JP5787298B2 - Method for preparing polypeptide specifically recognizing protein presented on membrane - Google Patents

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Description

本発明は、ポリペプチドライブラリーを調製する方法、およびこれを用いて新規なポリペプチドを同定する方法に関する。   The present invention relates to a method for preparing a polypeptide library and a method for identifying a novel polypeptide using the method.

ポリペプチドスキャフォールドを利用してポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーを作製し、抗体に代わる新規なタンパク質を発見する試みが行われている(非特許文献１)。この方法においては、タンパク質のフレームワーク領域の構造を維持しながら、相互作用に関与する領域(例えばループ領域)のアミノ酸配列がランダムであるように設計されたポリペプチドライブラリーを作製し、所望の標的と接触させて、その標的に結合しうるタンパク質を選択し、その構造を決定することにより、所望の標的に結合しうる新規なタンパク質を同定することができる。
ヘビ、サソリ、クモ、昆虫類が、その他の生物に対して防御あるいは攻撃用に即効的に用いる毒は一般に神経毒であり、急激に相手を麻痺させることができる。これら生物はそれぞれ何種類もの神経毒を有しているが、そのうち「α-型神経毒」と呼ばれるポリペプチド神経毒は、電位依存型イオンチャネルへのアンタゴニストとなっている場合が多い。これら「α-型神経毒」は、一般に、４〜５個のジスルフィド結合、３〜５個のアンチパラレルβシートにより、フィンガー様のループ領域を有する安定なスキャフォールド構造を形成している。
本発明者らは、以前に、「α-型神経毒」における「フィンガー様」の「スキャフォールド構造」に着目して、ヘビ毒に由来するポリペプチド神経毒がもつスリーフィンガー型(３Ｆ)スキャフォールドを使ってコンビナトリアルライブラリーを作製する方法を開発した(特許文献１、２)。具体的には、安定なスキャフォールド構造の形成に関わっているジスルフィド結合及びβシート領域のアミノ酸はそのままにして、ループを形成していると予想される領域をランダム化したディスプレイ型のポリペプチドライブラリーを作製し、エマルジョンPCR法と組み合わせたハイスループットスクリーニングにより、標的タンパク質との親和性の高いポリペプチドを得ることに成功している。
しかし、ヘビ毒由来の３Ｆスキャフォールドの場合、ポリペプチドの分子量が約7kDaとかなり大きく、ジスルフィド結合も４個あるが、リフォールディングとジスルフィド結合の形成という組換えタンパク質を作製する際の技術的な困難性からみて、できるだけ分子量が小さく、システイン残基の数もより少ないスキャフォールドが適していると考えられる。
３Ｆスキャフォールドを利用してライブラリーを作製する場合に、３つのフィンガー様のスキャフォールド全てが必要というわけではなく、１フィンガーずつ、そのスキャフォールド構造を維持するように分割し、いわば１Ｆスキャフォールドを利用したライブラリーでも、標的タンパク質に親和性のあるポリペプチドのスクリーニングに有効であることを確認した(特許文献２)が、もとの３Ｆスキャフォールドに比較すると、そのスクリーニング効率はかなり低くなってしまう。 Attempts have been made to create a combinatorial library of polypeptides using a polypeptide scaffold and to discover novel proteins that replace antibodies (Non-patent Document 1). In this method, while maintaining the structure of the framework region of the protein, a polypeptide library designed so that the amino acid sequence of the region involved in the interaction (for example, the loop region) is random is generated, and the desired target is created. A novel protein that can bind to the desired target can be identified by contacting with and selecting a protein that can bind to the target and determining its structure.
Poisons that snakes, scorpions, spiders, and insects use immediately for defense or attack against other organisms are generally neurotoxins and can rapidly paralyze their opponents. Each of these organisms has several types of neurotoxins, of which polypeptide neurotoxins called “α-type neurotoxins” are often antagonists to voltage-gated ion channels. These “α-type neurotoxins” generally form a stable scaffold structure having a finger-like loop region by 4 to 5 disulfide bonds and 3 to 5 antiparallel β sheets.
The present inventors have previously focused on the “finger-like” “scaffold structure” in “α-type neurotoxin”, and the three-finger (3F) scaffold possessed by the polypeptide neurotoxin derived from snake venom. A method of creating a combinatorial library using a fold has been developed (Patent Documents 1 and 2). Specifically, a display-type polypeptide library in which disulfide bonds and β-sheet region amino acids involved in the formation of a stable scaffold structure are left intact, and the regions that are expected to form loops are randomized. And has succeeded in obtaining a polypeptide having high affinity for the target protein by high-throughput screening combined with emulsion PCR.
However, in the case of the 3F scaffold derived from snake venom, the molecular weight of the polypeptide is considerably large, about 7 kDa, and there are four disulfide bonds. However, it is technical for the production of recombinant proteins such as refolding and disulfide bond formation. From the viewpoint of difficulty, it is considered that a scaffold having a molecular weight as small as possible and a smaller number of cysteine residues is suitable.
When creating a library using 3F scaffolds, not all three finger-like scaffolds are required, but one finger is divided so as to maintain the scaffold structure. It was confirmed that even a library using a protein is effective for screening a polypeptide having an affinity for a target protein (Patent Document 2), but its screening efficiency is considerably lower than that of the original 3F scaffold. End up.

