JP5807919B2 - Composition for improving metabolic disorders due to diabetes - Google Patents

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Description

本発明は、糖尿病による代謝異常を改善するための組成物に関する。   The present invention relates to a composition for improving metabolic disorders due to diabetes.

１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）は、膵臓からのインスリン分泌不全により、高血糖、高脂肪酸血症、高ケトン体症を引き起こし、骨格筋、脂肪組織重量が減少して死に至る疾患である。現在、インスリンだけがＴ１ＤＭの治療薬と考えられている。しかしながら、インスリン治療でさえ、Ｔ１ＤＭにおいては、心臓病、腎障害、高血圧などの二次的な合併症をひきこすことが知られている。   Type 1 diabetes (T1DM) is a disease that causes hyperglycemia, hyperfattyemia, and hyperketonopathy due to insulin secretion failure from the pancreas, resulting in decreased skeletal muscle and adipose tissue weight and death. Currently, only insulin is considered a therapeutic agent for T1DM. However, even insulin therapy is known to cause secondary complications such as heart disease, kidney damage, and hypertension in T1DM.

実際、長期のインスリン投与は、インスリンの脂質合成及びコレステロール合成促進作用により、脂肪細胞以外の組織での異所性脂質沈着を促進し、その結果、冠動脈疾患を引き起こすことが知られている。さらに、インスリン治療は、低血糖を引き起こすことによってしばしば生命の危険を伴う。このように、インスリン治療は、Ｔ１ＤＭの治療に大変有用であるが、その使用量を減少させる付加的治療法が要請されている。   In fact, it is known that long-term insulin administration promotes ectopic lipid deposition in tissues other than adipocytes due to the action of insulin to promote lipid synthesis and cholesterol synthesis, resulting in coronary artery disease. Furthermore, insulin treatment is often life-threatening by causing hypoglycemia. Thus, while insulin therapy is very useful for the treatment of T1DM, additional therapies that reduce the amount used are required.

ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ；以下、単に、ＡＭＰＫという。）は、細胞内のエネルギー枯渇によるＡＭＰ（ＡＤＰ）／ＡＴＰ比の上昇を検知して活性化するセリン／スレオニンリン酸化酵素である。ＡＭＰＫの活性化は、ミトコンドリア生合成、脂肪酸酸化、糖利用などのＡＴＰ産生をもたらす異化代謝作用を促進し、タンパク質合成などのＡＴＰを消費する同化作用を抑制する。   AMP-activated protein kinase (hereinafter simply referred to as AMPK) is a serine / threonine phosphorylation that is activated by detecting an increase in the AMP (ADP) / ATP ratio due to intracellular energy depletion. It is an enzyme. Activation of AMPK promotes catabolic and metabolic effects that lead to ATP production such as mitochondrial biosynthesis, fatty acid oxidation, and sugar utilization, and suppresses anabolic effects that consume ATP such as protein synthesis.

インスリン非依存性である２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）では、ＡＭＰＫを活性化するＡＭＰＫ活性化剤を投与して、糖や脂肪の燃焼を増加させることが１つの戦略となっている。こうしたＡＭＰＫ活性化剤としては、メトホルミンなどのビグアナイド系経口血糖降下剤のほか、各種の化合物が知られている（特許文献１、２、３）。   In type 2 diabetes (T2DM), which is independent of insulin, one strategy is to increase the burning of sugar and fat by administering an AMPK activator that activates AMPK. As such AMPK activators, various compounds are known in addition to biguanide oral hypoglycemic agents such as metformin (Patent Documents 1, 2, and 3).

特開２０１３−３５８６７号公報JP 2013-35867 A 特表２０１２−５１１５４９号公報Special table 2012-511549 gazette 特開２００８−２０８０８１号公報JP 2008-208081 A

現在までのところ、Ｔ１ＤＭに対するンスリン治療を補充する効果的な薬剤は未だ見出されていない。また、ＡＭＰＫ活性化剤は、Ｔ２ＤＭの治療戦略として有効であることは知られているが、ＡＭＰＫがＴ１ＤＭ等によって生じる、血中の糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体に関する代謝異常において果たす役割は知られていなかった。   To date, no effective drug has yet been found to supplement the sulin therapy for T1DM. In addition, AMPK activators are known to be effective as a therapeutic strategy for T2DM. However, AMPK is caused by T1DM and the like in metabolic abnormalities related to sugar, fatty acid, insulin, neutral fat and ketone bodies in blood. The role to play was unknown.

本明細書は、糖尿病における代謝異常を改善するための組成物を開示する。   The present specification discloses a composition for improving metabolic disorders in diabetes.

本発明者らは、糖尿病によって引き起こされる代謝異常とＡＭＰＫとの関係について種々検討したところ、意外にも、ＡＭＰＫ活性化を阻害する阻害剤が、糖尿病における高血糖、高脂肪酸血症、高ケトン体血症等の代謝状態（代謝異常）を改善できるという知見を得た。さらに、骨格筋と脂肪組織の萎縮を防止できるという知見を得た。本明細書は、こうした新たな知見に基づき以下の手段を提供する。   The present inventors have made various studies on the relationship between metabolic abnormality caused by diabetes and AMPK. Surprisingly, an inhibitor that inhibits AMPK activation is considered to be hyperglycemia, hyperfatty acid, high ketone body in diabetes. It was found that metabolic conditions (metabolic abnormalities) such as blood glucose could be improved. Furthermore, the knowledge that atrophy of skeletal muscle and adipose tissue can be prevented was obtained. This specification provides the following means based on such new findings.

（１）ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤を有効成分とする、糖尿病による１種又は２種以上の代謝異常を改善するための組成物。
（２）前記代謝異常は、糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される、（１）に記載の組成物。
（３）前記糖尿病はインスリン依存性糖尿病である、（１）又は（２）に記載の組成物。
（４）前記１種又は２種以上の代謝異常は、脂肪酸、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される、（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）前記ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤は、以下の式（１）で表される、（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤と、
グルカゴン阻害剤と、
を有効成分とする、糖尿病による１種又は２種以上の代謝異常を改善するための組成物。
（７）ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤と、
インスリンと、
を有効成分とする、インスリン依存糖尿病の糖尿病による１種又は２種以上の代謝異常を改善するための組成物。
（８）ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤と、
ＩＬ―６中和抗体と、
を有効成分とする、インスリン依存糖尿病の糖尿病による血中の糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される１種又は２種以上の代謝異常を改善するための組成物。
（９）糖尿病による血中の糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される１種又は２種以上の代謝異常を改善するためのＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤のスクリーニング方法であって、
被験化合物のＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼの阻害活性を評価する工程、
を備える、方法。 (1) A composition for improving one or more metabolic abnormalities due to diabetes, comprising an AMP-activated protein kinase inhibitor as an active ingredient.
(2) The composition according to (1), wherein the metabolic abnormality is selected from the group consisting of sugar, fatty acid, insulin, neutral fat and ketone body.
(3) The composition according to (1) or (2), wherein the diabetes is insulin-dependent diabetes.
(4) The composition according to any one of (1) to (3), wherein the one or more metabolic abnormalities are selected from the group consisting of fatty acids, neutral fats, and ketone bodies.
(5) The composition according to any one of (1) to (4), wherein the AMP-activated protein kinase inhibitor is represented by the following formula (1).
(6) an AMP-activated protein kinase inhibitor;
A glucagon inhibitor;
A composition for improving one or more types of metabolic abnormalities due to diabetes.
(7) an AMP-activated protein kinase inhibitor;
Insulin,
A composition for improving one or more metabolic abnormalities due to diabetes of insulin-dependent diabetes.
(8) an AMP-activated protein kinase inhibitor;
An IL-6 neutralizing antibody;
A composition for improving one or more metabolic abnormalities selected from the group consisting of sugar, fatty acid, insulin, neutral fat and ketone body in blood due to diabetes of insulin-dependent diabetes .
(9) An AMP-activated protein kinase inhibitor for improving one or more metabolic abnormalities selected from the group consisting of sugar, fatty acid, insulin, neutral fat and ketone body in blood due to diabetes A screening method comprising:
Evaluating the inhibitory activity of a test compound on AMP-activated protein kinase;
A method comprising:

Ａは、ＳＴＺ処理ＷＴマウスのヒラメ筋とＥＤＬ筋におけるリン酸化ＡＭＰＫ（Ｔｈｒ１７２）と総ＡＭＰＫを示す。Ｂは、リン酸化ＡＣＣ（Ｓｅｒ７９）、総ＡＣＣ、α１ＡＭＰＫ、α２ＡＭＰＫを示す。A shows phosphorylated AMPK (Thr172) and total AMPK in soleus and EDL muscles of STZ-treated WT mice. B shows phosphorylated ACC (Ser79), total ACC, α1AMPK, α2AMPK. Ｃは、ＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスの骨格筋（ヒラメ筋、腓腹筋の赤と白の部分と、ＥＤＬ筋）、心臓、鼠径部（Ｉｎｇ）と精巣上体（ＥｐｉＩ）のＷＡＴ、ＢＡＴ、膵臓、脾臓、脳全体におけるα１，α２−ＡＭＰＫに対する抗体を用いたイムノブロットの結果を示す。C, WT and DN-AMPK mouse skeletal muscle (soleus muscle, red and white part of gastrocnemius, EDL muscle), heart, groin (Ing) and epididymis (EpiI) WAT, BAT, pancreas, The result of the immunoblot using the antibody with respect to (alpha) 1, (alpha) 2-AMPK in a spleen and the whole brain is shown. Ａは、１回目のＳＴＺ投与から２週間後のＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおける血漿インスリン濃度に対するＳＴＺ投与の影響を示し、インスリンの細胞内シグナル分子であるＡＫＴのリン酸化（Ｔｙｒ４７３）に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｃは、血糖値に対するＳＴＺ投与の影響を示す。A shows the effect of STZ administration on plasma insulin concentration in WT and DN-AMPK mice 2 weeks after the first STZ administration, and the effect of STZ administration on phosphorylation of AKT, an intracellular signal molecule of insulin (Tyr473). Shows the effect, C indicates the effect of STZ administration on blood glucose levels. Ａは、１回目のＳＴＺ投与から２週間後のＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおけるＳＴＺ投与の体重に対する影響を示し、Ｂは、ＳＴＺ投与の食物摂取に対する影響を示し、Ｃは、生存率に対する影響を示す。A shows the effect of STZ administration on body weight in WT and DN-AMPK mice 2 weeks after the first STZ administration, B shows the effect of STZ administration on food intake, and C shows the effect on survival rate. Show. Ｄは、１回目のＳＴＺ投与から２週間後のＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおける組織重量（ヒラメ筋と腓腹筋）に対する影響を示し、写真は、それらのマウスの後肢を示す。Ｅは、同様のマウス群における、組織重量［精巣上体（ＥＰＩ）と鼠径部（Ｉｎｇ）のＷＡＴおよびＢＡＴ］に対する影響を示し、写真はそれらのマウスの腹腔内とＥＰＩＷＡＴを示す（ＤＮ−ＡＭＰＫマウス；右、ＷＴマウス：左）。D shows the effect on tissue weight (soleus and gastrocnemius) in WT and DN-AMPK mice 2 weeks after the first STZ administration, and the photograph shows the hind limbs of those mice. E shows the effect on tissue weight [epididymis (EPI) and inguinal (Ing) WAT and BAT] in a similar group of mice, and photographs show the intraperitoneal and EPIWAT of these mice (DN-AMPK). Mouse; right, WT mouse: left). Ａは、１回目のＳＴＺ投与から２週間後のＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおける血漿遊離脂肪酸、血漿トリグリセライド、血漿ケトン体濃度に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｂは、同様のマウス群における血漿ノルエピネフリン、血漿エピネフリン、血漿コルチコステロン及び血漿グルカゴン濃度に及ぼすＳＴＺ投与の効果を示す。A shows the effect of STZ administration on plasma free fatty acid, plasma triglyceride, plasma ketone body concentrations in WT and DN-AMPK mice 2 weeks after the first STZ administration, B shows plasma norepinephrine in a similar group of mice, Figure 3 shows the effect of STZ administration on plasma epinephrine, plasma corticosterone and plasma glucagon concentrations. Ａは、１回目のＳＴＺ投与から１週間後におけるグルコースの腹腔内投与ＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおけるＳＴＺ投与の血糖値に対する影響を示し、Ｂは、血漿インスリン濃度に及ぼす影響を示す。Ｃは、１回目のＳＴＺ投与から１週間後における脂肪負荷試験（トリオレインの強制経口胃内摂取）に係るＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおけるＳＴＺ投与の血漿遊離脂肪酸濃度に及ぼす影響を示す。 Ｄは、１回目のＳＴＺ投与から１週間後における脂肪負荷試験（トリオレインの強制経口胃内摂取）に係るＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおけるＳＴＺ投与の血漿インスリン濃度に及ぼす影響を示す。A shows the effect on glucose level of STZ administration in WT and DN-AMPK mice with intraperitoneal administration of glucose one week after the first STZ administration, and B shows the effect on plasma insulin concentration. C shows the effect of STZ administration on plasma free fatty acid concentration in WT and DN-AMPK mice in a fat tolerance test (triolein gavage ingestion by gastric ingestion) one week after the first STZ administration. D shows the effect of STZ administration on plasma insulin concentration in WT and DN-AMPK mice in a fat tolerance test (triolein gavage ingestion by gastric ingestion) one week after the first STZ administration. Ｅは、１回目のＳＴＺ投与から１週間後におけるピルビン酸耐性試験に係るＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおけるＳＴＺ投与の血糖値に対する影響とＳＴＺ一回目の投与から２週間後の肝臓におけるＰＥＰＣＫ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ）のｍＲＮＡ量を示す。Ｆは、１回目のＳＴＺ投与から２週間後におけるＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスの肝臓におけるＰＥＰＣＫのｍＲＮＡ量を示す。E shows the effect of STZ administration on blood glucose levels in WT and DN-AMPK mice in the pyruvate tolerance test one week after the first STZ administration, and PEPCK (phosphoenols) in the liver two weeks after the first STZ administration. The amount of mRNA of pyruvate carboxykinase) is shown. F shows the amount of PEPCK mRNA in the liver of WT and DN-AMPK mice 2 weeks after the first STZ administration. Ａは、１回目のＳＴＺ投与から２週間後のＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスのヒラメ筋におけるＮＡＭＰＴとＳＩＲＴ１のｍＲＮＡ量に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｂは、同様のマウス群の腓腹筋の赤い部分におけるアセチル化ＰＧＣ−１αのタンパク質量に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｃは、同様のマウス群のヒラメ筋におけるＵＬＫ１のリン酸化（Ｓｅｒ５５５）に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｄは、同様のマウス群のヒラメ筋でＬＣ−３ＩＩのタンパク質量に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｅは、同様のマウス群のヒラメ筋におけるＴＳＣ２のリン酸化（Ｓｅｒ１３８７）に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｆは、同様のマウス群のヒラメ筋におけるＳ６Ｋのリン酸化（Ｓｅｒ３８９）に対するＳＴＺ投与の影響を示す。A shows the effect of STZ administration on the amount of NAMPT and SIRT1 mRNA in the soleus muscle of WT and DN-AMPK mice two weeks after the first STZ administration, and B shows the red part of the gastrocnemius muscle of the same group of mice. The effect of STZ administration on the amount of acetylated PGC-1α protein is shown. C shows the effect of STZ administration on the phosphorylation of ULK1 (Ser555) in the soleus muscle of the same group of mice, and D shows the effect of the same group of mice. E shows the effect of STZ administration on the amount of LC-3II protein in the soleus muscle, E shows the effect of STZ administration on TSC2 phosphorylation (Ser1387) in the soleus muscle of the same group of mice, F shows the same group of mice Of STZ administration on S6K phosphorylation (Ser389) in Japanese soleus muscle. Ａは、１回目のＳＴＺ投与から２週間後のＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスの鼠径部（Ｉｎｇ）のＷＡＴにおけるリン酸化（Ｔｈｒ１７２）ＡＭＰＫと全ＡＭＰＫ（α１及びα２）に対するＳＴＺ投与の影響を示す。Ｂは、同様のマウス群の鼠径部ＷＡＴにおけるＦＡＳ、ＬＰＬ、ＵＣＰ１及びＣｉｄｅａのｍＲＮＡ量に対するＳＴＺ投与の影響を示す。A shows the effect of STZ administration on phosphorylation (Thr172) AMPK and total AMPK (α1 and α2) in WAT of the groin area (Ing) of WT and DN-AMPK mice 2 weeks after the first STZ administration. B shows the effect of STZ administration on FAS, LPL, UCP1 and Cidea mRNA levels in the inguinal WAT of a similar group of mice. Ａは、１回目のＳＴＺ投与から２週間後のＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスのヒラメ筋におけるアイリシンの前駆体であるＦＮＤＣ５のタンパク質量に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｂは、同様のマウス群の血漿アイリシン濃度に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｃは、ＩＬ−６のタンパク質量に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｄは、同様のマウス群における血漿ＩＬ−６濃度に及ぼすＳＴＺ投与の影響を示す。A shows the effect of STZ administration on the protein level of FNDC5, a precursor of iricin, in the soleus muscle of WT and DN-AMPK mice 2 weeks after the first STZ administration, and B shows the plasma of a similar group of mice. The effect of STZ administration on the concentration of iricin is shown, C shows the effect of STZ administration on the amount of IL-6 protein, and D shows the effect of STZ administration on plasma IL-6 concentration in the same group of mice. Ａ及びＢは、それぞれ、１回目のＳＴＺ投与から２週間後のＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおける血漿レプチン及び高分子量アディポネクチン濃度に及ぼすＳＴＺ投与の影響を示す。A and B show the effect of STZ administration on plasma leptin and high molecular weight adiponectin concentrations in WT and DN-AMPK mice 2 weeks after the first STZ administration, respectively. Ａは、レプチン処理およびＩＬ−６抗体で処理したＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＳＴＺ投与後における血漿グルコース濃度の変化を示す。浸透圧ミニポンプは実験１日目に皮下移植し、ＳＴＺをその２日目及び４日目に２回注射した。左のグラフは、ＳＴＺ投与後２週間の血漿グルコース濃度の変化を示し、真ん中と右のグラフは、ＳＴＺ投与後２週間での血糖値及び血漿遊離脂肪酸濃度を示す。Ｂは、ポンプの移植及びＳＴＺ投与から２週間後のレプチン処理及びＩＬ−６抗体処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける血漿レプチン、血漿ＩＬ−６、アイリシン及びインスリンに濃度に及ぼすＳＴＺ投与の影響を示す。A shows the change in plasma glucose concentration after STZ administration in C57BL / 6J mice treated with leptin and IL-6 antibody. The osmotic minipump was implanted subcutaneously on the first day of the experiment and STZ was injected twice on the second and fourth days. The left graph shows the change in plasma glucose concentration for 2 weeks after STZ administration, and the middle and right graphs show the blood glucose level and plasma free fatty acid concentration for 2 weeks after STZ administration. B shows the effect of STZ administration on plasma leptin, plasma IL-6, irisin and insulin concentrations in C57BL / 6J mice treated with leptin and IL-6 antibody 2 weeks after pump implantation and STZ administration. Ｃは、ポンプの移植及びＳＴＺ投与から２週間後のレプチン処理及びＩＬ−６抗体処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスのヒラメ筋、ＥＤＬ筋、腓腹筋、Ｅｐｉ及びＩｎｇのＷＡＴ及びＢＡＴの組織重量に対するＳＴＺ投与の影響を示す。C shows STZ administration on the soleus, EDL, gastrocnemius, Epi and Ing WAT and BAT tissue weights of C57BL / 6J mice treated with leptin and IL-6 antibody 2 weeks after pump implantation and STZ administration. Show the impact. ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭは、骨格筋のＡＭＰＫを活性化し、筋肉の萎縮を誘導し、ＩＬ−６およびアイリシンの血漿中濃度を増加させる。ＩＬ−６および／またはアイリシンは、脂肪組織の萎縮及び血漿レプチンレベルの低下を引き起こすと共に、脂肪組織においてＵＣＰ１発現および脂肪分解を促進する。減少した血漿レプチンレベルは、骨格筋においてグルコース及び脂質の利用を抑制し、さらに、筋萎縮を引き起こす。インスリンと同様、減少した血漿レプチンのレベルは、肝臓でのグルコース産生を増加させる。骨格筋におけるＡＭＰＫ活性の阻害は、ＩＤＤＭにおける代謝異常および体重及び組織重量の減少を改善し、ＩＬ−６およびアイリシンの血漿レベルを低減し、レプチン及びアディポネクチンの血漿レベルを増加させる。ＩＬ−６抗体又はレプチンの慢性的な注入は、筋特異的ＤＮ−ＡＭＰＫ発現するマウスと同様に、ＩＤＤＭにおける代謝異常と組織重量の減少を改善する。STZ-induced IDDM activates AMPK in skeletal muscle, induces muscle atrophy, and increases plasma concentrations of IL-6 and irisin. IL-6 and / or ilysin cause atrophy of adipose tissue and a decrease in plasma leptin levels, as well as promote UCP1 expression and lipolysis in adipose tissue. Reduced plasma leptin levels suppress glucose and lipid utilization in skeletal muscle, and further cause muscle atrophy. Like insulin, decreased plasma leptin levels increase glucose production in the liver. Inhibition of AMPK activity in skeletal muscle ameliorates metabolic abnormalities and decreased body weight and tissue weight in IDDM, reduces plasma levels of IL-6 and irisin, and increases plasma levels of leptin and adiponectin. Chronic infusion of IL-6 antibody or leptin improves metabolic abnormalities and tissue weight reduction in IDDM, similar to mice expressing muscle-specific DN-AMPK. ＳＴＺの第１回の投与から４日後に浸透圧ポンプを皮下移植し、これによりコンパウンドＣを同１４日目まで連続的に投与したときの第１４日目の血糖値、血漿脂肪酸濃度、組織（筋肉及び脂肪）の重量に対するコンパウンドＣの影響を示す。Four days after the first administration of STZ, an osmotic pump was implanted subcutaneously, whereby when Compound C was continuously administered up to the 14th day, blood glucose level, plasma fatty acid concentration, tissue ( The effect of Compound C on the weight of muscle and fat) is shown. ＳＴＺの第１回の投与から４日後に浸透圧ポンプを皮下移植し、これによりコンパウンドＣを同１４日目まで連続的に投与したときの第１４日目のヒラメ筋におけるリン酸化合物ＡＣＣ量に対するコンパウンドＣの影響を示す。4 days after the first administration of STZ, an osmotic pump was subcutaneously implanted, whereby the amount of phosphate compound ACC in the soleus muscle on the 14th day when Compound C was continuously administered until the 14th day The influence of Compound C is shown.

本明細書の開示は、ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼの阻害による、Ｔ１ＤＭなどの糖尿病によって生じる、血中の糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される１種又は２種以上の代謝異常の改善に関する。   The disclosure herein provides one or two selected from the group consisting of blood sugars, fatty acids, insulin, neutral fats and ketone bodies caused by diabetes such as T1DM by inhibition of AMP-activated protein kinase. It relates to the improvement of metabolic abnormalities over species.

本発明者らによれば、Ｔ１ＤＭモデル動物である、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導インスリン欠乏性糖尿病（ＩＤＤＭ）マウスの骨格筋においてＡＭＰＫが活性化していることがわかった。意外にも、骨格筋において内在性のＡＭＰＫと競合するドミナントネガティブＡＭＰＫを発現させてＡＭＰＫの活性化を阻害するマウス（ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫ発現マウス）においては、血漿インスリンレベルは低いままであるにも関わらず、このマウスにおける代謝異常を改善することがわかった。すなわち、グルコース、脂肪酸、ケトン体、及び糖新生ホルモンの血漿濃度を減少させることがわかった。また、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫ発現マウスでは、脂肪組織、骨格筋、および体重の量を増加し、その後生存率を増加させることがわかった。   According to the present inventors, it was found that AMPK is activated in the skeletal muscle of a T1DM model animal, streptozotocin (STZ) -induced insulin-deficient diabetic (IDDM) mouse. Surprisingly, plasma insulin levels remain low in mice that inhibit AMPK activation by expressing dominant negative AMPK that competes with endogenous AMPK in skeletal muscle (STZ-treated DN-AMPK expressing mice). Nevertheless, it was found to improve metabolic abnormalities in this mouse. That is, it was found that the plasma concentrations of glucose, fatty acids, ketone bodies, and gluconeogenic hormones were decreased. In addition, it was found that STZ-treated DN-AMPK expressing mice increase the amount of adipose tissue, skeletal muscle, and body weight, and then increase the survival rate.

さらに、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭマウスの白色脂肪組織（ＷＡＴ）は、脂質合成酵素の発現低下と同時に、ＵＣＰ１（脱共役タンパク質１）の発現を増加させたが、それらは、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫ発現するマウスではコントロールレベルに戻った。また、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫ発現マウスは、レプチンの血漿濃度を回復した。レプチンはＩＤＤＭにおける全身グルコース及び脂質代謝の異常を改善することが知られている。   Furthermore, white adipose tissue (WAT) of STZ-induced IDDM mice increased the expression of UCP1 (uncoupled protein 1) simultaneously with decreased expression of lipid synthase, but they expressed ST-treated DN-AMPK. The mouse returned to the control level. In addition, STZ-treated DN-AMPK-expressing mice recovered leptin plasma concentration. Leptin is known to ameliorate abnormalities in systemic glucose and lipid metabolism in IDDM.

