JP5804424B2 - クルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の製造方法 - Google Patents
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Description
(i)高発現プロモーター配列と、マーカー遺伝子をコードする配列のうち機能的なマーカー遺伝子発現に必須の3’末端領域を欠失した配列とを含む直鎖状の2本鎖DNA断片、及び、上記機能的なマーカー遺伝子発現に必須の3’末端領域をコードする配列と、その下流に所望の有用物質をコードするDNA配列等の任意の塩基配列とを含む直鎖状の2本鎖DNA断片;
(ii)高発現プロモーター配列と、マーカー遺伝子をコードする配列のうち転写開始点を含む5’末端領域をコードする配列とを含む直鎖状の2本鎖DNA断片、及び、上記マーカー遺伝子をコードする配列のうち、上記マーカー遺伝子の5’末端領域を含まず、上記マーカー遺伝子の5’末端領域の下流の3’末端までをコードする配列と、その下流に所望の有用物質をコードするDNA配列等の任意の塩基配列とを含む直鎖状の2本鎖DNA断片;
1.DNA断片の調製
サッカロマイセス・セレビシエ BY4704由来のDNAを鋳型として、KOD−plusポリメラーゼ(TOYOBO社製)を用いたPCR反応を行い、URA3遺伝子の全部又は一部を含むDNA断片(URA3−290−280c、URA3−290+771c、URA3+772−280c)を作製した。PCR反応に用いたプライマーの配列は以下に示す通りである。URA3の全部を含むDNA断片URA3−290−280cの作製にはフォワードプライマーとしてURA3−290、リバースプライマーとしてURA3−280cを、URA3の一部(N末端側)を含むDNA断片URA3−290+771cの作製にはフォワードプライマーとしてURA3−290、リバースプライマーとしてURA3+771cを、URA3の一部(C末端側)を含むDNA断片URA3+772−280cの作製にはフォワードプライマーとしてURA3+772、リバースプライマーとしてURA3−280cをそれぞれ用いた。
(フォワードプライマー)
URA3−290(5'-GAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTC-3';配列番号6)
URA3+772(5'-GCATATTTGAGAAGATGCGGCCAGC-3';配列番号7)
(リバースプライマー)
URA3+771c(5'-TTCCCAGCCTGCTTTTCTGTAACGT-3';配列番号8)
URA3−280c(5'-CAGTCTGTGAAACATCTTTCTACCA-3';配列番号9)
(反応液)
テンプレート 0.4μL
10xBuffer 1.0μL
2mM dNTPs 1.0μL
25mM MgSO4 0.4μL
フォワードプライマー 0.2μL
リバースプライマー 0.2μL
KOD−plusポリメラーゼ 0.2μL
滅菌水 6.6μL
ウラシル要求性遺伝子変異のクルイベロマイセス・マルシアヌス RAK3605株を、10mlのYPD培地(1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース)に接種して28℃で20時間培養した。培養液を回収して2本の15mLチューブに移し、8000rpmで3分間の遠心分離を行った。上清を捨てて、沈殿した細胞に300μL/チューブの形質転換用溶液[2000μlの60%PEG3350、150μLの4Mリチウムアセテート、300μLの1M DTT、550μLの滅菌水]を加えて、ボルテックスミキサーにより攪拌した。再び、8000rpmで3分間の遠心分離を行って上清を捨て、沈殿した細胞に600μL/チューブの形質転換用溶液を加えた後に、100μL/チューブとなるように1.5mLチューブに分注した。ここに、実施例1で作製したDNA断片(断片ごとに3μLずつ)を単独又は組み合わせて加え、47℃で15分間熱処理した。150μLの滅菌水を加え、細胞をウラシル欠損培地にスプレッドして28℃で3日培養し、生育したコロニー数をカウントした。
1.DNA断片の調製
サッカロマイセス・セレビシエ BY4704由来のDNAを鋳型として、KOD−plusポリメラーゼ(TOYOBO社製)を用いたPCR反応を行い、URA3遺伝子の全部又は一部を含むDNA断片(URA3−290−280c、URA3−290+771c、URA3+772−280c)を作製した。PCR反応に用いたプライマーの配列は以下に示す通りである。URA3の全部を含むDNA断片URA3−290−280cの作製にはフォワードプライマーとしてURA3−290、リバースプライマーとしてURA3−280cを用い、URA3の一部(N末端側)を含むDNA断片URA3−290+771cの作製にはフォワードプライマーとしてURA3−290、リバースプライマーとしてURA3+771cを用い、URA3の一部(C末端側)を含むDNA断片URA3+772−280cの作製にはフォワードプライマーとしてURA3+772、リバースプライマーとしてURA3−280cをそれぞれ用いた。
(フォワードプライマー)
URA3−290(5'-GAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTC-3';配列番号6)
