXで標識されたdT残基である)、
FVG11Cy55'CTGTAXTCCTCGCCXGTCC(配列番号146)(配列中、XはCySで標識されたdT残基である)、
FVG11Mix5'CTGTAFTCCTCGCCXGTCC(配列番号147)(配列中、FはFAMで標識されたdT残基であり、XはROXで標識されたdT残基である)。
単一および多重蛍光体標識内部塩基を有するオリゴヌクレオチドプローブは、全て一本鎖状態に比べてハイブリダイズしたときに蛍光発光のレベル増加を示す。オリゴヌクレオチドプローブおよび標的配列とは無関係に、ハイブリダイゼーションしたときにプローブ蛍光が常に増加することから、一本鎖の場合に蛍光体はプローブDNAと相互作用し消光を招くが、二本鎖状態ではプローブとも標的配列とも相互作用せず、その結果、蛍光体は脱消光され蛍光が増加すると考えられている。ハイブリダイズしたプローブから発光した蛍光のレベル増加は、DNAの消光の影響を逃れて溶液中に突出する蛍光体に起因すると考えられる。
Claims (41)
- 分子内塩基対形成を可能にする、相互の逆相補体である4つ以上の連続するヌクレオチド残基から形成される部分を含む配列を有さず、且つヌクレオチド残基から形成される、10から50個のヌクレオチド残基を有する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、2つ以上の内部ヌクレオチド残基の塩基が、結合するクエンチャーなしに蛍光体で標識されており、蛍光体で標識されている内部ヌクレオチド残基の少なくとも2つが、少なくとも2つの未標識ヌクレオチド残基で分離されており、3'ヌクレオチド残基が3'ヒドロキシルを有さず、各蛍光体が同一の蛍光体である、一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記内部ヌクレオチド残基の最大3分の1が蛍光体で標識されている、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 蛍光体で標識されている内部ヌクレオチド残基の全てが、少なくとも2つの未標識ヌクレオチド残基で分離されている、請求項1または2に記載のオリゴヌクレオチド。
- 少なくとも1つのG残基を有するオリゴヌクレオチドであって、前記蛍光体で標識されている内部ヌクレオチド残基の少なくとも1つが、前記G残基の少なくとも1つに隣接して位置する、請求項1から3のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 3'ヌクレオチド残基が3'リン酸を有するか、または3'デオキシ残基である、請求項1から4のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 15から50個のヌクレオチド残基を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 15から30個のヌクレオチド残基を有する、請求項6に記載のオリゴヌクレオチド。
- 2から10個の蛍光体で標識されている内部ヌクレオチド残基を有する、請求項7に記載のオリゴヌクレオチド。
- 2から5個の蛍光体で標識されている内部ヌクレオチド残基を有する、請求項8に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記蛍光体が、6-カルボキシフルオレセイン(FAM)、テトラクロロフルオレセイン(TET)、ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)などのフルオレセイン系色素;6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、6-カルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA)などのローダミン系色素;Cy3またはCy5などのCyファミリーの色素;NEDまたはJOEなどのその他の蛍光体;ならびにAlexa色素、Atto色素、Dyomic色素、Dyomic megastoke色素、およびThilyte色素からなる群から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記蛍光体が二本鎖DNAにインターカレートしない、請求項1から10のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 標的ポリヌクレオチド配列に配列相補性を有し、前記標的ポリヌクレオチド配列が、その中に任意の遺伝子またはその対立遺伝子を含むヒトゲノム、その中に任意の遺伝子またはその対立遺伝子を含むマウスゲノム、およびその中に任意の遺伝子またはその対立遺伝子を含む任意の感染因子のゲノムからなる群から選択されるか、またはヒツジPrP遺伝子に相補的な配列を有するものである、請求項1から11のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- N-アセチルトランスフェラーゼ2、第V因子Leiden、第II因子、MTHFR、または鎌状赤血球貧血症のヒト遺伝子またはその対立遺伝子の任意の1つに相補的な配列を有する、請求項12に記載のオリゴヌクレオチド。
- トラコーマクラミジア、アデノウイルス、A型インフルエンザ、肺炎連鎖球菌、またはMRSAの感染因子のゲノムまたはその中の任意の遺伝子またはその対立遺伝子に相補的な配列を有する、請求項12に記載のオリゴヌクレオチド。
- 遺伝子の1つの対立遺伝子に完全に相補的な配列を有する、請求項12から14のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記標的ポリヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項11から14のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記遺伝子の所与の対立遺伝子を別の対立遺伝子と比べたヌクレオチド配列の差に相補的な配列が、前記オリゴヌクレオチドの中央付近に位置する、請求項15に記載のオリゴヌクレオチド。
- 支持体上または支持体内に固定化されている、請求項1から17のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 支持体上または支持体内の間隔を置いた位置に固定化されているオリゴヌクレオチドのアレイであって、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つが、請求項1から17のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドであるアレイ。
