JP5854545B1

JP5854545B1 - Ｒ３ｒｐｔｐサブファミリーに属する受容体型プロテインチロシンホスファターゼの阻害剤のスクリーニング方法

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Publication number: JP5854545B1
Application number: JP2015093056A
Authority: JP
Inventors: 野田　昌晴; 昌晴野田; 隆史新谷
Original assignee: Inter University Research Institute Corp National Institute of Natural Sciences
Current assignee: Inter University Research Institute Corp National Institute of Natural Sciences
Priority date: 2015-04-30
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2016-02-09
Anticipated expiration: 2035-04-30
Also published as: JP2016208868A

Abstract

【課題】インスリンの欠乏又はインスリン受容体の活性低下に伴う疾患の予防又は治療のための薬剤として有用な物質を探索することができるスクリーニング方法を提供する。【解決手段】R3 RPTPサブファミリーに属する受容体型プロテインチロシンホスファターゼの阻害剤のスクリーニング方法において、リン酸化されたインスリン受容体由来の分子を基質として、被験化合物の存在下で前記基質に対し前記受容体型プロテインチロシンホスファターゼ由来の分子を作用させ、前記基質の脱リン酸化を指標として前記被験化合物の前記阻害剤としての有効性を評価する工程を含む。【選択図】図１

Description

本発明は、R3 RPTPサブファミリーに属する受容体型プロテインチロシンホスファターゼ（RPTP）の阻害剤のスクリーニング方法に関し、詳しくは、インスリンの欠乏又はインスリン受容体の活性低下に伴う疾患の予防又は治療のための薬剤として有用な物質のスクリーニング方法に関する。

タンパク質のチロシンリン酸化が関与する情報伝達機構は、細胞増殖や細胞分化、細胞移動、生体の恒常性維持などに重要な役割を果たしている。チロシンリン酸化は、リン酸化酵素であるプロテインチロシンキナーゼ(PTK)と、脱リン酸化酵素であるプロテインチロシンホスファターゼ(PTP)とによって可逆的に制御されている。PTKとPTPはそれぞれ、膜貫通領域を持たない細胞質型と、膜貫通領域を持つ受容体型に大別される。これらのうち、受容体型プロテインチロシンホスファターゼ(RPTP)は、哺乳類において21のメンバーが知られており、構造上の相同性から8つのサブファミリーに分類されている。本発明者らの研究グループは、R3 RPTPサブファミリーに属するPtproがRPTKのEphを基質とし、その活性化を制御することを報告している（非特許文献１参照）。

細胞質型プロテインチロシンホスファターゼに関しては、従来、PTP-1Bを欠損したマウスにおいてインスリンに対する感受性が上昇することが報告されている（非特許文献２参照）。また、特許文献１には、PTP-1B阻害薬となり得るホスホン酸誘導体について開示されている。

インスリン受容体（IR）は、細胞膜に存在する４サブユニットから成るタンパク質であり、インスリンと結合する２つのαサブユニットと、細胞膜を貫通し細胞質にチロシンキナーゼを内在する２つのβサブユニットとからなる。αサブユニットにインスリンが結合すると、細胞質側のチロシンキナーゼドメインが活性化され、自己リン酸化される。この自己リン酸化に伴い種々の細胞内タンパク質のリン酸化が行われることで細胞内の情報伝達が行われ、最終的にグルコース輸送体（GLUT4）が細胞膜に移動し、糖を細胞内に取り込む。

特表２００３−５２８１０７号公報

Nature Neuroscience (2006) 9巻6号761-769 Science 283,1544-1547,1999

世界の糖尿病人口は年々増え続けており、有効な対策を施さなければ更なる糖尿病有病者が増加すると予測されている。細胞内への糖の取り込みにはインスリンが関与しており、インスリンの作用低下は糖尿病を引き起こす要因となる。また近年では、インスリンの作用低下がアルツハイマー病を招くといった報告もある。こうした背景により、糖尿病やアルツハイマー病などといった、インスリンの作用低下が関与する疾患の予防又は治療に有用な新たな薬剤を開発することが求められている。

本発明は上記課題に鑑みなされたものであり、インスリンの欠乏又はインスリン受容体の活性低下に伴う疾患の予防又は治療のための薬剤として有用な物質を探索することができるスクリーニング方法を提供することを一つの目的とする。

