JP5844257B2 - 光学活性スクシンイミド誘導体の製造方法 - Google Patents
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Description
化合物Bから化合物Aを製造する方法は特許文献3及び非特許文献3等に記載されており、特許文献4の参考例1には、ジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノマロナートと2-ブロモ酢酸tert-ブチルを反応させる4-tert-ブチル=1-エチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-エトキシカルボニルスクシナートの製造方法が記載されている。
より具体的には、本発明の課題は、化合物Aの鍵中間体である光学活性スクシンイミド誘導体を効率的に製造する方法、及び化合物Aの有用中間体であるエステル誘導体から光学活性カルボン酸誘導体を効率的に製造する方法を提供することにある。
(1)式(I):
で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩の製造方法であって、以下の工程(A)〜(D)、さらに必要により工程 (E)を含む製造方法:
(A) 式(II):
で表されるハロゲン化酢酸エステル誘導体を塩基の存在下で反応させて式(IV):
で表されるエステル誘導体又はその塩に変換する工程、
(B)式(IV)で表されるエステル誘導体又はその塩に非動物由来の酵素、該酵素を生産する細胞、該細胞の培養物、又は該細胞若しくは該細胞の培養物の処理物を作用させ、式(V):
で表される光学活性カルボン酸誘導体又はその塩に変換する工程、
(C)式(V)で表される光学活性カルボン酸誘導体又はその塩を縮合剤の存在下、アンモニア源と反応させるか、又は活性化試薬と反応させた後に、さらにアンモニア源と反応させて、式(VI):
で表される光学活性アミド誘導体又はその塩に変換する工程、
(D)式(VI)で表される光学活性アミド誘導体又はその塩に塩基を作用させて、式(I)又は式(VII):
で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩に変換する工程、
(E)式(VII)で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩のR1A上の保護基を脱保護して、上記式(I)で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩に変換する工程。
(3)酵素が微生物由来エステラーゼである(1)又は(2)に記載の製造方法。
(4)酵素がバチルス属に属する微生物由来エステラーゼである(1)又は(2)に記載の製造方法。
(5)酵素がバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)由来のエステラーゼである(1)又は(2)に記載の製造方法。
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定される蛋白質
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1つ又は複数のアミノ酸が置換及び/又は欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質
(d)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、N末端から1〜40個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有する蛋白質
(8)(1)に記載の製造方法により、式(I)で表される光学活性スクシンイミド誘導体{以下、化合物(I)と称する}を製造する工程、及び該工程で得られた化合物(I)を化合物Aに変換する工程を含む化合物Aの製造方法。
(9)化合物Aの製造方法であって、下記(a)〜(e)の工程を含む製造方法:
(a)化合物(I)を(1)に記載の製造方法で製造する工程;
(b)前記工程(a)で得られた化合物(I)を酸(例えば、酢酸など)の存在下に2,5-ジメトキシテトラヒドロフランと反応させる工程;
(c)前記工程(b)で得られた生成物をトリクロロアセチル化試薬(例えば、トリクロロアセチルクロリド、トリクロロアセチルブロミド、無水トリクロロ酢酸など)と反応させる工程;
(d)前記工程(c)で得られた生成物を4-ブロモ-2-フルオロベンジルアミンと反応させる工程;及び
(e)前記工程(d)で得られた化合物Aを単離する工程。
(10)R3がエチルである(8)又は(9)に記載の製造方法。
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定される蛋白質
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1つ又は複数のアミノ酸が置換及び/又は欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質
