JP5832537B2 - 試料の強調視覚評価 - Google Patents
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Description
本出願は、2010年8月5日に出願された米国仮特許出願第61/371,151号の優先権を主張するものであり、その全内容を参照により本明細書に組み込む。
概して、従来のエオシン染色プロトコールは、試料に著しい量のエオシンを適用して、エオシンが結合する化合物および構造体の高感度な検出および定量的測定を可能にするように設計されている。本明細書で使用するとき、「従来の明視野H&E撮像」は、生物学的試料をヘマトキシリンおよびエオシンで染色して、病理学者による視覚検査のための試料の明視野画像を生み出すプロセスを指す。使用するエオシンの量は、電磁スペクトルの緑色領域において光を吸収し、エオシン染色領域がピンク色に見える画像を生み出すのに十分に多い。上で説明したように、そのような分量のエオシンの使用は、正確な定量測定値をもたらすことが観察されている一方で、適用されたエオシンは、存在しうる他の染色剤および/またはIFマーカーからの蛍光発光と干渉する。しかしながら、標準的な発色染色プロトコールにおいて適用されるエオシンの量と比較して、試料に適用されるエオシンの量を大幅に減らした場合、エオシンは、蛍光核染色剤およびIFマーカーと組み合わせて首尾よく使用されうることが分かっている。驚くべきことに、エオシンの量を著しく減らしたとしても、エオシン成分に関連付けられた測定の空間的および定量的な精度には影響しない。さらに、エオシンが大量に適用された場合に存在するであろう著しい混同作用なしに、蛍光染色剤および/またはIF標識からの寄与の測定を実施することができる。
OD (Red) = Kred * C
ここで、Cは、成分信号強度であり、Kredは、成分についての吸収係数である。ステップ5150でこの計算が実施されて、特定の色チャネル(たとえば、赤色)に関連付けられた光学濃度を決定する。
LUTi = { (Tr / 255)i /255, (Tg / 255) i /255 , (Tb / 255) i /255 }
ここで、LUTiは、テーブル(たとえば、256要素テーブル)におけるi番目のエントリであり、Tr、Tg、およびTbは、標的色のRGB値であり、色は、{255, 255, 255}に相当する白色に対して0〜255段階上で表されている。
さまざまなシステムおよび技法を使用して、スペクトル画像を得て、スペクトル画像キューブを形成することができる。たとえば、いくつかの実施形態において、照明光のある範囲の波長が試料に届くことを可能にする、および/または試料からの光のある範囲の波長が撮像デバイスに届くことを可能にするための、1つまたは複数の波長選択フィルタリング素子を備えた撮像デバイス(たとえば、CCDカメラなどのカメラ)を使用することによって、スペクトル画像を得ることができる。照明光および/または試料からの光の異なる範囲の波長が通るのを可能にするように、1つまたは複数の波長選択フィルタリング素子を変化させることによって、試料の複数の2次元画像を得ることが可能となり、2次元画像のいくつかまたは全部は、異なる照明波長および/または測定波長に対応する。
スペクトル非混合は、試料中に存在するいくつかの成分のそれぞれの量の定量的な推定値を提供するために、画像キューブに実施される数学的演算である。いくつかの実施形態において、スペクトル非混合技法は、試料成分のスペクトル特性に関する情報を含む、1つまたは複数のスペクトルライブラリを参照する。通常、スペクトル非混合技法は、画像キューブの2つの空間次元のそれぞれに沿った各画素に適用される。非混合演算の結果は、試料中に存在する成分のそれぞれ(たとえば、化学的実体および/または化学的状態)の高分解能マップである。
S(x, y, k) = a(x, y)・F(λk) + b(x, y)・G(λk) (1)
ここで、λkは、所与の波長(または波長帯域)を表すために使用される。関数a(x, y)およびb(x, y)は、試料中の2つの異なるスペクトル源からのスペクトル寄与の空間存在量を表す。
S(λk) = aF(λk) + bG(λk) (2)
A = E-1S (3)
であり、ここで、Aは、成分aおよびbを有する列ベクトルであり、Eは、その列がスペクトル固有状態、すなわち[F G]である、行列である。
Ua (λk) = S(λk) - aF(λk ) (5)
として定義し、次いであらゆるスペクトルチャネルにおいて非負値を有するUa(λk)と一致するパラメータaの最も大きい値を選択する。次いで結果として生じたスペクトルUa(λk)を、第1のスペクトル源Fに起因して寄与の抹消した、信号スペクトルとして使用する。上に挙げた厳密な非負基準には基づかないが、小さな負の分布を組み入れたなんらかの関連した基準に基づいて、パラメータaを決定して、測定システムにおけるショット雑音または検出器雑音などの考慮すべき事項を説明することもまたできる。最大量のスペクトル源Fを取り除くための最適化基準の追加の例は、異なる誤差関数を使用することを含む。
Ub(λk) = S(λk) - bG(λk ) (6)
として計算することができ、ここで、あらゆるスペクトルチャネルにおいて非負値を有するUb(λk)と一致するパラメータbの最も大きい値を選択する。
