JP5801055B2 - 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 - Google Patents

Description

本発明は、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物等に関する。

標的遺伝子の発現を抑制する方法として、例えばRNA干渉(RNA interference、以下、RNAiとよぶ)を利用した方法等が知られており、具体的には、線虫において標的とする遺伝子と同一の配列を有する二本鎖RNAを導入することにより、該標的遺伝子の発現が特異的に抑制される現象が報告されている［“ネイチャー(Nature)”,1998年,第391巻,第6669号,p.806-811参照］。また、ショウジョウバエにおいて長い二本鎖RNAの代わりに、21〜23塩基の長さの二本鎖RNAを導入することによっても、標的遺伝子の発現が抑制されることが見出され、これはshort interfering RNA(siRNA)と名づけられている(国際公開第01/75164号パンフレット参照)。

哺乳類細胞では、長い二本鎖RNAを導入した場合、ウイルス防御機構によりアポトーシスが起こり、特定の遺伝子の発現を抑制することができなかったが、20〜29塩基のsiRNAであれば、このような反応が起こらず、特定の遺伝子の発現を抑制できることが見出された。中でも21〜25塩基のものの発現抑制効果が高い［“ネイチャー(Nature)”,2001年,第411巻,第6836号,p.494-498、“ネイチャー・レビューズ・ジェネティクス(Nature Reviews Genetics)”,2002年,第3巻,第10号,p.737-747、“モレキュラー・セル(Molecular Cell)”,(米国),2002年,第10巻,第3号,p.549-561、“ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)”,(米国),2002年,第20巻,第5号,p.497-500]。また、二本鎖RNAでなく、分子内ハイブリダイズにより、ヘアピン構造を有する一本鎖RNAも、siRNAと同様にRNAiを示すことが報告されている［“プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America)”, 2002年,第99巻,第9号,p.6047-6052参照］。

RNAiについては、in vivo試験においても多く検証されており、50塩基対以下のsiRNAを用いた胎児の動物での効果(特許文献1参照)および成体マウスでの効果(特許文献2参照)が報告されている。また、siRNAをマウス胎児に静脈内投与した場合に、腎臓、脾臓、肺、膵臓および肝臓の各臓器で特定の遺伝子の発現抑制効果が確認されている(非特許文献1参照)。さらに、脳細胞においてもsiRNAを直接投与することで特定の遺伝子が発現抑制されることが報告されている(非特許文献2参照)。

一方、核酸の細胞内への送達手段として、カチオニックリポソームやカチオニックポリマーを用いる方法が知られている。しかし、該方法では、核酸を含有するカチオニックリポソームやカチオニックポリマーを静脈内に投与後、血中から速やかに核酸が除去されてしまい、標的組織が肝臓や肺以外の場合、例えば腫瘍部位等の場合には核酸を標的組織に送達することができず、十分な作用の発現を可能とするに至っていない。そこで、核酸が血中で速やかに除去されるという問題点を解決した核酸封入リポソーム(リポソーム内に核酸を封入したリポソーム)が報告されている(特許文献3〜6および非特許文献3参照)。特許文献3では、核酸等を封入するリポソームの製造方法として、例えば、カチオン性脂質をクロロホルムに予め溶解し、次いでオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)の水溶液とメタノールを加えて混合後、遠心分離することでクロロホルム層にカチオン性脂質/ODNの複合体を移行させ、さらにクロロホルム層を取り出し、これにポリエチレングリコール化リン脂質と中性の脂質と水を加えて油中水型(W/O)エマルジョンを形成し、逆相蒸発法で処理してODN内包リポソームを製造する方法が報告され、特許文献4および非特許文献3では、ODNを、pH3.8のクエン酸水溶液に溶解し、脂質(エタノール中)を加え、エタノール濃度を20v/v%まで下げてODN内包リポソームを調製し、サイジングろ過し、透析によって、過剰のエタノールを除去した後、試料をさらにpH7.5にて透析してリポソーム表面に付着したODNを除去してODN内包リポソームを製造する方法が報告され、それぞれ核酸等の有効成分を封入したリポソームが製造されている。

これらに対して特許文献5および6では、液体中で微粒子を脂質二重膜で被覆する方法で核酸等の有効成分を封入したリポソームを製造することが報告されている。該方法においては、微粒子が分散し、かつ脂質が溶解した極性有機溶媒含有水溶液中の極性有機溶媒の濃度を減少させることによって、液体中において、微粒子が脂質二重膜で被覆される。この方法では、例えば静脈注射用微粒子等に好適な大きさの脂質二重膜で被覆された微粒子(被覆微粒子)が、すぐれた効率で製造されており、また、特許文献5および6では被覆される微粒子の例として例えばODNまたはsiRNAとカチオン性脂質からなる静電的相互作用により形成される複合体が例示されている。該微粒子を被覆した被覆微粒子の粒子径は小さく、注射剤として使用可能であること、該被覆微粒子は、静脈内に投与した場合、高い血中滞留性を示し、腫瘍組織に多く集積したことが報告されている。

米国公開第2002-132788号 国際公開第03/10180号パンフレット 特表2002-508765号公報 特表2002-501511号公報 国際公開第02/28367号パンフレット 国際公開第2006/080118号パンフレット

ネイチャー・ジェネティクス(Nature Genetics),2002年,第32巻,第1号,p.107-108 ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology),2002年,第20巻,第10号,p.1006-1010 バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ(Biochimica et Biophysica Acta),2001年,第1510巻,p.152-166

本発明の目的は、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物等を提供することにある。

本発明は以下の(1)〜(54)に関する。
(1) 標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列(以下、配列Xとする)および該配列Xと相補的な塩基の配列(以下、相補配列X’とする)を含むRNAを封入したリポソームを含有し、配列Xおよび相補配列X’の塩基に結合する糖のあわせて1〜90%が、2’位において修飾基で置換されたリボースであり、該リポソームが標的遺伝子の発現部位を含む組織または臓器に到達するリポソームである、組成物。
(2) リポソームが、静脈内投与可能な大きさのリポソームである、前記(1)記載の組成物。
(3) RNAが、RNA干渉(RNAi)を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するRNAである、前記(1)または(2)記載の組成物。
(4) 標的遺伝子が、腫瘍または炎症に関連する遺伝子である、前記(1)〜(3)のいずれかに記載の組成物。
(5) 標的遺伝子が、血管新生に関連する遺伝子である、前記(1)〜(4)のいずれかに記載の組成物。
(6) 標的遺伝子が、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子受容体、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、クルッペル様因子、Ets転写因子、核因子および低酸素誘導因子のいずれかの遺伝子である、前記(1)〜(4)のいずれかに記載の組成物。
(7) mRNAがヒトまたはマウスのmRNAである、前記(1)〜(6)のいずれかに記載の組成物。
(8) RNAを封入したリポソームが、リード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜を含むリポソームであり、
該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能である、(1)〜(7)のいずれかに記載の組成物。
(9) 極性有機溶媒がアルコールである、(8)記載の組成物。
(10) 極性有機溶媒がエタノールである、(8)記載の組成物。
(11) リード粒子が、カチオン性物質を含むリード粒子であり、脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、(8)〜(10)のいずれかに記載の組成物。
(12) RNAを封入したリポソームが、カチオン性物質を含むリード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜を含むリポソームであり、
該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、(1)〜(7)のいずれかに記載の組成物。
(13) カチオン性物質がN-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N-ジメチルアミン、N-［1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジテトラデシルオキシプロピル)］-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび3β-［N-(N',N'-ジメチルアミノエチル)カルバモイル］コレステロールから選ばれる一つ以上である、(11)または(12)記載の組成物。
(14) 水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミンである、(11)〜(13)のいずれかに記載の組成物。
(15) 中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、(11)〜(14)のいずれかに記載の組成物。
(16) リード粒子と、腫瘍または炎症に関連する標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列(以下、配列X₁とする)および該配列と相補的な塩基の配列(以下、相補配列X₁’とする)を含むRNAであり、配列X₁および相補配列X₁’の塩基に結合する糖のあわせて1〜90%が、2’位において修飾基で置換されたリボースであるRNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜を含むリポソームを含有し、
該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能である、癌または炎症疾患の治療剤。
(17) 極性有機溶媒がアルコールである、(16)記載の癌または炎症疾患の治療剤。
(18) 極性有機溶媒がエタノールである、(16)記載の癌または炎症疾患の治療剤。
(19) リード粒子が、カチオン性物質を含むリード粒子であり、脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、(16)〜(18)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の治療剤。
(20) カチオン性物質を含むリード粒子と、腫瘍または炎症に関連する標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列(配列X₁)および該配列と相補的な塩基の配列(相補配列X₁’)を含むRNAであり、配列X₁および相補配列X₁’の塩基に結合する糖のあわせて1〜90%が、2’位において修飾基で置換されたリボースであるRNAとを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質二重膜を含し、
該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、癌または炎症疾患の治療剤。
(21) カチオン性物質がN-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N-ジメチルアミン、N-［1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジテトラデシルオキシプロピル)］-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび3β-［N-(N',N'ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロールから選ばれる一つ以上である、(19)または(20)記載の癌または炎症疾患の治療剤。
(22) 水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミンである、(19)〜(21)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の治療剤。
(23) 中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、(19)〜(22)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の治療剤。
(24) RNAが、RNA干渉(RNAi)を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するRNAである、(16)〜(23)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の治療剤。
(25) 腫瘍または炎症に関連する標的遺伝子が、血管新生に関与する遺伝子である、(16)〜(23)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の治療剤。
(26) 腫瘍または炎症に関連する標的遺伝子が、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子受容体、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、クルッペル様因子、Ets転写因子、核因子および低酸素誘導因子のいずれかの遺伝子である、(16)〜(23)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の治療剤。
(27) mRNAがヒトまたはマウスのmRNAである、(16)〜(26)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の治療剤。
(28) リード粒子と、腫瘍または炎症に関連する標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列(配列X₁)および該配列と相補的な塩基の配列(相補配列X₁’)を含むRNAであり、配列X₁および相補配列X₁’の塩基に結合する糖のあわせて1〜90%が、2’位において修飾基で置換されたリボースであるRNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜を含むリポソームを含有し、
該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能である、組成物を哺乳動物に投与する癌または炎症疾患の治療方法。
(29) 極性有機溶媒がアルコールである、(28)記載の癌または炎症疾患の治療方法。
(30) 極性有機溶媒がエタノールである、(28)記載の癌または炎症疾患の治療方法。
(31) リード粒子が、カチオン性物質を含むリード粒子であり、脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、(28)〜(30)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の治療方法。
(32) カチオン性物質を含むリード粒子と、腫瘍または炎症に関連する標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列(配列X₁)および該配列と相補的な塩基の配列(相補配列X₁’)を含むRNAであり、配列X₁および相補配列X₁’の塩基に結合する糖のあわせて1〜90%が、2’位において修飾基で置換されたリボースであるRNAとを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質二重膜を含し、
該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、組成物を哺乳動物に投与する癌または炎症疾患の治療方法。
(33) カチオン性物質がN-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N-ジメチルアミン、N-［1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジテトラデシルオキシプロピル)］-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび3β-［N-(N',N'ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロールから選ばれる一つ以上である、(31)または(32)記載の癌または炎症疾患の治療方法。
(34) 水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミンである、(31)〜(33)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の治療方法。
(35) 中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、(31)〜(34)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の治療方法。
(36) RNAが、RNA干渉(RNAi)を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するRNAである、(28)〜(35)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の治療方法。
(37) 腫瘍または炎症に関連する標的遺伝子が、血管新生に関与する遺伝子である、(28)〜(35)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の治療方法。
(38) 腫瘍または炎症に関連する標的遺伝子が、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子受容体、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、クルッペル様因子、Ets転写因子、核因子および低酸素誘導因子のいずれかの遺伝子である、(28)〜(35)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の治療方法。
(39) mRNAがヒトまたはマウスのmRNAである、(28)〜(38)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の治療方法。
(40) リード粒子と、腫瘍または炎症に関連する標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列(配列X₁)および該配列と相補的な塩基の配列(相補配列X₁’)を含むRNAであり、配列X₁および相補配列X₁’の塩基に結合する糖のあわせて1〜90%が、2’位において修飾基で置換されたリボースであるRNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜を含むリポソームを含有し、
該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能である、組成物の癌または炎症疾患の治療剤の製造のための使用。
(41) 極性有機溶媒がアルコールである、(40)記載の使用。
(42) 極性有機溶媒がエタノールである、(40)記載の使用。
(43) リード粒子が、カチオン性物質を含むリード粒子であり、脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、(40)〜(42)のいずれかに記載の使用。
(44) カチオン性物質を含むリード粒子と、腫瘍または炎症に関連する標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列(配列X₁)および該配列と相補的な塩基の配列(相補配列X₁’)を含むRNAであり、配列X₁および相補配列X₁’の塩基に結合する糖のあわせて1〜90%が、2’位において修飾基で置換されたリボースであるRNAとを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質二重膜を含し、
該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、組成物の癌または炎症疾患の治療剤の製造のための使用。
(45) カチオン性物質がN-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N-ジメチルアミン、N-［1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジテトラデシルオキシプロピル)］-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび3β-［N-(N',N'ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロールから選ばれる一つ以上である、(43)または(44)記載の癌または炎症疾患の使用。
(46) 水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミンである、(43)〜(45)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の使用。
(47) 中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、(43)〜(46)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の使用。
(48) RNAが、RNA干渉(RNAi)を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するRNAである、(40)〜(47)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の使用。
(49) 腫瘍または炎症に関連する標的遺伝子が、血管新生に関与する遺伝子である、(40)〜(47)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の使用。
(50) 腫瘍または炎症に関連する標的遺伝子が、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子受容体、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、クルッペル様因子、Ets転写因子、核因子および低酸素誘導因子のいずれかの遺伝子である、(40)〜(47)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の使用。
(51) mRNAがヒトまたはマウスのmRNAである、(40)〜(50)のいずれかに記載の癌または炎症疾患の使用。
(52) siRNAを含む被検液中に、核酸と複合体を形成する試薬を加えて、該siRNAと電気的に中性な複合体を形成させ、この複合体を分離後、再溶解液で溶解し、得られた溶液を高速液体クロマトグラフィ法にて分析することで、該siRNAの濃度を測定することを特徴とする血液中のsiRNAの濃度の測定方法。
(53) 被検液中に、被測定のsiRNAと塩基数の異なる核酸をISとして共存させることを特徴とする、(52)記載の血液中のsiRNAの濃度の測定方法。
(54) 高速液体クロマトグラフィ法による分析における検出装置が、質量分析装置であることを特徴とする、(52)または(53)記載の血液中のsiRNAの濃度の測定方法。

