JP5825095B2 - Target substance detection biosensor - Google Patents

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Description

本発明は、標的物質を検出するバイオセンサーおよび標的物質を検出する方法に関する。   The present invention relates to a biosensor for detecting a target substance and a method for detecting the target substance.

微量の低分子物質や生体由来物質等を検出する方法として、いわゆるＥＬＩＳＡ法が知られている。例えば、非特許文献１には、ヒト唾液中のＩｇＡをペルオキシダーゼ酵素標識した既知量の抗体と反応させ、次いで未反応の抗体と既知量の固定化ＩｇＡとを反応させ、固定化ＩｇＡ−抗体の量を、テトラメチルベンジジンと標識抗体との反応によって得られる発色の強度によって検出する方法が記載されている。   A so-called ELISA method is known as a method for detecting a small amount of a low-molecular substance or a biological substance. For example, Non-Patent Document 1 discloses that IgA in human saliva is reacted with a known amount of antibody labeled with a peroxidase enzyme, and then an unreacted antibody and a known amount of immobilized IgA are reacted with each other. A method is described in which the amount is detected by the intensity of color developed by the reaction of tetramethylbenzidine and a labeled antibody.

２０１１年１０月７日検索、http://www.salimetrics.com/assets/documents/products-and-services/salivary-assays/SIgA%20Kit%20Insert.pdfSearch October 7, 2011, http://www.salimetrics.com/assets/documents/products-and-services/salivary-assays/SIgA%20Kit%20Insert.pdf

しかしながら、非特許文献１の技術は、検出すべき標的物質と反応する抗体を、酵素によって標識する必要がある。また、酵素と基質とを反応させるための時間が必要である。さらに、操作が煩雑であるために、熟練した操作者が必要である。   However, the technique of Non-Patent Document 1 requires that an antibody that reacts with a target substance to be detected be labeled with an enzyme. Moreover, time is required for reacting the enzyme with the substrate. Further, since the operation is complicated, a skilled operator is required.

本発明は、検出すべき標的物質と反応する標的物質結合物質を酵素標識する必要がなく、短時間で簡単に標的物質を検出できる、標的物質検出バイオセンサーおよび標的物質検出方法を提供することを目的とする。   The present invention provides a target substance detection biosensor and a target substance detection method that do not require enzyme labeling of a target substance binding substance that reacts with the target substance to be detected, and that can easily detect the target substance in a short time. Objective.

本発明の標的物質検出バイオセンサーは、試料に含まれる標的物質を検出するものであって、基板と、前記基板の表面において平面状に形成された２つの金属電極と、前記基板の前記表面において２つの前記金属電極の間に形成され、一定量の前記標的物質を固定し、前記標的物質と特異的に反応する既知量の標的物質結合物質と前記試料との混合物と接触させられる標的物質固定部とを含み、固定された前記標的物質と前記標的物質結合物質とで形成される、第１の固定された複合体の量と相関し、かつ前記標的物質固定部における表面状態の変化に相関する電気的な物理量を出力し、前記標的物質固定部は、一定量の前記標的物質を固定したカーボンナノチューブを含み、前記カーボンナノチューブは、複数であって不規則な網目状に配置されるとともに、２つの前記金属電極の間、及び２つの前記金属電極の表面の一部に亘って配置されていることを特徴とする。これにより、検出すべき標的物質と反応する標的物質結合物質を酵素標識する必要がなく、短時間で簡単に標的物質を検出できる。また、カーボンナノチューブを不規則な網目状に配置することにより、簡易に標的物質検出バイオセンサーを作製でき、その結果簡易に標的物質を検出することができる。 The target substance detection biosensor of the present invention detects a target substance contained in a sample, and includes a substrate, two metal electrodes formed flat on the surface of the substrate, and the surface of the substrate. Target substance immobilization formed between two metal electrodes, immobilizing a certain amount of the target substance, and contacting with a mixture of a known amount of target substance binding substance and the sample that reacts specifically with the target substance And is correlated with the amount of the first immobilized complex formed by the immobilized target substance and the target substance-binding substance, and correlated with the change in the surface state in the target substance immobilization part. It outputs an electrical physical quantity, wherein the target substance fixed portion includes a carbon nanotube fixing the target substance fixed amount, the carbon nanotubes, coordination a plurality irregular reticulated While being characterized by two between the metal electrode, and is disposed over a portion of the two surfaces of the metal electrode. Thereby, it is not necessary to enzyme-label the target substance binding substance that reacts with the target substance to be detected, and the target substance can be easily detected in a short time. In addition, by arranging the carbon nanotubes in an irregular network, a target substance detection biosensor can be easily produced, and as a result, the target substance can be easily detected.

本発明の標的物質検出バイオセンサーは、前記混合物中の前記標的物質が、前記標的物質結合物質と複合体を形成していることが好ましい。   In the target substance detection biosensor of the present invention, it is preferable that the target substance in the mixture forms a complex with the target substance binding substance.

また本発明の標的物質検出バイオセンサーは、前記第１の固定された複合体と、前記第１の固定された複合体と特異的に反応する複合体結合物質とで形成される、第２の固定された複合体の量と相関する物理量を出力することが好ましい。これにより、標的物質検出バイオセンサーは、検出感度が上昇する。   The target substance detection biosensor of the present invention is formed of the first immobilized complex and a complex binding substance that reacts specifically with the first immobilized complex. It is preferable to output a physical quantity that correlates with the amount of the immobilized complex. As a result, the detection sensitivity of the target substance detection biosensor increases.

また本発明の標的物質検出バイオセンサーは、前記標的物質固定部が、一定量の前記標的物質を固定したカーボンナノチューブを含み、前記物理量は、電気的な物理量であることが好ましい。   In the target substance detection biosensor of the present invention, it is preferable that the target substance fixing unit includes a carbon nanotube on which a certain amount of the target substance is fixed, and the physical quantity is an electrical physical quantity.

また本発明の標的物質検出バイオセンサーは、前記カーボンナノチューブが、複数であって不規則な網目状に配置されていることが好ましい。これにより、簡易に標的物質検出バイオセンサーを作製でき、その結果簡易に標的物質を検出することができる。   In the target substance detection biosensor of the present invention, it is preferable that a plurality of the carbon nanotubes are arranged in an irregular network. Thereby, a target substance detection biosensor can be easily produced, and as a result, the target substance can be easily detected.

本発明の標的物質検出バイオセンサーは、試料に含まれる標的物質を検出するものであって、一定量の前記標的物質を固定し、前記標的物質と特異的に反応する既知量の標的物質結合物質と前記試料との混合物と接触させられる標的物質固定部を含み、固定された前記標的物質と前記標的物質結合物質とで形成される、第１の固定された複合体の量と相関し、かつ前記標的物質固定部における表面状態の変化に相関する光学的な物理量を出力し、前記標的物質固定部は、一定量の前記標的物質を固定したフォトニック結晶を含み、前記標的物質固定部に前記標的物質を固定させる前における反射光の強度を第１の強度とし、前記標的物質固定部に前記標的物質を固定したときの反射光の強度を第２の強度とし、前記標的物質固定部に前記第１の固定された複合体が形成されたときの反射光の強度を第３の強度としたときに、前記試料に含まれる前記標的物質の量は、前記第３の強度を前記第１の強度で除した値と、前記第２の強度を前記第１の強度で除した値との差の絶対値に基づいて求められることを特徴とする。これにより、検出すべき標的物質と反応する標的物質結合物質を酵素標識する必要がなく、短時間で簡単に標的物質を検出できる。 The target substance detection biosensor of the present invention detects a target substance contained in a sample, immobilizes a certain amount of the target substance, and specifically knows a target substance binding substance that reacts specifically with the target substance. Correlates with the amount of the first immobilized complex formed by the immobilized target substance and the target substance binding substance, including a target substance immobilization part that is brought into contact with the mixture of the sample and the sample, and An optical physical quantity that correlates with a change in surface state in the target substance fixing part is output, and the target substance fixing part includes a photonic crystal in which a certain amount of the target substance is fixed, and the target substance fixing part includes the photonic crystal The intensity of the reflected light before fixing the target substance is the first intensity, the intensity of the reflected light when the target substance is fixed to the target substance fixing part is the second intensity, and the target substance fixing part is First When the intensity of the reflected light when the fixed complex is formed is the third intensity, the amount of the target substance contained in the sample is calculated by dividing the third intensity by the first intensity. It is obtained based on the absolute value of the difference between the calculated value and the value obtained by dividing the second intensity by the first intensity. Thereby, it is not necessary to enzyme-label the target substance binding substance that reacts with the target substance to be detected, and the target substance can be easily detected in a short time.

また本発明の標的物質検出バイオセンサーは、前記標的物質固定部が、一定量の前記標的物質を固定したフォトニック結晶を含むことが好ましい。   In the target substance detection biosensor of the present invention, it is preferable that the target substance fixing part includes a photonic crystal in which a certain amount of the target substance is fixed.

また本発明の標的物質検出バイオセンサーは、前記物理量が、光の反射率が極値となる波長のシフト量であることが好ましい。   In the target substance detection biosensor of the present invention, the physical quantity is preferably a shift amount of a wavelength at which the light reflectance is an extreme value.

また本発明の標的物質検出バイオセンサーは、前記物理量が、極値である光の反射率の変化量であることが好ましい。   In the target substance detection biosensor of the present invention, it is preferable that the physical quantity is an amount of change in reflectance of light having an extreme value.

本発明の標的物質検出方法は、一定量の標的物質が固定された標的物質固定部を含む標的物質検出バイオセンサーにより試料中の標的物質を検出する方法であって、前記標的物質と特異的に反応する既知量の標的物質結合物質と前記試料とを混合して混合物とするステップと、前記標的物質固定部に、前記混合物を接触させるステップと、前記標的物質検出バイオセンサーから、固定された前記標的物質と前記標的物質結合物質とで形成される、第１の固定された複合体の量と相関し、かつ前記標的物質固定部における表面状態の変化に相関する光学的な物理量を出力させるステップと、を含み、前記標的物質固定部は、一定量の前記標的物質を固定したフォトニック結晶を含み、前記標的物質固定部に前記標的物質を固定させる前における反射光の強度を第１の強度とし、前記標的物質固定部に前記標的物質を固定したときの反射光の強度を第２の強度とし、前記標的物質固定部に前記第１の固定された複合体が形成されたときの反射光の強度を第３の強度としたときに、前記試料に含まれる前記標的物質の量は、前記第３の強度を前記第１の強度で除した値と、前記第２の強度を前記第１の強度で除した値との差の絶対値に基づいて求められることを特徴とする。これにより、検出すべき標的物質と反応する標的物質結合物質を酵素標識する必要がなく、短時間で簡単に標的物質を検出できる。 The target substance detection method of the present invention is a method for detecting a target substance in a sample by a target substance detection biosensor including a target substance fixing part on which a certain amount of target substance is fixed, and specifically detects the target substance. A step of mixing a known amount of a target substance-binding substance to react with the sample to form a mixture, a step of bringing the mixture into contact with the target substance immobilization part, and the target substance detection biosensor Outputting an optical physical quantity that correlates with the amount of the first immobilized complex formed by the target substance and the target substance binding substance and that correlates with a change in the surface state of the target substance fixing portion. When, wherein the said target material fixing unit may include a photonic crystal fixing the target substance fixed amount, before fixing the said target substance to the target substance fixed part The intensity of incident light is a first intensity, the intensity of reflected light when the target substance is fixed to the target substance fixing part is a second intensity, and the first fixed complex is fixed to the target substance fixing part. The amount of the target substance contained in the sample is a value obtained by dividing the third intensity by the first intensity when the intensity of the reflected light when the is formed is the third intensity, The second intensity is obtained based on an absolute value of a difference from a value obtained by dividing the second intensity by the first intensity . Thereby, it is not necessary to enzyme-label the target substance binding substance that reacts with the target substance to be detected, and the target substance can be easily detected in a short time.

本発明の標的物質検出バイオセンサーによれば、検出すべき標的物質と反応する標的物質結合物質を酵素標識する必要がなく、短時間で簡単に標的物質を検出できる。また、本発明の標的物質検出方法によれば、検出すべき標的物質と反応する標的物質結合物質を酵素標識する必要がなく、短時間で簡単に標的物質を検出できる。   According to the target substance detection biosensor of the present invention, it is not necessary to enzyme-label the target substance binding substance that reacts with the target substance to be detected, and the target substance can be easily detected in a short time. Further, according to the target substance detection method of the present invention, it is not necessary to enzyme-label the target substance binding substance that reacts with the target substance to be detected, and the target substance can be easily detected in a short time.

図１−１は、標的物質検出バイオセンサーによる標的物質検出の原理を説明する図である。FIG. 1-1 is a diagram for explaining the principle of target substance detection by a target substance detection biosensor. 図１−２は、標的物質検出バイオセンサーによる標的物質検出の原理を説明する図である。FIG. 1-2 is a diagram for explaining the principle of target substance detection by the target substance detection biosensor. 図１−３は、標的物質検出バイオセンサーにより試料中の標的物質を検出する方法のフローチャートである。FIG. 1-3 is a flowchart of a method for detecting a target substance in a sample by a target substance detection biosensor. 図２は、実施形態２に係る標的物質検出バイオセンサーの模式図である。FIG. 2 is a schematic diagram of a target substance detection biosensor according to the second embodiment. 図３は、実施形態２に係る標的物質検出バイオセンサーと比較例のバイオセンサーとの比較を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing a comparison between a target substance detection biosensor according to Embodiment 2 and a biosensor of a comparative example. 図４−１は、実施形態３に係る標的物質検出バイオセンサーの模式図である。FIG. 4A is a schematic diagram of the target substance detection biosensor according to the third embodiment. 図４−２は、フォトニック結晶の平面図である。FIG. 4B is a plan view of the photonic crystal. 図４−３は、図４−２におけるＡ−Ａ断面を示す図である。FIG. 4C is a diagram illustrating an AA cross section in FIG. 図５は、実施形態３に係る標的物質検出バイオセンサーと比較例のバイオセンサーとの比較を示すグラフである。FIG. 5 is a graph showing a comparison between a target substance detection biosensor according to Embodiment 3 and a biosensor of a comparative example.

以下、この発明につき図面を参照しつつ詳細に説明する。なお、この発明を実施するための形態（以下、実施形態という）によりこの発明が限定されるものではない。また、下記実施形態における構成要素には、当業者が容易に想定できるもの、実質的に同一のものが含まれる。また、同一機能を有する構成要素には同一の符号を付し、重複する説明は省略する。   Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the drawings. It should be noted that the present invention is not limited by the modes for carrying out the invention (hereinafter referred to as embodiments). In addition, constituent elements in the following embodiments include those that can be easily assumed by those skilled in the art and those that are substantially the same. Moreover, the same code | symbol is attached | subjected to the component which has the same function, and the overlapping description is abbreviate | omitted.