(d)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、N末端から1〜40個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有する蛋白質
(a)配列番号1に記載の塩基配列により特定されるDNA
(b)請求項11に記載の蛋白質をコードするDNA
(c)配列番号1に記載の塩基配列において1つ又は複数の塩基が置換及び/又は欠失及び/又は付加された塩基配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
(d)配列番号1に記載の塩基配列と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
式(I)〜(VII)の各基の定義において、
低級アルキルとしては、例えば直鎖又は分岐状の炭素数1〜6のアルキルが挙げられ、より具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等が挙げられる。ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。
酸の作用により脱保護される保護基としては、例えば、アセチル、トリチル、tert-ブトキシカルボニル等が挙げられ、より好ましくはtert-ブトキシカルボニルが挙げられる。
式中のR1及びR1Aとしては、例えば、チオール若しくは酸の作用、又は加水素分解等により脱離しうる保護基で保護されたアミノ等が挙げられ、好ましくは、ベンジルオキシカルボニルアミノ、又はtert-ブトキシカルボニルアミノが挙げられる。
式中のR2及びR3としては、例えば、エチル等が挙げられる。
Yとしては、ハロゲンが挙げられ、好ましくはヨウ素、臭素、塩素等が挙げられる。より好ましくは、臭素、又は塩素が挙げられる。
アンモニア等価体としては、例えば、アンモニアと酸との塩が挙げられ、好ましくは、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、炭酸アンモニウム等が挙げられ、さらに好ましくは酢酸アンモニウムが挙げられる。
化合物(II)に対し、溶媒中、-50℃と150℃の間の温度で、1〜30当量の塩基の存在下、1当量〜大過剰量の化合物(III)を、5分間〜72時間反応させることにより化合物(IV)を得ることができる。また、ハロゲン化アルカリを添加して反応を行ってもよい。
溶媒は、反応に関与しないものであればいずれも使用可能であるが、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、tert-ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン(THF)、ジオキサン、ピリジン、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルホルムアミド (DMF) 、ジメチルスルホキシド (DMSO)、アセトニトリル等が挙げられ、好ましくはDMFが挙げられる。これらは単独若しくは混合物として用いることができる。
化合物(III)としては、2-クロロ酢酸エチル、2-ブロモ酢酸エチル等が挙げられる。
化合物(II)及び化合物(III)は市販品として入手することもできる。
化合物(IV)に、水中又は水及び溶媒の混合溶媒中、基質濃度は0.1%〜50%、好ましくは1%〜30%で0〜60℃、好ましくは10〜40℃の間の温度で、反応pHは3〜10、好ましくはpH 4〜9で、基質に対し100,000分の1から10倍量、好ましくは10,000分の1から1倍量の酵素を作用させて、1〜200時間、好ましくは5〜150時間反応させることにより化合物(V)を得ることができる。さらに、緩衝液、又は金属塩を加えて反応を行うこともできる。
無機塩類としては、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン、鉄などの硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、硝酸塩、リン酸塩などをそれぞれ単独で又は混合して用いることができる。さらに、ビタミン類などの通常の培養に用いられる栄養源を適宜添加してもよい。
化合物(V)に対し、(A)溶媒中、-50℃〜150℃、好ましくは-30℃〜80℃の温度で、1当量〜大過剰量の縮合剤を5分間〜72時間反応させた後、-50℃〜150℃、好ましくは-30℃〜80℃の温度で、1当量〜大過剰量のアンモニア源を添加して、5分間〜72時間反応させるか、(B)溶媒中、-50℃〜150℃、好ましくは-30℃〜80℃の温度で、1当量〜大過剰量の活性化試薬を5分間〜72時間反応させた後、-50℃〜150℃、好ましくは-30℃〜80℃の温度で、1当量〜大過剰量のアンモニア源を添加して、5分間〜72時間反応させるか、又は、(C)溶媒中、-50℃〜150℃、好ましくは20℃〜80℃の温度で、1当量〜大過剰量の縮合剤の存在下、1当量〜大過剰量のアンモニア源を添加して、5分間〜72時間反応させることにより、化合物(VI)を得ることができる。
さらに、(A)〜(C)いずれの場合も、10分の1〜30当量の塩基を加えて反応を行うこともできる。