本発明者らは、R3 RPTPサブファミリーに属するタンパク質の基質となり得る分子の探索を行っていたところ、R3 RPTPサブファミリーがインスリン受容体を基質として該インスリン受容体を脱リン酸化し、インスリン受容体の活性を抑制するという新たな情報伝達制御機構が明らかになった。具体的には、R3 RPTPサブファミリーの細胞内領域から成る基質捕捉型変異体を作製し、哺乳類細胞ツーハイブリッド（mammalian two-hybryd）法を用いることにより、インスリン受容体が、R3 RPTPサブファミリーとの間で相互作用するという新たな知見を得た。

そこで本発明者らは、R3 RPTPサブファミリーがインスリン受容体の基質となり得ることを更に検証するために、R3 RPTPサブファミリーによるインスリン受容体の全体及びその特異的部分配列ペプチドの脱リン酸化についての試験管内での評価、R3 RPTPサブファミリーとインスリン受容体とを細胞に共発現させた系による評価、及び、R3 RPTPサブファミリー遺伝子の欠損変異体を用いた評価を行った。そして、これら評価の総合的な結果から、R3 RPTPサブファミリーがインスリン受容体を基質として、特定のリン酸化チロシン残基を脱リン酸化することによりインスリン受容体の活性化を抑制するという新たな知見を得て、本発明を解決するに至った。具体的には、本発明により以下の手段が提供される。

［１］R3 RPTPサブファミリーに属する受容体型プロテインチロシンホスファターゼの阻害剤のスクリーニング方法であって、リン酸化されたインスリン受容体由来の分子を基質として、被験化合物の存在下で上記基質に対し前記受容体型プロテインチロシンホスファターゼ由来の分子を作用させ、上記基質の脱リン酸化を指標として上記被験化合物の上記阻害剤としての有効性を評価する工程を含む、スクリーニング方法。
［２］上記基質が下記（ａ）又は（ｂ）である、上記［１］に記載のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１個又は複数個のアミノ酸が置換、欠損、挿入若しくは付加、又はそれらの組み合わせにより変異されたアミノ酸配列を有し、かつ上記受容体型プロテインチロシンホスファターゼにより脱リン酸化される活性を保持するペプチド。
［３］配列番号１及び配列番号２におけるリン酸化チロシンのアナログが、クマリン誘導体である、上記［２］に記載のスクリーニング方法。
［４］上記クマリン誘導体が、ホスホクマリン−アミノ−プロピオン酸である、上記［３］に記載のスクリーニング方法。
［５］上記受容体型プロテインチロシンホスファターゼが、Ptprb、Ptprh、Ptprj及びPtproよりなる群から選ばれる少なくとも一種である、上記［１］〜［４］のいずれか１に記載のスクリーニング方法。
［６］上記阻害剤は、糖尿病及びアルツハイマー病の少なくともいずれかの疾患の予防又は治療のための薬剤である、上記［１］〜［５］のいずれか１に記載のスクリーニング方法。
［７］下記（ａ）又は（ｂ）のペプチドを備える、R3 RPTPサブファミリーに属する受容体型プロテインチロシンホスファターゼの阻害剤としての有効性を評価するためのキット。
（ａ）配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１個又は複数個のアミノ酸が置換、欠損、挿入若しくは付加、又はそれらの組み合わせにより変異されたアミノ酸配列を有し、かつ前記受容体型プロテインチロシンホスファターゼにより脱リン酸化される活性を保持するペプチド。

RPTPのサブファミリーの一つであるR3サブファミリーがインスリン受容体を基質として脱リン酸化を行い、インスリン受容体の活性化を抑制することが明らかとなった。こうしたメカニズムに基づくアッセイ系を利用した本発明によれば、インスリンの欠乏又はインスリン受容体の活性低下に伴う疾患の予防又は治療のための薬剤として有用な物質を得ることができる。

