JP5868485B2 - 感染の早期診断およびモニタリングのための白血球の自己蛍光を使用した細胞学的方法 - Google Patents
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Description
先行技術
重度敗血症または重篤な細菌感染は、院内、より具体的には、集中治療室における罹患率、死亡率の主因であり続けている。さらに、米国民1,000人に3〜11例という現在の罹患率は、過去数十年にわたり毎年8.7％ずつ増加してきた。フランスにおける集中治療室への入院の14.6％が、この病理に関係している。診断および治療の手法の多くの改善にも関わらず、重度敗血症に関連した院内死亡率は、フランスにおいて、35％と推定されている。患者の入院から、抗生物質による治療の開始までの期間が、死亡率の主要な予後因子を構成することは、現在、明らかである。従って、21世紀における目標は、可能な限り早期に感染を診断することであり、それは、患者の生存の保証である。
重度敗血症または重篤な細菌感染は、院内、より具体的には、集中治療室における罹患率、死亡率の主因であり続けている。さらに、米国民1,000人に3〜11例という現在の罹患率は、過去数十年にわたり毎年8.7％ずつ増加してきた。フランスにおける集中治療室への入院の14.6％が、この病理に関係している。診断および治療の手法の多くの改善にも関わらず、重度敗血症に関連した院内死亡率は、フランスにおいて、35％と推定されている。患者の入院から、抗生物質による治療の開始までの期間が、死亡率の主要な予後因子を構成することは、現在、明らかである。従って、21世紀における目標は、可能な限り早期に感染を診断することであり、それは、患者の生存の保証である。
さらに、医学における現在の課題のうちの一つは、広範な使用の有害効果（細菌の耐性および経済コスト）を抑えるため、日々使用される抗生物質の全体量を低下させ得ることである。細菌感染のための抗生物質による処置の継続時間が、現在、主要な討論の中心にある。従って、進行中の感染をモニタリングし、従って、利用された抗感染処置の有効性をモニタリングするための迅速な技術が、必要である。これらの技術は、適切な時点で処置を中止することを可能にし、抗生物質による処置の継続時間を短縮させるであろう。このようにして、それらは、抗生物質の世界的な消費の低下をもたらすであろう。
しかしながら、直接検査および栄養培地での増殖を含む、現在利用可能な従来の微生物学的技術は、即座の応答を提供しない。実際、細菌学的診断応答を入手するには、24〜48時間が必要である。同様に、遺伝子増幅技術（例えば、RT-PCR）は、精巧な装置に頼るため極めて高価であり、診断的使用について完全にはバリデートされていない。
従って、これらの微生物学的技術または遺伝学的技術に取って換わるため、発症の極めて初期に、現在可能であるよりはるかに迅速に、感染を診断することを可能にする、信頼性がありかつ安価な方法を開発することが緊急に必要とされている。
しかしながら、宿主の微生物に対する応答は、感染の最初の数分に確立されることが公知である：それは実際ほぼ即時である。自然免疫の枢要な細胞である白血球細胞は、病原体の認識および破壊において、基礎的な極めて初期の役割を果たす。微生物（細菌およびウイルス）に対する宿主のこれらの防御機構は、トール様受容体（TLR）と呼ばれる特異的な受容体に依存する。これらのTLRのうちの数種は、細菌の認識において中心的な役割を果たす：例えば、TLR4は、リポ多糖（LPS）のようなグラム陰性菌膜成分を認識し、TLR2は、ペプチドグリカン（PGN）のようなグラム陽性菌要素を認識する。TLR3、7、および8は、ウイルスRNAを認識するエンドソーム受容体である。刺激された後、これらのTLRは、核内転写因子NF-κBの活性化、ならびに腫瘍壊死因子アルファ（TNFα）およびインターロイキン6（IL-6）のようなNF-κB依存性の炎症誘発性サイトカインの産生をもたらすという共通の特徴を有する。さらに、もう一つのシグナリング経路：N-ホルミル-L-メチオニル-L-ロイシル-L-フェニルアラニン（fMLP）受容体経路が、自然免疫の重要な防御機構を構成する。細菌タンパク質の分解産物であるこのペプチドは、細胞質内キナーゼの活性化のカスケードに通じるGタンパク質共役型受容体を活性化し、会合してNADHオキシダーゼを形成するサブユニットのリン酸化をもたらす。この膜酵素複合体は、単球および多形核好中球（PNN）が、NADHをNADへ酸化することにより、活性酸素種（ROS）を産生することを可能にする。これらのROSは食細胞の殺菌活性に関与する。
本発明者らは、微生物感染において確立される初期の免疫学的活性を明らかにするため（従って、個体の感染状態を明らかにするため）、これらの白血球細胞の自己蛍光を、極めて具体的な実験条件において、使用することが可能であることを本明細書において示す。本発明の診断法は、慣用の光学材料を使用することによって、細胞自己蛍光に適合する波長域で作用することが可能であり、従って、個体における感染を診断するための、迅速で、信頼性があり、かつ安価な補助を構成する。また、それは、以前に確立された抗感染治療の有効性を極めて迅速に測定することも可能にする。
本発明は、第一に、少なくとも以下の工程を含む、個体に由来する生物学的標本から得られた白血球細胞の試料に基づき、該個体の感染状態を診断するためのインビトロの方法に関する：
（i）該試料の平均細胞自己蛍光強度を測定する工程、および
（ii）該個体の感染状態を判定するため、工程（i）において測定された強度を対照値と比較する工程。
（i）該試料の平均細胞自己蛍光強度を測定する工程、および
（ii）該個体の感染状態を判定するため、工程（i）において測定された強度を対照値と比較する工程。
特定の態様において、試料の白血球細胞は、単球および／または多形核好中球より選択される。本発明のこの態様において、個体の状態が感染性である場合、該個体は、細菌感染、ウイルス感染、または真菌感染、好ましくは細菌感染を患っている。
好ましくは、生物学的標本は、個体の感染している可能性のある器官から得られた流体であり；より好ましくは、この試料は、肺液（pulmonary fluid）、腹水、脳脊髄液、血液試料、または感染している可能性のある器官から得られたその他の任意の生物学的流体である。
好ましい態様において、試料の細胞の自己蛍光強度は、蛍光顕微鏡、フローサイトメーター、分光測光機、または蛍光を測定することができるその他の任意の光学装置により、化学的に固定された細胞において測定される。
最も好ましい態様において、細胞の試料は、少なくとも以下の工程を含む方法により、工程（i）の前に、透明材料、好ましくはガラスの、スライド上に単層で調製される：
（a）試料の細胞を、少なくとも1種の細胞遠心分離（cytocentrifugation）システムに投入する工程、
（b）細胞をスライド上に塗抹するため、工程（a）で入手した装置を、好ましくは約600rpmで、約5分間、遠心分離する工程、
（c）細胞スポットを形成させるため、スライド上に塗抹された細胞を、少なくとも1滴の約4％パラホルムアルデヒド（PFA）により、好ましくは約10分間、固定する工程、
（d）予め固定した細胞スポットを、好ましくはPBS緩衝液により、濯ぐ工程、
（e）予め濯いだ細胞スポットを乾燥させる工程、
（f）予め乾燥させた細胞スポットに、蛍光の観察に適合する封入剤を少なくとも1滴、添加する工程、
（g）工程（f）から得られた細胞スポットに、好ましくはガラス製の、透明カバーガラスを載せる工程。
（a）試料の細胞を、少なくとも1種の細胞遠心分離（cytocentrifugation）システムに投入する工程、
（b）細胞をスライド上に塗抹するため、工程（a）で入手した装置を、好ましくは約600rpmで、約5分間、遠心分離する工程、
（c）細胞スポットを形成させるため、スライド上に塗抹された細胞を、少なくとも1滴の約4％パラホルムアルデヒド（PFA）により、好ましくは約10分間、固定する工程、
（d）予め固定した細胞スポットを、好ましくはPBS緩衝液により、濯ぐ工程、
（e）予め濯いだ細胞スポットを乾燥させる工程、
