JP5789863B2 - Evaluation method of Draise eye irritation - Google Patents
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Description
本発明は、被験物質の眼等に対する刺激性を定量的に評価することが可能で、ドレイズ眼刺激性試験の代替法となり得る新規な刺激性評価方法に関する。 The present invention relates to a novel method for evaluating irritation, which can quantitatively evaluate the irritation of a test substance to the eye or the like and can be an alternative to the Draise eye irritation test.
化粧品や食品に含まれる界面活性剤の刺激性を評価する手法として、動物実験（ドレイズ試験）が知られている。ドレイズ試験（Draize Test）は、１９４４年にジョン・ドレイズ（John H. Draize）らによって考案された急性毒性試験であり、ドレイズ眼刺激性試験とドレイズ皮膚刺激性試験に分類される。 As a method for evaluating the irritation of a surfactant contained in cosmetics and foods, an animal experiment (drape test) is known. The Draize Test is an acute toxicity test devised by John H. Draize et al. In 1944, and is classified into a Draise eye irritation test and a Draise skin irritation test.
ドレイズ眼刺激性試験法は、ウサギの眼瞼へ被験物質を点眼し、角膜、虹彩、結膜の3つの部位に対する反応を判定基準に従って経時的に肉眼判定した結果を評価する試験法であり、特に化粧品に含有する界面活性剤の刺激性評価に多用されている。判定は、角膜８０点、虹彩１０点、結膜２０点、合計１１０点で評価され、観察期間内で得られた最大評価点を用いて評価する「Kay and Calandra」の刺激区分は、病理組織学的な変化とよく相関するとされている。 The Draize eye irritation test method is a test method that evaluates the result of visual inspection over time in accordance with the criteria for the response to the three parts of the cornea, iris, and conjunctiva by instilling the test substance into the rabbit eyelid. Is often used for the evaluation of the irritation of surfactants contained in Judgment is based on 80 points of cornea, 10 points of iris, 20 points of conjunctiva, 110 points in total, and the stimulation category of “Kay and Calandra” evaluated using the maximum evaluation point obtained during the observation period is histopathology It is well correlated with general changes.
しかしながら、前記ドレイズ試験は、動物実験故の欠点も多数存在する。例えば、ドレイズ試験を行った各施設間において、同一試験物質の評価結果に著しい差異が生じたことが報告されている。この研究によって示された差異は、生育環境・試験環境の違いによって生じたウサギの個体差、刺激応答性の変化に起因していると考えられる。また、刺激応答性を視覚で判断することにより評価体系に主観的要素が含まれ、最終的に各研究施設間で差異が生じたものと考えられる。 However, the dreze test has many drawbacks due to animal experiments. For example, it has been reported that there was a significant difference in the evaluation results of the same test substance between the facilities where the Draize test was conducted. The difference shown by this study is thought to be due to the individual differences in rabbits and the changes in stimulus responsiveness caused by differences in growth and test environments. Moreover, it is thought that the subjective system was included in the evaluation system by judging the stimulus responsiveness visually, and the difference was finally caused between each research facility.
また、動物愛護の観点からも問題が多い。特に、ドレイズ眼刺激性試験法は、意識のある状態で拘束したウサギの眼に対し、被験物質を直接点眼することから、残酷な印象を与えるものとして動物愛護団体から強い批判を受けている。 There are also many problems from the viewpoint of animal welfare. In particular, the Draize Eye Irritation Test Method has received strong criticism from animal welfare organizations as a cruel impression because it directly instills the test substance into the eyes of rabbits restrained in a conscious state.
さらに、誤評価や低信頼性の問題もある。例えば、強刺激性物質を低刺激性物質として誤認する確率は１０．３％〜３８．７％、低刺激性物質を非刺激性物質と誤認する確率は３．５％〜５．５％であるとの調査報告があり、ドレイズ試験で低刺激性物質あるいは非刺激性物質と評価された物質の扱いには注意が必要である。実際、例えば化粧品開発の現場においては、ドレイズ試験による評価の後、直接、人の眼を用いて界面活性剤の刺激性を評価しているのが実情である。 In addition, there are problems of mis-evaluation and low reliability. For example, the probability of misidentifying a highly irritating substance as a hypoallergenic substance is 10.3% to 38.7%, and the probability of misidentifying a hypoallergenic substance as a non-irritating substance is 3.5% to 5.5%. There is a report that there is a research report, and care must be taken when handling substances evaluated as hypoallergenic or non-irritating by the Draize test. Actually, for example, in the field of cosmetics development, after the evaluation by the drape test, the actual condition is that the irritation of the surfactant is evaluated directly using the human eye.