［実施形態１］
まず、図１−１および図１−２を用いて標的物質検出の原理を説明する。図１−１および図１−２は、本実施形態による標的物質検出バイオセンサーによる標的物質検出の原理を説明する図である。この原理およびこの原理に関する説明は、後述する実施形態にも同様に適用することができる。 [Embodiment 1]
First, the principle of target substance detection will be described with reference to FIGS. 1-1 and 1-2. FIGS. 1-1 and 1-2 are diagrams illustrating the principle of target substance detection by the target substance detection biosensor according to the present embodiment. This principle and the explanation regarding this principle can be similarly applied to the embodiments described later.

なお、標的物質検出バイオセンサー１は、標的物質２の有無を検出するもののみに限定されず、標的物質２を定量するものであってもよい。標的物質検出バイオセンサー１は、一定量の標的物質２を固定する標的物質固定部１０１を含む。   The target substance detection biosensor 1 is not limited to the one that detects the presence or absence of the target substance 2, and may be one that quantifies the target substance 2. The target substance detection biosensor 1 includes a target substance fixing unit 101 that fixes a certain amount of the target substance 2.

未知量Ｘの標的物質２を含む試料Ｓを定量するためには、まず検量線を作成する。既知量の標的物質２を含む複数の試料について、標的物質検出バイオセンサー１を用いて以下の手順にしたがって対応する物理量を出力させ、標的物質２の量と出力される物理量との関係を表す関数を求め、検量線とする。   In order to quantify the sample S containing the unknown amount X of the target substance 2, a calibration curve is first created. A function representing the relationship between the amount of the target substance 2 and the output physical quantity by outputting the corresponding physical quantity according to the following procedure using the target substance detection biosensor 1 for a plurality of samples including the known amount of the target substance 2 To obtain a calibration curve.

試料Ｓに標的物質２が含まれているか否かを検出するためには、検量線を作成する必要はなく、標的物質２を含まない試料について以下の手順にしたがって対応する物理量を標的物質検出バイオセンサー１に出力させ、試料Ｓの測定により出力された物理量を、標的物質２を含まない試料の物理量と比較することによって検出することができる。   In order to detect whether or not the target substance 2 is contained in the sample S, it is not necessary to create a calibration curve. For the sample that does not contain the target substance 2, the corresponding physical quantity is determined according to the following procedure. The physical quantity output by the sensor 1 and output by the measurement of the sample S can be detected by comparing with the physical quantity of the sample not including the target substance 2.

未知量Ｘの標的物質２（例えば抗原）を含む試料Ｓを、必要に応じて前処理する。次いで試料Ｓを、少なくとも標的物質２と特異的に反応する既知量Ａａの標的物質結合物質３（例えば、レセプター、抗体、一次抗体）と混合する。標的物質固定部１０１に接触させる前に、標的物質２は標的物質結合物質３と複合体４ａを形成していることが好ましい。複合体４ａを確実に形成させるために、混合物Ｍを所定の時間、所定の温度条件で温置することが好ましい。次いで、混合物Ｍを、一定量の標的物質２が固定された標的物質固定部１０１に接触させる。標的物質２と複合体４ａを形成していない標的物質結合物質３は、標的物質固定部１０１に固定された標的物質２と複合体４ｂ（第１の固定された複合体）を形成する。必要に応じて、標的物質固定部１０１を洗浄して、第１の固定された複合体４ｂ以外の複合体４ａを除去する。次いで、標的物質検出バイオセンサー１から、第１の固定された複合体４ｂの量Ｃａと相関する物理量を出力させ、第１の固定された複合体４ｂの量Ｃａを測定する。すなわち、試料Ｓ中の標的物質２と複合体４ａを形成しなかった標的物質結合物質３の量（Ａａ−Ｘ）を測定する。標的物質結合物質３の量Ａａは既知であり、Ｘ＝Ａａ−Ｃａより、試料Ｓ中の標的物質２の量Ｘが測定できることになる。   A sample S containing an unknown amount X of the target substance 2 (for example, an antigen) is pretreated as necessary. Next, the sample S is mixed with at least a known amount Aa of the target substance-binding substance 3 (eg, receptor, antibody, primary antibody) that specifically reacts with the target substance 2. The target substance 2 preferably forms a complex 4a with the target substance binding substance 3 before being brought into contact with the target substance fixing part 101. In order to reliably form the composite 4a, it is preferable to incubate the mixture M under a predetermined temperature condition for a predetermined time. Next, the mixture M is brought into contact with the target substance fixing unit 101 on which a certain amount of the target substance 2 is fixed. The target substance binding substance 3 that has not formed the complex 4a with the target substance 2 forms a complex 4b (first fixed complex) with the target substance 2 fixed to the target substance fixing unit 101. If necessary, the target substance fixing unit 101 is washed to remove the complex 4a other than the first immobilized complex 4b. Next, a physical quantity correlated with the amount Ca of the first fixed complex 4b is output from the target substance detection biosensor 1, and the amount Ca of the first fixed complex 4b is measured. That is, the amount (Aa-X) of the target substance binding substance 3 that did not form the complex 4a with the target substance 2 in the sample S is measured. The amount Aa of the target substance binding substance 3 is known, and the quantity X of the target substance 2 in the sample S can be measured from X = Aa−Ca.

ただし、各物質の量は、物質の分子数に基づく量であり、例えば単位はｍｏｌである。一分子の標的物質２および一分子の標的物質結合物質３から一分子の複合体（４ａ，４ｂ）が構成されるとする。試料Ｓに含まれる標的物質２の量Ｘが微量である場合でも、測定する量はＡａ−ＸであってＸと比較して微量ではないために、標的物質２を感度よく測定することができる。   However, the amount of each substance is an amount based on the number of molecules of the substance. For example, the unit is mol. It is assumed that one molecule of the target substance 2 and one molecule of the target substance binding substance 3 constitute a single molecule complex (4a, 4b). Even when the amount X of the target substance 2 contained in the sample S is a very small amount, the amount to be measured is Aa-X and not a very small amount compared to X, and therefore the target substance 2 can be measured with high sensitivity. .

試料Ｓ中の標的物質２の量と、出力される物理量との関係を表す関数が得られるならば、標的物質２と標的物質結合物質３との具体的な結合様式が判明していなくとも標的物質２の量を測定することができる。例えば、複数の標的物質２および一分子の標的物質結合物質３から一分子の複合体が構成される場合であっても、試料Ｓ中の標的物質２の量を測定することができる。   If a function representing the relationship between the amount of the target substance 2 in the sample S and the output physical quantity is obtained, the target can be obtained even if the specific binding mode between the target substance 2 and the target substance binding substance 3 is not known. The amount of substance 2 can be measured. For example, the amount of the target substance 2 in the sample S can be measured even when a complex of one molecule is constituted by the plurality of target substances 2 and one molecule of the target substance binding substance 3.

ここで、標的物質結合物質３の量Ａａが、試料Ｓに含まれる標的物質２より十分に多くなければ、標的物質結合物質３は試料Ｓに含まれる標的物質２とすべて反応してしまうので、固定された標的物質２と複合体４ｂを形成することができない。その結果、試料Ｓ中の標的物質２を直接定量することができない。この場合は、試料Ｓを適宜希釈して希釈液中の標的物質２を定量することにより、試料Ｓ中の標的物質２を定量することができる。   Here, if the amount Aa of the target substance-binding substance 3 is not sufficiently larger than the target substance 2 contained in the sample S, the target substance-binding substance 3 will completely react with the target substance 2 contained in the sample S. The complex 4b cannot be formed with the immobilized target substance 2. As a result, the target substance 2 in the sample S cannot be directly quantified. In this case, the target substance 2 in the sample S can be quantified by appropriately diluting the sample S and quantifying the target substance 2 in the diluted solution.

標的物質固定部１０１に固定される標的物質２の量は一定量である。これにより、固定される標的物質２と標的物質結合物質３とが複合体４ｂを形成した場合に、形成した複合体４ｂの量と相関する物理量を、標的物質検出バイオセンサー１が出力できる。固定される標的物質２の一定量は、適宜変更してもよく、例えば、試料Ｓに含まれる標的物質２の量の範囲によって最適な量に設定することができる。標的物質固定部１０１に固定された標的物質２の量は、一定量であれば、具体的な量が明らかでなくともよい。   The amount of the target substance 2 fixed to the target substance fixing unit 101 is a fixed amount. Thereby, when the target substance 2 to be immobilized and the target substance binding substance 3 form a complex 4b, the target substance detection biosensor 1 can output a physical quantity correlated with the amount of the complex 4b formed. The fixed amount of the target substance 2 to be fixed may be appropriately changed. For example, it can be set to an optimum amount according to the range of the amount of the target substance 2 contained in the sample S. As long as the amount of the target substance 2 fixed to the target substance fixing unit 101 is a constant amount, the specific amount may not be clear.

標的物質固定部１０１に固定される標的物質２の量は、一定量であるので、あらかじめ一つの標的物質検出バイオセンサー１について検量線を作成しておけば、標的物質検出バイオセンサー１ごとに検量線を作成しなくてもよい。すなわち、標的物質固定部１０１に固定される標的物質２の量が一定量である、複数の標的物質検出バイオセンサー１の間で検量線を共用することができる。   Since the amount of the target substance 2 fixed to the target substance fixing unit 101 is a fixed amount, if a calibration curve is created for one target substance detection biosensor 1 in advance, the calibration is performed for each target substance detection biosensor 1. You do not have to create a line. That is, a calibration curve can be shared among a plurality of target substance detection biosensors 1 in which the amount of the target substance 2 fixed to the target substance fixing unit 101 is a constant amount.

標的物質検出バイオセンサー１は、第１の固定された複合体４ｂと特異的に反応する複合体結合物質５とで形成される、第２の固定された複合体６の量と相関する物理量を出力するものであってもよい。標的物質検出バイオセンサー１が、このような物理量を出力するものである場合には、標的物質２の検出は、以下のように行うことができる。   The target substance detection biosensor 1 has a physical quantity that correlates with the amount of the second immobilized complex 6 formed by the complex binding substance 5 that reacts specifically with the first immobilized complex 4b. It may be output. When the target substance detection biosensor 1 outputs such a physical quantity, the target substance 2 can be detected as follows.

標的物質固定部１０１に、第１の固定された複合体４ｂが形成された後、第１の固定された複合体４ｂと特異的に反応する複合体結合物質５（例えば二次抗体）であって第１の固定された複合体４ｂより過剰である量を標的物質固定部１０１に接触させて、第１の固定された複合体４ｂをすべて第２の固定された複合体６に変換する。次いで、標的物質検出バイオセンサー１に、第２の固定された複合体６の量と相関する物理量を出力させることによって、第２の固定された複合体６を定量する。第２の固定された複合体６の量は第１の固定された複合体４ｂと同一であるから、第１の固定された複合体４ｂが定量できることになる。   After the first immobilized complex 4b is formed on the target substance immobilization part 101, the complex-binding substance 5 (for example, a secondary antibody) that specifically reacts with the first immobilized complex 4b. Then, the target substance fixing unit 101 is brought into contact with an excess amount of the first fixed complex 4b to convert all of the first fixed complex 4b into the second fixed complex 6. Next, the target substance detection biosensor 1 outputs a physical quantity that correlates with the quantity of the second immobilized complex 6, thereby quantifying the second immobilized complex 6. Since the amount of the second fixed complex 6 is the same as that of the first fixed complex 4b, the first fixed complex 4b can be quantified.

このように、標的物質検出バイオセンサー１が、第２の固定された複合体６の量と相関する物理量を出力できることで、標的物質固定部１０１の表面状態におけるより大きい変化が検出できるようになる。したがって、標的物質検出バイオセンサー１は、第２の固定された複合体６の量と相関する物理量を出力できない標的物質検出バイオセンサーと比較して感度が大きくなる。以上の説明は、本実施形態以降に記載される実施形態にも適用される。   In this way, the target substance detection biosensor 1 can output a physical quantity that correlates with the quantity of the second immobilized complex 6, so that a larger change in the surface state of the target substance fixing unit 101 can be detected. . Therefore, the sensitivity of the target substance detection biosensor 1 is higher than that of the target substance detection biosensor that cannot output a physical quantity correlated with the amount of the second immobilized complex 6. The above description is also applied to the embodiments described after this embodiment.

（標的物質）
標的物質２とは、検出する対象物であって、低分子、タンパク質などの高分子、オリゴマーのいずれであってもよい。また、単分子に限定されず、複数の分子からなる複合体であってもよい。標的物質２として、例えば、生体内に存在する、生体活性物質が挙げられ、なかでも、コルチゾールが好ましい。コルチゾールとは分子量３６２ｇ／ｍｏｌの低分子物質であり、人間がストレスを感じると唾液中のコルチゾール濃度が増加するため、人間が感じているストレスの度合いを評価する物質として注目されている。コルチゾールを標的物質としてその濃度を測定すれば、例えば、ヒトの唾液中のコルチゾールの濃度を測定することで、ストレスの度合いを評価することができる。 (Target substance)
The target substance 2 is an object to be detected, and may be a low molecule, a polymer such as a protein, or an oligomer. Moreover, it is not limited to a single molecule, and may be a complex composed of a plurality of molecules. Examples of the target substance 2 include bioactive substances that exist in the living body, and among them, cortisol is preferable. Cortisol is a low-molecular substance having a molecular weight of 362 g / mol, and when humans feel stress, the cortisol concentration in saliva increases, and thus has been attracting attention as a substance that evaluates the degree of stress felt by humans. If the concentration is measured using cortisol as a target substance, for example, the degree of stress can be evaluated by measuring the concentration of cortisol in human saliva.

（標的物質結合物質）
標的物質結合物質３とは、標的物質２と特異的に反応する物質である。特異的に反応するとは、選択的に標的物質２と可逆的または不可逆的な結合をして複合体を形成することを意味し、化学反応に限定されない。また、特異的に反応する物質が標的物質２以外に存在していても構わない。試料Ｓ中に標的物質２の他に標的物質結合物質３と反応する物質があっても、親和性が標的物質２と比較して非常に小さい場合は、標的物質２を定量することができる。 (Target substance binding substance)
The target substance binding substance 3 is a substance that specifically reacts with the target substance 2. The specific reaction means that the target substance 2 is selectively reversibly or irreversibly bound to form a complex, and is not limited to a chemical reaction. In addition, a substance that reacts specifically may exist in addition to the target substance 2. Even if there is a substance that reacts with the target substance binding substance 3 in addition to the target substance 2 in the sample S, the target substance 2 can be quantified if the affinity is very small compared to the target substance 2.

標的物質結合物質３として、標的物質２を抗原とした抗体や、人工的に作製した抗体、アデニン、チミン、グアニン、シトシン等のＤＮＡを構成する物質から構成される分子、ペプチドを用いることができる。例えば、標的物質２がコルチゾールである場合は、標的物質結合物質３は、コルチゾール抗体であることが好ましい。   As the target substance binding substance 3, an antibody using the target substance 2 as an antigen, an artificially prepared antibody, a molecule composed of a substance constituting DNA such as adenine, thymine, guanine, cytosine, or a peptide can be used. . For example, when the target substance 2 is cortisol, the target substance binding substance 3 is preferably a cortisol antibody.