本発明の標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な塩基の配列を含むRNAを封入したリポソームを含有する組成物を、ほ乳類等に投与することにより、該標的遺伝子の発現を抑制することができる。

実施例１で得られた製剤を投与した時の血液中のRNAの濃度を示すものである。横軸は製剤投与後の時間(時間)を、縦軸は血液中のRNAの濃度(μmol/L)を表す。 比較例１で得られた製剤を投与した時の血液中のRNAの濃度を示すものである。横軸は製剤投与後の時間(時間)を、縦軸は血液中のRNAの濃度(μmol/L)を表す。 実施例2で得られた製剤を投与した時の血液中のRNAの濃度を示すものである。横軸は製剤投与後の時間(時間)を、縦軸は血液中のRNAの濃度(μmol/L)を表す。 実施例3で得られた製剤を投与した時の血液中のRNAの濃度を示すものである。横軸は製剤投与後の時間(時間)を、縦軸は血液中のRNAの濃度(μmol/L)を表す。 比較例2で得られた製剤を投与した時の血液中のRNAの濃度を示すものである。横軸は製剤投与後の時間(時間)を、縦軸は血液中のRNAの濃度(μmol/L)を表す。 実施例4で得られた製剤を投与した時の血液中のRNAの濃度を示すものである。縦軸は血液中のRNAの濃度(μmol/L)を表す。 比較例3で得られた製剤を投与した時の血液中のRNAの濃度を示すものである。縦軸は血液中のRNAの濃度(μmol/L)を表す。

本発明における標的遺伝子としては、ほ乳類においてmRNAを産生して発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、腫瘍または炎症に関連する遺伝子が好ましく、血管新生に関与する遺伝子等がより好ましく、例えば血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor、以下VEGFと略す)、血管内皮増殖因子受容体(vascular endothelial growth factor receptor、以下VEGFRと略す)、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、クルッペル様因子(Kruppel-like factor、以下KLFと略す)、Ets転写因子、核因子、低酸素誘導因子等のタンパク質をコードする遺伝子等があげられ、具体的にはVEGF遺伝子、VEGFR遺伝子、線維芽細胞増殖因子遺伝子、線維芽細胞増殖因子受容体遺伝子、血小板由来増殖因子遺伝子、血小板由来増殖因子受容体遺伝子、肝細胞増殖因子遺伝子、肝細胞増殖因子受容体遺伝子、KLF遺伝子、Ets転写因子遺伝子、核因子遺伝子、低酸素誘導因子遺伝子等が挙げられ、好ましくはVEGF遺伝子、VEGFR遺伝子、KLF遺伝子等が挙げられ、より好ましくはKLF遺伝子が挙げられ、さらにより好ましくはKLF5遺伝子が挙げられる。
KLFファミリーは、C末端のジンク・フィンガー(zinc finger)モチーフを特徴とする、転写因子のファミリーであり、KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16等が知られている。哺乳類において、KLFファミリーは、様々な組織や細胞、例えば赤血球、血管内皮細胞、平滑筋、皮膚、リンパ球等の分化に重要であること、また癌、心血管疾患、肝硬変、腎疾患、免疫疾患等の各種疾患の病態形成に重要な役割を果たしていることが報告されている[ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(The Journal of Biological Chemistry),2001年,第276巻,第37号,p.34355-34358、ジェノム・バイオロジー(Genome Biology),2003年,第4巻,第2号,p.206]。

KLFファミリーのうちのKLF5は、BTEB2(basic transcriptional element binding protein 2)あるいはIKLF(intestinal-enriched Kruppel-like factor)ともよばれる。血管平滑筋におけるKLF5の発現は、発生段階で制御を受けており、胎児の血管平滑筋では、高い発現を示すのに対し、正常な成人の血管平滑筋では発現が見られなくなる。また、バルーンカテーテルによる削剥後に新生した血管内膜の平滑筋では、KLF5の高い発現がみられ、動脈硬化や再狭窄の病変部の平滑筋でもKLF5の発現がみられる[サーキュレーション(Circulation),2000年,第102巻,第20号,p.2528-2534]。

VEGFは、1983年に、Ferraraらにより発見された血管内皮細胞に特異的な増殖因子である。同年に、Senger、Dvorakらにより血管透過性作用を有する因子が発見されVPF(vascular permeability factor)と名付けられた。タンパク質のアミノ酸配列解析の結果、2つは同一のものであることがわかった。VEGFは血管の内側にある内皮細胞の受容体に結合して増殖を促す。VEGFは胎児期に血管をつくるだけではなく、病的な血管をつくるときにも作用している。例えば癌がある程度大きくなって酸素不足になると、VEGFとその受容体が増加して血管新生が起こる。また血管透過性亢進作用により癌性腹水の原因になるとも考えられている。糖尿病が進行すると網膜に新生血管ができるが、これにもVEGFが働いている。つまり、新しい血管をつくるタンパクである。低酸素状態によりその発現が誘導されることにより血管新生への重要な役割を担っているといえる。また血管新生のみならず、腫瘍または炎症性病変等にみられる浮腫のメカニズムを説明するうえで本因子の関与が強く示唆されている。

一方、VEGFRは血管内皮細胞や癌細胞自身が持っており、VEGFRが受容体と結合することにより受容体自身がリン酸化(活性化)され、その結果細胞内に増殖や遊走等様々な命令が伝達される。この受容体のリン酸化を阻害することで細胞内の伝達を阻害し、血管新生を阻害することが知られている。

また、標的遺伝子として、例えば、B-CELL CLL/LYMPHOMA(以下bclと略す)遺伝子があげられ、好ましくはbcl2遺伝子があげられる。
Bcl-2は、いくつかの細胞種でアポトーシスによる細胞死の阻害を示す、ミトコンドリア内膜蛋白質である。Bcl-2蛋白質の大量発現によるアポトーシスの抑制は、癌や、血液学的悪性疾患などの原因となると考えられている。実際に、Bcl-2蛋白質はリンパ肉腫、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌および直腸癌などの様々な固形癌に大量に産生されている(T.J.McDonnellら、“Cancer Research”、1992年12月15日、52巻、24号、p.6940-6944)。また、胸腺のアポトーシスにはBcl-2の発現が関係していることが示されている(Kanavaros et al., Histol. Histopathol. 16(4):1005-12 (Oct. 2001))。
Bcl-2蛋白質が大量に産生される細胞においては、そのアポトーシス抑制作用から細胞死が誘導されないため、様々な抗癌剤に対する薬物耐性が引き起こされる。一方前立腺癌細胞においてBcl-2産生を抑制すると、細胞増殖の抑制が見られ、アポトーシスを誘導しやすくなることが知られている(Shi et al., Cancer Biother. Radiopharm., 16(5):421-9 (Oct. 2001))。したがって、固形癌および血液学的悪性疾患など、その治癒においてアポトーシスの促進が必要な疾患においては、Bcl-2蛋白質の発現を抑制する方法は効果的な治療法または予防法となり得る。

本発明で用いられるRNAとしては、前記標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基、好ましくは17〜25塩基、より好ましくは19〜23塩基の配列(以下、配列Xとする)および該配列と相補的な塩基の配列(以下、相補配列X’とする)を含んでいるRNAがあげられ、例えば、本発明で用いられるRNAには、配列Xを含むセンス鎖および相補配列X’を含むアンチセンス鎖からなる二本鎖RNA、該センス鎖と該アンチセンス鎖とが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれたヘアピン構造を有するRNAがあげられる。

配列Xを含むセンス鎖としては、塩基として配列Xのみを含んでいるRNA(以下、配列X鎖とする)、配列X鎖の3’端もしくは5’端または両端に1〜6個、好ましくは2〜4個のヌクレオチドが同一または異なって付加されたRNAがあげられる。
相補配列X’を含むアンチセンス鎖としては、塩基として相補配列X’のみを含んでいるRNA(以下、相補配列X’鎖とする)、相補配列X’鎖の3’端もしくは5’端または両端に1〜6個、好ましくは2〜4個のヌクレオチドが同一または異なって付加された、二本鎖RNA等があげられる。

配列Xを含むセンス鎖と相補配列X’を含むアンチセンス鎖とが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれたヘアピン構造を有するRNAのスペーサーオリゴヌクレオチドとしては、6〜12塩基のヌクレオチドが好ましく、その5’端の配列は2個のUであるのが好ましい。スペーサーオリゴヌクレオチドの例として、UUCAAGAGAの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。スペーサーオリゴヌクレオチドによってつながれる2つのRNAの順番はどちらが5’側になってもよく、配列Xを含むセンス鎖が5’側になることが好ましい。

配列X鎖および相補配列X’鎖に付加されるヌクレオチド、ならびにスペーサーオリゴヌクレオチドの塩基は、グアニン、アデニン、シトシン、チミンおよびウラシルのいずれか1種または複数種でもよく、またそれぞれの塩基に結合する糖が、リボース、デオキシリボースまたは2’位の水酸基が修飾基で置換されたリボースのいずれでもよいが、付加されるヌクレオチドとしては、ウリジル酸(U)およびデオキシチミジル酸(dT)のいずれか1種または2種がより好ましい。また、配列X鎖の3’端に付加されるヌクレオチドの塩基の配列を、標的遺伝子のmRNA内で配列Xと隣接するヌクレオチドの塩基の配列と同じ塩基配列としてもよく、この構造がより好ましい。また、相補配列X’鎖の3’端に付加されるヌクレオチドの塩基の配列を、標的遺伝子のmRNA内で配列Xと隣接するヌクレオチドの塩基の配列と相補的な塩基配列としてもよく、この構造がより好ましい。

本発明で用いられるRNAのより好ましい例としては、例えば、(a)配列Xを含むセンス鎖および相補配列X’を含むアンチセンス鎖からなる二本鎖RNAであり、配列Xが標的遺伝子のmRNAの連続する19〜21塩基の配列であって、センス鎖が配列X鎖および該配列X鎖の3’端に2〜4個の同一または異なって付加されたヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖が相補配列X’鎖および該相補配列X’鎖の3’端に2〜4個の同一または異なって付加されたヌクレオチドからなる、二本鎖RNA、(b)配列Xを含むセンス鎖および相補配列X’を含むアンチセンス鎖からなる二本鎖RNAであり、配列Xが標的遺伝子のmRNAの連続する23〜25塩基の配列であって、センス鎖が配列X鎖であり、アンチセンス鎖が相補配列X’鎖である、二本鎖RNA、(c)配列Xを含むセンス鎖および相補配列X’を含むアンチセンス鎖からなる二本鎖RNAであり、配列Xが標的遺伝子のmRNAの連続する23〜27塩基の配列であって、センス鎖が配列X鎖および該配列X鎖の3’端に2〜4個の同一または異なって付加されたヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖が相補配列X’鎖および該相補配列X’鎖の3’端に2〜4個の同一または異なって付加されたヌクレオチドからなり、相補配列X’鎖の3’端に付加されるヌクレオチドの塩基の配列が、標的遺伝子のmRNA内で配列Xと隣接するヌクレオチドの塩基の配列と相補的な塩基配列である、二本鎖RNA等があげられる。

また、本発明で用いられるRNAとしては、好ましくはRNA干渉(RNAi)を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するRNAがあげられる。
ここではBcl2遺伝子の発現を抑制するRNAを例にとって、RNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現を抑制するRNAについて説明する。他の遺伝子の発現を抑制するRNAの場合も同様の操作で得ることができる。

bcl-2遺伝子の発現を抑制するRNAは、Genbank Accession No.NM_000633として登録されているbcl-2の完全長mRNAに対応するDNA塩基配列(配列番号29)に基づいて設計することができる。該DNA塩基配列の連続する15〜30塩基、好ましくは17〜27塩基、より好ましくは19〜25塩基の部分配列を取り出す。取り出した配列のGC含量を計算し、GC含量が20〜80%、好ましくは30%〜70%、より好ましくは40〜60%の配列を選択し、配列中のTをUに変えた塩基配列を配列Xとする。選択された配列Xを含むセンス鎖および配列Xと相補配列である相補配列X’を含むアンチセンス鎖からなる二本鎖RNA、該センス鎖と該アンチセンス鎖とが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれたヘアピン構造を有するRNAが、bcl-2遺伝子の発現を抑制するRNAである。

さらに、本発明で用いられるRNAは、配列Xおよび相補配列X’の塩基に結合する糖のあわせて1〜90%、好ましくは10〜75%、より好ましくは20〜65%、最も好ましくは30〜55%が、2’位において修飾基で置換されたリボースである。
本発明におけるリボースの2’位において修飾基で置換されたとは、2’位の水酸基が修飾基に置換されているものを意味し、リボースの2’位の水酸基と立体配置が同じであっても異なっていてもよいが、好ましくはリボースの2’位の水酸基と立体配置が同じである。

配列Xおよび相補配列X’の塩基に結合する糖の、2’位において修飾基で置換されたリボース以外の糖は、リボースまたはデオキシリボースであり、好ましく2’位において修飾基で置換されたリボース以外の糖はすべてリボースである。
本発明で用いられるRNAには、リボ核酸の構造中のリン酸部、エステル部等に含まれる酸素原子等が、例えば硫黄原子等の他の原子に置換された誘導体を包含する。
また、本発明で用いられるRNAの5’末端の塩基に結合する糖は、それぞれ5’位の水酸基が、リン酸基もしくは修飾基、または生体内の核酸分解酵素等で、リン酸基もしくは修飾基になる基によって修飾されていてもよい。好ましくはセンス鎖の5’末端の塩基に結合する糖は、5’位の水酸基がリン酸化されている。
また、本発明で用いられるRNAの3’末端の塩基に結合する糖は、それぞれ3’位の水酸基が、リン酸基もしくは修飾基、または生体内の核酸分解酵素等で、リン酸基もしくは修飾基になる基によって修飾されていてもよい。