化合物(VI)に対し、溶媒中、-50℃〜150℃、好ましくは-20℃〜60℃の温度で、1当量〜大過剰量の塩基を5分間〜72時間作用させることにより化合物(I)又は化合物(VII)を得ることができる。
溶媒としては、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ピリジン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、tert-ブチルメチルエーテル、THF、ジオキサン、水、イソプロピルアルコール、メタノール、エタノール、DMF、DMSO等が挙げられ、好ましくはエタノールが挙げられる。これらの溶媒は単独又は任意の混合物として用いることができる。
化合物(VII)のR1Aが加水素分解により脱保護される保護基で保護されたアミノであるときは、溶媒中、-50℃〜150℃、好ましくは20℃〜100℃の温度で、1〜10気圧、より好ましくは1〜5気圧の圧力下で、基質に対して10分の1〜50重量%、好ましくは1〜10重量%の金属触媒を添加して、水素又は水素供与体共存下、5分間〜72時間反応させることにより化合物(I)を得ることができる。
水素供与体としては、ギ酸アンモニウム、シクロヘキセン、シクロヘキサ-1,3-ジエン、シクロヘキサ-1,4-ジエン等が挙げられる。
溶媒としては、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、tert-ブチルメチルエーテル、THF、ジオキサン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、水、イソプロピルアルコール、メタノール、エタノール、DMF、ジクロロメタン、クロロホルム等が挙げられ、これの溶媒を単独又は任意の混合物として用いることができる。
工程(c)では、例えば、前記工程(b)で得られた生成物、約3当量のトリクロロアセチルクロリド、及び適量のクロロホルムの混合物を約16時間加熱還流させる。クロロホルムに代えて他の不活性溶媒(例えば、ジクロロメタン、THF等)を用いることもできる。通常では、常法に従って粗製の反応生成物を単離し、これを次工程に用いることができる。
工程(e)では、例えば、工程(d)で得られた化合物Aを適量の酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒から再結晶する。他の再結晶溶媒として、エタノールなどのアルコール類を用いることもできる。
実施例及び参考例で用いられるプロトン核磁気共鳴スペクトル (1H NMR) は、300 MHzで測定されたものであり、化合物及び測定条件によって交換性プロトンが明瞭には観測されないことがある。なお、シグナルの多重度の表記としては通常用いられるものを用いるが、brとは見かけ上幅広いシグナルであることを表す。さらに、質量スペクトル(MS)により化合物の分子量の確認を行った。
また、化合物(I)、(IV)、(V)、(VI)、又は(VII)並びにそれらの塩は、水あるいは各種溶媒との付加物の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明に包含される。
ジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノマロナート5.0 g、炭酸カリウム2.7g、ヨウ化カリウム0.27 g及び2-クロロ酢酸エチル2.6 gのDMF 50 mL懸濁液を50℃で1時間撹拌した。冷後、反応液を希塩酸中に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣を酢酸エチル-n-ヘキサンから結晶化して表記の化合物5.5 g (収率86%)を無色結晶として得た。
1H NMR (CDCl3) δ(ppm): 7.34 (5H, m), 6.39 (1H, s), 5.10 (2H, s), 4.24 (4H, q, J= 6.9Hz), 4.10 (2H, q, J= 7.2Hz), 3.49 (2H, s), 1,21 (9H, m)
MS (FAB) : m/z 396(M+H+)
HR-MS(FAB) : calcd for C19H26NO8 396.1658, found 396.1653(M+H+)
ジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノマロナート50 gの無水DMF溶液300 mLに、氷冷撹拌下、水素化ナトリウム(60%) 6.47 gを徐々に加えた後、室温で30分間撹拌し、次いで2-ブロモ酢酸エチル22.6 gを加え一夜撹拌した。反応液を希塩酸中に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、n-ヘキサン-酢酸エチル(5:1)で溶出、精製した後、酢酸エチル-n-ヘキサンから結晶化して表記の化合物46.7 g (収率83%)を無色結晶として得た。
(a)酵素精製