標的物質結合物質３を作製するには公知の方法を採用することができる。例えば、抗体は、血清法、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ法によって作製できる。ＤＮＡを構成する物質から構成される分子は、例えばＳＥＬＥＸ法（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment:試験管内人工進化法）により作製できる。ペプチドは、例えばファージディスプレイ法により作製できる。   A known method can be employed to produce the target substance binding substance 3. For example, the antibody can be produced by a serum method, a hybridoma method, or a phage display method. Molecules composed of substances constituting DNA can be prepared by, for example, the SELEX method (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). The peptide can be prepared by, for example, a phage display method.

標的物質結合物質３として、特定の抗原（例えばコルチゾール）とのみ結合する抗体（例えばコルチゾール抗体）を用いることにより、特定の抗原を検出する標的物質検出バイオセンサー１とすることができる。これは、標的物質固定部１０１の表面もしくは表面近傍で起こる抗原抗体反応を利用するものである。   By using an antibody (for example, a cortisol antibody) that binds only to a specific antigen (for example, cortisol) as the target substance-binding substance 3, a target substance detection biosensor 1 that detects the specific antigen can be obtained. This utilizes an antigen-antibody reaction that occurs on or near the surface of the target substance immobilization part 101.

標的物質結合物質３は、何らかの酵素・同位体により標識されている必要はない。しかし、酵素・同位体によって標識されていてもよい。   The target substance binding substance 3 does not need to be labeled with any enzyme / isotope. However, it may be labeled with an enzyme / isotope.

（複合体結合物質）
複合体結合物質５は、第１の固定された複合体４ｂと特異的に反応して、第２の固定された複合体６を形成するものである。第１の固定された複合体４ｂと特異的に反応するとは、選択的に第１の固定された複合体４ｂと可逆的または不可逆的な結合をして複合体を形成することを意味し、化学反応に限定されない。また、特異的に反応する物質が第１の固定された複合体４ｂ以外に存在していても構わない。 (Complex binding substance)
The complex-binding substance 5 specifically reacts with the first immobilized complex 4b to form the second immobilized complex 6. Reacting specifically with the first immobilized complex 4b means selectively forming a complex by reversibly or irreversibly binding to the first immobilized complex 4b, It is not limited to chemical reactions. In addition, a substance that reacts specifically may be present in addition to the first immobilized complex 4b.

複合体結合物質５を作製するには公知の方法を採用することができる。例えば、抗体は、血清法、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ法によって作製できる。ＤＮＡを構成する物質から構成される分子は、例えばＳＥＬＥＸ法（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment:試験管内人工進化法）により作製できる。ペプチドは、例えばファージディスプレイ法により作製できる。複合体結合物質５は、何らかの酵素・同位体により標識されている必要はない。しかし、酵素・同位体によって標識されていてもよい。   A known method can be employed to produce the composite binding material 5. For example, the antibody can be produced by a serum method, a hybridoma method, or a phage display method. Molecules composed of substances constituting DNA can be prepared by, for example, the SELEX method (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). The peptide can be prepared by, for example, a phage display method. The complex-binding substance 5 does not need to be labeled with any enzyme / isotope. However, it may be labeled with an enzyme / isotope.

（標的物質検出バイオセンサー）
標的物質検出バイオセンサー１は、試料Ｓに含まれる標的物質２を検出するものであり、標的物質固定部１０１を含んでいる。標的物質固定部１０１には、一定量の標的物質２が固定されている。標的物質固定部１０１の基礎１０２として、その表面状態の変化により出力する物理量が変化する物質が使用される。この基礎１０２となる物質の表面に、標的物質２が固定されている。基礎１０２となる物質として、例えば、カーボンナノチューブ、ナノワイヤ、表面プラズモン効果が得られる物質、フォトニック結晶が挙げられる。カーボンナノチューブを基礎１０２として使用する場合、一分子のみを用いることもできるし、複数のカーボンナノチューブを連結したり、不規則な網目状に配置したりして用いることもできる。 (Target substance detection biosensor)
The target substance detection biosensor 1 detects the target substance 2 contained in the sample S, and includes a target substance fixing unit 101. A fixed amount of the target substance 2 is fixed to the target substance fixing unit 101. As the base 102 of the target substance fixing unit 101, a substance whose physical quantity to be output changes due to a change in its surface state is used. The target substance 2 is fixed on the surface of the substance serving as the base 102. Examples of the material serving as the base 102 include carbon nanotubes, nanowires, materials that can obtain the surface plasmon effect, and photonic crystals. When carbon nanotubes are used as the base 102, only one molecule can be used, or a plurality of carbon nanotubes can be connected or arranged in an irregular network.

標的物質２を基礎１０２となる物質に固定するには、共有結合、化学吸着、物理吸着などの、化学的結合、物理的結合方法を、基礎１０２となる物質および標的物質２の性質に応じて適宜選択して行うことができる。   In order to fix the target substance 2 to the substance serving as the base 102, chemical bonding and physical bonding methods such as covalent bonding, chemisorption, and physical adsorption are performed according to the properties of the substance serving as the base 102 and the target substance 2. It can be selected as appropriate.

標的物質固定部１０１の表面には、試料Ｓと標的物質結合物質３との混合物Ｍが接触させられる。これにより、標的物質固定部１０１に固定された標的物質２と、標的物質結合物質３とが反応して、標的物質固定部１０１の表面に標的物質２と標的物質結合物質３との複合体（第１の固定された複合体）４ｂが固定される。その結果、標的物質固定部１０１における表面の状態が変化し、標的物質検出バイオセンサー１は、標的物質固定部１０１に固定された複合体４ｂの量と相関し、かつ標的物質固定部１０１における表面状態の変化に相関する物理量を出力することができる。   The mixture M of the sample S and the target substance binding substance 3 is brought into contact with the surface of the target substance fixing part 101. Thereby, the target substance 2 fixed to the target substance fixing part 101 reacts with the target substance binding substance 3, and a complex of the target substance 2 and the target substance binding substance 3 (on the surface of the target substance fixing part 101 ( The first fixed complex) 4b is fixed. As a result, the surface state of the target substance fixing unit 101 changes, the target substance detection biosensor 1 correlates with the amount of the complex 4b fixed to the target substance fixing unit 101, and the surface of the target substance fixing unit 101 A physical quantity correlated with a change in state can be output.

物理量として、電気的な物理量、光学的な物理量などが挙げられる。電気的な物理量として、電圧、電流、周波数、電気抵抗値、導電性などが挙げられる。光学的な物理量として、光の波長、光の強度、光の反射率、光の透過率などが挙げられる。   Examples of the physical quantity include an electrical physical quantity and an optical physical quantity. Examples of the electrical physical quantity include voltage, current, frequency, electric resistance value, and conductivity. Examples of the optical physical quantity include light wavelength, light intensity, light reflectance, and light transmittance.

標的物質検出バイオセンサー１は、標的物質固定部１０１における表面状態の変化に相関する物理量を出力するものである。したがって、第１の固定された複合体４ｂが、他の物質を変化させ、変化後の物質が、その量に応じて物理量を変化させる場合は含まれない。例えば、いわゆるＥＬＩＳＡ法のように、第１の固定された複合体４ｂに酵素活性を持たせ、この酵素と反応する基質を加えた後に、変化後の基質の量と相関する物理量を測定することで、第１の固定された複合体４ｂの量を間接的に検出するものは含まれない。   The target substance detection biosensor 1 outputs a physical quantity that correlates with a change in the surface state of the target substance fixing unit 101. Therefore, the case where the first fixed complex 4b changes another substance and the changed substance changes the physical quantity according to the quantity is not included. For example, as in the so-called ELISA method, the first immobilized complex 4b has enzyme activity, and after adding a substrate that reacts with the enzyme, a physical quantity that correlates with the amount of the substrate after the change is measured. Thus, it does not include the one that indirectly detects the amount of the first immobilized complex 4b.

また、相関するとは、第１の固定された複合体４ｂの増加に伴って、物理量が増加または減少するという関係であって、比例関係には限定されない。第１の固定された複合体４ｂの量と出力される物理量との関係を表す関数は、例えば、１次関数、２次関数、指数関数であってもよい。第１の固定された複合体４ｂの量と、出力される物理量との関係は、一次関数であるか、一次関数に近似できることが好ましい。このような関係であると、検量線を作成することが容易となる。   Further, “correlation” refers to a relationship in which the physical quantity increases or decreases as the first fixed complex 4b increases, and is not limited to a proportional relationship. The function representing the relationship between the amount of the first fixed complex 4b and the output physical quantity may be, for example, a linear function, a quadratic function, or an exponential function. The relationship between the amount of the first fixed complex 4b and the output physical quantity is preferably a linear function or approximate to a linear function. Such a relationship makes it easy to create a calibration curve.

標的物質検出バイオセンサー１は、標的物質固定部１０１の他に、物理量を出力するための様々な要素を含むことができる。例えば、標的物質固定部１０１から電気的信号を取り出すための電極、電線などを含むことができる。また、試料溶液を保持するための試料保持部が形成されていてもよい。   The target substance detection biosensor 1 can include various elements for outputting a physical quantity in addition to the target substance fixing unit 101. For example, an electrode, an electric wire, etc. for taking out an electrical signal from target substance immobilization part 101 can be included. Moreover, a sample holding part for holding the sample solution may be formed.

本実施形態の標的物質検出バイオセンサー１によれば、標的物質結合物質３を酵素標識する必要がなく、短時間で簡便に標的物質２を検出することができる。   According to the target substance detection biosensor 1 of this embodiment, it is not necessary to label the target substance binding substance 3 with an enzyme, and the target substance 2 can be easily detected in a short time.

（標的物質検出バイオセンサーによる標的物質検出方法）
次に、標的物質検出バイオセンサー１により試料Ｓ中の標的物質２を検出する方法について述べる。図１−３は、標的物質検出バイオセンサー１により試料Ｓ中の標的物質２を検出する方法のフローチャートである。標的物質検出バイオセンサー１には、一定量の標的物質２が固定されている。試料Ｓと、既知量の標的物質結合物質３とを混合して混合物Ｍとする（ステップＳ１）。次いで、混合物Ｍを標的物質固定部１０１に接触させる（ステップＳ２）。次いで、標的物質検出バイオセンサー１から、物理量を出力させる（ステップＳ３）。ここで、出力させる物理量は、第１の固定された複合体４ｂの量と相関し、かつ標的物質固定部１０１における表面状態の変化に相関する物理量である。次いで、出力させた物理量に基づいて標的物質２を検出する（ステップＳ４）。本実施形態の標的物質検出方法によれば、標的物質結合物質３を酵素標識する必要がなく、短時間で簡便に標的物質２を検出することができる。 (Target substance detection method using target substance detection biosensor)
Next, a method for detecting the target substance 2 in the sample S by the target substance detection biosensor 1 will be described. FIG. 1C is a flowchart of a method for detecting the target substance 2 in the sample S by the target substance detection biosensor 1. A fixed amount of the target substance 2 is fixed to the target substance detection biosensor 1. The sample S and a known amount of the target substance binding substance 3 are mixed to form a mixture M (step S1). Next, the mixture M is brought into contact with the target substance fixing unit 101 (step S2). Next, a physical quantity is output from the target substance detection biosensor 1 (step S3). Here, the physical quantity to be output is a physical quantity that correlates with the amount of the first immobilized complex 4 b and correlates with the change in the surface state of the target substance fixing unit 101. Next, the target substance 2 is detected based on the outputted physical quantity (step S4). According to the target substance detection method of this embodiment, it is not necessary to label the target substance binding substance 3 with an enzyme, and the target substance 2 can be detected easily in a short time.

［実施形態２］
図２は、本実施形態に係る標的物質検出バイオセンサーの模式図である。標的物質検出バイオセンサー２００は、標的物質固定部２０１を含み、標的物質固定部２０１は基板２０４上に配置されている。標的物質固定部２０１は、基礎として、カーボンナノチューブ２０２を含む。カーボンナノチューブ２０２には一定量の標的物質２が固定されている。カーボンナノチューブ２０２は、複数であって、不規則な網目状に配置されている。また標的物質検出バイオセンサー２００は、標的物質固定部２０１と電気的に結合された少なくとも二つの電極２０３、２０３を含んでいる。二つの電極２０３、２０３は基板２０４上に配置されている。 [Embodiment 2]
FIG. 2 is a schematic diagram of the target substance detection biosensor according to the present embodiment. The target substance detection biosensor 200 includes a target substance fixing unit 201, and the target substance fixing unit 201 is disposed on the substrate 204. The target substance fixing unit 201 includes a carbon nanotube 202 as a basis. A certain amount of the target substance 2 is fixed to the carbon nanotube 202. The carbon nanotubes 202 are plural and are arranged in an irregular mesh shape. The target substance detection biosensor 200 includes at least two electrodes 203 and 203 that are electrically coupled to the target substance fixing unit 201. The two electrodes 203 and 203 are disposed on the substrate 204.

一般に、カーボンナノチューブは比表面積が大きく、その表面で起こる反応を電気的信号変化で読み取ることができる。カーボンナノチューブのデバイ長は、水溶液中で３ｎｍ程度あるとされる。そのデバイ長以内の距離における反応は、カーボンナノチューブに大きな影響を及ぼす。例えば、標的物質２がコルチゾールであり、標的物質結合物質３が抗コルチゾール抗体であるとする。抗コルチゾール抗体のＩｇＧは、大きさが１０ｎｍ程度であり、コルチゾールは１ｎｍ程度の大きさである。抗原抗体反応が起こる場所は、本実施形態においては、カーボンナノチューブから、固定されたコルチゾールの大きさだけ距離が離れた場所であり、カーボンナノチューブからおよそ１ｎｍ程度離れた場所であると考えられる。したがって、カーボンナノチューブのデバイ長以下の場所で抗原抗体反応が起こると考えられ、この反応はカーボンナノチューブに大きな影響を及ぼすと考えられる。   In general, a carbon nanotube has a large specific surface area, and a reaction occurring on the surface of the carbon nanotube can be read by an electric signal change. The Debye length of the carbon nanotube is about 3 nm in the aqueous solution. The reaction at a distance within the Debye length greatly affects the carbon nanotube. For example, it is assumed that the target substance 2 is cortisol and the target substance binding substance 3 is an anti-cortisol antibody. The anti-cortisol antibody IgG has a size of about 10 nm, and cortisol has a size of about 1 nm. In this embodiment, the place where the antigen-antibody reaction occurs is a place away from the carbon nanotube by the size of the immobilized cortisol, and is considered to be a place about 1 nm away from the carbon nanotube. Therefore, it is considered that an antigen-antibody reaction occurs at a place below the Debye length of the carbon nanotube, and this reaction is considered to have a great influence on the carbon nanotube.