このような状況から、経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）においては、ドレイズ代替法として、ウシ角膜摘出試験法と単離ニワトリ眼球試験法が認可されている。しかしながら、これらの方法のいずれもが動物の組織、器官を用いた試験法であり、動物実験代替法とはなり得ない。 Under such circumstances, the Organization for Economic Co-operation and Development (OECD) has approved the bovine keratoectomy test method and the isolated chicken eye test method as alternatives to drapes. However, any of these methods is a test method using animal tissues and organs and cannot be an alternative to animal experiments.
そこで、動物の組織や器官等を用いない動物実験代替法についての研究も進められており、脂質二重膜小胞体であるリポソームを用いた眼刺激判定方法も提案されている（特許文献１を参照）。 Therefore, research on alternative methods for animal experiments that do not use animal tissues or organs is also underway, and an eye irritation determination method using liposomes that are lipid bilayer vesicles has also been proposed (see Patent Document 1). reference).
特許文献１記載の眼刺激判定方法では、マーカーを内包するリポソームからなる眼刺激判定試薬を用い、このマーカーを内包するリポソームと被験物質とを作用させ、リポソームに内包されるマーカーの漏出やリポソームの膜配向性変化の度合から、被験物質の眼刺激性を評価している。
In the eye irritation determination method described in
しかしながら、特許文献１に記載される方法では、眼刺激性強度を定量的に評価することは難しく、ドレイズ試験のような段階的な評価は難しい。また、特許文献１では、リポソーム中のマーカーが５０％漏洩された時の活性剤濃度に基づいて眼刺激性強度を判定しているが、マーカーが５０％漏洩した時点を見極めることは難しく、誤評価や測定者による個人差が出やすいという問題もある。
However, with the method described in
本発明は、前述の従来の実情に鑑みて提案されたものであり、動物の組織や器官等を用いることなく、定量的に眼刺激性強度を評価することが可能で、ドレイズ代替法となり得る新規な刺激性評価方法を提供することを目的とする。 The present invention has been proposed in view of the above-described conventional situation, and can evaluate the eye irritation intensity quantitatively without using animal tissues or organs, and can be an alternative to Draise. An object is to provide a novel method for evaluating irritation.
リポソームに界面活性剤等の被験物質を加えると、いわゆる膜ダイナミクスが観察される。本発明者らは、膜変形、表面積変化、体積変化の定量的解析するとともに、被験物質により引き起こされる膜ダイナミクスの作用メカニズムを解明し、本発明を案出するに至った。 When a test substance such as a surfactant is added to the liposome, so-called membrane dynamics is observed. The present inventors have quantitatively analyzed membrane deformation, surface area change, and volume change, as well as elucidated the mechanism of action of membrane dynamics caused by the test substance, and have come up with the present invention.
本発明のドレイズ眼刺激性の評価方法は、リポソームを含む試験溶液に被験物質を加え、前記リポソームの大きさの変化に基づいて前記被験物質のドレイズ眼刺激性を評価することを特徴とする。
本発明は、前記リポソームの表面積の縮小スピードを画像解析により算出し、得られた算出結果を前記被験物質のドレイズ眼刺激性の指標とすることを特徴とする。本発明は、前記リポソームを不飽和リン脂質により形成し、初期の直径を１μｍ以上とすることを特徴とする。本発明は、前記被験物質は界面活性剤であることを特徴とする。
The method for evaluating the irritation of the drayed eye of the present invention is characterized in that a test substance is added to a test solution containing liposomes, and the draised eye irritation of the test substance is evaluated based on a change in the size of the liposomes.
The present invention is characterized in that the reduction speed of the surface area of the liposome is calculated by image analysis, and the obtained calculation result is used as an index of the dray eye irritation of the test substance. The present invention is characterized in that the liposome is formed of an unsaturated phospholipid and has an initial diameter of 1 μm or more. The present invention is characterized in that the test substance is a surfactant.
本発明の刺激性評価方法は、脂質二重膜小胞体であるリポソームの膜ダイナミクスを観察することで行われ、動物の組織や器官等を用いる必要がないので、動物実験の欠点（動物の個体差による問題や動物愛護の観点での問題、誤評価や低信頼性の問題）が解消される。また、本発明において、リポソームの膜ダイナミクス（大きさの変化）は、例えば画像解析により定量化され、誤評価や測定者の個人差等の問題も解消される。 The stimulation evaluation method of the present invention is performed by observing the membrane dynamics of liposomes, which are lipid bilayer vesicles, and does not require the use of animal tissues or organs. Problems due to differences, problems from the viewpoint of animal welfare, problems of incorrect evaluation and low reliability) are solved. Further, in the present invention, the membrane dynamics (change in size) of the liposome is quantified by, for example, image analysis, and problems such as erroneous evaluation and individual differences among measurers are solved.