本発明における修飾基としては、例えば、2’-シアノ、2’-アルキル、2’-置換アルキル、2’-アルケニル、2’-置換アルケニル、2’-ハロゲン、2’-O-シアノ、2’-O-アルキル、2’-O-置換アルキル、2’-O-アルケニル、2’-O-置換アルケニル、2’-S-アルキル、2’-S-置換アルキル、2’-S-アルケニル、2’-S-置換アルケニル、2’-アミノ、2’-NH-アルキル、2’-NH-置換アルキル、2’-NH-アルケニル、2’-NH-置換アルケニル、2’-SO-アルキル、2’-SO-置換アルキル、2’-カルボキシ、2’-CO-アルキル、-CO-置換アルキル、-Se-アルキル、-Se-置換アルキル、-SiH₂-アルキル、-SiH₂-置換アルキル、2’-ONO₂、2’-NO₂、2’-N₃、2’-NH-アルキル、2’-NH-置換アルキル、2’-アミノ酸残基(アミノ酸のカルボン酸から水酸基が除去されたもの)、2’-O-アミノ酸残基(前記アミノ酸残基と同義)があげられ、また、2’位の修飾基が4’位の炭素原子に架橋した構造を有する架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)、より具体的には、2’位の酸素原子と4’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)、およびエチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)［Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)］等も本発明における2’位において修飾基で置換されたリボースに含まれる。
本発明における修飾基として、2’-シアノ、2’-ハロゲン、2’-O-シアノ、2’-アルキル、2’-置換アルキル、2’-O-アルキル、2’-O-置換アルキル、2’-O-アルケニル、2’-O-置換アルケニル、-Se-アルキル、-Se-置換アルキルが好ましく、2’-シアノ、2’-フルオロ、2’-クロロ、2’-ブロモ、2’-トリフルオロメチル、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-O-イソプロピル、2’-O-トリフルオロメチル、2'-O-[2-(methoxy)ethyl]、2'-O-(3-aminopropyl)、2'-O-(2-[N,N-dimethyl]aminooxy)ethyl、2'-O-[3-(N,N-dimethylamino)propyl]、2'-O-[2-[2-(N,N-Dimethylamino)ethoxy]ethyl]および2'-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]、2’-Se-メチル等がより好ましく、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-フルオロ等がさらに好ましく、2’-O-メチル、2’-O-エチルがもっとも好ましい。
また、本発明における修飾基は、その大きさから好ましい範囲を定義することもでき、フルオロの大きさから、-O-ブチルの大きさに相当するものが好ましく、-O-メチルの大きさから-O-エチルの大きさに相当する大きさのものがより好ましい。

修飾基におけるアルキルとしては、例えば直鎖または分岐状の炭素数1〜6の、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、ヘキシル等があげられ、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル等があげられる。修飾基におけるアルケニルとしては、例えば直鎖または分岐状の炭素数1〜6の、例えばビニル、アリル、イソプロペニル等があげられる。
ハロゲンとしては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子があげられる。
アミノ酸としては、例えば脂肪族アミノ酸(具体的には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン等)、ヒドロキシアミノ酸(具体的には、セリン、トレオニン等)、酸性アミノ酸(具体的には、アスパラギン酸、グルタミン酸等)、酸性アミノ酸アミド(具体的には、アスパラギン、グルタミン等)、塩基性アミノ酸(具体的には、リジン、ヒドロキシリジン、アルギニン、オルニチン等)、含硫アミノ酸(具体的には、システイン、シスチン、メチオニン等)、イミノ酸(具体的には、プロリン、4-ヒドロキシプロリン等)等があげられる。
置換アルキルおよび置換アルケニルの置換基としては、例えば、ハロゲン(前記ハロゲンと同義)、ヒドロキシ、スルファニル、アミノ、オキソ、-O-アルキル(前記アルキルと同義)、-S-アルキル(前記アルキルと同義)、-NH-アルキル(前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノオキシ(該2つのアルキルは同一または異なって前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノ(該2つのアルキルは同一または異なって前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノアルキレンオキシ(該2つのアルキルは同一または異なって前記アルキルと同義であり、該アルキレンは前記アルキルから水素が除かれたものを意味する)等があげられ、置換数は好ましくは1〜3である。

なお、本発明で用いられるRNAは、製造方法や原料や中間体にかかわらず、例えば原料や中間体がDNAまたはデオキシリボースであっても、最終的に構造式が同じであれば本発明で用いられるRNAに包含される。すなわち、本発明におけるリボースの2’位においてデオキシされたリボースは、デオキシリボースを包含し、2’位において修飾基で置換されたリボースは、2’位において水素が修飾基に置換されたデオキシリボースを包含する。

本発明で用いられるRNAにおいて、2’位において修飾基で置換されたリボースは、隣接するのが最小限になるように分布することが好ましく、2’位において修飾基で置換されたリボースを1、2および3つおきに組み合わせて、全く隣接させずに分布することがより好ましい。また、特に配列Xの塩基に結合するリボースは、1つおきに、全く隣接させずに、30〜55%が、2’位において修飾基で置換されたリボースであることがより好ましい。
また、配列Xおよび相補配列X’における相補的塩基対は、両方が2’位において修飾基で置換されたリボースであるよりも、片側だけが2’位において修飾基で置換されたリボースであることが好ましく、上記の好ましい形態の中で、2’位において修飾基で置換されたリボースを1、2および3つおきに組み合わせて、全く隣接させずに分布させることが最も好ましい。

本発明で用いられるRNAは、既知のRNAまたはDNA合成法およびRNAまたはDNA修飾法を用いて製造すればよい。例えば北海道システムサイエンス株式会社等に化学合成を依頼して得ることができる。

本発明の組成物におけるリポソーム(以下リポソームA)としては、標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な塩基の配列を含むRNAを封入したリポソームが好ましい。該リポソームAは標的遺伝子の発現部位を含む組織または臓器に到達するリポソームであれば特に限定されないが、リポソームによって、それぞれ到達しやすい組織または臓器が知られているので、適宜選択すべきである。
本発明に用いるリポソームAとしては、例えば、カチオン性脂質/RNAの複合体を疎水性の有機溶媒層に分散させ、ポリエチレングリコール化脂質と中性の脂質と水を加えて油中水型(W/O)エマルジョンを形成し、逆相蒸発法で処理して製造されたリポソーム(特表2002-501511号公報参照)、RNAを、酸性の電解質水溶液に溶解し、脂質(エタノール中)を加え、エタノール濃度を下げてRNA内包リポソームを調製した後、試料のpHを上げて透析してリポソーム表面に付着した前記RNAを除去して製造されたリポソーム(特表2002-501511号公報およびバイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ(Biochimica et Biophysica Acta),2001年,第1510巻,p.152-166参照)、リード粒子と前記RNAを含む複合粒子および該複合粒子を封入する脂質二重膜から構成されたリポソーム(国際公開第02/28367号パンフレットおよび国際公開第2006/080118号パンフレット参照)等があげられ、リード粒子と前記RNAを含む複合粒子および該複合粒子を封入する脂質二重膜から構成されたリポソームが好ましく、該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能であることがより好ましい。また、リポソームAとしては、好ましくはカチオン性物質を含むリード粒子と前記RNAを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成され、該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とするリポソームもあげられ、該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能であることがより好ましい。なお、本発明において、分散とは、溶解せずに分散することを意味する。

これら例示したリポソームは、腫瘍または炎症の生じた組織もしくは臓器、具体的には固形腫瘍および固形癌、血管または血管近傍の炎症部位等に送達されることが報告されており、腫瘍または炎症に関連する遺伝子を標的遺伝子とした場合に、より好ましく用いることができるリポソームとしてあげられる。
また、これら例示したリポソームは、血液中での滞留性が高められたリポソームとしても報告されており、いずれの組織や臓器にも体循環を介して送達される可能性が高まっているので、標的に出来る遺伝子は制限されない。

本発明におけるリード粒子としては、例えば、脂質集合体、リポソーム、高分子ミセル等である微粒子があげられ、好ましくはリポソームである微粒子があげられる。本発明におけるリード粒子は、脂質集合体、リポソーム、高分子ミセル等を2つ以上組み合わせた複合体、例えば脂質集合体、リポソーム等の構成成分である脂質を含む複合体としての高分子ミセル、高分子ミセルの構成成分である高分子を含む複合体としての脂質集合体、リポソーム等であってもよい。

リード粒子としての脂質集合体またはリポソーム(以下リポソームB)は、例えば脂質および/または界面活性剤等、好ましくは脂質または脂質および界面活性剤によって構成されるのが好ましい。該脂質としては、単純脂質、複合脂質または誘導脂質のいかなるものであってもよく、例えばリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、スフィンゴイド、ステロールまたはカチオン性脂質等があげられるがこれらに限定されない。好ましくはリン脂質またはカチオン性脂質があげられる。また、脂質としては、例えば界面活性剤(後記の界面活性剤と同義)または高分子(後記の高分子と同義、具体的にはデキストラン等)もしくはポリオキシエチレン誘導体(具体的にはポリエチレングリコール等)等の脂質誘導体も含まれる。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤または両性界面活性剤等があげられる。

上記リード粒子を構成する脂質におけるリン脂質としては、例えばホスファチジルコリン(具体的には大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン(EPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン等)、ホスファチジルエタノールアミン(具体的にはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等)、グリセロリン脂質(具体的にはホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン等)、スフィンゴリン脂質(具体的にはスフィンゴミエリン、セラミドホスホエタノールアミン、セラミドホスホグリセロール、セラミドホスホグリセロリン酸等)、グリセロホスホノ脂質、スフィンゴホスホノ脂質、天然レシチン(具体的には卵黄レシチン、大豆レシチン等)または水素添加リン脂質(具体的には水素添加大豆ホスファチジルコリン等)等の天然または合成のリン脂質があげられる。

上記リード粒子を構成する脂質におけるグリセロ糖脂質としては、例えばスルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリドまたはグリコシルジグリセリド等があげられる。

上記リード粒子を構成する脂質におけるスフィンゴ糖脂質としては、例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシドまたはガングリオシド等があげられる。

上記リード粒子を構成する脂質におけるスフィンゴイドとしては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガン、スフィンゴシンまたはそれらの誘導体等があげられる。誘導体としては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガンまたはスフィンゴシン等の-NH₂を-NHCO(CH₂)xCH₃(式中、xは0〜18の整数を表し、中でも6、12または18が好ましい)に変換したもの等があげられる。

上記リード粒子を構成する脂質におけるステロールとしては、例えばコレステロール、ジヒドロコレステロール、ラノステロール、β-シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴカステロール、フコステロールまたは3β-［N-(N',N'-ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロール(DC-Chol)等があげられる。

上記リード粒子を構成する脂質におけるカチオン性脂質としては、例えば、N-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム(DOTAP)、N-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N-ジメチルアミン(DODAP)、N-［1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム(DOTMA)、2,3-ジオレイルオキシ-N-［2-(スペルミンカルボキシアミド)エチル］-N,N-ジメチル-1-プロパナミニウムトリフルオロ酢酸(DOSPA)、N-［1-(2,3-ジテトラデシルオキシプロピル)］-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウム(DMRIE)またはN-［1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)］-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウム(DORIE)等があげられる。

上記リード粒子を構成する非イオン性界面活性剤としては、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン(具体的にはポリソルベート80等)、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール(具体的にはプルロニックF68等)、ソルビタン脂肪酸エステル(具体的にはソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート等)、ポリオキシエチレン誘導体(具体的にはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、ポリオキシエチレンラウリルアルコール等)またはグリセリン脂肪酸エステル等があげられる。

上記リード粒子を構成するアニオン性界面活性剤としては、例えばアシルサルコシン、アルキル硫酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸塩、炭素数7〜22の脂肪酸ナトリウム等があげられる。具体的にはドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムまたはタウロデオキシコール酸ナトリウム等があげられる。
上記リード粒子を構成するカチオン性界面活性剤としては、例えばアルキルアミン塩、アシルアミン塩、第四級アンモニウム塩、アミン誘導体等があげられる。具体的には塩化ベンザルコニウム、アシルアミノエチルジエチルアミン塩、N-アルキルポリアルキルポリアミン塩、脂肪酸ポリエチレンポリアミド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、アルキルポリオキシエチレンアミン、N-アルキルアミノプロピルアミンまたは脂肪酸トリエタノールアミンエステル等があげられる。

上記リード粒子を構成する両性界面活性剤としては、例えば3-［(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ］-1-プロパンスルホン酸またはN-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸等があげられる。

リポソームBにおいては、これら脂質および界面活性剤は、単独でまたは2種以上を組み合わせて用いられ、好ましくは2種以上組み合わせて用いられる。2種以上組み合わせて用いる場合の組み合わせとしては、例えば水素添加大豆ホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール化リン脂質およびコレステロールから選ばれる2成分以上の組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール化リン脂質およびコレステロールから選ばれる2成分以上の組み合わせ、EPCとDOTAPの組み合わせ、EPC、DOTAPおよびポリエチレングリコール化リン脂質の組み合わせ、EPC、DOTAP、コレステロールおよびポリエチレングリコール化リン脂質の組み合わせ等があげられる。

また、リポソームBは、必要に応じて、例えばコレステロール等のステロール等の膜安定化剤、例えばトコフェロール等の抗酸化剤等を含有していてもよい。これら安定化剤は単独でまたは2種以上組み合わせて使用し得る。

