JP5843783B2 - GPVIに対する新規アンタゴニスト抗体および該抗体のFabフラグメントならびにこれらの使用 - Google Patents
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Description
(a)配列番号:18、配列番号:19および配列番号:20(または配列番号:38)によって定義されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)の相補性決定領域(CDR)と、
(b)配列番号:21、配列番号:22(または配列番号:39)および配列番号:23によって定義されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)の相補性決定領域(CDR)と
を含み、
GPVIエピトープ残基との接触を直接分断することなく各CDRの少なくとも2つのアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に変更することができる。
Pro4、Lys7、Glu40、Lys41、Leu42、Ser43、Ser44、Ser45、Arg46、Arg65、Arg67、Trp76、Leu78、Pro79、Ser80、Asp81、Gln82、Ser165、Arg166
を含むヒトGPVI残基と接触する。
Glu40、Lys41、Leu42、Ser43、Ser44、Ser45、Arg46
を含む配座エピトープを認識するモノクローナル抗GPVI抗体を提供する。
Trp76、Leu78、Pro79、Ser80、Asp81、Gln82
を含む配座エピトープを認識する抗GPVI抗体を提供する。
Glu40、Lys41、Leu42、Ser43、Ser44、Ser45、Arg46、Trp76、Leu78、Pro79、Ser80、Asp81、Gln82
を含む配座エピトープを認識する。
Pro4、Lys7、Glu40、Lys41、Leu42、Ser43、Ser44、Ser45、Arg46、Arg65、Arg67、Trp76、Leu78、Pro79、Ser80、Asp81、Gln82、Ser165、Arg166
を含む配座エピトープを認識する。
Pro4、Lys7、Glu40、Lys41、Leu42、Ser43、Ser44、Ser45、Arg46、Arg65、Arg67、Trp76、Leu78、Pro79、Ser80、Asp81、Gln82、Ser165、Arg166
を含む配座エピトープを認識する。
配列番号15および配列番号10にそれぞれ対応するVL1とVH1
配列番号15および配列番号11にそれぞれ対応するVL1とVH2
配列番号15および配列番号12にそれぞれ対応するVL1とVH3
配列番号15および配列番号13にそれぞれ対応するVL1とVH4
配列番号15および配列番号14にそれぞれ対応するVL1とVH5
配列番号16および配列番号11にそれぞれ対応するVL2とVH2
配列番号17および配列番号11にそれぞれ対応するVL3とVH2
配列番号17および配列番号13にそれぞれ対応するVL3とVH4。
(a)LCVR(配列番号15)とHCVR(配列番号10);
(b)LCVR(配列番号15)とHCVR(配列番号11);
(c)LCVR(配列番号15)とHCVR(配列番号12);
(d)LCVR(配列番号15)とHCVR(配列番号13);
(e)LCVR(配列番号15)とHCVR(配列番号14);
(f)LCVR(配列番号16)とHCVR(配列番号11);
(g)LCVR(配列番号17)とHCVR(配列番号11);および
(h)LCVR(配列番号17)とHCVR(配列番号13)
から成る群から選択される、重鎖可変領域(HCVR)アミノ酸配列と軽鎖可変領域(LCVR)アミノ酸配列の組み合わせをさらに含み、この場合、c末端伸長部は、配列番号:35、配列番号:36および配列番号:37から成る群から選択される。
i)受容体放出がこのメカニズムの少なくとも一部である場合、この過程は、一般にGPVIへのFab結合に依存しない。このことは、Fabによる細胞表面GPVIの小部分(例えば30%)の占有が放出を誘導する場合、この放出過程が、Fabによって占有されたGPVI受容体の30%に限定されず、遊離GPVIにも及ぶことを意味する。このことは、有意に少ないFabで(枯渇により)GPVI遮断100%を達成できることを含意する。
一価:分子の架橋を回避すべき場合に求められる
Fcドメイン欠如:Fc機能が必要とされないまたは望ましくない場合に求められる
より低い分子量:薬物動態的および薬力学的挙動ならびに組織分布を決定する