本発明によれば、ドレイズ代替法となり得る、あるいはドレイズ試験よりも精度の高い的確な評価が可能な刺激性評価方法を提供することが可能である。また、リポソームの作製に用いる脂質は非常に安価であることから、低コスト化が可能な刺激性評価方法を提供することが可能である。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, it is possible to provide the irritation | stimulation evaluation method which can become a draise alternative method or can perform accurate evaluation with higher precision than a drape test. Moreover, since the lipid used for preparation of liposome is very inexpensive, it is possible to provide a method for evaluating irritation capable of reducing the cost.
以下、本発明を適用した刺激性評価方法の実施形態について、詳細に説明する。 Hereinafter, an embodiment of a stimulation evaluation method to which the present invention is applied will be described in detail.
生体膜は、細胞内外を脂質２分子膜で隔て閉鎖系を構築することにより、細胞外物質の取り込みや細胞内物質の排出を制御している。生体膜を構成する主成分は、親水基と疎水基を持つ両親媒性分子のリン脂質である。リン脂質は、水溶液中で自己集合し、ミセルや２分子膜小胞（リポソーム）を自発的に形成する。リポソームは、生体膜と類似の構造と組成を有し、リポソームの中でも直径１０μｍ程度のリポソームは、巨大リポソームと呼ばれる。 Biological membranes control the uptake of extracellular substances and the discharge of intracellular substances by constructing a closed system by separating the inside and outside of cells with a lipid bilayer membrane. The main component constituting the biological membrane is a phospholipid of an amphiphilic molecule having a hydrophilic group and a hydrophobic group. Phospholipids self-assemble in an aqueous solution and spontaneously form micelles and bilayer vesicles (liposomes). Liposomes have a structure and composition similar to biological membranes. Among liposomes, liposomes having a diameter of about 10 μm are called giant liposomes.
本発明では、生体膜と類似した組成・構造・曲率を有する巨大リポソームの膜ダイナミクスを利用し、被験物質の刺激性を評価する。 In the present invention, the irritation of a test substance is evaluated using the membrane dynamics of giant liposomes having a composition, structure, and curvature similar to those of biological membranes.
使用するリポソームは、細胞に近い大きさであることが好ましく、その曲率がなるべく大きいことが好ましい。具体的には、直径が１μｍ以上の巨大リポソームを用いることが好ましい。また、リポソームの脂質二重膜を構成する脂質としては、任意のものを用いることができる、例えば不飽和リン脂質（ＤＯＰＣ：dioleoyl L-α phosphatidylcholine）や飽和リン脂質（ＤＰＰＣ：dipalmitoyl L-α phosphatidylcoline）等を挙げることができる。 It is preferable that the liposome to be used has a size close to that of cells, and its curvature is preferably as large as possible. Specifically, it is preferable to use giant liposomes having a diameter of 1 μm or more. Moreover, any lipid can be used as the lipid bilayer membrane of the liposome, such as unsaturated phospholipid (DOPC: dioleoyl L-α phosphatidylcholine) or saturated phospholipid (DPPC: dipalmitoyl L-α phosphatidylcoline). And the like.
前記巨大リポソームは、いわゆる静置水和法等によって形成することができる。あるいは、水性溶液相上に油性溶液相を配するとともに、油水界面に外層脂質膜となる脂質単分子膜を形成しておき、油性液体相中に内層脂質膜が形成された液滴を導入し、前記液滴を構成する水性溶液と前記水性溶液相を構成する水性溶液に比重差を付与することで、重力により前記液滴を水性溶液中に移行させ、前記内層脂質膜の外側に外層脂質膜を形成することで作製することもできる。 The giant liposome can be formed by a so-called stationary hydration method or the like. Alternatively, an oily solution phase is arranged on the aqueous solution phase, a lipid monomolecular film that becomes an outer lipid membrane is formed at the oil-water interface, and a droplet having an inner lipid membrane formed in the oily liquid phase is introduced. By applying a specific gravity difference between the aqueous solution constituting the droplet and the aqueous solution constituting the aqueous solution phase, the droplet is transferred into the aqueous solution by gravity, and the outer lipid layer is placed outside the inner lipid membrane. It can also be produced by forming a film.
