JP5843072B2 - 特定物質の測定方法および特定物質測定用キット - Google Patents
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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Description
例えば、ADPにホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを作用させ、次いで、生成するピルビン酸を補酵素としてNADH存在下で乳酸脱水素酵素を作用させてNADを生成させ、波長340nmの吸光度をもつNADHの減少量からADPを測定する方法が知られている(非特許文献1)。しかし、この方法は、検体中のADPが多くなるにつれて吸光度が減少する測定方法であるため、測定できるADPの上限値が試薬中のNADHにより制限されたりする場合がある。
また、ADPの測定方法として、試料中のADPにホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを作用させ、次いで、生成するピルビン酸をピルビン酸オキシダーゼ等で作用させ、生成する過酸化水素の量からADPを測定する方法が知られている(特許文献3)。しかし、この方法は試料中の尿酸、アスコルビン酸等の還元物質や、ビリルビン、ヘモグロビン等の着色物質の影響を受けやすくそれが測定値に影響を及ぼす場合がある。
[1].ATPを用いた酵素反応によりADPを発生させる試料中の特定物質の測定方法であって、
i)試薬成分としてのATP中に不純物として存在するADPに、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる工程、
ii)生成するグルコース−6−リン酸にグルコース−6−リン酸脱水素酵素とNAD類を作用させる工程、および
iii)生成するNADH類をピルビン酸と乳酸脱水素酵素を作用させNADH類を消去させる工程
により試薬成分としてのATP中のADPを除去させるADP除去反応;次いで
iv)上記i)からiii)の工程からなるADP除去反応によりADPが除去された試薬成分としてのATPを用いて試料中の特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程、
v)生成するADPに、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる工程、
vi)生成するグルコース−6−リン酸にグルコース−6−リン酸脱水素酵素とNAD(P)類を作用させる工程、および
vii)生成するNAD(P)H類を測定する工程
により試料中の特定物質を測定する特定物質測定反応
からなることを特徴とする特定物質の測定方法;
[2].試薬成分としてのATP中のADPを除去させるADP除去反応後、該ADP除去反応における工程iii)の乳酸脱水素酵素反応が進行しない条件下で、iv)からvii)の工程からなる特定物質測定反応を行う、上記[1]記載の特定物質の測定方法;
[3].工程vi)において用いるNAD(P)類がNADP類であり、かつ工程vii)において測定するNAD(P)H類がNADPH類である、上記[2]に記載の特定物質の測定方法;
[4].工程vi)において用いるグルコース−6−リン酸脱水素酵素の基質親和性がNAD類よりNADP類の方が高い、上記[3]に記載の特定物質の測定方法;
[5].試薬成分としてのATP中のADPを除去させるADP除去反応後、特定物質測定反応におけるvi)からvii)のいずれもの工程での反応液に乳酸脱水素酵素阻害剤を含む、上記[2]から[4]のいずれかに記載の特定物質の測定方法;
[6].乳酸脱水素酵素阻害剤がシュウ酸である、上記[5]に記載の特定物質の測定方法;
[7].工程vi)において、NAD(P)類としてNAD(P)とチオNAD(P)を共存させて使用し、かつ、工程vii)において、NAD(P)H類を測定する工程が、生成するチオNAD(P)H由来の波長405nm付近の吸光度の増加を測定することにより行う、上記[1]から[6]のいずれかに記載の特定物質の測定方法;
[8].特定物質が尿素であり、特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程iv)が、試料中の尿素にATP、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオン、およびウレアアミドリアーゼを作用させてADPを発生させる工程である、上記[1]から[7]のいずれかに記載の特定物質の測定方法;
[9].ATPを用いた酵素反応によりADPを発生させる特定物質を測定するためのキットであり、かつ、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−6−リン酸脱水素酵素、NAD類、ピルビン酸、乳酸脱水素酵素、およびATPを必須成分として含む第一試薬;およびNAD(P)類を必須成分として含む第二試薬から構成され、かつ第一試薬または第二試薬に、特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程に必須であってATP以外である試薬成分を他の試薬成分と独立に含む、特定物質測定用キット;