一方、カーボンナノチューブに抗コルチゾール抗体を固定させた場合、抗原抗体反応が起こる場所は、カーボンナノチューブから、固定された抗コルチゾール抗体の大きさだけ距離が離れた場所であると考えられ、カーボンナノチューブからおよそ１０ｎｍ程度離れた場所であると考えられる。したがって、カーボンナノチューブのデバイ長を超えた場所で抗原抗体反応が起こると考えられ、この反応は、本実施形態における反応よりも、カーボンナノチューブに及ぼす影響が少ないと考えられる。   On the other hand, when the anti-cortisol antibody is immobilized on the carbon nanotube, the place where the antigen-antibody reaction occurs is considered to be a place away from the carbon nanotube by the size of the immobilized anti-cortisol antibody. It is considered that the place is about 10 nm away. Therefore, it is considered that an antigen-antibody reaction occurs at a place exceeding the Debye length of the carbon nanotube, and this reaction is considered to have less influence on the carbon nanotube than the reaction in the present embodiment.

本実施形態のようにカーボンナノチューブ２０２に標的物質２を固定させることで、カーボンナノチューブ２０２に標的物質結合物質３を固定させた場合より大きな検出信号（物理量）を標的物質検出バイオセンサー２００に出力させることができる。   By fixing the target substance 2 to the carbon nanotube 202 as in the present embodiment, a larger detection signal (physical quantity) than when the target substance binding substance 3 is fixed to the carbon nanotube 202 is output to the target substance detection biosensor 200. be able to.

（カーボンナノチューブ）
カーボンナノチューブ２０２は、炭素原子により形成される円筒形の結晶である。カーボンナノチューブ２０２は、炭素原子のみにより形成されているもののほか、各種官能基が導入されているものであってもよい。カーボンナノチューブ２０２に各種官能基を導入するには、公知の方法を使用することができる。例えば、カーボンナノチューブ２０２に対し、フッ素化、アミノ化、カルボキシル化、アルキル化、１，３−双極子付加環化、ジアゾ化、求核反応、ナイトレン付加環化、Bingel反応、ジクロロカルベン付加を行うことによって、カーボンナノチューブ２０２に官能基を導入できる。 (carbon nanotube)
The carbon nanotube 202 is a cylindrical crystal formed by carbon atoms. The carbon nanotube 202 may be formed of only carbon atoms and may be one into which various functional groups are introduced. In order to introduce various functional groups into the carbon nanotube 202, a known method can be used. For example, the carbon nanotube 202 is subjected to fluorination, amination, carboxylation, alkylation, 1,3-dipolar cycloaddition, diazotization, nucleophilic reaction, nitrene cycloaddition, Bingel reaction, dichlorocarbene addition. Thus, a functional group can be introduced into the carbon nanotube 202.

カーボンナノチューブ２０２に官能基を導入する場合、官能基はカルボキシル基またはアミノ基が好ましい。カーボンナノチューブ２０２にカルボキシル基またはアミノ基を導入すると、カーボンナノチューブ２０２の各種溶媒に対する溶解性または分散性が向上する。また、カーボンナノチューブ２０２にカルボキシル基またはアミノ基を導入すると、標的物質２が抗体等のタンパク質の場合は、カーボンナノチューブ２０２のカルボキシル基またはアミノ基と、タンパク質との間にアミド結合を形成することができるので、容易にカーボンナノチューブ２０２と標的物質２とを結合させることができる。   When a functional group is introduced into the carbon nanotube 202, the functional group is preferably a carboxyl group or an amino group. When a carboxyl group or an amino group is introduced into the carbon nanotube 202, the solubility or dispersibility of the carbon nanotube 202 in various solvents is improved. In addition, when a carboxyl group or an amino group is introduced into the carbon nanotube 202, when the target substance 2 is a protein such as an antibody, an amide bond may be formed between the carboxyl group or amino group of the carbon nanotube 202 and the protein. Therefore, the carbon nanotube 202 and the target substance 2 can be easily combined.

カーボンナノチューブ２０２は、単層であっても、多層であってもよい。また、カーボンナノチューブ２０２は、格子欠陥を有するものでもよく、有さないものでもよい。   The carbon nanotube 202 may be a single wall or a multilayer. The carbon nanotubes 202 may or may not have lattice defects.

カーボンナノチューブ２０２は、金属性カーボンナノチューブであっても半導体性カーボンナノチューブであってもよい。また、これらの任意の割合の混合物であってもよい。一般に、金属性カーボンナノチューブと半導体性カーボンナノチューブとを分離することは困難である。本実施形態に係るカーボンナノチューブ２０２として、金属性カーボンナノチューブと半導体性カーボンナノチューブとの任意の割合の混合物を使用できるので、分離工程を必要とせず安価に標的物質検出バイオセンサー２００を作製することができる。   The carbon nanotube 202 may be a metallic carbon nanotube or a semiconducting carbon nanotube. Moreover, the mixture of these arbitrary ratios may be sufficient. In general, it is difficult to separate metallic carbon nanotubes from semiconducting carbon nanotubes. As the carbon nanotube 202 according to the present embodiment, a mixture of metallic carbon nanotubes and semiconducting carbon nanotubes can be used at any ratio, so that the target substance detection biosensor 200 can be produced at low cost without requiring a separation step. it can.

カーボンナノチューブ２０２は公知の方法によって製造することができる。例えば、CVD法（Chemical Vapor Deposition:化学気相成長法)で製造することができる。CVD法の中でも、例えば、アルコールCVD法、HiPCO法、スーパーグロースCVD法等で製造することができる。アーク法、レーザーアブレーション法、DIPS法（Direct Injection Pyrolytic Synthesis）等の方法により製造することもできる。本実施形態に係るカーボンナノチューブ２０２は、どの製造方法で製造されたものでもよい。しかし、カーボンナノチューブの量産化が容易で、得られるカーボンナノチューブの純度が比較的高い点で、CVD法、特にスーパーグロースCVD法、または、アーク法で得られたカーボンナノチューブを使用することが好ましい。   The carbon nanotube 202 can be manufactured by a known method. For example, it can be manufactured by a CVD method (Chemical Vapor Deposition). Among the CVD methods, for example, it can be produced by an alcohol CVD method, a HiPCO method, a super growth CVD method, or the like. It can also be produced by a method such as arc method, laser ablation method, DIPS method (Direct Injection Pyrolytic Synthesis). The carbon nanotube 202 according to this embodiment may be manufactured by any manufacturing method. However, it is preferable to use a carbon nanotube obtained by a CVD method, in particular, a super-growth CVD method or an arc method, because mass production of the carbon nanotube is easy and the purity of the obtained carbon nanotube is relatively high.

カーボンナノチューブ２０２に標的物質２を固定させるには、共有結合、化学吸着、物理吸着などの、化学的結合、物理的結合方法を、標的物質２の性質に応じて適宜選択して行うことができる。例えば、カーボンナノチューブ２０２に標的物質２を所定時間接触させ、カーボンナノチューブ２０２に標的物質２を吸着させる方法、カーボンナノチューブ２０２に各種官能基を導入し、導入した官能基と標的物質２とを共有結合させる方法等の方法を採用することができる。   In order to immobilize the target substance 2 on the carbon nanotube 202, a chemical bond or physical bond method such as covalent bond, chemical adsorption, or physical adsorption can be appropriately selected according to the properties of the target substance 2. . For example, the target substance 2 is brought into contact with the carbon nanotube 202 for a predetermined time, and the target substance 2 is adsorbed to the carbon nanotube 202. Various functional groups are introduced into the carbon nanotube 202, and the introduced functional group and the target substance 2 are covalently bonded. It is possible to adopt a method such as

（電極）
電極２０３は、標的物質固定部２０１を挟むように、基板２０４の表面に２個設けられる。本実施形態のように、二つの電極２０３、２０３を標的物質固定部２０１と同一平面上に作製することができるが、基板２０４の厚さ方向に、第１の電極と、標的物質固定部２０１と、第２の電極とをこの順で積層することで電極を作製してもよい。 (electrode)
Two electrodes 203 are provided on the surface of the substrate 204 so as to sandwich the target substance fixing part 201. As in the present embodiment, the two electrodes 203, 203 can be fabricated on the same plane as the target substance fixing unit 201, but the first electrode and the target substance fixing unit 201 are arranged in the thickness direction of the substrate 204. And an electrode may be produced by laminating the second electrode in this order.

標的物質固定部２０１と電極２０３、２０３を一つの基板２０４に作製する他、プロセス条件や工程を勘案して、標的物質固定部２０１および電極を個別に作製した後、両者をボンディングしてもよい。例えば、基板にカーボンナノチューブを塗布し、これに電極が作製された基板を合わせることにより標的物質検出バイオセンサー２００を作製することができる。このとき、標的物質検出バイオセンサー２００は、少なくともカーボンナノチューブ２０２を含む標的物質固定部２０１が露出するように構成される。   In addition to manufacturing the target substance fixing unit 201 and the electrodes 203 and 203 on one substrate 204, the target substance fixing unit 201 and the electrode may be manufactured separately in consideration of process conditions and processes, and then both may be bonded. . For example, the target substance detection biosensor 200 can be manufactured by applying carbon nanotubes to a substrate and combining the substrate with an electrode formed thereon. At this time, the target substance detection biosensor 200 is configured such that the target substance fixing unit 201 including at least the carbon nanotubes 202 is exposed.

電極２０３、２０３は、導電性のある材料で作製され、標的物質固定部２０１と電気的に接続される。電極２０３、２０３を作製する方法は特に限定されず、公知のＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical Systems）技術を用いることができる。例えば電極２０３をリソグラフィー法により作製することができる。本実施形態においては、一対の電極２０３、２０３で標的物質固定部２０１の両端を挟むようにしているが、電極の数は２個に限定されるものではない。すなわち、基板２０４は、少なくとも２個の電極を有していればよい。   The electrodes 203 and 203 are made of a conductive material and are electrically connected to the target substance fixing unit 201. A method for manufacturing the electrodes 203 and 203 is not particularly limited, and a known MEMS (Micro Electro Mechanical Systems) technique can be used. For example, the electrode 203 can be manufactured by a lithography method. In the present embodiment, both ends of the target substance fixing unit 201 are sandwiched between the pair of electrodes 203 and 203, but the number of electrodes is not limited to two. That is, the substrate 204 only needs to have at least two electrodes.

（標的物質固定部）
以下、複数のカーボンナノチューブというときは、カーボンナノチューブ２０２の一分子ではなく、複数のカーボンナノチューブ２０２全体を指すものとする。複数のカーボンナノチューブ２０５は、一種類のカーボンナノチューブの集合であってもよく、複数種類のカーボンナノチューブの集合であってもよい。標的物質固定部２０１を作製するには、基板２０４上に電極２０３を作製してから複数のカーボンナノチューブ２０５を配置する方法、基板２０４上に電極２０３を作製する前に複数のカーボンナノチューブ２０５を配置する方法のいずれであってもよい。いずれの場合も、標的物質固定部２０１以外に付着したカーボンナノチューブは、酸素プラズマにより除去することが好ましい。 (Target substance fixing part)
Hereinafter, the term “a plurality of carbon nanotubes” refers to the entire plurality of carbon nanotubes 202, not a single molecule of the carbon nanotubes 202. The plurality of carbon nanotubes 205 may be a set of one type of carbon nanotubes or a set of a plurality of types of carbon nanotubes. In order to produce the target substance fixing part 201, a method of arranging the plurality of carbon nanotubes 205 after the electrode 203 is produced on the substrate 204, and arranging the plurality of carbon nanotubes 205 before producing the electrode 203 on the substrate 204. Either method may be used. In any case, it is preferable to remove the carbon nanotubes attached to other than the target substance fixing part 201 by oxygen plasma.

基板２０４上に複数のカーボンナノチューブ２０５を配置する方法には、例えば気相法および液相法が挙げられる。気相法では、複数のカーボンナノチューブ２０５を基板２０４に噴霧することにより基板２０４に塗布する。液相法では、複数のカーボンナノチューブ２０５を各種溶媒に分散または溶解させ、分散液または溶液をピペットやスポッター、スプレー等を用いて基板２０４に塗布する。塗布の均一性に優れているので、スプレーを用いて塗布することが好ましい。複数のカーボンナノチューブ２０５の分散液または溶液を基板２０４に塗布することで、基板２０４に複数のカーボンナノチューブ２０５が不規則な網目状に配置される。   Examples of a method for arranging the plurality of carbon nanotubes 205 on the substrate 204 include a gas phase method and a liquid phase method. In the vapor phase method, a plurality of carbon nanotubes 205 are applied to the substrate 204 by spraying the substrate 204. In the liquid phase method, a plurality of carbon nanotubes 205 are dispersed or dissolved in various solvents, and the dispersion or solution is applied to the substrate 204 using a pipette, spotter, spray, or the like. Since it is excellent in the uniformity of application | coating, it is preferable to apply | coat using a spray. By applying a dispersion or solution of a plurality of carbon nanotubes 205 to the substrate 204, the plurality of carbon nanotubes 205 are arranged on the substrate 204 in an irregular mesh shape.

液相法において用いられる各種溶媒として、例えば、純水、１，２−ジクロロベンゼン、１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ジクロロエタン、ナノ純水、エタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール置換ポリチオフェン（ＨＦＩＰ−ＰＴ）、ポリ（３−へキシルチオフェン）（Ｐ３ＨＴ）、ｎ，ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、トルエン等が挙げられる。また、各種溶媒に界面活性剤を加えた溶液も、カーボンナノチューブを分散または溶解させる溶媒として使用できる。界面活性剤として、例えば、コラン酸ナトリウム、デオキシコラン酸ナトリウム（ＳＯＤ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００が挙げられる。界面活性剤を加えた溶媒として、例えば、コラン酸ナトリウム水溶液、デオキシコラン酸ナトリウム（ＳＯＤ）水溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液が挙げられる。   Examples of various solvents used in the liquid phase method include pure water, 1,2-dichlorobenzene, 1-methyl-2-pyrrolidone (NMP), dichloroethane, nanopure water, ethanol, hexafluoroisopropanol-substituted polythiophene (HFIP-PT ), Poly (3-hexylthiophene) (P3HT), n, n-dimethylformamide (DMF), toluene and the like. Further, a solution obtained by adding a surfactant to various solvents can also be used as a solvent for dispersing or dissolving the carbon nanotubes. Examples of the surfactant include sodium colanate, sodium deoxycholate (SOD), sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium dodecylbenzene sulfonate (SDBS), cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), Brij (registered trademark) 35, Examples include Tween (registered trademark) 20, Tween (registered trademark) 40, Tween (registered trademark) 60, and Triton (registered trademark) X-100. Examples of the solvent to which the surfactant is added include sodium colanate aqueous solution, sodium deoxycholanoate (SOD) aqueous solution, and sodium dodecyl sulfate (SDS) aqueous solution.

