JP5834484B2 - Process for producing fucosylated Gal-Glc or a derivative thereof - Google Patents
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Description
本発明は、フコシル化されたGal−Glcまたはその誘導体の製造方法などに関する
。
The present invention relates to a method for producing fucosylated Gal-Glc or a derivative thereof.
ルイス(Le)式血液型抗原決定基は、複合糖質糖鎖の非還元末端に頻繁に見られ、ヒ
トなどの高等動物で様々な役割を果たしている。マウス胚の発生過程では、段階特異的に
Lex[Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc]抗原の発現が観察され、この
一過的発現は胚細胞緊密化に関与していると考えられている。Lex抗原の発現は脳にお
いても制御されていることが見出され、中枢神経系の発達に重要であると推定されている
。通常の発生過程のみならず、Lea[Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc
]およびLeb[Fucα1−2Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc]抗原
の発現量の増加は、癌の進行および悪性度と相関していることがよく知られている。さら
に、シアリルLex抗原は、炎症部位での白血球ローリングを制御するセレクチンリガン
ドとして作用している。
The Lewis blood group antigenic determinant is frequently found at the non-reducing end of glycoconjugate sugar chains and plays various roles in higher animals such as humans. In the developmental process of mouse embryos, expression of Le x [Galβ1-4 (Fucα1-3) GlcNAc] antigen was observed in a stage-specific manner, and this transient expression is thought to be involved in germ cell tightness. Yes. Expression of le x antigen is found to be controlled also in the brain, it has been estimated to be important in the development of the central nervous system. In addition to the normal development process, Le a [Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAc
] And Le b [Fucα1-2Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAc] antigen expression levels are well known to correlate with cancer progression and malignancy. Furthermore, sialyl Le x antigen is acting as a selectin ligand controlling leukocyte rolling at sites of inflammation.
Le抗原は、動物における細胞間情報伝達に限らず、宿主と病原体との相互作用にも関
わっている。Helicobacter pyloriではリポ多糖(LPS)にLe抗
原が発現しており、このLe抗原はH.pyloriが宿主の上皮細胞に接着する際の足
場として働くことが知られている。さらに、H.pyloriのLPS上のLex抗原は
、宿主のDC−SIGN(樹状細胞特異的細胞間接着分子−3−グラビング非インテグリ
ン)を介して免疫応答を抑制する働きがあることが知られている。DC−SIGNは、マ
ンノースを含む複合糖質を認識するC型レクチンであり、通常は様々な病原菌を捕らえて
T細胞に病原菌の抗原を提示する役割を有するが、近年の研究によって、DC−SIGN
はLe抗原により高い親和性を示すことが示され、例えば、Lex抗原を有する糖タンパ
ク質やミルクオリゴ糖はヒト免疫不全ウイルスI型がDC−SIGNに結合するのを阻害
することが知られている。
The Le antigen is involved not only in cell-to-cell communication in animals but also in the interaction between a host and a pathogen. In Helicobacter pylori, Le antigen is expressed in lipopolysaccharide (LPS). It is known that pylori acts as a scaffold when adhering to host epithelial cells. In addition, H.C. Le x antigen on LPS of H. pylori, it is known that there are inhibiting serves the immune response through the host DC-SIGN (Dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing non-integrin). DC-SIGN is a C-type lectin that recognizes glycoconjugates including mannose, and usually has a role of capturing various pathogenic bacteria and presenting the antigens of pathogenic bacteria to T cells.
Has been shown to exhibit high affinity for Le antigens, e.g., glycoproteins or milk oligosaccharides with Le x antigen is known to inhibit the human immunodeficiency virus type I to bind to DC-SIGN Yes.
以上のことは、Le抗原を含むオリゴ糖が、糖鎖機能研究や医薬品応用に不可欠である
ことを示している。オリゴ糖を精密合成するには、グリコシド結合の位置および立体の正
確な制御が要求される。酵素合成法はアノマー(立体化学的)配置を完璧に制御する点で
、また、面倒な保護・脱保護を行わずに比較的高い位置特異性を有する点で、化学合成法
より優れていると考えられる。酵素合成では一般的にグリコシルトランスフェラーゼとグ
リコシダーゼを利用する(非特許文献1、2)。グリコシルトランスフェラーゼは、一般
に厳密な位置特異性および受容体特異性を示し、オリゴ糖の精密合成には優れた触媒であ
る。近年、H.pylori由来α−1,3−フコシルトランスフェラーゼを利用してL
exトリサッカライドを効率的に合成可能であることが報告された(非特許文献3)。し
かしながら、文献中にも記述されているように、グリコシルトランスフェラーゼの利用に
は高価な糖ヌクレオチドもしくは糖ヌクレオチド再生システムが必要であるため、大規模
オリゴ糖生産(高濃度オリゴ糖生産)への利用が難しい。一方で、グリコシダーゼの糖転
移活性を利用した合成は、反応の簡便性および多様性のため、現在まで効率的に利用され
てきている(非特許文献1、2)。特に10年ほど前に開発されたグリコシンターゼと呼
ばれる新しいタイプの酵素を利用した合成法は特筆すべきである(非特許文献4〜6)。
グリコシンターゼは、グリコシダーゼの加水分解活性を欠損させた変異体であるが、基質
として適切な糖供与体(フッ素のような脱離基を有する糖)を用いると糖転移反応を触媒
する。このように、グリコシダーゼおよびその変異体は、オリゴ糖を合成する際の有効な
手段となってきた(非特許文献2、7〜9)。しかしながら、グリコシダーゼが触媒する
糖転移反応は、一般的に位置選択性および受容体特異性がそれほど高くなく、反応産物は
様々な長さや様々な結合を持つオリゴ糖の混合物として得られてしまうため、精密合成と
いう点では克服すべき課題が残されていた。これらのことを考えると、グリコシド結合を
精密(立体・位置特異的)に合成するためには、グリコシド結合および脱離基(転移反応
の際に受容体となる)の両方に対して厳密な特異性を有するグリコシダーゼを見つけるこ
とが極めて重要であることとなる。
The above shows that oligosaccharides containing Le antigen are indispensable for sugar chain function research and pharmaceutical applications. Precise synthesis of oligosaccharides requires precise control of glycosidic bond position and stericity. The enzymatic synthesis method is superior to the chemical synthesis method in that it completely controls the anomeric (stereochemical) configuration and has a relatively high position specificity without troublesome protection and deprotection. Conceivable. Enzymatic synthesis generally uses glycosyltransferase and glycosidase (
It has been reported e x trisaccharide is efficiently synthesizable (Non-Patent Document 3). However, as described in the literature, the use of glycosyltransferases requires expensive sugar nucleotides or sugar nucleotide regeneration systems, so that they can be used for large-scale oligosaccharide production (high-concentration oligosaccharide production). difficult. On the other hand, synthesis utilizing glycosidase transglycosylation activity has been used efficiently to date due to the simplicity and diversity of the reaction (
Glycosynthase is a mutant lacking glycosidase hydrolysis activity, but catalyses the transglycosylation reaction when an appropriate sugar donor (a sugar having a leaving group such as fluorine) is used as a substrate. As described above, glycosidases and mutants thereof have become effective means for synthesizing oligosaccharides (Non-patent
以前の研究において、我々は、Bifidobacterium bifidum由来
の2種類のα−L−フコシダーゼを単離し、それらが厳密な基質特異性を有していること
を明らかにした。その1つは1,2−α−L−フコシダーゼ(BbAfcA)であり、複
合糖質糖鎖の非還元末端に存在するFucα1−2Gal結合を特異的に分解する(非特
許文献10〜12)。もう1つは、1,3−1,4−α−L−フコシダーゼ(BbAfc
B)で、LeaおよびLex抗原を含む様々な複合糖質糖鎖に存在するα−1,3/4−
フコシル結合に特異的に作用する(非特許文献13)。我々は、これら2種のα−L−フ
コシダーゼをオリゴ糖の精密酵素合成に利用することを試み、まず1,2−α−L−フコ
シダーゼ(BbAfcA)を1,2−α−L−フコシンターゼに変換することに成功し報
告した(非特許文献14)。この酵素は、供与体にβ−L−フコピラノシルフルオリド(
FucF)、受容体にラクトース(Lac)を用いて反応させると、2’−フコシルラク
トース(Fucα1−2Galβ1−4Glc,2’−FL)のみを特異的に合成し、副
産物は全く生じなかった。
In previous work we isolated two α-L-fucosidases from Bifidobacterium bifidum and revealed that they have strict substrate specificity. One of them is 1,2-α-L-fucosidase (BbAfcA), which specifically degrades the Fucα1-2Gal bond present at the non-reducing end of the glycoconjugate sugar chain (Non-Patent
B), α-1,3 / 4− present in various glycoconjugate sugar chains including Le a and Le x antigen
It specifically acts on fucosyl bonds (Non-patent Document 13). We tried to utilize these two kinds of α-L-fucosidase for the precision enzyme synthesis of oligosaccharide. First, 1,2-α-L-fucosidase (BbAfcA) was converted to 1,2-α-L-fucosidase. It was reported that the conversion was successful (Non-Patent Document 14). This enzyme uses β-L-fucopyranosyl fluoride (
When FucF) was reacted with lactose (Lac) as a receptor, only 2′-fucosyl lactose (Fucα1-2Galβ1-4Glc, 2′-FL) was specifically synthesized, and no by-product was produced.
本発明は、LeaおよびLex抗原を含む様々な糖鎖を特異的に製造可能な方法を開発
することを目的とする。
An object of the present invention is to develop a method capable of specifically producing various sugar chains including Le a and Le x antigens.
本発明者らは、オリゴ糖精密合成を目的としたグリコシンターゼ技術の可能性を広げる
ために、BbAfcBを1,3−1,4−α−L−フコシンターゼ化し、次に、その位置
特異性および受容体特異性について検討した。その結果、本酵素が、I型糖鎖(Galβ
1−3GlcNAc,lacto−N−biose I,LNB)にLea抗原決定基を
、またII型糖鎖(Galβ1−4GlcNAc,N−acetyllactosami
ne,LacNAc)にLex抗原決定基を導入するのに有効な手段となることなどを見
出し、本願発明を完成するに至った。
In order to expand the possibilities of glycosynthase technology aimed at oligosaccharide precision synthesis, the present inventors converted BbAfcB to 1,3-1,4-α-L-fucosynthase, and then its regiospecificity and The receptor specificity was examined. As a result, this enzyme was converted to type I sugar chain (Galβ
1-3GlcNAc, lacto-N-biose I , the Le a antigen determinants in LNB), also II type sugar chain (Galβ1-4GlcNAc, N-acetyllactosami
ne, it found such that an effective means to introduce the Le x epitope on LacNAc), and completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔1〕配列番号2で表されるアミノ酸配列における703位のアスパラギン酸がグリシンまたはセリンに置換されているアミノ酸配列に対して少なくとも90%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列(ただし、配列番号2で表されるアミノ酸配列における703位のアスパラギン酸のグリシンまたはセリンへの置換は維持されている)からなり、かつGal−Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入する活性を有する、タンパク質。
〔2〕Gal−Glcまたはその誘導体が、下記式(1a)または(1b):
R4、R5、R6およびR7は、各々独立して、置換されていてもよいC1〜C6炭化水素基、置換されていてもよいC3〜C11芳香族基、アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ(C1〜C6炭化水素)アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ(C3〜C11芳香族)アミノ基、置換されていてもよい(C1〜C6炭化水素)(C3〜C11芳香族)アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ(C1〜C6炭化水素−カルボニル)アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ(C3〜C11芳香族−カルボニル)アミノ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよい(C1〜C6炭化水素)オキシ基、置換されていてもよい(C3〜C11芳香族)オキシ基、またはハロゲン原子、あるいは1以上の糖残基を示す。)で表される糖化合物である、〔1〕のタンパク質。
〔3〕R1、R2およびR3が、各々独立して、C1〜C6アルキル基、(ヒドロキシ)C1〜C6アルキル基、アミノ基、(C1〜C6アルキル)アミノ基、(C1〜C6アルキル−カルボニル)アミノ基、ヒドロキシ基、(C1〜C6アルキル)オキシ基を示し、 R4、R5、R6およびR7が、各々独立して、C1〜C6アルキル基、(ヒドロキシ)C1〜C6アルキル基、アミノ基、(C1〜C6アルキル)アミノ基、(C1〜C6アルキル−カルボニル)アミノ基、ヒドロキシ基、(C1〜C6アルキル)オキシ基、または1以上の糖残基を示す、〔1〕または〔2〕のタンパク質。
〔4〕R4、R5、R6およびR7から選ばれる3つの基が、各々独立して、C1〜C6アルキル基、(ヒドロキシ)C1〜C6アルキル基、アミノ基、(C1〜C6アルキル)アミノ基、(C1〜C6アルキル−カルボニル)アミノ基、ヒドロキシ基、または(C1〜C6アルキル)オキシ基を示し、R4、R5、R6およびR7から選ばれる残りの1つの基が、1以上の糖残基を示す、〔3〕のタンパク質。
〔5〕前記活性が、Gal−Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入して、下記式(2a)または(2b):
で表される糖化合物を生成する活性である、〔2〕〜〔4〕のいずれかのタンパク質。
〔6〕前記活性が、ラクト−N−ビオースI〔Galβ1−3GlcNAc〕、またはラクト−N−ビオースI〔Galβ1−3GlcNAc〕を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスa抗原〔Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc〕、またはルイスa抗原〔Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc〕を非還元末端に有する糖鎖を生成する活性である、〔1〕のタンパク質。
〔7〕前記活性が、N−アセチルラクトサミン〔Galβ1−4GlcNAc〕、またはN−アセチルラクトサミン〔Galβ1−4GlcNAc〕を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスx抗原〔Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc〕、またはルイスx抗原〔Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc〕を非還元末端に有する糖鎖を生成する活性である、〔1〕のタンパク質。
〔8〕前記糖鎖が、二糖、三糖または四糖である、〔1〕〜〔7〕のいずれかのタンパク質。
〔9〕〔1〕〜〔8〕のいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔10〕〔9〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔11〕〔10〕の発現ベクターが導入された形質転換体。
〔12〕〔11〕の形質転換体を培地中で培養して、〔1〕〜〔8〕のいずれかのタンパク質を生成することを含む、タンパク質の製造方法。
〔13〕〔1〕〜〔8〕のいずれかのタンパク質の存在下において、Gal−Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入して、フコシル化されたGal−Glcまたはその誘導体を得ることを含む、フコシル化されたGal−Glcまたはその誘導体の製造方法。
〔14〕ラクト−N−ビオースI〔Galβ1−3GlcNAc〕、またはラクト−N−ビオースI〔Galβ1−3GlcNAc〕を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスa抗原〔Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc〕、またはルイスa抗原〔Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc〕を非還元末端に有する糖鎖を生成する方法である、〔13〕の方法。
〔15〕N−アセチルラクトサミン〔Galβ1−4GlcNAc〕、またはN−アセチルラクトサミン〔Galβ1−4GlcNAc〕を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスx抗原〔Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc〕、またはルイスx抗原〔Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc〕を非還元末端に有する糖鎖を生成する方法である、〔13〕の方法。
That is, the present invention is as follows.
[1] An amino acid sequence having at least 90 % or more amino acid sequence identity to an amino acid sequence in which the aspartic acid at position 703 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is substituted with glycine or serine (however, SEQ ID NO: And the glycine or serine substitution of aspartic acid at position 703 in the amino acid sequence represented by 2 is maintained, and the protein has an activity of introducing a fucosyl group into Gal-Glc or a derivative thereof.
[2] Gal-Glc or a derivative thereof is represented by the following formula (1a) or (1b):
R 4 , R 5 , R 6 and R 7 are each independently an optionally substituted C 1 -C 6 hydrocarbon group, an optionally substituted C 3 -C 11 aromatic group, an amino group , An optionally substituted mono or di (C 1 -C 6 hydrocarbon) amino group, an optionally substituted mono or di (C 3 -C 11 aromatic) amino group, optionally substituted ( C 1 -C 6 hydrocarbon) (C 3 -C 11 aromatic) amino group, optionally substituted mono or di (C 1 -C 6 hydrocarbon-carbonyl) amino group, optionally substituted mono or
[3] R 1 , R 2 and R 3 are each independently a C 1 -C 6 alkyl group, a (hydroxy) C 1 -C 6 alkyl group, an amino group, or a (C 1 -C 6 alkyl) amino group , (C 1 -C 6 alkyl-carbonyl) amino group, hydroxy group, (C 1 -C 6 alkyl) oxy group, and R 4 , R 5 , R 6 and R 7 are each independently C 1 -C 6 alkyl group, (hydroxy) C 1 -C 6 alkyl group, an amino group, (C 1 -C 6 alkyl) amino group, (C 1 -C 6 alkyl - carbonyl) amino group, hydroxy group, (C 1 -C 6 alkyl) or an oxy group or one or more sugar residues, a protein of [1] or [2].