哺乳類細胞ツーハイブリッド法の概要図（図中Ａ）、及びR3 RPTPサブファミリーの基質捕捉変異体とインスリン受容体との相互作用を解析した結果を示す図（図中Ｂ）。 R3 RPTPサブファミリーによるインスリン受容体の脱リン酸化（試験管内の反応）についてウエスタンブロッティングにより解析した結果を示す図。 R3 RPTPサブファミリーによるインスリン受容体の脱リン酸化（細胞内の反応）についてウエスタンブロッティングにより解析した結果を示す図。 R3 RPTPサブファミリーによって脱リン酸化されるインスリン受容体中のチロシン残基を同定した図。図中、Ａは、インスリン受容体中、リン酸化が予想されるチロシン残基の位置、及び実験で使用したリン酸化ペプチドのアミノ酸配列に対応する位置を示し、Ｂは、実験で使用したリン酸化ペプチドのアミノ酸配列を示し、Ｃは、リン酸化ペプチドの脱リン酸化の実験結果を示す。 Ptprj遺伝子欠損マウスにおけるインスリン受容体の活性化状態を示す図。 Ptprj遺伝子欠損マウスにおけるグルコース耐性能（図中Ａ）及びインスリン耐性能（図中Ｂ）を示す図。

本発明のスクリーニング方法は、リン酸化されたインスリン受容体由来の分子を基質として、R3サブファミリーに属する受容体型プロテインチロシンホスファターゼ（RPTP）の阻害剤をスクリーニングするものである。詳しくは、被験化合物の存在下で該基質に対しR3 RPTPサブファミリーに由来する分子を作用させ、基質の脱リン酸化を指標として、被験化合物におけるR3 RPTPサブファミリーの阻害剤（以下、「R3サブファミリー阻害剤」ともいう。）としての有効性を評価する。以下、詳しく説明する。

（R3 RPTPサブファミリー）
R3 RPTPサブファミリーは、Ptprb、Ptprh、Ptprj及びPtproの４つのメンバーより構成されていることが知られている。このR3 RPTPサブファミリーに属するタンパク質は、細胞外に複数個のフィブロネクチンIII型リピート構造を有し、細胞内に１個のPTPドメインを有する共通構造を備える。本スクリーニング方法において、R3 RPTPサブファミリータンパク質としては各種動物由来のものを適用することができ、例えばヒト、及びヒト以外の哺乳動物（マウス、ラット等）に由来のものを適用することができる。

本スクリーニング方法におけるR3 RPTPサブファミリーに由来する分子は、R3 RPTPサブファミリータンパク質の全長アミノ酸配列を有するものであってもよいし、あるいは、全長アミノ酸配列のうちの少なくとも細胞内領域のアミノ酸配列を有する部分アミノ酸配列からなるものであってもよい。また、当該分子は、天然から取得したものであってもよく、PTP酵素活性が保持されている限り組み換えタンパク質であってもよい。

なお、R3 RPTPサブファミリーに属する受容体型プロテインチロシンホスファターゼPtprb、Ptprh、Ptprj及びPtproのアミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードする塩基配列は、NCBI（National Center for Biotechnology Information）等の公知のデータベースを参照することにより入手することができる。

（基質）
基質としてのインスリン受容体由来の分子は、天然から取得した分子の一部又は全部であってもよく、R3 RPTPサブファミリーの脱リン酸化を受ける活性を保持している限り、天然から取得したタンパク質の組み換え体であってもよく、あるいは人工的に合成したものであってもよい。また、本スクリーニング方法において、基質としてのインスリン受容体由来の分子は、インスリン受容体（IR）の全長アミノ酸配列を有する分子であってもよいし、インスリン受容体の全長アミノ酸配列の一部である部分アミノ酸配列からなる分子であってもよい。あるいは、これら分子が有するアミノ酸配列において１個又は複数個のアミノ酸が置換、欠損、挿入若しくは付加、又はそれらの２つ以上の組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなる変異型であってもよい。

変異型の場合は、R3 RPTPサブファミリーにより脱リン酸化される活性が保持されている限り特に制限されないが、変異前のアミノ酸配列に対し、好ましくは８０％以上の相同性を有し、より好ましくは９０％以上の相同性を有し、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。なお、本明細書において「相同性」とは、２つ又は複数間のアミノ酸配列における同一のアミノ酸数の割合を当該技術分野で公知の方法に従って算出したものである。インスリン受容体のアミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードする塩基配列は、NCBI（National Center for Biotechnology Information）等の公知のデータベースを参照することにより取得することができる。