[10].特定物質が尿素であり、特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程に必須であってATP以外の試薬成分が、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオン、およびウレアアミドリアーゼである、上記[9]に記載のキット;および
[11].第二試薬に乳酸脱水素酵素阻害剤を含む、上記[9]または[10]に記載のキット
に関する。
本発明において、特定物質とは、ATPを用いる酵素反応によりADPを生成する物質、すなわち、ATPよりADPを生成する酵素またはその基質であれば特に限定しない。そのような特定物質として尿素またはウレアアミドリアーゼ、クレアチンまたはクレアチンキナーゼ、コリンまたはコリンキナーゼを例示できる。
本明細書においては、そのような特定物質とATPとよりADPを生成する酵素反応を特定物質酵素反応ともいうものとする。
特定物質として尿素またはウレアアミドリアーゼを測定するときには、特定物質酵素反応として、尿素、ATP、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオンとウレアアミドリアーゼを作用させるウレアアミドリアーゼ反応を用いることができる。その反応式を下記に示す。
本発明において、NAD(P)類とは、NAD、NADP、チオNAD、チオNADPのいずれかを意味し、NAD類とは、NAD、チオNADのいずれかを意味し、NADP類とは、NADP、チオNADPのいずれかを意味するし、脱水素酵素反応に用いる補酵素として働く化合物のことを指す。ここで、NADとはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味し、NADPとはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを意味し、チオNADとはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味し、チオNADPとはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを意味する。
本発明において、NAD(P)H類とは、NAD(P)類の対応する還元型であり、NAD(P)類がNAD、NADP、チオNAD、チオNADPのときは、それぞれ、NADH、NADPH、チオNADH、チオNADPHを意味する。
本発明において、NAD(P)とは、NADまたはNADPを意味し、NAD(P)Hとは、NAD(P)の対応する還元型を意味し、NAD(P)がNAD、NADPのときは、それぞれ、NADH、NADPHを意味する。本発明において、チオNAD(P)とは、チオNADまたはチオNADPを意味し、チオNAD(P)Hとは、チオNAD(P)の対応する還元型を意味し、チオNAD(P)がチオNAD、チオNADPのときは、それぞれ、チオNADH、チオNADPHを意味する。
本発明においては、i)からiii)の工程からなるADP除去反応、iv)からvii)の工程からなる特定物質測定反応は、それぞれ、ワンポットで、すなわち一気に行うことが好ましい。
i)試薬成分としてのATP中に不純物として存在するADPに、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる工程
この工程i)においては、下記反応式(本明細書ではこの反応をADP依存性ヘキソキナーゼ反応と記載することもある)において、ADPに、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させてグルコース−6−リン酸(G6P)を生成させる。この工程においては、ADPは、試薬成分としてのATPに不純物として存在するADPである。
工程ii)においては、工程i)で生成するグルコース−6−リン酸(G6P)が酵素反応に付される。下記反応式(本明細書では、グルコース−6−リン酸脱水素酵素が関与する反応をグルコース−6−リン酸脱水素酵素反応ともいう)のように、グルコース−6−リン酸脱水素酵素(G6PDH)とNAD類を作用させると、グルコノラクトン−6−リン酸(6−PGL)とともに、NADH類が発生する。
特定物質測定反応における工程vi)で発生するNAD(P)H類を工程vii)で測定する際、工程ii)で生成するNADH類は、ブランクの上昇の原因となるので、この工程iii)においては、工程ii)で生成するNADH類をピルビン酸と乳酸脱水素酵素を作用させる乳酸脱水素反応によりNADH類をNAD類に変換させ消去させる。
iv)上記i)からiii)の工程からなるADP除去反応によりADPが除去された試薬成分としてのATPを用いて試料中の特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程
本工程iv)においては、特定物質酵素反応を進行させるための試薬成分を用いた特定物質酵素反応により、測定対象である試料中の特定物質と、上記i)からiii)の工程からなるADP除去反応によりADPが除去された試薬成分としてのATPとよりADPを生成させる。