脂質集合体としては、例えば球状ミセル、球状逆ミセル、ソーセージ状ミセル、ソーセージ状逆ミセル、板状ミセル、板状逆ミセル、ヘキサゴナルI、ヘキサゴナルIIおよび脂質2分子以上からなる会合体、エマルジョン粒子(例えば脂肪乳剤、非イオン性界面活性剤と大豆油からなるエマルジョン、リピッドエマルジョン、リピッドナノスフェアー等の水中油型(O/W)エマルジョンや水中油中水型(W/O/W)エマルジョン粒子等)があげられる。

高分子ミセルとしては、例えばタンパク質、アルブミン、デキストラン、ポリフェクト(polyfect)、キトサン、デキストラン硫酸、例えばポリ-L-リジン、ポリエチレンイミン、ポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド-アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸またはポリエチレングリコール化ポリ乳酸等の高分子またはそれらの塩の１以上からなるミセルがあげられる。

ここで、高分子における塩は、例えば金属塩、アンモニウム塩、酸付加塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を包含する。金属塩としては、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩または亜鉛塩等があげられる。アンモニウム塩としては、例えばアンモニウムまたはテトラメチルアンモニウム等の塩があげられる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩またはリン酸塩等の無機酸塩、および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩またはクエン酸塩等の有機酸塩があげられる。有機アミン付加塩としては、例えばモルホリンまたはピペリジン等の付加塩があげられる。アミノ酸付加塩としては、例えばグリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはリジン等の付加塩があげられる。

また、本発明におけるリード粒子は、例えば糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤等を含有することができる。糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤は、リード粒子として含有されてもよく、リード粒子に加えて用いてもよい。

糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤としては、好ましくは、糖脂質、または水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体があげられ、より好ましくは、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられる。糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤は、分子の一部がリード粒子の他の構成成分と例えば疎水性親和力、静電的相互作用等で結合する性質をもち、他の部分がリード粒子の製造時の溶媒と例えば親水性親和力、静電的相互作用等で結合する性質をもつ、2面性をもつ物質であるのが好ましい。

糖、ペプチドまたは核酸の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばショ糖、ソルビトール、乳糖等の糖、例えばカゼイン由来ペプチド、卵白由来ペプチド、大豆由来ペプチド、グルタチオン等のペプチド、または例えばDNA、RNA、プラスミド、siRNA、ODN等の核酸と、前記リード粒子の定義の中であげた脂質または例えばステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸等の脂肪酸とが結合してなるもの等があげられる。

また、糖の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えば前記リード粒子の定義の中であげたグリセロ糖脂質またはスフィンゴ糖脂質等も含まれる。

水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、オリゴ糖、デキストリン、水溶性セルロース、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ポリグリセリン、キトサン、ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸アミド、ポリ-L-リジン、マンナン、プルラン、オリゴグリセロール等またはそれらの誘導体と、前記リード粒子の定義の中であげた脂質、または例えばステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸またはラウリン酸等の脂肪酸とが結合してなるもの等があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体、ポリグリセリン誘導体等の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられ、さらに好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられる。

ポリエチレングリコール誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリエチレングリコール化脂質(具体的にはポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミン(より具体的には1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000］(PEG-DSPE)等)、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、クレモフォアイーエル(CREMOPHOR EL)等)、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル類(具体的にはモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等)またはポリエチレングリコール脂肪酸エステル類等があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール化脂質があげられる。

ポリグリセリン誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリグリセリン化脂質(具体的にはポリグリセリン-ホスファチジルエタノールアミン等)またはポリグリセリン脂肪酸エステル類等があげられ、より好ましくは、ポリグリセリン化脂質があげられる。

界面活性剤としては、例えば前記リード粒子の定義の中であげた界面活性剤、ポリエチレングリコールアルキルエーテル等があげられ、好ましくは、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステルまたはポリエチレングリコールアルキルエーテル等があげられる。

上記したリード粒子は、正電荷をもつものが好ましい。ここで述べる、正電荷とは、前記RNA内の電荷、分子内分極等に対して静電的引力を生じる電荷、表面分極等を包含する。リード粒子が正電荷をもつには、リード粒子は、カチオン性物質を含有するのが好ましく、リード粒子は、カチオン性脂質を含有するのがより好ましい。

リード粒子に含有されるカチオン性物質は、カチオン性を呈する物質であるが、カチオン性の基とアニオン性の基の両方をもつ両性の物質であっても、pHや、他の物質との結合等により相対的な陰性度が変化するので、その時々に応じてカチオン性物質に分類され得るものも含まれる。これらカチオン性物質は、リード粒子として含有されてもよく、リード粒子に加えて用いてもよい。

カチオン性物質としては、例えば前記のリード粒子の定義で例示したもののうちのカチオン性物質［具体的には、脂質におけるカチオン性物質、カチオン性界面活性剤(前記と同義)、カチオン性高分子等］、等電点以下の値のpHでカチオン性を呈する蛋白質またはペプチド等があげられ、好ましくはN-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N-ジメチルアミン、N-［1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジテトラデシルオキシプロピル)］-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび3β-［N-(N',N'ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロールから選ばれる一つ以上があげられる。
脂質におけるカチオン性物質としては、例えばDOTAP、DODAP、DOTMA、DOSPA、DMRIE、DORIEまたはDC-Chol等があげられる。
カチオン性高分子としては、例えばポリ-L-リジン、ポリエチレンイミン、ポリフェクト(polyfect)またはキトサン等があげられる。

等電点以下の値のpHでカチオン性を呈する蛋白質またはペプチドとしては、その物質の等電点以下の値のpHでカチオン性を呈する蛋白質またはペプチドであれば、特に限定されない。該蛋白質またはペプチドとしては、例えば、アルブミン、オロソムコイド、グロブリン、フィブリノーゲン、ペプシンまたはリボヌクレアーゼT1等があげられる。

本発明におけるリード粒子は、公知の製造方法またはそれに準じて製造することができ、いかなる製造方法で製造されたものであってよい。例えば、リード粒子の1つであるリポソームBの製造には、公知のリポソームの調製方法が適用できる。公知のリポソームの調製方法としては、例えばバンガム(Bangham)らのリポソーム調製法［“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)”,1965年,第13巻,p.238-252参照］、エタノール注入法［“ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(J.Cell Biol.)”,1975年,第66巻,p.621-634参照］、フレンチプレス法［“エフイービーエス・レターズ(FEBS Lett.)”,1979年,第99巻,p.210-214参照］、凍結融解法［“アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス(Arch.Biochem.Biophys.)”,1981年,第212巻,p.186-194参照］、逆相蒸発法［“プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)”,1978年,第75巻, p.4194-4198参照］またはpH勾配法(例えば特許第2572554号公報、特許第2659136号公報等参照)等があげられる。リポソームBの製造の際にリポソームBを分散させる溶液としては、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液またはアミノ酸輸液等を用いることができる。また、リポソームBの製造の際には、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインまたはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)等の抗酸化剤、例えばグリセリン、ブドウ糖または塩化ナトリウム等の等張化剤等の添加も可能である。また、脂質等を例えばエタノール等の有機溶媒に溶解し、溶媒を留去した後、生理食塩水等を添加、振とう撹拌し、リポソームを形成させることによってもリポソームBを製造することができる。

また、例えば非イオン性界面活性剤(前記と同義)、カチオン性界面活性剤(前記と同義)、アニオン性界面活性剤(前記と同義)、高分子、ポリオキシエチレン誘導体等によるリポソームB等のリード粒子の表面改質も任意に行うことができる［ラジック(D.D.Lasic)、マーティン(F.Martin)編,“ステルス・リポソームズ(Stealth Liposomes)”(米国),シーアールシー・プレス・インク(CRC Press Inc),1995年,p.93-102参照］。表面改質に使用し得る高分子としては、例えばデキストラン、プルラン、マンナン、アミロペクチンまたはヒドロキシエチルデンプン等があげられる。ポリオキシエチレン誘導体としては、例えばポリソルベート80、プルロニックF68、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、ポリオキシエチレンラウリルアルコールまたはPEG-DSPE等があげられる。リポソームB等のリード粒子の表面改質は、リード粒子に糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有させる方法の1つによっても行うことができる。

リポソームBの平均粒子径は、所望により自由に選択できるが、下記するリード粒子径とするのが好ましい。リポソームBの平均粒子径を調節する方法としては、例えばエクストルージョン法、大きな多重膜リポソーム(MLV)を機械的に粉砕(具体的にはマントンゴウリン、マイクロフルイダイザー等を使用)する方法［ミュラー(R.H.Muller)、ベニタ(S.Benita)、ボーム(B.Bohm)編著,“エマルジョン・アンド・ナノサスペンジョンズ・フォー・ザ・フォーミュレーション・オブ・ポアリー・ソラブル・ドラッグズ(Emulsion and Nanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs)”,ドイツ,サイエンティフィック・パブリッシャーズ・スチュットガルト(Scientific Publishers Stuttgart),1998年,p.267-294参照］等があげられる。

また、リード粒子である、例えば脂質集合体、リポソームB、高分子ミセル等から選ばれる2つ以上を組み合わせた複合体の製造方法は、例えば水中で脂質、高分子等を混合するだけでもよく、所望によりさらに整粒工程や無菌化工程等を加えることもできる。また、前記複合体の製造は例えばアセトンまたはエーテル等種々の溶媒中で行うことも可能である。

本発明におけるリード粒子の大きさは、平均粒子径が数nm〜数十μmであるのが好ましく、約10nm〜1000nmであるのがより好ましく、約50nm〜300nmであるのがさらに好ましい。

本発明におけるリード粒子とRNAを含む複合粒子を被覆する脂質二重膜の構成成分としては、例えば前記リード粒子の定義の中であげた脂質または界面活性剤等があげられ、好ましくは、脂質または界面活性剤のうちの中性脂質があげられる。ここで、前記中性脂質とは、脂質または界面活性剤のうちの、前記リード粒子が正電荷をもつ場合におけるカチオン性物質の中であげた脂質におけるカチオン性物質とカチオン性界面活性剤および後記の付着競合剤の中であげたアニオン性脂質とアニオン性界面活性剤を除いたもののことであり、中性脂質としてより好ましくは、リン脂質、グリセロ糖脂質またはスフィンゴ糖脂質等があげられる。より好ましくはリン脂質があげられ、さらに好ましくはEPCがあげられる。これら脂質または界面活性剤は単独でまたは2種以上を組み合わせて用いることができる。

また、複合粒子を被覆する脂質二重膜の構成成分は、極性有機溶媒に可溶であることが好ましく、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液中には、分散可能であることが好ましい。特定の濃度で該極性溶媒を含む液中の該極性溶媒の濃度は、該脂質二重膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度が好ましい。該極性有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、n-プロパノール、2-プロパノール、n-ブタノール、2-ブタノール、tert-ブタノール等のアルコール、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコールまたはポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール等があげられ、中でも、アルコールが好ましく、エタノールがより好ましい。
本発明における極性有機溶媒を含む液中の、極性有機溶媒以外の溶媒としては、例えば、水、液体二酸化炭素、液体炭化水素、ハロゲン化炭素またはハロゲン化炭化水素等が挙げられ、好ましくは水が挙げられる。また、イオンまたは緩衝成分等を含んでいてもよい。溶媒は1種または2種以上を用いることができるが、2種以上用いる場合は、相溶する組み合わせが好ましい。

また、複合粒子を被覆する脂質二重膜に用いられる脂質としては、例えば合成脂質等も好ましくあげられる。合成脂質としては、例えばフッ素添加ホスファチジルコリン、フッ素添加界面活性剤または臭化ジアルキルアンモニウム等があげられ、これらは単独でまたは他の脂質等と組み合わせて用いられてもよい。

また、複合粒子を被覆する脂質二重膜は、水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体もしくは脂肪族炭化水素誘導体または前記界面活性剤を含有することが好ましい。水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体としては、例えば前記の糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体、または糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂肪族炭化水素誘導体があげられる。水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体としては、前記水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体がより好ましく、前記ポリエチレングリコール化リン脂質がさらに好ましく、ポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミンが最も好ましい。なお、本発明における水溶性物質の脂肪族炭化水素誘導体としては、水溶性物質と、例えば長鎖脂肪族アルコール、ポリオキシプロピレンアルキルまたはグリセリン脂肪酸エステルのアルコール性残基等とが結合してなるものがあげられる。

糖、ペプチドまたは核酸の脂肪族炭化水素誘導体としては、例えばショ糖、ソルビトールまたは乳糖等の糖、例えばカゼイン由来ペプチド、卵白由来ペプチド、大豆由来ペプチドまたはグルタチオン等のペプチド、あるいは例えばDNA、RNA、プラスミド、siRNAまたはODN等の核酸の脂肪族炭化水素誘導体があげられる。

水溶性高分子の脂肪族炭化水素誘導体としては、例えばポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、オリゴ糖、デキストリン、水溶性セルロース、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ポリグリセリン、キトサン、ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸アミド、ポリ-L-リジン、マンナン、プルラン、オリゴグリセロール等またはそれらの誘導体の脂肪族炭化水素誘導体があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体またはポリグリセリン誘導体等の脂肪族炭化水素誘導体があげられ、さらに好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体の脂肪族炭化水素誘導体があげられる。

リード粒子がリポソームBである微粒子である場合、リポソームBと前記RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜を含むものがリポソームAとなり、その構成から狭義のリポソームと分類され、リード粒子がリポソームBである微粒子以外である場合でも、脂質二重膜で被覆されているので、広義のリポソームと分類される。本発明において、リード粒子がリポソームBである微粒子であることがより好ましい。