（f）予め乾燥させた細胞スポットに、蛍光の観察に適合する封入剤を少なくとも1滴、添加する工程、
（g）工程（f）から得られた細胞スポットに、好ましくはガラス製の、透明カバーガラスを載せる工程。
試料の白血球細胞が主として単球である場合、工程（i）において測定された自己蛍光強度が対照値より有意に高いならば個体の状態は感染性である。
試料の白血球細胞が主として多形核好中球である場合、工程（i）において測定された自己蛍光強度が対照値より有意に低いならば個体の状態は感染性である。
[本発明1001]
少なくとも以下の工程を含む、個体に由来する生物学的標本から得られた白血球細胞の試料に基づき、該個体の感染状態を診断するためのインビトロの方法：
（i）該試料の平均細胞自己蛍光強度を測定する工程、および
（ii）該個体の感染状態を判定するため、工程（i）において測定された強度を対照値と比較する工程。
[本発明1002]
試料の白血球細胞が、単球および／または多形核好中球より選択されることを特徴とする、本発明1001の方法。
[本発明1003]
個体の状態が感染性である場合、該個体が、細菌感染、ウイルス感染、または真菌感染、好ましくは細菌感染を患っていることを特徴とする、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
生物学的試料が、個体の器官から得られた流体であることを特徴とする、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
生物学的試料が、肺液（pulmonary fluid）、腹水、脳脊髄液、血液試料、またはその他の任意の感染している可能性のある器官の液体であることを特徴とする、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
試料の細胞の自己蛍光強度が、浮遊細胞において測定されることを特徴とする、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
浮遊細胞の自己蛍光強度が、フローサイトメトリーまたは分光測光によって測定されることを特徴とする、本発明1006の方法。
[本発明1008]
試料の細胞の自己蛍光強度が、蛍光の観察に適合するスライド、好ましくは透明スライドガラスに化学的に固定され配置された細胞において測定されることを特徴とする、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1009]
試料の細胞の自己蛍光強度が、蛍光顕微鏡を使用して測定されることを特徴とする、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
細胞の試料が、少なくとも以下の工程を含む方法により、工程（i）の前に、透明材料のスライド上に単層で調製される、本発明1001〜1005、1008、および1009のいずれかの方法：
（a）試料の細胞を、少なくとも1種の細胞遠心分離（cytocentrifugation）システムに投入する工程、
（b）細胞をスライド上に塗抹するため、工程（a）で入手した装置を、好ましくは約600rpmで、約5分間、遠心分離する工程、
（c）細胞スポットを形成させるため、スライド上に塗抹された細胞を、少なくとも1滴の約4％パラホルムアルデヒド（PFA）により、好ましくは約10分間、化学的に固定する工程、
（d）予め固定した細胞スポットを、好ましくはPBS緩衝液により、濯ぐ工程、
（e）予め濯いだ細胞スポットを乾燥させる工程、
（f）予め乾燥させた細胞スポットに、蛍光の観察に適合する封入剤を少なくとも1滴、添加する工程、
（g）工程（f）から得られた細胞スポットに、好ましくはガラス製の、透明カバーガラスを載せる工程。
[本発明1011]
試料の白血球細胞が主として単球である場合、工程（i）において測定された自己蛍光強度が対照値より有意に高いならば個体の状態が感染性であることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
試料の白血球細胞が主として多形核好中球である場合、工程（i）において測定された自己蛍光強度が対照値より有意に低いならば個体の状態が感染性であることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1001]
少なくとも以下の工程を含む、個体に由来する生物学的標本から得られた白血球細胞の試料に基づき、該個体の感染状態を診断するためのインビトロの方法：
（i）該試料の平均細胞自己蛍光強度を測定する工程、および
（ii）該個体の感染状態を判定するため、工程（i）において測定された強度を対照値と比較する工程。
[本発明1002]
試料の白血球細胞が、単球および／または多形核好中球より選択されることを特徴とする、本発明1001の方法。
[本発明1003]
個体の状態が感染性である場合、該個体が、細菌感染、ウイルス感染、または真菌感染、好ましくは細菌感染を患っていることを特徴とする、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
生物学的試料が、個体の器官から得られた流体であることを特徴とする、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
生物学的試料が、肺液（pulmonary fluid）、腹水、脳脊髄液、血液試料、またはその他の任意の感染している可能性のある器官の液体であることを特徴とする、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
試料の細胞の自己蛍光強度が、浮遊細胞において測定されることを特徴とする、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
浮遊細胞の自己蛍光強度が、フローサイトメトリーまたは分光測光によって測定されることを特徴とする、本発明1006の方法。
[本発明1008]
試料の細胞の自己蛍光強度が、蛍光の観察に適合するスライド、好ましくは透明スライドガラスに化学的に固定され配置された細胞において測定されることを特徴とする、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1009]
試料の細胞の自己蛍光強度が、蛍光顕微鏡を使用して測定されることを特徴とする、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
細胞の試料が、少なくとも以下の工程を含む方法により、工程（i）の前に、透明材料のスライド上に単層で調製される、本発明1001〜1005、1008、および1009のいずれかの方法：
（a）試料の細胞を、少なくとも1種の細胞遠心分離（cytocentrifugation）システムに投入する工程、
（b）細胞をスライド上に塗抹するため、工程（a）で入手した装置を、好ましくは約600rpmで、約5分間、遠心分離する工程、
（c）細胞スポットを形成させるため、スライド上に塗抹された細胞を、少なくとも1滴の約4％パラホルムアルデヒド（PFA）により、好ましくは約10分間、化学的に固定する工程、
（d）予め固定した細胞スポットを、好ましくはPBS緩衝液により、濯ぐ工程、
（e）予め濯いだ細胞スポットを乾燥させる工程、
（f）予め乾燥させた細胞スポットに、蛍光の観察に適合する封入剤を少なくとも1滴、添加する工程、
（g）工程（f）から得られた細胞スポットに、好ましくはガラス製の、透明カバーガラスを載せる工程。
[本発明1011]
試料の白血球細胞が主として単球である場合、工程（i）において測定された自己蛍光強度が対照値より有意に高いならば個体の状態が感染性であることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
試料の白血球細胞が主として多形核好中球である場合、工程（i）において測定された自己蛍光強度が対照値より有意に低いならば個体の状態が感染性であることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