この工程は、前記工程iv)で生成するADPを、ADP依存性ヘキソキナーゼ反応に付す工程である。
この工程においては、工程v)により生成したグルコース−6−リン酸(G6P)にグルコース−6−リン酸脱水素酵素(G6PDH)を作用させてグルコース−6−リン酸脱水素酵素反応を行い、グルコノラクトン−6−リン酸(6−PGL)とともにNADH類が生成する。なお、補酵素としては、工程ii)とは異なり、工程ii)の後の乳酸脱水素酵素反応を進行させることを考慮する必要がないので、NAD類に限定されず、NAD(P)類を用いることができる。
本工程においては、NAD(P)類では吸光度がほとんどなくNAD(P)H類で吸光度がある波長を用いて、NAD(P)H類由来の吸光度の増加を測定する。そのNAD(P)H類由来の吸光度の増加量から、あらかじめ作成した検量線と比較して、特定物質の濃度を測定することができる。
工程vi)において、補酵素のNAD(P)類としてNAD(P)を用いる場合は、生成するNAD(P)Hに由来する340nm付近、例えば、波長330〜350nmの吸光度の増加量からADPを測定することができる。
本発明において、工程vi)において、補酵素のNAD(P)類としてチオNAD(P)を用いる場合は、生成するチオNAD(P)Hに由来する405nm付近、例えば、波長390〜415nmの吸光度の増加量からADPを測定することができる。本発明においてこのチオNAD(P)を用いることは、安価で入手しやすい可視分光光度計を用いて測定できる点、特定物質の測定領域を著しく改善できる点などで好適である。
この場合、用いるNAD(P)の量は特に限定しないが、検量線の傾きを適度に調整するため、用いるチオNAD(P)の量の0.1〜30倍モル数が好ましく、0.5〜25倍モル数がさらに好ましい。
本発明においては、工程iii)の乳酸脱水素酵素反応はNAD依存性なので、特定物質測定反応においてこの乳酸脱水素酵素反応を進行させないためには、工程vi)で用いるNAD(P)類は、NADP類であることが好ましい。その際、グルコース−6−リン酸脱水素酵素は、基質親和性がNAD類よりNADP類の方が高いものが好ましい。この場合、グルコース−6−リン酸脱水素酵素は、NADP類に対するKmが、NAD類に対するKmの0.01〜0.5倍が好ましい。
また、乳酸脱水素酵素反応を特定物質測定反応において進行させないためには、試薬成分中のADPを除去させたADP除去反応後、iv)からvii)の工程からなる特定物質測定反応において、反応液に乳酸脱水素酵素阻害剤を存在させて乳酸脱水素酵素反応を阻害することも好ましい。乳酸脱水素酵素阻害剤としては、シュウ酸、オキサミン酸およびこれらの塩を例示することができ、中でも、シュウ酸が好ましい。
第二試薬には、iv)からvii)の工程からなる特定物質測定反応を進行させるための成分として、NAD(P)類を必須成分として含むが、第一試薬に含まれている成分は省略してもよい。第一試薬または第二試薬には、特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程に必須であってATP以外である試薬成分は、独立に含まれることが必要であり、さらに少なくともその必須成分の一部または全部が第二試薬に含まれていることが好ましい。
例えば、特定物質が尿素の場合、特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程に必須であってATP以外である試薬成分は、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオン、およびウレアアミドリアーゼであり、これらが独立に第一試薬または第二試薬に含まれていることが必要である。さらに少なくともその必須成分の一部または全部が第二試薬に含まれていることが好ましい。
例えば、第二試薬には、乳酸脱水素酵素阻害剤を含むことが好ましい。第一試薬または第二試薬には、界面活性剤、緩衝剤を適宜、加えてもよい。
例えば、i)からiii)の工程を経た第一試薬を20〜40℃好ましくは37℃で混合し3〜10分好ましくは5分で放置する。ついでそれに、試料および第二試薬を加え、iv)からvii)の工程を含む特定物質測定反応を、ワンポットで、すなわち一気に行い、生成するNAD(P)Hの増加を適当な波長の吸光度を測定することにより、特定物質を測定することができる。
チオNADPとNADPを用い阻害剤(シュウ酸)を用いない本発明による尿素の測定
1.方法
ウレアアミドリアーゼ、ADP依存性ヘキソキナーゼ、およびグルコース−6−リン酸脱水素酵素、チオNADP、NADPを用いた尿素窒素測定系において、試薬中のATP中に含有されるADPから、ADP依存性ヘキソキナーゼ、およびグルコース−6−リン酸脱水素酵素の反応によって生じるNADHの発色を、前もって試薬中の乳酸脱水素酵素を用いた反応によりNADHをNADに酸化して消去することにより防止した。この方法により、ブランク値、尿素の測定可能の濃度範囲を検討した。更に、乳酸脱水素酵素を用いることなく、NADHをNADに酸化して消去しないで測定する比較例と比較した。
ブランク試料は生理食塩水を用いた。測定のための試料は尿素窒素として200mg/dLとなる様に尿素溶液を調製し、各濃度に生理食塩水で適宜希釈した。
試薬は、以下の第一試薬および第二試薬を用いた。