本発明におけるリード粒子と前記RNAを構成成分とする複合粒子は、該リード粒子を製造後または該リード粒子の製造と同時に、該RNAをリード粒子に付着または封入して複合粒子を製造でき、さらに該複合粒子の製造後または複合粒子の製造と同時に、脂質二重膜で該複合粒子を被覆することによりリポソームAを製造することができる。リポソームAは、例えば、特表2002-508765号公報、特表2002-501511号公報、“バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ(Biochimica et Biophysica Acta)”,2001年,第1510巻,p.152-166、国際公開第02/28367号パンフレット等の公知の製造方法またはそれに準じて製造するか、例えばリード粒子に前記RNAを付着または封入して複合粒子を製造後、該複合粒子および被覆層成分を、該被覆層成分が可溶な極性有機溶媒を含む、該複合粒子が溶解せず、該被覆層成分が分散状態で存在することが可能な濃度の液中に分散させる工程および該複合粒子を該被覆層成分で被覆する工程を含む製造方法で製造することができる。本発明におけるリード粒子と前記RNAを構成成分とする複合粒子は、リード粒子を水中で製造し、該リード粒子を製造後または該リード粒子の製造と同時に前記RNAを水に分散または溶解して混合し、該RNAをリード粒子に付着または封入させることで複合粒子を製造するか、またはリード粒子を任意な溶媒中で製造した後、該リード粒子を水中に分散させ、前記RNAを水中に分散または溶解して混合し、リード粒子に該RNAを付着させることで製造することが好ましく、リード粒子を水中で製造し、該リード粒子を製造後、前記RNAを水に分散または溶解して混合し、リード粒子に該RNAを付着させることで製造することがより好ましい。

本発明の組成物におけるリポソームAの好ましい製造方法としては、以下のリード粒子と前記RNAを構成成分とする複合粒子を製造する工程(工程1)および該複合粒子を脂質二重膜で被覆する工程(工程2または工程3)を含む製造方法があげられる。

工程1) リード粒子と前記RNAを構成成分とする複合粒子を製造する工程
リード粒子を、例えば水等の溶媒中に分散させ、リード粒子が分散した液中に、前記RNAを分散または溶解して含有させて混合し、リード粒子に該RNAを付着させることが好ましい。工程1において、リード粒子の凝集を抑制するために、リード粒子は凝集抑制物質を含有するリード粒子であることが好ましい。凝集抑制物質としては、前記糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤が好ましくあげられる。また、リード粒子が、正電荷をもつものである場合、リード粒子が分散した液中で、該RNAと付着競合剤を共存させ、付着競合剤を該RNAとともにリード粒子に付着させてもよく、さらにリード粒子が凝集抑制物質を含有するリード粒子である場合にも、リード粒子の凝集をより抑制させるために付着競合剤を用いてもよい。リード粒子と前記RNAの組み合わせとしては、複合粒子が極性有機溶媒を含有する液に分散可能となる組み合わせを選択することが好ましく、極性有機溶媒に対しての複合粒子の溶解度が、工程2または3で用いる脂質二重膜の構成成分のそれよりも低いことがより好ましく、また、該極性有機溶媒を含む液中に、該脂質二重膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する組み合わせを選択することがより好ましい。

付着競合剤としては、例えばアニオン性物質等があげられる。該アニオン性物質は、分子内の電荷、分子内分極等による静電的引力により、リード粒子に静電的に付着する物質を包含する。付着競合剤としてのアニオン性物質は、アニオン性を呈する物質であるが、アニオン性の基とカチオン性の基の両方をもつ両性の物質であっても、pHや、他の物質との結合等により相対的な陰性度が変化するので、その時々に応じてアニオン性物質に分類され得る。

アニオン性物質としてはアニオン性脂質、アニオン性界面活性剤(前記と同義)、アニオン性高分子等または等電点以上の値のpHでアニオン性を呈する蛋白質、ペプチドもしくは核酸等があげられ、好ましくはデキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸またはデキストランフルオレセインアニオニック等があげられる。これらアニオン性物質は単独でまたは2種以上を組み合わせて用いることができる。

アニオン性脂質としては、例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトールまたはホスファチジン酸等があげられる。

アニオン性高分子としては、例えばポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド-アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール化ポリ乳酸、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸またはデキストランフルオレセインアニオニック等があげられる。
等電点以上の値のpHでアニオン性を呈する蛋白質またはペプチドとしては、その物質の等電点以上の値のpHでアニオン性を呈する蛋白質またはペプチドであれば、特に限定されない。例えば、アルブミン、オロソムコイド、グロブリン、フィブリノーゲン、ヒストン、プロタミン、リボヌクレアーゼまたはリゾチーム等があげられる。

アニオン性物質としての核酸としては、例えばDNA、RNA、プラスミド、siRNAまたはODN等があげられ、生理活性を示さないものであれば、どのような長さ、配列のものであってもよい。

付着競合剤は、リード粒子に静電的に付着することが好ましく、リード粒子に付着してもリード粒子を凝集させるような架橋を形成しない大きさの物質であるか、分子内に付着する部分と、付着に反発してリード粒子の凝集を抑制する部分をもつ物質であることが好ましい。

工程1は、より具体的には、例えば凝集抑制物質を含有するリード粒子が分散した液を製造する操作および該リード粒子が分散した液中に、前記RNAを分散または溶解して含有させる操作(例えば該リード粒子が分散した液中に、該RNAを加えて分散または溶解させる操作、該リード粒子が分散した液中に、該RNAが分散または溶解した液を加える操作等)を含む製造方法において実施することができる。ここで、リード粒子が分散した液中に、前記RNAを分散または溶解して含有させる工程により得られる複合粒子としては、具体的には、カチオン性物質を含有するリポソームBである微粒子に該RNAが付着して形成される複合粒子、カチオン性物質を含有する脂質集合体である微粒子に前記RNAが付着して形成される複合粒子、ポリ-L-リジン等のカチオン性高分子を含有する高分子である微粒子に前記RNAが付着して形成される複合粒子があげられる。また、リード粒子が分散した液中に、前記RNAを分散または溶解して含有させる操作が、該RNAが分散または溶解した液に、さらに付着競合剤を含有させて、これを該リード粒子が分散した液中に加える操作であることが好ましく、この場合、該リード粒子に、該RNAと該付着競合剤が共に付着して複合粒子が製造され、該複合粒子の製造中におけるリード粒子の凝集も、製造後における複合粒子の凝集もより抑制されて製造できる。

リード粒子のリード粒子が分散する液に対する割合は、リード粒子に前記RNAが付着できれば特に限定されるものではないが、約1μg/mL〜1g/mLであるのが好ましく、約0.1〜500mg/mLであるのがより好ましい。

工程2) 複合粒子を脂質二重膜で被覆する工程(その1)
工程1で得られた複合粒子が分散し、かつ脂質二重膜の構成成分が溶解した極性有機溶媒を含む液(液A)を調製する操作、次いで、液A中の極性有機溶媒の濃度を減少させることによって、複合粒子を脂質二重膜で被覆する操作を含む製造方法によってリポソームAが製造できる。この場合、リポソームAは分散液(液B)の形態で得られる。液Aにおける溶媒は、該脂質二重膜の構成成分が可溶で、該複合粒子が分散可能な極性有機溶媒の濃度の該極性有機溶媒を含む溶媒であり、液A中の極性有機溶媒の濃度を減少させた液Bでは、該脂質二重膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能であることが好ましい。液A中の溶媒が、極性有機溶媒と極性有機溶媒以外の溶媒との混合液である場合、例えば該極性有機溶媒と混合可能な極性有機溶媒以外の溶媒を含む溶媒(液C)を加えること、および/または、蒸発留去、半透膜分離、分留等によって、選択的に極性有機溶媒を取り除くことで、極性有機溶媒の濃度を減少させることができる。ここで、液Cは、極性有機溶媒以外の溶媒を含む液が好ましいが、極性有機溶媒も液Aにおける極性有機溶媒の濃度より低ければ含んでいてよい。

工程2における極性有機溶媒以外の溶媒としては、例えば、水、液体二酸化炭素、液体炭化水素、ハロゲン化炭素またはハロゲン化炭化水素等があげられ、好ましくは水があげられる。また、液Aおよび液Cは、イオンまたは緩衝成分等を含んでいてもよい。これら溶媒は単独でまたは2種以上を組み合わせて用いることができる。

極性有機溶媒と極性有機溶媒以外の溶媒の組み合わせは、相互に混合可能である組み合わせであるのが好ましく、液Aおよび液B中の溶媒ならびに液Cに対する、複合粒子および脂質二重膜の構成成分の溶解度等を考慮して選択できる。複合粒子については、液Aおよび液B中の溶媒ならびに液Cのいずれに対しての溶解度も低いことが好ましく、また極性有機溶媒および極性有機溶媒以外の溶媒のいずれに対しての溶解度も低いことが好ましく、脂質二重膜の構成成分は、液B中の溶媒および液Cに対しての溶解度が低いことが好ましく、液A中の溶媒に対しての溶解度が高いことが好ましく、また極性有機溶媒に対しての溶解度が高いことが好ましく、極性有機溶媒以外の溶媒に対する溶解度が低いことが好ましい。ここで、「複合粒子の溶解度が低い」とは、複合粒子に含有されるリード粒子、RNAおよび付着競合剤等の各成分の、溶媒中における溶出性が小さいことであり、各成分の個々の溶解度が高くても各成分間の結合等によって各成分の溶出性が小さくなっていればよい。例えば、リード粒子に含まれる成分のいずれかの液A中の溶媒に対する溶解度が高い場合でも、リード粒子が正電荷をもつ場合、RNA内の電荷、分子内分極等と静電的に結合することで複合粒子中の成分の溶出が抑制され、複合粒子の液A中の溶媒に対する溶解度を低くすることが可能である。すなわち、リード粒子が正電荷をもつことは、リポソームAの製造において、複合粒子の成分の溶出を抑制し、製造性と歩留まりを向上させる効果も備えている。

液Aにおける極性有機溶媒の濃度は、脂質二重膜の構成成分が可溶で、複合粒子が分散可能であれば特に限定されるものではなく、用いる溶媒や複合粒子、脂質二重膜の構成成分の種類等により異なるが、好ましくは約30v/v%以上、より好ましくは約60〜90v/v%である。また、液Bにおける極性有機溶媒の濃度は、液Aよりも低い濃度で該極性有機溶媒を含み、脂質二重膜の構成成分が分散可能で、複合粒子も分散可能であれば特に限定されるものではないが、好ましくは約50v/v%以下である。

液Aを調製する工程としては、極性有機溶媒、複合粒子および脂質二重膜の構成成分、必要により極性有機溶媒以外の溶媒を混合して液Aを調製する工程があげられる。極性有機溶媒、複合粒子および脂質二重膜の構成成分、必要により極性有機溶媒以外の溶媒は、複合粒子が溶解しなければ、それらを加える順序に特に制限はないが、好ましくは、例えば該複合粒子が分散した極性有機溶媒を含む液(液D)を調製し、液D中の極性有機溶媒と同一または異なった極性有機溶媒を含む溶媒に該脂質二重膜の構成成分を溶解させた液(液E)を調製し、液Dと液Eを混合して調製する工程があげられる。液Dと液Eを混合して液Aを調製する際には、徐々に混合することが好ましい。

工程3) 複合粒子を脂質二重膜で被覆する工程(その2)
工程1で得られた複合粒子および脂質二重膜の構成成分を、該脂質二重膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含み、該脂質二重膜の構成成分が分散状態で存在することが可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液(液F)中に分散させる操作を含む製造方法でリポソームAが製造でき、この場合、リポソームAは分散液の状態で得られる。なお、液Fは、該脂質二重膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含むが、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子がともに分散可能な特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液である。

液Fの調製方法はいかなる形態をも取ることができる。例えば複合粒子の分散液と、脂質二重膜の構成成分の溶解液または分散液を調製した後、両液を混合して液Fを調製してもよく、複合粒子または脂質二重膜の構成成分のどちらか一方の分散液を調製し、その分散液に、固体状態の複合粒子または脂質二重膜の構成成分の残る一方を加えて分散させて液Fを調製してもよい。複合粒子の分散液と、脂質二重膜の構成成分の溶解液または分散液を混合する場合には、複合粒子の分散媒は、あらかじめ極性有機溶媒を含んでいてもよく、脂質二重膜の構成成分の溶媒または分散媒は極性有機溶媒を含む液または極性有機溶媒のみで構成される液であってもよい。一方、複合粒子または脂質二重膜の構成成分のどちらか一方の分散液を調製し、該分散液に、固体状態の複合粒子または脂質二重膜の構成成分の残る一方を加える場合には、該分散液は、極性有機溶媒を含む液であることが好ましい。なお、液Fを調製した後に複合粒子が溶解せず、脂質二重膜の構成成分が分散している場合には、複合粒子が溶解せず、脂質二重膜の構成成分が分散する極性有機溶媒濃度の範囲であれば極性有機溶媒を加えてもよく、極性有機溶媒を除去してもよく、または濃度を減少させてもよい。一方、液Fを調製した後に複合粒子は溶解していないが、脂質二重膜の構成成分が溶解している場合には、複合粒子が溶解せず、脂質二重膜の構成成分が分散する極性有機溶媒濃度の範囲で極性有機溶媒を除去するかまたは濃度を減少させればよい。また、複合粒子と脂質二重膜の構成成分をあらかじめ極性有機溶媒以外の溶媒中で混合し、そこに複合粒子が溶解せず、脂質二重膜の構成成分が分散する極性有機溶媒濃度の範囲で極性有機溶媒を加えてもよい。その場合には、複合粒子および脂質二重膜の構成成分のそれぞれを極性有機溶媒以外の溶媒中に分散させ、両分散液を混合した後で、極性有機溶媒を加えてもよく、複合粒子または脂質二重膜の構成成分のどちらか一方を極性有機溶媒以外の溶媒中に分散させ、その分散液に、固体状態の複合粒子または脂質二重膜の構成成分の残る一方を加えて分散させた後で、極性有機溶媒を加えてもよい。また、複合粒子および脂質二重膜の構成成分が分散し、極性有機溶媒を含有する液を、複合粒子が脂質二重膜で被覆されるに充分な時間、静置または混合する操作を含むことが好ましい。複合粒子と脂質二重膜の構成成分を、極性有機溶媒を含有する液中に分散させた後、静置または混合する時間は、複合粒子および脂質二重膜の構成成分を、極性有機溶媒を含有する液中に分散させた後に瞬時に終了させるのでなければ制限はないが、脂質二重膜の構成成分や、極性有機溶媒を含有する液の種類に応じて任意に設定することができ、得られたリポソームAの収率が定常量となる時間を設定することが好ましく、例えば約3秒〜30分である。