また、従来開発したポリペプチドライブラリーは、膜タンパク質を標的とする場合には標的タンパク質を発現する細胞の調製など煩雑な工程が多いため、実際にはアゴニスト、アンタゴニストのハイスループットなスクリーニング系として利用できる標的タンパク質の対象は可溶性タンパク質のみであり、膜タンパク質への適用開発がなかなか進まなかった。
以上のことから、ヘビ毒由来の３Ｆスキャフォールドを利用したライブラリーに代わる、分子量が小さく、システイン残基の数がより少ないスキャフォールドを利用したライブラリーであって、しかもスクリーニング効率の高いポリペプチドライブラリーの提供が強く望まれていた。また、膜タンパク質を標的としたハイスループットスクリーニング系の開発と同時に、当該系に適用可能なポリペプチドライブラリーの提供も切望されていた。 In addition, a polypeptide library that has been developed in the past can be used as a high-throughput screening system for agonists and antagonists because there are many complicated steps such as preparation of cells that express the target protein when targeting a membrane protein. The target protein is only soluble protein, and the development of application to membrane protein has not progressed easily.
From the above, it is a library using a scaffold having a small molecular weight and a smaller number of cysteine residues instead of a library using a 3F scaffold derived from snake venom, and having high screening efficiency. The rally was strongly desired. At the same time as the development of a high-throughput screening system targeting membrane proteins, provision of a polypeptide library applicable to the system has been eagerly desired.

特開２００７−３０６８６６号公報JP 2007-306866 A 特開２００８−１９３９２２号公報JP 2008-193922 A 特開２００８−１１号公報Japanese Patent Laid-Open No. 2008-11

J. Immunol. Methods., 290： 3-28 (2004)J. Immunol. Methods., 290: 3-28 (2004) Biochemistry 34： 8076-8081 (1995)Biochemistry 34: 8076-8081 (1995) J. Biol. Chem. 276： 40306-40312 (2001)J. Biol. Chem. 276: 40306-40312 (2001) J. Gen. Physiol. 123： 455-467 (2004)J. Gen. Physiol. 123: 455-467 (2004) J. Biol. Chem. 279： 37734-37740 (2004)J. Biol. Chem. 279: 37734-37740 (2004) Toxicon. 49： 202-212 (2007)Toxicon. 49: 202-212 (2007) Toxicon. 39： 43-60 (2001)Toxicon. 39: 43-60 (2001) Ono, S., et al. (2006)，Program No 28 (ION CHANNELS) , 15th World Congress on Animal, Plant & Microbial Toxins, Glasgow, UK. 24th July, 2002)(Ono, S., et al. (2006), Program No 28 (ION CHANNELS), 15th World Congress on Animal, Plant & Microbial Toxins, Glasgow, UK. 24th July, 2002)

本発明は、３Ｆスキャフォールドよりも低分子でシステイン残基の数がより少ないスキャフォールドを利用した、所望の標的タンパク質に親和性の高いポリペプチドを同定するためのポリペプチドライブラリーであって、膜タンパク質を標的としたハイスループットスクリーニング系にも適用可能なポリペプチドライブラリーを提供することを目的とする。   The present invention relates to a polypeptide library for identifying a polypeptide having a high affinity for a desired target protein, using a scaffold having a lower molecular weight than a 3F scaffold and having a smaller number of cysteine residues. An object of the present invention is to provide a polypeptide library applicable to a high-throughput screening system targeting proteins.