第一試薬:
第一試薬は、以下の組成のものを用いた。
100mM BES(N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル−2−
アミノエタンスルホン酸)pH7.5
10mM D−グルコース
10mM 炭酸水素カリウム
5mM ATP・2Na(種々の濃度のADPを含む)
10mM ピルビン酸
5mM NAD
0.1% 界面活性剤
10mM 酢酸マグネシウム・四水和物
6KU/L ヘキソキナーゼ
2KU/L グルコース−6−リン酸脱水素酵素
200U/L 乳酸脱水素酵素
第二試薬は、以下の組成のものを用いた。
100mM BES(N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル−2−
アミノエタンスルホン酸)pH7.5
2KU/L ウレアアミドリアーゼ
5mM NADP
1mM チオNADP
0.1% 界面活性剤
本実施例では、表1に示すように試薬成分のATP中にADPが存在している試薬を用いた。本実施例に用いた第一試薬はADPより発生したNADHが乳酸脱水素酵素によりNADとなるように1時間以上放置し、十分な時間を置きATP中のADPを除去した。また、乳酸脱水素酵素(LDH)による逆反応の影響を防ぐため、ADP測定系(特定物質測定反応における工程vi))に用いる補酵素はLDHと反応するチオNADではなく、LDHと反応しないチオNADPを用いた。なお、このとき、その補酵素としてNADPを加えず、チオNADP単独では、測定ブランクが2倍以上で傾きが高く測定濃度範囲は、50mg/dL以下となるため、チオNADPとNADPを併用することにした。
表1に示したとおり、比較例1から7に用いた第一試薬はLDHを添加せず、ADPの消去反応が起きない組成を用いた。加えて、測定系の測定可能範囲を広げることを目的とし、NADPとチオNADPの終濃度比が5:1となるような試薬組成を用いた。
測定は以下のように行った。可視部測定装置(吸光度信頼範囲2.5以下)を用い、試料3.0μLと第一試薬100μLとを37℃、5分間混合した後、第二試薬100μLを加え同温度で5分間反応させた。発色反応後の吸光度を当該機種の1ポイントエンド法により波長405nmで測定した。
a)ブランク吸光度の比較
ブランクの吸光度の結果を図1と表2に示す。
比較例1−7の検量線を図2に、実施例1−7の検量線を図3に示す。
図2で示すように比較例1−7の組成では、尿素窒素濃度200mg/dLの試料を測定する場合、得られる吸光度が測定機器の吸光度上限である2.5を越え、測定不能であった。一方、図3が示すように実施例1−7では尿素窒素濃度200mg/dLの試料を測定しても得られる吸光度は2.5を越えず、本発明により尿素の測定可能範囲が拡大されることが判明した。
チオNADとNADを用いさらに阻害剤(シュウ酸)を用いた本発明による尿素の測定
1.方法
ウレアアミドリアーゼ、ADP依存性ヘキソキナーゼ、およびグルコース−6−リン酸脱水素酵素、チオNAD、NADを用いた尿素窒素測定系において、試薬中のATP中に含有されるADPから、ADP依存性ヘキソキナーゼ、およびグルコース−6−リン酸脱水素酵素の反応によって生じるNADHの発色を、前もって試薬中の乳酸脱水素酵素を用いた反応によりNADHをNADに酸化して消去することにより防止した。その後、乳酸脱水素酵素阻害剤(シュウ酸)によりその酵素反応を停止させた。この方法による、ブランク値、尿素の測定可能な濃度範囲を検討した。更に、乳酸脱水素酵素を用いることなく、NADHをNADに酸化して消去しないで測定する比較例と比較した。
ブランク試料は生理食塩水を用いた。測定のための試料は尿素窒素として200mg/dLとなる様に尿素溶液を調製し、各濃度に生理食塩水で適宜希釈した。
試薬は、以下の第一試薬および第二試薬を用いた。
第一試薬:
第一試薬は、以下の組成のものを用いた。
100mM BES(N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル−2−
アミノエタンスルホン酸)pH7.5
10mM D−グルコース
10mM 炭酸水素カリウム
5mM ATP・2Na(種々の濃度のADPを含む)
10mM ピルビン酸
5mM NAD
0.1% 界面活性剤
10mM 酢酸マグネシウム・四水和物
6KU/L ヘキソキナーゼ
2KU/L グルコース−6−リン酸脱水素酵素
200U/L 乳酸脱水素酵素
第二試薬は、以下の組成のものを用いた。
100mM BES(N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル−2−
アミノエタンスルホン酸)pH7.5
2KU/L ウレアアミドリアーゼ
100mM シュウ酸カリウム・一水和物
1mM チオNAD
0.1% 界面活性剤
本実施例では、表3に示すように試薬成分のATP中にADPが存在している試薬を用いた。本実施例に用いた第一試薬はADPより発生したNADHが乳酸脱水素酵素(LDH)によりNADとなるように十分な時間を置き用いた。また、試料中の尿素窒素から生成されたNADHがLDHによって消去されないように、LDHに対するインヒビターであるシュウ酸を第二試薬組成中に添加した。表3に示すように比較例に用いた第一試薬はLDHを添加せず、ADPを消去しない組成を用いた。加えて、チオNAD単独では、測定ブランクが2倍以上で傾きが高く測定濃度範囲は、50mg/dl以下となるため、測定系の測定可能範囲を広げることを目的とし、NADとチオNADの終濃度比が5:1となるような試薬組成を用いた。