液Fにおける極性有機溶媒以外の溶媒としては、例えば工程2における極性有機溶媒以外の溶媒で例示した物があげられ、好ましくは水があげられる。

液Fにおける極性有機溶媒の濃度は、複合粒子と、脂質二重膜の構成成分がともに分散されている条件さえ満たしていれば特に限定されるものではなく、用いる溶媒や複合粒子、脂質二重膜の構成成分の種類等により異なるが、好ましくは約1〜80v/v%、より好ましくは約10〜60v/v%、さらに好ましくは約20〜50v/v%、最も好ましくは約30〜40v/v%である。

本発明において、「脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に対して可溶」とは、脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に溶解する性質をもつ場合、可溶化剤等を用いることにより脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に溶解する性質をもつ場合、脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒中で凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化し得る性質をもつ場合等を包含する。また、「脂質二重膜の構成成分が分散する」とは、脂質二重膜の構成成分の全部が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化している状態、脂質二重膜の構成成分の一部が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が溶解している状態、脂質二重膜の構成成分の一部が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が沈殿している状態等を包含する。なお、「脂質二重膜の構成成分が溶解する」とは、脂質二重膜の構成成分の全部が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化している状態を包含しない。

本発明において、「複合粒子が分散する」とは、複合粒子が懸濁または乳濁もしくはエマルジョン化している状態のことであり、複合粒子の一部が懸濁または乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が溶解している状態、複合粒子の一部が乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が沈殿している状態等を包含する。「複合粒子が溶解しない」とは、前記の「複合粒子が分散する」と同義である。

本発明におけるリポソームAの製造方法において用いられる、極性有機溶媒含有水溶液中の複合粒子の濃度は、複合粒子を脂質二重膜で被覆できれば特に限定されるものではないが、約1μg/mL〜1g/mLであるのが好ましく、約0.1〜500mg/mLであるのがより好ましい。また、用いられる脂質二重膜の構成成分の濃度は、複合粒子を被覆できれば特に限定されるものではないが、約1μg/mL〜1g/mLであるのが好ましく、約0.1〜400mg/mLであるのがより好ましい。

本発明のリポソームAに対する脂質二重膜の割合は、重量比で約1:0.1〜1:1000が好ましく、約1:1〜1:10がより好ましい。

また、本発明におけるリポソームAの大きさは、平均粒子径が約300nm以下であるのが好ましく、約200nm以下であるのがより好ましく、具体的には、例えば注射可能な大きさであるのが好ましい。

さらに、上記で得られるリポソームAに抗体等の蛋白質、糖類、糖脂質、アミノ酸、核酸、種々の低分子化合物または高分子化合物等の物質による修飾を行うこともでき、これらで得られる被覆複合粒子もリポソームAに包含される。例えば、ターゲッティングに応用するため、上記で得られるリポソームAに対して、さらに抗体等の蛋白質、ペプチドまたは脂肪酸類等による脂質二重膜の表面修飾を行うこともできる［ラジック(D. D. Lasic)、マーティン(F. Martin)編,“ステルス・リポソームズ(Stealth Liposomes)”(米国),シーアールシー・プレス・インク(CRC Press Inc),1995年,p.93-102参照］。また、リポソームAに例えば水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体による表面改質も任意に行うことができ、これら表面改質に用いられる水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体は、前記脂質二重膜の構成成分としての水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体と同義である。

本発明の組成物は、人を含む哺乳動物に投与することで、前記RNAを標的遺伝子の発現部位へ送達されれば、in vivoでほ乳類の細胞に、遺伝子の発現を抑制するRNA等を導入することができ、遺伝子等の発現の抑制ができる。本発明の組成物における標的遺伝子が、例えば腫瘍または炎症に関連する遺伝子であれば、本発明の組成物を、癌または炎症疾患の治療剤または予防剤、好ましくは固形癌または血管もしくは血管近傍の炎症の治療剤または予防剤として使用することができる。具体的には、本発明の組成物における標的遺伝子が、血管新生に関連する遺伝子等であれば、血管平滑筋の増殖や血管新生等を抑制できるので、本発明の組成物を、例えば血管平滑筋の増殖や血管新生を伴う癌または炎症疾患の治療剤または予防剤として使用することができる。
即ち、本発明は、上記説明した本発明の組成物を哺乳動物に投与する癌または炎症疾患の治療方法も提供する。投与対象は、人であることが好ましく、癌または炎症疾患に罹患している人がより好ましい。
また、本発明の組成物は、癌または炎症疾患の治療剤または予防剤に関するin vivoのスクリーニング系においてピーオーシー［POC(Proof of concept)］取得のツールとして使用することもできる。

本発明の組成物は、例えば血液成分等の生体成分(例えば血液、消化管等)中での前記RNAの安定化、副作用の低減または標的遺伝子の発現部位を含む組織または臓器への薬剤集積性の増大等を目的とする製剤としても使用できる。

本発明の組成物を、医薬品の癌または炎症疾患等の治療剤または予防剤として使用する場合、投与経路としては、治療に際し最も効果的な投与経路を使用するのが望ましく、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内または静脈内等の非経口投与または経口投与をあげることができ、好ましくは静脈内投与または筋肉内投与をあげることができ、より好ましくは静脈内投与があげられる。
投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路などによって異なるが、例えばRNAに換算した1日投与量が約0.1μg〜1000mgとなるように投与すればよい。

静脈内投与または筋肉内投与に適当な製剤としては、例えば注射剤があげられ、上述の方法により調製したリポソームAの分散液をそのまま例えば注射剤等の形態として用いることも可能であるが、該分散液から例えば濾過、遠心分離等によって溶媒を除去して使用することも、該分散液を凍結乾燥して使用するまたは例えばマンニトール、ラクトース、トレハロース、マルトースまたはグリシン等の賦形剤を加えた分散液を凍結乾燥して使用することもできる。
注射剤の場合、前記のリポソームAの分散液または前記の溶媒を除去または凍結乾燥したリポソームAに、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液またはアミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインもしくはEDTA等の抗酸化剤またはグリセリン、ブドウ糖もしくは塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。

本発明の癌または炎症疾患の治療剤としては、上記説明した本発明の組成物のうち、RNAが腫瘍または炎症に関連する標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列(以下、配列X₁とする)および該配列と相補的な塩基の配列(以下、相補配列X₁’とする)を含むRNAであり、配列X₁および相補配列X₁’の塩基に結合する糖のあわせて1〜90%が、2’位において修飾基で置換されたリボースであるRNAであって、リポソームAが、リード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜を含むリポソームであり、該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能であるリポソーム、またはカチオン性物質を含むリード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜を含むリポソームであり、該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜であるリポソームである場合の、該リポソームを含有する組成物があげられる。本発明の癌または炎症疾患の治療剤において、癌としては、好ましくは固形癌があげられ、炎症疾患としては、好ましくは血管もしくは血管近傍の炎症があげられる。
また、本発明は、上記説明した本発明の組成物のうち、RNAが腫瘍または炎症に関連する標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列(配列X₁とする)および該配列と相補的な塩基の配列(相補配列X₁’)を含むRNAであり、配列X₁および相補配列X₁’の塩基に結合する糖のあわせて1〜90%が、2’位において修飾基で置換されたリボースであるRNAであって、リポソームAが、リード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜を含むリポソームであり、該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能であるリポソーム、またはカチオン性物質を含むリード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜を含むリポソームであり、該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜であるリポソームである場合の、該リポソームを含有する組成物の、癌または炎症疾患の治療剤、好ましくは固形癌または血管もしくは血管近傍の炎症の治療剤の製造のための使用も提供する。

次に、実施例および試験例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例および試験例に限定されるものではない。

実施例1において用いたRNAは、BCL2遺伝子のmRNAの連続する19塩基の配列(以下、配列X₂とする)および該配列と相補的な塩基の配列(以下、配列X₂’とする)を含む二本鎖RNA［sense; 5’-GmUG mAAmG UmCA mACmA UmGC mCUmG CdTdT-3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースであり、5’-側から2、4、6、8、10、12、14、16、18番目のmが付された塩基に結合する糖は、2’-O-メチルで置換されているリボースである)(配列番号1)、antisense; 5’-mGCmA GmGC mAUmG UmUG mACmU UmCA mCdTdT-3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースであり、5’-側から1、3、5、7、9、11、13、15、17、19番目のmが付された塩基に結合する糖は、2’-O-メチルで置換されているリボースである)(配列番号2)］(以下、2’-OMe BCL2siRNA Exp.1という)であり、配列X₂および相補配列X₂’の塩基に結合するリボースのあわせて50%が、2’-O-メチル基で置換されたリボースである。センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれEurogentec社（ベルギー）から入手し、アニーリングさせることにより二本鎖RNAを調製した。
DOTAP(アバンチポーラルリピッズ社製)/PEG-DSPE(日本油脂社製)/蒸留水(大塚製薬社製)を40 mg/16 mg/1mLとなるように混合し、ボルテックスミキサーで振とう撹拌した。この懸濁液を70℃で0.4 μmのポリカーボネートメンブランフィルター(コスター社製)に10回、0.2 μmのポリカーボネートメンブランフィルター(ワットマン社製)に3回、0.1 μmのポリカーボネートメンブランフィルター(コーニング社製)に10回、さらに0.05 μmのポリカーボネートメンブランフィルター(ワットマン社製)に20回通した。Dynamic light scattering (DLS)で得られたリード粒子の平均粒子径を測定したところ、73.01 nmであった。
一方、EPC(日本油脂社製)/PEG-DSPE(日本油脂社製)/エタノール(和光純薬社製)/水を15 mg/3.125 mg/0.625mL/0.375mLとなるように混合し、脂質二重膜の構成成分の溶液を調製した。
得られたリード粒子の分散液0.875 mLに、2’-OMe BCL2siRNA Exp.1/水を24 mg/1mLとなるように混合して得られた水溶液0.2917mLを混合して複合粒子を調製した。得られた複合粒子の分散液を、脂質二重膜の構成成分の溶液4.667 mLに添加し、続いて1.459 mLの蒸留水を添加し、0.4667 mLの脂質二重膜の構成成分の溶液を添加後、蒸留水を54.31 mLを徐々に加え、エタノールの濃度が5%以下になるよう調整した。得られたリポソーム懸濁液の超遠心(80分間,110,000×g,25℃)を行い、上清を除去した。生じた沈殿を約5 mLの生理食塩水(大塚製薬社製)で再懸濁した。
DLSでリポソームの平均粒子径を測定したところ、92.89 nmであった。また、リポソーム内の2’-OMe BCL2siRNA Exp.1の定量を行ったところ、濃度は1.2460 mg/mLであり、仕込み2’-OMe BCL2siRNA Exp.1の量に対する回収率は88.02%であった。最後に3.270 mLの生理食塩水を添加し,2’-OMe BCL2siRNA Exp.1濃度を0.75 mg/mLに調整し、製剤を得た。

比較例1
比較例1において用いたRNAは、配列X₂および相補配列X₂’を含む二本鎖RNA［sense; 5’-GUG AAG UCA ACA UGC CUG CdTdT-3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースである)(配列番号3)、antisense;5’-GCA GGC AUG UUG ACU UCA CdTdT-3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースである)(配列番号4)］(以下、BCL2siRNA Com.1という)であり。センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれEurogentec社（ベルギー）から入手し、アニーリングさせることにより二本鎖RNAを調製した。
実施例1と同様にして得られたリード粒子の分散液0.5mLに、BCL2siRNA Com.1の24 mg/mL水溶液0.1667 mLを混合して複合粒子を調製した。得られた複合粒子の分散液を、脂質二重膜の構成成分の溶液2.667 mLに添加し、続いて0.8334 mLの蒸留水を添加し、0.2667 mLの脂質二重膜の構成成分の溶液を添加後、蒸留水を31.03 mLを徐々に加え、エタノールの濃度が5%以下になるよう調整した。得られたリポソーム懸濁液の超遠心(80分間,110,000×g,25℃)を行い、上清を除去した。生じた沈殿を約2 mLの生理食塩水(大塚製薬社製)で再懸濁した。
DLSでリポソームの平均粒子径を測定したところ、88.31 nmであった。また、リポソーム内のBCL2siRNA Com.1の定量を行ったところ、濃度は1.7332 mg/mLであり、仕込みBCL2siRNA Com.1の量に対する回収率は90.09%であった。最後に0.3232 mLの生理食塩水を添加し、BCL2siRNA Com.1濃度を1.5 mg/mLに調整し、製剤を得た。

試験例1
実施例1および比較例1で得られた製剤を、雄性Balb/cマウス(6週齢、日本クレア)に、薬液(siRNA濃度 750 μg/mL) 200 μLを尾静脈より、7日間の間隔をあけて2回投与した(投与量は150 μg/mouse)。2回目の投与の後、投与0.5、3、7および24時間後に、尾動脈より1時点につき10 μLの血液を採取し、denaturing solution (4 mol/L グアニジンチオシアネート、25 mmol/L クエン酸ナトリウム、0.1 v/v% 2-メルカプトエタノール、0.5 w/v% sodium N-lauroyl sarcosine；以下、D溶液という) 90 μLを添加して混合し、10 v/v% 血液とした。