URA3+772(5'-GCATATTTGAGAAGATGCGGCCAGC-3';配列番号7)
(リバースプライマー)
URA3+771c(5'-TTCCCAGCCTGCTTTTCTGTAACGT-3';配列番号8)
URA3−280c(5'-CAGTCTGTGAAACATCTTTCTACCA-3';配列番号9)
(フォワードプライマー)
URA3+772TAA−TDH−527(5'-GCATATTTGAGAAGATGCGGCCAGCAAAACTAAgctgtaacccgtacatgcccaa-3';配列番号10)
URA3+772TAA+17−TDH−527(5'-GCATATTTGAGAAGATGCGGCCAGCAAAACTAAaaaactgtattataagtGCTGTAACCCGTACATGCCCAA-3';配列番号11)
(リバースプライマー)
yCLuc+1662c(5'-CTACTTGCACTCATCTGGGACC-3';配列番号12)
(反応液)
テンプレート 0.4μL
10xBuffer 1.0μL
2mM dNTPs 1.0μL
25mM MgSO4 0.4μL
フォワードプライマー 0.2μL
リバースプライマー 0.2μL
KOD−plusポリメラーゼ 0.2μL
滅菌水 6.6μL
ウラシル要求性遺伝子変異のクルイベロマイセス・マルシアヌス RAK3605株を、2mlのYPD培地(1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース)に接種して一晩時間培養した。1.5mLの培養液を回収して別のチューブに移し、12000rpmで1分間の遠心分離を行った。上清を捨てた後、沈殿した細胞に200μL/チューブの形質転換用溶液[2000μlの60%PEG3350、150μLの4Mリチウムアセテート、300μLの1M DTT、550μLの滅菌水]を加えて、ボルテックスミキサーにより攪拌した。再び、12000rpmで1分間の遠心分離を行って上清を捨て、沈殿した細胞に50μLの形質転換用溶液と、実施例3で作製したDNA断片(DNA断片ごとに3μLずつ)を組み合わせて加えてボルテックスミキサーにより攪拌し、47℃で15分間熱処理した。その後、150μLの滅菌水を加え、細胞をウラシル欠損培地にスプレッドして28℃で3日培養し、生育したコロニー数をカウントした。
1.DNA断片の調製
サッカロマイセス・セレビシエ BY4704由来のDNAを鋳型として、KOD−plusポリメラーゼ(TOYOBO社製)を用いたPCR反応を行い、URA3遺伝子の全部又は一部を含むDNA断片(URA3−290−280c、URA3−290+771c、URA3+772−280c、URA3+773−280c、URA3+774−280c、URA3+770−280c、URA3+771−280c)を作製した。PCR反応に用いたプライマー配列は以下に示す通りである。DNA断片URA3−290−280cの作製にはフォワードプライマーとしてURA3−290、リバースプライマーとしてURA3−280cを、DNA断片URA3−290+771cの作製にはフォワードプライマーとしてURA3−290、リバースプライマーとしてURA3+771cを、DNA断片URA3+772−280cの作製にはフォワードプライマーとしてURA3+772、リバースプライマーとしてURA3−280cを、DNA断片URA3+773−280cの作製にはフォワードプライマーとしてURA3+773、リバースプライマーとしてURA3−280cを、DNA断片URA3+774−280cの作製にはフォワードプライマーとしてURA3+774、リバースプライマーとしてURA3−280cを、DNA断片URA3+770−280cの作製にはフォワードプライマーとしてURA3+770、リバースプライマーとしてURA3−280cを、DNA断片URA3+771−280cの作製にはフォワードプライマーとしてURA3+771、リバースプライマーとしてURA3−280cをそれぞれ用いた。
(フォワードプライマー)
URA3−290(5'-GAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTC-3';配列番号6)
URA3+772(5'-GCATATTTGAGAAGATGCGGCCAGC-3';配列番号7)
URA3+773(5'-CATATTtGAGAAGATGCGGCCA-3';配列番号13)
URA3+774(5'-ATATTtGAGAAGATGCGGCCAG-3';配列番号14)
URA3+770(5'-AaGCATATTtGAGAAGATGCGG-3';配列番号15)
URA3+771(5'-aGCATATTtGAGAAGATGCGGC-3';配列番号16)
(リバースプライマー)
URA3+771c(5'-TTCCCAGCCTGCTTTTCTGTAACGT-3';配列番号8)
URA3−280c(5'-CAGTCTGTGAAACATCTTTCTACCA-3';配列番号9)
(反応液)
テンプレート 0.4μL
10xBuffer 1.0μL
2mM dNTPs 1.0μL
25mM MgSO4 0.4μL
フォワードプライマー 0.2μL
リバースプライマー 0.2μL
KOD−plusポリメラーゼ 0.2μL
滅菌水 6.6μL