インターロイキン−６（ＩＬ−６）は骨格筋から放出および脂肪組織における脂肪分解を促進し、かつ新規マイオカインであるアイリシンは、ＷＡＴにおいて熱産生タンパク質ＵＣＰ１を誘導する。ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭマウスでは、ＩＬ−６とアイリシンの発現が骨格筋において増加し、それらの血漿中濃度も増加した。しかし、ＤＮ−ＡＭＰＫ発現マウスではＳＴＺを処理してもそれらはコントロールレベルであった。さらに、浸透圧ミニポンプによってＩＬ−６中和抗体を投与すると、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫ発現マウスと同程度に、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭマウスにおける代謝異常が改善した。   Interleukin-6 (IL-6) promotes release from skeletal muscle and lipolysis in adipose tissue, and the novel myokine, ilysin, induces the heat-producing protein UCP1 in WAT. In STZ-induced IDDM mice, IL-6 and irisin expression increased in skeletal muscle and their plasma concentrations also increased. However, even if DNZ-AMPK expressing mice were treated with STZ, they were at the control level. Furthermore, when IL-6 neutralizing antibody was administered by an osmotic minipump, metabolic abnormalities in STZ-induced IDDM mice improved to the same extent as STZ-treated DN-AMPK expressing mice.

さらに、ＡＭＰＫ阻害剤として知られているコンパウンドＣをＳＴＺ誘発ＩＤＤＭマウスに投与したところ、このマウスにおける代謝異常を改善することがわかった。すなわち、グルコース、脂肪酸を減少させることがわかった。   Furthermore, when Compound C, known as an AMPK inhibitor, was administered to STZ-induced IDDM mice, it was found to improve metabolic abnormalities in these mice. That is, it was found that glucose and fatty acids were decreased.

以上のように、本明細書は、ＡＭＰＫがＴ１ＤＭなどの糖尿病における代謝異常に重要な役割を果たすことを明らかにする。ＩＤＤＭにおけるＡＭＰＫの活性阻害は、血漿インスリンレベルが低いままであるにも関わらず、全身の代謝の改善と、筋肉および脂肪組織の萎縮の防止と、生存率を増加させた。さらに、本発明者らは、ＩＬ−６およびレプチン脂肪細胞ホルモンが、ＩＤＤＭの代謝異常に関わるおそらくメディエーターであることを明らかにした。本明細書によれば、Ｔ１ＤＭなどの糖尿病における代謝異常が筋肉や脂肪組織を含む臓器ネットワークの悪循環によって引き起こされることを示している。そして、本明細書は、骨格筋においてＡＭＰＫの活性化を阻害することにより、代謝調節に関わる臓器ネットワークの異常を修正し、Ｔ１ＤＭなどの糖尿病における悪循環を改善できることを示している。   As described above, the present specification reveals that AMPK plays an important role in metabolic abnormalities in diabetes such as T1DM. Inhibition of AMPK activity in IDDM improved systemic metabolism, prevented muscle and adipose tissue atrophy, and increased survival despite plasma insulin levels remaining low. In addition, the present inventors have revealed that IL-6 and leptin adipocyte hormone are probably mediators involved in abnormal metabolism of IDDM. According to the present specification, it is shown that metabolic abnormalities in diabetes such as T1DM are caused by vicious circles of organ networks including muscles and adipose tissues. This specification shows that inhibition of AMPK activation in skeletal muscle can correct organ network abnormalities related to metabolic regulation and improve vicious circles in diabetes such as T1DM.

以上のことから、本明細書は、ＡＭＰＫ阻害剤の投与は、糖尿病によって生じる、血中の糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される１種又は２種以上の代謝異常を改善することを開示する。すなわち、ＡＭＰＫ阻害剤は、こうした糖尿病における糖や脂肪の代謝異常を改善し、その結果、高血糖、高脂肪酸血症、高ケトン体症を改善し、糖尿病の終末期に生じる、骨格筋、脂肪組織重量が減少することを予防し、治療することができる。   Based on the above, this specification indicates that administration of an AMPK inhibitor is one or more selected from the group consisting of blood sugar, fatty acid, insulin, neutral fat and ketone bodies caused by diabetes. Disclose improving metabolic abnormalities. In other words, the AMPK inhibitor improves sugar and fat metabolism abnormalities in such diabetes, and as a result, improves hyperglycemia, hyperfattyemia, and hyperketonosis, and causes skeletal muscle, fat, A reduction in tissue weight can be prevented and treated.

また、本明細書は、ＡＭＰＫ活性阻害とともにＩＬ−６中和抗体の投与が、Ｔ１ＤＭなどの糖尿病における代謝異常と代謝異常に伴う疾患を改善し、予防し、治療することができることを開示する。   In addition, the present specification discloses that administration of IL-6 neutralizing antibody together with inhibition of AMPK activity can improve, prevent and treat metabolic disorders in diabetes such as T1DM and diseases associated with metabolic disorders.

さらに、本明細書は、ＡＭＰＫ阻害剤を投与しても、血糖値をさらに低下する余地があることを示す知見も提供する。このため血糖値を低下させるための、ＡＭＰＫ阻害剤とグルカゴン阻害剤との組合せによる、糖尿病における代謝異常の改善を提供する。また、インスリンとの併用による糖尿病における代謝異常の改善も提供する。以下、本明細書の開示に関する各種の実施形態を詳細に説明する。   Furthermore, this specification also provides the knowledge which shows that even if an AMPK inhibitor is administered, there exists room to further reduce a blood glucose level. For this reason, the improvement of the metabolic abnormality in diabetes by the combination of an AMPK inhibitor and a glucagon inhibitor for lowering blood glucose level is provided. It also provides an improvement in metabolic abnormalities in diabetes by combination with insulin. Hereinafter, various embodiments related to the disclosure of this specification will be described in detail.

（ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ；ＡＭＰＫ）
ＡＭＰＫは、触媒αサブユニットおよび規制β−およびγ−サブユニットからなるヘテロ複合体である。ＡＭＰＫは生体内において多様な役割を担っている。 (AMP-activated protein kinase; AMPK)
AMPK is a heterocomplex composed of a catalytic α subunit and regulatory β- and γ-subunits. AMPK plays various roles in vivo.

（１）ＡＭＰＫの活性化は、例えば、ミトコンドリア生合成、脂肪酸酸化及びグルコース利用とＡＴＰを産生する異化プロセスを促進し、ＡＴＰを消費するタンパク質合成（９）のような同化経路を阻害する。ＡＭＰＫは、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の直接リン酸化（Ｓｅｒ７９）とその活性の抑制を介して脂肪酸酸化を促進することが示されている。ＡＣＣ活性の抑制は、サイトゾルからミトコンドリアに遊離脂肪酸を輸送するカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ（ＣＰＴ１）のアロステリック阻害剤であるマロニルＣｏＡの産生を減少させ、結果として脂肪酸酸化に至る。 (1) Activation of AMPK, for example, promotes mitochondrial biosynthesis, fatty acid oxidation and glucose utilization and catabolism processes that produce ATP, and inhibits anabolic pathways such as protein synthesis that consumes ATP (9). AMPK has been shown to promote fatty acid oxidation through direct phosphorylation of acetyl-CoA carboxylase (ACC) (Ser79) and suppression of its activity. Inhibition of ACC activity reduces the production of malonyl CoA, an allosteric inhibitor of carnitine palmitoyltransferase I (CPT1), which transports free fatty acids from the cytosol to the mitochondria, resulting in fatty acid oxidation.

（２）ＡＭＰＫは、また、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）とＳＩＲＴ１（サーチュイン−１：ＮＡＤ＋依存性脱アセチル化酵素）依存経路を介して、ミトコンドリア関連遺伝子発現のための転写補助因子、ＰＧＣ−１αを活性化する。 (2) AMPK is also a transcriptional cofactor for expression of mitochondria-related genes, PGC−, via a nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) and SIRT1 (sirtuin-1: NAD + dependent deacetylase) dependent pathway. Activates 1α.

（３）ＡＭＰＫは、ＴＳＣ２（結節性硬化症のタンパク質２）の直接リン酸化及びそれによるｍＴＯＲ（ｒａｐａｍａｉｃｉｎの哺乳類標的）とＳ６Ｋ（Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ）シグナル伝達経路の抑制を介して、タンパク質合成を阻害する。 (3) AMPK inhibits protein synthesis through direct phosphorylation of TSC2 (tuberous sclerosis protein 2) and thereby suppression of mTOR (mammalian target of rapamamicin) and S6K (P70 S6 kinase) signaling pathway To do.

（４）ＡＭＰＫは、直接ＵＬＫ１（ＵＮＣ−５１様キナーゼ１）をリン酸化し、オートファジーを誘導、ＬＣ３−ＩＩ（オートファジーの調節因子）の発現を増加させる（１７−１９）。 (4) AMPK directly phosphorylates ULK1 (UNC-51-like kinase 1), induces autophagy, and increases the expression of LC3-II (autophagy regulator) (17-19).

本明細書において、ＡＭＰＫの活性を阻害するとは、ＡＭＰＫの活性を低下させる、あるいはＡＭＰＫの活性化を低下させるいかなる態様を含む。ＡＭＰＫの活性を阻害する態様としては、例えば、ＡＭＰＫと基質を競合するタンパク質の供給（発現）、ＡＭＰＫのアロステリックな阻害、ＡＭＰＫが活性化する経路の阻害等が挙げられる。   In the present specification, inhibiting AMPK activity includes any mode of reducing AMPK activity or reducing AMPK activation. Examples of the mode of inhibiting the activity of AMPK include supply (expression) of a protein that competes with AMPK and a substrate, allosteric inhibition of AMPK, inhibition of the pathway by which AMPK is activated, and the like.

（糖尿病による１種又は２種以上の代謝異常を改善するための組成物）
本組成物は、ＡＭＰＫ阻害剤を有効成分とする。ＡＭＰＫ阻害剤としては、上記の通り、ＡＭＰＫ活性を選択的に低下させるものであれば特に限定されない。ＡＭＰＫ阻害剤としては、例えば、以下の式（１）に示すコンパウンドＣ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃ）と称される化合物が挙げられる(J Clin Invest.108, 1167-1174. 2001)。本化合物は、ＡＭＰＫの阻害剤として広く用いられている化合物であり、ＡＭＰＫのキナーゼ活性に必要なα1、α2サブユニットのATP結合部位を選択的に阻害する。 (Composition for improving one or more metabolic abnormalities due to diabetes)
This composition contains an AMPK inhibitor as an active ingredient. As described above, the AMPK inhibitor is not particularly limited as long as it selectively reduces AMPK activity. Examples of the AMPK inhibitor include a compound called Compound C shown in the following formula (1) (J Clin Invest. 108, 1167-1174. 2001). This compound is a compound widely used as an inhibitor of AMPK, and selectively inhibits the ATP binding sites of α1 and α2 subunits necessary for the kinase activity of AMPK.

他のＡＭＰＫ阻害剤としては、以下に示すイソマルトースやイソマルトース構造（グルコースがα１−６結合で結合した）を有するグルコースオリゴマーであるオリゴサッカライドが挙げられる(Cell Metab. 9, 23-34. 2009)。これらは、ＡＭＰＫのβサブユニットのグリコーゲン結合ドメインに結合し、活性を阻害する。   Other AMPK inhibitors include oligosaccharides, which are glucose oligomers having the following isomaltose and isomaltose structures (glucose linked by α1-6 bonds) (Cell Metab. 9, 23-34. 2009). ). They bind to the glycogen binding domain of the β subunit of AMPK and inhibit activity.

ＡＭＰＫ阻害剤は、このほか、後述するスクリーニング方法によっても得ることができる。   In addition, the AMPK inhibitor can be obtained by a screening method described later.

本組成物は、糖尿病による代謝異常を改善することができる。糖尿病による代謝異常は、各種知られているが、なかでも、糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される１種又は２種以上の代謝異常が挙げられる。   This composition can improve metabolic disorders due to diabetes. Various metabolic abnormalities due to diabetes are known. Among them, one or more metabolic abnormalities selected from the group consisting of sugars, fatty acids, insulin, neutral fats and ketone bodies are mentioned.

糖の代謝異常は、いわゆる血中のグルコース量である血糖値の異常を意味している。血糖値に関する代謝異常は、一般的に採用されている基準値等で判定されるものであってもよく、人種、性別、年齢等により、あるいは個人的な基準値で判定されたものであってもよい。血糖値の異常は、糖尿病においては概して高血糖である。血糖値の測定方法は周知である。   Abnormal sugar metabolism means a so-called abnormal blood glucose level, which is the amount of glucose in the blood. Metabolic abnormalities related to blood glucose levels may be determined by commonly adopted standard values, etc., and may be determined by race, gender, age, etc., or by personal standard values. May be. Abnormal blood glucose levels are generally hyperglycemia in diabetes. A method for measuring a blood glucose level is well known.

脂肪酸の代謝異常は、血中の遊離脂肪酸値の異常を意味している。血中遊離脂肪酸に関する代謝異常は、一般的に採用されている基準値等で判定されるものであってもよく、人種、性別、年齢等により、あるいは個人的な基準値で判定されたものであってもよい。血中遊離脂肪酸の代謝異常は、糖尿病においては概して高値である。血中遊離脂肪酸の測定方法は周知である。   The abnormal fatty acid metabolism means an abnormal free fatty acid level in blood. Metabolic abnormalities related to blood free fatty acids may be determined based on commonly adopted standard values, etc., and are determined based on race, gender, age, etc., or based on personal standard values. It may be. Abnormal metabolism of blood free fatty acids is generally high in diabetes. Methods for measuring blood free fatty acids are well known.