- 各オリゴヌクレオチドが請求項1から17のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドである、請求項19に記載のオリゴヌクレオチドのアレイ。
- ポリヌクレオチド配列を含有する試料中の標的ポリヌクレオチド配列の存在を判定する方法であって、前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる、請求項1から18のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと前記試料を接触させるステップ、およびハイブリダイゼーションが起こったかどうかを判定するステップを含む方法。
- 蛍光の増加の検出が、前記オリゴヌクレオチドと前記標的ポリヌクレオチド配列との間でハイブリダイゼーションが起こったかどうかを判定するために使用される、請求項21に記載の方法。
- 前記標的ポリヌクレオチド配列と前記オリゴヌクレオチドとの間に形成したハイブリッドの融解点付近の所定の温度で、または前記融解点を包含する温度範囲にわたって行われる、請求項21または22に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチド配列に完全に相補的である、請求項21から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチド配列に完全には相補的でない、請求項21から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項25に記載の方法。
- 存在を判定される前記標的ポリヌクレオチド配列が遺伝子の1つまたは複数の対立遺伝子である、請求項21から26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、前記遺伝子の1つを超える対立遺伝子にハイブリダイズすることができる、請求項27に記載の方法。
- 前記試料中の前記標的ポリヌクレオチド配列の存在または量を検出、同定、または定量するために使用される、請求項21から26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、増幅により産生されたポリヌクレオチド配列を含有する、請求項21から27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチド配列が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写PCR(RT-PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)、転写介在性増幅(TMA)、ローリングサークル増幅(RCA)、または核酸配列に基づく増幅(NASBA)の任意の1つまたは複数により産生される、請求項30に記載の方法。
- 前記試料中の前記ポリヌクレオチド配列の前記増幅が、前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの存在下で行われる、請求項30または31に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドの3'ヌクレオチド残基が3'ヒドロキシルを有さない、請求項32に記載の方法。
- 蛍光の観察が、前記試料中の前記ポリヌクレオチド配列の前記増幅中に行われる、請求項32または33に記載の方法。
- 前記試料中の前記ポリヌクレオチド配列が、核酸の予備抽出なしに生物学的起源からの増幅により産生される、請求項30から34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCRが非対称的増幅である、請求項31に記載の方法。
- 前記標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド、前記ポリヌクレオチド標的配列を含有しうる試料、またはその両方が支持体上または支持体内に固定化されている、請求項23から36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的ポリヌクレオチド配列が、その中に任意の遺伝子またはその対立遺伝子を含むヒトゲノム、マウスゲノムまたはその中の任意の遺伝子またはその対立遺伝子、およびその中に任意の遺伝子またはその対立遺伝子を含む任意の感染因子のゲノムからなる群から選択される、請求項23から37のいずれか一項に記載の方法。
- 標的ポリヌクレオチド配列を選択するステップ、および前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を有し、請求項1から18のいずれかに記載の性質を有するオリゴヌクレオチドを合成するステップを含む、請求項12から17のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを製造する方法。
- 前記標的ポリヌクレオチド配列が、その中に任意の遺伝子またはその対立遺伝子を含むヒトゲノム、その中に任意の遺伝子またはその対立遺伝子を含むマウスゲノム、およびその中に任意の遺伝子またはその対立遺伝子を含む任意の感染因子のゲノムからなる群から選択される、請求項39に記載の方法。
- 増幅により産生されたポリヌクレオチド配列を含有する試料中の標的ポリヌクレオチド配列の存在を判定する方法であって、前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドと前記試料を接触させるステップ、およびハイブリダイゼーションが起こったかどうかを判定するステップを含み、前記オリゴヌクレオチドが、分子内塩基対形成を可能にする、相互の逆相補体である4つ以上の連続するヌクレオチド残基から形成される部分を含む配列を有さず、且つヌクレオチド残基から形成される、10から50個のヌクレオチド残基を有する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、2つ以上の内部ヌクレオチド残基の塩基が、結合するクエンチャーなしに蛍光体で標識されており、蛍光体で標識されているヌクレオチド残基の少なくとも2つが、少なくとも2つの未標識ヌクレオチド残基で分離されており、3'ヌクレオチド残基が3'ヒドロキシルを有さず、各蛍光体が同一の蛍光体である、一本鎖オリゴヌクレオチドである、方法。
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