[4] Three groups selected from R 4 , R 5 , R 6 and R 7 are each independently a C 1 -C 6 alkyl group, a (hydroxy) C 1 -C 6 alkyl group, an amino group, ( C 1 -C 6 alkyl) amino group, (C 1 -C 6 alkyl-carbonyl) amino group, hydroxy group, or (C 1 -C 6 alkyl) oxy group, R 4 , R 5 , R 6 and R The protein according to [3], wherein the remaining one group selected from 7 represents one or more sugar residues.
[5] The above activity is obtained by introducing a fucosyl group into Gal-Glc or a derivative thereof, and represented by the following formula (2a) or (2b):
The protein according to any one of [2] to [4], which has an activity to produce a sugar compound represented by:
[6] The above activity is achieved by introducing a fucosyl group into a sugar chain having lacto-N-biose I [Galβ1-3GlcNAc] or lacto-N-biose I [Galβ1-3GlcNAc] at the non-reducing end, and Lewis a The protein according to [1], which has an activity of generating a sugar chain having an antigen [Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAc] or a Lewis a antigen [Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAc] at a non-reducing end.
[7] The activity is determined by introducing a fucosyl group into a sugar chain having N-acetyllactosamine [Galβ1-4GlcNAc] or N-acetyllactosamine [Galβ1-4GlcNAc] at the non-reducing end, and Lewis x antigen [ Galβ1-4 (Fucα1-3) GlcNAc] or Lewis x antigen [Galβ1-4 (Fucα1-3) GlcNAc] is an activity that produces a sugar chain having a non-reducing end at [1].
[8] The protein according to any one of [1] to [7], wherein the sugar chain is a disaccharide, a trisaccharide or a tetrasaccharide.
[9] A polynucleotide encoding the protein of any one of [1] to [8].
[10] An expression vector comprising the polynucleotide of [9].
[11] A transformant introduced with the expression vector of [10].
[12] A method for producing a protein, comprising culturing the transformant of [11] in a medium to produce the protein of any one of [1] to [8].
[13] Introducing a fucosyl group into Gal-Glc or a derivative thereof in the presence of the protein of any one of [1] to [8] to obtain a fucosylated Gal-Glc or a derivative thereof, A method for producing fucosylated Gal-Glc or a derivative thereof.
[14] A fucosyl group is introduced into a sugar chain having lacto-N-biose I [Galβ1-3GlcNAc] or lacto-N-biose I [Galβ1-3GlcNAc] at the non-reducing end, and Lewis a antigen [Galβ1- 3 (Fucα1-4) GlcNAc] or Lewis a antigen [Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAc] is produced by producing a sugar chain at the non-reducing end.
[15] A fucosyl group is introduced into a sugar chain having N-acetyllactosamine [Galβ1-4GlcNAc] or N-acetyllactosamine [Galβ1-4GlcNAc] at the non-reducing end, and Lewis x antigen [Galβ1-4 ( Fucα1-3) GlcNAc] or Lewis x antigen [Galβ1-4 (Fucα1-3) GlcNAc] is a method for producing a sugar chain at the non-reducing end.
本発明によれば、LeaおよびLex抗原を含む様々な糖鎖を特異的に製造することが
できる。
According to the present invention, various sugar chains containing Le a and Le x antigens can be specifically produced.
本発明は、Gal−Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入する活性を有するタン
パク質を提供する。
The present invention provides a protein having an activity of introducing a fucosyl group into Gal-Glc or a derivative thereof.
本発明のタンパク質は、配列番号2で表されるアミノ酸配列における703位のアスパラギン酸がグリシンまたはセリンに置換されているアミノ酸配列に対して少なくとも80%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる(ただし、配列番号2で表されるアミノ酸配列における703位のアスパラギン酸のグリシンまたはセリンへの置換は維持されている)。アミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、最も好ましくは96%以上、97%以上、98%以上または99%以上であってもよい。 The protein of the present invention comprises an amino acid sequence having at least 80% or more amino acid sequence identity to the amino acid sequence in which the aspartic acid at position 703 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is substituted with glycine or serine (However, the substitution of aspartic acid at position 703 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 with glycine or serine is maintained). The percent amino acid sequence identity is preferably 85% or higher, more preferably 90% or higher, even more preferably 95% or higher, most preferably 96% or higher, 97% or higher, 98% or higher, or 99% or higher. Also good.
一実施形態では、本発明のタンパク質は、配列番号2で表されるアミノ酸配列における703位のアスパラギン酸がグリシンまたはセリンに置換されているアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基の変異(例、欠失、置換、付加および挿入)を含むアミノ酸配列からなるものであってもよい(ただし、配列番号2で表されるアミノ酸配列における703位のアスパラギン酸のグリシンまたはセリンへの置換は維持されている)。1または数個のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の1つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。アミノ酸残基の変異に関する用語「1または数個」が示す数は、例えば、1〜290個、好ましくは1〜250個、より好ましくは1〜200個、1〜150個または1〜100個、さらにより好ましくは1〜50個、1〜30個、1〜20個または1〜10個、特に好ましくは1、2、3、4または5個である。 In one embodiment, the protein of the present invention is a mutation of one or several amino acid residues in an amino acid sequence in which the aspartic acid at position 703 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is substituted with glycine or serine ( It may consist of an amino acid sequence including examples, deletions, substitutions, additions and insertions (however, substitution of glycine or serine with aspartic acid at position 703 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is maintained) Have been). The mutation of one or several amino acid residues may be introduced into one region in the amino acid sequence, but may be introduced into a plurality of different regions. The number “1 or several” related to amino acid residue mutations is, for example, 1 to 290, preferably 1 to 250, more preferably 1 to 200, 1 to 150, or 1 to 100, Even more preferably 1-50, 1-30, 1-20 or 1-10, particularly preferably 1, 2, 3, 4 or 5.
アミノ酸配列において変異を導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に明らか
であるが、配列アライメントを参考にして、変異体を作製してもよい。具体的には、当業
者は、1)複数のホモログのアミノ酸配列(例、配列番号2で表されるアミノ酸配列、お
よび他のホモログのアミノ酸配列)を比較し、2)相対的に保存されている領域、および
相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、3)相対的に保存されている領域
および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領
域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を
認識できる(図1)。
The positions of amino acid residues that may be introduced with mutations in the amino acid sequence will be apparent to those skilled in the art, but variants may be created with reference to sequence alignment. Specifically, a person skilled in the art compares 1) the amino acid sequences of a plurality of homologs (eg, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequences of other homologs), and 2) is relatively conserved. Region, and relatively unconserved region, and then 3) regions that can play an important role in function from the relatively conserved region and the relatively unconserved region, respectively And because it is possible to predict areas that cannot play an important role in function, the correlation between structure and function can be recognized (FIG. 1).
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であっ
てもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基
を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ
酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては
、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有
するアミノ酸(例、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電性極性側鎖を有するアミノ
酸(例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非
極性側鎖を有するアミノ酸(例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン
、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β位分岐側鎖を有する
アミノ酸(例、スレオニン、バリン、イソロイシン)、芳香族側鎖を有するアミノ酸(例
、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)、ヒドロキシル基(例、
アルコール性、フェノール性)含有側鎖を有するアミノ酸(例、セリン、スレオニン、チ
ロシン)、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸(例、システイン、メチオニン)が挙げ
られる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間で
の置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルア
ラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイ
シンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよ
い。
When an amino acid residue is mutated by substitution, the amino acid residue substitution may be a conservative substitution. As used herein, the term “conservative substitution” refers to the replacement of a given amino acid residue with an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues with similar side chains are well known in the art. For example, such families include amino acids having basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), amino acids having acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), amino acids having uncharged polar side chains (Eg, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), amino acids with non-polar side chains (eg, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), β-branched side chain Amino acids (eg, threonine, valine, isoleucine), amino acids having aromatic side chains (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine), hydroxyl groups (eg,
Examples include amino acids having alcoholic and phenolic side chains (eg, serine, threonine, tyrosine), and amino acids having sulfur-containing side chains (eg, cysteine, methionine). Preferably, the conservative substitution of amino acids is a substitution between aspartic acid and glutamic acid, a substitution between arginine and lysine and histidine, a substitution between tryptophan and phenylalanine, and between phenylalanine and valine. Or a substitution between leucine, isoleucine and alanine, and a substitution between glycine and alanine.
別の実施形態では、本発明のタンパク質は、配列番号1で表されるヌクレオチド配列に
対して相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドによりコードされるものであってもよい(ただし、配列番号1で表されるヌ
クレオチド配列における2107〜2109位のヌクレオチド残基は、グリシンまたはセ
リンをコードするように置換されている)。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる
特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。
このような条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、同一性が高いポ
リヌクレオチド同士、例えば80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%
以上、さらにより好ましくは95%以上、最も好ましくは96%以上、97%以上、98
%以上または99%以上の同一性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、そ
れより低い同一性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体
的には、このような条件としては、6×SSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)
中、約45℃でのハイブリダイゼーション、続いて、0.2×SSC、0.1%SDS中
、50〜65℃での1または2回以上の洗浄が挙げられる。
In another embodiment, the protein of the present invention may be encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. However, the nucleotide residues at positions 2107 to 2109 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 are substituted to encode glycine or serine. “Stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
Although it is difficult to quantify such conditions clearly, for example, polynucleotides having high identity, for example, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90%
More preferably 95% or more, most preferably 96% or more, 97% or more, 98
This is a condition in which polynucleotides having% or more or 99% or more identity hybridize and polynucleotides having lower identity do not hybridize. Specifically, such conditions include 6 × SSC (sodium chloride / sodium citrate)
Medium hybridization at about 45 ° C. followed by one or more washes in 0.2 × SSC, 0.1% SDS at 50-65 ° C.
アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性(例、同一性または類似性)は、例えば
KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLAST(Pro.Natl
.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))、PearsonによるF
ASTA(MethodsEnzymol.,183,63(1990))を用いて決定
することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTP、BLAST
Nとよばれるプログラムが開発されているので(http://www.ncbi.nl
m.nih.gov参照)、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配
列およびヌクレオチド配列の相同性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の相同性とし
ては、例えば、Lipman−Pearson法を採用している株式会社ゼネティックス
のソフトウェアGENETYX Ver7.0.9を使用し、ORFにコードされるポリ
ペプチド部分全長を用いて、Unit Size to Compare=2の設定でS
imilarityをpercentage計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ
酸配列およびヌクレオチド配列の相同性として、これらの計算で導き出される値のうち、
最も低い値を採用してもよい。
Amino acid and nucleotide sequence homologies (eg, identity or similarity) can be determined using, for example, the algorithm BLAST (Pro. Natl by Karlin and Altschul).
. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)), F by Pearson.
It can be determined using ASTA (Methods Enzymol., 183, 63 (1990)). Based on this algorithm BLAST, BLASTP, BLAST
Since a program called N has been developed (http://www.ncbi.nl
m. nih. (See gov), these programs may be used with default settings to calculate amino acid and nucleotide sequence homology. As the homology of amino acid sequences, for example, using GENETYX Ver 7.0.9 of GENETICS, which employs the Lipman-Pearson method, the full length of the polypeptide part encoded by ORF is used. Set to Compare = 2 to set S
You may use the numerical value at the time of carrying out percentage calculation of immigration. Among the values derived from these calculations as homology of amino acid sequence and nucleotide sequence,
The lowest value may be adopted.
配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質が由来し得る微生物としては、
特に限定されないが、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobac
terium bifidum)等のビフィドバクテリウム(Bifidobacter
ium)属に属する細菌が挙げられる。
As a microorganism from which the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be derived,
Although not particularly limited, for example, Bifidobacterium Bifidobac
terium bifidum) and other Bifidobacterium
ium).
本発明のタンパク質は、Gal−Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入する活性
を有し、それにより、フコシル化されたGal−Glcまたはその誘導体を生成する。G
alは、ガラクトースを示し、Glcはグルコースを示し、Gal−Glcは、ガラクト
ースおよびグルコースからなる二糖を示す。Gal−Glcまたはその誘導体の糖間の結
合としては、Gal−Glcまたはその誘導体に対してフコシル基を導入する活性を保持
し得るものである限り特に限定されないが、例えば、β−1,3−結合、およびβ−1,
4−結合が挙げられる。好ましくは、上記活性は、Gal−Glcまたはその誘導体にフ
コシル基を導入して、Gal−GlcにおけるGlc部分またはGal−Glcの誘導体
におけるGlc対応部分と、α−1,3−フコシル結合またはα−1,4−フコシル結合
を生成する活性である。
The protein of the present invention has the activity of introducing a fucosyl group into Gal-Glc or a derivative thereof, thereby producing fucosylated Gal-Glc or a derivative thereof. G
al represents galactose, Glc represents glucose, and Gal-Glc represents a disaccharide composed of galactose and glucose. The linkage between saccharides of Gal-Glc or a derivative thereof is not particularly limited as long as it can retain the activity of introducing a fucosyl group to Gal-Glc or a derivative thereof. For example, β-1,3- Binding, and β-1,
4-bond is mentioned. Preferably, the above activity is achieved by introducing a fucosyl group into Gal-Glc or a derivative thereof to form a Glc moiety in Gal-Glc or a Glc-corresponding moiety in a derivative of Gal-Glc and an α-1,3-fucosyl bond or α- It is an activity that forms a 1,4-fucosyl bond.
Gal−Glcの誘導体としては、Gal−Glc中のGal部分および/またはGl
c部分が修飾された誘導体、ならびにGal−Glcまたはその誘導体を、糖鎖の非還元
末端に有する糖化合物が挙げられる。糖化合物を構成する糖残基の個数は、Gal−Gl
cに起因する糖残基の個数(2個)を、後述する糖残基の個数に加算した数である。
The derivative of Gal-Glc includes a Gal moiety in Gal-Glc and / or Gl.
Examples include derivatives in which the c moiety is modified, and sugar compounds having Gal-Glc or a derivative thereof at the non-reducing end of the sugar chain. The number of sugar residues constituting the sugar compound is Gal-Gl.
This is the number obtained by adding the number of sugar residues (2) resulting from c to the number of sugar residues described below.
より具体的には、Gal−Glcの誘導体としては、以下が挙げられる:
(1)Gal−GlcにおけるGlc部分の1以上のヒドロキシ基が、置換されていても
よいC1〜C6炭化水素基、置換されていてもよいC3〜C11芳香族基、アミノ基(−
NH3)、置換されていてもよいモノまたはジ(C1〜C6炭化水素)アミノ基、置換さ
れていてもよいモノまたはジ(C3〜C11芳香族)アミノ基、置換されていてもよい(
C1〜C6炭化水素)(C3〜C11芳香族)アミノ基、置換されていてもよいモノまた
はジ(C1〜C6炭化水素−カルボニル)アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ
(C3〜C11芳香族−カルボニル)アミノ基、ヒドロキシ基(−OH)、置換されてい
てもよい(C1〜C6炭化水素)オキシ基、置換されていてもよい(C3〜C11芳香族
)オキシ基、またはハロゲン原子で置換された化合物;
(2)Gal−GlcにおけるGal部分のヒドロキシ基が、置換されていてもよいC1
〜C6炭化水素基、置換されていてもよいC3〜C11芳香族基、アミノ基、置換されて
いてもよいモノまたはジ(C1〜C6炭化水素)アミノ基、置換されていてもよいモノま
たはジ(C3〜C11芳香族)アミノ基、置換されていてもよい(C1〜C6炭化水素)
(C3〜C11芳香族)アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ(C1〜C6炭化
水素−カルボニル)アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ(C3〜C11芳香族
−カルボニル)アミノ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよい(C1〜C6炭化水素)
オキシ基、置換されていてもよい(C3〜C11芳香族)オキシ基、またはハロゲン原子
、あるいは1以上の糖残基で置換された化合物;ならびに
(3)上記(1)および(2)で示された置換が組み合わされた化合物。
More specifically, Gal-Glc derivatives include the following:
(1) One or more hydroxy groups of the Glc moiety in Gal-Glc may be substituted C 1 to C 6 hydrocarbon groups, optionally substituted C 3 to C 11 aromatic groups, amino groups ( −
NH 3 ), optionally substituted mono or di (C 1 -C 6 hydrocarbon) amino group, optionally substituted mono or di (C 3 -C 11 aromatic) amino group, substituted Good (
C 1 -C 6 hydrocarbon) (C 3 -C 11 aromatic) amino group, optionally substituted mono or di (C 1 -C 6 hydrocarbon-carbonyl) amino group, optionally substituted mono Or a di (C 3 -C 11 aromatic-carbonyl) amino group, a hydroxy group (—OH), an optionally substituted (C 1 -C 6 hydrocarbon) oxy group, an optionally substituted (C 3 -C 11 aromatic) group or compounds substituted with a halogen atom;
(2) The hydroxy group of the Gal moiety in Gal-Glc may be substituted C 1
-C 6 hydrocarbon group, optionally substituted C 3 -C 11 aromatic group, amino group, optionally substituted mono- or di (C 1 -C 6 hydrocarbon) amino group, substituted which may mono- or
(C 3 -C 11 aromatic) amino group, optionally substituted mono or di (C 1 -C 6 hydrocarbon-carbonyl) amino group, optionally substituted mono or di (C 3 -C 11) Aromatic-carbonyl) amino group, hydroxy group, optionally substituted (C 1 -C 6 hydrocarbon)
Oxy group, an optionally substituted (C 3 -C 11 aromatic) group or a halogen atom, or compounds substituted with one or more sugar residues,; and (3) above (1) and (2) A compound in which the substitution represented by is combined.