インスリンの代謝異常は、いわゆる血中のインスリン値の異常を意味している。血中インスリン値に関わる代謝異常は、一般的に採用されている基準値等で判定されるものであってもよく、人種、性別、年齢等により、あるいは個人的な基準値で判定されたものであってもよい。血中インスリン値の異常は、糖尿病においては概して低値である。血中インスリン値の測定方法は周知である。   Insulin metabolism abnormality means so-called abnormality of blood insulin level. Metabolic abnormalities related to blood insulin levels may be determined by commonly used reference values, etc., determined by race, gender, age, etc., or by personal reference values It may be a thing. Abnormal blood insulin levels are generally low in diabetes. A method for measuring the blood insulin level is well known.

中性脂肪の代謝異常は、血中の脂肪酸のグリセリンエステル値の異常を意味している。血中中性脂肪に関する代謝異常は、一般的に採用されている基準値等で判定されるものであってもよく、人種、性別、年齢等により、あるいは個人的な基準値で判定されたものであってもよい。血中中性脂肪の異常は、糖尿病においては概して基準値よりも高値である。血中中性脂肪値の測定方法は周知である。   Abnormal metabolism of neutral fat means an abnormality in the glycerin ester value of fatty acid in blood. Metabolic abnormalities related to blood triglycerides may be determined by commonly used standard values, etc., and determined by race, gender, age, etc., or by personal standard values It may be a thing. Blood triglyceride abnormalities are generally higher than baseline in diabetes. A method for measuring the blood triglyceride level is well known.

ケトン体の代謝異常は、血中のアセト酢酸、3-ヒドロキシ酪酸、アセトンの３種の合計のケトン体値の異常を意味している。血中ケトン体に関する代謝異常は、一般的に採用されている基準値等で判定されるものであってもよく、人種、性別、年齢等により、あるいは個人的な基準値で判定されたものであってもよい。血中ケトン体の異常は、糖尿病においては概して基準値よりも高値である。血中ケトン体値の測定方法は周知である。   The metabolism abnormality of a ketone body means an abnormality in the total ketone body value of acetoacetic acid, 3-hydroxybutyric acid, and acetone in blood. Metabolic abnormalities related to blood ketone bodies may be determined based on commonly used reference values, etc., and determined based on race, gender, age, etc., or based on personal reference values It may be. Blood ketone body abnormalities are generally higher than the reference value in diabetes. The method for measuring blood ketone bodies is well known.

これらの代謝異常のなかでも、脂肪酸、中性脂肪及びケトン体の代謝異常に対して本組成物を用いることが有利である。ＡＭＰＫ阻害剤はこれらの代謝異常に対して効果的に作用し、低減させることができる。   Among these metabolic abnormalities, it is advantageous to use this composition for fatty acid, neutral fat and ketone body metabolic abnormalities. AMPK inhibitors can effectively act and reduce these metabolic abnormalities.

本組成物は、ＡＭＰＫ阻害剤と、グルカゴン阻害剤及び／又はグルカゴン受容体阻害剤と、を有効成分とすることができる。ＡＭＰＫ阻害剤の投与による血糖値の低下は、未だ改善の余地が認められる。血糖値の不完全な低下は、グルカゴンによるものと考えられる。そこで、ＡＭＰＫ阻害剤に対してグルカゴン阻害剤及び／又はグルカゴン受容体阻害剤を組み合わせることで、血糖値の低下をより効果的に実現できる。   This composition can contain an AMPK inhibitor and a glucagon inhibitor and / or a glucagon receptor inhibitor as active ingredients. There is still room for improvement in the reduction of blood glucose level due to administration of an AMPK inhibitor. The incomplete decrease in blood glucose level is thought to be due to glucagon. Thus, by combining a glucagon inhibitor and / or a glucagon receptor inhibitor with an AMPK inhibitor, it is possible to more effectively reduce the blood glucose level.

グルカゴン阻害剤としては、Glu-001（ノボノルディスク、Soensen H, et al Diabetes 55: 2843-2848, 2006）、グルカゴン受容体アンタゴニスト（イーライリリー、特開2011-518125号公報）等のほか、Yan H, et al J Pharmacol Exp Ther. 329:102-111, 2009に開示されている。また、公知のグルカゴン受容体阻害剤が挙げられる。   Glucagon inhibitors include Glu-001 (Novonordisk, Soensen H, et al Diabetes 55: 2843-2848, 2006), glucagon receptor antagonists (Eli Lilly, JP 2011-518125), etc., and Yan H, et al J Pharmacol Exp Ther. 329: 102-111, 2009. Also, known glucagon receptor inhibitors can be mentioned.

本組成物は、ＡＭＰＫ阻害剤と、インスリンと、を有効成分としてもよい。既に説明したように、ＡＭＰＫ阻害剤は、低血糖を引き起こさないため、インスリンと併用することが可能である。この結果、インスリンの投与量を低減でき、注射回数を低減でき、患者の使用性を改善することができる。   The present composition may contain an AMPK inhibitor and insulin as active ingredients. As already explained, AMPK inhibitors do not cause hypoglycemia and can be used in combination with insulin. As a result, the dose of insulin can be reduced, the number of injections can be reduced, and the patient's usability can be improved.

本組成物は、ＡＭＰＫ阻害剤と、ＩＬ−６中和抗体と、を有効成分としてもよい。既に説明したように、ＩＬ−６中和抗体の投与が、Ｔ１ＤＭなどの糖尿病における代謝異常を改善する。ＩＬ−６中和抗体としては、公知の方法で取得ないし入手が可能である。   The present composition may contain an AMPK inhibitor and an IL-6 neutralizing antibody as active ingredients. As already explained, administration of IL-6 neutralizing antibody improves metabolic abnormalities in diabetes such as T1DM. The IL-6 neutralizing antibody can be obtained or obtained by a known method.

本明細書に開示される組成物は、医薬組成物、飲食品、あるいは研究目的（例えば、インビトロやインビボの実験）に用いられる試薬の形態であり得る。   The compositions disclosed herein can be in the form of pharmaceutical compositions, food and drink, or reagents used for research purposes (eg, in vitro or in vivo experiments).

本組成物は、糖尿病の予防や治療のために投与される医薬組成物として好適に用いることができる。また、糖尿病の予防や改善を図るために日常的に摂取される飲食品としても好適に用いることができる。   This composition can be suitably used as a pharmaceutical composition administered for the prevention or treatment of diabetes. It can also be suitably used as a food or drink that is taken daily to prevent or improve diabetes.

本組成物における有効成分は、製剤形態等、必要に応じて、適切な塩の形態をとっていてもよい。塩を有効成分とする場合において、許容される塩の形態は、当業者において周知であり、当業者であれば適切な塩の形態を選択できる。   The active ingredient in this composition may take the form of a suitable salt as needed, such as a formulation form. In the case of using a salt as an active ingredient, acceptable salt forms are well known to those skilled in the art, and those skilled in the art can select an appropriate salt form.

本組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの各種形態として、経口的に摂取したり、静脈注射などの方法によって非経口的に生体内に取り入れることができる。   This composition can be formulated by a known pharmaceutical method. For example, various forms such as tablets, powders, granules, capsules, and liquids can be taken orally or parenterally taken into a living body by a method such as intravenous injection.

これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤と適宜組み合わせることができる。その他、栄養補助剤を添加して用いることもできる。   In these preparations, carriers that are acceptable pharmacologically or as foods and beverages, specifically, sterile water and physiological saline, vegetable oils, solvents, bases, emulsifiers, suspensions, surfactants, stabilizers, Flavor, fragrance, excipient, vehicle, preservative, binder, diluent, tonicity agent, extender, disintegrant, buffer, coating agent, lubricant, colorant, sweetener, viscous It can be appropriately combined with agents, flavoring agents, solubilizing agents or other additives. In addition, a nutritional supplement can be added and used.

本組成物を医薬組成物として用いる場合には、Ｔ１ＤＭなど、糖尿病における代謝異常の改善に有効な１種もしくは２種以上の他の成分を配合することができる。また、糖尿病の予防や治療に有効な他の医薬組成物と併用してもよい。   When this composition is used as a pharmaceutical composition, one or more other components effective for improving metabolic abnormalities in diabetes, such as T1DM, can be blended. Moreover, you may use together with the other pharmaceutical composition effective in the prevention and treatment of diabetes.

なお、ＡＭＰＫ阻害剤を、他の有効成分、例えば、上記したグルカゴン阻害剤及び／又はグルカゴン受容体阻害剤、インスリン、ＩＬ−６中和抗体などと併用するとき（以下、こうした併用の組合せを本組合せという場合もある。）、単一の組成物の形態に限定せず、異なる製剤形態、異なる用法用量での投与が可能なように、２以上の有効成分を含む製剤の組合せ（キット）とすることも、当然ながら可能であり、適切な場合がある。こうした変形は、当業者であれば適宜設計事項の範囲内で可能である。   When the AMPK inhibitor is used in combination with other active ingredients such as the above-described glucagon inhibitor and / or glucagon receptor inhibitor, insulin, IL-6 neutralizing antibody, etc. A combination of preparations containing two or more active ingredients (kits) so that administration in different dosage forms and different dosages is possible, not limited to a single composition form) Of course, it is possible and appropriate. Such modifications can be made by those skilled in the art within the scope of the design matter as appropriate.

本組成物又は本組合せを飲食品として用いる場合、当該飲食品は、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、病者用食品、あるいは食品添加物、であり得る。本発明の飲食品は、上記のような組成物として摂取することができる他、種々の飲食品として摂取することもできる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状またはゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。本発明における飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。飲食品においては、糖尿病における代謝異常の改善に寄与できる他の１種又は２種以上の成分を含んでいてもよい。さらに、飲食品は、他の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。例えば、適宜、栄養補助剤等を添加し、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化等の生活習慣病を幅広く予防または改善するための多機能性の飲食品として用いることもできる。   When this composition or this combination is used as a food or drink, the food or drink can be, for example, a health food, a functional food, a food for specified health use, a nutritional supplement, a food for a sick person, or a food additive. The food / beverage products of this invention can be ingested as a composition as described above, and can also be ingested as various food / beverage products. Furthermore, health foods and drinks prepared in the form of powder, granules, tablets, capsules, liquid, paste or jelly are also included. Manufacture of the food-drinks in this invention can be implemented with a manufacturing technique well-known in the said technical field. The food or drink may contain one or more other components that can contribute to the improvement of metabolic abnormalities in diabetes. Furthermore, the food and drink may be a multifunctional food and drink by combining with other components that exhibit other functions or other functional foods. For example, a nutritional supplement or the like can be appropriately added and used as a multifunctional food or drink for widely preventing or improving lifestyle-related diseases such as diabetes, hypertension, hyperlipidemia, and arteriosclerosis.

本組成物又は本組合せの投与量または摂取量は、年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）などに応じて、適宜選択される。本発明の組成物の有効成分であるＡＭＰＫ阻害剤は、概して、Ｔ１ＤＭを含む糖尿病における１種又は２種以上の代謝異常を改善できるのに有効量で使用される。具体的には、成人で１日あたり５ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは５０ｍｇ〜５００ｍｇ程度が投与又は摂取されるように、１日１回乃至数回に分けて用いることが好ましい。通常、数週間乃至数ヶ月間反復摂取（服用）することが好ましい。   The dose or intake of the composition or the combination is appropriately selected according to age, weight, symptom, health condition, type of composition (pharmaceutical, food and drink, etc.) and the like. The AMPK inhibitor that is the active ingredient of the composition of the present invention is generally used in an effective amount to be able to ameliorate one or more metabolic abnormalities in diabetes including T1DM. Specifically, it is preferable to use it once or several times a day so that an adult can administer or ingest about 5 mg to 500 mg, preferably about 50 mg to 500 mg per day. Usually, it is preferable to take (take) repeatedly for several weeks to several months.

本組成物又は本組合せに係る製品（医薬品、飲食品、試薬）またはその説明書は、糖尿病の予防、治療、あるいは改善に用いられる旨の表示を付されていてもよい。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。表示においては、本組成物あるいは場合によっては本組合せで投与もしくは摂取することにより糖尿病における代謝異常が改善されることあるいはその機序についての情報を含むことができる。   The product (pharmaceutical product, food and drink, reagent) according to the present composition or the present combination or its instructions may be labeled as used for the prevention, treatment or improvement of diabetes. Here, “labeled product or instructions” means that the product body, container, packaging, etc. are marked, or instructions, package inserts, promotional materials, or other printed materials that disclose product information. It means that the display is attached to. Indications may include information on how or by which metabolic abnormalities in diabetes are improved by administration or ingestion of the composition or optionally the combination.