図１は、後者の方法による巨大リポソームの作製過程を模式的に示すものである。リポソームの作製のためには、油水界面に脂質単分子膜を形成し、内層脂質膜が形成された液滴を油性溶液から水性溶液へと移行する必要がある。そこで、本発明においても、図１（ａ）に示すように、水性溶液相１上に油性溶液相２を形成し、これら水性溶液相１と油性溶液相２の界面（油水界面）に脂質単分子膜３を形成しておく。脂質単分子膜３は、油性溶液相２中に各種リン脂質等の脂質成分を添加することにより容易に形成することが可能である。油性溶液相２中に添加された脂質成分は、各脂質分子４の疎水基部分４ａが油性溶液相２側になり、親水基部分４ｂが水性溶液相１側になるように油水界面において整列し、全ての脂質分子４が一定方向を向いた脂質単分子膜３が油水界面に形成される。
FIG. 1 schematically shows a process for producing giant liposomes by the latter method. In order to produce liposomes, it is necessary to form a lipid monomolecular film at the oil-water interface and transfer the droplets with the inner lipid membrane formed from the oily solution to the aqueous solution. Therefore, also in the present invention, as shown in FIG. 1 (a), an
油水界面に脂質単分子膜３を形成した後、油性溶液相２中に内層脂質膜６を形成したＷ／Ｏ液滴５を導入する。このＷ／Ｏ液滴５は、水性溶液の液滴７の周囲に内層脂質膜６を形成したものであり、内層脂質膜６は、親水基部分８ｂが水性溶液粒子６側を向き、疎水基部分８ａが外側に向くように各脂質分子８が整列した単分子膜として形成されている。
After the
なお、前記Ｗ／Ｏ液滴５は、別途作製したものを前記油性溶液相２中に導入してもよいし、油性溶液相２中で形成するようにしてもよい。後者の場合、例えば油性溶液相２を下層油性溶液相と上層油性溶液相の２層に分け、上層油性溶液相中に内層脂質膜形成用の脂質成分を添加しておく。そして、上層油性溶液相中に水性溶液の液滴７をマイクロキャピラリ等を用いて導入する。すると、水性溶液の液滴７に脂質成分の親水基部分８ｂが引き寄せられ、水性溶液の液滴７の周囲に前記内層脂質膜６が単分子膜として形成される。
The W /
油性溶液相２中に前記Ｗ／Ｏ液滴５を導入すると、重力によってＷ／Ｏ液滴５は沈んでいき、図１（ｂ）に示すように、油水界面に到達する。油性溶液相２を構成する油性溶液に比べて液滴７を構成する水性溶液の方が重いからである。
When the W /
ただし、Ｗ／Ｏ液滴５と水性溶液相１はいずれも水性溶液により構成されているので、例えばＷ／Ｏ液滴４の液滴７を構成する水性溶液と水性溶液相１を構成する水性溶液が同じである場合、Ｗ／Ｏ液滴５はそれ以上降下することができず、水性溶液相１中に移行させることができない。そこで、本発明においては、Ｗ／Ｏ液滴５の液滴７を構成する水性溶液と水性溶液相１を構成する水性溶液に比重差を付与し、重力によってＷ／Ｏ液滴５が水性溶液相１中に移行するにようにしている。
However, since both the W /
Ｗ／Ｏ液滴５の液滴７を構成する水性溶液の比重を大とし、水性溶液相１を構成する水性溶液の比重を小とすれば、図１（ｃ）に示すように、重力によってＷ／Ｏ液滴５は油水界面を通過し、水性溶液相１中においても沈んでいく。Ｗ／Ｏ液滴５が油水界面を通過する際には、周囲に前記脂質単分子膜３を巻き込む形になり、当該脂質単分子膜３が外層脂質膜となって脂質２分子膜を備えたリポソーム９が形成される。
If the specific gravity of the aqueous solution constituting the droplet 7 of the W /
Ｗ／Ｏ液滴５の液滴７を構成する水性溶液と水性溶液相１を構成する水性溶液に比重差を付与するためには、これら水性溶液にそれぞれ異なる溶質を溶解すればよい。溶質としては、糖類や塩類等を挙げることができ、例えば液滴７を構成する水性溶液にスクロース、水性溶液相１を構成する水性溶液にグルコースを溶解すれば、前記比重差を付与することができる。溶解する溶質の組み合わせとしては、糖類と糖類の組み合わせ、塩類と塩類の組み合わせ等が好適であり、さらには糖類の塩類の組み合わせ等も可能である。
In order to give a specific gravity difference between the aqueous solution constituting the droplet 7 of the W /
なお、前記溶質の水性溶液への溶解により比重差を付与するに当たり、液滴７を構成する水性溶液における溶質濃度と、水性溶液相１を構成する水性溶液における溶質濃度（体積モル濃度）は、同等に設定することが好ましい。前記溶質濃度に差があり過ぎると、浸透圧によって形成されるリポソーム９が変形したり破裂するおそれが生ずる。
In addition, in giving a specific gravity difference by dissolution of the solute in the aqueous solution, the solute concentration in the aqueous solution constituting the droplet 7 and the solute concentration (volume molar concentration) in the aqueous solution constituting the
Ｗ／Ｏ液滴５の液滴７を構成する水性溶液と水性溶液相１を構成する水性溶液に比重差を付与し、重力を利用してＷ／Ｏ液滴５を水性溶液相１に移行する場合、油水界面に形成された脂質単分子膜３が抵抗になり、これを突き破る必要がある。したがって、脂質単分子膜３を突き破るに足る重力が加わるように前記比重差を設定する必要がある。ここで、前記必要な比重差は、Ｗ／Ｏ液滴５のサイズによって異なる。サイズの大きなＷ／Ｏ液滴５では、前記比重差が比較的小さくても大きな重力が加わり、水性溶液相１に移行し易い。一方、サイズの小さなＷ／Ｏ液滴５では、前記比重差が小さいと加わる重力も小さく、水性溶液相１に移行することができない。
A specific gravity difference is given to the aqueous solution constituting the droplet 7 of the W /
したがって、逆に言えば、Ｗ／Ｏ液滴５のサイズと比重差を調整することで、形成されるリポソーム９のサイズをコントロールできることになる。すなわち、前記比重差を大きくすれば、小さなＷ／Ｏ液滴５まで油水界面を通過し、水性溶液相１中に移行する。その結果、小さな粒径のリポソーム９が形成される。これに対して、前記比重差を小さくすれば、大きなＷ／Ｏ液滴５のみが油水界面を通過し、大きな粒径のリポソーム９が形成される。これらのことから、例えばＷ／Ｏ液滴５の液滴７を構成する水性溶液と水性溶液相１を構成する水性溶液の比重を調整することで、形成されるリポソーム９のサイズコントロールが可能となる。