好ましい実施形態では、Gal−Glcまたはその誘導体は、下記式(1a)または(
1b):
水素基、置換されていてもよいC3〜C11芳香族基、アミノ基、置換されていてもよい
モノまたはジ(C1〜C6炭化水素)アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ(C
3〜C11芳香族)アミノ基、置換されていてもよい(C1〜C6炭化水素)(C3〜C
11芳香族)アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ(C1〜C6炭化水素−カル
ボニル)アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ(C3〜C11芳香族−カルボニ
ル)アミノ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよい(C1〜C6炭化水素)オキシ基、
置換されていてもよい(C3〜C11芳香族)オキシ基、またはハロゲン原子を示し、
R4、R5、R6およびR7は、各々独立して、置換されていてもよいC1〜C6炭化
水素基、置換されていてもよいC3〜C11芳香族基、アミノ基、置換されていてもよい
モノまたはジ(C1〜C6炭化水素)アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ(C
3〜C11芳香族)アミノ基、置換されていてもよい(C1〜C6炭化水素)(C3〜C
11芳香族)アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ(C1〜C6炭化水素−カル
ボニル)アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ(C3〜C11芳香族−カルボニ
ル)アミノ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよい(C1〜C6炭化水素)オキシ基、
置換されていてもよい(C3〜C11芳香族)オキシ基、またはハロゲン原子、あるいは
1以上の糖残基を示す。)で表される糖化合物であってもよい。
In a preferred embodiment, Gal-Glc or a derivative thereof has the following formula (1a) or (
1b):
3 to C 11 aromatic) amino group, optionally substituted (C 1 to C 6 hydrocarbon) (C 3 to C
11 aromatic) amino group, optionally substituted mono or di (C 1 -C 6 hydrocarbon-carbonyl) amino group, optionally substituted mono or di (C 3 -C 11 aromatic-carbonyl) amino group, hydroxy group, an optionally substituted (C 1 -C 6 hydrocarbon) group,
An optionally substituted (C 3 -C 11 aromatic) oxy group, or a halogen atom;
R 4 , R 5 , R 6 and R 7 are each independently an optionally substituted C 1 -C 6 hydrocarbon group, an optionally substituted C 3 -C 11 aromatic group, an amino group An optionally substituted mono or di (C 1 -C 6 hydrocarbon) amino group, an optionally substituted mono or di (C
3 to C 11 aromatic) amino group, optionally substituted (C 1 to C 6 hydrocarbon) (C 3 to C
11 aromatic) amino group, optionally substituted mono or di (C 1 -C 6 hydrocarbon-carbonyl) amino group, optionally substituted mono or di (C 3 -C 11 aromatic-carbonyl) amino group, hydroxy group, an optionally substituted (C 1 -C 6 hydrocarbon) group,
An optionally substituted (C 3 to C 11 aromatic) oxy group, a halogen atom, or one or more sugar residues. ) May be used.
したがって、Gal−Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入する活性は、上記の
Gal−Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入して、下記式(2a)または(2b
):
は、フコシル基を示す。)
で表される糖化合物を生成する活性であってもよい。
Therefore, the activity of introducing a fucosyl group into Gal-Glc or a derivative thereof can be achieved by introducing a fucosyl group into the above-described Gal-Glc or a derivative thereof.
):
Represents a fucosyl group. )
The activity which produces | generates the sugar compound represented by these may be sufficient.
C1〜C6炭化水素基は、直鎖または分岐鎖、あるいは環状の炭素原子数1〜6個の炭
化水素基を示す。C1−6炭化水素基としては、例えば、C1〜C6アルキル基(例、メ
チル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、ter
t−ブチル、ペンチル、ヘキシル)、C2〜C6アルケニル基(例、ビニル、アリル)、
C2〜C6アルキニル基(例、エチニル、プロパルギル)、C3〜C6シクロアルキル基
(例、シクロプロピル、シクロブチル)が挙げられる。C1〜C6炭化水素基は、好まし
くは、C1〜C6アルキル基である。また、C1〜C6炭化水素基は、上述したように置
換されていてもよいが、置換されていてもよいC1〜C6炭化水素基としては、ヒドロキ
シ基で置換されたC1〜C6炭化水素基が好ましく、ヒドロキシ基で置換されたC1〜C
6アルキル基である(ヒドロキシ)C1〜C6アルキル基がより好ましい。
C 1 -C 6 hydrocarbon group refers to a straight or branched chain or cyclic 1-6 carbon atoms in the hydrocarbon group. Examples of the C 1-6 hydrocarbon group include a C 1 to C 6 alkyl group (eg, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, ter
t- butyl, pentyl, hexyl), C 2 -C 6 alkenyl group (e.g., vinyl, allyl),
C 2 -C 6 alkynyl group (eg, ethynyl, propargyl), C 3 -C 6 cycloalkyl group (eg, cyclopropyl, cyclobutyl) can be mentioned. The C 1 -C 6 hydrocarbon group is preferably a C 1 -C 6 alkyl group. Also, C 1 -C 6 hydrocarbon group may be substituted as described above, the substituted C 1 optionally -C 6 hydrocarbon group, C 1 ~ substituted with a hydroxy group C 6 hydrocarbon group is preferred, C 1 -C substituted with hydroxy group
An alkyl group (hydroxy) C 1 -C 6 alkyl group is more preferable.
C3〜C11芳香族基は、炭素原子数3〜11個の芳香族基を示す。C3〜C11芳香
族基としては、例えば、C6〜C10アリール基(例、フェニル、1−ナフチル、2−ナ
フチル)またはC3〜C11芳香族複素環基が挙げられる。C3〜C11芳香族基は、好
ましくは、C6〜C10アリール基である。
C 3 -C 11 aromatic group, an aromatic group having 3 to 11 carbon atoms. Examples of the C 3 to C 11 aromatic group include a C 6 to C 10 aryl group (eg, phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl) or a C 3 to C 11 aromatic heterocyclic group. C 3 -C 11 aromatic group, preferably a
C3〜C11芳香族複素環基は、3〜11個の炭素原子および少なくとも1個のヘテロ
原子を含む単環式芳香族複素環基または縮合芳香族複素環基であり得る。このような単環
式芳香族複素環基は、環構成原子として炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子および窒素原
子(好ましくは、窒素原子)から選ばれるヘテロ原子を1ないし4個含有する4ないし7
員(好ましくは、5または6員)の基であり得る。このような縮合芳香族複素環基は、上
記の単環式芳香族複素環基(好ましくは、環構成原子として窒素原子を含有する基)に対
応する環と、1または2個の窒素原子を含む5または6員の芳香族複素環(例、ピロール
、イミダゾール、ピラゾール、ピラジン、ピリジン、ピリミジン)、1個の硫黄原子を含
む5員の芳香族複素環(例、チオフェン)およびベンゼン環から選ばれる1または2個の
環とが縮合した環から誘導される基であり得る。
C 3 -C 11 aromatic heterocyclic group may be monocyclic aromatic heterocyclic group or fused aromatic heterocyclic group containing 3 to 11 carbon atoms and at least one heteroatom. Such monocyclic aromatic heterocyclic groups contain 1 to 4 heteroatoms selected from oxygen atoms, sulfur atoms and nitrogen atoms (preferably nitrogen atoms) in addition to carbon atoms as ring constituent atoms. 7
It can be a membered (preferably 5 or 6 membered) group. Such a fused aromatic heterocyclic group includes a ring corresponding to the above monocyclic aromatic heterocyclic group (preferably a group containing a nitrogen atom as a ring constituent atom), and one or two nitrogen atoms. 5 or 6 membered aromatic heterocycle containing (eg, pyrrole, imidazole, pyrazole, pyrazine, pyridine, pyrimidine), 5 membered aromatic heterocycle containing 1 sulfur atom (eg, thiophene) and benzene ring It may be a group derived from a ring condensed with 1 or 2 rings.
上記の単環式芳香族複素環基としては、例えば、フリル、チエニル、ピリジル、ピリミ
ジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル
、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリ
ル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニルが挙げられる。
Examples of the monocyclic aromatic heterocyclic group include furyl, thienyl, pyridyl, pyrimidinyl, pyridazinyl, pyrazinyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, oxadiazolyl, thiadiazolyl, triazolyl, tetrazolyl, triazinyl Is mentioned.
上記の縮合芳香族複素環基としては、例えば、キノリル、イソキノリル、キナゾリル、
キノキサリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンズオキサゾリル、ベンズイソオキサ
ゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、インドリル(例
、インドール−1−イル、インドール−2−イル、インドール−3−イル、インドール−
5−イル)、インダゾリル、ピロロピラジニル、イミダゾピリジニル、イミダゾピラジニ
ル、ピラゾロピリジニル、ピラゾロチエニル、ピラゾロトリアジニルが挙げられる。
Examples of the fused aromatic heterocyclic group include quinolyl, isoquinolyl, quinazolyl,
Quinoxalyl, benzofuryl, benzothienyl, benzoxazolyl, benzisoxazolyl, benzothiazolyl, benzimidazolyl, benzotriazolyl, indolyl (eg, indol-1-yl, indol-2-yl, indol-3-yl, Indole
5-yl), indazolyl, pyrrolopyrazinyl, imidazopyridinyl, imidazopyrazinyl, pyrazolopyridinyl, pyrazolothienyl, pyrazolotriazinyl.
モノまたはジ(C1〜C6炭化水素)アミノ基は、上記のC1〜C6炭化水素基でモノ
置換またはジ置換されたアミノ基を示す。モノまたはジ(C1〜C6炭化水素)アミノ基
は、好ましくは、モノまたはジ(C1〜C6アルキル)アミノ基であり、より好ましくは
、(C1〜C6アルキル)アミノ基である。
The mono- or di (C 1 -C 6 hydrocarbon) amino group represents an amino group that is mono-substituted or di-substituted with the above-mentioned C 1 -C 6 hydrocarbon group. The mono or di (C 1 -C 6 hydrocarbon) amino group is preferably a mono or di (C 1 -C 6 alkyl) amino group, more preferably a (C 1 -C 6 alkyl) amino group. is there.
モノまたはジ(C3〜C11芳香族)アミノ基は、上記のC3〜C11芳香族基でモノ
置換またはジ置換されたアミノ基を示す。モノまたはジ(C3〜C11芳香族)アミノ基
は、好ましくは、モノまたはジ(C3〜C11芳香族)アミノ基であり、より好ましくは
、(C6〜C10アリール)アミノ基である。
Mono- or
(C1〜C6炭化水素)(C3〜C11芳香族)アミノ基は、上記のC1〜C6炭化水
素基および上記のC3〜C11芳香族基で置換されたアミノ基を示す。
(C 1 -C 6 hydrocarbon) (C 3 -C 11 aromatic) amino group is an amino group substituted with the above C 1 -C 6 hydrocarbon group and the above C 3 -C 11 aromatic group. Show.
モノまたはジ(C1〜C6炭化水素−カルボニル)アミノ基は、C1〜C6炭化水素−
カルボニルでモノ置換またはジ置換されたアミノ基を示す。C1〜C6炭化水素−カルボ
ニルにおけるC1〜C6炭化水素部分は、上記のC1〜C6炭化水素基と同様である。モ
ノまたはジ(C1〜C6炭化水素−カルボニル)アミノ基は、好ましくは、モノまたはジ
(C1〜C6アルキル−カルボニル)アミノ基であり、より好ましくは、(C1〜C6ア
ルキル−カルボニル)アミノ基である。C1〜C6アルキル−カルボニルにおけるC1〜
C6アルキル部分は、上記のC1〜C6アルキル基と同様である。
The mono or di (C 1 -C 6 hydrocarbon-carbonyl) amino group is a C 1 -C 6 hydrocarbon-
An amino group mono- or di-substituted with carbonyl is shown. C 1 -C 6 hydrocarbon - C 1 -C 6 hydrocarbon moiety in the carbonyl is the same as C 1 -C 6 hydrocarbon group described above. The mono or di (C 1 -C 6 hydrocarbon-carbonyl) amino group is preferably a mono or di (C 1 -C 6 alkyl-carbonyl) amino group, more preferably (C 1 -C 6 alkyl). -Carbonyl) amino group. C 1 -C 6 alkyl - C 1 ~ in the carbonylation
The C 6 alkyl moiety is the same as the C 1 -C 6 alkyl group described above.
モノまたはジ(C3〜C11芳香族−カルボニル)アミノ基は、C3〜C11芳香族−
カルボニルでモノ置換またはジ置換されたアミノ基を示す。C3〜C11芳香族−カルボ
ニルにおけるC3〜C11芳香族部分は、上記のC3〜C11芳香族基と同様である。モ
ノまたはジ(C3〜C11芳香族−カルボニル)アミノ基は、好ましくは、モノまたはジ
(C6〜C10アリール−カルボニル)アミノ基であり、より好ましくは、(C6〜C1
0アリール−カルボニル)アミノ基である。C6〜C10アリール−カルボニルにおける
C6〜C10アリール部分は、上記のC6〜C10アリール基と同様である。
Mono- or
An amino group mono- or di-substituted with carbonyl is shown. The C 3 to C 11 aromatic moiety in the C 3 to C 11 aromatic-carbonyl is the same as the above C 3 to C 11 aromatic group. The mono or di (C 3 -C 11 aromatic-carbonyl) amino group is preferably a mono or di (C 6 -C 10 aryl-carbonyl) amino group, more preferably (C 6 -C 1
0 aryl-carbonyl) amino group. The C 6 -C 10 aryl moiety in C 6 -C 10 aryl-carbonyl is the same as the above C 6 -C 10 aryl group.
(C1〜C6炭化水素)オキシ基は、上記のC1〜C6炭化水素基で置換されたヒドロ
キシ基(−O−R)を示す。(C1〜C6炭化水素)オキシ基は、好ましくは、(C1〜
C6アルキル)オキシ基である。(C1〜C6アルキル)オキシ基におけるC1〜C6ア
ルキル部分は、上記のC1〜C6アルキル基と同様である。
The (C 1 -C 6 hydrocarbon) oxy group represents a hydroxy group (—O—R) substituted with the above C 1 -C 6 hydrocarbon group. The (C 1 -C 6 hydrocarbon) oxy group is preferably (C 1-
C 6 alkyl) oxy group. C 1 -C 6 alkyl moieties of the (C 1 -C 6 alkyl) group is the same as C 1 -C 6 alkyl group described above.
(C3〜C11芳香族)オキシ基は、上記のC3〜C11芳香族で置換されたヒドロキ
シ基(−O−R’)を示す。(C3〜C11芳香族)オキシ基は、好ましくは、(C6〜
C10アリール)オキシ基である。(C6〜C10アリール)オキシ基におけるC6〜C
10アリール部分は、上記のC6〜C10アリール基と同様である。
The (C 3 -C 11 aromatic) oxy group represents a hydroxy group (—O—R ′) substituted with the above C 3 -C 11 aromatic. The (C 3 -C 11 aromatic) oxy group is preferably (C 6-
Is a C 10 aryl) oxy group. C 6 in (C 6 -C 10 aryl) oxy group -C
The 10 aryl moiety is the same as the C 6 -C 10 aryl group described above.
ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子が挙げられ
る。
Examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
置換されていてもよい上記の基における「置換基」としては、例えば、ヒドロキシ基、
ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、スルホニル基、ホルミル基、アミノ基およびカルボ
キシル基、ならびに上述したようなC1〜C6炭化水素基、C3〜C11芳香族基、C3
〜C11芳香族複素環基、モノまたはジ(C1〜C6炭化水素)アミノ基、モノまたはジ
(C3〜C11芳香族)アミノ基、(C1〜C6炭化水素)(C3〜C11芳香族)アミ
ノ基、モノまたはジ(C1〜C6炭化水素−カルボニル)アミノ基、モノまたはジ(C3
〜C11芳香族−カルボニル)アミノ基、(C1〜C6炭化水素)オキシ基、および(C
3〜C11芳香族)オキシ基が挙げられる。置換基の個数は、1〜3個であり、好ましく
は、1個または2個である。置換基が2個または3個である場合、各置換基は同一でも異
なっていてもよい。
Examples of the “substituent” in the above-described optionally substituted group include a hydroxy group,
Halogen atoms, nitro groups, cyano groups, sulfonyl groups, formyl groups, amino groups and carboxyl groups, and C 1 -C 6 hydrocarbon groups, C 3 -C 11 aromatic groups, C 3 as described above.
-C 11 aromatic heterocyclic group, mono- or di (C 1 -C 6 hydrocarbon) amino group, mono- or
-C 11 aromatic - carbonyl) amino group, (C 1 -C 6 hydrocarbon) group, and (C
3 -C 11 aromatic), and the group. The number of substituents is 1 to 3, preferably 1 or 2. When there are 2 or 3 substituents, each substituent may be the same or different.
R3、R4、R5およびR6についての糖残基としては、ペントース、ヘキソース、ヘ
プトースが挙げられる。糖残基は、アルドースまたはケトースであり得る。具体的には、
糖残基としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、N−アセチル−グルコサミン
、N−アセチル−ガラクトサミン、フコース、キシロース、シアル酸が挙げられる。糖残
基は、α体またはβ体であり得る。糖残基はまた、D体またはL体であり得る。糖残基の
個数が2個以上である場合、糖残基の種類は同じでも異なっていてもよい。
Examples of sugar residues for R 3 , R 4 , R 5 and R 6 include pentose, hexose, and heptose. The sugar residue can be an aldose or ketose. In particular,
Examples of sugar residues include glucose, mannose, galactose, N-acetyl-glucosamine, N-acetyl-galactosamine, fucose, xylose, and sialic acid. The sugar residue may be α-form or β-form. The sugar residue can also be D-form or L-form. When the number of sugar residues is 2 or more, the types of sugar residues may be the same or different.
R3、R4、R5およびR6についての糖残基の個数は、1以上であれば特に限定され
ないが、例えば、1〜15個、好ましくは、1〜10個、より好ましくは、1〜5個、さ
らにより好ましくは1〜3個、特に好ましくは、1個または2個である。例えば、糖残基
の個数が1個である場合、式(1)で表される糖鎖は三糖であり、糖残基の個数が2個で
ある場合、式(1)で表される糖鎖は四糖である。
The number of sugar residues for R 3 , R 4 , R 5 and R 6 is not particularly limited as long as it is 1 or more. For example, 1 to 15, preferably 1 to 10, more preferably 1 -5, even more preferably 1-3, particularly preferably 1 or 2. For example, when the number of sugar residues is 1, the sugar chain represented by formula (1) is a trisaccharide, and when the number of sugar residues is 2, it is represented by formula (1). The sugar chain is a tetrasaccharide.
R3、R4、R5およびR6についての糖残基は、通常の糖間結合を介して、Gal−
GlcにおけるGalに結合し得る。また、R3、R4、R5およびR6についての糖残
基の個数が2個以上である場合、2個以上の糖残基は、通常の糖間結合を介して、隣接す
る糖残基に各々結合し得る。このような糖間結合としては、Gal−Glcまたはその誘
導体(糖鎖の非還元末端に存在し得る)に対してフコシル基を導入する活性を保持し得る
ものである限り特に限定されないが、例えば、α−1,2−結合、α−1,3−結合、α
−1,4−結合、β−1,2−結合、β−1,3−結合、およびβ−1,4−結合が挙げ
られる。
The sugar residues for R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are linked via Gal-
Can bind to Gal in Glc. Further, when the number of sugar residues for R 3 , R 4 , R 5 and R 6 is 2 or more, the two or more sugar residues are adjoined via a normal intersugar bond. Each may be attached to a group. Such an intersugar linkage is not particularly limited as long as it can retain the activity of introducing a fucosyl group to Gal-Glc or a derivative thereof (which may be present at the non-reducing end of the sugar chain). , Α-1,2-bond, α-1,3-bond, α
Examples include -1,4-bond, β-1,2-bond, β-1,3-bond, and β-1,4-bond.
好ましくは、R1、R2およびR3は、各々独立して、C1〜C6アルキル基、(ヒド
ロキシ)C1〜C6アルキル基、アミノ基、(C1〜C6アルキル)アミノ基、(C1〜
C6アルキル−カルボニル)アミノ基、ヒドロキシ基、(C1〜C6アルキル)オキシ基
を示してもよい。
Preferably, R 1 , R 2 and R 3 are each independently a C 1 -C 6 alkyl group, a (hydroxy) C 1 -C 6 alkyl group, an amino group, or a (C 1 -C 6 alkyl) amino group. , (C 1 ~
C 6 alkyl-carbonyl) amino group, hydroxy group, (C 1 -C 6 alkyl) oxy group may be indicated.
好ましくは、R4、R5、R6およびR7は、各々独立して、C1〜C6アルキル基、
(ヒドロキシ)C1〜C6アルキル基、アミノ基、(C1〜C6アルキル)アミノ基、(
C1〜C6アルキル−カルボニル)アミノ基、ヒドロキシ基、(C1〜C6アルキル)オ
キシ基、または1以上の糖残基を示してもよい。より好ましくは、R4、R5、R6およ
びR7から選ばれる3つの基は、各々独立して、C1〜C6アルキル基、(ヒドロキシ)
C1〜C6アルキル基、アミノ基、(C1〜C6アルキル)アミノ基、(C1〜C6アル
キル−カルボニル)アミノ基、ヒドロキシ基、または(C1〜C6アルキル)オキシ基を
示してもよく、R4、R5、R6およびR7から選ばれる残りの1つの基が、1以上の糖
残基を示してもよい。
Preferably, R 4 , R 5 , R 6 and R 7 are each independently a C 1 -C 6 alkyl group,
(Hydroxy) C 1 -C 6 alkyl group, an amino group, (C 1 -C 6 alkyl) amino group, (
C 1 -C 6 alkyl - carbonyl) amino group, hydroxy group, may indicate (C 1 -C 6 alkyl) group or one or more sugar residues. More preferably, the three groups selected from R 4 , R 5 , R 6 and R 7 are each independently a C 1 -C 6 alkyl group, (hydroxy)
C 1 -C 6 alkyl group, an amino group, (C 1 -C 6 alkyl) amino groups, - a (C 1 -C 6 alkyl) amino group, hydroxy group, or, (C 1 -C 6 alkyl) group The remaining one group selected from R 4 , R 5 , R 6 and R 7 may represent one or more sugar residues.
さらにより好ましくは、R1およびR2は、各々独立して、C1〜C6アルキル基、(
ヒドロキシ)C1〜C6アルキル基、アミノ基、(C1〜C6アルキル)アミノ基、(C
1〜C6アルキル−カルボニル)アミノ基、ヒドロキシ基、または(C1〜C6アルキル
)オキシ基を示してもよい。R3、R4、R5およびR6は、ヒドロキシ基、または(C
1〜C6アルキル)オキシ基を示してもよい。R7は、ヒドロキシメチル基等の(ヒドロ
キシ)C1〜C6アルキル基を示してもよい。
Even more preferably, R 1 and R 2 are each independently a C 1 -C 6 alkyl group, (
Hydroxy) C 1 -C 6 alkyl group, an amino group, (C 1 -C 6 alkyl) amino group, (C
1 -C 6 alkyl - carbonyl) amino group, hydroxy group, or, (C 1 -C 6 alkyl) may indicate an oxy group. R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are a hydroxy group or (C
1 -C 6 alkyl) may indicate an oxy group. R 7 may represent a (hydroxy) C 1 -C 6 alkyl group such as a hydroxymethyl group.
フコシル基の導入のために用いられるフコシル基供給化合物は、フコース中のヒドロキ
シ基(例、1位のヒドロキシル基)が脱離基で置換されているフコース誘導体であり得る
。フコシル基供給化合物におけるフコシル基は、α体またはβ体であり得る。フコシル基
はまた、L体であり得る。脱離基としては、例えば、フッ素原子、リン酸基が挙げられる
。好ましくは、フコシル基供給化合物は、フッ化フコースである。
The fucosyl group-providing compound used for introducing the fucosyl group may be a fucose derivative in which a hydroxy group in fucose (eg, hydroxyl group at the 1-position) is substituted with a leaving group. The fucosyl group in the fucosyl group-supplying compound may be α-form or β-form. The fucosyl group can also be in the L form. Examples of the leaving group include a fluorine atom and a phosphoric acid group. Preferably, the fucosyl group supply compound is fucose fluoride.
より好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は、以下の活性を有し得る:
(i)ラクト−N−ビオースI(Galβ1−3GlcNAc)、またはラクト−N−ビ
オースI(Galβ1−3GlcNAc)を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導
入して、ルイスa抗原〔Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc〕、またはルイ
スa抗原〔Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc〕を非還元末端に有する糖鎖
を生成する活性(GlcNAcは、グルコサミンを示す。以下、同様。);
(ii)N−アセチルラクトサミン(Galβ1−4GlcNAc)、またはN−アセチ
ルラクトサミン(Galβ1−4GlcNAc)を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル
基を導入して、ルイスx抗原〔Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc〕、また
はルイスx抗原〔Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc〕を非還元末端に有す
る糖鎖を生成する活性;
(iii)ラクトース(Galβ1−4Glc)、またはラクトース(Galβ1−4G
lc)を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、3−フコシルラクトース[
Galβ1−4(Fucα1−3)Glc]、または3−フコシルラクトース[Galβ
1−4(Fucα1−3)Glc]を非還元末端に有する糖鎖を生成する活性;
(iv)2’−フコシルラクトース(Fucα1−2Galβ1−4Glc)、または2
’−フコシルラクトース(Fucα1−2Galβ1−4Glc)を非還元末端に有する
糖鎖に、フコシル基を導入して、ジフコシルラクトース[Fucα1−2Galβ(Fu
cα1−3)1−4Glc]、またはジフコシルラクトース[Fucα1−2Galβ(
Fucα1−3)1−4Glc]を非還元末端に有する糖鎖を生成する活性;ならびに
(v)ラクト−N−テトラオース(Galβ1−3GlcNAcβ1−3Galβ1−4
Glc)、またはラクト−N−テトラオース(Galβ1−3GlcNAcβ1−3Ga
lβ1−4Glc)を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ラクト−N−
フコペンタオースII[Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Gal
β1−4Glc]、またはラクト−N−フコペンタオースII[Galβ1−3(Fuc
α1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc]を非還元末端に有する糖鎖を生
成する活性。
In a more preferred embodiment, the protein of the invention may have the following activities:
(I) A fucosyl group is introduced into a sugar chain having lacto-N-biose I (Galβ1-3GlcNAc) or lacto-N-biose I (Galβ1-3GlcNAc) at the non-reducing end, and Lewis a antigen [Galβ1- 3 (Fucα1-4) GlcNAc] or Lewis a antigen [Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAc], which produces a sugar chain at the non-reducing end (GlcNAc represents glucosamine; the same shall apply hereinafter);
(Ii) A fucosyl group is introduced into a sugar chain having N-acetyllactosamine (Galβ1-4GlcNAc) or N-acetyllactosamine (Galβ1-4GlcNAc) at a non-reducing end, and Lewis x antigen [Galβ1-4 ( Fucα1-3) GlcNAc], or an activity of producing a sugar chain having Lewis x antigen [Galβ1-4 (Fucα1-3) GlcNAc] at the non-reducing end;
(Iii) Lactose (Galβ1-4Glc) or Lactose (Galβ1-4G
lc) is introduced into a sugar chain having a non-reducing end, a fucosyl group is introduced, and 3-fucosyl lactose [
Galβ1-4 (Fucα1-3) Glc], or 3-fucosyl lactose [Galβ
1-4 (Fucα1-3) Glc] is an activity for producing a sugar chain having a non-reducing end;
(Iv) 2′-fucosyl lactose (Fucα1-2Galβ1-4Glc), or 2
A fucosyl group is introduced into a sugar chain having '-fucosyl lactose (Fucα1-2Galβ1-4Glc) at the non-reducing end, and difucosyl lactose [Fucα1-2Galβ (Fu
cα1-3) 1-4Glc], or difucosyl lactose [Fucα1-2Galβ (
Fucα1-3) 1-4Glc] to generate a sugar chain having a non-reducing end; and (v) lacto-N-tetraose (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4
Glc), or lacto-N-tetraose (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Ga)
a fucosyl group is introduced into a sugar chain having 1β1-4Glc) at the non-reducing end, and lacto-N—
Fucopentaose II [Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAcβ1-3Gal
β1-4Glc], or lacto-N-fucopentaose II [Galβ1-3 (Fuc
α1-4) Activity to generate a sugar chain having GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc] at the non-reducing end.
上記糖鎖を構成する糖残基の総数は、Gal−Glcに起因する糖残基の個数(2個)
を、上述した糖残基の個数に加算した数である。したがって、糖鎖を構成する糖残基の総
数は、例えば、1〜17個、好ましくは、1〜12個、より好ましくは、1〜7個、さら
により好ましくは3、4または5個である。
The total number of sugar residues constituting the sugar chain is the number of sugar residues derived from Gal-Glc (2).
Is added to the number of sugar residues described above. Therefore, the total number of sugar residues constituting the sugar chain is, for example, 1 to 17, preferably 1 to 12, more preferably 1 to 7, and even more preferably 3, 4 or 5. .
本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質を発現する形質転換体から得ることができ
る。この形質転換体は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、本発
明のタンパク質の発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入するこ
とにより作製することができる。本発明のタンパク質を発現させるための宿主としては、
例えば、エスケリシア・コリ(Escherichia coli)等のエスケリシア属
細菌、コリネバクテリウム属細菌、およびバチルス・ズブチリス(Bacillus s
ubtilis)をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス・セレビシエ(Sa
ccharomyces cerevisiae)、ピヒア・スティピティス(Pich
ia stipitis)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus ory
zae)をはじめとする種々の真核細胞が挙げられる。
The protein of the present invention can be obtained from a transformant that expresses the protein of the present invention. This transformant can be prepared by preparing an expression vector of the protein of the present invention containing a polynucleotide encoding the protein of the present invention and then introducing the expression vector into a host. As a host for expressing the protein of the present invention,
For example, Escherichia bacteria such as Escherichia coli, Corynebacterium bacteria, and Bacillus subtilis.
various prokaryotic cells including ubtilis), Saccharomyces cerevisiae (Sa
ccharomyces cerevisiae), Pichia Stipitis (Pich)
ia stititis), Aspergillus oryzae
and various eukaryotic cells including zae).
形質転換される宿主としてE.coliについて詳述すると、E.coliとしては、
例えば、E.coli K12株亜種のE.coli JM109株、DH5α株、HB
101株、BL21(DE3)株が挙げられる。形質転換方法、および形質転換体を選別
する方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual, 3rd edition, Cold Spring Harbor pr
ess (2001/01/15)などにも記載されている。以下、形質転換されたE.
coliを作製し、これを用いて本発明のタンパク質を製造する方法を、一例としてより
具体的に説明する。
E. coli as a host to be transformed. E. coli will be described in detail. As for coli,
For example, E.I. E. coli K12 strain subspecies. E. coli JM109 strain, DH5α strain, HB
101 strain, BL21 (DE3) strain. Transformation methods and methods for selecting transformants are described in Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual, 3rd edition, Cold Spring Harbor pr
ess (2001/01/15) and the like. Hereinafter, the transformed E. coli was transformed.
A method for producing E. coli and producing the protein of the present invention using the same will be described more specifically as an example.
本発明のタンパク質をコードするDNAを発現させるプロモータとしては、通常E.c
oliにおける異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例え
ば、T7プロモータ、lacプロモータ、trpプロモータ、trcプロモータ、tac
プロモータ、ラムダファージのPRプロモータ、PLプロモータ、T5プロモータ等の強
力なプロモータが挙げられる。ベクターとしては、例えば、pUC19、pUC18、p
BR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RS
F1010、pACYC177、pACYC184、pMW119、pMW118、pM
W219、pMW218、pQE30およびその誘導体が挙げられる。
As a promoter for expressing the DNA encoding the protein of the present invention, E. c
Promoters used for heterologous protein production in oli can be used, for example, T7 promoter, lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac
Strong promoters such as promoters, lambda phage PR promoters, PL promoters, T5 promoters and the like can be mentioned. Examples of vectors include pUC19, pUC18, p
BR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RS
F1010, pACYC177, pACYC184, pMW119, pMW118, pM
W219, pMW218, pQE30 and derivatives thereof.