発明の詳細な説明
本発明の方法は、リスクを有する個体における細菌性および／またはウイルス性の病原体の存在を診断するため、免疫系の特別な細胞の自己蛍光を使用する。細菌性および／またはウイルス性の感染性病原体は、TLRの活性化を介して、これらの免疫細胞における初期代謝活性を引き起こすことができる。この代謝活性は、その細胞内自己蛍光を特徴とする、細胞エネルギー代謝に関与している必須の補酵素のうちの1種であるNAD(P)Hの濃度の変動と相関し得る（Mayevsky A et al.,Am J.Physiol.Cell Physiol.2007）。
本発明の方法は、リスクを有する個体における細菌性および／またはウイルス性の病原体の存在を診断するため、免疫系の特別な細胞の自己蛍光を使用する。細菌性および／またはウイルス性の感染性病原体は、TLRの活性化を介して、これらの免疫細胞における初期代謝活性を引き起こすことができる。この代謝活性は、その細胞内自己蛍光を特徴とする、細胞エネルギー代謝に関与している必須の補酵素のうちの1種であるNAD(P)Hの濃度の変動と相関し得る（Mayevsky A et al.,Am J.Physiol.Cell Physiol.2007）。
この内在性の蛍光シグナルは、一般的に、蛍光プローブを使用する研究の状況においては厄介なものであるが、癌研究および細胞代謝の領域において既に活用されており、その研究は、様々な代謝状態を区別することを可能にしている（米国特許第6,289,236号、Palmer GM et al.,Photochem Photobiol 2003；Li BH et al.,World J.Gastroenterol.2006）。しかしながら、免疫系の細胞の自己蛍光を使用する診断試験、特に、本発明者らによって同定されたものは、かつて記載されておらず、示唆されてもいない。
この領域においては、二つの研究のみが実施されている：第一に、Pettyらのチームは、多形核好中球の様々な活性化状態の特徴決定を試みることにより、免疫アゴニストによって刺激された多形核好中球における自己蛍光シグナルの時間的および空間的な振動を示した（Petty H.R.et al.,PNAS 2001;98:3145-3149）。この研究は、好中球および単球の自己蛍光が、主として、細菌活性化シグナルによって誘導され得る、時間的な振動および有意な細胞内置換を受けるNADHの存在によることを想起させる。研究されたシグナルが、0.1μs〜20μsの時間スケール、および数ミクロンの空間スケールでの、時間的および空間的な自己蛍光強度の波状変動のシグナルであることに注意することが重要である。従って、時空的な波状変化は、PNNのインビトロ免疫刺激に続く極小の時間的間隔で（関連のある免疫アゴニストによる刺激の数μs後に）起こる。従って、これらの結果は、時間的に短か過ぎ、空間的に局所的であり過ぎるため、これらの自己蛍光増減を診断法のために使用することを断念させるものである。実際、診断法の観点からは、感染の時点T1以後に修飾される代謝状態が、経時的に安定しており、試料が採取される時点T2において定量可能であることが必要である。関心対象の細胞の刺激から、活性化された代謝状態の証明までの時間間隔は、実際、数時間〜数日に相当するため、従って、それは、Pettyらによって記載された時間スケールとは完全に非適合性である。
第二の研究は、肺のマクロファージの自己蛍光に対するタバコの効果の証明に関する。Paulyらは、喫煙がこの自己蛍光の強度を増加させることを実際に同定した（Pauly J.L.et al.,Microsc Res Tech 2005）。
さらに、国際特許出願WO99/50642は、病気の患者の血漿を対照のものから区別する放出スペクトル特徴を確立するための、ウイルス感染（エイズウイルスまたは肝炎ウイルス）を患っている患者の全血漿の自己蛍光の活用に基づき、感染を診断する方法を記載している。本発明の方法は、（WO99/50642によって提唱されるような）血漿の自己蛍光ではなく、特異的な細胞、即ち、全血または感染している可能性のある器官から得られた免疫細胞（好ましくは、中でも単球および多形核好中球）の自己蛍光を利用する。
本発明者らは、白血球細胞の自己蛍光、特に、活性化に関連したこの自己蛍光のモジュレーションを活用することを可能にする実験プロトコルを初めて開発した。従って、本発明者らは、標的個体の感染状態を評価するための、再現性があり、信頼性があり、かつ効果的なシステムを提唱する。
従って、第一の局面において、本発明は、少なくとも以下の工程を含む、個体に由来する生物学的標本から得られた免疫細胞の試料に基づき、該個体の感染状態を診断するためのインビトロの方法に関する：
（i）該試料の平均細胞自己蛍光強度を測定する工程、および
（ii）該個体の感染状態を判定するため、工程（i）において測定された強度を対照値と比較する工程。
（i）該試料の平均細胞自己蛍光強度を測定する工程、および
（ii）該個体の感染状態を判定するため、工程（i）において測定された強度を対照値と比較する工程。
本発明の状況において、個体の状態が「感染性」である場合、該個体は、微生物、好ましくは細菌、ウイルス、または真菌（酵母もしくは糸状菌）に感染している。より好ましくは、個体は、細菌感染を患っている。この状態は、事前に既に診断されていてもよく、個体は抗感染処置（抗生物質）に供されていてもよい。この場合、本発明の診断法は、感染がまだ存在するか否か、および／または処置が中止され得るか否かを評価することを目的とする。
本明細書において、「個体」とは、動物または哺乳動物、特に、ヒトをさす。
「生物学的」標本とは、本発明において、好ましくは感染している可能性のある器官から得られたものであり、従って、白血球細胞を含有している、生物学的液体の標本として定義される。例えば、本発明の状況において、肺液（肺炎の場合）、腹水（腹水の感染）、脳脊髄液（髄膜炎）、または血液、またはその他の任意の感染している可能性のある器官の試料を採取することが可能である。
本発明の状況において、「生物学的標本から得られた細胞の試料の入手」は、（1）個体、好ましくは個体の器官からの、生物学的流体の試料の採取、および（2）特に、血液試料の状況における、精製された細胞の試料を入手するための、従来の細胞生物学的方法による、この試料からの関心対象の細胞の精製からなる。
血液以外の生物学的流体が使用される時には、関心対象の細胞を優先的に入手するための細胞精製の随意の工程が必要でないことに注意するべきである。実際、感染の場合、その他の流体（肺液、脳脊髄液、または腹水）が採取された場合には、これらの流体が含有している細胞の大多数が、関心対象の細胞（PNNおよび単球）であり、従って、それらを精製する必要はない。
血液試料の場合、採取される容量は、精製後に関心対象の細胞を十分に入手するため、好ましくは少なくとも10ml〜20mlである。器官からの流体の試料の場合、数mlで十分である（1サイトスピンウェル当たり500μl〜1ml）。
本発明の診断法において使用され得る細胞の試料は、即座に（実際、試料が採取されてから5時間後未満で）使用するため、室温で保存されてもよいし、または細胞の精製／単離、固定、および／もしくは自己蛍光強度の測定の作業まで、細胞の完全性を保存するため、4℃の温度で保存されてもよい。
本発明の状況において、本発明の診断法の工程（i）において測定される「平均細胞自己蛍光強度」は、細胞浮遊液についての全自己蛍光強度、または少なくとも約50個の細胞、好ましくは約100個の細胞において入手した中央細胞値である。次いで、（1）可能性のある汚染細胞による自己蛍光の値をこの全値から差し引き、（2）研究された試料に存在する関心対象の細胞（単球または多形核好中球）の数で、この残りの強度を割ることが望ましい。この最終値が、本発明の状況における平均細胞強度であろう。
今日、多数のソフトウェアパッケージが、細胞自己蛍光レベルの定量化を即座に入手し、多数の細胞についての平均値を計算することを可能にする（例えば、MetaMorph、ImageJ、Imaris、または当業者に公知のその他の画像処理ソフトウェア）。