インスリン受容体（IR）は、タンパク質チロシンキナーゼ活性を有する細胞膜表面レセプターであり、インスリンと結合するαサブユニットと、細胞膜を貫通し細胞質にチロシンキナーゼを内在するβサブユニットがジスルフィド結合で結合されたα２β２ヘテロの４サブユニットから成る糖タンパク質である。本スクリーニング方法において、インスリン受容体としては各種動物由来のものを適用することができ、例えばヒト、及びヒト以外の哺乳動物（マウス、ラット等）に由来のものを適用することができる。

インスリン受容体の部分アミノ酸配列からなる分子を基質とする場合、基質としてのIR由来分子は、インスリン受容体における細胞内領域のアミノ酸配列を含むことが好ましい。被験化合物の阻害剤としての有効性評価をより簡便にかつより高精度に行う観点からすると、IR由来分子は、特に下記（ａ）又は（ｂ）であることが好ましい。
（ａ）SSNPE(Z)LSAS（配列番号１）又はMTRDI(Z)ETDY（配列番号２）のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）SSNPE(Z)LSAS（配列番号１）又はMTRDI(Z)ETDY（配列番号２）のアミノ酸配列において１個又は複数個のアミノ酸が置換、欠損、挿入若しくは付加、又はそれらの組み合わせにより変異されたアミノ酸配列を有し、かつ上記受容体型プロテインチロシンホスファターゼにより脱リン酸化される活性を保持するペプチド。
なお、アミノ酸配列中の「Z」は、リン酸化チロシン又はリン酸化チロシンのアナログであることを示す。

上記（ｂ）における「置換」は、保存的アミノ酸置換を非必須アミノ酸残基に生じさせることによるものであることが好ましい。ここで、「非必須アミノ酸残基」とは、R3 RPTPサブファミリーの基質としての活性の保持に関与しないアミノ酸残基を意味する。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基の置換を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基によって行うことを意味する。具体的には、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）のように同様の性質の側鎖を有する群の中での置換であることが好ましい。配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列中、置換するアミノ酸残基の数は、R3 RPTPサブファミリーの基質としての活性を保持していれば特に制限されないが、０〜３個であることが好ましく、０〜２個であることがより好ましい。

上記（ｂ）における「欠損」は、非必須アミノ酸残基を対象とすることが好ましい。配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列中、欠損するアミノ酸残基の数は、R3 RPTPサブファミリーの基質としての活性を保持していれば特に制限されないが、０〜３個であることが好ましく、０〜２個であることがより好ましい。また、「挿入」についても、R3 PTPRサブファミリーの基質としての活性を保持していれば特に制限されず、例えば０〜３個、好ましくは０〜２個のアミノ酸残基を、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列中のアミノ酸残基間に挿入してもよい。

上記（ｂ）における「付加」の一態様は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列のアミノ末端及びカルボキシ末端の少なくとも一方に、１個以上のアミノ酸残基が連結されてなるものである。アミノ末端に連結されるアミノ酸残基の数は、好ましくは０〜１０個、より好ましくは０〜５個、更に好ましくは０〜３個である。また、カルボキシ末端に連結されるアミノ酸残基の数は、好ましくは０〜１０個、より好ましくは０〜５個、更に好ましくは０〜３個である。配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列のアミノ末端及びカルボキシ末端に連結するアミノ酸残基は、天然型のインスリン受容体に対応するアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１個又は複数個のアミノ酸を置換、欠損、挿入又は付加したものとすることが好ましい。

基質としてのIR由来分子を構成するアミノ酸残基の数は、R3 RPTPサブファミリーにより脱リン酸化される活性を保持している限り特に制限されないが、好ましくは５〜２０個であり、より好ましくは７〜１６個であり、更に好ましくは７〜１２個である。なお、上記（ｂ）において「R3 RPTPサブファミリーにより脱リン酸化される活性を保持」しているとは、改変前のアミノ酸配列からなるペプチドと同等に脱リン酸化される活性を有していればよく、具体的には、例えば脱リン酸化の程度が、改変前のアミノ酸配列からなるペプチドの８０％以上、好ましくは９０％以上であることを意味する。