溶媒に加える分散助剤あるいは溶解助剤として、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ等の生体物質を用いることができ、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル基等の親水基、および／または、アリール基、アルキル基等の疎水基が結合した各種多環式芳香族分子、側鎖にピレン等の多環式芳香族炭化水素を有する高分子、非共役系高分子、共役系高分子、これらのブロック共重合体等を用いることができる。   Biological substances such as peptides, proteins, and DNA can be used as dispersion aids or dissolution aids added to the solvent. Hydrophilic groups such as hydroxy groups, amino groups, carboxyl groups, and / or aryl groups, alkyl groups, etc. Various polycyclic aromatic molecules to which a hydrophobic group is bonded, polymers having polycyclic aromatic hydrocarbons such as pyrene in the side chain, non-conjugated polymers, conjugated polymers, block copolymers thereof, etc. Can be used.

複数のカーボンナノチューブ２０５の分散または溶解のために溶媒に界面活性剤、分散助剤、または溶解助剤を加えない場合は、複数のカーボンナノチューブ２０５を基板２０４上に配置した後に溶媒を除去するだけでよく、界面活性剤、分散助剤、または溶解助剤を除去する必要がない点で有利である。   When a surfactant, dispersion aid, or dissolution aid is not added to the solvent for dispersing or dissolving the plurality of carbon nanotubes 205, the solvent is simply removed after the plurality of carbon nanotubes 205 are placed on the substrate 204. This is advantageous in that it is not necessary to remove the surfactant, dispersion aid, or dissolution aid.

複数のカーボンナノチューブ２０５の分散または溶解のために溶媒に界面活性剤、分散助剤、または溶解助剤を加えると、これらを加えない場合と比較して短時間で複数のカーボンナノチューブ２０５を溶媒中に分散または溶解することができる。また、カーボンナノチューブ２０２の溶媒中の濃度を大きくすることができる。   When a surfactant, a dispersion aid, or a dissolution aid is added to the solvent to disperse or dissolve the plurality of carbon nanotubes 205, the plurality of carbon nanotubes 205 are added to the solvent in a shorter time than when these are not added. Can be dispersed or dissolved. Further, the concentration of the carbon nanotube 202 in the solvent can be increased.

複数のカーボンナノチューブ２０５を各種溶媒に分散または溶解する場合に、各種溶媒と複数のカーボンナノチューブ２０５との混合物に超音波を加えると、分散または溶解の速度が大きくなるので好ましい。各種溶媒と複数のカーボンナノチューブ２０５との混合物を加温してもよい。各種溶媒に、界面活性剤、分散助剤、または溶解助剤（以下界面活性剤等という）が加えられている場合も同様であり、混合物に超音波を加えることが好ましく、混合物を加温してもよい。   When dispersing or dissolving a plurality of carbon nanotubes 205 in various solvents, it is preferable to apply ultrasonic waves to a mixture of the various solvents and the plurality of carbon nanotubes 205 because the speed of dispersion or dissolution increases. A mixture of various solvents and the plurality of carbon nanotubes 205 may be heated. The same applies when surfactants, dispersion aids, or dissolution aids (hereinafter referred to as surfactants) are added to various solvents, and it is preferable to apply ultrasonic waves to the mixture, and warm the mixture. May be.

溶媒または界面活性剤等を加えた溶媒中に分散または溶解させた複数のカーボンナノチューブ２０５の分散液または溶解液を基板２０４に配置した後、溶媒を除去する。溶媒に界面活性剤等を加えた場合は、複数のカーボンナノチューブ２０５を基板２０４に配置した後に、基板２０４から溶媒を除去し、さらに界面活性剤等を洗浄除去し基板２０４から洗浄液を除去する。次いで、基板２０４を乾燥させる。   After a dispersion or solution of a plurality of carbon nanotubes 205 dispersed or dissolved in a solvent to which a solvent or a surfactant is added is placed on the substrate 204, the solvent is removed. When a surfactant or the like is added to the solvent, after the plurality of carbon nanotubes 205 are arranged on the substrate 204, the solvent is removed from the substrate 204, and the surfactant and the like are further removed by washing to remove the cleaning liquid from the substrate 204. Next, the substrate 204 is dried.

複数のカーボンナノチューブ２０５を基板２０４に配置した後、複数のカーボンナノチューブ２０５に標的物質２を接触させて、複数のカーボンナノチューブ２０５に標的物質２を物理吸着させ、カーボンナノチューブ２０２に標的物質２を固定させる。または、複数のカーボンナノチューブ２０５に、標的物質２および各種試薬を加えて、複数のカーボンナノチューブ２０５と標的物質２との間に化学的結合を形成させ、カーボンナノチューブ２０２に標的物質２を固定させる。   After the plurality of carbon nanotubes 205 are arranged on the substrate 204, the target substance 2 is brought into contact with the plurality of carbon nanotubes 205, the target substance 2 is physically adsorbed on the plurality of carbon nanotubes 205, and the target substance 2 is fixed to the carbon nanotubes 202. Let Alternatively, the target substance 2 and various reagents are added to the plurality of carbon nanotubes 205 to form a chemical bond between the plurality of carbon nanotubes 205 and the target substance 2, and the target substance 2 is fixed to the carbon nanotubes 202.

複数のカーボンナノチューブ２０５を基板２０４に配置した後に、カーボンナノチューブ２０２に標的物質２を固定させてもよいが、カーボンナノチューブ２０２に標的物質２を固定させた後に、標的物質２を固定したカーボンナノチューブ２０２を各種溶媒に分散または溶解し、得られた分散液または溶解液を基板２０４に塗布してもよい。その場合、標的物質２を固定したカーボンナノチューブ２０２が変性しないような分散・溶解の条件を選択することが好ましい。   The target material 2 may be fixed to the carbon nanotubes 202 after arranging the plurality of carbon nanotubes 205 on the substrate 204. However, after the target material 2 is fixed to the carbon nanotubes 202, the carbon nanotubes 202 to which the target material 2 is fixed are fixed. May be dispersed or dissolved in various solvents, and the obtained dispersion or solution may be applied to the substrate 204. In that case, it is preferable to select a dispersion / dissolution condition such that the carbon nanotubes 202 on which the target substance 2 is immobilized are not denatured.

基板２０４上に複数のカーボンナノチューブ２０５を不規則な網目状に配置し、次いで複数のカーボンナノチューブ２０５に標的物質２を固定させる。このようにすることで、標的物質２が固定された複数のカーボンナノチューブ２０５が、不規則な網目状に配置された標的物質固定部２０１が形成される。または、基板２０４上に標的物質２が固定された複数のカーボンナノチューブ２０５を不規則な網目状に配置することで、基板２０４上に標的物質固定部２０１が形成される。   A plurality of carbon nanotubes 205 are arranged in an irregular network shape on the substrate 204, and then the target substance 2 is fixed to the plurality of carbon nanotubes 205. By doing in this way, the target substance fixing | fixed part 201 in which the some carbon nanotube 205 with which the target substance 2 was fixed is arrange | positioned in irregular mesh shape is formed. Alternatively, the target substance fixing portion 201 is formed on the substrate 204 by arranging the plurality of carbon nanotubes 205 on which the target substance 2 is fixed on the substrate 204 in an irregular mesh shape.

標的物質２を固定した複数のカーボンナノチューブ２０５を不規則な網目状に配置することで、複数のカーボンナノチューブ２０５が、様々な特性を持ったカーボンナノチューブの集合であっても、平均化されたカーボンナノチューブの特性が標的物質検出バイオセンサー２００に現れる。そのため、複数の標的物質検出バイオセンサー２００同士の関係ではばらつきのない特性を得ることができる。すなわち、様々な特性を持ったカーボンナノチューブを分離せずに用いることができるので、簡易に標的物質検出バイオセンサー２００を作製でき、その結果簡易に標的物質２を検出することができる。   By arranging a plurality of carbon nanotubes 205 to which the target substance 2 is fixed in an irregular network shape, even if the plurality of carbon nanotubes 205 is an aggregate of carbon nanotubes having various characteristics, an averaged carbon The characteristic of the nanotube appears in the target substance detection biosensor 200. For this reason, it is possible to obtain characteristics that do not vary in the relationship between the plurality of target substance detection biosensors 200. That is, since carbon nanotubes having various characteristics can be used without being separated, the target substance detection biosensor 200 can be easily produced, and as a result, the target substance 2 can be easily detected.

以下に、標的物質固定部１０１および電極２０３、２０３の作製例を示す。絶縁膜として酸化ケイ素膜が形成されたケイ素基板上に、厚さ２μｍのフォトレジスト（ＯＦＰＲ８００ＬＢ：東京応化株式会社製）をスピンコートにより塗布し、基板に対して９０℃で８分間プレベーク処理を行う。その後、電極のパターンを持つマスクを用いて基板を露光（ＥＭＡ−４００：ユニオン光学株式会社製）し、現像液（ＭＮＤ３：東京応化株式会社製）を用いてパターンを現像する。最後に超純水で基板を６０秒間リンスする。その後リフトオフ法により基板上に電極を形成する。具体的には、スパッタリング法により基板に連続的に１０ｎｍのＣｒ、次いで５０ｎｍのＡｕを塗布し、アセトンにより基板上の残留フォトレジストを除去する。その後、ダイシング装置により１０μｍ×１０μｍのチップサイズに切断する。切断したチップの電極に配線を施し、パッケージングを行って、電極が作製された基板を得る。   Hereinafter, an example of manufacturing the target substance fixing unit 101 and the electrodes 203 and 203 will be described. A 2 μm-thick photoresist (OFPR800LB: manufactured by Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd.) is applied onto a silicon substrate on which a silicon oxide film is formed as an insulating film by spin coating, and prebaking is performed on the substrate at 90 ° C. for 8 minutes. . Then, the substrate is exposed (EMA-400: manufactured by Union Optical Co., Ltd.) using a mask having an electrode pattern, and the pattern is developed using a developer (MND3: manufactured by Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd.). Finally, the substrate is rinsed with ultrapure water for 60 seconds. Thereafter, an electrode is formed on the substrate by a lift-off method. Specifically, 10 nm of Cr and then 50 nm of Au are continuously applied to the substrate by a sputtering method, and residual photoresist on the substrate is removed with acetone. Thereafter, it is cut into a chip size of 10 μm × 10 μm by a dicing apparatus. Wiring is applied to the electrode of the cut chip and packaging is performed to obtain a substrate on which the electrode is manufactured.

純水中に、カーボンナノチューブ（製品Ｍｅｉｊｏ Ａｒｃ：名城ナノカーボン製）を加える。得られた混合物に超音波を５時間加えてカーボンナノチューブを液中に分散させる。この分散液をピペットに取り、電極が作製された基板上に滴下する。その後、基板を乾燥し、カーボンナノチューブが不規則な網目状に基板上に配置されたカーボンナノチューブ塗布基板を得る。このカーボンナノチューブ塗布基板のカーボンナノチューブ部分に、一定量の標的物質２を固定させる。   Carbon nanotubes (product Meijo Arc: made by Meijo Nano Carbon) are added to pure water. Ultrasonic waves are added to the obtained mixture for 5 hours to disperse the carbon nanotubes in the liquid. This dispersion is taken up in a pipette and dropped onto the substrate on which the electrode is formed. Thereafter, the substrate is dried to obtain a carbon nanotube-coated substrate in which the carbon nanotubes are arranged on the substrate in an irregular network shape. A fixed amount of the target substance 2 is fixed to the carbon nanotube portion of the carbon nanotube-coated substrate.

標的物質検出バイオセンサー２００は、第１の固定された複合体４ｂの量と相関し、かつ標的物質固定部２０１に含まれるカーボンナノチューブ２０２の表面状態の変化に相関する物理量として、電気的な物理量である電気抵抗値を出力する。具体的には、標的物質検出バイオセンサー２００は、二つの電極２０３間の電気抵抗値を物理量として出力する。   The target substance detection biosensor 200 is an electrical physical quantity that correlates with the amount of the first immobilized complex 4b and correlates with a change in the surface state of the carbon nanotubes 202 included in the target substance fixing unit 201. The electrical resistance value is output. Specifically, the target substance detection biosensor 200 outputs the electrical resistance value between the two electrodes 203 as a physical quantity.

標的物質２の検出および定量は、−ΔＧ／Ｇ０の値に基づいて行う。ここで、Ｇ０は標的物質検出バイオセンサー２００の標的物質固定部２０１に試料を接触させる直前の電気抵抗値Ｒ０の逆数であり、Ｇｔは標的物質検出バイオセンサー２００に試料を接触させた時をｔ＝０とした場合におけるｔ秒後の電気抵抗値Ｒｔの逆数であり、ΔＧ＝Ｇｔ−Ｇ０である。標的物質２の濃度を定量するには、標的物質２の濃度が既知である参照試料を標的物質検出バイオセンサー２００の標的物質固定部２０１に接触させる。１０分後〜数１０分後に−ΔＧ／Ｇ０の値は一定値に達する。標的物質２の濃度により、この−ΔＧ／Ｇ０の一定値は変化する。標的物質２の濃度に対して−ΔＧ／Ｇ０の値をプロットすると、標的物質２の検量線が得られる。標的物質２の濃度が未知である試料の−ΔＧ／Ｇ０の一定値を測定し、前記参照試料から得られた前記一定値と検量線とを比較することにより、試料に含まれる標的物質２の濃度を決定することができる。なお、標的物質２の検出および定量は、−ΔＧ／Ｇ０ではなくΔＧ／Ｇ０の値に基づいて行ってもよい。 Detection and quantification of the target substance 2 are performed based on the value of -ΔG / G 0 . Here, G 0 is the reciprocal of the electrical resistance value R 0 immediately before the sample is brought into contact with the target substance fixing unit 201 of the target substance detection biosensor 200, and G t is the sample brought into contact with the target substance detection biosensor 200. This is the reciprocal of the electric resistance value R t after t seconds when the time is t = 0, and ΔG = G t −G 0 . In order to quantify the concentration of the target substance 2, a reference sample whose concentration of the target substance 2 is known is brought into contact with the target substance fixing unit 201 of the target substance detection biosensor 200. The value of -ΔG / G 0 reaches a constant value after 10 minutes to several tens of minutes. The constant value of −ΔG / G 0 changes depending on the concentration of the target substance 2. When the value of -ΔG / G 0 is plotted against the concentration of the target substance 2, a calibration curve of the target substance 2 is obtained. The target substance 2 contained in the sample is measured by measuring a constant value of −ΔG / G 0 of the sample whose concentration of the target substance 2 is unknown, and comparing the constant value obtained from the reference sample with a calibration curve. The concentration of can be determined. The detection and quantification of the target substance 2 may be performed based on the value of ΔG / G 0 instead of −ΔG / G 0 .