（糖尿病における代謝異常を改善するための方法）
本明細書は、このように、本組成物又は本組合せを対象個体に投与もしくは摂取させることを特徴とする、対象における糖尿病における代謝異常を改善し、予防し、治療する方法を提供することができる。 (Methods for improving metabolic abnormalities in diabetes)
The present specification thus provides a method for improving, preventing and treating metabolic abnormalities in diabetes in a subject, characterized in that the subject composition is administered or ingested with the composition or the combination. it can.

（スクリーニング方法）
本明細書に開示されるスクリーニング方法は、糖尿病による血中の糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される１種又は２種以上の代謝異常を改善するためのＡＭＰＫ阻害剤のスクリーニング方法である。本スクリーニング方法は、被験化合物のＡＭＰＫ阻害活性を評価する工程、を備えることができる。本スクリーニング方法によれば、糖尿病の代謝異常を改善するのに有効なＡＭＰＫ阻害をスクリーニングできる。 (Screening method)
The screening method disclosed in the present specification is an AMPK for improving one or more metabolic abnormalities selected from the group consisting of blood sugar, fatty acids, insulin, neutral fat and ketone bodies due to diabetes. Inhibitor screening method. This screening method can comprise a step of evaluating the AMPK inhibitory activity of the test compound. According to this screening method, it is possible to screen for AMPK inhibition effective in improving diabetes metabolic abnormality.

ＡＭＰＫ阻害活性の評価は、例えば、既に説明したＡＭＰＫの活性に基づいて、例えば、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の直接リン酸化（Ｓｅｒ７９）などを指標として評価することができる。   The AMPK inhibitory activity can be evaluated, for example, based on the activity of AMPK already described, using, for example, direct phosphorylation (Ser79) of acetyl-CoA carboxylase (ACC) as an index.

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated more concretely based on an Example, this invention is not limited to a following example.

まず、実験に用いた動物及び実験方法を記述し、その後結果について既述する。   First, the animals and experimental methods used in the experiments are described, and then the results are described.

（動物）
雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本ＳＬＣ、浜松、日本）と骨格筋特異ＤＮ−ＡＭＰＫ発現するマウス（ＤＮ−ＡＭＰＫマウス）（２９）は、生後１０〜１２週で検討に用いた。ＤＮ−ＡＭＰＫマウスは、ヒトα−骨格アクチンプロモーター（２９）の制御下に、骨格筋において優先的に、アラニン（Ａｓｐ１５７Ａｌａ）の１５７位にアスパラギン酸残基を置換したＡＭＰＫのα１の触媒サブユニットの変異体を過剰発現させた。１５７位のアスパラギン酸は、プロテインキナーゼがＭｇ２＋−ＡＴＰの結合（２９）に不可欠なＤＦＧ（プロテインキナーゼ触媒サブユニットにサブドメインＶＩＩ）モチーフ内にある。動物は、０６：００から１８：００時間に点灯し。２４℃±１℃に調節されたプラスチックゲージに個別に収容され、それらは実験室食（オリエンタル酵母、東京、日本）と水をいつでもアクセスできるように維持した。 (animal)
Male C57BL / 6J mice (Japan SLC, Hamamatsu, Japan) and skeletal muscle-specific DN-AMPK-expressing mice (DN-AMPK mice) (29) were used at 10 to 12 weeks after birth. The DN-AMPK mouse has a catalytic subunit of AMPK α1 in which an aspartic acid residue is substituted at position 157 of alanine (Asp157Ala) preferentially in skeletal muscle under the control of the human α-skeletal actin promoter (29). Mutants were overexpressed. Aspartic acid at position 157 is within the DFG (protein kinase catalytic subunit subdomain VII) motif, where the protein kinase is essential for Mg 2+ -ATP binding (29). The animal lights up from 06:00 to 18:00 hours. Individually housed in plastic gauges adjusted to 24 ° C. ± 1 ° C., they maintained laboratory food (Oriental Yeast, Tokyo, Japan) and water at all times.

マウスに対して、１日目と３日目にストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（Ｓｉｇｍａ社、東京、日本）を２回腹腔内注射（２００ｍｇ／ｋｇ）した（ＳＴＺ処理ＷＴマウスとＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウス）。マウスの別のグループ（ＷＴマウスおよびＤＮ−ＡＭＰＫマウス）は、ＳＴＺ処理したマウスと同様の方法でビヒクルを注射した。２回目の注射から１週間後、ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）を行い、その後、脂肪負荷試験およびピルビン酸耐性試験を行った。   Mice were injected intraperitoneally (200 mg / kg) with streptozotocin (STZ) (Sigma, Tokyo, Japan) on day 1 and day 3 (STZ-treated WT mice and STZ-treated DN-AMPK mice). . Another group of mice (WT mice and DN-AMPK mice) were injected with vehicle in the same manner as STZ-treated mice. One week after the second injection, a glucose tolerance test (GTT) was performed, followed by a fat tolerance test and a pyruvate tolerance test.

血液は毎日尾から採取し、グルコースの血漿濃度はキット（グルコース：グルコースCII-テストワコー、大阪、日本）を用いて測定し、血糖値とした。２回目のＳＴＺ注射から２週間後、午後１時にマウスを断頭し、組織および血液サンプルを採取した。   Blood was collected from the tail every day, and the plasma concentration of glucose was measured using a kit (glucose: glucose CII-Test Wako, Osaka, Japan) to obtain a blood glucose level. Two weeks after the second STZ injection, the mice were decapitated at 1 pm and tissue and blood samples were collected.

（ＤＮ−ＡＭＰＫ（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ ＡＭＰＫ））
ＤＮ−ＡＭＰＫは、ＡＭＰＫα１サブユニットの１５７番目アスパラギン酸を、アラニンに変異させたタンパク質である。このアスパラギン酸は、キナーゼ活性に必要なＡＴＰ結合に必須であり、アラニンに置換したα１サブユニットを持つＡＭＰＫは、キナーゼ活性を消失する。また、これを細胞内に発現させると、正常なＡＭＰＫと基質、および調節サブユニットを取り合い、細胞内のＡＭＰＫ活性を低下させる。さらに、調節サブユニットに結合出来なかった正常なα１、α２サブユニットは分解されるため、結果としてＡＭＰＫ活性が著しく低下する。 (DN-AMPK (dominant negative form AMPK))
DN-AMPK is a protein in which the 157th aspartic acid of the AMPKα1 subunit is mutated to alanine. This aspartic acid is essential for ATP binding required for kinase activity, and AMPK having an α1 subunit substituted with alanine loses kinase activity. Moreover, when this is expressed in a cell, normal AMPK, a substrate, and a regulatory subunit are brought together to reduce the intracellular AMPK activity. Furthermore, normal α1 and α2 subunits that could not bind to the regulatory subunit are degraded, resulting in a marked decrease in AMPK activity.

本実験では、骨格筋選択的なヒトアクチンプロモータを用いて、ＤＮ−ＡＭＰＫを骨格筋に選択的に過剰発現したマウスを用いた（国立栄養学研究所江崎教授より供与）。学位論文、下記引用論文にあるように、骨格筋においてａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ （ＡＣＣ） （ＡＭＰＫの主要な標的タンパク質：脂肪合成のための重要な律速酵素）のリン酸化が減少しており、ＡＭＰＫ活性が抑制されていることが分かる。また、α２サブユニットのタンパク質量が骨格筋において選択的に低下している（結合できなかったα２サブユニットが分解されたため）(Am J Physiol Endocrinol Metab. 296, E47-E55.)。   In this experiment, mice that selectively overexpressed DN-AMPK in skeletal muscle using a skeletal muscle-selective human actin promoter were used (provided by Prof. Esaki, National Institute of Nutrition). As shown in the dissertation and the following cited paper, phosphorylation of acetyl-CoA carboxyylase (ACC) (a major target protein for AMPK: an important rate-limiting enzyme for fat synthesis) is reduced in skeletal muscle, and AMPK activity It can be seen that is suppressed. In addition, the amount of α2 subunit protein is selectively reduced in skeletal muscle (because the α2 subunit that could not be bound was degraded) (Am J Physiol Endocrinol Metab. 296, E47-E55.).

（グルコース耐性、ピルビン酸耐性および脂肪負荷試験）
一晩の絶食後、動物にブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）のためにグルコース（２グラム／ｋｇ）を腹腔内に注射した。グルコース投与から０、３０、６０、９０及び１２０分後に動物の尾から血液を採取した。血漿中のグルコース濃度とインスリン濃度をキット（マウスインスリンＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（Ｕ型）、シバヤギインスリングルコースＣＩＩ−テストワコーグルコース）を用いて測定した（表１）。 (Glucose tolerance, pyruvate tolerance and fat tolerance test)
After an overnight fast, animals were injected intraperitoneally with glucose (2 grams / kg) for a glucose tolerance test (GTT). Blood was collected from the animal's tail at 0, 30, 60, 90 and 120 minutes after glucose administration. Plasma glucose concentration and insulin concentration were measured using a kit (mouse insulin ELISA KIT (U type), Shiba goat insulin glucose CII-Test Wako glucose) (Table 1).

脂肪負荷試験は、既述に従い実施した（３０）。すなわち、４時間の絶食後、マウスにトリオレイン（関東化学株式会社、東京、日本）（１７μｌ／ｇ）を強制的に経口的に胃に導入し、血液を０、３０、６０、９０、１０，１８０及び３００分に連続的に尾より採血した。遊離脂肪酸、トリグリセリドおよびインスリンの血漿濃度は、キットを用いて測定した（遊離脂肪酸：ＮＥＦＡＣ−テストワコー、トリグリセリド：トリグリセリドＥ−テストワコー、マウスインスリンＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（Ｕ型）、シバヤギ）（表１）。   The fat tolerance test was performed as previously described (30). That is, after fasting for 4 hours, triolein (Kanto Chemical Co., Inc., Tokyo, Japan) (17 μl / g) was forcibly introduced into the stomach orally in mice, and blood was 0, 30, 60, 90, 10 , Blood was collected from the tail continuously at 180 and 300 minutes. Plasma concentrations of free fatty acids, triglycerides and insulin were measured using kits (free fatty acids: NEFAC-Test Wako, triglycerides: Triglycerides E-Test Wako, mouse insulin ELISA KIT (U type), Shibayagi) (Table 1).

（免疫ブロット分析）
組織を４℃で、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１％トリトンＸ、１ｍＭブチルホスファターゼ阻害剤（カルビオケム社、カリフォルニア、ＵＳＡ）及びプロテイナーゼ阻害剤（シグマ）でホモジナイズした。ホモジネートを遠心分離し、上清（２０μｇのタンパク質）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した。免疫ブロット分析は、表２に示した特異的抗体を用いて行った。免疫複合体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（サンタクルズ、カリフォルニア州、米国）と強化された化学発光試薬（ＧＥヘルスケア、東京、日本）で可視化した。タンパク質バンドは、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（国立衛生研究所、ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）を用いて定量した。 (Immunoblot analysis)
Tissue was treated at 50C with 50 mM Tris (pH 7.4), 5 mM EDTA (pH 8.0), 10 mM sodium pyrophosphate, 1% Triton X, 1 mM butyl phosphatase inhibitor (Calbiochem, California, USA) and proteinase inhibitor ( Sigma). The homogenate was centrifuged and the supernatant (20 μg protein) was fractionated by SDS-PAGE. Immunoblot analysis was performed using the specific antibodies shown in Table 2. Immune complexes were visualized with a horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody (Santa Cruz, CA, USA) and an enhanced chemiluminescent reagent (GE Healthcare, Tokyo, Japan). Protein bands were quantified using ImageJ software (National Institutes of Health, http://rsbweb.nih.gov/ij).

（アセチルＰＧＣ−１αの測定）
腓腹筋の赤色部分を４℃で、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭの塩化カリウム、１％ＮＰ４０、５ｍＭのニコチンアミド、１ｍＭのナトリウム酪酸ホスファターゼ阻害剤（カルビオケム）およびプロテイナーゼ阻害剤（シグマ）を含有する溶解緩衝液中でホモジナイズした。筋肉の溶解液（タンパク質２ｍｇ）を４０μｌのプロテインＧ−共役セファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、東京、日本）で予備洗浄を行い、４μｇのＰＧＣ−１（Ｈ３００）抗体（サンタクルスバイオテクノロジー）とプロテインＡ共役セファロースビーズ（ＧＥヘルスケア）で免疫沈降させた。得られた免疫沈降物を、１２５ｍＭトリス塩酸液（ｐＨ６．８）、２０％グリセロール、４％ＳＤＳ、０．０２％ブロモフェノールブルー、２０％２−メルカプトエタノールを含む５０μｌの試料緩衝液で煮沸し、アセチル化リジンに対する抗体（セルシグナリングテクノロジー、Ｄｅｎｖｅｒｓ、ＭＡ）又は全ＰＧＣ−１α（Ｈ３００）を用いてウェスタンブロット分析に供した。 (Measurement of acetyl PGC-1α)
The red part of the gastrocnemius muscle at 4 ° C., 50 mM Tris (pH 7.4), 1 mM EDTA, 150 mM potassium chloride, 1% NP40, 5 mM nicotinamide, 1 mM sodium butyrate phosphatase inhibitor (Calbiochem) and proteinase inhibitor ( Homogenized in lysis buffer containing Sigma). The muscle lysate (2 mg protein) was pre-washed with 40 μl protein G-conjugated Sepharose beads (GE Healthcare, Tokyo, Japan) and 4 μg PGC-1 (H300) antibody (Santa Cruz Biotechnology) and protein A Immunoprecipitated with conjugated Sepharose beads (GE Healthcare). The resulting immunoprecipitate was boiled in 50 μl of sample buffer containing 125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 20% glycerol, 4% SDS, 0.02% bromophenol blue, 20% 2-mercaptoethanol. Western blot analysis using antibodies against acetylated lysine (Cell Signaling Technology, Denvers, Mass.) Or total PGC-1α (H300).