また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の下流に、転写終結配列であるターミネ
ータを連結してもよい。このようなターミネータとしては、例えば、T7ターミネータ、
fdファージターミネータ、T4ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネ
ータ、大腸菌trpA遺伝子のターミネータが挙げられる。
Furthermore, a terminator that is a transcription termination sequence may be linked downstream of the gene encoding the protein of the present invention. Examples of such terminators are T7 terminator,
Examples include fd phage terminator, T4 terminator, tetracycline resistance gene terminator, and E. coli trpA gene terminator.
本発明のタンパク質をコードする遺伝子をE.coliに導入するためのベクターとし
ては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ColE1由来の複製開始点を有する
プラスミド、例えばpUC系のプラスミドやpBR322系のプラスミドあるいはその誘
導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および/ま
たは逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう「改
変」とは、変異剤やUV照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも
含む。
A gene encoding the protein of the present invention is designated as E. coli. As a vector for introduction into E. coli, a so-called multicopy type is preferable, and a plasmid having a replication origin derived from ColE1, such as a pUC-type plasmid, a pBR322-type plasmid, or a derivative thereof can be mentioned. Here, the “derivative” means one obtained by modifying a plasmid by base substitution, deletion, insertion, addition and / or inversion. The “modification” here includes modification by mutation treatment, UV irradiation, natural mutation, or the like.
ベクターは、形質転換体の選別のため、アンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有する
ことが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが
市販されている(例、pUC系(タカラバイオ社製)、pPROK系(クローンテック製
)、pKK233−2(クローンテック製))。
The vector preferably has a marker such as an ampicillin resistance gene for selection of transformants. As such a plasmid, an expression vector having a strong promoter is commercially available (eg, pUC system (manufactured by Takara Bio Inc.), pPROK system (manufactured by Clontech), pKK233-2 (manufactured by Clontech)).
得られた発現ベクターを用いてE.coliを形質転換し、得られたE.coliを培
養すると、本発明のタンパク質が発現される。
Using the resulting expression vector, E. coli. The resulting E. coli was transformed. When the E. coli is cultured, the protein of the present invention is expressed.
培地としては、例えば、M9−カザミノ酸培地、LB培地など、大腸菌を培養するため
に通常用いる培地が挙げられる。培養および生産誘導等の条件は、用いたベクターのマー
カー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択することができる。
Examples of the medium include media usually used for culturing Escherichia coli, such as M9-casamino acid medium and LB medium. Conditions such as culture and production induction can be appropriately selected according to the type of the marker, promoter, host fungus and the like of the vector used.
本発明のタンパク質を回収するには、以下の方法などがある。本発明のタンパク質は、
本発明のタンパク質を産生する形質転換体を回収した後、形質転換体を破砕(例、ソニケ
ーション、ホモジナイゼーション)あるいは溶解(例、リゾチーム処理)することにより
、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出
、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、精製タンパク質
、粗タンパク質、または本発明のタンパク質含有画分を得ることができる。
In order to recover the protein of the present invention, there are the following methods. The protein of the present invention is
After recovering the transformant producing the protein of the present invention, the transformant is crushed (eg, sonication, homogenization) or dissolved (eg, lysozyme treatment) to obtain a crushed product and a lysate. Can do. By subjecting such crushed material and lysate to techniques such as extraction, precipitation, filtration, and column chromatography, purified protein, crude protein, or the protein-containing fraction of the present invention can be obtained.
本発明はまた、本発明のタンパク質の作製に用いることができる、上述したような、本
発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドを含む発
現ベクター、ならびに当該発現ベクターを含む形質転換体を提供する。
The present invention can also be used to produce the protein of the present invention, as described above, a polynucleotide encoding the protein of the present invention, an expression vector comprising the polynucleotide, and a transformant comprising the expression vector. I will provide a.
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードするので、本発明のタンパ
ク質に関する上述した説明に基づいて、種々の観点から特定することができる。
Since the polynucleotide of the present invention encodes the protein of the present invention, the polynucleotide of the present invention can be specified from various viewpoints based on the above-described explanation regarding the protein of the present invention.
本発明はまた、フコシル化されたGal−Glcまたはその誘導体の製造方法を提供す
る。本方法は、本発明のタンパク質の存在下において、Gal−Glcまたはその誘導体
にフコシル基を導入して、フコシル化されたGal−Glcまたはその誘導体を生成する
ことを含む。本発明のタンパク質、Gal−Glcまたはその誘導体、フコシル基を導入
するためのフコシル基供給化合物等の詳細は、上述したとおりである。
The present invention also provides a method for producing fucosylated Gal-Glc or a derivative thereof. The method includes introducing a fucosyl group into Gal-Glc or a derivative thereof in the presence of the protein of the present invention to produce a fucosylated Gal-Glc or derivative thereof. Details of the protein of the present invention, Gal-Glc or a derivative thereof, a fucosyl group supply compound for introducing a fucosyl group, and the like are as described above.
好ましい実施形態では、Gal−Glcまたはその誘導体は、上記式(1)で表される
多糖であってもよい。
In a preferred embodiment, Gal-Glc or a derivative thereof may be a polysaccharide represented by the above formula (1).
より好ましい実施形態では、本発明の製造方法は、以下のとおりである:
(i’)ラクト−N−ビオースI(Galβ1−3GlcNAc)、またはラクト−N−
ビオースI(Galβ1−3GlcNAc)を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を
導入して、ルイスa抗原〔Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc〕、またはル
イスa抗原〔Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc〕を非還元末端に有する糖
鎖を生成する方法
(ii’)N−アセチルラクトサミン(Galβ1−4GlcNAc)、またはN−アセ
チルラクトサミン(Galβ1−4GlcNAc)を非還元末端に有する糖鎖に、フコシ
ル基を導入して、ルイスx抗原〔Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc〕、ま
たはルイスx抗原〔Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc〕を非還元末端に有
する糖鎖を生成する製造方法;
(iii’)ラクトース(Galβ1−4Glc)、またはラクトース(Galβ1−4
Glc)を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、3−フコシルラクトース
[Galβ1−4(Fucα1−3)Glc]、または3−フコシルラクトース[Gal
β1−4(Fucα1−3)Glc]を非還元末端に有する糖鎖を生成する製造方法;
(iv’)2’−フコシルラクトース(Fucα1−2Galβ1−4Glc)、または
2’−フコシルラクトース(Fucα1−2Galβ1−4Glc)を非還元末端に有す
る糖鎖に、フコシル基を導入して、ジフコシルラクトース[Fucα1−2Galβ(F
ucα1−3)1−4Glc]、またはジフコシルラクトース[Fucα1−2Galβ
(Fucα1−3)1−4Glc]を非還元末端に有する糖鎖を生成する製造方法;なら
びに
(v’)ラクト−N−テトラオース(Galβ1−3GlcNAcβ1−3Galβ1−
4Glc)、またはラクト−N−テトラオース(Galβ1−3GlcNAcβ1−3G
alβ1−4Glc)を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ラクト−N
−フコペンタオースII[Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Ga
lβ1−4Glc]、またはラクト−N−フコペンタオースII[Galβ1−3(Fu
cα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc]を非還元末端に有する糖鎖を
生成する製造方法。
In a more preferred embodiment, the production method of the present invention is as follows:
(I ′) lacto-N-biose I (Galβ1-3GlcNAc), or lacto-N—
A fucosyl group is introduced into a sugar chain having biose I (Galβ1-3GlcNAc) at the non-reducing end, and Lewis a antigen [Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAc] or Lewis a antigen [Galβ1-3 (Fucα1- 4) Method for producing a sugar chain having GlcNAc] at the non-reducing end (ii ′) A sugar chain having N-acetyllactosamine (Galβ1-4GlcNAc) or N-acetyllactosamine (Galβ1-4GlcNAc) at the non-reducing end A sugar chain having Lewis x antigen [Galβ1-4 (Fucα1-3) GlcNAc] or Lewis x antigen [Galβ1-4 (Fucα1-3) GlcNAc] at the non-reducing end is generated by introducing a fucosyl group into Production method;
(Iii ′) lactose (Galβ1-4Glc), or lactose (Galβ1-4)
Glc) is introduced into a sugar chain having a non-reducing end, a fucosyl group is introduced, and 3-fucosyl lactose [Galβ1-4 (Fucα1-3) Glc], or 3-fucosyl lactose [Gal
β1-4 (Fucα1-3) Glc], a production method for producing a sugar chain having a non-reducing end;
(Iv ′) 2′-fucosyl lactose (Fucα1-2Galβ1-4Glc) or 2′-fucosyl lactose (Fucα1-2Galβ1-4Glc) is introduced into a sugar chain having a non-reducing end to introduce a difucosyl lactose [Fucα1-2Galβ (F
ucα1-3) 1-4Glc], or difucosyl lactose [Fucα1-2Galβ
(Fucα1-3) 1-4Glc] for producing a sugar chain having a non-reducing end; and (v ′) lacto-N-tetraose (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-
4Glc), or lacto-N-tetraose (Galβ1-3GlcNAcβ1-3G
alβ1-4Glc) at the non-reducing end, a fucosyl group is introduced, and lacto-N
-Fucopentaose II [Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAcβ1-3Ga
lβ1-4Glc], or lacto-N-fucopentaose II [Galβ1-3 (Fu
cα1-4) A production method for producing a sugar chain having GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc] at the non-reducing end.
上記糖鎖を構成する糖残基の総数は、上述したとおりである。 The total number of sugar residues constituting the sugar chain is as described above.
本発明のタンパク質の存在下におけるGal−Glcまたはその誘導体へのフコシル基
の導入は、反応系中に、本発明のタンパク質、ならびにGal−Glcまたはその誘導体
およびフコシル基供給化合物が共存する条件下で行なわれる。このような条件は、例えば
、(I)本発明のタンパク質(例、精製タンパク質、粗タンパク質)、ならびにGal−
Glcまたはその誘導体およびフコシル基供給化合物を含有する反応液、または(II)
本発明のタンパク質を発現する本発明の形質転換体、ならびにGal−Glcまたはその
誘導体およびフコシル基供給化合物を含有する培養液を用いることにより達成することが
できる。
The introduction of a fucosyl group into Gal-Glc or a derivative thereof in the presence of the protein of the present invention is carried out under conditions where the protein of the present invention, and Gal-Glc or a derivative thereof and a fucosyl group-providing compound coexist in the reaction system. Done. Such conditions include, for example, (I) the protein of the present invention (eg, purified protein, crude protein), and Gal-
A reaction solution containing Glc or a derivative thereof and a fucosyl group-providing compound, or (II)
This can be achieved by using the transformant of the present invention that expresses the protein of the present invention, and a culture solution containing Gal-Glc or a derivative thereof and a fucosyl group supply compound.
反応系中の基質(Gal−Glcまたはその誘導体およびフコシル基供給化合物)の濃
度は、特に制限されず、適宜設定できる。基質はまた、反応中に適宜補充されてもよい。
さらに、基質は、遊離の塩基および塩のいずれの形態でも用いることができる。反応系中
には、フッ化フコース等の基質の自発分解を抑制し得る成分を補充してもよい。このよう
な成分としては、例えば、DMSOが挙げられる。
The concentration of the substrate (Gal-Glc or a derivative thereof and a fucosyl group supply compound) in the reaction system is not particularly limited and can be set as appropriate. The substrate may also be supplemented as appropriate during the reaction.
Furthermore, the substrate can be used in any form of free base and salt. The reaction system may be supplemented with a component that can suppress the spontaneous decomposition of the substrate, such as fluorinated fucose. An example of such a component is DMSO.
本発明の製造方法におけるpHは、目的の反応が進行する限り特に限定されない。本発
明の製造方法は、目的化合物の収率の観点から、例えば、pH約4.0〜約7.5、好ま
しくは、pH約4.0〜約6.5、より好ましくはpH約4.5〜約5.5で行なわれて
もよい。
The pH in the production method of the present invention is not particularly limited as long as the target reaction proceeds. From the viewpoint of the yield of the target compound, the production method of the present invention is, for example, about pH 4.0 to about 7.5, preferably about pH 4.0 to about 6.5, more preferably about pH 4. It may be performed at 5 to about 5.5.
本発明の製造方法における温度は、目的の反応が進行する限り特に限定されない。本発
明の製造方法は、例えば、約20〜45℃、好ましくは、約25〜40℃で行なわれても
よい。
The temperature in the production method of the present invention is not particularly limited as long as the target reaction proceeds. The production method of the present invention may be performed at, for example, about 20 to 45 ° C, preferably about 25 to 40 ° C.
本発明の製造方法において、反応時間は、製造されるべき目的化合物の量に応じて適宜
設定できる。反応は、静置または攪拌状態で行われ得る。
In the production method of the present invention, the reaction time can be appropriately set according to the amount of the target compound to be produced. The reaction can be carried out in a stationary or stirred state.
本発明の製造方法において得られる目的化合物は、公知の分離精製手段、例えば、濃縮
、減圧濃縮、溶媒抽出、晶出、再結晶、転溶、活性炭処理、イオン交換クロマトグラフィ
ー等のクロマトグラフィーなどの処理を必要に応じて組み合せることにより単離精製する
ことができる。本発明の製造方法において原料として用いられる化合物、および本発明の
製造方法において得られる目的化合物は、特に断らない限り、塩の形態であってもよい。
このような塩は、それ自体公知の手段に従い、例えば、原料または目的化合物に無機酸ま
たは有機酸を加えることによって製造することができる。また、原料または目的化合物の
塩は、水和物であってもよく、水和物および非水和物のいずれも本発明の範囲に包含され
るものである。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の各種塩が挙
げられる。
The target compound obtained in the production method of the present invention is a known separation and purification means, for example, concentration, vacuum concentration, solvent extraction, crystallization, recrystallization, transfer dissolution, activated carbon treatment, chromatography such as ion exchange chromatography, etc. Isolation and purification can be performed by combining the treatments as necessary. Unless otherwise specified, the compound used as a raw material in the production method of the present invention and the target compound obtained in the production method of the present invention may be in the form of a salt.
Such a salt can be produced by a method known per se, for example, by adding an inorganic acid or an organic acid to a raw material or a target compound. The salt of the starting material or the target compound may be a hydrate, and both a hydrate and a non-hydrate are included in the scope of the present invention. Examples of the salt include various salts such as sodium salt, potassium salt, and ammonium salt.
(略語)
CAD:荷電エアロゾル検出器〔charged aerosol detector〕
DC−SIGN:樹状細胞特異的細胞間接着分子−3−グラビング非インテグリン〔de
ndritic cell−specific intercellular adhe
sion molecule−3−grabbing non−integrin〕
DFL:ジフコシルラクトース〔difucosyllactose〕
ESI−MS:電気スプレーイオン化−質量分析〔electrospray ioni
zation−mass spectrometry〕
2’−FL:2’−フコシルラクトース〔2’−fucosyllactose〕
3−FL:3−フコシルラクトース〔3−fucosyllactose〕
FucF:β−L−フコピラノシルフルオリド〔β−L−fucopyranosyl
fluoride〕
FucN3:β−L−フコピラノシルアジド〔β−L−fucopyranosyl a
zide〕
GH:グリコシドヒドロラーゼ〔glycoside hydrolase〕
HEPES:4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸〔4−(
2−hydroxyethyl)−1−piperazine ethanesulfo
nic acid〕
HPLC:高速液体クロマトグラフィー〔high−performance liqu
id chromatography〕
Lac:ラクトース〔lactose〕
LacNAc:N−アセチルラクトサミン〔N−acetyllactosamine〕
LNB:ラクト−N−ビオースI〔lacto−N−biose I〕
LNDFH:ラクト−N−ジフコヘキサオース〔lacto−N−difucohexa
ose〕
LNFP:ラクト−N−フコメンタオース〔lacto−N−fucopentaose
〕
LNT:ラクト−N−テトラオース〔lacto−N−tetraose〕
LPS:リポ多糖〔lipopolysaccharides〕
MES:2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸〔2−(N−morpholino)
ethanesulfonic acid〕
MOPS:3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸〔3−(N−morpholin
o)propanesulfonic acid〕
NMR:核磁気共鳴〔nuclear magnetic resonance〕
pNP−α−Fuc:4−ニトロフェニル−α−L−フコピラノシド〔4−nirtop
henyl−α−L−fucopyranoside〕
TLC:薄層クロマトグラフィー〔thin−layer chromatograph
y〕
(Abbreviation)
CAD: Charged aerosol detector (charged aerosol detector)
DC-SIGN: Dendritic cell specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin [de
ndritic cell-specific intercellular adhe
sion molecule-3-grabbing non-integrin]
DFL: difucosyl lactose
ESI-MS: Electrospray ionization-mass spectrometry [electrospray ioni
zation-mass spectrometry)
2'-FL: 2'-fucosyl lactose [2'-fucosyl lactose]
3-FL: 3-fucosyl lactose
FucF: β-L-fucopyranosyl fluoride [β-L-fucopyranosyl
fluoride]]
FucN 3 : β-L-fucopyranosyl azide [β-L-fucopyranosyl a
zide]
GH: glycoside hydrolase
HEPES: 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid [4- (
2-hydroxyethyl) -1-piperazine etheresulfo
nic acid]
HPLC: high-performance liquid chromatography [high-performance liquid
id chromatography]
Lac: lactose
LacNAc: N-acetyllactosamine [N-acetyllactosamine]
LNB: lacto-N-biose I [lacto-N-biose I]
LNDFH: lacto-N-difucohexaose
ose)
LNFP: lacto-N-fucomentaose
]
LNT: lacto-N-tetraose
LPS: Lipopolysaccharide [lipopolysaccharides]
MES: 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid [2- (N-morpholino)
etheresulphonic acid]
MOPS: 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid [3- (N-morpholin
o) propanesulphonic acid]
NMR: nuclear magnetic resonance
pNP-α-Fuc: 4-nitrophenyl-α-L-fucopyranoside [4-nirtop
henyl-α-L-fucopyranoside]
TLC: thin-layer chromatography (thin-layer chromatography)
y]
以下の実施例により、本発明を詳細に説明するが、これらの実施例により本発明が限定
されるものではない。
The following examples explain the present invention in detail, but the present invention is not limited to these examples.