試験される個体の自己蛍光強度を比較するための望ましい「対照」値（または「標準」）は、少なくとも7日間、処置（特に、抗生物質または抗炎症処置）を受けておらず、明言された検出可能な感染（例えば、発熱、疼痛、苦痛等のような感染の兆候または症状）を示さない数人の健康な個体から得られた多数の単離された細胞から入手した平均細胞自己蛍光強度である。この対照値は、典型的には、少なくとも5人の健康な個体から単離された少なくとも100個の細胞において計算される。それは、試験される患者について使用されるであろう（特に、使用される光学材料、細胞固定法、励起波長、および放出波長、温度、pH等に関する）標準的な実験パラメーターを使用して事前に計算される。
「白血球細胞」または「白血球」とも呼ばれる免疫細胞は、自然免疫の状況において、異物に対する生物の防御における役割を本質的に果たす、単核または分葉（multi-lobed）核を含有しているヒト血球細胞である。白血球細胞の中で、単核細胞（B細胞、T細胞、単球、マクロファージ）は、多形核細胞（または好中球、好酸球、および好塩基球を含む「顆粒球」）と区別される（Keneth M.Murphy,Paul Tavers,& Mark Walport,Janeway's Immunobiology.7th Edition）。
好ましくは、本発明の状況において、試料の白血球細胞は、単球および／または多形核好中球より選択される。
本発明の診断法の変法において、細胞試料は、好ましくは少なくとも約80％、好ましくは約90％のPNN、さらに好ましくは少なくとも約95％のPNNを含有している。
器官から直接採取されたある種の生物学的流体は、PNNのみを含有していることが公知である。例えば、気管支肺胞洗浄液および腹水からの流体は、主としてPNNを含有している（E.Pilly,Maladies infectieuses et tropicales,22nd edition,2010）。この場合、予備的な精製工程は、必要ないであろう。
好ましくは、本発明において使用される生物学的流体の試料は、少なくとも約80％、好ましくは約90％のPNN、さらに好ましくは、少なくとも約95％のPNNを天然に含有しているため、精製工程を経ないであろう。従って、生物学的流体の試料は、優先的には、BAL、腹水、または脳脊髄液（CSF）の試料である。
にも関わらず、本発明の方法において使用され得る細胞試料を入手するために精製工程が必要とされる場合（特に、血液試料の場合）、まず、多核血球細胞を単離し、次いで、例えば、磁気カラム（抗CD16）での分離による選択のような、当業者に公知の技術によって、多形核好中球を入手することが好ましい。生物学的流体から多核細胞の試料を入手するためには、当業者に周知の技術のうちの一つを使用することが望ましい。例えば、密度勾配技術、および、それに次ぐ、多形核細胞に本質的に相当するより低いバンドの回収を挙げることができる（下記実施例に記載されるCederlane（登録商標）Tebu-bioの技術を参照のこと）。
大部分の肺炎例が、主として好中球（主としてPNN）の組成を有する。しかしながら、主として単球または混合型（50/50）であるものも存在する。これらの割合は、肺炎の原因となった病原体、個体、および／または肺炎の進行度に依る。本発明において言及された生物学的流体（血液、肺液、脳脊髄液、腹水）は、全て、ある種の特定の感染例において、主として単球を含有している可能性がある。
従って、本発明の診断法のもう一つの変法において、細胞試料は、好ましくは少なくとも約80％、好ましくは約90％の単球、さらに好ましくは少なくとも約95％の単球を含有している。
好ましくは、本発明において使用される生物学的流体の試料は、（肺液、脳脊髄液、または腹水の場合）少なくとも約80％、好ましくは約90％の単球、さらに好ましくは少なくとも約95％の単球を天然に含有しているため、精製工程を経ないであろう。
精製工程が必要とされる（例えば、試料が血液のものである）場合、当業者に周知の技術によって単核細胞から単球を単離することができる。例えば、磁気カラム（抗CD14抗体）での分離によるポジティブ選択を実施することができる。生物学的流体から単核細胞（リンパ球、単球、マクロファージ）の試料を入手するためには、当業者に周知の細胞生物学的技術を使用することが好ましい。例えば、密度勾配技術を使用し、次いで、これらの細胞を含むより高いバンドを回収することができる（下記実施例に記載されるCederlane（登録商標）Tebu-bioの技術を参照のこと）。
蛍光とは、分子が、（ある光子の吸収の後）励起状態から基底状態へ戻るため、別の光子を放出する特性である。細胞は、可視域または紫外（UV）域の波長の光線により励起された時に蛍光性になり得る分子を含有している。内在性フルオロフォアから発せられるこの蛍光の放出は、「自己蛍光」または「内在性蛍光」と呼ばれる細胞の固有の特性であり、外来性マーカーの添加によって入手される蛍光シグナルとは区別されなければならない。公知のフルオロフォアは、芳香族アミノ酸、親油性色素、NADPH、フラビン、およびポルフィリンである。自己蛍光は、特異的なマーキングを必要としない（Monici M.,Biotechnol Annu Rev.2005）。
関連波長域の光の十分に強力な強度を提供することができる限り、本法において使用される光源は、光学ツールの任意の形態をとることができる。LASER UV（アルゴン）源は、そのような特徴を有する入射ビームを提供することができるが、細胞NADHの励起に適合する波長域を提供することができるその他の光学ツールが使用されてもよい。これは、LASERダイオードのある種のランプ（水銀、ハロゲン等）および（広範な波長域で連続的な放出スペクトルを放つ）白色LASERランプに当てはまる。
生物学的自己蛍光を明らかにし測定するためには、（1）浮遊細胞、即ち、支持体に付着しておらず、適当な液体培地中を自由に移動する細胞を使用してもよいし、または（2）透明支持体、好ましくはスライドガラスに固定された細胞を使用してもよい。
本発明の特定の態様によると、試料の細胞の自己蛍光強度は、浮遊細胞において測定される。この特定の態様において、自己蛍光は、これらの細胞を見ることができる観察手段なしに、蛍光を測定するシステムにより、例えば、フローサイトメトリー、分光測光法、または顕微分光蛍光法によって測定され得る。
この場合、平均自己蛍光強度は、各試料の全蛍光を測定するシステム（フローサイトメーター、分光光度計）によって自動的に測定される。
本発明のもう一つの具体的な態様において、試料の細胞の自己蛍光強度は、蛍光の観察に適合するスライド、好ましくは透明スライドガラスの上に配置された化学的に固定された細胞において測定され、その場合、自己蛍光は、従来の蛍光顕微鏡検（落射蛍光顕微鏡検）、共焦点顕微鏡検、または二光子顕微鏡検の装置により測定される。
次いで、顕微鏡に連結されたカメラのような適当な装置から入手した画像を処理するソフトウェアによって、平均自己蛍光強度が測定される。
それに限定されることは望まないが、本発明の状況において、フローサイトメーター、従来の分光光度計、または強度イメージングもしくは光子計数を使用して蛍光シグナルを入手することを可能にする任意の型の顕微鏡が使用され得る。
本発明の好ましい態様において、自己蛍光強度は、従来の落射蛍光顕微鏡を使用して、透明スライドガラス上に固定された細胞について測定される。
本発明のさらにより好ましい態様において、試料の細胞の自己蛍光強度は、約300nm〜約600nmの範囲、好ましくは約350nm〜約450nmの範囲の波長により細胞を励起する落射蛍光顕微鏡を使用して測定される。この励起は、好ましくはレーザーUV源を使用することにより実施される。
さらに、本発明の工程（i）において測定される試料の細胞の自己蛍光強度は、好ましくは約400nm〜約700nmの範囲、好ましくは約450nm〜約600nmの範囲の波長で放出されるものである。
極めて具体的な態様において、試料の細胞の自己蛍光強度は、連続アルゴンUVレーザー源、約400nm〜約550nmの波長域で高感度である光電子増倍管、開口ピンホール、およびX63/1.4油浸レンズを有する共焦点蛍光顕微鏡を使用して、本発明の診断法の工程（i）において測定される。