Therefore, in other words, the size of the liposome 9 to be formed can be controlled by adjusting the size and specific gravity difference of the W /
前述の方法により作製された巨大リポソームを含む溶液に、被験物質（例えば界面活性剤）を加えると、巨大リポソームにおいて、膜ダイナミクスが誘起される。観察されるダイナミクス経路、膜孔パターンは以下の通りである。 When a test substance (for example, a surfactant) is added to a solution containing giant liposomes produced by the method described above, membrane dynamics is induced in the giant liposomes. The observed dynamics path and membrane pore pattern are as follows.
（１）ダイナミクス経路Ａ：界面活性剤添加前の球形リポソームから、膜ゆらぎを介して膜陥入を引き起こし、最終的に球形リポソームに戻った経路。
（２）ダイナミクス経路Ｂ：膜ゆらぎを介して膜陥入を引き起こした後、扁長型のダンベル構造を形成し、最終的に膜***を引き起こした経路。
（３）ダイナミクス経路Ｃ：膜ゆらぎを介して膜陥入を引き起こした後、マルチラメラ構造を形成し、最終的に膜***を引き起こした経路。
（４）ダイナミクス経路D：球形リポソームまたは膜ゆらぎ直後、膜を破裂させた経路。
（５）膜孔パターンａ：連続的ポアを形成し、膜孔を開口状態に維持したままリポソームの縮小を引き起こしたパターン。
（６）膜孔パターンｂ：連続的ポアからリズミックポアに変化したことにより、膜孔が開口状態から開閉状態に転移し、リポソームの縮小を引き起こしたパターン。
（７）膜孔パターンｃ：リズミックポアを形成し、膜孔を開閉させながらリポソームの縮小を引き起こしたパターン。
(1) Dynamics pathway A: A pathway that causes membrane invagination through membrane fluctuation from a spherical liposome before addition of a surfactant and finally returns to the spherical liposome.
(2) Dynamics pathway B: A pathway that causes membrane invagination via membrane fluctuations, and then forms an elongated dumbbell structure, which ultimately causes membrane splitting.
(3) Dynamics pathway C: a pathway that causes membrane invagination via membrane fluctuations, then forms a multilamella structure, and finally causes membrane division.
(4) Dynamics pathway D: A pathway in which a membrane is ruptured immediately after spherical liposome or membrane fluctuation.
(5) Membrane pore pattern a: A pattern that forms continuous pores and causes liposomes to shrink while maintaining the membrane pores in an open state.
(6) Membrane pore pattern b: A pattern in which membrane pores are changed from an open state to an open / closed state due to a change from continuous pores to rhythmic pores, causing reduction of liposomes.
(7) Membrane pore pattern c: a pattern that formed a rhythmic pore and caused the liposome to shrink while opening and closing the membrane pore.
これらの中で、特にリポソームの縮小スピードに注目し、解析を行ったところ、ドレイズ試験と良い相関を示し、ドレイズ代替法としての有用性が示された。具体的には、ドレイズ試験法においてポジティブコントロール（刺激性）、ネガティブコントロール（無刺激性）とされている２種類の界面活性剤に関して、それぞれの界面活性剤濃度を変えて比較したところ、界面活性剤種・濃度依存性が明らかとなり、擬似的なドレイズスコアを算出することに成功した。これらの式によって導き出された擬似的ドレイズスコアは、実際のドレイズと良い相関性を示した。 Of these, the analysis was conducted with particular attention to the reduction speed of liposomes, and it showed a good correlation with the drape test, indicating its usefulness as an alternative to drape. Specifically, when two types of surfactants, which are designated as positive control (irritant) and negative control (non-irritant) in the Draize test method, were compared by changing the concentration of each surfactant, The drug type / concentration dependence was clarified, and the pseudo draise score was successfully calculated. The pseudo draise score derived by these equations showed a good correlation with the actual draise.