に依存する。患者への投与後に抗体Fabフラグメントのこれらの望ましい特性を維持するために、Fabフラグメントと非標的分子との相互作用を回避すべきである。
a.FabのC末端先端部への分子の付加
b.細菌、酵母または哺乳動物細胞系を含めて適切な系における修飾Fabの生産
c.修飾Fabの精製
の工程を含む。生産されたFabを適切な溶液中でさらに調合することができる。
a.本発明の1つのHCまたはHCフラグメントおよび1つのLCをコードするDNA配列を含有する細胞系の培養
b.培養基において発現された抗体またはFabの精製
c.適便な形態での抗体の調合
の工程を含む。
GPVIの組換え細胞外D1およびD2ドメインの生成
A hGPVI−hFc融合発現プラスミド(hGPVI−hFc)の構築
ヒトcDNA含有プラスミドをPCRテンプレートとして使用して、ヒト免疫グロブリンIgGのヒンジ領域、CH2およびCH3ドメインを含む237アミノ酸残基重鎖定常領域をコードするDNAフラグメントを増幅させた。ヒトゲノムDNAをPCRテンプレートして使用して、205アミノ酸残基ヒトGPVI D1およびD2細胞外ドメインをコードするDNAフラグメントを増幅した。このヒトGPVI D1およびD2フラグメントはシグナル配列を含み、および野生型タンパク質(NP_057447/Q9HCN6)におけるアミノ酸M1からT205に対応する。ヒトGPVI D1およびD2とヒトFc領域とをコードする、得られた増幅され切断され精製されたPCR産物をライゲーションPCRによって組み合わせ、EcoRIおよびNotl部位を用いるInFusion法によってバキュロウイルス発現ベクターpVL1393にライゲートした。得られたGPVI−Fc ORFを配列番号1としておよびこの対応するタンパク質配列を配列番号2として列挙する。
前に説明したGPVI−Fc含有プラスミドをPCRテンプレートとして使用して、野生型タンパク質(Swissport:Q9HCN6)におけるアミノ酸M1からT205に対応するシグナル配列を含むヒトGPVI D1およびD2細胞外ドメインを増幅した。リバースプライマーは、tev切断認識配列と構築物のC末端のHisタグに相当する7つのヒスチジン残基とをコードするDNAを含有した。得られた増幅PCRフラグメントを制限エンドヌクレアーゼEcoRI+Notlで切断し、バキュロウイルス発現ベクターpVL1393にライゲートした。得られたOFRを配列番号3としておよびこの対応するタンパク質配列を配列番号4として列挙する。
SF900 II無血清浮遊培養(Invitrogen)で増殖させたSF9細胞を、発現プラスミドおよびFlashBacバキュロウイルスDNA(Oxford Expression Technologies)でコトランスフェクトした。Cellfectinトランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用してトランスフェクションを行った。5時間後、トランスフェクトされた培養物に5%全ウシ胎仔血清を添加した。細胞を28℃で5日間、培養した。組換えウイルスを含有する培養上清を、5%ウシ胎仔血清を含有するSF900 II浮遊培養での大規模ウイルス増幅に使用した。
機能性抗GPVI mAbの産生および選択
A 抗GPVI mAbの産生
Kilpatrickら(1997.Hybridoma 16:381389)によって記載されたようなRIMMS法を用いて、GPVI特異的抗体を産生させた。
GPVI−Fc融合タンパク質(実施例1において説明したとおり調製したもの)を捕捉抗原として使用してELISAにより抗GPVI IgG生産についての最初のスクリーニングを行った。プレートをGPVI−Fc融合タンパク質で被覆し、ハイブリドーマ上清をこのプレートに添加し、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートしたウサギ抗マウスIgG(Sigma;#A9044)を使用することによって検出した。TMB−H2O2緩衝液の添加により抗体結合を可視化し、450nmの波長で読み取った。
競合ELISA結合アッセイで第二のスクリーニングを行って、すべてのヒトGPVI特異的mAbの機能的特性を、ヒトGPVI−Fc融合タンパク質へのコラーゲンの結合を遮断するmAbの能力について特性付けした。特注のコーラゲン被覆96ウエルプレート(Pierce)を使用した。ヒトGPVI−Fc融合タンパク質とハイブリドーマ上清のプレインキュベートした混合物をこのプレートに添加し、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗ヒトIgG−Fc(Sigma;#A0170)を使用することによりコラーゲン−ヒトGPVI−Fc複合体を検出した。TMB−H2O2緩衝液の添加により抗体結合を可視化し、450nmの波長で読み取った。100のGPVI結合ハイブリドーマの中で22のハイブリドーマがコラーゲンへのGPVI−Fcの結合を遮断した(閾値:90%阻害)。図1Aに示すように競合ELISAアッセイを用いてヒトGPVIに対する予選択mAbの遮断特性が容量依存性であることを確認した。