標的物質２の検出をするにあたり、参照電極として銀−塩化銀電極、カロメル電極、パラジウム−水素電極などを用いることができる。安定性に優れるため、銀−塩化銀電極を用いることが好ましい。また、参照電極として、市販のものを用いてもよいし、参照電極を標的物質検出バイオセンサー２００に組み込んでもよい。   In detecting the target substance 2, a silver-silver chloride electrode, a calomel electrode, a palladium-hydrogen electrode, or the like can be used as a reference electrode. Since it is excellent in stability, it is preferable to use a silver-silver chloride electrode. A commercially available reference electrode may be used, or the reference electrode may be incorporated into the target substance detection biosensor 200.

次に、標的物質検出バイオセンサー２００が検出感度に優れている点を示す。比較例として、標的物質２ではなく、標的物質結合物質３を標的物質固定部２０１に固定させた以外は、標的物質検出バイオセンサー２００と同じ構成のバイオセンサーを用いた。比較例では、試料Ｓを標的物質結合物質３と反応させることなく、直接標的物質結合物質３を固定させた場所に接触させ、バイオセンサーから電気抵抗値を出力させた。   Next, the point that the target substance detection biosensor 200 is excellent in detection sensitivity will be described. As a comparative example, a biosensor having the same configuration as the target substance detection biosensor 200 was used except that the target substance binding substance 3 was fixed to the target substance fixing unit 201 instead of the target substance 2. In the comparative example, without reacting the sample S with the target substance-binding substance 3, the sample S was directly brought into contact with the place where the target substance-binding substance 3 was fixed, and the electrical resistance value was output from the biosensor.

比較は、同一試料を標的物質検出バイオセンサー２００および比較例のバイオセンサーにそれぞれ接触させ、標的物質検出バイオセンサー２００および比較例のバイオセンサーから電気抵抗値を出力させることにより行った。図３は、標的物質検出バイオセンサー２００から出力される電気抵抗値から換算された−ΔＧ／Ｇ０と、比較例のバイオセンサーから出力される電気抵抗値から換算された−ΔＧ／Ｇ０との、相対的大きさについて示すグラフである。標的物質２としてコルチゾール、標的物質結合物質３として抗コルチゾール抗体を用いた。 The comparison was performed by bringing the same sample into contact with the target substance detection biosensor 200 and the biosensor of the comparative example, and outputting an electrical resistance value from the target substance detection biosensor 200 and the biosensor of the comparative example. Figure 3 is a -ΔG / G 0 which is converted from the electrical resistance values output from the target substance detection biosensor 200, and -ΔG / G 0 which is converted from the electrical resistance value output from the biosensor of the comparative example It is a graph shown about the relative magnitude | size. Cortisol was used as target substance 2, and anti-cortisol antibody was used as target substance binding substance 3.

図３によれば、本実施形態の標的物質検出バイオセンサー２００が出力する−ΔＧ／Ｇ０は、比較例のバイオセンサーが出力する物理量−ΔＧ／Ｇ０よりも大きく、比較例のバイオセンサーよりも標的物質２の検出感度が大きいことがわかる。 According to FIG. 3, −ΔG / G 0 output from the target substance detection biosensor 200 of the present embodiment is larger than the physical quantity −ΔG / G 0 output from the biosensor of the comparative example, which is larger than that of the biosensor of the comparative example. It can also be seen that the detection sensitivity of the target substance 2 is high.

本実施形態の標的物質検出バイオセンサー２００は、標的物質結合物質３を酵素標識する必要がなく、短時間で簡単に標的物質２を感度よく検出することができる。   The target substance detection biosensor 200 of the present embodiment does not need to label the target substance binding substance 3 with an enzyme, and can easily detect the target substance 2 with high sensitivity in a short time.

［実施形態３］
図４−１は、本実施形態に係る標的物質検出バイオセンサーの模式図である。本実施形態に係る標的物質検出バイオセンサー３００（標的物質検出フォトニック結晶バイオセンサー）は、基礎としてのフォトニック結晶３５０に、一定量の標的物質２を固定した標的物質固定部３０１を含む。標的物質固定部３０１は、試料Ｓと、標的物質２と特異的に反応する既知量の標的物質結合物質３との混合物Ｍと接触させられる。標的物質検出バイオセンサー３００は、固定された標的物質２と標的物質結合物質３とで形成される、第１の固定された複合体４ｂの量と相関し、かつ標的物質固定部３０１における表面状態の変化に相関する物理量を出力するものである。 [Embodiment 3]
FIG. 4A is a schematic diagram of the target substance detection biosensor according to the present embodiment. A target substance detection biosensor 300 (target substance detection photonic crystal biosensor) according to this embodiment includes a target substance fixing unit 301 in which a certain amount of target substance 2 is fixed to a photonic crystal 350 as a basis. The target substance fixing unit 301 is brought into contact with the mixture M of the sample S and a known amount of the target substance binding substance 3 that specifically reacts with the target substance 2. The target substance detection biosensor 300 correlates with the amount of the first fixed complex 4b formed by the fixed target substance 2 and the target substance binding substance 3, and the surface state in the target substance fixing unit 301 It outputs a physical quantity that correlates with the change in.

ここで、一般にフォトニック結晶とは、サブ波長間隔の格子構造をもつ構造体であって、構造体表面（以後反射面という。）に広領域波長の光を照射すると、フォトニック結晶の形状および材質に依存した、すなわち、フォトニック結晶の表面状態に依存した特定の波長帯の光を反射または透過するものである。この反射光または透過光の変化を読み取ることにより、フォトニック結晶の表面状態の変化を定量化することができる。フォトニック結晶の表面状態の変化としては、表面への物質の吸着、構造変化等が挙げられる。表面に金属薄膜が形成されたフォトニック結晶も、光が照射されると、光の反射率または光の透過率に極値（極大値または極小値）が現れる。この反射率または透過率の極値は、金属の種類、金属の膜厚、フォトニック結晶の表面形状に依存するものである。この光の反射率または光の透過率を読み取ることにより、フォトニック結晶の表面状態の変化を定量化することができる。金属薄膜については後述する。フォトニック結晶の表面状態の変化を反射光または透過光の変化から定量化するには、例えば、極値（極大値または極小値）である、極値である反射率または透過率の変化量、あるいは反射率または透過率が極値となる波長のシフト量を求めるなどの方法を用いることができる。なお、反射率または透過率の極値が複数ある場合には、任意の極値に着目する。そして、着目した極値について変化量を求め、または着目した極値となる波長のシフト量を求めることによりフォトニック結晶の表面状態の変化を定量することができる。   Here, in general, a photonic crystal is a structure having a lattice structure with sub-wavelength spacing, and when the surface of the structure (hereinafter referred to as a reflective surface) is irradiated with light of a wide wavelength range, It reflects or transmits light in a specific wavelength band depending on the material, that is, depending on the surface state of the photonic crystal. By reading the change in the reflected light or transmitted light, the change in the surface state of the photonic crystal can be quantified. Examples of changes in the surface state of the photonic crystal include adsorption of substances on the surface, structural changes, and the like. Even in a photonic crystal having a metal thin film formed on its surface, when it is irradiated with light, an extreme value (maximum value or minimum value) appears in light reflectance or light transmittance. This extreme value of reflectance or transmittance depends on the type of metal, the thickness of the metal, and the surface shape of the photonic crystal. The change in the surface state of the photonic crystal can be quantified by reading the light reflectance or light transmittance. The metal thin film will be described later. In order to quantify the change in the surface state of the photonic crystal from the change in reflected light or transmitted light, for example, the amount of change in reflectance or transmittance that is an extreme value, which is an extreme value (maximum value or minimum value), Alternatively, a method such as obtaining a shift amount of a wavelength at which the reflectance or transmittance becomes an extreme value can be used. Note that when there are a plurality of extreme values of reflectance or transmittance, attention is paid to arbitrary extreme values. Then, the change in the surface state of the photonic crystal can be quantified by determining the amount of change for the focused extreme value or by determining the shift amount of the wavelength that is the focused extreme value.

例えば、標的物質２と標的物質結合物質３との特異的反応として、コルチゾールと抗コルチゾール抗体との抗原抗体反応を考える。レセプターであるＩｇＧ抗体は、大きさが１０ｎｍ程度であり、コルチゾールは１ｎｍ程度の大きさである。したがって、フォトニック結晶３５０にＩｇＧ抗体を固定させて、抗原であるコルチゾールを反応させる場合よりも、フォトニック結晶３５０に抗原であるコルチゾールを固定させて、抗体であるＩｇＧを反応させる場合の方が、フォトニック結晶３５０の表面状態の変化が大きく、標的物質固定部３０１の感度が大きくなる。また、複合体結合物質５として、例えば抗体に対する抗体（二次抗体）を反応させることによって、フォトニック結晶３５０の表面状態の変化はさらに大きくなり、感度が上昇する。二次抗体はそのまま使用することもできるし、他の物質を付加した二次抗体を用いてもよい。複合体結合物質５である二次抗体が大きいほどフォトニック結晶３５０の表面状態の変化が大きくなり、標的物質固定部３０１の感度が大きくなる。   For example, as a specific reaction between the target substance 2 and the target substance binding substance 3, an antigen-antibody reaction between cortisol and an anti-cortisol antibody is considered. The IgG antibody as a receptor has a size of about 10 nm, and cortisol has a size of about 1 nm. Therefore, the case of immobilizing the antigenic cortisol to the photonic crystal 350 and the reaction of the antibody IgG rather than the case of immobilizing the IgG antibody to the photonic crystal 350 and reacting the antigen cortisol. The change in the surface state of the photonic crystal 350 is large, and the sensitivity of the target substance fixing unit 301 is increased. Further, by reacting, for example, an antibody (secondary antibody) against the antibody as the complex binding substance 5, the change in the surface state of the photonic crystal 350 is further increased, and the sensitivity is increased. The secondary antibody can be used as it is, or a secondary antibody to which another substance is added may be used. The larger the secondary antibody that is the complex-binding substance 5, the greater the change in the surface state of the photonic crystal 350, and the greater the sensitivity of the target substance fixing part 301.

標的物質検出バイオセンサー３００は、第１の固定された複合体４ｂの量が変化することで、反射面の状態が変化し、反射光に変化が生じる。すなわち、標的物質固定部３０１の表面状態に変化が生じる。標的物質検出バイオセンサー３００は、物理量として、標的物質固定部３０１の表面状態の変化に相関し、かつ第１の固定された複合体４ｂの量と相関する光学的な物理量を出力する。光学的な物理量は、例えば、反射光または透過光の強度、極値である反射光または透過光の強度の変化量、反射光または透過光の強度が極値となる波長のシフト量、光の反射率または透過率の変化量、光の反射率または透過率が極値となる波長のシフト量である。   In the target substance detection biosensor 300, when the amount of the first immobilized complex 4b is changed, the state of the reflecting surface is changed, and the reflected light is changed. That is, a change occurs in the surface state of the target substance fixing unit 301. The target substance detection biosensor 300 outputs, as a physical quantity, an optical physical quantity that correlates with a change in the surface state of the target substance fixing unit 301 and correlates with the amount of the first immobilized complex 4b. The optical physical quantity is, for example, the intensity of reflected or transmitted light, the amount of change in the intensity of reflected or transmitted light that is an extreme value, the amount of shift in wavelength at which the intensity of reflected or transmitted light is an extreme value, The amount of change in reflectance or transmittance, and the amount of shift in wavelength at which the reflectance or transmittance of light becomes an extreme value.

光学的な物理量を出力させるには、例えば以下のようにして行う。例えば、標的物質固定部３０１に対して垂直に光を入射し、反射された光を検出する。標的物質固定部３０１に対して角度をつけて光を入射し、反射された光を検出することもできる。また、標的物質固定部３０１から反射された光ではなく、標的物質固定部３０１を透過した光を検出することもできる。反射された光を検出することが好ましい。これにより、装置を構造上省スペースとすることができ、装置を小型化することができる。垂直に入射され、垂直に反射された光を検出する場合には、二股ファイバを用いて光を入射し、反射光を検出することが好ましい。   In order to output an optical physical quantity, for example, it is performed as follows. For example, light is incident on the target substance fixing unit 301 perpendicularly and the reflected light is detected. It is also possible to detect the reflected light by entering light at an angle with respect to the target substance fixing unit 301. Further, not the light reflected from the target substance fixing part 301 but also the light transmitted through the target substance fixing part 301 can be detected. It is preferable to detect the reflected light. Thereby, the apparatus can be made space-saving in structure, and the apparatus can be miniaturized. When detecting vertically incident and vertically reflected light, it is preferable to detect the reflected light by entering light using a bifurcated fiber.

図４−２および図４−３は、本実施形態に係るフォトニック結晶３５０を説明する図である。図４−２はフォトニック結晶３５０の平面図であり、図４−３は図４−２におけるＡ−Ａ断面を示す図である。   FIG. 4B and FIG. 4C are diagrams for explaining the photonic crystal 350 according to the present embodiment. FIG. 4-2 is a plan view of the photonic crystal 350, and FIG. 4-3 is a view showing a cross section taken along line AA in FIG.

本実施形態に係るフォトニック結晶３５０は、表面に凸部３５２が周期的に形成された反射面３５１を有している。円柱状の凸部３５２の直径Ｄは２５０ｎｍである。円柱状の凸部３５２の中心間の距離は、約５００ｎｍである。円柱状の凸部３５２は、三角形の格子状に配置されている。円柱状の凸部３５２の高さＨは、１５０ｎｍである。円柱状の凸部３５２の直径Ｄは５０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましい。また、円柱状の凸部３５２同士の間隔は１００ｎｍを超え２０００ｎｍ以下であることが好ましい。   The photonic crystal 350 according to the present embodiment has a reflection surface 351 on which convex portions 352 are periodically formed. The diameter D of the cylindrical convex portion 352 is 250 nm. The distance between the centers of the columnar convex portions 352 is about 500 nm. The columnar convex portions 352 are arranged in a triangular lattice shape. The height H of the cylindrical convex portion 352 is 150 nm. The diameter D of the columnar convex portion 352 is preferably 50 nm or more and 1000 nm or less. Moreover, it is preferable that the space | interval of the cylindrical convex parts 352 is more than 100 nm and 2000 nm or less.

本実施形態に係るフォトニック結晶３５０の形態は、図４−２および図４−３に示した形態に限定されることはない。例えば、表面に凹部が周期的に形成されたもの、矩形または多角形の格子状の微細パターンが表面に形成されたもの、もしくは、平行線状パターンや波型形状パターン等が表面に形成されたもの、詳しくは周期的にパターン等が形成されたもの、またはこれらのパターンの組合せであってもよい。   The form of the photonic crystal 350 according to the present embodiment is not limited to the form shown in FIGS. 4-2 and 4-3. For example, a concave portion is periodically formed on the surface, a rectangular or polygonal lattice-like fine pattern is formed on the surface, or a parallel line pattern or a corrugated pattern is formed on the surface. In particular, it may be a pattern in which a pattern or the like is periodically formed, or a combination of these patterns.

フォトニック結晶３５０の材質としては、合成樹脂等の有機材料、金属・セラミック等の無機材料を使用することができる。   As a material of the photonic crystal 350, an organic material such as a synthetic resin or an inorganic material such as a metal / ceramic can be used.