本発明の刺激性評価方法は、前記知見に基づいて開発されたものであり、評価に際しては、前記巨大リポソームを含む溶液に被験物質を加え、リポソームの大きさの変化を観察する。ここで、リポソームの大きさの変化を客観的に計測するには、例えばリポソームの表面積の変化を画像解析し、リポソームの縮小スピードを算出すればよい。 The method for evaluating irritation according to the present invention has been developed based on the above findings, and in the evaluation, a test substance is added to a solution containing the giant liposome, and the change in the size of the liposome is observed. Here, in order to objectively measure the change in the size of the liposome, for example, the change in the surface area of the liposome may be image-analyzed to calculate the reduction speed of the liposome.
係る本発明の刺激性評価方法を採用することにより、様々なメリットを得ることができる。先ず第１に、安価な試験法を提供することが可能になる。リポソームの作製に用いるＤＯＰＣ等の脂質は、非常に安価であり、低コスト化が見込める。 Various merit can be acquired by employ | adopting the irritation | stimulation evaluation method of this invention which concerns. First, it becomes possible to provide an inexpensive test method. Lipids such as DOPC used for the production of liposomes are very inexpensive and can be expected to reduce costs.
第２に、本発明の刺激性評価方法は、評価効率に優れるという特徴を有する。例えば、ドレイズ法における観察期間は最大で１４日であるのに対し、リポソームを用いた実験系では、１サンプル当たりの観察時間は２０分程度である。観察時間の短縮によって、短時間でより多くのサンプル観察、刺激性評価を行うことが可能である。 Secondly, the stimulation evaluation method of the present invention is characterized by excellent evaluation efficiency. For example, the maximum observation period in the dreze method is 14 days, whereas in an experimental system using liposomes, the observation time per sample is about 20 minutes. By shortening the observation time, it is possible to observe more samples and evaluate the irritation in a short time.
第３に、本発明の刺激性評価方法では、直接観察による評価が可能である。ドレイズ法では、界面活性剤が誘起する眼の赤み、腫れ、出血、失明等を結果的に評価することになるのに対して、リポソームを用いた評価方法では、例えばリアルタイム顕微鏡を用いることによって、脂質が完全に可溶化されるまでのプロセス（膜ダイナミクス）を評価することができる。また、膜ダイナミクスの物理化学的評価によって、界面活性剤の刺激性を分子レベルで評価することが可能である。 Thirdly, in the stimulus evaluation method of the present invention, evaluation by direct observation is possible. In the Draise method, the redness, swelling, bleeding, blindness, etc. of the eye induced by the surfactant will be evaluated as a result, whereas in the evaluation method using liposomes, for example, by using a real-time microscope, It can be evaluated the process (film dynamics) until the lipid is completely solubilized. Moreover, it is possible to evaluate the irritation of the surfactant at the molecular level by physicochemical evaluation of the membrane dynamics.
第４に、本発明の刺激性評価方法では、定量的な解析が可能である。ドレイズ法による刺激性評価は、視覚で判断するため主観的要素を含むが、リポソームを用いた評価法では、画像解析によって定量的な評価が可能である。 Fourthly, the stimulus evaluation method of the present invention enables quantitative analysis. The stimulus evaluation by the Draise method includes a subjective element for visual judgment, but the evaluation method using liposome can quantitatively evaluate by image analysis.
第５に、本発明の刺激性評価方法では、リポソームを細胞模倣膜として扱うことにより、動物細胞において顕著に現れる個体差を著しく減らすことができる。 Fifthly, in the method for evaluating irritation according to the present invention, individual differences that appear remarkably in animal cells can be significantly reduced by treating the liposome as a cell mimetic membrane.
第６に、本発明の刺激性評価方法は、動物を用いない評価法であることから、動物愛護の観点を考慮しなくて良いという利点を有する。 Sixth, since the stimulation evaluation method of the present invention is an evaluation method that does not use animals, it has the advantage that it is not necessary to consider the viewpoint of animal welfare.
第７に、本発明の刺激性評価方法は、高感度な試験法であると言える。例えばドレイズ代替法として知られているウシ角膜摘出試験法や単離ニワトリ眼球試験法では、低刺激性物質の評価が困難（ドレイズスコアとの相関が悪い）であるが、リポソームを用いた試験法では、強刺激性物質、低刺激性物質のいずれにおいてもドレイズスコアとの良い相関を得ることができる。 Seventh, it can be said that the irritation evaluation method of the present invention is a highly sensitive test method. For example, it is difficult to evaluate hypoallergenic substances (both correlates with the Draise score) in the bovine keratotomy test method and the isolated chicken eyeball test method, which are known as alternatives to the Draise method. Then, it is possible to obtain a good correlation with the Draise score in both the strong stimulating substance and the hypoallergenic substance.