独立法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門より分譲を受けたBacillus thuringiensis NBRC13866 をGPY培地(1%グルコース、0.5%ペプトン、0.3%酵母エキスからなる培地)にて30℃、16時間、好気的に培養した。得られた培養液から、遠心分離(12,000 × g、10分)により、湿菌体を回収し、0.01 Mトリス塩酸緩衝液(pH8.0)に懸濁した。懸濁液を氷冷下、超音波ホモジナイザー(日本精機US-300T)により破砕した後、遠心分離(12,000 × g、10分間)により、上清と残渣に分離した。上清に氷冷下、硫酸アンモニウムを20%飽和濃度になるように加え、攪拌後、遠心分離(12,000 × g、10分間)を行い、上清を除いた。沈殿を1 mM Dithiothreitol (DTT) を含む0.01 Mトリス塩酸緩衝液(pH8.0)に懸濁し、同緩衝液により透析した。この溶液にDEAE Sepharose Fast Flow(GE Healthcare 社製)を加え、混合後、ろ過し、活性溶液を回収した。
上記(a)のDEAE Sepharoseカラム精製の活性画分を限外ろ過膜により濃縮した。濃縮液0.08 mL(約8 mU)、35%のジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-エトキシカルボニルスクシナートを含むアセトニトリル0.01 mL、1 M リン酸緩衝液(pH7)を0.01 mLを加え混合し、30℃で振盪した。反応液のpHは1N 水酸化ナトリウムを用いpH7.5に調整した。HPLC分析により、30時間後には反応収率70%で1-エチル=水素=3-ベンジルオキシカルボニルアミノ-3-エトキシカルボニルスクシナートが得られたことを確認した。生成物の光学純度をHPLCで確認したところ、R体であり、光学純度は100% eeであった。
1H NMR (CDCl3) δ(ppm): 7.35 (5H, m), 6.51 (1H, s), 5.09 (2H, m), 4.24 (2H, q, J= 7.2Hz), 4.08 (2H, q, J= 7.2Hz), 3.48 (2H, s), 1,19 (6H, m)
MS (FAB) : m/z 368(M+H+)
HR-MS(FAB) : calcd for C17H22NO8 368.1345, found 368.1314(M+H+)
上記(a)で精製した酵素のN末端アミノ酸配列分析を行なった。分析は株式会社アプロサイエンス(〒771-0360 徳島県鳴門市瀬戸町字板屋島124番4)に依頼した。分析の結果、Glu-Lys-Lys-Pro-Val-Ser-Leu-Thr-Glu-Arg-Thr-Ser-Leu-Phe-Pheの配列が得られた。この配列をDNA Data Bank of Japan(DDBJ)で相同性検索を行なったところ、Bacillus thuringiensis IBL 200の、遺伝子配列から推定されるHydrolase(accession no.C3IAP1)と相同性があった。
このHydrolaseの遺伝子情報を基にBacillus thuringiensis NBRC13866から酵素遺伝子の取得を行なった。Bacillus thuringiensis NBRC13866を5 mL GPY培地で、30℃、200rpmで24時間、振盪培養した培養液から、Genomic DNA Buffer set(株式会社キアゲン)及びQIAGEN Genomic-tip 500/G(株式会社キアゲン)を用いて単離したゲノムDNAを鋳型とし、5'-TAAATCCATTGCTTAACGCCTCTACTCTT (北海道システム・サイエンス株式会社)及び5'-TCACGCAATGATGATTGCATGATGGCTTT(北海道システム・サイエンス株式会社)をプライマーとして、KOD-plus-(東洋紡績株式会社)を使用して添付説明書に従いPCRを行った。PCR産物をpUC18(タカラバイオ株式会社)に挿入しプラスミドを構築した(pBTEST7)。
pBTEST7を鋳型とし、5'-AAACAGCATGCAAAAAAAGAAATTACAAAAATCAGCAC(北海道システム・サイエンス株式会社)および5'-CTTTTGTTGTAGATCTTTTCTTTGTCGCATTGACCCA(北海道システム・サイエンス株式会社)をプライマーとし、KOD-plus-を使用してPCRを行った。PCR産物をSph I(東洋紡績株式会社)、及びBgl II(東洋紡績株式会社)で消化し、pQE-70(株式会社キアゲン)のSph I及びBgl IIサイトに挿入したプラスミドを構築した(pBTEST12)。pBTEST12をCompetent high JM109(東洋紡績株式会社)を用いて添付説明書に従い大腸菌JM109に遺伝子導入し、大腸菌JM109/pBTEST12を作製した。