上記（ｂ）のペプチドは、R3 RPTPサブファミリーにより脱リン酸化される活性を保持している限り、１種又は２種以上の修飾が施された修飾ペプチドであってもよい。修飾ペプチドの具体例としては、例えば、構成アミノ酸残基内の官能基が適当な保護基（例えば、アシル基、アルキル基、単糖、オリゴ糖、多糖など）によって保護されたもの、糖鎖が付加されたもの、N末端又はC末端が他の原子等で置換されることによってアルキルアミン、アルキルアミド、スルフィニル、スルフォニルアミド、ハライド、アミド、アミノアルコール、エステル、アミノアルデヒド等に分類される各種ペプチド誘導体、標識化ペプチド等が挙げられる。標識化ペプチドとしては、例えば、N末端がビオチン標識やFITC標識されたペプチド、蛍光色素で標識化されたペプチドなどが挙げられる。

上記（ａ）及び（ｂ）のペプチドにおけるリン酸化チロシンのアナログとしては、R3 RPTPサブファミリーにより脱リン酸化される限り特に限定されない。リン酸化チロシンのアナログの具体例としては、例えば蛍光色素由来の構造の導入、リンの放射線同位元素による置き換えなどの改変が施されたものが挙げられる。蛍光色素由来の構造が導入されたアナログの一例としてはクマリン誘導体が挙げられ、具体的には、例えばホスホクマリン−アミノ−プロピオン酸（phosphocoumaryl-amino-propionic acid（pCAP）、下記式（A-1）で表される化合物）が挙げられる。
pCAPを有するペプチドを基質として用いた場合、基質の脱リン酸化を蛍光で検出することができる。したがって、簡便かつ効率的なアッセイが可能になる。

IR由来分子の一態様である基質ペプチドは、公知のペプチド合成法（例えば、固相合成法、液相合成法など）を利用して製造する方法；天然のタンパク質から調製する方法、などにより得ることができる。基質ペプチドがpCAPを有する場合には、Bioorg. Med. Chem. Lett.. 15, 5142-5145, 2005を参考にして該ペプチドを調製することができる。また、遺伝子工学的手法を用いて上記基質ペプチドを調製してもよい。即ち、上記基質ペプチドをコードする核酸を適当な宿主細胞に導入し、形質転換体内で発現されたペプチドを回収することにより調製することもできる。回収したペプチドは、必要に応じて精製したり、適当な置換反応に供したり、あるいは所望の修飾ペプチドに変換してもよい。

（有効性の評価）
本スクリーニング法では、まず、被験化合物の存在下で、基質としてのIR由来分子にR3 RPTPサブファミリーに属する１種以上のタンパク質を作用させる。使用する被験化合物としては特に制限はなく、種々の分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例としては、例えば核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質及び複合脂質を含む。）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン等が挙げられる。また、被験化合物は、天然物であってもよく、人工的に合成された物質であってもよい。被験化合物としては、植物抽出液、細胞抽出液又は培養上清を使用してもよく、あるは既存の薬剤を使用してもよい。用いる被験化合物は１種であってもよく、２種以上の混合物であってもよい。

基質にR3 RPTPサブファミリータンパク質を作用させる方法は特に制限されず、インビボ系及びインビトロ系のいずれで行ってもよい。被験化合物のR3 RPTPサブファミリーに対する阻害活性の評価を簡便にかつ高精度に行う観点からすると、基質として上記基質ペプチドを用いたインビトロ系の評価とすることが好ましい。一態様としては、被験化合物、基質及びR3 RPTPサブファミリータンパク質を同一の容器（例えばマルチウェルプレートのウェル等）内に入れ、これらの各成分が相互作用し得る状態を形成することにより行う方法が挙げられる。この方法は、R3サブファミリー阻害剤としての有効性を簡便にかつ高精度に評価できる点で好ましい。

評価に際して使用する容器や、各成分の添加の順序及び濃度、反応系に添加してもよい他の成分等は、被験化合物、基質及びR3サブファミリータンパク質が相互作用し得る状態を形成できる限り、任意に選択及び設定することができる。反応条件としては、R3 RPTPサブファミリータンパク質の酵素反応に適した条件が採用される。最適な条件は、使用するR3 RPTPサブファミリータンパク質や基質等に応じて適宜設定することができる。例えば、pH6.0〜8.0及び温度25〜40℃の条件下で反応させる。