合成樹脂としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリシクロオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、アクリル、ポリメタクリル酸エステル、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリテトラフルオロエチレン、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエーテルエーテルケトン等の熱可塑性樹脂、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂等の熱硬化性樹脂が使用できる。   Synthetic resins include polyethylene, polypropylene, polymethylpentene, polycycloolefin, polyamide, polyimide, acrylic, polymethacrylic acid ester, polycarbonate, polyacetal, polytetrafluoroethylene, polybutylene terephthalate, polyethylene terephthalate, polyvinyl chloride, polyvinyl chloride Thermosetting resins such as vinylidene, polystyrene, polyphenylene sulfide, polyether sulfone, polyether ether ketone, and the like, and phenol resins, urea resins, and epoxy resins can be used.

セラミックとしては、シリカ、アルミナ、ジルコニア、チタニア、イットリア等のセラミックを好適に使用することができる。   As the ceramic, ceramics such as silica, alumina, zirconia, titania, and yttria can be suitably used.

金属としては、鉄鋼材料をはじめ各種合金が使用可能である。具体的には、ステンレス鋼やチタン、チタン合金等を好適に使用できる。   As the metal, various alloys including steel materials can be used. Specifically, stainless steel, titanium, titanium alloy, or the like can be suitably used.

上記した各種材料の中でも、光学特性、加工性、標的物質２（ターゲットとなる物質）を含有する溶液に対する耐性、標的物質２の吸着性、洗浄剤に対する耐性等を考慮すると、ポリシクロオレフィン系合成樹脂もしくはシリカ系のセラミックがより好ましい。この中でも、ポリシクロオレフィン系合成樹脂は加工性に優れており最も好適である。   Among the various materials described above, in consideration of optical properties, processability, resistance to a solution containing the target substance 2 (target substance), adsorption of the target substance 2, resistance to a cleaning agent, etc., polycycloolefin synthesis A resin or a silica-based ceramic is more preferable. Among these, the polycycloolefin-based synthetic resin is most suitable because of its excellent processability.

フォトニック結晶３５０は、上記材料基板の表面に微細な加工を施すことにより作成される。加工方法としては、レーザー加工、熱ナノインプリント、光ナノインプリント、フォトマスクとエッチングの組合せ等が使用できる。   The photonic crystal 350 is formed by performing fine processing on the surface of the material substrate. As a processing method, laser processing, thermal nanoimprint, optical nanoimprint, a combination of a photomask and etching, or the like can be used.

特に、ポリシクロオレフィン系合成樹脂等の熱可塑性樹脂を材料とする場合には、熱ナノインプリントによる方法が好適である。   In particular, when a thermoplastic resin such as a polycycloolefin-based synthetic resin is used as a material, a method using thermal nanoimprinting is preferable.

フォトニック結晶３５０は、その表面に金属薄膜が形成されたものであることが好ましい。金属は、ＡｕまたはＡｇであることが好ましい。安定性に優れるために、Ａｕであることが特に好ましい。金属薄膜の形成は、スパッタリングや、蒸着装置による形成など、公知の方法を用いて行うことができる。金属薄膜の厚さは、好ましくは５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、さらに好ましくは１５０ｎｍ以上４００ｎｍ以下である。金属薄膜が適度に厚いと、光を透過させないため好ましく、金属薄膜が適度に薄いと、フォトニック結晶３５０の表面に詳細なパターン形状を作製することが容易であるので好ましい。例えば、パターンの角がシャープになって、パターンの寸法を確保することが容易となる。   The photonic crystal 350 preferably has a metal thin film formed on the surface thereof. The metal is preferably Au or Ag. In order to be excellent in stability, Au is particularly preferable. The metal thin film can be formed using a known method such as sputtering or vapor deposition. The thickness of the metal thin film is preferably 50 nm or more and 500 nm or less, and more preferably 150 nm or more and 400 nm or less. An appropriately thick metal thin film is preferable because it does not transmit light, and an appropriately thin metal thin film is preferable because a detailed pattern shape can be easily formed on the surface of the photonic crystal 350. For example, the corners of the pattern become sharp and it becomes easy to ensure the dimensions of the pattern.

フォトニック結晶３５０の表面を、3-triethoxysilylpropylamine（ＡＰＴＥＳ）を用いて改質することが好ましい。フォトニック結晶３５０の表面に、ＡｕまたはＡｇ薄膜を形成させた場合には、ＡＰＴＥＳではなく、一端にチオール基を有し、他端にアミノ基やカルボキシル基などの官能基を有する炭素鎖を用いてフォトニック結晶３５０の表面を改質することが好ましい。ＡｕやＡｇ以外の金属薄膜をフォトニック結晶３５０の表面に形成させた場合は、一端に官能基を有するシラン系カップリング剤、例えばＡＰＴＥＳを使用して、フォトニック結晶３５０の表面を改質することが好ましい。   It is preferable to modify the surface of the photonic crystal 350 using 3-triethoxysilylpropylamine (APTES). When an Au or Ag thin film is formed on the surface of the photonic crystal 350, a carbon chain having a thiol group at one end and a functional group such as an amino group or a carboxyl group at the other end is used instead of APTES. It is preferable to modify the surface of the photonic crystal 350. When a metal thin film other than Au or Ag is formed on the surface of the photonic crystal 350, the surface of the photonic crystal 350 is modified by using a silane coupling agent having a functional group at one end, for example, APTES. It is preferable.

標的物質２は、フォトニック結晶３５０の反射面３５１に固定される。標的物質２をフォトニック結晶３５０の反射面３５１に固定する手段として、共有結合、化学吸着、物理吸着などの、化学的結合、物理的結合方法が挙げられ、これらの手段を、標的物質２の性質に応じて適宜選択することができる。例えば、固定する手段として吸着を選択した場合、操作は例えば以下のようなものである。標的物質２を含んだ溶液を、フォトニック結晶３５０の反射面３５１に滴下し、所定の時間、室温で、または必要に応じ冷却・加温して、標的物質２を反射面３５１に吸着させる。   The target substance 2 is fixed to the reflection surface 351 of the photonic crystal 350. Examples of means for fixing the target substance 2 to the reflecting surface 351 of the photonic crystal 350 include chemical bonding and physical bonding methods such as covalent bonding, chemical adsorption, and physical adsorption. It can be appropriately selected depending on the properties. For example, when adsorption is selected as the fixing means, the operation is as follows, for example. A solution containing the target substance 2 is dropped on the reflection surface 351 of the photonic crystal 350, and the target substance 2 is adsorbed on the reflection surface 351 by cooling and heating for a predetermined time at room temperature or as necessary.

フォトニック結晶３５０に固定される標的物質２の量は、一定量である。固定される標的物質２の量が一定量であることで、固定される標的物質２と標的物質結合物質３とが複合体４ｂを形成した場合に、形成した複合体４ｂの量と相関する物理量を、標的物質検出バイオセンサー３００が出力できる。固定される標的物質２の一定量は、適宜変更してもよく、例えば、試料Ｓに含まれる標的物質２の量の範囲によって最適な量に設定することができる。   The amount of the target substance 2 fixed to the photonic crystal 350 is a fixed amount. When the amount of the target substance 2 to be fixed is a fixed amount, and the target substance 2 to be fixed and the target substance binding substance 3 form a complex 4b, a physical quantity that correlates with the amount of the complex 4b formed. Can be output by the target substance detection biosensor 300. The fixed amount of the target substance 2 to be fixed may be appropriately changed. For example, it can be set to an optimum amount according to the range of the amount of the target substance 2 contained in the sample S.

標的物質固定部３０１は、標的物質２が固定された後の反射面３５１に、ブロッキング剤（保護物質）が固定されたものであってもよい。ブロッキング剤は、標的物質結合物質３が標的物質固定部３０１に接触させられる前に固定される。フォトニック結晶３５０の表面は、一般的に超疎水性であり、疎水性相互作用によって標的物質結合物質３以外の不純物を吸着してしまうおそれがある。さらに、フォトニック結晶３５０の光学特性は表面状態に大きく影響されるので、フォトニック結晶３５０の表面には、なるべく不純物が吸着されていない方が検出の精度は向上する。   The target substance fixing unit 301 may be one in which a blocking agent (protective substance) is fixed to the reflective surface 351 after the target substance 2 is fixed. The blocking agent is fixed before the target substance binding substance 3 is brought into contact with the target substance fixing part 301. The surface of the photonic crystal 350 is generally superhydrophobic, and there is a possibility that impurities other than the target substance binding substance 3 may be adsorbed by hydrophobic interaction. Furthermore, since the optical characteristics of the photonic crystal 350 are greatly influenced by the surface state, the detection accuracy is improved when the surface of the photonic crystal 350 is not adsorbed with impurities as much as possible.

したがって、標的物質２が吸着（固定）された部分以外の箇所には、不純物等が固定されない様に、いわゆるブロッキング剤をあらかじめ固定させておくことが好ましい。ブロッキング剤をあらかじめ吸着させておくには、ブロッキング剤を、フォトニック結晶３５０の表面に接触させる。ブロッキング剤として、スキムミルクやウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等を使用することができる。   Therefore, it is preferable to fix a so-called blocking agent in advance so that impurities and the like are not fixed at a portion other than the portion where the target substance 2 is adsorbed (fixed). In order to adsorb the blocking agent in advance, the blocking agent is brought into contact with the surface of the photonic crystal 350. As a blocking agent, skim milk, bovine serum albumin (BSA), or the like can be used.

次に、標的物質検出バイオセンサー３００の構造について説明する。標的物質検出バイオセンサー３００は、プレート３０２と、開口部３０４が設けられているプレート３０３とにより標的物質固定部３０１を挟む構造である。開口部３０４の一端は、標的物質固定部３０１の基礎となるフォトニック結晶３５０の反射面３５１により閉塞される。このような構造のため、プレート３０３の開口部３０４側内壁と反射面３５１とで囲まれたある一定容積の凹部（試料保持部）ができる。この凹部に試料が保持されるので、少量の試料であっても検出・測定が可能となる。なお、開口部３０４側内壁とは、プレート３０３と開口部３０４との境界面である、プレート３０３の内壁をいう。   Next, the structure of the target substance detection biosensor 300 will be described. The target substance detection biosensor 300 has a structure in which a target substance fixing part 301 is sandwiched between a plate 302 and a plate 303 provided with an opening 304. One end of the opening 304 is blocked by the reflecting surface 351 of the photonic crystal 350 that is the basis of the target substance fixing unit 301. Due to such a structure, a concave portion (sample holding portion) having a certain volume surrounded by the inner wall on the opening 304 side of the plate 303 and the reflecting surface 351 can be formed. Since the sample is held in the concave portion, even a small amount of sample can be detected and measured. Note that the inner wall on the opening 304 side refers to the inner wall of the plate 303 that is a boundary surface between the plate 303 and the opening 304.

開口部３０４は、試料を保持することができる形状であれば図示した円柱形に限らず、各種の形状とすることができる。また、開口部３０４を円柱状とした場合、その直径等は、標的物質２と標的物質結合物質３との組み合わせの種類、例えば抗体と抗原との組合せの種類や、必要な測定精度、または、反射光の検出器の光学系に合わせて様々な直径とすることができる。好ましくは、開口部３０４は直径０．５ｍｍ〜１０ｍｍとするのが好ましい。より好ましくは、上記リンス操作や吸着操作時の操作や取り扱いの利便性を考慮し２〜６ｍｍ程度とすることが好ましい。   The opening 304 is not limited to the illustrated cylindrical shape as long as it can hold the sample, and can have various shapes. Further, when the opening 304 is cylindrical, the diameter or the like is the type of the combination of the target substance 2 and the target substance binding substance 3, for example, the type of the combination of the antibody and the antigen, the required measurement accuracy, or Various diameters can be selected in accordance with the optical system of the reflected light detector. Preferably, the opening 304 has a diameter of 0.5 mm to 10 mm. More preferably, it is preferably about 2 to 6 mm in consideration of the convenience of operation and handling during the rinsing operation and the adsorption operation.

プレート３０２，３０３の材料として種々のものを選択することができる。表面が清浄である材料が好ましく、特にステンレス鋼、ポリシクロオレフィン系樹脂、シリカを有するものが好ましい。   Various materials can be selected for the materials of the plates 302 and 303. A material having a clean surface is preferable, and a material having stainless steel, polycycloolefin resin, or silica is particularly preferable.

プレート３０３を疎水性の材料とすると、唾液等の親水性の試料の検出・定量を行う場合は、凹部に試料を集めることができるので好ましい。また、脂質等のいわゆる親油性の試料溶液の検出・定量を行う場合はプレート３０３を親水性の材料とすることが好ましい。   When the plate 303 is made of a hydrophobic material, it is preferable to detect and quantify a hydrophilic sample such as saliva because the sample can be collected in the recess. In addition, when detecting and quantifying so-called lipophilic sample solutions such as lipids, the plate 303 is preferably made of a hydrophilic material.

さらに、プレート３０３を撥水性、撥油性、または、撥水撥油性のある材料で形成することも好ましい。また、表面処理やコーティングを行うことにより、プレート３０３表面に撥水性、撥油性、または、撥水撥油性を付与してもよい。このようにすることで、凹部に試料を集めることができる。   Furthermore, it is also preferable to form the plate 303 with a material having water repellency, oil repellency, or water / oil repellency. Further, water repellency, oil repellency, or water / oil repellency may be imparted to the surface of the plate 303 by performing surface treatment or coating. By doing in this way, a sample can be collected in a recessed part.

標的物質２の検出・定量は、標的物質検出バイオセンサー３００が出力する光学的な物理量、例えば、光強度の極値の変化量、光強度が極値となる波長のシフト量、光の反射率または透過率の極値の変化量、光の反射率または透過率が極値となる波長のシフト量に基づいて行われる。標的物質２の検出・定量を、光の最大強度波長または最小強度波長のシフト量に基づいて行ってもよい。標的物質２の検出・定量を光の反射率が極値となる波長のシフト量に基づいて行う場合には、例えば以下のようにして行う。   The detection and quantification of the target substance 2 is performed by optical physical quantities output from the target substance detection biosensor 300, for example, the amount of change in the extreme value of the light intensity, the shift amount of the wavelength at which the light intensity becomes the extreme value, and the light reflectance. Alternatively, it is performed based on the amount of change in the extreme value of the transmittance and the shift amount of the wavelength at which the light reflectance or transmittance becomes the extreme value. Detection and quantification of the target substance 2 may be performed based on the shift amount of the maximum intensity wavelength or the minimum intensity wavelength of light. When the detection / quantification of the target substance 2 is performed based on the shift amount of the wavelength at which the light reflectance is an extreme value, for example, it is performed as follows.