(材料および方法)
材料
LacNAc、Lea、Lex、および、LNFP IIは、Dextra Labo
ratories(Reading,UK)より購入した。N,N’−ジアセチルキトビ
オースは生化学工業(Tokyo,Japan)から、DFLはIsosep(Tull
inge,Sweden)から購入した。LNB(Nishimoto et al.2
007)、Glcβ1−4GlcNAc(Honda et al.2004)、および
、FucF(Wada et al.2008)は既報通りに合成した。3−FLはDe
xtra Laboratoriesで購入し、Bio−Gel P2カラム(Bio−
Rad,CA,USA)で更に精製した。他の試薬は、分析グレードの市販品である。
(Materials and methods)
Materials LacNAc, Le a , Le x , and LNFP II are Dexta Labo
purchased from laboratories (Reading, UK). N, N'-diacetylchitobiose is from Seikagaku Corporation (Tokyo, Japan) and DFL is Isosep (Tull
inge, Sweden). LNB (Nishimoto et al. 2
007), Glcβ1-4GlcNAc (Honda et al. 2004) and FucF (Wada et al. 2008) were synthesized as previously reported. 3-FL is De
Purchased from xtra Laboratories, Bio-Gel P2 column (Bio-
(Rad, CA, USA). Other reagents are analytical grade commercial products.
変異体の構築
BbAfcBのD703変異体(D703A,D703C,D703G,D703S)
は、鋳型にプラスミドpET23b−afcB(Ashida et al.2009)
を使って、QuikChange site−directed mutagenesi
s method(Stratagene)により構築した。使用したプライマーは、以
下の表1に記載した。設計した部分以外に余分な変異が入っていないことはシークエンス
により確認した。作製したプラスミドは、Escherichia coli BL21
ΔlacZ(DE3)に導入した(Ashida et al.2009)。
Construction of mutant D703 mutant of BbAfcB (D703A, D703C, D703G, D703S)
Is the plasmid pET23b-afcB (Ashida et al. 2009)
Using QuikChange site-directed mutegenes
It was constructed by s method (Stratagene). The primers used are listed in Table 1 below. It was confirmed by sequencing that there were no extra mutations other than the designed part. The prepared plasmid was Escherichia coli BL21.
It was introduced into ΔlacZ (DE3) (Ashida et al. 2009).
タンパク質発現と精製
組換え体は、100μg/mLアンピシリンを含むLuria−Bertani培地に
て、吸光度(600nm)が0.5に達するまで18℃で培養し、その後、isopro
pyl−β−D−thiogalactopyranosideを終濃度0.1mMにな
るように加えた。さらに15時間培養した後に集菌し、超音波処理により破砕した。超音
波破砕することで、BugBuster Protein Extraction re
agent(Merck,Darmstadt,Germany)を使用した以前の方法
(Ashida et al.2009)よりも高収率で活性酵素を得ることが出来た。
遠心後、上清をNi−NTAアガロースカラム(Qiagen)にアプライし、マニュア
ルに従って蛋白質を溶出させた。活性フラクションを収集し、Amicon Ultra
50 K(Millipore,MA,USA)にて濃縮した後、Superdex
200 10/300 GLゲルろ過カラム(GE Healthcare Bio−S
ciences,Uppsala,Sweden)に供した。溶出は150mM NaC
lを含む20mM tris(hydroxymethyl)aminomethane
−HCl buffer(pH8.0)にて行った。精製した酵素は50mM 4−(2
−hydroxyethyl)−1−piperazineethanesulfoni
c acid(HEPES)buffer(pH7.0)に透析した。タンパク質濃度は
、bovine serum albuminを標準に用い、BCA protein
assay kit(Pierce,Thermo Fisher Scientifi
c,IL,USA)にて測定した。
Protein Expression and Purification Recombinants are cultured at 18 ° C. in Luria-Bertani medium containing 100 μg / mL ampicillin until the absorbance (600 nm) reaches 0.5, then isopro
pyl-β-D-thiogalactopyranoside was added to a final concentration of 0.1 mM. After further culturing for 15 hours, the cells were collected and disrupted by ultrasonic treatment. BugBuster Protein Extraction re
The active enzyme could be obtained in a higher yield than the previous method (Ashida et al. 2009) using agent (Merck, Darmstadt, Germany).
After centrifugation, the supernatant was applied to a Ni-NTA agarose column (Qiagen), and the protein was eluted according to the manual. Collect active fractions, Amicon Ultra
After concentration at 50 K (Millipore, MA, USA), Superdex
200 10/300 GL gel filtration column (GE Healthcare Bio-S
ciences, Uppsala, Sweden). Elution is 150 mM NaC
20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane containing 1
-It was carried out with HCl buffer (pH 8.0). The purified enzyme is 50 mM 4- (2
-Hydroxyethyl) -1-piperazine etheresufoni
Dialyzed against c acid (HEPES) buffer (pH 7.0). As for protein concentration, using bovine serum albumin as a standard, BCA protein
assay kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific)
c, IL, USA).
酵素測定
BbAfcB変異体の加水分解活性は、基質に3−FLを用いて決定した。反応液の組
成は、100mM 3−(N−morpholino)propanesulfonic
acid(MOPS)buffer(pH6.5)、1mM基質、および、酵素(野生
型14nM、および、D703変異体12μM)とした。反応は30℃で行い、熱処理で
反応を止めた後、遊離したL−fucose(Fuc)の量をフコースデヒドロゲナーゼ
カップリング法で決定した(Cohenford et al.1989;Kataya
ma et al.2004)。1Uは、1分間に1μmolのFucを生じさせるのに
必要な酵素量とした。
D703変異体のグリコシンターゼ活性は、100mM MOPS buffer(p
H7.0)、20mM FucF(供与体)、100mM LNB/LacNAc(受容
体)、および、酵素(17μM)の存在下で測定した。反応は50μlで行い、30℃に
て10分保温後に、30%トリクロロ酢酸5μlを加えて反応を止めた。反応産物はSu
gar−Dカラム(4.6×250mm、Nacalai Tesque)を用いた高速
クロマトグラフィー(HPLC)によって分析した。溶出には75%もしくは78%アセ
トニトリルを用い、40℃および流速1.0mL/minとした。検出は214nmもし
くはコロナ荷電化粒子検出器(Corona CAD,Esa,USA)にて行った。反
応産物の濃度は、LeaおよびLexトリサッカライド標品を使用して作成した検量線を
用いて決定した。
Enzyme measurement The hydrolysis activity of the BbAfcB mutant was determined using 3-FL as the substrate. The composition of the reaction solution was 100 mM 3- (N-morpholino) panesulfonic.
Acid (MOPS) buffer (pH 6.5), 1 mM substrate, and enzyme (wild type 14 nM and D703 mutant 12 μM) were used. The reaction was carried out at 30 ° C., and after the reaction was stopped by heat treatment, the amount of liberated L-fucose (Fuc) was determined by the fucose dehydrogenase coupling method (Cohenford et al. 1989; Kataya)
ma et al. 2004). 1 U was defined as the amount of enzyme required to produce 1 μmol of Fuc per minute.
The glycosynthase activity of the D703 mutant is 100 mM MOPS buffer (p
H7.0), 20 mM FucF (donor), 100 mM LNB / LacNAc (acceptor), and enzyme (17 μM). The reaction was performed in 50 μl, and after incubation at 30 ° C. for 10 minutes, 5 μl of 30% trichloroacetic acid was added to stop the reaction. The reaction product is Su
Analysis was by high performance chromatography (HPLC) using a gar-D column (4.6 × 250 mm, Nacalai Tesque). For elution, 75% or 78% acetonitrile was used at 40 ° C. and a flow rate of 1.0 mL / min. Detection was performed with a 214 nm or corona charged particle detector (Coron CAD, Esa, USA). The concentration of the reaction product was determined using a calibration curve prepared using Le a and Le x trisaccharide standards.
グリコシンターゼ反応の至適pHは、D703S変異体を用いて決定した。緩衝液(1
00mM)は、クエン酸−NaOH(pH4.0−5.0)、MES(pH5.0−6.
5)、およびMOPS(pH6.5−8.0)を使用した。反応初速度は、100mM
MES buffer(pH5.0)、FucF(20および60mM)、LNB/La
cNAc(0−300mM)、および、酵素(17μM D703S)の存在下、反応産
物が直線的に増加する条件下(30℃,5分)で決定した。D703S変異体の受容体特
異性は、13種類の基質を用いて検討した。40mM FucFおよび100mM各受容
体を含む100mM MES buffer(pH5.0)を、17μM D703S存
在下もしくは非存在下で30℃40分間保温し、その後、反応産物をHPLC−CADに
て分析した。
The optimum pH for the glycosynthase reaction was determined using the D703S mutant. Buffer solution (1
00 mM) is citric acid-NaOH (pH 4.0-5.0), MES (pH 5.0-6.
5), and MOPS (pH 6.5-8.0) were used. Initial reaction rate is 100 mM
MES buffer (pH 5.0), FucF (20 and 60 mM), LNB / La
The determination was performed under the condition (30 ° C., 5 minutes) where the reaction product increased linearly in the presence of cNAc (0-300 mM) and the enzyme (17 μM D703S). The receptor specificity of the D703S mutant was examined using 13 types of substrates. A 100 mM MES buffer (pH 5.0) containing 40 mM FucF and 100 mM each receptor was incubated at 30 ° C. for 40 minutes in the presence or absence of 17 μM D703S, and then the reaction product was analyzed by HPLC-CAD.
D703S変異体を使用した最適条件下でのLeaおよびLexトリサッカライドの合成
Leaトリサッカライド合成は、100mM MES buffer(pH5.0)、
40mM FucF(供与体)、200mM LNB(受容体)、および、D703変異
体(17μM)の存在下で行った。反応液は300μlとし30℃で行った。Lexトリ
サッカライド合成では、受容体に100mM LacNAcを用い、同様の条件で行った
。
Synthesis of Le a and Le x trisaccharides under optimal conditions using the D703S mutant Le a trisaccharide synthesis was performed using 100 mM MES buffer (pH 5.0),
It was carried out in the presence of 40 mM FucF (donor), 200 mM LNB (acceptor), and D703 mutant (17 μM). The reaction solution was 300 μl and carried out at 30 ° C. In le x trisaccharide synthesis, using 100 mM LacNAc receptor, it was carried out under the same conditions.
反応産物の精製と構造解析
反応産物はAmberlite MB−3にて脱塩し、凍結乾燥させた後に、Suga
r−Dカラムを使ってHPLCにより精製した。溶出条件は上記の通りである。得られた
画分は、凍結乾燥後、さらにTSKgel ODS−80TSカラム(4.6×250m
m,Tosoh,Japan)を用いて精製し、残存するLNB/LacNAcを完全に
取り除いた。溶出には水を用い、流速は0.5ml/minとした。また、検出には示差
屈折率検出器(RID−10A,Shimazu,Kyoto,Japan)を用いた。
1H−および13C NMR解析には、Bruker Avance 500 spec
trometerを用いた。ESI−MS測定にはBruker APEX II 70
eフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計を用い、ポジティブモードで行った
。
Purification and structural analysis of reaction product The reaction product was desalted with Amberlite MB-3, freeze-dried, and then Suga.
Purification by HPLC using an r-D column. The elution conditions are as described above. The obtained fraction was freeze-dried and further subjected to TSKgel ODS-80TS column (4.6 × 250 m
m, Tosoh, Japan) to completely remove the remaining LNB / LacNAc. Water was used for elution and the flow rate was 0.5 ml / min. Further, a differential refractive index detector (RID-10A, Shimazu, Kyoto, Japan) was used for detection.
For 1 H- and 13 C NMR analysis, Bruker Avance 500 spec
A trometer was used. Bruker APEX II 70 for ESI-MS measurement
An eFourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer was used and performed in positive mode.
求核残基としてのAsp−703
B.bifidum由来1,3−1,4−α−L−フコシダーゼ(BbAfcB)は、
糖質加水分解酵素(GH)ファミリー29に属している(http://www.caz
y.org)(Cantarel et al,2009)。このファミリーに属する酵
素は、立体保持型の反応機構でα−L−フコシル結合を加水分解する(McCarter
and Withers 1994;Sulzenbacher et al.200
4)。BbAfcBのα−L−フコシンターゼ化の第一段階として、まず求核残基の同定
を試みた(立体保持型グリコシダーゼをグリコシンターゼ化するためには、求核残基に変
異を導入して加水分解活性を消失させることが必須である)。既知の数種類のGH29酵
素の立体構造やアミノ酸配列を比較した結果、Asp−703が求核残基である可能性が
示唆された(後に詳しく考察する)。
Asp-703 as a nucleophilic residue
B. bifidum-derived 1,3-1,4-α-L-fucosidase (BbAfcB) is
It belongs to carbohydrate hydrolase (GH) family 29 (http: //www.caz
y. org) (Cantarel et al, 2009). Enzymes belonging to this family hydrolyze α-L-fucosyl bonds through a steric retention type reaction mechanism (McCarter).
and Withers 1994; Sulzenbacher et al. 200
4). As the first step in the conversion of BbAfcB to α-L-fucosynthase, we first attempted to identify a nucleophilic residue. It is essential to lose activity). As a result of comparing the three-dimensional structures and amino acid sequences of several known GH29 enzymes, it was suggested that Asp-703 may be a nucleophilic residue (discussed in detail later).
Asp−703をアラニン、システイン、グリシン、および、セリンに置換し、これら
変異体の加水分解活性を調べた[これらのアミノ酸残基はグリコシンターゼ化に適してい
ると言われている(Jakeman and Withers 2002)]。なお、活
性は比活性のみで表している。というのも、反応初速度が20mMの基質濃度まで直線的
に増加し、速度論的パラメータを算出できなかったためである。野生型酵素の比活性と比
較して、D703A、D703C、D703G、およびD703Sの比活性はそれぞれ1
60,000倍、46,000倍、17,000倍、および76,000倍低下した(表
2)。これらの結果から、Asp−703がBbAfcBの求核残基であることが強く示
唆された(考察および図1)。
It decreased by 60,000 times, 46,000 times, 17,000 times, and 76,000 times (Table 2). These results strongly suggested that Asp-703 is a nucleophilic residue of BbAfcB (discussion and FIG. 1).