ヘビ毒液と同様に、クモ毒液にもカルシウムチャネルやナトリウムチャネル、カリウムチャネル、タンパク質加水分解酵素などの働きを阻害する生理活性ポリペプチドが含まれることが知られている。クモ毒液成分の中には、成熟ポリペプチドが30−40アミノ酸残基からなり、Inhibitor Cystine Knots(ICK)とよばれる構造モチーフを持つ一連のポリペプチドファミリーがある。このファミリーは、６個のシステイン残基があって、そのシステイン・フレームワークは厳密に保存されているが、それ以外の配列は多様である。質量分析や立体構造解析からこのポリペプチドは３個のジスルフィド結合を形成し、物理化学的にも生物学的にも安定な構造をしていることが報告されている。(非特許文献７)
本発明者らは、最近、このクモ毒のうち、南米産グラモストラ・スパチュラタ由来のカルシウムチャネル遮断タイプの毒ペプチド(A4-1)遺伝子の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を決定した(特許文献３)。
本発明者らは、当該A4-1ポリペプチドのアミノ酸数82のORF(システイン７個)におけるアミノ酸配列と立体構造を詳細に検討する過程で、当該ポリペプチドのＮ末側はシグナルペプチド及びプレプロ配列であり、成熟体は、アミノ酸数34、分子量約4kDa、システイン残基が６個であることを見出した。A4-1の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである。

DCLGFMRKCIPDNDKCCRPNLVCSRTHKWCKYVF (配列番号１)

本発明者らは、さらに、Ｎ末側から数えて１番目のシステイン(以下、Cys-1ともいう。)が４番目(Cys-4)と、２番目のシステイン(Cys-2)が５番目(Cys-5)と、そして３番目のシステイン(Cys-3)が６番目(Cys-6)と、３箇所でS-S結合したスキャフォールド(ICKスキャフォールド)を形成していることを見出した(図１)。当該ICKスキャフォールドは、比較的サイズが小さく安定性も高いため、このようなポリペプチドライブラリー候補として最適であると考えられた。
そこで、本発明者らは、当該ICKスキャフォールド標的のカルシウムチャネルとは、それぞれのS-S結合で挟まれた３箇所の領域でβシート構造を除いた３つのループ領域(Ｎ末側からループI、ループII、ループIIIともいう。)と、Cys-6からＣ末端側のテール領域とが、結合していると予測し、それらの各領域のアミノ酸残基を同時にランダム化したポリペプチドライブラリーを作製した(図１の濃いグレー部分がランダム化した配列に相当する。)。
さらに、本発明者らは、上記４箇所に対応する塩基配列をランダム化した変異ポリペプチド遺伝子を発現ベクターに挿入してディスプレイ型のライブラリーを作製する際に、同時に標的となる膜タンパク質遺伝子も同一発現ベクターに挿入したコンビナトリアルライブラリーを構築した。当該ライブラリーは、標的タンパク質を大腸菌の内膜表面に提示させることができるが、ICKスキャフォールドを利用したライブラリーは分子量が比較的小さく安定性も高いため、ペリズミック空間内でのスクリーニング工程も可能であることが確認できた。当該スクリーニング技術により、より標的膜タンパク質との親和性の高いポリペプチド配列に分子進化させることができることも実証した。これは、従来困難であるとされていた膜タンパクに対するリガンド検索にも有効である画期的なハイスループットスクリーニングの技術を提供するものである。
以上の知見をもとに、ICKスキャフォールドを利用したライブラリーに係る本発明を完成させた。なお、ディスプレイ型のポリペプチドライブラリー遺伝子と標的となる膜タンパク質遺伝子とを同一の発現ベクターに挿入したハイスループットスクリーニング技術である「ペリプラズム内分泌・選択法(iPS&S法)」については、同日付で出願している。 Like snake venom, it is known that spider venom contains physiologically active polypeptides that inhibit the action of calcium channels, sodium channels, potassium channels, protein hydrolases, and the like. Among spider venom components, there is a series of polypeptide families in which the mature polypeptide consists of 30-40 amino acid residues and has a structural motif called Inhibitor Cystine Knots (ICK). This family has 6 cysteine residues and its cysteine framework is strictly conserved, but the rest of the sequence is diverse. It has been reported from mass spectrometry and three-dimensional structure analysis that this polypeptide forms three disulfide bonds and has a physicochemical and biologically stable structure. (Non-patent document 7)
The present inventors recently determined the base sequence and the corresponding amino acid sequence of a calcium channel blocking type venom peptide (A4-1) gene derived from South American Gramostra spatulata among these spider venoms (Patent Document 3). ).
In the process of examining in detail the amino acid sequence and three-dimensional structure of the ORF (7 cysteines) of the amino acid number 82 of the A4-1 polypeptide, the N-terminal side of the polypeptide has a signal peptide and a prepro sequence. The matured body was found to have 34 amino acids, a molecular weight of about 4 kDa, and 6 cysteine residues. The amino acid sequence of the mature polypeptide of A4-1 is as follows.