GPVI遮断抗体の結合特性を評価するために表面プラズモン共鳴(BIAcore 2000)により最後のスクリーニングを行った。この分析において、本発明者らは、CMチップに共有結合で連結させた抗Fc抗体に固定した抗ヒトGPVI mAbとヒトGPVIタンパク質との相互作用を評価した。Canziani et al 2004.Anal.Biochem.325:301−307により記載されたプロトコルを用いて、個々のmAbの結合動態を実行した。
表1に列挙したGPVI特異的mAbを霊長類GPVI−Fcタンパク質に結合するmAbの能力についてELISAにより評定した。プレートを霊長類GPVI−Fc融合タンパク質で被覆し、抗hGPVI mAbをプレートに添加し、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートしたウサギ抗マウスIgG(Sigma;#A9044)で検出した。TMB−H2O2緩衝液の添加により抗体結合を可視化し、450nmの波長で読み取った。半固体培地中での増殖により、予選択ハイブリドーマをクローニングした。ペトリプレートに125細胞/mLで接種し、有意な増殖を示すクローンを、GPVI結合、GPVI遮断活性および霊長類GPVIとの交差反応性についてスクリーニングした。図1Bおよび図2に示すように、すべてのmAbは霊長類GPVIと交差反応性であった。
モノクローナル抗体の可変ドメインをコードするcDNAを次のように得た:QiagenからのOligotexキットでハイブリドーマ細胞からmRNAを抽出した。Gene Racerキット(Invitrogen)、55℃のトランスクリプターゼSuperScript III(Invitrogen)および表2に記載のプライマー(RACEMOG1またはCKFOR)を用いて、RACE法によるRT−PCRにより、対応するcDNAを増幅した。55℃のポリメラーゼPhusion(Finnzymes)および同じく表2に記載のプライマーを用いて、PCRにより、cDNAフラグメントを増幅した。
KABAT命名法を用いてタンパク質配列からCDR領域についての配列を演繹した。
LCについて、CDR1は配列番号21に対応し、CDR2は、配列番号22に対応し、CDR3は配列番号23に対応する
抗GPVI mAbおよびmAbのFabフラグメントの調製および生物物理学的特性
A 抗GPVI IgGまたはIgGのタンパク質分解性Fabフラグメントによる組換えGPVIへのコラーゲン結合の阻害
コラーゲン被覆384ウエルプレート(Pierce)を3%BSAで2時間ブロックした。漸増濃度のIgGまたはフィシン切断によって生産されたIgGの対応するFabフラグメント(0.3−20μg/mL)を組換えGPVI(細胞外GPVIドメインのFc融合タンパク質;3μg/mL)と共に30分間インキュベートした。GPVI−IgG混合物をコラーゲン被覆プレートに添加し、1時間、室温でインキュベートした。次に、384ウエルプレートを5回洗浄し(DELFIA洗浄用緩衝液、Perkin Elmer)、Eu標識抗ヒトIgG(100ng/mL、Perkin Elmer)を添加した。室温で1時間のインキュベーションの後、プレートを再び5回洗浄し、増強溶液(Perkin Elmer)を添加し、10分間インキュベートした。Tecan Ultraリーダーを使用して360/612nmで蛍光を検出した。図3は、代表的な読取値を示す。表4は、2回の独立した実験のGPVIへのコラーゲン結合の阻害についての算出IC50値(μg/mL)を示す。
1.抗GPVI Fabの組換え生産のための発現プラスミドの構築
抗ヒトGPVI抗体の可変重および軽鎖のアミノ酸配列を、ヌクレオチド配列に逆翻訳し、Young L.およびDong Q.(Nucl.Acids Res.(2004),32(7),e59)により記載されたオーバーラップ伸長PCR(OE−PCR)の修正プロトコルを用いて、または遺伝子合成(Geneart)によって、それぞれ生成した。Invitrogen TOPOクローニングキットを使用してPCR産物をpCR Blunt II TOPOベクターにクローニングし、M13フォワードおよびM13リバースプライマーを使用してシークエンシングした。