本発明の一つの態様において、平均細胞自己蛍光強度は、生細胞において測定される。
優先様式において、これらの生細胞は、器官から単離され、好ましくは（細胞培養物ウェルまたは下記の最初の実験段階において使用されたLabTek（登録商標）のような）光学活用ツールに移行され得る培養装置において、液体培地に再び浮遊させられた。
この場合、本発明者らは、信頼性がありかつ再現性のある様式で、生細胞において自己蛍光を測定するためには、自己蛍光の測定の間中、培養培地のpHおよび温度を一定値（好ましくは7〜8、さらに好ましくは7.4のpH、および37℃に維持された温度）に維持することが重要であることを示した。さもなければ、測定される自己蛍光強度値は、より信頼性が低く、より再現性が低いものとなるであろう。
しかしながら、本発明の好ましい態様において、試料の細胞自己蛍光強度は、例えば、パラホルムアルデヒドを使用して、化学的に固定された細胞、即ち、特定の細胞代謝状態で固定された細胞において測定される。
この態様において、生物学的標本の細胞は、生物学的試料が採取された後可能な限り迅速に、好ましくは5時間未満で、化学的に固定される。実際、ある種の状態で白血球細胞を固定することによって、研究されるのは瞬間の細胞代謝状態となる。これは、生細胞を研究する方法が必要とするであろう、生細胞状態の永続に関連した技術的問題を全て回避することを可能にする。このため、試料の採取と、試料の細胞の固定との間の時間を最小化することが重要である。生細胞においてのみ、従って、固定工程の前にのみ精製工程を行うことができる、血液試料の特定の場合が注意される。
本発明者らは、下記の二つの型の免疫細胞（単球およびPNN、下記実施例3を参照のこと）について自己蛍光の信頼性のある測定を入手するため、数種の固定法および数種のスライド封入システムを試験した。このようにして、本発明の方法の制約に適合した一般的な細胞試料処理プロトコル、即ち、これらの二つの細胞型についての信頼性がありかつ再現性のある結果を入手することを可能にする、十分な自己蛍光シグナルを確実にするものを同定した。
この好ましい態様においては、細胞を、細胞遠心分離によってガラス顕微鏡用スライド上に単層で調製した後、パラホルムアルデヒド（PFA）によりスライド上に固定し、洗浄し、乾燥させ、次いで、最後に、蛍光の観察に適合する封入剤で封入した後、カバーガラスを被せなければならない。
より正確には、本発明の方法のこの具体的な態様において、細胞の試料は、少なくとも以下の工程を含む方法により、工程（i）の前に、透明材料の、好ましくはガラス製の、スライド上に単層で調製される：
（a）試料からの細胞を、少なくとも1種の細胞遠心分離システムに投入する工程、
（b）細胞をスライド上に塗抹するため、好ましくは約600rpmで、約5分間、工程（a）で入手した装置を遠心分離する工程、
（c）細胞スポットを形成させるため、スライド上に塗抹された細胞を、少なくとも1滴の約4％パラホルムアルデヒド（PFA）により、好ましくは約10分間、化学的に固定する工程、
（d）好ましくはPBS緩衝液により、予め固定した細胞スポットを濯ぐ工程、
（e）予め濯いだ細胞スポットを乾燥させる工程、
（f）予め乾燥させた細胞スポットに、蛍光の観察に適合する封入剤を少なくとも1滴、添加する工程、
（g）工程（f）から得られた細胞スポットに、好ましくはガラス製の、透明カバーガラスを載せる工程。
（a）試料からの細胞を、少なくとも1種の細胞遠心分離システムに投入する工程、
（b）細胞をスライド上に塗抹するため、好ましくは約600rpmで、約5分間、工程（a）で入手した装置を遠心分離する工程、
（c）細胞スポットを形成させるため、スライド上に塗抹された細胞を、少なくとも1滴の約4％パラホルムアルデヒド（PFA）により、好ましくは約10分間、化学的に固定する工程、
（d）好ましくはPBS緩衝液により、予め固定した細胞スポットを濯ぐ工程、
（e）予め濯いだ細胞スポットを乾燥させる工程、
（f）予め乾燥させた細胞スポットに、蛍光の観察に適合する封入剤を少なくとも1滴、添加する工程、
（g）工程（f）から得られた細胞スポットに、好ましくはガラス製の、透明カバーガラスを載せる工程。
この極めて具体的な態様において、試料の平均細胞自己蛍光強度を測定する工程（i）は蛍光顕微鏡を使用して実施される。
工程（a）において、遠心分離システムのウェルへ導入される細胞の数は、有利には、1ウェル当たり500μl〜1mlの容量で、500,000〜1,000,000個である。
これらの細胞は、好ましくはガラス製の、透明顕微鏡用スライドに連結されたウェルからなる、サイトスピン型細胞遠心分離システム（例えば、Shandon Cytospin（登録商標）の名称でThermo Electron Corporationにより市販されているもの）に投入される。
細胞遠心分離は、ウェル内に配置された関心対象の細胞を、透明材料の、好ましくはガラス製の、顕微鏡用スライド上の明確な区域に、単層で沈着させることを可能にし、サンプルチャンバーフィルターによって残液の吸収を可能にする、今日周知のテクノロジーである。遠心分離装置の動作中、装置の回転運動が、ウェルを垂直位に傾け、スライドの沈着区域へと細胞を遠心分離し、全ての細胞に同一の露出可能性を提供する。
関心対象の細胞を沈着させる透明スライド（または「顕微鏡用スライド」）は、好ましくはFisher Scientificによって市販されているもののような、1.2mm〜1.5mmの範囲、好ましくは1.5mmの厚さの細胞蛍光の分析に適合したスライドガラスである。
次いで、工程（a）において入手した装置を遠心分離する。この工程（b）の遠心分離は、400〜1000rpm、好ましくは約600rpm（41g）で、約5分間、実施される。
次いで、工程（c）を実施するため、顕微鏡用スライドを遠心分離装置から取り出し、工程（b）の後に入手した細胞スポットを、約2％〜6％の範囲、好ましくは約4％の濃度にPBS溶液で希釈されたパラホルムアルデヒド（PFA）溶液により化学的に固定する。
PFAの量は、有利には、細胞約106個に対して約15μlのパラホルムアルデヒド（PFA）、またはスライド上に塗抹された細胞スポットに対して1mlのPFAの液滴である。
PFA固定時間は、2分〜20分であり、好ましくは約10分である。
次いで、固定された細胞スポットを、残余PFAを排除するため、例えば、PBSにより濯ぐ（工程（d））。一般に、残余PFAを効果的に排除するためには、3回の洗浄が必要とされる。
工程（e）において、細胞スポットを、室温で、必要される時間、約10分間、例えば、空気により、完全に乾燥させる。
次いで、細胞スポットに、蛍光の観察に適合する封入剤の液滴（好ましくは20μl）を被せる。この封入剤は、例えば、「ProLong（登録商標）Gold」または「Fluoromount」封入剤、または「Vectashield Slow Fade」である。好ましくは、この封入剤は「ProLong（登録商標）Gold」である。
次いで、最後に、Fisher Scientificによって提供されるもののような、典型的には、0.13〜0.17mmの厚さの、好ましくはガラス製の、蛍光の測定に適合したカバーガラスを、試料に被せなければならない。
本発明者らは、試験される患者の試料の平均細胞自己蛍光強度を、いわゆる「対照」値と比較することによって、試料の白血球細胞が主として単球である場合、工程（i）において測定された自己蛍光強度が対照値より有意に高いならば個体の状態が感染性であることを示した。
換言すると、少なくとも約70％、好ましくは少なくとも約80％、さらに好ましくは少なくとも約90％の単球を含む細胞の試料が、対照値より有意に高い自己蛍光シグナルを放出する場合、その生物学的流体の試料が採取された個体は、細菌感染、ウイルス感染、もしくは真菌感染を患っている（またはそれらにまだ感染中である）。
「有意に高い」という用語は、本発明の状況において、比［患者の平均細胞強度］／［対照値］が、少なくとも約1.2、有利には、約1.3〜3、好ましくは約1.5〜2であることを意味する。