DCLGFMRKCIPDNDKCCRPNLVCSRTHKWCKYVF (SEQ ID NO: 1)

Further, the present inventors have counted the first cysteine (hereinafter also referred to as Cys-1) from the N-terminal side as the fourth (Cys-4) and the second cysteine (Cys-2) as the fifth. It was found that (Cys-5) and the third cysteine (Cys-3) formed a scaffold (ICK scaffold) that was SS-linked to the sixth (Cys-6) at three positions (ICK scaffold). (Fig. 1). Since the ICK scaffold is relatively small in size and high in stability, it was considered to be optimal as such a polypeptide library candidate.
Therefore, the present inventors have said that the calcium channel of the ICK scaffold target is the three loop regions (loop I, N from the N-terminal side) excluding the β sheet structure in three regions sandwiched between the respective SS bonds. Loop II and Loop III) and the tail region from Cys-6 to the C-terminal side are predicted to be bound, and a polypeptide library is prepared in which the amino acid residues in each region are simultaneously randomized (The dark gray portion in FIG. 1 corresponds to a randomized array.)
Furthermore, when the present inventors insert a mutant polypeptide gene in which nucleotide sequences corresponding to the above four locations are randomized into an expression vector to prepare a display-type library, the target membrane protein gene is also simultaneously detected. A combinatorial library inserted into the same expression vector was constructed. The library can display target proteins on the inner membrane surface of E. coli, but the library using the ICK scaffold has a relatively small molecular weight and high stability, so it can be screened in the peri- mic space. It was confirmed that. It has also been demonstrated that the screening technology enables molecular evolution to a polypeptide sequence with higher affinity for the target membrane protein. This provides an epoch-making high-throughput screening technique that is effective for ligand search for membrane proteins, which has been considered difficult in the past.
Based on the above findings, the present invention relating to a library using an ICK scaffold has been completed. The `` periplasmic endocrine / selection method (iPS & S method) '', which is a high-throughput screening technology in which the display-type polypeptide library gene and the target membrane protein gene are inserted into the same expression vector, was filed on the same date. ing.

すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ ICKスキャフォールドを有する複数のポリペプチドの群で構成されるポリペプチドライブラリーであり、かつ当該各ポリペプチドのアミノ酸配列が、下記(ｉ)〜(ｉｖ)の領域において同時にランダム化されたアミノ酸配列を有していることを特徴とするポリペプチドライブラリー；
（ｉ）Cys-1とCys-2の間のループI領域中のCys-1のＣ末側４番目からCys-2のＮ末側１番目までのアミノ酸配列；
（ｉｉ）Cys-2とCys-3の間のループII領域中のCys-2のＣ末側３番目からCys-3のＮ末側１番目までのアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）Cys-5とCys-6の間のループIII領域中のCys-5のＣ末側２番目からCys-6のＮ末側３番目までのアミノ酸配列；および
（ｉｖ）Cys-6からＣ末端側のテール領域中のCys-6のＣ末側３番目からＣ末端までのアミノ酸配列。
［２］ 前記ポリペプチドライブラリーを構成する各ポリペプチドが、下記式〔１〕のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、前記［１］に記載のポリペプチドライブラリー；
式〔１〕
DCLGF(X)3CIP(X)4CCRPNLVCS(X)3KWCKY(X)2 (配列番号２)
(式中、Xは任意のアミノ酸残基である)
［３］ 前記ポリペプチドライブラリーを構成する各ポリペプチドが、それぞれのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在している、前記[１]又は[２]に記載のポリペプチドライブラリー。
［４］ ICKスキャフォールドを有する複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの群で構成されるポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのアミノ酸配列が、下記(ｉ)〜(ｉｖ)の領域において同時にランダム化されたアミノ酸配列を有していることを特徴とする、ポリヌクレオチドライブラリー；
（ｉ）Cys-1とCys-2の間のループI領域中のCys-1のＣ末側４番目からCys-2のＮ末側１番目までのアミノ酸配列；
（ｉｉ）Cys-2とCys-3の間のループII領域中のCys-2のＣ末側３番目からCys-3のＮ末側１番目までのアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）Cys-5とCys-6の間のループIII領域中のCys-5のＣ末側２番目からCys-6のＮ末側３番目までのアミノ酸配列；および
（ｉｖ）Cys-6からＣ末端側のテール領域中のCys-6のＣ末側３番目からＣ末端までのアミノ酸配列。
［５］ 前記ポリヌクレオチドライブラリーを構成する各ポリヌクレオチドが、下記式〔１〕のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、前記[４]に記載のポリヌクレオチドライブラリー；
式〔１〕
DCLGF(X)3CIP(X)4CCRPNLVCS(X)3KWCKY(X)2 (配列番号２)
(式中、Xは任意のアミノ酸残基である)。
［６］ 前記ポリヌクレオチドライブラリーが、発現ベクター中に組み込まれている状態にある、前記[４]又は[５]に記載のポリヌクレオチドライブラリー。
［７］ 前記発現ベクターにおいて、前記ポリヌクレオチドの上流に分泌シグナル配列が存在している、前記[６]に記載のポリヌクレオチドライブラリー。
［８］ 前記発現ベクターにおいて、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドが同一ベクター上に組み込まれている、前記[６]又は[７]に記載のポリヌクレオチドライブラリー。
［９］ 前記[６]〜[８]のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換された形質転換宿主の群により構成された、ポリヌクレオチドライブラリー。
［１０］ 前記形質転換宿主がグラム陰性細菌である前記[９]に記載のポリヌクレオチドライブラリー。
［１１］ 標的に対して親和性を有するポリペプチドを同定する方法であって、下記(ａ)〜(ｄ)の工程を含む方法；
（ａ）ICKスキャフォールドを有する複数のポリペプチドの群で構成されるポリペプチドライブラリーであり、かつ当該各ポリペプチドのアミノ酸配列が、下記(ｉ)〜(ｉｖ)の領域において同時にランダム化されたアミノ酸配列を有していることを特徴とするポリペプチドライブラリーを用意する工程、
（ｉ）Cys-1とCys-2の間のループI領域中のCys-1のＣ末側４番目からCys-2のＮ末側１番目までのアミノ酸配列；
（ｉｉ）Cys-2とCys-3の間のループII領域中のCys-2のＣ末側３番目からCys-3のＮ末側１番目までのアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）Cys-5とCys-6の間のループIII領域中のCys-5のＣ末側２番目からCys-6のＮ末側３番目までのアミノ酸配列；および
（ｉｖ）Cys-6からＣ末端側のテール領域中のCys-6のＣ末側３番目からＣ末端までのアミノ酸配列、
（ｂ）前記ポリペプチドライブラリーを前記標的と接触させる工程；
（ｃ）前記標的と結合したポリペプチドを選択する工程；そして
（ｄ）前記選択されたポリペプチドのアミノ酸配列を決定する工程。
［１２］ 前記ポリペプチドライブラリーを構成する各ポリペプチドが、下記式〔１〕のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、前記[１１]に記載の方法；
式〔１〕
DCLGF(X)3CIP(X)4CCRPNLVCS(X)3KWCKY(X)2 (配列番号２)
(式中、Xは任意のアミノ酸残基である)