実施例1で得られた製剤の投与群の10 v/v% 血液 10 μLに、ジエチルピロカルボナート水溶液(ジエチルピロカルボナートを超純水に対し0.1 v/v%の容量で添加し混合した)10 μL、I.S.溶液(I.S.として濃度が0.3 μmol/Lの前記ジエチルピロカルボナート水溶液)10 μL、D溶液 100 μL、2 mmol/L 酢酸ナトリウム(pH 4.0) 10 μLおよびTE(10mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA)飽和フェノール/クロロホルム溶液(TE飽和フェノールとクロロホルムを1/1の容量比で混合した後の下層を用いた)150 μLを添加して混合し、4℃、132000 x gで10分間遠心分離した。上清 65 μLにGenTLE溶液(GenTLE precipitation carrier (タカラバイオ)を前記ジエチルピロカルボナート水溶液で15倍希釈した)15 μLを添加して混合した後、エタノール 200 μLを添加して混合し、室温で10分間以上静置した。4℃、132000 x gで10分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿に75 v/v% エタノール 200 μLを添加した。4℃、132000 x gで15分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿を風乾した後、再溶解液(ジエチルピロカルボナート/triethylamine/hexafluoroisopropanol/waterを0.1/0.4/30/1000の容量比で混合した)100 μLに溶解した。4℃、132000 x gで10分間遠心分離し、上清を分析試料とし、HPLC法にて定量した。結果を図1に示す。
＜装置＞
HPLC装置;ACQUITY UPLC system (Waters)
質量分析装置;API4000 Q TRAP (Applied Biosystems/MDS Sciex)
解析ソフトウェア;Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems/MDS Sciex)
＜HPLC条件＞
内標準物質(I.S.)
5'-GmUG mAAmG UmCA mACmA UmGC mCUmG CdT-3'(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースであり、5’-側から2、4、6、8、10、12、14、16、18番目のmが付された塩基に結合する糖は、2’-O-メチルで置換されているリボースである)(配列番号5)
5'-mGCmA GmGC mAUmG UmUG mACmU UmCA mCdT-3'(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースであり、5’-側から1、3、5、7、9、11、13、15、17、19番目のmが付された塩基に結合する糖は、2’-O-メチルで置換されているリボースである)(配列番号6)
カラム;Xbridge C18 (3.5 μm、2.1 mm I.D. x 50 mm、Waters)
プレフィルター;Xbridge guard cartridge (3.5 μm、2.1 mm I.D. x 10 mm、Waters)
カラム温度;65℃
移動層;triethylamine/hexafluoroisopropanol/water (0.4/30/1000)：メタノール = 93:7 〜75:25
注入量;25 μL
検出;質量分析装置(イオン化法: electrospray ionization, negative、イオン源温度: 500℃)

比較例1で得られた製剤の投与群の10 v/v% 血液 10 μLに、ジエチルピロカルボナート水溶液(ジエチルピロカルボナートを超純水に対し0.1 v/v%の容量で添加し混合した)10 μL、I.S.溶液(I.S.として濃度が0.3 μmol/Lの前記ジエチルピロカルボナート水溶液)10 μL、D溶液 100 μL、2 mmol/L 酢酸ナトリウム(pH 4.0) 10 μLおよび酸性飽和フェノール/クロロホルム溶液(酸性飽和フェノールとクロロホルムを1/1の容量比で混合した後の下層を用いた)150 μLを添加して混合し、4℃、132000 x gで10分間遠心分離した。上清 65 μLにGenTLE溶液(GenTLE precipitation carrier (タカラバイオ)を前記ジエチルピロカルボナート水溶液で15倍希釈した)15 μLを添加して混合した後、エタノール 200 μLを添加して混合し、室温で10分間以上静置した。4℃、132000 x gで10分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿に75 v/v% エタノール 200 μLを添加した。4℃、132000 x gで15分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿を風乾した後、再溶解液(ジエチルピロカルボナート/triethylamine/hexafluoroisopropanol/waterを0.1/0.4/30/1000の容量比で混合した)100 μLに溶解した。4℃、132000 x gで10分間遠心分離し、上清を分析試料とし、HPLC法にて定量した。結果を図2に示す。
＜装置＞
HPLC装置;ACQUITY UPLC system (Waters)
質量分析装置;API4000 Q TRAP (Applied Biosystems/MDS Sciex)
解析ソフトウェア;Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems/MDS Sciex)
＜HPLC条件＞
内標準物質(I.S.)
5'-GUG AAG UCA ACA UGC CUG dTdT-3'(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースである)(配列番号7)
5'-CAG GCA UGU UGA CUU CAC dTdT-3'(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースである)(配列番号8)
カラム;Xbridge C18 (3.5 μm、2.1 mm I.D. x 50 mm、Waters)
プレフィルター;Xbridge guard cartridge (3.5 μm、2.1 mm I.D. x 10 mm、Waters)
カラム温度;65℃
移動層;triethylamine/hexafluoroisopropanol/water (0.4/30/1000)：メタノール = 93:7 〜75:25
注入量: 25 μL
検出: 質量分析装置(イオン化法: electrospray ionization, negative、イオン源温度: 500℃)

本発明は、簡便で精度の良い血液中のsiRNAの濃度の測定方法も提供する。本発明の血液中のsiRNAの濃度の測定方法としては、上記の試験例1に具体的に示したように、被検液中のsiRNAを、好ましくは被測定のsiRNAと塩基数の異なる核酸をISとして共存下で、核酸と複合体を形成する試薬、例えばGenTLE溶液を加えて、電気的に中性な複合体を形成させ、この複合体を分離後、再溶解液で溶解し、得られた溶液を高速液体クロマトグラフィ法にて分析することで、siRNAの濃度を測定することを特徴とする血液中のsiRNAの濃度の測定方法があげられる。
なお、血液中のsiRNAの濃度の測定は、本発明の血液中のsiRNAの濃度の測定方法に限定されるものではなく、常法に従って血液中のsiRNAの濃度を測定しても構わない。

図1および図2より、実施例1で得られた製剤を投与したマウスでは、比較例1で得られた製剤を投与したマウスに比べて、RNAの血液中濃度推移が高いことを示している。すなわち、配列Xおよび相補配列X’の塩基に結合する糖のあわせて1〜90%が、2’位において修飾基で置換されたリボースである本発明の組成物は、より血中滞留性が改善され、副作用の低減または標的遺伝子の発現部位を含む組織または臓器への薬剤集積性を増大できることが明らかとなった。

実施例2において用いたRNAは、BCL2遺伝子のmRNAの連続する19塩基の配列(以下、配列X₃とする)および該配列と相補的な塩基の配列(以下、相補配列X₃’とする)を含む二本鎖RNA［sense; 5’-GmAA mGUmG AmCA mUCmU UmCA mGCmA AdTdT-3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースであり、5’-側から2、4、6、8、10、12、14、16、18番目のmが付された塩基に結合する糖は、2’-O-メチルで置換されているリボースである)(配列番号9)、antisense; 5’-mUUmG CmUG mAAmG AmUG mUCmA CmUU mCdTdT-3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースであり、5’-側から1、3、5、7、9、11、13、15、17、19番目のmが付された塩基に結合する糖は、2’-O-メチルで置換されているリボースである)(配列番号10)］(以下、2’-OMe BCL2siRNA Exp.2という)であり、配列X₃および相補配列X₃’の塩基に結合するリボースのあわせて50%が、2’-O-メチル基で置換されたリボースである。センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ北海道システムサイエンスから入手し、アニーリングさせることにより二本鎖RNAを調製した。
DOTAP(アバンチポーラルリピッズ社製)/PEG-DSPE(日本油脂社製)/蒸留水(大塚製薬社製)を40 mg/16 mg/1 mLとなるように混合し、ボルテックスミキサーで振とう撹拌した。この懸濁液を70℃で0.4 μmのポリカーボネートメンブランフィルター(コスター社製)に10回、0.2 μmのポリカーボネートメンブランフィルター(ワットマン社製)に3回、0.1 μmのポリカーボネートメンブランフィルター(コーニング社製)に10回、さらに0.05 μmのポリカーボネートメンブランフィルター(ワットマン社製)に20回通した。Dynamic light scattering (DLS)で得られたリード粒子の平均粒子径を測定したところ、70.71 nmであった。
一方、EPC(日本油脂社製)/PEG-DSPE(日本油脂社製)/エタノール(和光純薬社製)/水を15 mg/3.125 mg/0.625 mL/0.375 mLとなるように混合し、脂質二重膜の構成成分の溶液を調製した。
得られたリード粒子の分散液0.225 mLに、2’-OMe BCL2siRNA Exp.2/水を24 mg/1 mLとなるように混合して得られた水溶液0.075 mLを混合して複合粒子を調製した。得られた複合粒子の分散液を、脂質二重膜の構成成分の溶液1.2 mLに添加し、続いて0.375 mLの蒸留水を添加し、さらにEPC/PEG-DSPEを62.5 mg/62.5 mg/mLになるように40vol%エタノールに溶解した溶液0.12 mLを添加後、蒸留水を13.965 mLを徐々に加え、エタノールの濃度が5vol%以下になるよう調整した。得られたリポソーム懸濁液の超遠心(80分間,110,000×g,25℃)を行い、上清を除去した。生じた沈殿を生理食塩水(大塚製薬社製)で再懸濁した。
DLSでリポソームの平均粒子径を測定したところ、88.52 nmであった。また、リポソーム内の2’-OMe BCL2siRNA Exp.2の定量を行ったところ、濃度は2.307 mg/mLであり、仕込み2’-OMe BCL2siRNA Exp.2の量に対する回収率は87.2%であった。最後に0.366 mLの生理食塩水を添加し,2’-OMe BCL2siRNA Exp.2濃度を1.5 mg/mLに調整し、製剤を得た。

実施例3において用いたRNAは、配列X₃および相補配列X₃’を含む二本鎖RNA［sense; 5’-GmAA mGUmG AmCA mUCmU UmCA mGCmA AdTdT-3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースであり、5’-側から2、4、6、8、10、12、14、16、18番目のmが付された塩基に結合する糖は、2’-O-メチルで置換されているリボースである)(配列番号11)、antisense; 5’-UUG CUG AAG AUG UCA CUU CdTdT-3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースである)(配列番号12)］(以下、2’-OMe BCL2siRNA Exp.3という)であり、配列X₃および相補配列X₃’の塩基に結合するリボースの24%が、2’-O-メチル基で置換されたリボースである。センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ北海道システムサイエンスから入手し、アニーリングさせることにより二本鎖RNAを調製した。
2’-OMe BCL2siRNA Exp.2を2’-OMe BCL2siRNA Exp.3にした以外、実施例2と同様にして製剤を得た。
DLSでリポソームの平均粒子径を測定したところ、91.42 nmであった。

比較例2
比較例2において用いたRNAは、配列X₃および相補配列X₃’を含む二本鎖RNA［sense; 5’-GAA GUG ACA UCU UCA GCA AdTdT-3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースである)(配列番号13)、antisense; 5’-UUG CUG AAG AUG UCA CUU CdTdT-3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースである)(配列番号14)］(以下、BCL2siRNA Com.2という)である。センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ北海道システムサイエンスから入手し、アニーリングさせることにより二本鎖RNAを調製した。
2’-OMe BCL2siRNA Exp.2をBCL2siRNA Com.2にした以外、実施例2と同様にして製剤を得た。
DLSでリポソームの平均粒子径を測定したところ、96.52 nmであった。

試験例2
実施例2、3および比較例2で得られた製剤を、雄性Balb/cマウス(6週齢、日本クレア)に、薬液(siRNA濃度 750 μg/mL) 200 μLを尾静脈より、7日間の間隔をあけて2回投与した(投与量は150 μg/mouse)。2回目の投与の後、投与0.5、3、7および24時間後に、尾動脈より1時点につき10 μLの血液を採取し、denaturing solution (4 mol/L グアニジンチオシアネート、25 mmol/L クエン酸ナトリウム、1 mmol/L ジチオスレイトール、0.5 w/v% sodium N-lauroyl sarcosine；以下、D溶液という) 90 μLを添加して混合し、10 v/v% 血液とした。
各投与群の10 v/v% 血液 50 μLに、ジエチルピロカルボナート水溶液(ジエチルピロカルボナートを超純水に対し0.1 v/v%の容量で添加し混合した)5 μL、I.S.溶液(I.S.として濃度が0.3μmol/Lの前記ジエチルピロカルボナート水溶液)10 μL、D溶液 50 μL、2 mmol/L 酢酸ナトリウム(pH 4.0) 10 μLおよび酸性飽和フェノール/クロロホルム溶液(酸性飽和フェノールとクロロホルムを1/1の容量比で混合した後の下層を用いた)150 μLを添加して混合し、4℃、132000 x gで10分間遠心分離した。上清 65 μLにGenTLE溶液(GenTLE precipitation carrier (タカラバイオ)を前記ジエチルピロカルボナート水溶液で15倍希釈した)15 μLを添加して混合した後、エタノール 200 μLを添加して混合し、室温で10分間以上静置した。4℃、132000 x gで10分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿に75 v/v% エタノール 200 μLを添加した。4℃、132000 x gで15分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿を風乾した後、再溶解液(ジエチルピロカルボナート/triethylamine/hexafluoroisopropanol/waterを0.1/0.4/30/1000の容量比で混合した)100 μLに溶解した。4℃、132000 x gで10分間遠心分離し、上清を分析試料とし、HPLC法にて定量した。結果をそれぞれ図3〜5に示す。
＜装置＞
HPLC装置;ACQUITY UPLC system (Waters)
質量分析装置;API4000 Q TRAP (Applied Biosystems/MDS Sciex)
解析ソフトウェア;Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems/MDS Sciex)
＜HPLC条件＞
実施例2; 5’-GmUG mAAmG UmCA mACmA UmGC mCUmG CdT-3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースであり、5’-側から2、4、6、8、10、12、14、16、18番目のmが付された塩基に結合する糖は、2’-O-メチルで置換されているリボースである)(配列番号15)
5’-mGCmA GmGC mAUmG UmUG mACmU UmCA mCdT-3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースであり、5’-側から1、3、5、7、9、11、13、15、17、19番目のmが付された塩基に結合する糖は、2’-O-メチルで置換されているリボースである)(配列番号16)
実施例3; 5’- GmUG mAAmG UmCA mACmA UmGC mCUmG CdT -3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースであり、5’-側から2、4、6、8、10、12、14、16、18番目のmが付された塩基に結合する糖は、2’-O-メチルで置換されているリボースである)(配列番号17)
5’-GCA GGC AUG UUG ACU UCA CdT-3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースである)(配列番号18)
比較例2; 5’- GUG AAG UCA ACA UGC CUG CdT -3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースである)(配列番号19)
5’-GCA GGC AUG UUG ACU UCA CdT-3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースである)(配列番号20)
カラム;Xbridge C18 (3.5 μm、2.1 mm I.D. x 50 mm、Waters)
プレフィルター;Xbridge guard cartridge (3.5 μm、2.1 mm I.D. x 10 mm、Waters)
カラム温度;65℃
移動層;triethylamine/hexafluoroisopropanol/water (0.4/30/1000)：メタノール = 93:7 〜75:25
注入量: 25 μL
検出: 質量分析装置(イオン化法: electrospray ionization, negative、イオン源温度: 500℃)