本発明者らは、反対に、試験される患者に由来する試料の平均細胞自己蛍光強度を、いわゆる「対照」値と比較することによって、試料の白血球細胞が主として多形核好中球である場合、工程（i）において測定された自己蛍光強度が対照値より有意に低い場合、個体の状態が感染性であることを示した。
2種の細胞集団の間の結果の違いは、とりわけ、これらの2種の細胞の極めて異なる代謝的性質によって説明され得る。
換言すると、細胞の試料が、少なくとも約70％、好ましくは少なくとも約80％、さらに好ましくは少なくとも約90％の多形核好中球を含み、対照値より有意に低い自己蛍光シグナルを放出する場合、その生物学的流体の試料が採取された個体は、細菌感染、ウイルス感染、もしくは真菌感染を患っている（またはそれらにまだ感染中である）。
「有意に低い」という用語は、本発明の状況において、比［患者の平均細胞強度］／ ［対照値］が、多くとも約0.8、有利には、約0.1〜0.7、好ましくは約0.1〜0.6であることを意味する。
従って、第二の局面において、本発明は、以下の工程を含む、上記の診断法において使用するための固定された細胞試料を調製する方法に関する：
（a）細胞を、少なくとも1種の細胞遠心分離システムに投入する工程、
（b）細胞をスライド上に塗抹するため、工程（a）で入手した装置を、好ましくは約600rpm（41g）で、約5分間、遠心分離する工程、
（c）細胞スポットを形成させるため、スライド上に塗抹された細胞を、少なくとも1滴の約4％パラホルムアルデヒド（PFA）により、好ましくは約10分間、化学的に固定する工程、
（d）予め固定した細胞スポットを、好ましくはPBS緩衝液により、濯ぐ工程、
（e）予め濯いだ細胞スポットを乾燥させる工程、
（f）予め乾燥させた細胞スポットに、蛍光の観察に適合する封入剤を少なくとも1滴、添加する工程、
（g）工程（f）から得られた細胞スポットに、好ましくはガラス製の、透明カバーガラスを載せる工程。
（a）細胞を、少なくとも1種の細胞遠心分離システムに投入する工程、
（b）細胞をスライド上に塗抹するため、工程（a）で入手した装置を、好ましくは約600rpm（41g）で、約5分間、遠心分離する工程、
（c）細胞スポットを形成させるため、スライド上に塗抹された細胞を、少なくとも1滴の約4％パラホルムアルデヒド（PFA）により、好ましくは約10分間、化学的に固定する工程、
（d）予め固定した細胞スポットを、好ましくはPBS緩衝液により、濯ぐ工程、
（e）予め濯いだ細胞スポットを乾燥させる工程、
（f）予め乾燥させた細胞スポットに、蛍光の観察に適合する封入剤を少なくとも1滴、添加する工程、
（g）工程（f）から得られた細胞スポットに、好ましくはガラス製の、透明カバーガラスを載せる工程。
工程（a）〜（g）は上記と同様である。
有利には、この調製法は、これらの工程を逐次的に実施することができるロボットによって自動的に実施され得る。
本発明の診断法のもう一つの利点は、単一の小型装置により、完全に自動的に実施され得るという事実にある：
（1）患者に由来する試料の自動調製、
（2）試料の平均細胞自己蛍光の自動測定、
（3）値の対照値との比較、
（4）結果の生成：患者における細菌性、ウイルス性、または真菌性の病原体の存在。
（1）患者に由来する試料の自動調製、
（2）試料の平均細胞自己蛍光の自動測定、
（3）値の対照値との比較、
（4）結果の生成：患者における細菌性、ウイルス性、または真菌性の病原体の存在。
この自動化されたシステムは、現在使用されている微生物学的技術よりはるかに速く、感染性病原体の存在の同定を目標とした遺伝学的技術よりはるかに安価であるという利点を有する。さらに、遺伝学的技術は、特に、細菌感染の場合、未だ完全にはバリデートされていない。
（1）使用された試薬および材料
全血を、3.8％(w/v)クエン酸ナトリウム0.5mlを含む4.5ml BD Vacutainer（登録商標）チューブに採取した。培養培地RPMI 1640は、Invitrogen（登録商標）（Paisley,United Kingdom）製である。
全血を、3.8％(w/v)クエン酸ナトリウム0.5mlを含む4.5ml BD Vacutainer（登録商標）チューブに採取した。培養培地RPMI 1640は、Invitrogen（登録商標）（Paisley,United Kingdom）製である。
密度勾配：Lympholyte-Poly（登録商標）は、Cedarlane Tebu-bio（登録商標）（Le Perrey-en-Yvelines,France）製である。単球を単離するためのMACS（登録商標）キットおよび抗CD14抗体は、Miltenyi Biotec（登録商標）（Paris）製である。大腸菌（Escherichia coli）0111:B4の精製リポ多糖（LPS）は、Sigma（登録商標）（Saint Louis,Missouri,United States of America）製である。Pam3Csk4（以後、PAM）は、InvivoGen（登録商標）（San Diego,United States of America）製である。fMLPは、Sigma-Aldrich（登録商標）（St Quentin Fallavier,France）製である。Lab-Tek（登録商標）共焦点顕微鏡検のための無菌観察チャンバーは、Brands Products（登録商標）（United States of America）製である。無菌の24穴プレートおよび円錐管は、Falcon（登録商標）、Becton Dickinson Labware（Europe,Le Pont de Claix,France）製である。特異的な封入剤ProLong（登録商標）Gold Antifade試薬は、Invitrogen製である（ref.：P36934）。細胞遠心分離および細胞試料のスライドへの塗抹のために使用された遠心分離装置は、Shandon Cytospin（登録商標）遠心分離装置である。
Orsayのバイオメディカルフォトニクスセンター（biomedical photonics ceneter）のイメージングユニット（imaging unit）において利用可能な顕微鏡は、Leica（登録商標）TCS SP5（登録商標）共焦点顕微鏡である。それは、4個の連続レーザー（2個のヘリウムネオンレーザー、633nmおよび543nm、可視アルゴンレーザー、458nm、476nm、488nm、および514nm、ならびにアルゴンUVレーザー、351nmおよび364nm）、ならびに1個の高パルスレートチタン／サファイア赤外レーザーを有する。使用された最初の取得モードは、AUで定量化された蛍光強度（If）の分析のものである。
（2）NAD(P)H自己蛍光シグナル取得の条件
初期の細胞観察に基づき、NAD(P)H自己蛍光強度の画像分解能および生物学的試料の悪化に関して最良の折衷を与える最適の光学実験条件を設定した。
初期の細胞観察に基づき、NAD(P)H自己蛍光強度の画像分解能および生物学的試料の悪化に関して最良の折衷を与える最適の光学実験条件を設定した。
蛍光強度シグナルの取得のため、連続アルゴンUVレーザー源（λ＝364nm、P＝1.3mW）および400nm〜550nmの波長域の光電子増倍管（ゲイン＝1250V）を、最大開口の1/3に開かれたピンホール、X63油浸レンズと共に使用した。246μm/246μmの最終サイズについて1024ピクセル/1024ピクセルの解像度を有する4個の画像の平均値を、Ifで画像を表示するために適用した。
（3）エクスビボで刺激されたヒトの単球およびPNNから入手した細胞学的自己蛍光の活用可能性の証明
有志者のインフォームドコンセントの後、8人の健康有志者から20mlの全血を採取した。健康有志者の集団は、少なくとも7日間、いかなる処置も受けていない、特に、抗生物質および抗炎症薬を受けていない、25〜60才の男女から構成されていた。彼らは、明らかに発生中の感染を示さなかった。血液は、肘の内側の静脈の穿刺によって入手した。
有志者のインフォームドコンセントの後、8人の健康有志者から20mlの全血を採取した。健康有志者の集団は、少なくとも7日間、いかなる処置も受けていない、特に、抗生物質および抗炎症薬を受けていない、25〜60才の男女から構成されていた。彼らは、明らかに発生中の感染を示さなかった。血液は、肘の内側の静脈の穿刺によって入手した。