試料からの情報を収集し、処理し、分析し、解釈し、表示するためのさまざまな方法と関連して上で説明したステップは、標準的なプログラミング技法を使用して、コンピュータプログラムにおいて実装されてよく、ステップは、スペクトル非混合に関連付けられたステップ、および試料の合成吸収画像を作成するステップを含む。そのようなプログラムは、プログラマブルコンピュータまたは特殊設計された集積回路上で実行するように設計されており、コンピュータまたは集積回路のそれぞれは、電子プロセッサ、データ記憶システム(メモリおよび/または記憶素子を含む)、少なくとも1つの入力デバイス、およびディスプレイまたはプリンタなどの少なくとも1つの出力デバイスを含む。プログラムコードを、入力データ(たとえば、検出器からの画像)に適用して、本明細書で説明した機能を実施し、ディスプレイデバイスを含むユーザインターフェースなどの1つまたは複数の出力デバイスに適用される出力情報(たとえば、試料成分の寄与を示す画像、複数の成分画像のオーバーレイなど)を生成する。そのような各コンピュータプログラムは、高水準手続き言語もしくはオブジェクト指向プログラミング言語、またはアセンブリ言語もしくは機械語で実装されてよい。さらに、言語は、コンパイラ型言語またはインタプリタ型言語であってよい。そのような各コンピュータプログラムは、コンピュータ可読記憶媒体(たとえば、CD ROMまたは磁気ディスケット)に記憶されてよく、コンピュータによって読み込まれるときに、コンピュータのプロセッサに、本明細書で説明した分析機能および制御機能を実施させてよい。
本開示は、特許請求の範囲を限定することを意図しない、以下の実施例を含む。この開示において、用語エオシンは、エオシンY、エオシンB、フロキシンB、およびこれらのうちのいずれかと同様に生物学的構造を染色する(そのような構造は、エオシン好性として知られている)化合物のいずれか、ならびにそのような化合物のいずれかの混合物を意味するように使用される。エオシンYは、フルオレセインのテトラブロモ誘導体であり、エオシンBは、フルオレセインのジブロモジニトロ誘導体である。その脱プロトン化体において、エオシンYは、2-(2,4,5,7-テトラブロモ-6-オキシド-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)安息香酸(CAS番号17372-87-1)として表すことができる。エオシンYは、4',5'-ジブロモ-3',6'-ジヒドロキシ-2',7'-ジニトロ-1-スピロ[イソベンゾフラン-3,9'-キサンテン]オン(CAS番号548-24-3)として表すことができる。フロキシンBは、二ナトリウム2',4',5',7'-テトラブロモ-4,5,6,7-テトラクロロ-3-オキソスピロ[2-ベンゾフラン-1,9'-キサンテン]-3',6'-ジオラート(CAS番号18472-87-2)として表すことができる。以下の実施例において、これらのより固有の用語が、使用される固有の化合物を表すために、いくつかのケースにおいて使用される。
いくつかの実施形態を説明してきた。それでもなお、本開示の趣旨および範囲から逸脱せずに、さまざまな修正形態が行われてよいことが理解されるだろう。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。
102 光源
104 光調整光学部品
106 照明ステージ
108 試料
110 光収集光学部品
112 検出器
114 電子制御システム
116 プロセッサ
118 ディスプレイデバイス
120 ユーザインターフェース
122 光
124 入射光
126 放射光
128 出力光
130 電気通信線
132 電気通信線
134 電気通信線
136 電気通信線
138 電気通信線
Claims (34)
- 生物学的試料を撮像するための方法であって、
a.エオシンおよび少なくとも1つの追加の染色剤を含む第1の染色剤で前記試料を染色するステップと、
b.前記染色剤のそれぞれが蛍光を発光するように、前記試料に励起光を向けるステップであって、前記試料におけるエオシンの量が、前記励起光に応答した前記エオシンによる、検出可能な蛍光を生み出すのに十分である、励起光を向けるステップと、
c.前記試料における前記染色剤から発光した前記蛍光の画像を記録するステップと
を含み、
d.前記試料におけるエオシンの量は、前記試料が緑色波長において0.10未満の平均光学濃度を有するように十分に希釈されている、
方法。 - 前記試料におけるエオシンの量は、前記試料が緑色波長において0.05未満の平均光学濃度を有するように十分に希釈されている、請求項1に記載の方法。
- エオシンを含む前記第1の染色剤で前記試料を染色する前記ステップが、前記試料を溶液100mLにつきエオシン0.01g以下のエオシン濃度を有する溶液に1秒以下の間接触させるステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記試料におけるエオシンの量が、前記励起光に応答した前記エオシンによる、検出可能な蛍光を生み出すのに十分である、請求項1に記載の方法。
- 前記緑色波長が、530nmから570nmまでである、請求項1に記載の方法。
- 前記エオシンが、エオシンY、エオシンB、およびフロキシンのうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記記録された画像が、異なるスペクトル帯域にスペクトル的に分解される、請求項1に記載の方法。
- 前記緑色波長のうちの少なくともいくつかが、前記染色剤のそれぞれ1つに対する蛍光波長範囲に対応する、請求項5に記載の方法。