［１３］ 工程(ａ)のポリペプチドライブラリーを構成する各ポリペプチドが，それぞれのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており，ポリペプチドのアミノ酸配列を決定する工程(ｄ)が，そのポリペプチドに結合しているポリヌクレオチドの塩基配列を決定することにより行われる，前記[１１]又は[１２]に記載の方法。
［１４］ 標的に対して親和性を有するポリペプチドを同定する方法であって、下記(ａ)〜(ｈ)の工程を含む方法；
（ａ）ICKスキャフォールドを有する複数のポリペプチドの群で構成されるポリペプチドライブラリーであり、かつ当該各ポリペプチドのアミノ酸配列が、下記(ｉ)〜(ｉｖ)の領域において同時にランダム化されたアミノ酸配列を有しているポリペプチドライブラリーであり、かつ当該ポリペプチドライブラリーを構成する各ポリペプチドがそれぞれのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しているポリペプチドライブラリーを用意する工程；
（ｉ）Cys-1とCys-2の間のループI領域中のCys-1のＣ末側４番目からCys-2のＮ末側１番目までのアミノ酸配列；
（ｉｉ）Cys-2とCys-3の間のループII領域中のCys-2のＣ末側３番目からCys-3のＮ末側１番目までのアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）Cys-5とCys-6の間のループIII領域中のCys-5のＣ末側２番目からCys-6のＮ末側３番目までのアミノ酸配列；および
（ｉｖ）Cys-6からＣ末端側のテール領域中のCys-6のＣ末側３番目からＣ末端までのアミノ酸配列、
（ｂ）前記ポリペプチドライブラリーを前記標的と接触させる工程；
（ｃ）前記標的と結合したポリペプチドを選択する工程；
（ｄ）前記選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅し、転写し、および翻訳することにより、第２のポリペプチドライブラリーを製造する工程であり、ここで前記第２のポリペプチドライブラリーを構成する各ポリペプチドはそれぞれのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在している工程；
（ｅ）前記第２のポリペプチドライブラリーを前記標的と接触させる工程；
（ｆ）前記標的と結合したポリペプチドを選択する工程；
（ｇ）必要により工程(ｄ)−(ｆ)を繰り返す工程；そして
（ｈ）選択されたポリペプチドのアミノ酸配列を決定する工程。
［１５］ 前記ポリペプチドライブラリーを構成する各ポリペプチドが、下記式〔１〕のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、前記[１４]に記載の方法；
式〔１〕
DCLGF(X)3CIP(X)4CCRPNLVCS(X)3KWCKY(X)2 (配列番号２)
(式中、Xは任意のアミノ酸残基である)
［１６］ 標的に対して親和性を有するポリペプチドを同定する方法であって、下記(ａ)〜(ｈ)の工程を含む方法；
（ａ）ICKスキャフォールドを有する複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの群で構成される、発現ベクターの状態で存在するポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのアミノ酸配列が、下記(ｉ)〜(ｉｖ)の領域において同時にランダム化されたアミノ酸配列を有していることを特徴とする、ポリヌクレオチドライブラリーを用意する工程；
（ｉ）Cys-1とCys-2の間のループI領域中のCys-1のＣ末側４番目からCys-2のＮ末側１番目までのアミノ酸配列；
（ｉｉ）Cys-2とCys-3の間のループII領域中のCys-2のＣ末側３番目からCys-3のＮ末側１番目までのアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）Cys-5とCys-6の間のループIII領域中のCys-5のＣ末側２番目からCys-6のＮ末側３番目までのアミノ酸配列；および
（ｉｖ）Cys-6からＣ末端側のテール領域中のCys-6のＣ末側３番目からＣ末端までのアミノ酸配列；
（ｂ）前記ポリヌクレオチドライブラリーを構成する各発現ベクターを形質転換細胞のそれぞれで、対応するポリペプチドを発現させる工程；
（ｃ）前記各ポリペプチドを、前記標的と接触させる工程；
（ｄ）前記標的と結合したポリペプチドを選択する工程；
（ｅ）前記選択されたポリペプチドを発現した形質転換細胞中のポリヌクレオチドを増幅して第２のポリヌクレオチドライブラリーを製造する工程；
（ｆ）前記第２のポリヌクレオチドライブラリーを構成する各発現ベクターを形質転換細胞のそれぞれで、対応するポリペプチドを発現させる工程；
（ｇ）前記各ポリペプチドを、前記標的と接触させる工程；
（ｈ）前記標的と結合したポリペプチドを選択する工程；
（ｉ）必要により工程(ｅ)−(ｈ)を繰り返す工程；そして
（ｊ）選択されたポリペプチドのアミノ酸配列を決定する工程。
［１７］ 前記ポリヌクレオチドライブラリーを構成する各ポリヌクレオチドが、下記式〔１〕のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、前記[１６]に記載の方法；
式〔１〕
DCLGF(X)3CIP(X)4CCRPNLVCS(X)3KWCKY(X)2 (配列番号２)
(式中、Xは任意のアミノ酸残基である)
［１８］ 標的の膜タンパク質に対して親和性を有するポリペプチドを同定する方法であって、下記(ａ)〜(ｈ)の工程を含む方法；
（ａ）ICKスキャフォールドを有する複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、それぞれ分泌シグナル配列の下流に挿入された発現ベクターの群で構成され、各ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのアミノ酸配列が、下記(ｉ)〜(ｉｖ)の領域において同時にランダム化されたアミノ酸配列を有しているポリヌクレオチドライブラリーであり、前記発現ベクター中には前記標的膜タンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれているポリヌクレオチドライブラリーを用意する工程；