単球の入手について：
当業者に周知の密度勾配技術（Lympholyte-Poly（登録商標）（Cedarlane Tebu-bio（登録商標）,Le Perrey-en-Yvelines,France））を使用して、各血液試料（20ml）から、単核細胞（MNC）を単離した。この技術は、2本の別個の細胞のバンド、回収されたMNC（リンパ球および単球）の上方バンドと、多形核好中球から本質的に構成される多核細胞の下方バンドとを入手することを可能にする。次いで、磁気カラム（MACS（登録商標）（Miltenyi Biotec,Paris））での分離によるポジティブ選択技術を使用して、MNCから単球を単離した。次いで、血中単球を、RPMI 1640＋4％ヒト血清＋ペニシリンG（100U/ml）およびストレプトマイシン（100ng/ml）（Valbiotech）に浮遊させた。
当業者に周知の密度勾配技術（Lympholyte-Poly（登録商標）（Cedarlane Tebu-bio（登録商標）,Le Perrey-en-Yvelines,France））を使用して、各血液試料（20ml）から、単核細胞（MNC）を単離した。この技術は、2本の別個の細胞のバンド、回収されたMNC（リンパ球および単球）の上方バンドと、多形核好中球から本質的に構成される多核細胞の下方バンドとを入手することを可能にする。次いで、磁気カラム（MACS（登録商標）（Miltenyi Biotec,Paris））での分離によるポジティブ選択技術を使用して、MNCから単球を単離した。次いで、血中単球を、RPMI 1640＋4％ヒト血清＋ペニシリンG（100U/ml）およびストレプトマイシン（100ng/ml）（Valbiotech）に浮遊させた。
PNNの入手について：
各血液試料（12ml）から、Ficolでの遠心分離（40分、1600rpm、+4℃）により、RPMI＋ヒト血清（4％）＋EDTA（5％）に浮遊した下方バンドを回収することができた。次いで、この培地で2回の洗浄を実施した（10分、1600rpm、+4℃）。次いで、磁気カラム（MACS（登録商標）（Miltenyi Biotec,Paris））での分離によるネガティブ選択により、抗CD16抗体の添加による好酸球の枯渇を実施した。次いで、PNNを、RPMI 1640＋4％ヒト血清＋ペニシリンG（100U/ml）およびストレプトマイシン（100μg/ml）（Valbiotech）に浮遊させた。
各血液試料（12ml）から、Ficolでの遠心分離（40分、1600rpm、+4℃）により、RPMI＋ヒト血清（4％）＋EDTA（5％）に浮遊した下方バンドを回収することができた。次いで、この培地で2回の洗浄を実施した（10分、1600rpm、+4℃）。次いで、磁気カラム（MACS（登録商標）（Miltenyi Biotec,Paris））での分離によるネガティブ選択により、抗CD16抗体の添加による好酸球の枯渇を実施した。次いで、PNNを、RPMI 1640＋4％ヒト血清＋ペニシリンG（100U/ml）およびストレプトマイシン（100μg/ml）（Valbiotech）に浮遊させた。
このようにして入手した2種の細胞集団（PNNおよび単球）を、106細胞/mlの細胞密度で、免疫アゴニストの存在下で、90分間インキュベートした。LPSを50μg/mLの最終濃度で使用し、PAMを10μg/mLの最終濃度で使用し、fMLPを10-6モル/lの最終濃度で使用した。
90分後、500μlの容量の細胞試料（5・105細胞）を慎重に回収し、Cytospin（登録商標）装置により細胞診スライドに連結されたウェルに投入した。遠心分離スライド塗抹サイクルを、低い加速度−減速度で、600rpmで、8分間実施した。スライド上に塗抹された細胞スポットを、1滴の4％パラホルムアルデヒド（PFA）により10分間固定した後、標準的なPBS緩衝溶液により、3回、慎重に濯いだ。完全乾燥の後、新鮮に解凍したProLong（登録商標）Gold Antifade試薬封入剤の20μlの液滴を、固定された細胞スポットの上に置いた。次いで、気泡の形成を回避するため注意しながら、慎重に、封入剤の液滴の上にカバーガラスを配置した。
次いで、このようにして入手した細胞学スライドを、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して観察した。蛍光強度シグナルの取得のため、連続アルゴンUVレーザー源（λ＝364nm、P＝1.3mW）および400nm〜550nmの波長域の光電子増倍管（ゲイン＝1250V）を、最大開口の1/3に開かれたピンホールおよびX63油浸レンズと共に使用した。246μm/246μmの最終サイズについて1024ピクセル/1024ピクセルの解像度を有する4個の画像の平均値を、Ifで画像を表示するために適用した。
対照単球と比べた10％〜18％のIfの有意な増加が、刺激された単球について認められる。さらに、刺激されたPNNについては、対照PNNと比べたIfの有意な減少（2桁）が認められる。従って、刺激された単球についても、刺激されたPNNについても、対照単球または対照PNNと比べた自己蛍光Ifの違いが存在するようである。刺激された細胞のIfの変動の方向についてのこの「PNN−単球」対比は、細胞エネルギー代謝および病原体に対する防御の手段の基本的な違いによって、おそらく説明される。
細胞遠心分離プロトコル（サイトスピン）に関して、数種の回転スピード（300rpm、600rpm、800rpm）を、数種の遠心分離時間（6分、8分、10分）と共に試験した。600rpm、8分間の力の組み合わせが、最も好成績であり、細胞診試料調製時間に関して最も有利であることが判明した。
細胞試料を固定するための数種のプロトコル、特に、4％PFAおよびエタノール含有アルコールスプレー（Merckofix Spray,Merck art）を、アセトンまたはエタノールまたはメタノールでの-20℃での固定と共に試験した。細胞自己蛍光の活用可能性に関する最良の結果は、4％PFAの使用で認められた。
スライドとカバーガラスとの間へ細胞試料を封入するための数種の方法、特に、Eukitt Mounting Medium（ProSciTech）、Fluoromount-G（SouthernBiotech）、およびProlong Gold Reagent（Invitrogen,Molecular Probes）を試験した。細胞試料の自己蛍光の活用可能性に関する最良の結果は、Prolong Gold Reagentで認められた。
（4）肺炎のマウスモデルから採取されたBAL細胞の自己蛍光の活用可能性の証明
ブドウ球菌肺炎のモデルに関しては、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（MSSA）の株（ATCC 29213株）を、トリプティックソイ（tryptic soy）培地において37℃で16時間増殖させた。使用直前に、培養物を2回洗浄し（1000gで10分間遠心分離し）、無菌の等張生理食塩水で希釈し、それを分光法によって較正した。細菌濃度を、定量培養によって系統的にモニタリングした。
ブドウ球菌肺炎のモデルに関しては、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（MSSA）の株（ATCC 29213株）を、トリプティックソイ（tryptic soy）培地において37℃で16時間増殖させた。使用直前に、培養物を2回洗浄し（1000gで10分間遠心分離し）、無菌の等張生理食塩水で希釈し、それを分光法によって較正した。細菌濃度を、定量培養によって系統的にモニタリングした。
緑膿菌肺炎のモデルに関しては、野生型緑膿菌株を、トリプティックソイ液体培地において37℃で18時間増殖させた。気管内滴注の直前に、培養物を2回洗浄し（37℃で5000gで10分間遠心分離し）、無菌の等張生理食塩水で希釈し、それを分光法によって較正した後、1・106CFU/mlの濃度を入手するために比濁分析により較正した。対照は、セトリミド寒天（緑膿菌用の選択培地）において調製される。