各可変重鎖をIGHG1(Genebankアクセッション番号Q569F4)のCH1ドメインに融合し、可変軽鎖を定常カッパ鎖(IGKC、Genebankアクセッション番号Q502W4)にそれぞれ融合させた。これらのフラグメントをNheIおよびHindIIIで消化し、それぞれをエピソーム発現ベクターpXL(Durocher et al.(2002),Nucl.Acids Res.30(2),E9によって記載されたpTTベクターの類似物)のNheI/HindIII部位にライゲートして、キメラおよびヒト化抗GPVI Fabの一過性哺乳動物発現のためのプラスミドを作った。抗体の重および軽鎖をコードする発現プラスミドをE.コリ(E.coli)NEB 10−ベータ(DH10B誘導体)において増やした。トランスフェクションに用いたプラスミドは、Qiagen EndoFree Plasmid Mega Kitを使用してE.コリ(E.coli)から調製した。
Freestyle Medium(Invitrogen)で増殖しているHek 293−FSを、Fugene(Roche)トランスフェクション試薬を使用して、示すLCおよびHCプラスミドでトランスフェクトした。7日後、細胞を遠心分離によって除去し、10% 容量/容量 1M Tris HCl(pH8.0)を添加し、上清を0.22μmフィルタに通して粒子を除去した。KappaSelectマトリックス(GE Healthcare)を使用してFabタンパク質を捕捉し、pHシフトによって溶離した。タンパク質含有画分をプールし、PD−10またはSephadexカラムを使用して脱塩した。濃縮し、滅菌濾過(0.22μm)したタンパク質溶液を1mg/mLに調整し、使用するまで4℃で保持した。
精製抗体フラグメントの詳細な動態特性付けにBiacore 3000(GE Healthcare)での表面プラズモン共鳴技術を用いた。リガンドとして抗GPVI Fabおよび分析物としてヒトGPVIで、直接結合アッセイを用いた。典型的には、500RUの抗GPVI Fabをアミン反応性カップリングにより研究グレードDM5チップ上に固定して、結合したGPVI分子について200RUのRmaxを得た。HBS−EP(10mM HEPES(pH7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005% Surfactant P20)中、概して0.8から208nMの間の濃度範囲にわたって30μL/分の流量で結合動態を測定した。チップ表面を10mMグリシン(pH2.0)で再生させた。参照として固定化Fabのないフローセルを使用して、BIAevaluationプログラムパッケージ(バージョン4.1)で動態パラメータを分析および算出した。物質移動を伴う1:1結合モデルを曲線に対するデータのグローバルフィットに利用した。
エピトープ特性付けのために共結晶化戦略を利用した。Fab 390−nG(HEK293細胞において発現されたもの)とヒト糖タンパク質VI(昆虫細胞High fiveにおいて発現された、ヒトGPVIの細胞外粗メイン(Met1−Thr205))の複合体を、両方のタンパク質の等モル比でのインキュベーションによって形成した。この複合体をトリプシンで消化し、ゲル濾過によって再び精製し、濃縮し、結晶化スクリーニングに付した。100nLのタンパク質溶液(20mM Tris(pH8.0)、150mM NaCl中、6.5mg/mLのFab−抗原複合体)と、0.1M BisTris(pH5.5)、25%PEG3350および0.2M酢酸アンモニウムを含有する100nLのリザーバー溶液とを混合すること、および密封したシッティングドロップ蒸気拡散結晶化プレートにおいて4℃で200μLのリザーバー溶液に対するタンパク質ドロップをインキュベートすることによって、よく回折する結晶を得た。凍結防止のために25%エチレングリコールを補足したリザーバー溶液を使用して液体窒素で1つの結晶を急速冷凍した。フランス、グルノーブルの欧州シンクロトン放射光施設(European Synchrotron Radiation Facility)においてビームラインID14−4で結晶学データを収集した。Fab 390−nGについてのモデルとしてpdb−entry 1FDLのFabフラグメントを、およびGPVIについてのモデルとしてヒト血小板糖タンパク質VIの結晶構造の1つの単量体、pdb−entry 2GI7を使用する分子置換によって構造を解明した。この微細構造の分解能および最終R因子は、1.72Å、R因子17.2%およびRフリー19.9%である。GPVI結合エピトープは、抗原hGPVIの下記の残基へのFab 390−nGの相互作用(距離<4.5Åと定義する。)を特徴とする配座エピトープである:
Pro4、Lys7、Glu40、Lys41、Leu42、Ser43、Ser44、Ser45、Arg46、Arg65、Arg67、Trp76、Leu78、Pro79、Ser80、Asp81、Gln82、Ser165、Arg166。
特許出願WO2009/032611に記載されているヒト化プロトコルを用いてFab 390−nGクローンをヒト化した。加えて、Fab 390−nGとヒトGPVIとの結晶学的複合体の分析は、このヒト化キャンペーンの中でヒトGPVIに対するFab 390−nGの親和性を改善するまたは少なくとも保持する目的での幾つかの突然変異につながった。
精製抗体フラグメントの詳細な動態特性付けのためにBiacoa 3000(GE Healthcare)での表面プラズモン共鳴技術を用いた。固定化ヒトGPVIでのアッセイを用いた。典型的には、GPVIの300RUをアミン反応性カップリングにより研究グレードCM5チップ上に固定して、結合した抗体フラグメントについて200RUのRmaxを得た。HBS−EP(10mM HEPES(pH7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005% Surfactant P20)中3.2から112nMの間の濃度範囲にわたって30μL/分の流量で結合動態を測定した。チップ表面を10mMグリシン(pH2.0)で再生させた。参照として固定化GPVIのないフローセルを使用して、BIAevaluationプログラムパッケージ(バージョン4.1)で動態パラメータを分析および算出した。物質移動を伴う1:1結合モデルを、Fabフラグメントの3−56nMの分析物濃度に対応する曲線に対するデータのグローバルフィットに利用した。
抗GPVI Fabフラグメントによるコラーゲン結合のおよび血小板凝集の阻害
A.組換え抗GPVI Fabフラグメントによるコラーゲンへの組換えGPVIの結合の阻害
コラーゲン被覆384プレート(Pierce)を3%BSAで2時間ブロックした。漸増濃度の抗GPVI Fabフラグメント(0.3−20μg/mL)を組換えGPVI(GPVIの細胞外ドメインとヒトIgGのFc部分の融合タンパク質;3μg/mL)と共にインキュベートした。GPVI−Fab混合物をコラーゲン被覆プレートに添加し、1時間、室温でインキュベートした。384ウエルプレートを5回洗浄し(DELFIA洗浄用緩衝液、Perkin Elmer)、Eu標識抗ヒトIgG(100ng/mL、Perkin Elmer)を添加した。室温で1時間のインキュベーションの後、プレートを再び5回洗浄し、増強溶液(Perkin Elmer)を添加し、10分間インキュベートした。Tecan Ultraリーダーを使用して360/612nmで蛍光を検出した。GPVIコラーゲン結合に対する組換え生産抗GPVI Fabフラグメントの阻害効果の例を表15に示す。
多血小板血漿(PRP)については、10%の最終濃度までのACD−Aが入っている注射器に血液を採取した。200×gで20分間、室温で、破壊することなく遠心分離した後、上清(PRP)を分離した。10分間、1500×gでの遠心分離により、残りの血液から少血小板血漿(PPP)を分離した。PRPをPPPでの希釈により3.0×108細胞/mLにした。Fabフラグメントを0.15−20μg/mLの最終濃度で使用し、PRPと共に5分間、37℃でインキュベートした。その後、コラーゲンを1−1.5μg/mLの濃度で添加し、96ウエル・プレート・リーダー(96ウエルプレート凝集)またはBorn凝集検出計(古典的凝集)のいずれかの使用による光透過の測定により凝集応答をモニターした。凝集応答を20分間モニターした。表16に示すように、調査したすべてのFabフラグメントは、濃度依存的様式でコラーゲン誘導血小板凝集を阻害することができた。
これらの実験については、血液を20μg/mLヒルジンで抗凝固剤処置し、直ちに使用した。測定前に全血をNaClで1:1希釈した。Fabフラグメントを0.15−20μg/mLの最終濃度で使用し、血液と共に5分間、37℃でインキュベートした。その後、コラーゲンを1μg/mLの濃度で添加し、Multiplate(登録商標)分析装置を使用するインピーダンスの測定により凝集応答をモニターした。反応を6分間モニターした。製造業者により指定されたとおりに凝集曲線下面積(AUC)によって凝集応答を定量した。図6に示すように、調査したFabフラグメントは、濃度依存的様式でコラーゲン誘導血小板凝集を阻害することができた。