被験化合物におけるR3サブファミリー阻害剤としての有効性の評価は、基質の脱リン酸化を指標として行う。基質の脱リン酸化は、例えばリン酸化チロシンに特異的な抗体を用いた免疫学的手法（免疫沈降法やウエスタンブロット法）によって検出する方法；脱リン酸化により遊離したリン酸を検出する方法、などによって行うことができる。

基質の脱リン酸化を指標とした評価は、例えば、基質の脱リン酸化レベルを経時的に検出し、その検出結果に基づき評価する方法；被験化合物の非存在下で基質にR3 RPTPサブファミリータンパク質を作用させたときの脱リン酸化の程度を基準として、その基準との比較により被験化合物の阻害剤としての有効性を評価する方法、などが挙げられる。好ましくは、基準との比較により有効性を評価する方法である。また、被験化合物が溶液又は混合液として存在する場合には、該溶液又は混合液における被験化合物以外の化合物（溶媒）の存在下で基質にR3 RPTPサブファミリータンパク質を作用させたときの脱リン酸化レベルを基準とすることが好ましい。この方法によれば、評価結果の正確性及び信頼性を向上させることができる。

有効性評価の一態様としては、例えば、被験化合物の存在下で基質にR3 RPTPサブファミリータンパク質を作用させたときの脱リン酸化レベルを測定し、その測定した脱リン酸化レベルが基準よりも低い場合に、被験化合物はR3 RPTPサブファミリー阻害剤として有効であると評価する。こうした評価により、R3 RPTPサブファミリーによるインスリン受容体の脱リン酸化の抑制作用が評価されることになり、R3サブファミリー阻害剤のスクリーニングが可能となる。

基質の脱リン酸化を指標としたR3サブファミリー阻害剤のスクリーニングは、細胞ベースのアッセイによるものとしてもよい。具体的には、基質とR3 RPTPサブファミリータンパク質とを共発現する細胞を準備し、被験化合物の存在下で該細胞を培養し、その培養後の細胞における基質の脱リン酸化を指標として被験化合物のR3サブファミリー阻害剤としての有効性を評価する方法などが挙げられる。細胞としては、例えばHEK293細胞、HeLa細胞、CHO細胞、Vero細胞、HepG2細胞、COS-7細胞等の株化細胞が用いられる。基質及びR3 RPTPサブファミリータンパク質を共発現する細胞は、上記細胞に、基質遺伝子及びR3 RPTPサブファミリー遺伝子を、例えばベクターを用いて導入することにより調製することができる。基質遺伝子を発現可能に保持するベクター及びR3 RPTPサブファミリー遺伝子を発現可能に保持するベクターは常法に従って構築することができる。

本スクリーニング方法により有効性が評価された被験化合物は、インスリンの欠乏やインスリン受容体の活性低下に伴う疾患の予防又は治療のための有用な薬剤又はその候補化合物となる。具体的には、糖尿病及びアルツハイマー病の少なくともいずれかの疾患の予防又は治療のための薬剤やその候補化合物とすることができる。

（評価用キット）
本発明の評価用キットは、R3 RPTPサブファミリーに属する受容体型プロテインチロシンホスファターゼの阻害剤としての有効性を評価するためのキットであり、基質として上記（ａ）又は（ｂ）のペプチドを備える。本評価用キットは、該ペプチド以外のその他の成分を、該ペプチドと一体に又は別個に更に備えていてもよい。こうしたその他の成分としては、例えばR3 RPTPサブファミリーに属する受容体型プロテインチロシンホスファターゼの１種又は２種以上、媒体などが挙げられる。