測定は以下のように行った。可視部測定装置(吸光度信頼範囲2.5以下)を用い、試料3.0μLと第一試薬100μLとを37℃、5分間混合した後、第二試薬100μLを加え同温度で5分間反応させた。発色反応後の吸光度を当該機種の1ポイントエンド法により波長405nmで測定した。
5.結果
a)ブランク吸光度の比較
ブランクの吸光度の結果を図4と表4に示す。
比較例8−14の検量線を図5に、実施例8−14の検量線を図6に示す。
図5が示すように比較例8−14では、尿素窒素濃度200mg/dLの試料を測定する場合、得られる吸光度が測定機器の吸光度上限である2.5を越え、測定不能であった。一方、図6が示すように実施例8−14では尿素窒素濃度200mg/dLの試料を測定しても得られる吸光度は2.5を越えず、本発明により尿素の測定範囲が拡大されることが判明した。
Claims (10)
- 試料中の、ATPを用いた酵素反応によりADPを発生させる特定物質の測定方法であって、
1)グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−6−リン酸脱水素酵素、NAD、ピルビン酸、乳酸脱水素酵素、およびATPを含む第一試薬:
ここで第一試薬は、
試薬成分としてのATP中に不純物として存在するADPに、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させ;生成するグルコース−6−リン酸にグルコース−6−リン酸脱水素酵素とNADを作用させ;生成するNADHをピルビン酸と乳酸脱水素酵素を作用させNADHを消去させることにより試薬成分としてのATP中のADPを除去させるADP除去反応をされている;
を試料に添加し、ついで
2)NAD(P)類を含む第二試薬を添加反応させ;
上記ADP除去反応によりADPが除去された試薬成分としてのATPを用いて試料中の特定物質を酵素反応に付しADPを発生させ;生成するADPに、第一試薬由来のグルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させ;生成するグルコース−6−リン酸にグルコース−6−リン酸脱水素酵素とNAD(P)類を作用させ、そして
3)生成するNAD(P)H類を測定することより試料中の特定物質を測定することを含み、
ここで、第一試薬または第二試薬には、特定物質を酵素反応に付しADPを発生させるのに必須であってATP以外である試薬成分が独立に含まれ、その必須成分の一部または全部が第二試薬に含まれていることを特徴とする、
特定物質の測定方法。 - 前記NAD(P)類が、NADP類である、請求項1記載の特定物質の測定方法。
- グルコース−6−リン酸脱水素酵素の基質親和性がNADよりNADP類の方が高い、請求項2に記載の特定物質の測定方法。
- 前記第二試薬が、乳酸脱水素酵素阻害剤を含む、請求項1から3のいずれかに記載の特定物質の測定方法。
- 乳酸脱水素酵素阻害剤がシュウ酸である、請求項4に記載の特定物質の測定方法。
- 第二試薬が、NAD(P)類としてNAD(P)とチオNAD(P)を含み、かつ、工程3)において、NAD(P)H類を測定する工程が、生成するチオNAD(P)H由来の波長405nm付近の吸光度の増加を測定することにより行う、請求項1から5のいずれかに記載の特定物質の測定方法。
- 特定物質が尿素であり、特定物質を酵素反応に付しADPを発生させるのに必須であってATP以外である試薬成分が、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオン、およびウレアアミドリアーゼである、請求項1から6のいずれかに記載の特定物質の測定方法。
- 請求項1に記載の特定物質の測定方法のためのキットであり、
グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−6−リン酸脱水素酵素、NAD、ピルビン酸、乳酸脱水素酵素、およびATPを必須成分として含む第一試薬;および
NAD(P)類を必須成分として含む第二試薬を含み、
ここで第一試薬または第二試薬に、特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程に必須であってATP以外である試薬成分が独立に含まれ、その必須成分の一部または全部が第二試薬に含まれている、
特定物質測定用キット。 - 特定物質が尿素であり、特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程に必須であってATP以外の試薬成分が、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオン、およびウレアアミドリアーゼである、請求項8に記載のキット。
- 第二試薬に乳酸脱水素酵素阻害剤を含む、請求項8または9に記載のキット。
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