まず、フォトニック結晶３５０に一定量の標的物質２を固定させて、フォトニック結晶３５０の反射面３５１に、例えば３００ｎｍ以上９００ｎｍ以下の光を照射する。このときの、光の反射率が極値（極大値または極小値）となる波長をλ１とする。   First, a certain amount of the target substance 2 is fixed to the photonic crystal 350, and the reflection surface 351 of the photonic crystal 350 is irradiated with light of, for example, 300 nm to 900 nm. At this time, the wavelength at which the light reflectance is an extreme value (maximum value or minimum value) is λ1.

次に、標的物質検出バイオセンサー３００の標的物質固定部３０１に、試料Ｓと既知量の標的物質結合物質３との混合物Ｍを接触させて、標的物質固定部３０１の表面に第１の固定された複合体４ｂを形成させる。その後、標的物質検出バイオセンサー３００の反射面３５１に、例えば３００ｎｍ以上９００ｎｍ以下の光を照射する。このときの、光の反射率が極値（極大値または極小値）となる波長をλ２とする。標的物質固定部３０１に、第２の固定された複合体６を形成させる場合は、形成させた後の標的物質検出バイオセンサー３００に光を照射する。その結果得られる光の反射率が極値となる波長をλ２とする。極値が複数ある場合には、着目する極値を適宜選定する。選定された任意の極値について、波長λ１および波長λ２を求める。   Next, the target substance fixing unit 301 of the target substance detection biosensor 300 is brought into contact with the mixture M of the sample S and a known amount of the target substance binding substance 3 to be first fixed on the surface of the target substance fixing unit 301. The complex 4b is formed. Thereafter, the reflective surface 351 of the target substance detection biosensor 300 is irradiated with light having a wavelength of 300 nm to 900 nm, for example. At this time, the wavelength at which the light reflectance becomes an extreme value (maximum value or minimum value) is λ2. When forming the second immobilized complex 6 in the target substance fixing unit 301, the target substance detection biosensor 300 after the formation is irradiated with light. The wavelength at which the reflectance of the light obtained as a result is an extreme value is λ2. When there are a plurality of extreme values, the extreme value of interest is appropriately selected. The wavelength λ1 and the wavelength λ2 are obtained for the selected arbitrary extreme value.

光の反射率が極値となる波長のシフト量Δλは、λ２−λ１である。標的物質固定部３０１における表面状態の変化に応じて、シフト量Δλは変化する。このΔλに基づいて、標的物質２の検出・定量を行う。   The shift amount Δλ of the wavelength at which the light reflectance is an extreme value is λ2−λ1. The shift amount Δλ changes according to the change in the surface state of the target substance fixing unit 301. Based on this Δλ, the target substance 2 is detected and quantified.

標的物質２の検出・定量を、光強度を用いて行う場合には、以下のようにして行う。まず、フォトニック結晶３５０に標的物質２を固定させる前に、フォトニック結晶３５０の反射面３５１に光を照射して、特定波長における反射光の強度を出力させ、これを第１の強度Ｉ１とする。   When detecting and quantifying the target substance 2 using light intensity, it is performed as follows. First, before fixing the target substance 2 to the photonic crystal 350, the reflection surface 351 of the photonic crystal 350 is irradiated with light to output the intensity of the reflected light at a specific wavelength, which is referred to as a first intensity I1. To do.

次に、標的物質２が固定された標的物質検出バイオセンサー３００の反射面３５１に光を照射して、特定波長における反射光の強度を出力させ、これを第２の強度Ｉ２とする。   Next, light is irradiated to the reflection surface 351 of the target substance detection biosensor 300 to which the target substance 2 is fixed, and the intensity of the reflected light at the specific wavelength is output, which is set as the second intensity I2.

次に、標的物質検出バイオセンサー３００の標的物質固定部３０１に、試料Ｓと既知量の標的物質結合物質３との混合物Ｍを接触させて、標的物質固定部３０１の表面に第１の固定された複合体４ｂを形成させる。その後、標的物質検出バイオセンサー３００の反射面３５１に光を照射して、特定波長における反射光の強度を出力させ、これを第３の強度Ｉ３とする。標的物質固定部３０１に、第２の固定された複合体６を形成させる場合は、形成させた後の標的物質検出バイオセンサー３００に光を照射して得られた反射光の強度を第３の強度Ｉ３とする。   Next, the target substance fixing unit 301 of the target substance detection biosensor 300 is brought into contact with the mixture M of the sample S and a known amount of the target substance binding substance 3 to be first fixed on the surface of the target substance fixing unit 301. The complex 4b is formed. Thereafter, the reflection surface 351 of the target substance detection biosensor 300 is irradiated with light, and the intensity of the reflected light at a specific wavelength is output, which is set as a third intensity I3. When forming the second immobilized complex 6 in the target substance fixing unit 301, the intensity of the reflected light obtained by irradiating the target substance detection biosensor 300 after the formation with the light is set to the third level. The intensity is I3.

標的物質２の定量は、第３の強度と第２の強度との差の絶対値｜Ｉ３−Ｉ２｜に基づいて行ってもよいが、第３の強度を第１の強度で除した値と、第２の強度を第１の強度で除した値との差の絶対値｜Ｉ３／Ｉ１−Ｉ２／Ｉ１｜に基づいて行うことが好ましい。それは以下の理由による。フォトニック結晶３５０に標的物質２が固定される前に出力された、フォトニック結晶３５０の反射光強度は、熱ナノインプリントの成形条件などによってバラツキが発生する場合がある。また、標的物質２がフォトニック結晶３５０に固定される量は、標的物質検出バイオセンサー３００毎にバラツキが発生する場合がある。そのため、出力結果の反射光強度をそのまま使用した場合は、これらのバラツキが検出結果に影響を与える可能性がある。そこで、第３の強度を第１の強度で除した値と、第２の強度を第１の強度で除した値との差の絶対値｜Ｉ３／Ｉ１−Ｉ２／Ｉ１｜に基づいて標的物質２の検出・定量を行うことで、これらのバラツキの影響を少なくすることができる。   The target substance 2 may be quantified based on the absolute value | I3-I2 | of the difference between the third intensity and the second intensity, but the value obtained by dividing the third intensity by the first intensity and The absolute value | I3 / I1-I2 / I1 | of the difference from the value obtained by dividing the second intensity by the first intensity is preferably used. The reason is as follows. The reflected light intensity of the photonic crystal 350 output before the target substance 2 is fixed to the photonic crystal 350 may vary depending on the molding conditions of the thermal nanoimprint. Further, the amount of the target substance 2 fixed to the photonic crystal 350 may vary for each target substance detection biosensor 300. Therefore, when the reflected light intensity of the output result is used as it is, these variations may affect the detection result. Therefore, based on the absolute value | I3 / I1-I2 / I1 | of the difference between the value obtained by dividing the third intensity by the first intensity and the value obtained by dividing the second intensity by the first intensity, By performing the detection and quantification of 2, the influence of these variations can be reduced.

次に、標的物質検出バイオセンサー３００が検出感度に優れている点を示す。比較例として、標的物質２ではなく、標的物質結合物質３をフォトニック結晶３５０に固定させた以外は、標的物質検出バイオセンサー３００と同じ構成のバイオセンサーを用いた。比較例では、試料Ｓを標的物質結合物質３と反応させることなく、フォトニック結晶３５０に接触させた。   Next, the point that the target substance detection biosensor 300 is excellent in detection sensitivity will be described. As a comparative example, a biosensor having the same configuration as that of the target substance detection biosensor 300 was used except that the target substance binding substance 3 instead of the target substance 2 was fixed to the photonic crystal 350. In the comparative example, the sample S was brought into contact with the photonic crystal 350 without reacting with the target substance binding substance 3.

比較は、同一試料を標的物質検出バイオセンサー３００および比較例のバイオセンサーにそれぞれ接触させ、標的物質検出バイオセンサー３００および比較例のバイオセンサーから出力される、光の反射率が任意の極値となる波長のシフト量Δλを比較することにより行った。また、標的物質検出バイオセンサー３００に第２の固定された複合体６を形成させた場合の検出感度についても比較を行った。この場合は、試料を標的物質検出バイオセンサー３００に接触させた後、さらに第１の固定された複合体４ｂと特異的に反応する複合体結合物質５を接触させて、光の反射率が任意の極値となる波長のシフト量Δλを出力させた。標的物質２としてコルチゾール、標的物質結合物質３として抗コルチゾール抗体、第２の固定された複合体６として、二次抗体を用いた。   In the comparison, the same sample is brought into contact with the target substance detection biosensor 300 and the biosensor of the comparative example, and the reflectance of light output from the target substance detection biosensor 300 and the biosensor of the comparative example is an arbitrary extreme value. This was performed by comparing the shift amount Δλ of the wavelength. In addition, the detection sensitivity when the second immobilized complex 6 was formed on the target substance detection biosensor 300 was also compared. In this case, after the sample is brought into contact with the target substance detection biosensor 300, the complex-binding substance 5 that specifically reacts with the first immobilized complex 4b is further brought into contact, and the light reflectance is arbitrary. The shift amount Δλ of the wavelength that is the extreme value of is output. Cortisol was used as the target substance 2, anti-cortisol antibody was used as the target substance binding substance 3, and a secondary antibody was used as the second immobilized complex 6.

フォトニック結晶３５０としては、熱ナノインプリントにより所定の微細構造を表面に形成したシクロオレフィン系ポリマーのシートを所定の大きさに切断したものを用いている。   As the photonic crystal 350, a sheet of a cycloolefin polymer having a predetermined fine structure formed on the surface by thermal nanoimprinting is cut into a predetermined size.

図５は、標的物質検出バイオセンサー３００から出力される、光の反射率が任意の極値となる波長のシフト量Δλと、比較例のバイオセンサーから出力される、光の反射率が任意の極値となる波長のシフト量Δλとの相対的大きさについて示すグラフである。なお、「標的物質検出バイオセンサー３００＋複合体結合物質」のグラフは、標的物質検出バイオセンサー３００に第２の固定された複合体６を形成させた場合の、光の反射率が任意の極値となる波長のシフト量Δλを示すものである。   FIG. 5 illustrates a wavelength shift amount Δλ output from the target substance detection biosensor 300 at which the light reflectivity is an arbitrary extreme value, and a light reflectivity output from the biosensor of the comparative example. It is a graph shown about the relative magnitude | size with shift amount (DELTA) (lambda) of the wavelength used as an extreme value. The graph of “target substance detection biosensor 300 + complex binding substance” shows an extreme value where the reflectance of light is arbitrary when the target substance detection biosensor 300 is formed with the second fixed complex 6. Is a shift amount Δλ of the wavelength.

図５によれば、比較例のバイオセンサーと比較して、標的物質検出バイオセンサー３００は、検出感度に優れていることがわかる。さらに、標的物質検出バイオセンサー３００に、第２の固定された複合体６を形成させると、検出感度が上昇することがわかる。   According to FIG. 5, it can be seen that the target substance detection biosensor 300 is superior in detection sensitivity compared to the biosensor of the comparative example. Furthermore, when the target substance detection biosensor 300 is formed with the second immobilized complex 6, it can be seen that the detection sensitivity increases.

本実施形態に係る標的物質検出バイオセンサー３００は、標的物質結合物質３を酵素標識する必要がなく、短時間に簡単に感度よく標的物質２を検出することができる。   The target substance detection biosensor 300 according to the present embodiment does not need to label the target substance binding substance 3 with an enzyme, and can easily detect the target substance 2 with high sensitivity in a short time.

１、２００、３００ 標的物質検出バイオセンサー
２ 標的物質
３ 標的物質結合物質
４ａ 複合体
４ｂ 第１の固定された複合体
５ 複合体結合物質
６ 第２の固定された複合体
１０１、２０１、３０１ 標的物質固定部
１０２ 基礎
２０２ カーボンナノチューブ
２０３ 電極
２０４ 基板
２０５ 複数のカーボンナノチューブ
３０２ プレート
３０３ プレート
３０４ 開口部
３５０ フォトニック結晶
３５１ 反射面
３５２ 凸部 1, 200, 300 Target substance detection biosensor 2 Target substance 3 Target substance binding substance 4a Complex 4b First immobilized complex 5 Complex binding substance 6 Second immobilized complex 101, 201, 301 Target Material fixing part 102 Base 202 Carbon nanotube 203 Electrode 204 Substrate 205 Multiple carbon nanotubes 302 Plate 303 Plate 304 Opening 350 Photonic crystal 351 Reflecting surface 352 Convex part

Claims (3)

試料に含まれる標的物質を検出するものであって、
基板と、
前記基板の表面において平面状に形成された２つの金属電極と、
前記基板の前記表面において２つの前記金属電極の間に形成され、一定量の前記標的物質を固定し、前記標的物質と特異的に反応する既知量の標的物質結合物質と前記試料との混合物と接触させられる標的物質固定部とを含み、
固定された前記標的物質と前記標的物質結合物質とで形成される、第１の固定された複合体の量と相関し、かつ前記標的物質固定部における表面状態の変化に相関する電気的な物理量を出力し、
前記標的物質固定部は、一定量の前記標的物質を固定したカーボンナノチューブを含み、前記カーボンナノチューブに固定された前記標的物質の大きさは、前記カーボンナノチューブのデバイ長よりも小さく、
前記カーボンナノチューブは、複数であって不規則な網目状に配置されるとともに、２つの前記金属電極の間、及び２つの前記金属電極の表面の一部に亘って配置されていることを特徴とする、標的物質検出バイオセンサー。 Detecting a target substance contained in a sample,
A substrate,
Two metal electrodes formed in a planar shape on the surface of the substrate;
A mixture of a sample with a known amount of a target substance binding substance formed between the two metal electrodes on the surface of the substrate, immobilizing a certain amount of the target substance, and reacting specifically with the target substance; A target substance fixing part to be contacted,
An electrical physical quantity that correlates with the amount of the first immobilized complex formed by the immobilized target substance and the target substance-binding substance and that correlates with a change in the surface state of the target substance immobilization part. Output
The target substance fixing portion includes carbon nanotubes that fix a certain amount of the target substance, and the size of the target substance fixed to the carbon nanotubes is smaller than the Debye length of the carbon nanotubes,
The carbon nanotubes are arranged in a plurality of irregular meshes, and are arranged between two metal electrodes and over a part of the surface of the two metal electrodes. A target substance detection biosensor. 前記混合物中の前記標的物質は、前記標的物質結合物質と複合体を形成していることを特徴とする、請求項１に記載の標的物質検出バイオセンサー。 The target substance detection biosensor according to claim 1, wherein the target substance in the mixture forms a complex with the target substance binding substance. 前記第１の固定された複合体と、前記第１の固定された複合体と特異的に反応する複合体結合物質とで形成される、第２の固定された複合体の量と相関する物理量を出力する、請求項１または請求項２に記載の標的物質検出バイオセンサー。 A physical quantity that correlates with the amount of the second immobilized complex formed by the first immobilized complex and a complex-binding substance that reacts specifically with the first immobilized complex. The biosensor for detecting a target substance according to claim 1 or 2 , wherein
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