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

１．R3 RPTPサブファミリーとインスリン受容体の相互作用
マウス由来R3 RPTPサブファミリーの基質捕捉変異体を用いて、哺乳類細胞ツーハイブリッド（Mammalian two-hybrid）法により、R3 RPTPサブファミリーがインスリン受容体を基質として認識するか解析を行った（図１Ａ）。使用した基質捕捉変異体は、Ptprbの 1871番目のアスパラギン酸(NCBI Accession No. NP_084204)、Ptprhの1019番目のアスパラギン酸(同XP_011248936)、Ptprjの1219番目のアスパラギン酸(同XP_006499054)、Ptproの1112番目のアスパラギン酸(同NP_035346)をそれぞれアラニンに置換したものであり、PTP活性中心側のシステイン残基と基質側のリン酸基間で共有結合が形成された状態で反応が停止することによりPTP−基質複合体が形成されるものである。スクリーニングは、Stratagene社のMammalian two-hybrid assay kitを使用して行った。マウスインスリン受容体の細胞内領域のcDNAをpCMV-BDベクターに挿入し(IR)、一方、R3 RPTPサブファミリーの細胞内領域の基質捕捉型変異体をコードするcDNAをpCMV-ADベクターに挿入した。株化細胞のCOS7細胞に、これらのプラスミドとルシフェラーゼをコードするレポータープラスミドを共導入し、24時間後にルシフェラーゼの発現を定量解析した。その結果、Ptprb, Ptprh, Ptprj及びPtproのそれぞれの基質捕捉変異体(DA)とインスリンレセプターの組み合わせはいずれも高い値を示し、両者の間に安定な複合体を形成することが分かった。一方、野生型(WT)のRPTPsは、インスリン受容体を脱リン酸化するため、安定な複合体を形成できなかった。以上より、R3 RPTPサブファミリーがインスリン受容体を基質分子として認識することが明らかになった（図１Ｂ）。

２．R3 RPTPサブファミリーによるインスリン受容体の脱リン酸化（試験管内の反応）
GSTタンパク質のみ (GST発現プラスミド, GST)、及び、GSTタンパク質とマウス由来のPtprb, Ptprh, Ptprj, 又はPtproの細胞内領域との融合タンパク質を発現するプラスミド（GST-RPTP発現プラスミド, GST-RPTP）を構築するとともに、Mycタグを付加した、全長のマウス由来インスリン受容体型を発現するプラスミド（インスリン受容体発現プラスミド, IR-Myc）を構築した。発現プラスミドの構築は、GST及びGST-RPTPについてはpGEX-4T-1ベクター(GE Healthcare社製)を、インスリン受容体についてはpcDNA3.1ベクター（Life Technologies社製）を使用して行った。GST発現プラスミド、又はGST-RPTP発現プラスミドによりトランスフォームした大腸菌より、グルタチオンカラムを用いてGSTタンパク質及びGST−R3サブファミリー融合タンパク質を調製した。次いで、株化細胞のHEK293細胞に、構築したインスリン受容体発現プラスミドを単独で導入し、24時間後に50 ng/mlのインスリンで15分間処理し、インスリン受容体を活性化したのち細胞抽出液を調製した。抽出液について、抗Myc抗体を用いて免疫沈降を行った。この免疫沈降物をそれぞれ10 ngのGSTタンパク質、又はGST−R3サブファミリー融合タンパク質と30℃で15分間反応させた。反応物について抗リン酸化チロシン抗体を用いたウエスタンブロットを行ったところ、インスリン受容体のチロシンリン酸化レベルは、GSTタンパク質と反応させた場合に比べて、GST−R3サブファミリー融合タンパク質(Ptprb, Ptprh, Ptprj, Ptpro)と反応させた場合に顕著に低下した（図２）。

３．R3 RPTPサブファミリーによるインスリン受容体の脱リン酸化（細胞内の反応）
HAタグを付加したマウス由来Ptprb, Ptprh, Ptprj, Ptpro（いずれも全長配列）を発現するプラスミド（RPTP発現プラスミド, HA-RPTP）をそれぞれ構築した。発現プラスミドの構築はpDisplayベクター（Life Technologies社製）を使用して行った。次いで、株化細胞のHEK293細胞に、上記２で構築したインスリン受容体発現プラスミド(IR-Myc）を単独で、又はRPTP発現プラスミドと共に導入し、24時間後にインスリン(50 ng/ml)刺激を行い、１５分後に細胞抽出液を調製した。抽出液について、抗Myc抗体を用いて免疫沈降を行った。これら免疫沈降物について抗リン酸化チロシン抗体を用いたウエスタンブロットを行ったところ、インスリン受容体のチロシンリン酸化レベルは、インスリン受容体を単独で発現させた場合に比べて、R3サブファミリー(Ptprb, Ptprh, Ptprj, Ptpro)と共発現させた場合に顕著に低下した（図３）。