マウスにイソフルラン麻酔を施し、背臥位に配置した。気管のカテーテル挿入および70μlの細菌溶液（ブドウ球菌または緑膿菌）の注射のため、経腸供給針（24ゲージ）を使用した。次いで、接種材料の浸透を改善するため、マウスを、30秒間、門歯によって吊り下げた。気管内滴注率は100％に達した。
24時間後、安楽死の直後に、経皮経路によって、気管にカテーテル挿入（24ゲージカテーテル）することにより、気管支肺胞洗浄を実施した。次いで、1mlの生理食塩水溶液により、3回、洗浄を実施した。次いで、Malassez計数チャンバーを使用して細胞計数を実施した。次いで、肺胞洗浄液を遠心分離し（10分、5000g、37℃）、細胞ペレットを、1・106細胞/mlにするために十分な生理食塩水溶液に再び浮遊させた。
500μlの容量の細胞試料（5・105細胞）を慎重に回収し、Cytospin（登録商標）装置により顕微鏡検スライドに連結されたウェルに投入した。遠心分離スライド塗抹サイクルを、低い加速度−減速度で、600rpmで、8分間実施した。スライド上に塗抹された細胞スポットを、1滴の4％パラホルムアルデヒド（PFA）で10分間固定した後、PBS緩衝溶液により3回、慎重に濯いだ。完全乾燥の後、新鮮に解凍したProLong（登録商標）Gold Antifade試薬封入剤の20μlの液滴を、固定された細胞スポットの上に置いた。次いで、気泡の形成を回避するために注意しながら、慎重に、封入剤の液滴の上にカバーガラスを配置した。
肺胞洗浄液中に存在する様々なPNN／マクロファージ細胞型の割合を特徴決定した（ギムザ染色）：
* シャムに対して、p＜0.05
細菌溶液のいずれか（ブドウ球菌または緑膿菌）を接種されたマウスにおいて、マクロファージと比べたPNN細胞の数の高度に有意な増加が観察される。感染動物において観察された多形核好中球の、対照動物（シャム）に対する比率（％）は、細菌性肺障害の存在を確認する。
次いで、このようにして入手した試料スライドを、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して観察した。蛍光強度シグナルの取得のため、連続アルゴンUVレーザー源（λ＝364nm、P＝1.3mW）および400nm〜550nmの波長域の光電子増倍管（ゲイン＝1250V）を、最大開口の1/3に開かれたピンホールおよびX63油浸レンズと共に使用した。246μm/246μmの最終サイズについて1024ピクセル／1024ピクセルの解像度を有する4個の画像の平均値を、Ifで画像を表示するために適用した。
対照マウス8匹、緑膿菌肺炎を有するマウス9匹、およびブドウ球菌肺炎を有するマウス12匹を含む、29匹のマウスを研究した。肺炎を有するマウスからのスライドについての平均細胞自己蛍光強度は、対照マウスに由来するBALからの細胞と比べて、減少する。肺炎を有するマウスのBALからの細胞の大多数（PNN）は、対照マウスのBALからのものより少なく蛍光を発する（44.8AU対107.5AU）。肺炎を有するマウスのBALからの細胞の平均自己蛍光強度と、対照マウスのBALからの細胞の平均自己蛍光強度との間には、2桁の差が存在する。これらの結果は、対照マウスのBALから得られた細胞と、肺炎を患っているマウスのBALから得られた細胞とを区別することを可能にし；この判定は平均自己蛍光強度の違いに基づく。エクスビボでの刺激のモデルにおいて、感染マウスのBALからの細胞の自己蛍光シグナルの、単球のものとは反対の変動が観察されたことは、感染マウスのBALに含有されている細胞の大多数がPNNからなることを確認する。従って、この結果は、エクスビボで刺激された細胞の細胞学の先のモデルにおける、エクスビボで刺激されたPNNの自己蛍光強度の、未刺激PNN対照と比べた減少と一致している。刺激されたPNNと刺激された単球との間の平均自己蛍光強度の変動の方向の違いは、おそらく、エネルギー代謝、および刺激をもたらす病原体に対する防御の手段に関する顕著な違いにある。
書誌参照
Claims (18)
- 少なくとも以下の工程を含む、個体に由来する生物学的標本から得られた白血球細胞の試料に基づき、該個体の感染状態を診断するためのインビトロの方法：
（i）該試料の平均細胞自己蛍光強度を測定する工程、および
（ii）該個体の感染状態を判定するため、工程（i）において測定された強度を対照値と比較する工程。 - 試料の白血球細胞が、単球および／または多形核好中球より選択されることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 個体の状態が感染性である場合、該個体が、細菌感染、ウイルス感染、または真菌感染を患っていることを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
- 感染が細菌感染である、請求項3記載の方法。
- 生物学的標本が、個体の器官から得られた流体であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 生物学的標本が、肺液（pulmonary fluid）、腹水、脳脊髄液、血液試料、またはその他の任意の感染している可能性のある器官の液体であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 試料の細胞の自己蛍光強度が、浮遊細胞において測定されることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 浮遊細胞の自己蛍光強度が、フローサイトメトリーまたは分光測光によって測定されることを特徴とする、請求項7記載の方法。
- 試料の細胞の自己蛍光強度が、蛍光の観察のためのスライドに化学的に固定され配置された細胞において測定されることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 蛍光の観察のためのスライドが、透明スライドガラスである、請求項9記載の方法。
- 試料の細胞の自己蛍光強度が、蛍光顕微鏡を使用して測定されることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 細胞の試料が、少なくとも以下の工程を含む方法により、工程（i）の前に、透明材料のスライド上に単層で調製される、請求項1〜6、および9〜11のいずれか一項記載の方法：
（a）試料の細胞を、少なくとも1種の細胞遠心分離（cytocentrifugation）システムに投入する工程、
（b）細胞をスライド上に塗抹するため、該システムを、遠心分離する工程、
（c）細胞スポットを形成させるため、スライド上に塗抹された細胞を、少なくとも1滴の約4％パラホルムアルデヒド（PFA）により、化学的に固定する工程、
（d）予め固定した細胞スポットを、濯ぐ工程、
（e）予め濯いだ細胞スポットを乾燥させる工程、
（f）予め乾燥させた細胞スポットに、蛍光の観察のための封入剤を少なくとも1滴、添加する工程、
（g）工程（f）から得られた細胞スポットに、透明カバーガラスを載せる工程。 - 工程（b）が、約600rpmで、約5分間、実施される、請求項12記載の方法。
- 工程（c）が、約10分間、実施される、請求項12記載の方法。
- 工程（d）が、PBS緩衝液により実施される、請求項12記載の方法。
- 工程（g）のカバーガラスが、ガラス製である、請求項12記載の方法。
- 試料の白血球細胞が主として単球である場合、工程（i）において測定された自己蛍光強度が対照値より有意に高いならば個体の状態が感染性であることを特徴とする、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
- 試料の白血球細胞が主として多形核好中球である場合、工程（i）において測定された自己蛍光強度が対照値より有意に低いならば個体の状態が感染性であることを特徴とする、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
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