上記(e)で作製した大腸菌JM109/pBTEST12を100 mg/Lのアンピシリンナトリウム(和光純薬工業株式会社)を含む5 mLのLB液体培地(1.0%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、pH 7.0)に植菌し、25℃、200 rpmで12時間振盪培養を行った。この培養液を0.1 mM イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(ナカライテスク株式会社)を含む200 mLのLB液体培地に植え継ぎ、25℃、200rpmで24時間振盪培養を行った。この培養液を1.6 L調製し、12,000 × g、4℃で10分間遠心分離し、菌体を得た。この菌体を精製水に懸濁し、35% ジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-エトキシカルボニルスクシナートを含むアセトニトリル溶液を10 mL、1.0 M リン酸緩衝液(pH7.0)を10 mL加え、さらに総量100 mLとなるよう精製水を加えた。この溶液を攪拌しながら、24時間、25℃に維持した。反応液のpHが7.0に維持されるように、適時28%水酸化ナトリウム溶液を加えた。
大腸菌JM109/pBTEST12を100mg/Lのアンピシリンナトリウムを含む5 mLのLB液体培地に植菌し、25℃、200 rpmで12時間振盪培養を行った。この培養液を0.1 mM イソプロピル-β-チオガラクトピラノシドを含む200 mLのLB液体培地に植え継ぎ、25℃、200rpmで24時間振盪培養を行った。この培養液からQIAexpress Type ATG Kit(株式会社キアゲン)を使用し、添付説明書に従い酵素精製を行った。精製した酵素溶液をSDS-PAGE(0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む12% ポリアクリルアミドゲル)で電気泳動を行った結果、単一のバンドであり酵素精製できたことを確認した。
上記(d)において、エステラーゼ活性を有する蛋白質は、配列番号2に記載のアミノ酸配列のN末端側のアミノ酸配列が、40アミノ酸を欠損している蛋白質であることが分かった。このことから、N末端が欠損している蛋白質を発現する組換え大腸菌を作製した。
(R)-1-エチル=水素=3-ベンジルオキシカルボニルアミノ-3-エトキシカルボニルスクシナート1.8 gのTHF 20 mL溶液に-15℃撹拌下、トリエチルアミン0.96 mL、クロロギ酸イソブチル0.84 mL (0.87 g)の順で加え、5分間撹拌した。同温度にて25%アンモニア水0.47 mLを反応液に滴下した。同温度にて1時間撹拌後、反応液を希塩酸中に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、n-ヘキサン-酢酸エチル(1:1)で溶出、精製した後、酢酸エチル-n-ヘキサンから結晶化して表記の化合物1.51 g (収率84%)を無色結晶として得た。旋光度は[α]D 25 -5.7°(c 0.52、エタノール)、光学純度は96.1% eeであった。
1H NMR (CDCl3) δ(ppm): 7.34 (5H, m), 6.51 (1H, br), 6.35 (1H, br), 5.63 (1H, br), 5.12 (2H, s), 4.26 (2H, m), 4.10 (2H, q, J= 7.2 Hz), 3.48 (2H, s), 1,23 (6H, m)
MS (FAB) : 367(M+H+)
HR-MS(FAB) : calcd for C17H23N2O7 367.1505, found 367.1509(M+H+)
氷冷撹拌下、(R)-ジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-カルバモイルスクシナート200 mgの無水エタノール10 mL溶液に、ナトリウムエトキシド 41 mgを加え、同温度で2時間撹拌した後、冷1 mol/L塩酸を注ぎ、酢酸エチルで抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧留去し残渣を酢酸エチル-n-ヘキサンから再結晶して表記の化合物149 mg (収率85%)を無色結晶として得た。旋光度は[α]D 28 -31.8°(c 0.59、エタノール)、光学純度は99.2% eeであった。
1H NMR (CDCl3) δ(ppm): 8.39 (1H, s), 7.36 (5H, m), 6.27 (1H, s), 5.12 (2H, m), 4.32 (2H, q, J= 6.9Hz), 3.18 (2H, m), 1,29 (3H, t, J= 7.1Hz)
MS (FAB) : 321(M+H+)
HR-MS(FAB) : calcd for C15H17N2O6 321.1087, found 321.1074(M+H+)
(R)-2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-エトキシカルボニルスクシンイミド80 mgをエタノール10 mLに溶解し、5%パラジウム-炭素4 mgを加え、水素雰囲気下、室温で接触水素化した。触媒を濾去した後、濾液を減圧濃縮した。残渣をエタノールから再結晶して、表記の化合物43 mg (収率93%)を無色結晶として得た。旋光度は[α]D 24-35.9°(c0.22、エタノール)であった。光学純度 は 99.9% ee 以上であった。
1H NMR (CDCl3) δ(ppm): 4.28 (2H, q, J= 7.2Hz), 3.19 (1H, d, J= 18.0Hz), 2.74 (1H, d, J= 18.0Hz), 1,30 (3H, t, J= 7.1Hz)