図3〜5より、実施例2および3で得られた製剤を投与したマウスでは、比較例2で得られた製剤を投与したマウスに比べて、RNAの血液中濃度推移が高いことを示している。すなわち、配列Xおよび相補配列X’の塩基に結合する糖のあわせて1〜90%が、2’位において修飾基で置換されたリボースである本発明の組成物は、より血中滞留性が改善され、副作用の低減または標的遺伝子の発現部位を含む組織または臓器への薬剤集積性を増大できることが明らかとなった。

実施例4において用いたRNAは、BCL2遺伝子のmRNAの連続する23塩基の配列(以下、配列X₄とする)および該配列と相補的な塩基の配列(以下、相補配列X₄’とする)を含む二本鎖RNA［sense; 5’-GmAA mGUmG AmCA mUCmU UmCA mGCmA AmAU mAAdA dC-3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースであり、5’-側から2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22番目のmが付された塩基に結合する糖は、2’-O-メチルで置換されているリボースである)(配列番号21)、antisense; 5’-GUmU UmAU mUUmG CmUG mAAmG AmUG mUCmA CmUU mCmUmU-3’(5’-側から3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25〜27番目のmが付された塩基に結合する糖は、2’-O-メチルで置換されているリボースである)(配列番号22)］(以下、2’-OMe BCL2siRNA Exp.4という)であり、配列X₄および相補配列X₄’の塩基に結合するリボースのあわせて50%が、2’-O-メチル基で置換されたリボースである。センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ北海道システムサイエンスから入手し、アニーリングさせることにより二本鎖RNAを調製した。
DOTAP(アバンチポーラルリピッズ社製)/PEG-DSPE(日本油脂社製)/蒸留水(大塚製薬社製)を40 mg/16 mg/1mLとなるように混合し、ボルテックスミキサーで振とう撹拌した。この懸濁液を70℃で0.4 μmのポリカーボネートメンブランフィルター(コスター社製)に10回、0.2 μmのポリカーボネートメンブランフィルター(ワットマン社製)に5回、0.1 μmのポリカーボネートメンブランフィルター(コーニング社製)に10回、さらに0.05 μmのポリカーボネートメンブランフィルター(ワットマン社製)に20回通した。Dynamic light scattering (DLS)で得られたリード粒子の平均粒子径を測定したところ、72.93 nmであった。
一方、EPC(日本油脂社製)/PEG-DSPE(日本油脂社製)/エタノール(和光純薬社製)/水を15 mg/3.125 mg/0.625 mL/0.375 mLとなるように混合し、脂質二重膜の構成成分の溶液を調製した。
得られたリード粒子の分散液0.0125 mLに、2’-OMe BCL2siRNA Exp.4/水を24 mg/1 mLとなるように混合して得られた水溶液0.00417 mLを混合して複合粒子を調製した。得られた複合粒子の分散液を、脂質二重膜の構成成分の溶液0.06667 mLに添加し、続いて0.02083 mLの蒸留水を添加した。さらにEPC/PEG-DSPEを62.5mg/62.5mg/mLになるように40vol%エタノールに溶解した溶液を0.00667 mL添加後、蒸留水を0.7758 mLを徐々に加え、エタノールの濃度が5vol%以下になるよう調整した。得られたリポソーム懸濁液を食塩水で等張化した。さらに生理食塩水(大塚製薬社製)で最終液量を1 mLとすることで、2’-OMe BCL2siRNA Exp.4濃度を0.1 mg/mLに調整し、製剤を得た。
DLSでリポソームの平均粒子径を測定したところ、87.50 nmであった。

比較例3
比較例3において用いたRNAは、配列X₄および相補配列X₄’を含む二本鎖RNA［sense; 5’-GAA GUG ACA UCU UCA GCA AAU AAdA dC-3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースである)(配列番号23)、antisense; 5’-GUU UAU UUG CUG AAG AUG UCA CUU CUU-3’(配列番号24)］(以下、BCL2siRNA Com.3という)である。センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ北海道システムサイエンスから入手し、アニーリングさせることにより二本鎖RNAを調製した。
2’-OMe BCL2siRNA Exp.4をBCL2siRNA Com.3にした以外、実施例4と同様にして製剤を得た。
DLSでリポソームの平均粒子径を測定したところ、94.32 nmであった。

試験例3
実施例4および比較例3で得られた製剤を、雄性Balb/cマウス(6週齢、日本クレア)に、薬液(siRNA濃度50 μg/mL) 100 μLを尾静脈より、7日間の間隔をあけて2回投与した(投与量は5 μg/mouse)。2回目の投与の後、投与3時間後に、尾動脈より1時点につき10 μLの血液を採取し、denaturing solution (4 mol/L グアニジンチオシアネート、25 mmol/L クエン酸ナトリウム、1 mmol/L ジチオスレイトール、0.5 w/v% sodium N-lauroyl sarcosine；以下、D溶液という) 90 μLを添加して混合し、10 v/v% 血液とした。
各投与群の10 v/v% 血液 100 μLに、ジエチルピロカルボナート水溶液(ジエチルピロカルボナートを超純水に対し0.1 v/v%の容量で添加し混合した)10 μL、I.S.溶液(I.S.として濃度が0.3μmol/Lの前記ジエチルピロカルボナート水溶液)10 μL、2 mmol/L 酢酸ナトリウム(pH 4.0) 10 μLおよび酸性飽和フェノール/クロロホルム溶液(酸性飽和フェノールとクロロホルムを1/1の容量比で混合した後の下層を用いた)150 μLを添加して混合し、4℃、132000 x gで10分間遠心分離した。上清 30 μLにGenTLE溶液(GenTLE precipitation carrier (タカラバイオ)を前記ジエチルピロカルボナート水溶液で15倍希釈した)10 μLを添加して混合した後、エタノール100 μLを添加して混合し、室温で10分間以上静置した。4℃、132000 x gで10分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿に75 v/v%エタノール 100 μLを添加した。4℃、132000 x gで15分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿を風乾した後、再溶解液(ジエチルピロカルボナート/triethylamine/hexafluoroisopropanol/waterを0.1/0.4/30/1000の容量比で混合した)50 μLに溶解した。4℃、132000 x gで10分間遠心分離し、上清を分析試料とし、HPLC法にて定量した。結果をそれぞれ図6および図7に示す。
＜装置＞
HPLC装置;ACQUITY UPLC system (Waters)
質量分析装置;API4000 Q TRAP (Applied Biosystems/MDS Sciex)
解析ソフトウェア;Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems/MDS Sciex)
＜HPLC条件＞
内標準物質(I.S.)
実施例4; 5’-GmUG mAAmG UmCA mACmA UmGC mCUmG CdT-3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースであり、5’-側から2、4、6、8、10、12、14、16、18番目のmが付された塩基に結合する糖は、2’-O-メチルで置換されているリボースである)(配列番号25)
5’-mGCmA GmGC mAUmG UmUG mACmU UmCA mCdT-3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースであり、5’-側から1、3、5、7、9、11、13、15、17、19番目のmが付された塩基に結合する糖は、2’-O-メチルで置換されているリボースである)(配列番号26)
比較例3; 5’- GUG AAG UCA ACA UGC CUG CdT -3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースである)(配列番号27)
5’-GCA GGC AUG UUG ACU UCA CdT-3’(dが付された塩基に結合する糖は、デオキシリボースである)(配列番号28)
カラム;Xbridge C18 (3.5 μm、2.1 mm I.D. x 50 mm、Waters)
プレフィルター;Xbridge guard cartridge (3.5 μm、2.1 mm I.D. x 10 mm、Waters)
カラム温度;65℃
移動層;triethylamine/hexafluoroisopropanol/water (0.4/30/1000)：メタノール = 93:7 〜75:25
注入量: 25 μL
検出: 質量分析装置(イオン化法: electrospray ionization, negative、イオン源温度: 500℃)

図6および図7より、実施例4で得られた製剤を投与したマウスでは、比較例3で得られた製剤を投与したマウスに比べて、RNAの血液中濃度推移が高いことを示している。すなわち、配列Xおよび相補配列X’の塩基に結合する糖のあわせて1〜90%が、2’位において修飾基で置換されたリボースである本発明の組成物は、より血中滞留性が改善され、副作用の低減または標的遺伝子の発現部位を含む組織または臓器への薬剤集積性を増大できることが明らかとなった。

本発明の標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な塩基の配列を含むRNAを封入したリポソームを含有する組成物を、ほ乳類等に投与することにより、該標的遺伝子の発現を抑制することができる。

配列番号1-実施例1のsiRNA センス鎖
配列番号2-実施例1のsiRNA アンチセンス鎖
配列番号3-比較例1のsiRNA センス鎖
配列番号4-比較例1のsiRNA アンチセンス鎖
配列番号5-実施例1のsiRNA センス鎖用のIS
配列番号6-実施例1のsiRNA アンチセンス鎖用のIS
配列番号7-比較例1のsiRNA センス鎖のIS
配列番号8-比較例1のsiRNA アンチセンス鎖のIS
配列番号9-実施例2のsiRNA センス鎖
配列番号10-実施例2のsiRNA アンチセンス鎖
配列番号11-実施例3のsiRNA センス鎖
配列番号12-実施例3のsiRNA アンチセンス鎖
配列番号13-比較例2のsiRNA センス鎖
配列番号14-比較例2のsiRNA アンチセンス鎖
配列番号15-実施例2のsiRNA センス鎖用のIS
配列番号16-実施例2のsiRNA アンチセンス鎖用のIS
配列番号17-実施例3のsiRNA センス鎖用のIS
配列番号18-実施例3のsiRNA アンチセンス鎖用のIS
配列番号19-比較例2のsiRNA センス鎖のIS
配列番号20-比較例2のsiRNA アンチセンス鎖のIS
配列番号21-実施例4のsiRNA センス鎖
配列番号22-実施例4のsiRNA アンチセンス鎖
配列番号23-比較例3のsiRNA センス鎖
配列番号24-比較例3のsiRNA アンチセンス鎖
配列番号25-実施例4のsiRNA センス鎖用のIS
配列番号26-実施例4のsiRNA アンチセンス鎖用のIS
配列番号27-比較例3のsiRNA センス鎖のIS
配列番号28-比較例3のsiRNA アンチセンス鎖のIS
配列番号29-bcl2 mRNA

Claims (12)

1. 標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列(以下、配列Xとする)および該配列Xと相補的な塩基の配列(以下、相補配列X’とする)を含むRNAを封入したリポソームを含有し、配列Xおよび相補配列X’の塩基に結合する糖のあわせて30〜55%が、2’位において2’-O-メチル、2’-O-エチルおよび2’-フルオロのいずれかで置換されたリボースであり、該リポソームが標的遺伝子の発現部位を含む組織または臓器に到達するリポソームである、組成物。
2. リポソームが、静脈内投与可能な大きさのリポソームである、請求項1記載の組成物。
3. RNAが、RNA干渉(RNAi)を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するRNAである、請求項1または2記載の組成物。
4. 標的遺伝子が、腫瘍または炎症に関連する遺伝子である、請求項1〜3のいずれかに記載の組成物。
5. 標的遺伝子が、血管新生に関連する遺伝子である、請求項1〜4のいずれかに記載の組成物。
6. RNAを封入したリポソームが、リード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜を含むリポソームであり、
   該脂質二重膜の構成成分がエタノールに可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度でエタノールを含む液に分散可能である、請求項1〜5のいずれかに記載の組成物。
7. RNAを封入したリポソームが、カチオン性物質を含むリード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜を含むリポソームであり、
   該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、請求項1〜6のいずれかに記載の組成物。
8. リード粒子と、腫瘍または炎症に関連する標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列(以下、配列X₁とする)および該配列と相補的な塩基の配列(以下、相補配列X₁’とする)を含むRNAであり、配列X₁および相補配列X₁’の塩基に結合する糖のあわせて30〜55%が、2’位において2’-O-メチル、2’-O-エチルおよび2’-フルオロのいずれかで置換されたリボースであるRNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜を含むリポソームを含有し、
   該脂質二重膜の構成成分がエタノールに可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度でエタノールを含む液に分散可能である、癌または炎症疾患の治療剤。
9. リード粒子が、カチオン性物質を含むリード粒子であり、脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、請求項8記載の癌または炎症疾患の治療剤。
10. カチオン性物質を含むリード粒子と、腫瘍または炎症に関連する標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列(配列X₁)および該配列と相補的な塩基の配列(相補配列X₁’)を含むRNAであり、配列X₁および相補配列X₁’の塩基に結合する糖のあわせて30〜55%が、2’位において2’-O-メチル、2’-O-エチルおよび2’-フルオロのいずれかで置換されたリボースであるRNAとを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質二重膜を含有し、
    該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、癌または炎症疾患の治療剤。
11. RNAが、RNA干渉(RNAi)を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するRNAである、請求項8〜10のいずれかに記載の癌または炎症疾患の治療剤。
12. 腫瘍または炎症に関連する標的遺伝子が、血管新生に関与する遺伝子である、請求項8〜11のいずれかに記載の癌または炎症疾患の治療剤。
    

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