1,3−1,4−α−L−フコシンターゼへの変換
上記で得られたBbAfcB D703変異体のグリコシンターゼ活性を調べた。20
mM FucF(β−L−フコピラノシルフルオリド)を供与体、100mM LNB(
Galβ1−3GlcNAc)を受容体として反応させたところ、D703GとD703
S変異体において、保持時間15.4分にLeaトリサッカライドに相当するピークが検
出された(図2)。しかしながら、野生型およびD703A/C変異体においては検出さ
れなかった。D703GとD703S変異体では、受容体にLacNAc(Galβ1−
4GlcNAc)を用いた際にも、保持時間14.9分にLexトリサッカライドに相当
するピークが観察された(図3)。どちらの受容体を用いた場合でも、D703Sのピー
クの方がD703Gのピークよりわずかに大きかった。以上の結果、および、D703S
の加水分解活性の方がD703Gより低いことから(表2)、以降の実験にはD703S
を使用することとした。
Conversion to 1,3-1,4-α-L-fucosynthase The glycosynthase activity of the BbAfcB D703 mutant obtained above was examined. 20
mM FucF (β-L-fucopyranosyl fluoride) as donor, 100 mM LNB (
When Galβ1-3GlcNAc) is reacted as a receptor, D703G and D703 are reacted.
In the S mutant, a peak corresponding to Lea trisaccharide was detected at a retention time of 15.4 minutes (FIG. 2). However, it was not detected in wild type and D703A / C mutants. In the D703G and D703S mutants, LacNAc (Galβ1-
When 4GlcNAc) was used, a peak corresponding to Le x trisaccharide was observed at a retention time of 14.9 minutes (FIG. 3). With either receptor, the D703S peak was slightly larger than the D703G peak. The above results and D703S
The hydrolysis activity of D703S is lower than that of D703G (Table 2).
It was decided to use.
合成反応の至適pHは5.0(2−(N−morpholino)ethanesul
fonic acid(MES)buffer)であり、その時の収量はpH7.0のと
きより2倍高かった(図4)。反応液をコロナ荷電化粒子検出器を用いた高速液体クロマ
トグラフィー(HPLC−CAD)によって分析した結果、FucF、LNB/LacN
Ac、および、酵素が存在した時にのみ合成活性が検出され、どれか1つでも反応系から
除くと、基質以外のピークは検出されないことが明らかとなった(図5、6)[120分
以降の保持時間においてもピークは検出されなかった(データ示さず)]。反応産物の薄
層クロマトグラフィー分析においても、LeaおよびLexトリサッカライドの特異的合
成が示唆された(データ示さず)。反応産物の同定については後述する。
The optimum pH for the synthesis reaction is 5.0 (2- (N-morpholino) etheresul.
Fonic acid (MES) buffer), and the yield at that time was twice as high as that at pH 7.0 (FIG. 4). As a result of analyzing the reaction solution by high performance liquid chromatography (HPLC-CAD) using a corona charged particle detector, FucF, LNB / LacN
It was revealed that synthetic activity was detected only when Ac and enzyme were present, and that any peak other than the substrate was not detected when any one of them was removed from the reaction system (FIGS. 5 and 6) [after 120 minutes. No peak was detected even at a retention time of (data not shown)]. Thin layer chromatographic analysis of the reaction products also suggested specific synthesis of Le a and Le x trisaccharides (data not shown). The identification of the reaction product will be described later.
次に、FucF濃度を20mMおよび60mMに固定し、LNB/LacNAc濃度を
変化させる(0−300mM)ことによって、速度論的パラメータを決定しようと試みた
(図7、8)。その結果、LNB/LacNAcに対する見かけのKm値はFucF依存
的に増加し、また、これらの値は2基質反応の式(Cleland 1963)に回帰す
ることが出来なかった。以上の結果から、本酵素のFucFに対する親和性が低いことが
示唆された。
Next, an attempt was made to determine the kinetic parameters by fixing the FucF concentration at 20 mM and 60 mM and changing the LNB / LacNAc concentration (0-300 mM) (FIGS. 7 and 8). As a result, the apparent K m value for LNB / LacNAc increased in a FucF-dependent manner, and these values could not be regressed to the two-substrate reaction formula (Cleland 1963). From the above results, it was suggested that the affinity of this enzyme for FucF is low.
最適化した条件下[40mM FucF(供与体),200mM LNBもしくは10
0mM LacNAc(受容体),17μM酵素]において反応の時間依存性を検討した
ところ、Leaトリサッカライドの濃度は約40分、Lexトリサッカライドの濃度は約
60分で最大に達した。両者とも、その反応効率は添加したFucFに対して56%であ
った(図9、10)。
Under optimized conditions [40 mM FucF (donor), 200 mM LNB or 10
When the time dependency of the reaction was examined in 0 mM LacNAc (receptor), 17 μM enzyme], the Le a trisaccharide concentration reached a maximum in about 40 minutes and the Le x trisaccharide concentration reached about 60 minutes. In both cases, the reaction efficiency was 56% with respect to the added FucF (FIGS. 9 and 10).
受容体特異性
様々な単糖およびオリゴ糖(100mM)を使用して、BbAfcB D703Sの受
容体特異性を調べた(表3)。本酵素は、LNBおよびLacNAcに加えてラクトース
(Lac)(Galβ1−4Glc)、2’−フコシルラクトース(2’−FL)(Fu
cα1−2Galβ1−4Glc)、およびラクト−N−テトラオース(LNT)(Ga
lβ1−3GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc)を認識し、それぞれ3−FL[
Galβ1−4(Fucα1−3)Glc]、ジフコシルラクトース(DFL)[Fuc
α1−2Galβ(Fucα1−3)1−4Glc]、ラクト−N−フコペンタオースI
I(LNFPII)[Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ
1−4Glc]を生成した。収率は、添加したFucFに対して13%、5.5%、およ
び、41%であった。しかしながら本酵素は、単糖(Gal,GalNAc,Glc,G
lcNAc)、セロビオース(Glcβ1−4Glc)、2−アセトアミド−2−デオキ
シ−4−O−(β−グルコシル)−グルコース(Glcβ1−4GlcNAc)、N,N
’−ジアセチルキトビオース (GlcNAcβ1−4GlcNAc)、および、ガラク
ト−N−ビオース(Galβ1−3GalNAc)には全く作用しなかった。以上の結果
から、本酵素は、非還元末端のLNB、LacNAc、Lac二糖構造[Galβ1−3
/4Glc(NAc)]を認識して、GlcNAc/Glc残基にα−(1→3/4)−
フコシル結合を導入することが明らかになった(図11)。
Receptor specificity The receptor specificity of BbAfcB D703S was investigated using various mono- and oligosaccharides (100 mM) (Table 3). In addition to LNB and LacNAc, this enzyme contains lactose (Lac) (Galβ1-4Glc), 2′-fucosyl lactose (2′-FL) (Fu
cα1-2Galβ1-4Glc), and lacto-N-tetraose (LNT) (Ga
lβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) and 3-FL [
Galβ1-4 (Fucα1-3) Glc], difucosyl lactose (DFL) [Fuc
α1-2Galβ (Fucα1-3) 1-4Glc], lacto-N-fucopentaose I
I (LNFPII) [Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAcβ1-3Galβ
1-4Glc]. Yields were 13%, 5.5%, and 41% based on added FucF. However, this enzyme is a monosaccharide (Gal, GalNAc, Glc, G
lcNAc), cellobiose (Glcβ1-4Glc), 2-acetamido-2-deoxy-4-O- (β-glucosyl) -glucose (Glcβ1-4GlcNAc), N, N
'-Diacetylchitobiose (GlcNAcβ1-4GlcNAc) and galacto-N-biose (Galβ1-3GalNAc) did not act at all. From the above results, this enzyme has non-reducing terminal LNB, LacNAc, Lac disaccharide structure [Galβ1-3
/ 4Glc (NAc)] and α- (1 → 3/4) − to the GlcNAc / Glc residue.
It was revealed that a fucosyl bond was introduced (FIG. 11).
反応産物の分析
1,3−1,4−α−L−フコシンターゼの位置特異性および立体特異性を証明するた
め、反応産物を精製してエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI−MS)、および
、1H−,13C−核磁気共鳴分光法(NMR)を用いて分析した。MSスペクトルの結
果は、LNBおよびLacNAcにフコシル基が一カ所導入されたことを示していた(ナ
トリウム付加物[M+Na]+の計算値は552.19、実測値は552.18)。1H
および13C NMRスペクトルは、LeaおよびLexトリサッカライド標準品のスペ
クトルと一致した(データ示さず)。受容体にLNTを用いた場合では、LNFP II
[Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc]のみ
が合成され、ラクト−N−フコペンタオース V[Galβ1−3GlcNAcβ1−3
Galβ1−4(Fucα1−3)Glc]やラクト−N−ジフコヘキサオース II[
Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−
3)Glc、LNDFH II]は合成されなかった(データ示さず)。以上の結果によ
り、本シンターゼの特異性が証明された。
To demonstrate the position specificity and stereospecificity of the
And 13 C NMR spectra were consistent with those of Le a and Le x trisaccharide standards (data not shown). When LNT is used as a receptor, LNFP II
Only [Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc] was synthesized and lacto-N-fucopentaose V [Galβ1-3GlcNAcβ1-3
Galβ1-4 (Fucα1-3) Glc] and lacto-N-difucohexaose II [
Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAcβ1-3Galβ1-4 (Fucα1-
3) Glc, LNDFH II] was not synthesized (data not shown). From the above results, the specificity of the synthase was proved.
(考察)
BbAfcBの求核残基D703
GH29は、そのアミノ酸配列の系統樹解析により2つのサブファミリーに分類されて
おり、この分類は明らかに両グループの基質特異性の差異と相関している(Ashida
et al.2009)。一つ目のサブファミリー(GH29−A)は、ヒトやThe
rmotoga maritima由来の酵素によって代表されるように、比較的広い基
質特異性を示し、4−ニトロフェニル−α−L−フコピラノシド(pNP−α−Fuc)
にも作用する酵素群から構成される(Liu et al.2009a;Sulzenb
acher et al.2004)。これとは対照的に、もう一つのサブファミリー(
GH29−B)に属する酵素は、非還元末端に存在するα−(1→3)−およびα−(1
→4)−フコシル結合のみを特異的に切断し、pNP−α−Fucには作用しない。Bb
AfcBはGH29−Bサブファミリーに分類される(Ashida et al.20
09)。最近、B.longum subsp.infantis ATCC15697
由来の1,3−1,4−α−L−フコシダーゼホモログ(BiAfcB,GH29−B)
の結晶構造が決定された(PDB code:3MO4)。その立体構造はT.mari
tima(TmFuc)(GH29−A)のα−L−フコシダーゼ(PDB code:
1ODU)と類似性を示し[the root mean square devia
tion=3.5オングストローム(289 Cα原子に対して);Zスコア=28.5
;配列一致性=24%](Holm and Park 2000)、特に、−1サブサ
イトの構造が極似していた。TmFucの求核残基Asp−224(Sulzenbac
her et al.2004)は、立体構造上でBiAfcBのAsp−172とよく
重なり、BiAfcBのAsp−172は、アミノ酸配列のアライメントにおいてBbA
fcBのAsp−703に対応していた(図1)。これらの知見、および、変異体解析の
結果から、BbAfcBの求核残基はAsp−703であると結論づけた。
(Discussion)
Nucleophilic residue D703 of BbAfcB
GH29 has been classified into two subfamilies by phylogenetic analysis of its amino acid sequence, which clearly correlates with differences in substrate specificity between the two groups (Ashida).
et al. 2009). The first subfamily (GH29-A) is human and The
4-nitrophenyl-α-L-fucopyranoside (pNP-α-Fuc), which exhibits relatively broad substrate specificity, as typified by the enzyme from Rmotoga maritima
(Liu et al. 2009a; Sulzenb)
acher et al. 2004). In contrast, another subfamily (
The enzymes belonging to GH29-B) are α- (1 → 3)-and α- (1
→ 4) Specifically cleaves only the -fucosyl bond and does not act on pNP-α-Fuc. Bb
AfcB is classified into the GH29-B subfamily (Ashida et al. 20
09). Recently, longum subsp. infantis ATCC15697
1,3-1,4-α-L-fucosidase homologue from origin (BiAfcB, GH29-B)
Was determined (PDB code: 3MO4). Its three-dimensional structure is T.W. mari
α-L-fucosidase (PDB code) of tima (TmFuc) (GH29-A):
1 ODU) [the root mean square device
tion = 3.5 angstrom (for 289 C α atom); Z-score = 28.5
Sequence identity = 24%] (Holm and Park 2000), especially the -1 subsite structure was very similar. Nucleophilic residue Asp-224 of TmFuc (Sulzenbac
her et al. 2004) overlaps with BiAfcB Asp-172 in conformation, and BiAfcB Asp-172 has a BbA in amino acid sequence alignment.
It corresponded to Asp-703 of fcB (FIG. 1). From these findings and the results of mutant analysis, it was concluded that the nucleophilic residue of BbAfcB is Asp-703.
1,3−1,4−α−L−フコシンターゼ
D703GおよびD703SはLeaとLexトリサッカライド合成活性を示したのに
対し、D703AおよびD703Cは示さなかった。この結果は、BbAfcBのグリコ
シンターゼ化には、変異体の残存加水分解活性や置換残基の側鎖の大きさが関係しないこ
とを示唆している(表2)。それゆえ、グリコシンターゼ化を行う上で求核残基をどのア
ミノ酸残基に置換するのが適当であるかという疑問に対する答えは、Cobucci−P
onzano et al.(2009)が示唆しているように、目的の酵素に依存して
いるのであろう。
1,3-1,4-α-L-fucosynthase D703G and D703S showed Le a and Le x trisaccharide synthesizing activities, whereas D703A and D703C did not. This result suggests that the glycosylation of BbAfcB is not related to the residual hydrolysis activity of the mutant or the side chain size of the substituted residue (Table 2). Therefore, the answer to the question of which amino acid residue is appropriate for replacing a nucleophilic residue in performing glycosynthaseation is Cobucci-P
onzano et al. (2009) suggests that it depends on the target enzyme.
合成反応において、2基質反応の式に適合する速度論的パラメータは、今回の実験条件
下では得られなかった。このことは、本シンターゼの基質に対する親和性の低さを示唆し
ている。変異体は、添加したFucF量に対して約60%の収率でLeaおよびLexト
リサッカライドを合成した。この反応効率は典型的なグリコシンターゼ(80%以上)よ
りわずかに低いと思われるが、これは、反応中にFucFが自然分解したためと考えられ
る(Wada et al.2008)。
In the synthesis reaction, no kinetic parameters that fit the two-substrate reaction equation were obtained under the current experimental conditions. This suggests that the synthase has a low affinity for the substrate. The mutant synthesized Le a and Le x trisaccharides in a yield of about 60% based on the amount of FucF added. This reaction efficiency appears to be slightly lower than typical glycosynthase (over 80%), which may be due to spontaneous degradation of FucF during the reaction (Wada et al. 2008).
近年、Cobucci−Ponzanoら(2009)はSulfolobus so
lfataricus由来(SsFuc D242S)およびT.maritima由来
(TmFuc D224G)の2種のα−L−フコシンターゼを作製した(両酵素ともG
H29−Aサブファミリーに属している)。これら2種のフコシンターゼは、β−L−フ
コピラノシルアザイド(FucN3)(水溶液中ではFucFに比べてかなり安定)を糖
供与体に利用することが可能であり、その反応効率は、受容体の種類により変動するもの
の(30−90%)、最大でFucN3に対して90%まで到達した。BbAfcB D
703変異体は、検討した条件下においてはFucN3を供与体として利用できず、また
、アザイドによってその活性はレスキューされなかった(データ示さず)。
In recent years, Cobucci-Ponzano et al. (2009) have reported that Sulfolobus so
from lfataricus (SsFuc D242S) and T. Two α-L-fucosynthases derived from maritima (TmFuc D224G) were prepared (both enzymes were G
Belongs to the H29-A subfamily). These two fucosynthases can utilize β-L-fucopyranosyl azide (FucN 3 ) (which is considerably more stable than FucF in aqueous solution) as a sugar donor, and the reaction efficiency is although varying according to the type of body (30-90%), reaching up to 90% with respect to FucN 3 at maximum. BbAfcB D
703 variants, not available FucN 3 as donors under the conditions studied, also, its activity (data not shown) were not rescued by azide.