- 前記生物学的試料が、血液、細胞、または組織切片を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの追加の染色剤が、蛍光性の核対比染色剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記蛍光性の核対比染色剤が、DAPIまたはHoechstを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの追加の染色剤が、少なくとも1つの免疫蛍光染色剤をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記免疫蛍光染色剤が、量子ドットを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記励起光を向ける前記ステップが、異なるスペクトル帯域において、前記試料に励起光を順次向けるステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記蛍光の画像を記録する前記ステップが、複数の異なるスペクトル帯域のそれぞれにおける前記蛍光の画像を記録するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記試料に関する情報を得るために、前記記録された画像をコンピュータによって処理するステップをさらに含む請求項1に記載の方法。
- 前記記録された画像を処理する前記ステップが、前記記録された画像を非混合画像にスペクトル的にアンミックスするステップを含み、それぞれの非混合画像が、前記染色剤のそれぞれ1つからの蛍光に対応する、請求項16に記載の方法。
- 前記記録された画像を処理する前記ステップが、前記記録された蛍光画像から前記試料の明視野画像を生成するステップを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記明視野画像が、エオシンを局在化する前記試料の領域に対応するピンク色領域と、核を含む前記試料の領域に対応する青色領域とを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記明視野画像が、免疫蛍光染色剤を局在化する前記試料の領域に対応するためにレンダリングされた追加の領域をさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 前記試料に関する前記情報を出力するステップをさらに含む請求項16に記載の方法。
- 前記出力された情報が、前記記録された画像から引き出された合成画像を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記緑色波長における前記試料の前記平均光学濃度と、赤色波長における前記試料の平均光学濃度との差が、0.08以下である、請求項1に記載の方法。
- 前記赤色波長が、610nmから650nmまでである、請求項23に記載の方法。
- 前記試料の前記平均光学濃度に対する前記エオシンの寄与が、0.05未満である、請求項1に記載の方法。
- 生物学的試料を撮像するための方法であって、
a.エオシン、核対比染色剤、および少なくとも1つの免疫蛍光染色剤を含む第1の染色剤で前記試料を染色するステップであって、前記試料におけるエオシンの量は、前記試料が緑色波長において0.10未満の平均光学濃度を有するように十分に希釈されている、染色するステップと、
b.前記染色剤のそれぞれが蛍光を発光するように、前記試料に励起光を向けるステップであって、前記試料におけるエオシンの量が、前記励起光に応答した前記エオシンによる、検出可能な蛍光を生み出すのに十分である、励起光を向けるステップと、
c.前記試料における前記染色剤から発光した前記蛍光の画像を記録するステップと、
d.合成画像を生み出すために前記記録された画像をコンピュータによって処理するステップと、
e.前記合成画像を表示するステップと
を含む方法。 - 前記合成画像が、エオシンを局在化する前記試料の領域に対応するピンク色領域と、核を含む前記試料の領域に対応する青色領域と、前記免疫蛍光染色剤を局在化する前記試料の領域に対応するためにレンダリングされた追加の領域と含む、明視野画像を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記記録された画像を処理する前記ステップが、前記記録された画像を非混合画像にスペクトル的にアンミックスするステップを含み、それぞれの非混合画像が、前記染色剤のそれぞれ1つからの蛍光に対応する、請求項26に記載の方法。
- 前記生物学的試料が、血液を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記試料における前記エオシンが、530nmから580nmの間の波長において0.05未満の平均光学濃度を有する、請求項26に記載の方法。
- 前記緑色波長における前記試料の前記平均光学濃度と、赤色波長における前記試料の平均光学濃度との差が、0.08以下である、請求項26に記載の方法。
- 前記赤色波長が、610nmから650nmまでである、請求項31に記載の方法。
- 前記試料の前記平均光学濃度に対する前記エオシンの寄与が、0.05未満である、請求項26に記載の方法。
- 生物学的試料を撮像するための方法であって、
a.エオシンおよび少なくとも1つの追加の染色剤を含む第1の染色剤で前記試料を染色するステップと、
b.前記染色剤のそれぞれが蛍光を発光するように、前記試料に励起光を向けるステップであって、前記試料におけるエオシンの量が、前記励起光に応答した前記エオシンによる、検出可能な蛍光を生み出すのに十分である、励起光を向けるステップと、
c.前記試料における前記少なくとも1つの追加の染色剤からの蛍光発光を測定するステップと、
d.エオシンからの、および前記少なくとも1つの追加の染色剤からの、寄与に、前記測定された蛍光発光をスペクトル的にアンミックスするステップと
を含み、
e.前記試料におけるエオシンの量が、前記試料が緑色波長において0.10未満の平均光学濃度を有するように十分に希釈されている、
方法。
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