これらの実験については、血液を20μg/mLヒルジンで抗凝固剤処置し、直ちに使用した。1×0.1mmの内径を有する長方形キャピラリーマイクロスライドガラス(英国、ケンブリッジのCamlab)を一晩、100μg/mLのHormコラーゲンで被覆し、室温で1時間、熱不活性化0.5%脂肪酸不含BSAでブロックした。血小板を2μMのDiOC6(3)で蛍光標識し、Fabフラグメントで5分間、37℃で処理した。コラーゲン被覆カバーガラス全体の灌流を2分間、2000秒−1で行った。血液灌流後、タイロード緩衝液1を5分間、同じ剪断速度でマイクロスライド全体に灌流させた。血小板(血栓)表面被覆率の判定により、血栓形成を定量した。このために、キャピラリーの中央の異なるエリアから10の最終蛍光画像を記録した。加えて、位相差およびDIC写真を記録した。白黒CCDカメラ(CoolSnap cf、オットブルンのRopers Scientific GmbH/Photometrics)に接続したImagePro plus画像処理ソフトウェア(米国、シルバースプリングのMediacy)を使用して、画像処理、記録および分析を行った。図7A−Eは、抗GPVI Fabフラグメントによる血流下での血栓形成の阻害の例を示す。
このインビボ調査には、GPVI受容体がヒト化されたマウスを用いた。頸動脈閉塞を光化学的に誘導して、血管外壁に影響を及ぼすことなく血管内側に血管内皮損傷を生じさせた。この技法により、赤色色素、ローズベンガルを全身投与し、頸動脈の内皮に緑色レーザー光線を照射して、「インサイドアウト」損傷を生じさせた。抗GPVI Fabフラグメントを10mg/kgで頸静脈カテーテルにより静脈内ボーラスとして投与した。15分のインキュベーション期間の後、レーザー光線源を頸動脈端部からフロープローブのほうに12cm離して配置した。90分の観察期間の間、継続的に血流をモニターした。測定した血栓症パラメータは、血管損傷後に動脈閉塞を完了する時間長(閉塞までの時間、TTO)および血流曲線下面積(AUC)であった。
これらの実験については、血液を20μg/mLヒルジンで抗凝固剤処置し、直ちに使用した。示す濃度で抗GPVI−Fabフラグメントを使用した。血液または多血小板血漿(PRP)試料をFabフラグメントと共に5分間、15分間、1時間および2時間、それぞれインキュベートした。その後、パラホルムアルデヒドを使用して試料を固定し、GPVI受容体発現を判定した。血小板表面のGPVI密度を、異なる蛍光標識抗GPVI抗体を使用して測定し、フローサイトメーター(BD LSR II)で判定した。対照として、この抗体が調査したFabフラグメントとは無関係に(および調査したFabフラグメント存在下で)GPVIに結合できることを予め証明した。
1.動物詳説および投薬レジメン:
動物研究は、地元の動物福祉規制に従っておよび獣医当局による登録を受けたAAALAC(実験動物管理公認協会)認証施設において行った。研究において使用した種/株は、カニクイザル(Macaca fascicularis)であった。この研究にはメスザルのみを使用した。1用量群につき2匹の動物を研究した。研究した用量は、リン酸緩衝食塩水(PBS)ビヒクル対照、0.01、0.1、1および3mg/kgの抗GPVI Fabを含み、すべて2mL/kgのIVボーラスで投与した。含めたサルの体重は、3.52kgと7.34kgの間の範囲であった。1mg/kg用量群において使用した動物のうちの1匹(サルD)は、投薬前試料で血小板凝集応答を一切示さなかった。この故、継時的な凝集応答(投薬前と比較した%での凝集の阻害)の個体内相対変化の算出は不可能であったのでデータを提供しない。
健常で意識のある一箇所に収容されていたサルの前肘静脈から、薬物またはビヒクル投与前および後に様々な時間間隔(投薬前、0.5、1、2、4、6、8、24、48、72、149.5時間)で針を穿刺して、3.13%クエン酸ナトリウム(ドイツ、Bad Neuenahr−AhrweilerのEifelfango)が入っている試験管に全血を採集した(血液試料採取後、全試験管容積の1/10)。PBSビヒクル治療群からは、試料採取スケジュールがわずかに異なり、次の時点で試料を採取した:投薬前、0.5、1、2、4、6、8、24、48、126時間。自動血液学分析装置Scil Vet abc(ドイル、ViernheimのScil animal care Company GmbH)を使用することにより、血小板数に特に的を絞って全血球数を判定して、血液学の生理状態をモニターした。全血凝集アッセイ後、残りの血液試料を各時点からの血漿調製のために遠心分離した。血漿調製のために、血液を5000U/分で15分間、遠心分離し上清を別の試験管に回収し、後の時点での抗GPVI Fabの血漿レベルについての分析のために−20℃で冷凍した。