４．R3 RPTPサブファミリーによって脱リン酸化されるインスリン受容体中のチロシン残基の同定
マウスインスリン受容体のリン酸化が予想されるリン酸化チロシン残基を含む６種類の部分ペプチド（図４Ａ及び図４Ｂ、peptide1〜peptide6）を用いて、R3サブファミリーがどのチロシン残基に対して脱リン酸化効率が高いか調べた。なお、図４Ｂの各アミノ酸配列中の「pY」はリン酸化チロシンであることを示す。上記２で調製したGST−R3サブファミリー融合タンパク質(10 ng)を各ペプチド(0.2 mM)と反応させた後、遊離したリン酸をマラカイトグリーンにより定量した。その結果、R3サブファミリーは、peptide1及びpeptide2に対する脱リン酸化効率が高いことが明らかになった（図４Ｃ）。この２つのペプチドのアミノ酸配列は、ヒトインスリン受容体のアミノ酸配列と一致する（配列番号１，２）。

５．Ptprj遺伝子欠損マウスにおけるインスリン受容体の活性亢進
Ptprj遺伝子欠損マウスを用いて、Ptprjが欠損した場合のインスリン受容体の活性化状態を調べた。マウスの腹腔にインスリンを投与し(体重1 kg当たり10 unit)、肝臓におけるインスリン受容体のチロシンリン酸化を調べると、Ptprj遺伝子欠損マウス(KO)では、野生型(WT)マウスに比べて、インスリン受容体のチロシンリン酸化（活性化）が亢進していることが明らかになった（図５）。以上の結果より、Ptprjはインスリン受容体を負に制御していることが明らかになった。

６．Ptprj遺伝子欠損マウスにおけるグルコース耐性能並びにインスリン耐性能の増強
Ptprj遺伝子欠損マウスを用いて、Ptprj遺伝子が欠損した場合のインスリン受容体の活性変化を調べた。まず、グルコース耐性テストを行った（図６Ａ）。マウスの腹腔にグルコースを投与し(体重1 kg当たり1 g)、血糖値の変化を調べると、野生型(WT)マウスよりもPtprj遺伝子欠損マウス(KO)において、より速やかに血糖値が低下することが分かった（図６Ａ）。

次に、インスリン耐性テストを行った（図６Ｂ）。マウスの腹腔にインスリンを投与し(体重1 kg当たり1 unit)、血糖値の変化を調べると、野生型(WT)マウスよりもPtprj遺伝子欠損マウス(KO)において、より血糖値が低下することが分かった（図６Ｂ）。
以上の結果より、Ptprjはインスリン受容体を負に制御しており、Ptprj遺伝子欠損マウスにおいては、Ptprj遺伝子の欠損の結果、インスリン受容体の活性が亢進しているため、グルコース耐性及びインスリン耐性が増強していることが明らかになった。

Claims

R3 RPTPサブファミリーに属する受容体型プロテインチロシンホスファターゼの阻害剤のスクリーニング方法であって、
配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを基質として、被験化合物の存在下で前記基質に対し、前記受容体型プロテインチロシンホスファターゼの少なくとも細胞内領域を有するタンパク質を作用させ、前記基質の脱リン酸化を指標として前記被験化合物の前記阻害剤としての有効性を評価する工程を含む、スクリーニング方法。
配列番号１及び配列番号２におけるリン酸化チロシンのアナログが、クマリン誘導体である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
前記クマリン誘導体が、ホスホクマリン−アミノ−プロピオン酸である、請求項２に記載のスクリーニング方法。
前記受容体型プロテインチロシンホスファターゼが、Ptprb、Ptprh、Ptprj及びPtproよりなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
前記阻害剤は、糖尿病及びアルツハイマー病の少なくともいずれかの疾患の予防又は治療のための薬剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを備える、R3 RPTPサブファミリーに属する受容体型プロテインチロシンホスファターゼの阻害剤としての有効性を評価するためのキット。