第８に、本発明の刺激性評価方法は、広範な被験物質への応用が可能である。本発明者らの実験において、界面活性剤だけでなく、アルコール（エタノール）等においてもドレイズスコアと良い相関が得られたことから、様々な物質に適用可能であると考えられる。 Eighth, the irritation evaluation method of the present invention can be applied to a wide range of test substances. In the experiments conducted by the present inventors, not only the surfactant but also alcohol (ethanol) or the like has a good correlation with the Draise score, so it can be applied to various substances.
第９に、本発明の刺激性評価方法は、高信頼性を有する。ドレイズ試験法は、誤認が多く、実際の眼刺激性を完全に評価することができないという問題がある。特に、非刺激性や低刺激性と評価されているにもかかわらず、実際は強刺激性物質である可能性がかなり高い。リポソームを用いた実験法では、ドレイズ試験において誤評価された物質についても正確に刺激性を評価できることが実験的に確かめられており、ドレイズ試験法よりも高感度、高信頼性の試験法であると言える。 Ninth, the stimulation evaluation method of the present invention has high reliability. The Draize test method has many problems of being misidentified, and the actual eye irritation cannot be completely evaluated. In particular, although it is evaluated as non-irritant or hypoallergenic, it is highly likely that it is actually a strong irritant substance. In the experimental method using liposomes, it has been experimentally confirmed that it is possible to accurately evaluate irritation even for substances mis-evaluated in the Draize test, which is a test method with higher sensitivity and reliability than the Draise test method. It can be said.
以上、本発明を適用した刺激性評価方法の実施形態について説明してきたが、本発明が前述の実施形態に限定されるものでないことは言うまでもなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。例えば、リポソームの作製に当たり、脂質に蛍光色素を添加する等、画像を認識し易いような工夫を行うことも可能である。また、画像解析に用いるツール等も任意である。 As mentioned above, although embodiment of the irritation | stimulation evaluation method to which this invention is applied has been described, it cannot be overemphasized that this invention is not what is limited to the above-mentioned embodiment, and it is various changes in the range which does not deviate from the summary of this invention. Is possible. For example, in preparing the liposome, it is possible to make an effort to recognize the image, such as adding a fluorescent dye to the lipid. A tool used for image analysis is also arbitrary.
以下、本発明の具体的な実施例について、実験結果に基づいて詳細に説明する。 Hereinafter, specific examples of the present invention will be described in detail based on experimental results.
リポソームの作製
本実施例では、静置水和法により巨大リポソームを作製した。作製手順としては、先ず、ダーラム管をアセトンで洗浄し、洗浄したダーラム管に、クロロホルム／メタノール＝２／１（ｖ／ｖ）で溶かしたＤＯＰＣ、ローダミンレッド（商品名ＴＭＸ−ＤＨＰＥ）、及びグルコースをそれぞれ２０μｌ、８μｌ、１２μｌ加え、ピペッティングにより溶液を混合した。
Preparation of liposomes In this example, giant liposomes were prepared by the stationary hydration method. As a preparation procedure, first, the Durham tube was washed with acetone, and DOPC dissolved in chloroform / methanol = 2/1 (v / v), rhodamine red (trade name TMX-DHPE), and glucose were washed in the washed Durham tube. 20 μl, 8 μl and 12 μl were added, and the solution was mixed by pipetting.
次に、混合溶液に窒素ガスを吹きつけ、クロロホルムとメタノールを揮発させることによってダーラム管底部に脂質フィルムを形成させた。さらに、ダーラム管を真空デシケータ内に入れ、１８０分以上真空中で静置することにより、残存する有機溶媒を十分に飛ばした。 Next, nitrogen gas was blown into the mixed solution, and chloroform and methanol were volatilized to form a lipid film at the bottom of the Durham tube. Further, the Durham tube was placed in a vacuum desiccator and allowed to stand in a vacuum for 180 minutes or longer to sufficiently remove the remaining organic solvent.
真空デシケータからダーラム管を取り出し、超純水（２００μｌ）を加え、パラフィルムで密閉後、３７℃条件下（一定温度）で２４時間インキュベーションした。インキュベーション中は、脂質・蛍光色素の酸化を防ぐため、ダーラム管をアルミホイルで覆った。２４時間後、インキュベーションを終了し、リポソームの作製を完了（ＤＯＰＣ終濃度０．２ｍＭ，グルコース終濃度０．６ｍＭ，ローダミンレッド終濃度０．００４ｍＭ）した。観察時は、以上により作製したリポソーム溶液に超純水を加え、１０倍希釈したリポソーム溶液を用いた。 The Durham tube was taken out from the vacuum desiccator, ultrapure water (200 μl) was added, sealed with parafilm, and incubated at 37 ° C. (constant temperature) for 24 hours. During incubation, the Durham tube was covered with aluminum foil to prevent oxidation of lipids and fluorescent dyes. After 24 hours, the incubation was terminated to complete the production of liposomes (DOPC final concentration 0.2 mM, glucose final concentration 0.6 mM, rhodamine red final concentration 0.004 mM). At the time of observation, an ultrapure water was added to the liposome solution prepared as described above, and a liposome solution diluted 10 times was used.