全血血小板凝集アッセイは、multiplate(登録商標)血小板機能分析装置(ドイツ、ミュンヒェンのDynabyte Informationssysteme GmbH)を使用して行った。使用したアゴニストは、1μg/mLの最終濃度でのウマI型コラーゲン(Horn collagen、ドイツ、ミュンヒェンのNycomed)であった。製造業者の説示に従って分析を行い、投薬前の個々の全血凝集応答それぞれを基準にして全血凝集の阻害率を算出した。簡潔に説明すると、カートリッジに297μLのCaCl2を前もって負荷し、297μLの全血を添加した。5分の平衡の後、6μLのアゴニストコラーゲンを100倍濃度で添加し、測定を開始した。7分間、記録を行い、分での一定期間にわる曲線下面積(AUC、任意単位)として結果を表示した。投薬前の値と比較した一定期間のAUCの相対変化を計算して血小板凝集の阻害率を得、グラフにプロットした。
健常で意識のある一箇所に収容されていたサルの前肘静脈から薬物またはビヒクル投与前および後に様々な時間間隔で針を穿刺して、3.13%クエン酸ナトリウムが入っている試験管に全血を採集し(血液試料採取後、全試験管容積の1/10)、直ちに使用した。5%パラホルムアルデヒドを使用して試料を固定し、GPVI受容体発現を判定した。血小板表面の密度を、異なる蛍光標識抗GPVI抗体を使用して測定し、フローサイトメーターで判定した。対照として、この抗体が調査したFabフラグメントとは無関係に(および調査したFabフラグメント存在下で)GPVIに結合できることを予め証明した。
それぞれの投薬レジメンを比較するために、個々の動物それぞれの投薬前の値を基準にして全血血小板凝集の阻害率を算出した。PBSビヒクル群は、IVボーラス投与後6時間の時点で67%までの血小板凝集阻害を見せた(データは示さない。)。しかし、少なくとも2つの連続する時点にわたって少なくとも80%の血小板凝集阻害が生理学的に適切であると考えられた。試験した抗GPVI Fabの2つの低い用量(0.01および0.1mg/kg 抗GPVI fab)の両方が全血凝集の適切な阻害を一切示さなかった。1mg/kgでは、93%血小板阻害が投与後1時間の時点で既に達成され、(2での効果のわずかな減少(図10A)を除けば)24時間まで80%より上のままであった。その後、血小板機能の阻害は継時的に減少した。3mg/kgでは、血小板凝集の阻害は観察の最初の24時間の間80%より大きい値で安定しており、72時間まで69%と77%の間の値を維持した(図10B)。試験したより高い用量群両方において、血小板機能は最後の時点で(149.5時間、図10AおよびB)完全に回復された。このデータに基づいて、ED50をIVボーラス投与後0.5時間の時点で概算し、試験した抗GPVI Fabについて0.5mg/kgと判明した。
実験の時間経過を通して血液学の生理状態をモニターするために、血小板数に特に的を絞って全血球数を判定した。平均血小板数は、投薬前の時点でのPBSビヒクル中の428×103/μLと0.01mg/kg 抗GPVI Fabでの369×103/μL、0.1mg/kg 抗GPVI Fabでの235×103/μL、1mg/kg 抗GPVI Fabでの357×103/μL、および3mg/kg 抗GPVI Fabでの312×103/μLの間で様々であった(図12A−E)。実験の時間経過を通して、血小板数は実質的に変化せず(即ち、100×103/μL未満の値)、PBSビヒクル群において126時間の時点で次の血小板数を判定した:358×103/μL(図12A)。すべての抗GPVI Fab治療群において、149.5時間の時点で判定した血小板数は、次の値を示した:0.01mg/kg 抗GPVI Fabでの411×103/μL、0.1mg/kg 抗GPVI Fabでの329×103/μL、1mg/kg 抗GPVI Fabでの321×103/μL、および3mg/kg 抗GPVI Fabでの320×103/μL(図12B−E)。判定した他のすべての血液学パラメータ、ヘマトクリット、赤血球数およびヘモグロビンは、実験の時間経過を通じて実質的に変わらなかった(データは示さない。)。
図13に示すように、抗GPVI Fabのiv投与前、すべての血小板はGPVI発現について陽性であった(投薬前)。薬物投与後に採取した血液では、GPVIに対する特異的シグナルを血小板表面で観察することができなかった(24時間)。薬物投与後48時間の時点で開始して、新たな血小板集団が発生し、これらはGPVI陽性である。薬物投与の150時間後、すべての血小板はGPVI受容体発現に対して再び陽性であった。
自己抗体による認識によるFabフラグメント特性の修飾
A ドナー血漿における活性化性成分の判定
抗GPVI Fabの活性化性効果にとっての血漿中に存在するIgGの重要性を調査するために、51の異なる血液試料を試験した。活性化性と同定された試料のIgGを、プロテインAを使用して枯渇させた。