MS (FAB) : 187(M+H+)
HR-MS(FAB) : calcd for C7H11N2O4 187.0719, found 187.0700(M+H+)
Claims (8)
- 式(I) :
で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩の製造方法であって、以下の工程(A)〜(D)、さらに必要により工程 (E)を含む製造方法:
(A) 式(II):
で表されるハロゲン化酢酸エステル誘導体を塩基の存在下で反応させて式(IV) :
で表されるエステル誘導体又はその塩に変換する工程、
(B)式(IV)で表されるエステル誘導体又はその塩に非動物由来の酵素、該酵素を生産する細胞、該細胞の培養物、又は該細胞若しくは該細胞の培養物の処理物を作用させ、式(V):
で表される光学活性カルボン酸誘導体又はその塩に変換する工程
[ただし、該酵素は以下の(a)〜(d)より選ばれる蛋白質である:
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定される蛋白質
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸が置換及び/又は欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質
(d)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、N末端から1〜40個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有する蛋白質]、
(C)式(V)で表される光学活性カルボン酸誘導体又はその塩を縮合剤の存在下、アンモニア源と反応させるか、又は活性化試薬と反応させた後に、さらにアンモニア源と反応させて、式(VI):
で表される光学活性アミド誘導体又はその塩に変換する工程、
(D)式(VI)で表される光学活性アミド誘導体又はその塩に塩基を作用させて、式(I)又は式(VII):
で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩に変換する工程、
(E)式(VII)で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩のR1A上の保護基を脱保護して、上記式(I)で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩に変換する工程。 - R1及びR1Aがベンジルオキシカルボニルアミノであり、R2がエチルであり、R3がエチルである請求項1又は2のいずれか1項に記載の製造方法。
- (3R)-2'-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)スピロ[ピロリジン-3,4'(1'H)-ピロロ[1,2-a]ピラジン]-1',2,3',5(2'H)-テトラオンの製造方法であって、下記(a)〜(e)の工程を含む製造方法:
(a)式(I):
で表される光学活性スクシンイミド誘導体{以下、化合物(I)と称する}を請求項1に記載の製造方法で製造する工程;
(b)前記工程(a)で得られた化合物(I)を酸の存在下に2,5-ジメトキシテトラヒドロフランと反応させる工程;
(c)前記工程(b)で得られた生成物をトリクロロアセチル化試薬と反応させる工程;
(d)前記工程(c)で得られた生成物を4-ブロモ-2-フルオロベンジルアミンと反応させる工程;及び
(e)前記工程(d)で得られた化合物Aを単離する工程。 - R3がエチルである請求項4又は5に記載の製造方法。
- 以下の(a)〜(d)より選ばれる蛋白質。
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定される蛋白質
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸が置換及び/又は欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列と97%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質
(d)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、N末端から1〜40個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有する蛋白質 - 以下の(a)〜(d)より選ばれるDNA。
(a)配列番号1に記載の塩基配列により特定されるDNA
(b)請求項11に記載の蛋白質をコードするDNA
(c)配列番号1に記載の塩基配列において1から数個の塩基が置換及び/又は欠失及び/又は付加された塩基配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
(d)配列番号1に記載の塩基配列と97%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
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