顕微鏡観察
使用機器は、倒立型リサーチ顕微鏡（オリンパス社製、商品名ＩＸ７１）、共焦点スキャナユニット（横河電気社製、ＣＳＵ１０）、対物レンズ（ＰｌａｎＡｐｏＮ ６０×／１．４２）、カメラ（ＩＭＰＡＣＴＲＯＮ ＣＣＤ ＣＡＭＥＲＡ，ＭＯＤＥＬ ＡＤＴ−３３Ｂ ＦＬＯＶＥＬ）、レコーダー（東芝社製、ＲＤ−Ｅ−３００）である。
The microscope observation equipment is an inverted research microscope (Olympus, trade name IX71), confocal scanner unit (Yokogawa, CSU10), objective lens (
観察チャンバーは、図２に示すように、シリコンラバー１１とシリコンカバー１２の間にメンブランフィルタ１３を配置し、これをマイクロカバーガラス１４上に載置することにより構成した。シリコンラバー１１とシリコンカバー１２の間にメンブランフィルタ１３を配置したことにより、顕微鏡観察中におけるリポソーム溶液と界面活性剤溶液の混和を可能とした。このチャンバーを用いることにより、界面活性剤添加時からリポソーム可溶化までの動的構造変化をリアルタイム観察することができる。
As shown in FIG. 2, the observation chamber was configured by placing a
観察に際しては、観察チャンバーのシリコンカバー１２側に開けた孔に、超純水で１０倍希釈したリポソーム溶液８μｌを入れ、マイクロカバーガラスで密閉した。観察チャンバーを顕微鏡ステージに乗せ、レーザー光（波長５３２ｎｍ）をサンプルに照射した。観察対象のリポソームが見つかり次第、録画を開始した。レーザーの出力をオフ（眼を痛めないように）にし、界面活性剤３２μｌをシリコンラバー１１側から添加した。
At the time of observation, 8 μl of a liposome solution diluted 10-fold with ultrapure water was put in a hole opened on the
界面活性剤添加後、膜ダイナミクス（リポソームの形態変化、膜孔形成）の観察を行った後、画像解析によって定量的な界面活性剤刺激性評価を行った。図３は、リポソームのサイズが小さくなる様子を示す顕微鏡写真である。 After addition of the surfactant, the membrane dynamics (liposome morphology change, membrane pore formation) were observed, and then quantitative surfactant evaluation was performed by image analysis. FIG. 3 is a photomicrograph showing how the liposome size is reduced.
評価結果
前記画像解析において、膜孔形成後のリポソームの表面積を縦軸、観察時間を横軸にプロットし（図４）、一次反応速度定数を導いた。導き出した速度定数をリポソームの縮小スピードと定義し、界面活性剤刺激性の指標とした。
Evaluation Results In the image analysis, the surface area of the liposome after the formation of membrane pores was plotted on the vertical axis and the observation time was plotted on the horizontal axis (FIG. 4), and a first-order reaction rate constant was derived. The derived rate constant was defined as the reduction speed of the liposome, and was used as an index of surfactant irritation.
さらに、膜孔形成パターン（リズミックポアであるか否か）で分類し、それぞれ式（１），（２）から擬似的なドレイズスコアを算出した。
（１）式 擬似的ドレイズスコア＝（縮小スピード−0.0763）／0.0019
（２）式 擬似的ドレイズスコア＝（縮小スピード−0.073）／0.0014
Furthermore, it classified by the membrane hole formation pattern (whether it is a rhythmic pore), and calculated the pseudo dray score from Formula (1) and (2), respectively.
(1) Formula Pseudo Draise Score = (Reduction Speed -0.0763) /0.0019
(2) Formula Pseudo Draise Score = (Reduction Speed -0.073) /0.0014
種々の被検物質について、ドレイズスコアとリポソーム刺激性評価値の関係についての調査結果を図５に示す。リポソームを用いた試験法では、ドレイズ試験において誤評価された物質についても、正確に刺激性が評価できていることが確認された。
FIG. 5 shows the results of a survey on the relationship between the draise score and the liposome irritation evaluation value for various test substances. In the test method using liposomes, it was confirmed that irritation could be accurately evaluated even for substances that were erroneously evaluated in the Draize test.
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