（ＲＮＡ抽出及び定量的リアルタイムＰＣＲ）
全ＲＮＡをＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン、和光、日本）を使用して組織から単離し、ＲＮＡ（４００ｎｇ）をオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｓｉｇｍａ社）およびトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（タカラ、滋賀県、日本）を用いて逆転写に供した。得られたｃＤＮＡは、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックスを用いて前述のようにＡＢＩ ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、日本、東京）（２２）によって定量した。データは、骨格筋については酸性リボソームタンパク質の存在量により、脂肪組織サンプルについては３６Ｂ４の存在量によって正規化した。プライマーの配列は表３に示す。 (RNA extraction and quantitative real-time PCR)
Total RNA was isolated from tissues using Isogen (Nippon Gene, Wako, Japan), RNA (400 ng) was isolated from oligo (dT) primer (Sigma) and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase (Takara, Shiga, Japan) Japan) was used for reverse transcription. The obtained cDNA was quantified by ABI 7500 real-time PCR system (Applied iosystems, Tokyo, Japan) (22) as described above using SYBR green PCR master mix. Data were normalized by the abundance of acidic ribosomal protein for skeletal muscle and by the abundance of 36B4 for adipose tissue samples. The primer sequences are shown in Table 3.

（血漿代謝物とホルモンの測定）
血液サンプル中のグルコース、コルチコステロン遊離脂肪酸、トリグリセリド、ケトン体、インスリン、グルカゴン、ＩＬ−６およびアイリシンの血漿濃度を表１に記載のキットにより測定した。 (Measurement of plasma metabolites and hormones)
Plasma concentrations of glucose, corticosterone free fatty acid, triglyceride, ketone body, insulin, glucagon, IL-6 and ilysin in blood samples were measured using the kit described in Table 1.

（ＩＬ−６のためのレプチンと中和抗体の慢性注入）
組換えマウスレプチン（０．５ｍｇ／ｍｌ）（ぺプロテック株式会社、ロッキーヒル、ＮＪ）またはＩＬ−６（１ｍｇ／ｍｌ）中和抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、ＭＮ）（３１）を、浸透圧ミニポンプ（アルゼット、モデル２００２、室町機械（株）、東京、日本）を用いて皮下に１４日間０．５μＬ／時の速度で送達した。浸透圧ミニポンプは、ケタミン（体重の１００ｍｇ／ｋｇ体重）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）による麻酔下で皮下に移植した。対照群は、同じタイプのポンプでリン酸緩衝生理食塩水を送達した。その後、浸透圧ミニポンプの移植後２日目と４日目に、ＳＴＺ（２００ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクルを腹腔内注射した。体重およびグルコースとインスリンの血漿濃度を毎日モニターした。ミニポンプを移植して二週間後にマウスを断頭し、血液および組織のサンプルを採取した。 (Chronic infusion of leptin and neutralizing antibody for IL-6)
Recombinant mouse leptin (0.5 mg / ml) (Peprotech Inc., Rocky Hill, NJ) or IL-6 (1 mg / ml) neutralizing antibody (R & D Systems, Minneapolis, MN) (31) A pressure minipump (Alzette, model 2002, Muromachi Kikai Co., Ltd., Tokyo, Japan) was delivered subcutaneously at a rate of 0.5 μL / hr for 14 days. The osmotic minipump was implanted subcutaneously under anesthesia with ketamine (100 mg / kg body weight) and xylazine (10 mg / kg). The control group delivered phosphate buffered saline with the same type of pump. Thereafter, STZ (200 mg / kg) or vehicle was injected intraperitoneally on the second and fourth days after transplantation of the osmotic minipump. Body weight and plasma concentrations of glucose and insulin were monitored daily. Two weeks after transplanting the minipump, the mice were decapitated and blood and tissue samples were taken.

（統計分析）
データは平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として表示した。複数のグループ間の統計学的比較は分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって検定し、続いてＴｕｋｅｙのＨＳＤ事後検定を行った。２群間の統計分析は、スチューデントのｔ検定によって行った。＜０．０５のＰ値を統計的に有意とみなした。 (Statistical analysis)
Data were expressed as mean ± standard error (SEM). Statistical comparisons between groups were tested by analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey's HSD post-test. Statistical analysis between the two groups was performed by Student's t test. A P value of <0.05 was considered statistically significant.

（結果１：ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭは骨格筋においてＡＭＰＫを活性化する）
まず、骨格筋におけるＡＭＰＫがＳＴＺ誘発ＩＤＤＭによってマウスで活性化されるかどうかを検討した。結果を図１−１及び図１−２に示す。ＳＴＺ処理したＷＴマウスでは、ヒラメ筋（骨格筋の赤色部分）と長趾伸筋（extenstor digtorum longus、ＥＤＬ）（赤筋と白筋を含む混合筋）（図１−１のＡ）においてＡＭＰＫのＴｈｒ１７２リン酸化が増加した。ＡＭＰＫによってリン酸化されるＡＣＣのＳｅｒ７９リン酸化も、ＳＴＺ処理ＷＴマウス（図１−１のＢ）のヒラメ筋で増加した。 (Result 1: STZ-induced IDDM activates AMPK in skeletal muscle)
First, it was examined whether AMPK in skeletal muscle is activated in mice by STZ-induced IDDM. The results are shown in FIGS. 1-1 and 1-2. In STZ-treated WT mice, soleus muscle (red part of skeletal muscle) and extensor digtorum longus (EDL) (mixed muscle including red and white muscle) (A in Fig. 1-1) Thr172 phosphorylation increased. Ser79 phosphorylation of ACC phosphorylated by AMPK was also increased in the soleus of STZ-treated WT mice (FIG. 1-1B).

α１触媒サブユニット変異体の発現により、ＤＮ−ＡＭＰＫマウスのヒラメ筋、腓腹筋の赤色と白色の部分、およびＥＤＬにおいて、変異α１ＡＭＰＫタンパク質が増加した。これに対して、心臓の筋肉、鼠径（Ｉｎｇ）と精巣上体（ＥＰＩ）ＷＡＴ、肩甲骨間褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、膵臓、脾臓、脳などの他の組織においてα１ＡＭＰＫタンパク質の発現は変化しなかった（図１−１のＢと図１−２のＣ）。対照的に、以前に報告されているように、ＡＭＰＫのα２触媒サブユニットは骨格筋で減少していた。これは、ヘテロ複合体として構成されないＡＭＰＫのサブユニットは分解されるためと考えられる。ＡＭＰＫの活性化と並行して、ＳＴＺ処理ＷＴマウスのヒラメ筋ではＡＣＣのＳｅｒ７９リン酸化が増加したが、ＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは増加しなかった（図１−１のＢ）。   Expression of the α1 catalytic subunit mutant increased mutant α1AMPK protein in the soleus, red and white parts of the gastrocnemius muscle, and EDL of DN-AMPK mice. In contrast, α1AMPK protein expression is altered in other tissues such as heart muscle, inguinal (Ing) and epididymis (EPI) WAT, interscapular brown adipose tissue (BAT), pancreas, spleen, and brain. None (B in FIG. 1-1 and C in FIG. 1-2). In contrast, as previously reported, the α2 catalytic subunit of AMPK was decreased in skeletal muscle. This is probably because the subunits of AMPK that are not configured as heterocomplexes are decomposed. Concurrently with the activation of AMPK, Ser79 phosphorylation of ACC increased in the soleus muscle of STZ-treated WT mice, but not in DN-AMPK mice (B in FIG. 1-1).

ＳＴＺ処理は、血漿インスリン濃度（図２のＡ）とＡｋｔのＳｅｒ４７３リン酸化（図２のＢ）をＷＴおよびＤＮ−ＡＭＰＫマウスの両方のヒラメ筋において減少させた。しかし、血漿グルコース濃度（図２のＣ）は、ＳＴＺ処理ＷＴマウスに比べＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおいて有意に低かった。したがって、骨格筋におけるＡＭＰＫ活性の選択的抑制は、血漿インスリンレベルが低いままであり骨格筋におけるそのシグナル伝達が阻害されているにも関わらず、高血糖を改善した。   STZ treatment reduced plasma insulin concentrations (FIG. 2A) and Akt Ser473 phosphorylation (FIG. 2B) in both soleus muscles of WT and DN-AMPK mice. However, plasma glucose concentration (C in FIG. 2) was significantly lower in STZ-treated DN-AMPK mice compared to STZ-treated WT mice. Thus, selective suppression of AMPK activity in skeletal muscle improved hyperglycemia despite plasma insulin levels remaining low and its signaling in skeletal muscle being inhibited.

（結果２：骨格筋におけるＤＮ−ＡＭＰＫの選択的な発現は、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭにおける体重減少、過食症、生存率を減少させ、組織の減量を向上させることができる）
ＷＴマウスはＳＴＺ処理（図３−１のＡ）によって体重が減少した。しかしながら、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは有意に改善した。ＳＴＺ投与によって引き起こされた過食もＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウス（図３−１のＢ）で抑制された。さらに、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウスは、ＳＴＺの第１回注射後２週目においてもすべて生き残ったが、ＳＴＺ処理したＷＴマウスはわずか３５．７％生き残っただけであった（図３−１のＣ）。 (Result 2: Selective expression of DN-AMPK in skeletal muscle can reduce weight loss, bulimia, survival in STZ-induced IDDM, and improve tissue weight loss)
WT mice lost weight by STZ treatment (A in FIG. 3-1). However, STZ-treated DN-AMPK mice showed a significant improvement. Overeating caused by STZ administration was also suppressed in STZ-treated DN-AMPK mice (FIG. 3-1 B). Furthermore, all STZ-treated DN-AMPK mice survived 2 weeks after the first injection of STZ, while only 35.7% of STZ-treated WT mice survived (FIG. 3-1). C).

ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスは、ＳＴＺ処理ＷＴマウス（図３−２のＤ）と比較して大幅にヒラメ筋と腓腹筋の組織重量を回復した。また、ＳＴＺ処理により減少した組織精巣上体（Ｅｐｉ）と鼠径（Ｉｎｇ）ＷＡＴ、および肩甲骨間ＢＡＴの重量も、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウスで回復した（図３−２のＥ）。これらのデータは、骨格筋におけるＡＭＰＫ活性化を阻害することにより、ＳＴＺによって誘発される骨格筋および脂肪組織の萎縮及び体重減少が改善し、その結果、生存率を増加させることを示唆している。   STZ-treated DN-AMPK mice significantly recovered soleus and gastrocnemius tissue weights compared to STZ-treated WT mice (D in FIG. 3-2). Moreover, the tissue epididymis (Epi), inguinal (Ing) WAT, and interscapular BAT weight decreased by STZ treatment were also recovered in the DN-AMPK mice treated with STZ (E in FIG. 3-2). These data suggest that inhibiting AMPK activation in skeletal muscle improves STZ-induced skeletal muscle and adipose tissue atrophy and weight loss, resulting in increased survival. .

（結果３：骨格筋におけるＤＮ−ＡＭＰＫの選択的発現は、全身のグルコースおよび脂質代謝を改善する）
ＳＴＺ第１回注射から二週間後、ＳＴＺ−処理されたＷＴマウスは、遊離脂肪酸、トリグリセリドおよびケトン体の血漿濃度が増加していた。ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは、完全に正常レベルに戻った（図４のＡ）。血漿中のノルエピネフリンの濃度、エピネフリン及びコルチコステロン濃度は、ＳＴＺ処理したＷＴマウスでは増加したが、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは増加していなかった（図４のＢ）。対照的に、血漿グルカゴン濃度はＳＴＺ−処理ＷＴマウスと同様、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおいて高いままであった（図４のＢ）。このように、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおいて血糖値が部分的な改善に留まったのは、マウスの高グルカゴン血症（図２のＣ）によるものである。 (Result 3: Selective expression of DN-AMPK in skeletal muscle improves systemic glucose and lipid metabolism)
Two weeks after the first STZ injection, STZ-treated WT mice had increased plasma concentrations of free fatty acids, triglycerides and ketone bodies. In the DN-AMPK mice treated with STZ, the level returned to normal level (A in FIG. 4). Plasma concentrations of norepinephrine, epinephrine and corticosterone were increased in STZ-treated WT mice but not in STZ-treated DN-AMPK mice (FIG. 4B). In contrast, plasma glucagon concentrations remained high in STZ-treated DN-AMPK mice as in STZ-treated WT mice (FIG. 4B). Thus, it was due to hyperglucagonemia in the mouse (C in FIG. 2) that the blood glucose level remained partially improved in STZ-treated DN-AMPK mice.