ウラシル要求性遺伝子変異のクルイベロマイセス・マルシアヌス RAK3605株を、2mlのYPD培地(1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース)に接種して一晩時間培養した。1.5mLの培養液を回収して別のチューブに移し、12000rpmで1分間の遠心分離を行った。上清を捨てた後、沈殿した細胞に200μL/チューブの形質転換用溶液[2000μlの60%PEG3350、150μLの4Mリチウムアセテート、300μLの1M DTT、550μLの滅菌水]を加えて、ボルテックスミキサーにより攪拌した。再び、12000rpmで1分間の遠心分離を行って上清を捨て、沈殿した細胞に50μLの形質転換用溶液と、実施例5で作製したDNA断片(DNA断片ごとに3μLずつ)を組み合わせて加えてボルテックスミキサーにより攪拌し、47℃で15分間熱処理した。その後、150μLの滅菌水を加え、細胞をウラシル欠損培地にスプレッドして28℃で3日培養し、生育したコロニー数をカウントした。
以上の結果から、URA3遺伝子のN末端側をコードするDNA断片と、URA3遺伝子のC末端側をコードする配列を5’側に配置したDNA断片を作製し、クルイベロマイセス・マルシアヌス RAK3605株に導入することにより、目的のDNA配列を含む形質転換体を得ることができることが明らかとなった。
クルイベロマイセス・マルシアヌスにおける自律複製配列(ARS)を特定する目的で以下の実験を行った。クルイベロマイセス・マルシアヌス由来のゲノムDNAを制限酵素XhoI及びEcoRIで消化し、出芽酵母用単コピーベクターpRS316(Sikorski and Hieter, 1989; Genetics 122, 19-27)に挿入した(図6)。このベクターを大腸菌に導入して6868個のコロニーを得た。これらのコロニーからプラスミドを抽出/精製して、クルイベロマイセス・マルシアヌスのゲノムDNAライブラリを作製し、クルイベロマイセス・マルシアヌスに導入した(図7)。5−FOA培地を用いてURA3の脱落した株を選抜することにより、形質転換したプラスミド配列がゲノムに挿入されていないコロニーのみを選択した(図8)。
以上のことから、図13に示すように、今回同定された50〜60bpのKmのARSを、任意のDNA断片に付加して、クルイベロマイセス・マルシアヌスに導入することにより、形質転換細胞内で環状DNAを構築できることが明らかとなった。
Claims (7)
- 2種以上の直鎖状の2本鎖DNA断片からなるDNA連結体を含む形質転換酵母の製造方法であって、前記2種以上の直鎖状の2本鎖DNA断片が、それぞれ単独ではマーカー遺伝子の発現に必要な配列の全部を含んでおらず、複数の2本鎖DNA断片が非相同末端結合で連結して所望のDNA連結体を形成した場合にのみマーカー遺伝子の発現が可能となるような配列を含む、以下の工程(a)及び(b)を順次備えることを特徴とする方法。
(a)前記2種以上の直鎖状の2本鎖DNA断片をクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入する工程;
(b)上記工程(a)により得られる、上記所望のDNA連結体を含む形質転換体を、マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程; - 2種以上の直鎖状の2本鎖DNA断片が、自律複製配列を含まないDNA断片であって、所望のDNA連結体が、ゲノムDNA中に挿入されることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 2種以上の直鎖状の2本鎖DNA断片のうち1種が、自律複製配列の全部を含み、所望のDNA連結体が、環状であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 2種以上の直鎖状の2本鎖DNA断片が、自律複製配列の一部を含み、それぞれ単独では自律複製配列の全部を含んでおらず、複数の2本鎖DNA断片が非相同末端結合で連結した場合にのみ、自律複製配列の全部の発現が可能となるような配列を含むDNA断片であって、所望のDNA連結体が環状であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 自律複製配列が、配列番号1〜5のいずれかに示される塩基配列を含むことを特徴とする請求項3又は4に記載の製造方法。
- DNA連結体が、さらに、所望の有用物質をコードする遺伝子を含むことを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の製造方法。
- クルイベロマイセス・マルシアヌス菌が、クルイベロマイセス・マルシアヌス RAK3605であり、マーカー遺伝子がURA3遺伝子であることを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の製造方法。
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JPN6011019376; Yeast Vol. 10, 1994, P. 1621-1629 * |
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JP2018093806A (ja) | 酵母でタンパク質を過剰発現させる方法 |
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