Fabによる血小板活性化の活性化に関する血漿IgGの役割をさらに調査するために、重および軽鎖(HCおよびLC)配列は同一であるが重鎖のC末端修飾が異なる種々のFabフラグメントを使用した。
Fab−Hisタグ:C末端Hisタグを加えた自然に存在する配列に相当する、HC上にHisHisHisHisHisペプチド配列(配列番号:35)を有するもの(図15B)
Fab−Gly4Ser:C末端Gly4Serタグを加えた自然に存在する配列に相当する、Hc上にGlyGlyGlyGlySerペプチド配列(配列番号:36)を有するもの(図15C)
Fab−(Gly4Ser)2:C末端(Gly4Ser)2タグを加えた自然に存在する配列に相当する、Hc上にGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerペプチド配列(配列番号:36)を有するもの(図15C)
Claims (11)
- ヒト化重鎖(HC)アミノ酸配列とヒト化軽鎖(LC)アミノ酸配列の組み合わせを含む、改変Fabフラグメントであって、
該ヒト化重鎖が、追加のアミノ酸残基を含むc末端伸長部をさらに含み、
該c末端伸長部が、抗Fab抗体による認識を防止するものであり、および
該c末端伸長部が、配列番号:36および配列番号:37から成る群から選択される、
改変Fabフラグメント。 - Fabフラグメントが、ヒトGPVIに特異的に結合し、およびGPVI枯渇表現型を誘導する、請求項1に記載の改変Fabフラグメント。
- Fabフラグメントが、ヒトGPVIの配座エピトープに結合し、ならびにSer43、Arg67およびAsp81を含むヒトGPVI残基と接触する、請求項2に記載の改変Fabフラグメント。
- Fabフラグメントが、
(a)配列番号:18、配列番号:19および配列番号:20によって定義されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)の相補性決定領域(CDR)と
(b)配列番号:21、配列番号:22および配列番号:23によって定義されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)の相補性決定領域(CDR)と
を含む、
請求項2または3に記載の改変Fabフラグメント。 - Fabフラグメントが、配列番号6の重鎖および配列番号8の軽鎖を含む、請求項2から4のいずれか一項に記載の改変Fabフラグメント。
- Fabフラグメントが、ヒト化されたものである、請求項2から5のいずれか一項に記載の改変Fabフラグメント。
- ヒト化Fabフラグメントが、
(a)LCVR(配列番号15)とHCVR(配列番号10);
(b)LCVR(配列番号15)とHCVR(配列番号11);
(c)LCVR(配列番号15)とHCVR(配列番号12);
(d)LCVR(配列番号15)とHCVR(配列番号13);
(e)LCVR(配列番号15)とHCVR(配列番号14);
(f)LCVR(配列番号16)とHCVR(配列番号11);
(g)LCVR(配列番号17)とHCVR(配列番号11);および
(h)LCVR(配列番号17)とHCVR(配列番号13)
から成る群から選択される、重鎖可変領域(HCVR)アミノ酸配列と軽鎖可変領域(LCVR)アミノ酸配列の組み合わせを含む、請求項6に記載の改変Fabフラグメント。 - 請求項1から7のいずれか一項において定義したとおりの改変Fabフラグメントと医薬的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
- 請求項1から7のいずれか一項において定義したとおりの改変Fabフラグメントの調製方法であって、
a.請求項1から7において定義したとおりの改変Fabフラグメントを発現する細胞系の培養
b.培地において発現された該改変Fabフラグメントの精製
の工程を含む方法。 - 血栓性疾患および血管疾患の予防または治療に使用するための、請求項1から7のいずれか一項において定義したとおりの改変Fabフラグメント。
- 重鎖のc末端に分子を有する、修飾Fabフラグメントの調製方法であって、
a.Fabフラグメントの重鎖c末端への、配列番号:36および配列番号:37から成る群から選択される分子の付加、
b.適切な系における修飾Fabフラグメントの生産、
c.修飾Fabフラグメントの精製、
の工程を含み;
該付加が、既存する抗Fab抗体による修飾Fabフラグメントの認識を防止するか、または抗GPVI Fabを使用するときの、血小板活性を防止する、
前記方法。
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