さらに骨格筋にＤＮ−ＡＭＰＫを発現させた時の全身の糖・脂質代謝に及ぼす影響を調べるために、ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）とピルビン酸耐性試験、脂肪（トリオレイン）負荷試験を行った。ＳＴＺ処理されたＷＴマウスは、ＧＴＴに応答して、大きく血糖値が増加した（図５−１のＡ）。しかし、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは有意に血糖値（図５−１のＡ）が改善した。またトリオレインの摂取によって、ＳＴＺ処理ＷＴマウスでは血漿遊離脂肪酸とトリグリセリドの濃度が増加したが、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは有意に改善した（図５−１のＣ）。また、実験の間、血漿インスリン濃度は、ＳＴＺ処理ＷＴマウスと同様、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおいても低いままであった（図５−１のＢおよびＤ）。また、肝臓の糖新生活性を反映するピルビン酸耐性試験は、ピルビン酸塩注射に応答して増加した血漿グルコース濃度が、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおいて有意に改善することを示した（図５−２のＥ）。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼカルボキシラーゼ（ＰＥＰＣＫ）のｍＲＮＡは、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウス（図５−２のＦ）の肝臓で減少した。これらのデータは、骨格筋においてＡＭＰＫ活性を阻害することにより、血漿インスリンレベルは低いままであっても全身のグルコースおよび脂質代謝が改善することを示唆する。   Furthermore, in order to examine the influence on whole body sugar / lipid metabolism when DN-AMPK was expressed in skeletal muscle, a glucose tolerance test (GTT), a pyruvate tolerance test, and a fat (triolein) tolerance test were performed. In WT mice treated with STZ, the blood glucose level was greatly increased in response to GTT (A in FIG. 5A). However, the blood glucose level (A in FIG. 5-1) improved significantly in STZ-treated DN-AMPK mice. In addition, ingestion of triolein increased plasma free fatty acid and triglyceride concentrations in STZ-treated WT mice, but significantly improved in STZ-treated DN-AMPK mice (FIG. 5-1C). During the experiment, plasma insulin concentrations remained low in STZ-treated DN-AMPK mice as well as STZ-treated WT mice (B and D in FIG. 5-1). A pyruvate tolerance test reflecting liver gluconeogenic activity also showed that plasma glucose concentrations increased in response to pyruvate injection were significantly improved in STZ-treated DN-AMPK mice (FIG. 5). -2 E). Phosphoenolpyruvate carboxylase carboxylase (PEPCK) mRNA was decreased in the liver of STZ-treated DN-AMPK mice (FIG. 5-2F). These data suggest that inhibiting AMPK activity in skeletal muscle improves systemic glucose and lipid metabolism even though plasma insulin levels remain low.

（結果４：骨格筋におけるＤＮ−ＡＭＰＫの選択的発現は、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭに応答した骨格筋におけるＡＭＰＫ関連信号の活性化を阻害する）
図１−１のＢは、ＩＤＤＭではＡＭＰＫの活性化に並行して、骨格筋においてＡＣＣリン酸化が増加することを示す。そこで、ヒラメ筋においてＡＭＰＫに関連するその他の下流シグナル分子の反応を調べた。ＳＴＺ処理したＷＴマウスでは、ヒラメ筋においてＮＡＭＰＴとＳＩＲＴ１のｍＲＮＡ量が増加したが、これらの変化は、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは抑制された（図６のＡ）。さらに、ＳＴＺ処理したＷＴマウスでは、腓腹筋の赤色部分においてアセチル化ＰＧＣ−１αの量が減少した。これに対してＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは減少しなかった（図６のＢ）。 (Result 4: Selective expression of DN-AMPK in skeletal muscle inhibits activation of AMPK-related signals in skeletal muscle in response to STZ-induced IDDM)
FIG. 1-1B shows that IDDM increases ACC phosphorylation in skeletal muscle in parallel with AMPK activation. Therefore, the reaction of other downstream signal molecules related to AMPK in the soleus muscle was examined. In STZ-treated WT mice, the amounts of NAMPT and SIRT1 mRNA increased in the soleus muscle, but these changes were suppressed in STZ-treated DN-AMPK mice (A in FIG. 6). Furthermore, in WT mice treated with STZ, the amount of acetylated PGC-1α decreased in the red part of the gastrocnemius muscle. In contrast, DN-AMPK mice did not decrease (B in FIG. 6).

オートファジーは、長期的な飢餓のようなエネルギー危機における骨格筋の適応応答において重要な役割を果たす（３２−３４）。ＡＭＰＫは、直接ＵＬＫ１をリン酸化（Ｓｅｒ５５５）し、その結果、ＬＣ３−ＩＩのタンパク質量の増加させることによりオートファジーを調節する（１７−１９）。 ＳＴＺ処理ＷＴマウスは、ヒラメ筋においてＵＬＫ１のリン酸化およびＬＣ３−ＩＩのタンパク質発現を増加したが、これらの変化はＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは抑制された（図６のＣおよびＤ）。   Autophagy plays an important role in the adaptive response of skeletal muscle in energy crises such as long-term hunger (32-34). AMPK directly phosphorylates ULK1 (Ser555) and consequently regulates autophagy by increasing the amount of LC3-II protein (17-19). STZ-treated WT mice increased ULK1 phosphorylation and LC3-II protein expression in soleus muscle, but these changes were suppressed in STZ-treated DN-AMPK mice (C and D in FIG. 6).

ＡＭＰＫは、ＴＳＣ２（結節性硬化症複合体）のリン酸化（Ｓｅｒ１３８７）の増加とｍＴＯＲシグナルを減少させることによって、タンパク質合成を阻害する（１５，１６）。ＳＴＺ処理されたＷＴマウスではＴＳＣ２（Ｓｅｒ１３８７）のリン酸化が増加し、その結果、ヒラメ筋においてＳ６Ｋのリン酸化（Ｔｈｒ３８９）が減少した。ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは、それらは正常レベルに戻った（図６のＥおよびＦ）。   AMPK inhibits protein synthesis by increasing phosphorylation (Ser1387) of TSC2 (tuberous sclerosis complex) and decreasing mTOR signal (15, 16). In STZ-treated WT mice, phosphorylation of TSC2 (Ser1387) increased, and as a result, phosphorylation of S6K (Thr389) decreased in the soleus muscle. In STZ-treated DN-AMPK mice they returned to normal levels (E and F in FIG. 6).

（結果５：骨格筋におけるＤＮ−ＡＭＰＫの選択的発現は、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭのＷＡＴにおけるＡＭＰＫ活性化と変更された遺伝子発現を正常化する）
ＩＤＤＭマウスにおいてＷＡＴが萎縮するメカニズムを探るために、ＳＴＺ処理ＷＴとＤＮ−ＡＭＰＫマウスのＷＡＴにおいてＡＭＰＫの活性化と遺伝子発現を調べた。骨格筋と同様に、ＡＭＰＫはＳＴＺ処理ＷＴマウスのＩｎｇＷＡＴにおいて活性化したが、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは活性化していなかった（図７のＡ）。ＡＭＰＫは、脂肪細胞において脂質合成を抑制し、脂質合成関連遺伝子の発現を阻害することが示されている（３５）。脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）とリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）のｍＲＮＡ存在量は、ＳＴＺ処理ＷＴマウスの鼠径部（Ｉｎｇ）ＷＡＴにおいて減少したが、それらの発現はＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは有意に回復した（図７のＢ）。また、予期せぬことに、ＳＴＺ処理ＷＴマウスはＩｎｇＷＡＴにおいてＵＣＰ１とＣｉｄｅａ（ｃｅｌｌ-ｄｅａｔｈ-ｉｎｄｕｃｉｎｇ ＤＦＦ４５-ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ａ）の遺伝子発現が増加したが、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫでは抑制された（図の７Ｂ）。これらの結果は、ＷＡＴの萎縮が脂質生成の抑制によって誘導され、おそらくＷＡＴにおける熱産生タンパク質ＵＣＰ１の発現増大によって促進されたことを示唆する。 (Result 5: Selective expression of DN-AMPK in skeletal muscle normalizes AMPK activation and altered gene expression in STAT-induced IDDM WAT)
In order to investigate the mechanism of WAT atrophy in IDDM mice, activation of AMPK and gene expression were investigated in WAT of STZ-treated WT and DN-AMPK mice. Similar to skeletal muscle, AMPK was activated in IngWAT of STZ-treated WT mice but not in STZ-treated DN-AMPK mice (A in FIG. 7). AMPK has been shown to suppress lipid synthesis in adipocytes and inhibit the expression of lipid synthesis-related genes (35). Fatty acid synthase (FAS) and lipoprotein lipase (LPL) mRNA abundances were decreased in the inguinal (Ing) WAT of STZ-treated WT mice, but their expression was significantly restored in STZ-treated DN-AMPK mice (B in FIG. 7). Unexpectedly, STZ-treated WT mice showed increased gene expression of UCP1 and Cidea (cell-death-inducing DFF45-like effector A) in IngWAT, but were suppressed by STZ-treated DN-AMPK (Fig. 7B). These results suggest that WAT atrophy was induced by suppression of lipogenesis, possibly promoted by increased expression of the thermogenic protein UCP1 in WAT.

（結果６：ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭはＡＭＰＫ依存的に骨格筋においてｍｙｏｋｉｎｅｓ（マイオカイン）の発現を増加させる）
骨格筋におけるＡＭＰＫ活性化を抑制することにより、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭでの”脂肪組織萎縮症”が改善するメカニズムを探るために、脂肪細胞の代謝に影響を及ぼすマイオカインの発現を調べた。最近の研究において、新規マイオカイン、アイリシンは、ＰＧＣ−１α依存的に骨格筋においてＦＮＤＣ５（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ５）から生成され、皮下ＷＡＴにおけるＵＣＰ１および関連遺伝子発現を誘導することが明らかとなっている（２７）。骨格筋におけるＰＧＣ−１α活性化と一致して、ＳＴＺ処理したＷＴマウスではヒラメ筋中のＦＮＤＣ５タンパク質および血漿アイリシン濃度が増加していた（図８のＡ、Ｂ）。これらは、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおいて完全に正常レベルに戻った。 (Result 6: STZ-induced IDDM increases the expression of myokines in skeletal muscle in an AMPK-dependent manner)
In order to investigate the mechanism of improving “adipose tissue atrophy” in STZ-induced IDDM by suppressing AMPK activation in skeletal muscle, the expression of myokine that affects adipocyte metabolism was examined. Recent studies have revealed that a novel myokine, ilysin, is generated from FNDC5 (fibronectin type III domain containing 5) in skeletal muscle in a PGC-1α-dependent manner and induces UCP1 and related gene expression in subcutaneous WAT. (27). Consistent with PGC-1α activation in skeletal muscle, STZ-treated WT mice had increased concentrations of FNDC5 protein and plasma iricin in soleus muscle (A, B in FIG. 8). These returned to normal levels completely in STZ-treated DN-AMPK mice.

ＩＬ−６は、骨格筋から放出された別のマイオカインであり、ＷＡＴの脂肪分解を促進する（２５，２６）。ＩＬ−６は、ＡＭＰＫ（２６）を活性化することが報告されている（２６）。ＳＴＺ処理したＷＴマウスではヒラメ筋中のＩＬ−６タンパク質（図８のＣ）および血漿ＩＬ−６（図８のＤ）の濃度が増加したが、それらは、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスで減少した。次に、骨格筋（３６）から放出されることが報告されているＩＬ−１５の血漿濃度を調べた。しかし、ＳＴＺ−処理ＷＴマウスにおいてＩＬ−１５は血漿中で増加しなかった（データは示さず）。   IL-6 is another myokine released from skeletal muscle and promotes WAT lipolysis (25, 26). IL-6 has been reported to activate AMPK (26) (26). STZ-treated WT mice had increased levels of IL-6 protein (FIG. 8C) and plasma IL-6 (FIG. 8D) in soleus muscle, but they decreased in STZ-treated DN-AMPK mice . Next, the plasma concentration of IL-15 reported to be released from skeletal muscle (36) was examined. However, IL-15 did not increase in plasma in STZ-treated WT mice (data not shown).