基質特異性
位置特異性および受容体特異性の高さは、オリゴ糖を精密合成する際に、特に重要な決
定因子であり、その点で、酵素合成法は化学合成法よりも有効である場合が多い。これま
でに、Alcaligenes sp.、Aspergillus niger、Pen
icillium multicolor、および、T.maritima由来の立体保
持型α−L−フコシダーゼにおいて、糖供与体にpNP−Fucを利用した糖転移反応に
よるフコシルオリゴ糖の合成が行われてきた(Ajisaka et al.1998;
Murata et al.1999;Farkas et al.2000;Osa
njo et al.2007)。また、上述したように、近年、TmFuとSsFuc
がグリコシンターゼ化された(Cobucci−Ponzano et al.2009
)。これらの酵素もしくは変異体は、様々な受容体に効率的にα−L−フコシル結合を導
入することが出来るが、GH29−Aに属しているため(いくつかの酵素についての遺伝
子情報は得られていないが、pNP−Fucに対して活性があることから推察できる)、
本質的に、位置および受容体の選択的制御が出来ない。例えば、TmFucをpNP−α
−Fuc(供与体)およびpNP−β−Gal(受容体)と反応さて糖転移反応を行うと
、Fucα1−3Fucα−pNP およびFucα1−2Galβ−pNPの混合物が
得られることが知られている(Osanjo et al.2007)。また、SsFu
cのグリコシンターゼ変異体は、供与体にFucN3、および、受容体にGalβ−pN
Pを用いると、Fucα1−6Galβ−pNP、Fucα1−3Galβ−pNP、F
ucα1−4Galβ−pNP、および、Fucα1−2(Fucα1−3)Galβ−
pNPを生じることが報告されている(Cobucci−Ponzano et al.
2009)。
Substrate specificity Positional specificity and high receptor specificity are particularly important determinants in the precise synthesis of oligosaccharides, in which case enzyme synthesis is more effective than chemical synthesis There are many. To date, Alcaligenes sp. , Aspergillus niger, Pen
icillium multicolor, and T. In steric retention α-L-fucosidase derived from maritima, fucosyl oligosaccharides have been synthesized by a transglycosylation reaction using pNP-Fuc as a sugar donor (Ajisaka et al. 1998;
Murata et al. 1999; Farkas et al. 2000; Osa
njo et al. 2007). In addition, as described above, in recent years, TmFu and SsFuc
Was glycosynthated (Cobucci-Ponzano et al. 2009).
). These enzymes or mutants can efficiently introduce α-L-fucosyl bonds to various receptors, but belong to GH29-A (gene information on some enzymes is available) But can be inferred from its activity against pNP-Fuc)
Essentially, there is no selective control of position and receptors. For example, TmFuc is changed to pNP-α
It is known that a mixture of Fucα1-3Fucα-pNP and Fucα1-2Galβ-pNP can be obtained by performing a transglycosylation reaction by reacting with -Fuc (donor) and pNP-β-Gal (acceptor) (Osanjo et al. 2007). SsFu
The glycosynthase variant of c is FucN 3 as donor and Galβ-pN as acceptor.
When P is used, Fucα1-6Galβ-pNP, Fucα1-3Galβ-pNP, F
ucα1-4Galβ-pNP and Fucα1-2 (Fucα1-3) Galβ-
It has been reported to produce pNP (Cobucci-Ponzano et al.
2009).
本研究では、BbAfcBのグリコシンターゼ化により、特異的かつ効率的にLeaお
よびLexトリサッカライドを合成することに成功した。特筆すべきはその厳密な受容体
特異性である。本酵素は、非還元末端に存在するLNB、LacNAc、Lacの二糖構
造[Galβ1−3/4GlcNAc(Glc)]のみを受容体として認識し、単糖はG
lcNAcでさえ認識しない。現在、BbAfcBの立体構造情報がないので(類縁酵素
BiAfcBにおいても、(+)サブサイトを形成するループ構造が決定できていない)
、本酵素の受容体特異性について説明することが出来ないが、以前の報告にあるように(
Sugimura et al.2006)、様々な基質を利用して受容体特異性を調べ
ることで、(+)サブサイトの特性についての有用な情報を得ることが出来た。つまり、
BbAfcBはGlc/GlcNAc残基のサブサイト(GalNAc残基は認識しない
)の隣に、枝分かれしたGal残基を収容できるサブサイト(GlcNAc/Glc残基
は認識しない)があると推察された(表3、図11)。ここで、LNBとLacNAc(
Lac)では、GlcNAc環の面が反転しており、そのためにそれぞれのGlcNAc
残基のO4およびO3の水酸基の立***置が同一となることに注目すべきである(図11
)。非還元末端Galβ1−3/4GlcNAc(Glc)二糖を認識することによって
、本酵素は特異的にGlcNAc(Glc)のO3/O4位にα−L−フコシル基を導入
する。GlcNAc/Glc残基のフコシル化部位の隣の位置する環外官能基の大きさ(
−NHCOCH3,−CH2OH,−OH)が反応効率に影響すると考えられた(表3、
図11)。このような位置特異性および受容体特異性は、本酵素BbAfcB D703
Sのユニークの特性であり、GH29−Aサブファミリーに属する他のα−L−フコシダ
ーゼを利用することでは確立できなかったであろうと思われる。
In this study, we succeeded in synthesizing Le a and Le x trisaccharides specifically and efficiently by glycosynthaseization of BbAfcB. Of particular note is its strict receptor specificity. This enzyme recognizes only LNB, LacNAc, and Lac disaccharide structures [Galβ1-3 / 4GlcNAc (Glc)] present at the non-reducing end as a receptor, and the monosaccharide is G
Even lcNAc is not recognized. Currently, there is no three-dimensional structure information of BbAfcB (the loop structure forming the (+) subsite has not been determined even in the related enzyme BiAfcB)
, We cannot explain the receptor specificity of this enzyme, but as previously reported (
Sugimura et al. 2006), useful information about the characteristics of the (+) subsite could be obtained by examining receptor specificity using various substrates. That means
It was speculated that BbAfcB has a subsite (not recognizing GlcNAc / Glc residues) that can accommodate a branched Gal residue next to a subsite of Glc / GlcNAc residues (not recognizing GalNAc residues) (Table 1). 3, FIG. 11). Here, LNB and LacNAc (
In Lac), the face of the GlcNAc ring is inverted, so that each GlcNAc
It should be noted that the steric positions of the hydroxyl groups of the residues O4 and O3 are the same (FIG. 11).
). By recognizing the non-reducing terminal Galβ1-3 / 4GlcNAc (Glc) disaccharide, the enzyme specifically introduces an α-L-fucosyl group at the O3 / O4 position of GlcNAc (Glc). Size of the exocyclic functional group located next to the fucosylation site of the GlcNAc / Glc residue (
-NHCOCH 3, -CH 2 OH, -OH ) is thought to affect the reaction efficiency (Table 3,
FIG. 11). Such positional specificity and receptor specificity are attributed to the enzyme BbAfcB D703.
It is a unique characteristic of S, and it seems that it could not be established by using other α-L-fucosidases belonging to the GH29-A subfamily.
本酵素は受容体に2’−FL(Fucα1−2Galβ1−4Glc)を利用し、効率
は良くないがDFL[Fucα1−2Galβ(Fucα1−3)1−4Glc]を特異
的に合成した。また、本酵素はLNT(Galβ1−3GlcNAcβ1−3Galβ1
−4Glc)を受容体とした場合に、LNFP II[Galβ1−3(Fucα1−4
)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc]を合成した。LNTにはフコシル化可能
な部位が2つ存在するが、単離した産物を分析したところ、LNFP IIしか検出され
なかった。このことは、野生型のBbAfcBをLNDFH II[Galβ1−3(F
ucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc]に作用
させた場合、Fucα1−3Glc結合よりもFucα1−4GlcNAc結合を約10
0倍早く切断するという事実と良く一致していた(データ示さず)。
This enzyme uses 2′-FL (Fucα1-2Galβ1-4Glc) as a receptor and specifically synthesizes DFL [Fucα1-2Galβ (Fucα1-3) 1-4Glc] although it is not efficient. In addition, this enzyme is LNT (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1
-4Glc) as a receptor, LNFP II [Galβ1-3 (Fucα1-4
) GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc] was synthesized. LNT has two sites capable of fucosylation, but when the isolated product was analyzed, only LNFP II was detected. This indicates that wild-type BbAfcB is converted to LNDFH II [Galβ1-3 (F
ucα1-4) GlcNAcβ1-3Galβ1-4 (Fucα1-3) Glc] causes about 10 Fucα1-4GlcNAc binding rather than Fucα1-3Glc binding.
It was in good agreement with the fact that it cuts 0 times faster (data not shown).
BbAfcB D703S変異体を利用すれば、様々な複合糖質糖鎖の非還元末端のI
型およびII型構造に、極めて特異的に、意図しないフコシル基を導入することなく、L
eaおよびLex抗原を形成することが可能となる。また、1,3−1,4−α−L−フ
コシンターゼ、および、我々がすでに開発している1,2−α−L−フコシンターゼ(W
ada et al.2008)を組み合わせることで、すべてのタイプのルイス糖を合
成することが可能となるかも知れない。
If the BbAfcB D703S mutant is used, the non-reducing end I of various glycoconjugate sugar chains
Without specific introduction of unintended fucosyl groups into the type II and type II structures
it is possible to form a e a and Le x antigen. In addition, 1,3-1,4-α-L-fucosynthase and 1,2-α-L-fucosynthase (W
ada et al. 2008) may be able to synthesize all types of Lewis sugars.
(まとめ)
ルイスa(Lea)[Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc]およびルイス
x(Lex)[Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc]血液型抗原決定基は、
複合糖質糖鎖の非還元末端に存在し、様々な生命現象に関わっている.それゆえ、これら
抗原の効率的な合成方法を確立することは、糖鎖の機能研究において極めて重要である。
我々は、Bifidobacterium bifidum由来1,3−1,4−α−L
−フコシダーゼの求核残基変異体D703Sが、供与体にβ−L−フッ化フコース(Fu
cF)および受容体にラクト−N−ビオースI(Galβ1−3GlcNAc)あるいは
N−アセチルラクトサミン(Galβ1−4GlcNAc)を用いた場合に、添加したF
ucF濃度に対して56%の効率でLeaとLexトリサッカライドを合成することを見
出した。また、本酵素は受容体としてラクトース(Galβ1−4Glc)、2’−フコ
シルラクトース(Fucα1−2Galβ1−4Glc)、ラクト−N−テトラオース(
Galβ1−3GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc)を認識し、それぞれ3−フ
コシルラクトース[Galβ1−4(Fucα1−3)Glc]、ジフコシルラクトース
[Fucα1−2Galβ(Fucα1−3)1−4Glc]、ラクト−N−フコペンタ
オースII [Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4
Glc]を特異的に合成した。しかしながら、単糖、セロビオース(Glcβ1−4Gl
c)、Glcβ1−4GlcNAc、N,N’−ジアセチルキトビオース(GlcNAc
β1−4GlcNAc)、ガラクト−N−ビオース(Galβ1−3GalNAc)は受
容体にはならなかった。すなわち、本酵素は、非還元末端に存在する二糖構造[Galβ
1−3/4GlcNAc(Glc)]を特異的に認識し、GlcNAc/Glc残基の3
位もしくは4位にフコシル基を特異的に導入することを明らかとした。本酵素(1,3−
1,4−α−L−フコシンターゼ)の高い位置特異性および受容体特異性は極めてユニー
クであり、I型およびII型糖鎖構造にそれぞれLeaおよびLex抗原決定基を導入す
るための極めて有用なツールとなることが示唆された。
(Summary)
Lewis a (Le a ) [Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAc] and Lewis x (Le x ) [Galβ1-4 (Fucα1-3) GlcNAc] blood group antigenic determinants are
It exists at the non-reducing end of glycoconjugates and is involved in various life phenomena. Therefore, establishing an efficient method for synthesizing these antigens is extremely important in the study of sugar chain functions.
We have 1,3-1,4-α-L derived from Bifidobacterium bifidum
-Fucosidase nucleophilic residue mutant D703S has β-L-fluorinated fucose (Fu
cF) and F-added when lacto-N-biose I (Galβ1-3GlcNAc) or N-acetyllactosamine (Galβ1-4GlcNAc) is used as the receptor
We have found that Le a and Le x trisaccharides are synthesized with an efficiency of 56% relative to the ucF concentration. In addition, this enzyme has lactose (Galβ1-4Glc), 2′-fucosyl lactose (Fucα1-2Galβ1-4Glc), lacto-N-tetraose (
Recognize Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc), 3-fucosyl lactose [Galβ1-4 (Fucα1-3) Glc], difucosyl lactose [Fucα1-2Galβ (Fucα1-3) 1-4Glc], lacto-N-, respectively. Fucopentaose II [Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAcβ1-3Galβ1-4
Glc] was specifically synthesized. However, the monosaccharide cellobiose (Glcβ1-4Gl
c), Glcβ1-4GlcNAc, N, N′-diacetylchitobiose (GlcNAc
β1-4GlcNAc), galacto-N-biose (Galβ1-3GalNAc) did not become receptors. That is, this enzyme has a disaccharide structure [Galβ existing at the non-reducing end.
1-3 / 4GlcNAc (Glc)] is specifically recognized and 3 of the GlcNAc / Glc residues
It was clarified that a fucosyl group was specifically introduced into position 4 or position 4. This enzyme (1,3-
1,4-α-L-fucosynthase) is highly unique and highly unique for introducing Le a and Le x antigenic determinants into type I and type II carbohydrate structures, respectively. It was suggested that it would be a useful tool.
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本発明は、LeaおよびLex抗原を含む様々な糖鎖の特異的な製造に有用である。 The present invention is useful for the specific production of various sugar chains including Le a and Le x antigens.
Claims (7)
Gal−Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入する活性が以下(a)および(b)からなる群より選ばれる活性である、タンパク質:
(a)ラクト−N−ビオースI〔Galβ1−3GlcNAc〕、またはラクト−N−ビオースI〔Galβ1−3GlcNAc〕を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスa抗原〔Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc〕、またはルイスa抗原〔Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc〕を非還元末端に有する糖鎖を生成する活性;および
(b)N−アセチルラクトサミン〔Galβ1−4GlcNAc〕、またはN−アセチルラクトサミン〔Galβ1−4GlcNAc〕を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスx抗原〔Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc〕、またはルイスx抗原〔Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc〕を非還元末端に有する糖鎖を生成する活性。 An amino acid sequence having at least 90% or more amino acid sequence identity to the amino acid sequence in which the aspartic acid at position 703 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is substituted with glycine or serine (however, represented by SEQ ID NO: 2 A protein having an activity of introducing a fucosyl group into Gal-Glc or a derivative thereof .
A protein whose activity of introducing a fucosyl group into Gal-Glc or a derivative thereof is selected from the group consisting of the following (a) and (b):
(A) A fucosyl group is introduced into a sugar chain having lacto-N-biose I [Galβ1-3GlcNAc] or lacto-N-biose I [Galβ1-3GlcNAc] at the non-reducing end, and Lewis a antigen [Galβ1- 3 (Fucα1-4) GlcNAc], or the activity of producing a sugar chain having a Lewis a antigen [Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAc] at the non-reducing end; and
(B) A fucosyl group is introduced into a sugar chain having N-acetyllactosamine [Galβ1-4GlcNAc] or N-acetyllactosamine [Galβ1-4GlcNAc] at the non-reducing end, and Lewis x antigen [Galβ1-4 ( Fucα1-3) GlcNAc] or Lewis x antigen [Galβ1-4 (Fucα1-3) GlcNAc] has an activity of generating a sugar chain having a non-reducing end.
当該製造方法が以下(a)および(b)からなる群より選ばれる方法である、製造方法:
(a)ラクト−N−ビオースI〔Galβ1−3GlcNAc〕、またはラクト−N−ビオースI〔Galβ1−3GlcNAc〕を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスa抗原〔Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc〕、またはルイスa抗原〔Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc〕を非還元末端に有する糖鎖を生成する方法;および
(b)N−アセチルラクトサミン〔Galβ1−4GlcNAc〕、またはN−アセチルラクトサミン〔Galβ1−4GlcNAc〕を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスx抗原〔Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc〕、またはルイスx抗原〔Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc〕を非還元末端に有する糖鎖を生成する方法。 Claim 1 or 2 Keru you in the presence of a protein according to a fucosylated Gal-Glc A production method of a derivative,
The production method is a method selected from the group consisting of the following (a) and (b):
(A) A fucosyl group is introduced into a sugar chain having lacto-N-biose I [Galβ1-3GlcNAc] or lacto-N-biose I [Galβ1-3GlcNAc] at the non-reducing end, and Lewis a antigen [Galβ1- 3 (Fucα1-4) GlcNAc], or a method for producing a sugar chain having a Lewis a antigen [Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAc] at the non-reducing end; and
(B) A fucosyl group is introduced into a sugar chain having N-acetyllactosamine [Galβ1-4GlcNAc] or N-acetyllactosamine [Galβ1-4GlcNAc] at the non-reducing end, and Lewis x antigen [Galβ1-4 ( Fucα1-3) GlcNAc] or Lewis x antigen [Galβ1-4 (Fucα1-3) GlcNAc] at a non-reducing terminal.
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