（結果７：ＳＴＺ処理ＷＴとＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおけるレプチンとアディポネクチンの血漿濃度）
レプチンは脂肪細胞から分泌され、その分泌はＷＡＴ量に良く相関する。レプチンは、交感神経および組織におけるβ−アドレナリン受容体を介して、骨格筋におけるグルコース利用を促進する（２０−２２）。さらに、長期的なレプチン治療は、中枢神経系を介して、ＳＴＺ誘発糖尿病を含むＩＤＤＭにおける代謝変化を改善する（２３、２４、３７、３８）。別の脂肪細胞分泌ホルモンであるアディポネクチンも、骨格筋におけるグルコースと脂質の利用を促進し、肝臓でのグルコース産生を抑制する（３９）。レプチン血漿濃度はＳＴＺ処理ＷＴマウスにおいて顕著に減少したが、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは回復した（図９のＡ）。高分子量アディポネクチンの血漿濃度は、ＳＴＺ処理ＷＴマウス（図９のＢ）では変化しなかったが、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウス（図９のＢ）では増加した。 (Result 7: Plasma concentrations of leptin and adiponectin in STZ-treated WT and DN-AMPK mice)
Leptin is secreted from adipocytes and its secretion correlates well with the amount of WAT. Leptin promotes glucose utilization in skeletal muscle via β-adrenergic receptors in sympathetic nerves and tissues (20-22). Furthermore, long-term leptin treatment improves metabolic changes in IDDM, including STZ-induced diabetes, via the central nervous system (23, 24, 37, 38). Another adipocyte secreting hormone, adiponectin, also promotes glucose and lipid utilization in skeletal muscle and suppresses glucose production in the liver (39). Leptin plasma concentration was significantly reduced in STZ-treated WT mice, but recovered in STZ-treated DN-AMPK mice (A in FIG. 9). The plasma concentration of high molecular weight adiponectin did not change in STZ-treated WT mice (FIG. 9B), but increased in STZ-treated DN-AMPK mice (FIG. 9B).

（結果８：レプチンまたはＩＬ−６の中和抗体の慢性的な注入は、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭにおける代謝異常を改善する）
ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭにおける代謝変化に対して、レプチンおよびＩＬ−６がどのような調節作用を及ぼすかを探るために、浸透圧ミニポンプを用いて２週間、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭ Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにレプチンまたはＩＬ−６の中和抗体を注入した。レプチンの注入により、ＳＴＺ処理を行っていないコントロールレベルまでに血漿グルコース濃度が減少した（図１０−１のＡ）。ＩＬ−６中和抗体の注入も、また、グルコースの血漿濃度を減少した（図１０−１のＡ）。さらに、血漿遊離脂肪酸の濃度はレプチン及びＩＬ−６抗体の注入によってコントロールレベルに戻った（図１０−１のＡ）。 (Result 8: Chronic infusion of leptin or IL-6 neutralizing antibody ameliorates metabolic abnormalities in STZ-induced IDDM)
To explore the regulatory effects of leptin and IL-6 on metabolic changes in STZ-induced IDDM, STZ-induced IDDM C57BL / 6J mice were treated with leptin or IL- 2 for 2 weeks using an osmotic minipump. Six neutralizing antibodies were injected. The leptin injection reduced the plasma glucose concentration to the control level where STZ treatment was not performed (A in FIG. 10-1). Infusion of IL-6 neutralizing antibody also reduced the plasma concentration of glucose (A in FIG. 10-1). Furthermore, plasma free fatty acid concentrations returned to control levels by infusion of leptin and IL-6 antibody (A in FIG. 10-1).

レプチンの注入はミニポンプの植え込み後３日目に約３０ｎｇ／ｍｌまでレプチン血漿濃度を増加させ、実験の終了（２週間）までその濃度を保った（図１０−１のＢ）。脂肪組織量の増加に対応して、ＩＬ−６抗体の注入は、ＳＴＺ処理単独に対して有意に血漿レプチン濃度を増加させた（ＳＴＺ＋ビヒクル：０．１２±０．０１ｎｇ／ｍｌ；ＳＴＺ＋ＩＬ−６抗体：４．１８±０．５７ｎｇ／ｍｌ）（図１０−１のＢ）。   Leptin infusion increased leptin plasma concentration to about 30 ng / ml 3 days after mini-pump implantation and maintained that concentration until the end of the experiment (2 weeks) (FIG. 10-1 B). Corresponding to the increase in adipose tissue volume, IL-6 antibody infusion significantly increased plasma leptin concentrations relative to STZ treatment alone (STZ + vehicle: 0.12 ± 0.01 ng / ml; STZ + IL-6 Antibody: 4.18 ± 0.57 ng / ml) (B in FIG. 10-1).

血漿ＩＬ−６およびアイリシンの濃度は、ＩＬ−６抗体とレプチンの注入によって減少した（図１０−１のＢ）。対照的に、血漿インスリン濃度はＳＴＺ処理単独と同様、ＩＬ−６抗体およびレプチンの注入後においても低かった（図１０−１のＢ）。   Plasma IL-6 and ilysin concentrations were decreased by infusion of IL-6 antibody and leptin (B in FIG. 10-1). In contrast, plasma insulin concentrations were low after infusion of IL-6 antibody and leptin as well as STZ treatment alone (FIG. 10-1B).

次に、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭにおいて、レプチンあるいはＩＬ−６に対する抗体を注入した後の骨格筋量、ＷＡＴおよびＢＡＴ組織重量を調べた。全ての注入において、ヒラメ筋、ＥＤＬと腓腹筋の量が増加した（図１０−２のＣ）。さらに、ＩＬ−６抗体の注入により、ＥｐｉＷＡＴとＩｎｇＷＡＴおよびＢＡＴの量が増加した（図１０−２のＣ）。レプチンの注入もそれら脂肪組織の量を少し回復した（図１０−２のＣ）。ＩＬ−６抗体の注入に比べて、レプチン注入後に脂肪組織量の増加が少ない理由は、レプチンが脂肪組織の脂質代謝において異化効果を有するためと考えられる（図１０−２のＣ）。   Next, in STZ-induced IDDM, skeletal muscle mass, WAT and BAT tissue weight after injecting antibodies against leptin or IL-6 were examined. In all injections, the amount of soleus, EDL and gastrocnemius increased (C in Fig. 10-2). Furthermore, injection of IL-6 antibody increased the amount of EpiWAT, IngWAT and BAT (C in FIG. 10-2). Leptin injection also restored the amount of adipose tissue slightly (C in FIG. 10-2). The reason why the increase in the amount of adipose tissue after injection of leptin is small compared to the injection of IL-6 antibody is considered to be because leptin has a catabolic effect in lipid metabolism of adipose tissue (C in FIG. 10-2).

まとめると、これらの結果は、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭは、骨格筋においてＡＭＰＫを活性化し、筋萎縮を誘導し、それによってＩＬ−６およびアイリシンの生産を増加することを示唆する（図１１）。ＩＬ−６の血漿レベルの増加は、次いで、脂肪組織において異化プロセスを促進し、レプチン産生を減少させる。アイリシンは、また、ＵＣＰ１の発現を誘導し、ＷＡＴの量を減少させる。血漿レプチン濃度の低下は、骨格筋におけるグルコース及び脂質代謝を損ない、臓器ネットワークにおける悪循環を誘導する。   Taken together, these results suggest that STZ-induced IDDM activates AMPK in skeletal muscle and induces muscle atrophy, thereby increasing IL-6 and irisin production (FIG. 11). Increased plasma levels of IL-6 then promote the catabolic process in adipose tissue and reduce leptin production. Ilysin also induces UCP1 expression and reduces the amount of WAT. Decreased plasma leptin levels impair glucose and lipid metabolism in skeletal muscle and induce a vicious cycle in the organ network.

（結果９：ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭマウスに対するＡＭＰＫ阻害剤の投与は、血糖値及び血中遊離脂肪酸濃度を改善する）
ＳＴＺを１日目と３日目に各２００ｍｇ／ｋｇを腹腔内に投与して作成したＳＴＺ誘発ＩＤＤＭマウスに対して、糖尿病が顕在化するＳＴＺ投与後４日目に浸透圧ポンプを皮下に埋め込み、ＡＭＰＫ阻害剤であるコンパウンドＣ（２４０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ）を、０．５μｌ／ｈｒ／週でＳＴＺを投与してから１４日目まで持続的に皮下投与した。対照として、ビヒクルのみを皮下投与した。さらに、コントロールとして、ＳＴＺ未処理でビヒクル及びコンパウンドＣを皮下投与した。結果を図１２及び図１３に示す。 (Result 9: Administration of AMPK inhibitor to STZ-induced IDDM mice improves blood glucose level and blood free fatty acid concentration)
STZ-induced IDDM mice prepared by intraperitoneally administering 200 mg / kg of STZ on day 1 and day 3 were implanted with an osmotic pump subcutaneously on day 4 after STZ administration when diabetes was manifested. Compound C (240 μg / ml, 500 μg / ml), an AMPK inhibitor, was continuously administered subcutaneously until day 14 after STZ was administered at 0.5 μl / hr / week. As a control, vehicle alone was administered subcutaneously. Further, as a control, vehicle and compound C were subcutaneously administered without STZ treatment. The results are shown in FIGS.

図１２に示すように、コンパウンドＣの投与により、血糖値及び血中遊離脂肪酸濃度は有意に減少した。また、図１３に示すように、コンパウンドＣの投与により、ヒラメ筋、長趾伸筋及び腓腹筋の重量が増大し、鼠径部及び精巣上体並びにＢＡＴの脂肪組織重量も増大した。この結果から、ＡＭＰＫ阻害剤の投与によっても、ＤＮ−ＡＭＰＫを骨格筋に発現させた時と同様の改善効果が得られることがわかった。   As shown in FIG. 12, administration of Compound C significantly decreased blood glucose levels and blood free fatty acid concentrations. Further, as shown in FIG. 13, administration of compound C increased the weights of the soleus, longus extensor and gastrocnemius muscles, and also increased the groin and epididymis and the fat tissue weight of BAT. From these results, it was found that the same improvement effect as that obtained when DN-AMPK was expressed in skeletal muscle can be obtained by administration of an AMPK inhibitor.

以下に、本明細書で参照しうる参考文献を示す。これらの番号は、適宜明細書において参照される。これらの文献の全内容は、引用により本願に取り込まれるものとする。
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配列番号１〜１８：プライマー Sequence number 1-18: Primer

Claims (9)

以下の式（１）で表される化合物を有効成分として含有する、１型糖尿病の治療剤。
A therapeutic agent for type 1 diabetes comprising a compound represented by the following formula (1) as an active ingredient.
糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される代謝異常を改善する、請求項１に記載の治療剤。   The therapeutic agent according to claim 1, which improves a metabolic disorder selected from the group consisting of sugar, fatty acid, insulin, neutral fat and ketone body. 脂肪酸、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される代謝異常を改善する、請求項２に記載の治療剤。   The therapeutic agent according to claim 2, which improves a metabolic disorder selected from the group consisting of fatty acids, neutral fats, and ketone bodies. 以下の式（１）で表される化合物と、
グルカゴン阻害剤及び／又はグルカゴン受容体阻害剤と、
を有効成分として含有する、１型糖尿病の治療用組成物。 A compound represented by the following formula (1):
A glucagon inhibitor and / or a glucagon receptor inhibitor;
A composition for the treatment of type 1 diabetes. 以下の式（１）で表される化合物と、
インスリンと、
を有効成分として含有する、１型糖尿病の治療用組成物。 A compound represented by the following formula (1):
Insulin,
A composition for the treatment of type 1 diabetes. 以下の式（１）で表される化合物と、
ＩＬ―６中和抗体と、
を有効成分として含有する、１型糖尿病の治療用組成物。 A compound represented by the following formula (1):
An IL-6 neutralizing antibody;
A composition for the treatment of type 1 diabetes. Ｉ型糖尿病の治療のためのＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤のスクリーニング方法であって、
被験化合物のＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼによるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼのリン酸化を阻害する阻害活性を測定する工程、
を備え、
前記阻害活性が肯定される被験化合物を前記阻害剤としてスクリーニングする、方法。 A screening method for AMP-activated protein kinase inhibitors for the treatment of type I diabetes comprising:
Measuring the inhibitory activity of inhibiting the phosphorylation of acetyl-CoA carboxylase by AMP-activated protein kinase of a test compound ;
With
A method of screening a test compound having a positive inhibitory activity as the inhibitor . 前記被験化合物の前記阻害活性が、以下の式（１）で表される化合物；
が有する被験化合物のＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼによるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼのリン酸化を阻害する阻害活性と同等以上であるとき、前記被験化合物の前記阻害活性を肯定する、請求項７に記載の方法。 A compound in which the inhibitory activity of the test compound is represented by the following formula (1);
The method according to claim 7, wherein the inhibitory activity of the test compound is affirmed when the test compound has an inhibitory activity that inhibits phosphorylation of acetyl-CoA carboxylase by AMP-activated protein kinase of the test compound . さらに、前記阻害活性が肯定された前記被験化合物をＩ型モデル動物に投与して、当該モデル動物における血糖値、血中遊離脂肪酸、筋重量及び脂肪組織重量からなる群から選択される１種又は２種以上を評価する工程と、
を備える、請求項７又は８に記載の方法。 Further, the test compound having an affirmative inhibitory activity is administered to a type I model animal, and one or more selected from the group consisting of blood glucose level, blood free fatty acid, muscle weight and adipose tissue weight in the model animal A process of evaluating two or more,
A method according to claim 7 or 8, comprising:
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