（ｉ）Cys-1とCys-2の間のループI領域中のCys-1のＣ末側４番目からCys-2のＮ末側１番目までのアミノ酸配列；
（ｉｉ）Cys-2とCys-3の間のループII領域中のCys-2のＣ末側３番目からCys-3のＮ末側１番目までのアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）Cys-5とCys-6の間のループIII領域中のCys-5のＣ末側２番目からCys-6のＮ末側３番目までのアミノ酸配列；および
（ｉｖ）Cys-6からＣ末端側のテール領域中のCys-6のＣ末側３番目からＣ末端までのアミノ酸配列；
（ｂ）前記ポリヌクレオチドライブラリーを構成する各発現ベクターを、形質転換グラム陰性細菌において、前記標的膜タンパク質を内膜表面に、また各ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドをペリプラズム間隙内にそれぞれ発現させる工程；
（ｃ）前記各ポリペプチドを、前記ペリプラズム間隙内で前記標的膜タンパク質と接触させる工程；
（ｄ）前記形質転換グラム陰性細菌のスフェロプラストを形成させて、前記標的膜タンパク質と結合したポリペプチドを選択する工程；
（ｅ）前記選択されたポリペプチドを発現した形質転換細胞中のポリヌクレオチドを増幅して発現ベクターに挿入した第２のポリヌクレオチドライブラリーであり、各ポリヌクレオチドは分泌シグナル配列の下流に挿入され、かつ前記標的膜タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの群で構成された第２のポリヌクレオチドライブラリーを製造する工程、；
（ｆ）前記第２のポリヌクレオチドライブラリーを構成する各発現ベクターを形質転換グラム陰性細菌において、前記標的膜タンパク質を内膜表面に、また各ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドをペリプラズム間隙内にそれぞれ発現させる工程；
（ｇ）前記各ポリペプチドを、前記ペリプラズム間隙内で前記標的膜タンパク質と接触させる工程；
（ｈ）前記形質転換グラム陰性細菌のスフェロプラストを形成させて、前記標的膜タンパク質と結合したポリペプチドを選択する工程；
（ｉ）必要により工程(ｅ)−(ｈ)を繰り返す工程；そして
（ｊ）選択されたポリペプチドのアミノ酸配列を決定する工程。
［１９］ 配列番号３〜１４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、m2受容体と高い親和性を有するポリペプチド。；
［２０］ 配列番号３〜１４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、m2受容体と高い親和性を有するポリペプチドを有効成分として含むm2受容体の阻害剤。 That is, the present invention is as follows.
[1] A polypeptide library composed of a group of a plurality of polypeptides having an ICK scaffold, and the amino acid sequences of the respective polypeptides were simultaneously randomized in the following regions (i) to (iv) A polypeptide library characterized by having an amino acid sequence;
(I) the amino acid sequence from the fourth C-terminal side of Cys-1 to the first N-terminal side of Cys-2 in the loop I region between Cys-1 and Cys-2;
(Ii) an amino acid sequence from the third C-terminal side of Cys-2 to the first N-terminal side of Cys-3 in the loop II region between Cys-2 and Cys-3;
(Iii) the amino acid sequence from the second C-terminal side of Cys-5 to the third N-terminal side of Cys-6 in the loop III region between Cys-5 and Cys-6; and (iv) from Cys-6 Amino acid sequence from the third C-terminal side to the C-terminal side of Cys-6 in the tail region on the C-terminal side.
[2] The polypeptide library according to the above [1], wherein each polypeptide constituting the polypeptide library is a polypeptide comprising an amino acid sequence of the following formula [1];
Formula [1]
DCLGF (X) 3 CIP (X) 4 CCRPNLVCS (X) 3 KWCKY (X) 2 (SEQ ID NO: 2)
(Where X is any amino acid residue)
[3] The polypeptide library according to [1] or [2], wherein each polypeptide constituting the polypeptide library is present in a form associated with a polynucleotide encoding each polypeptide. .
[4] A polynucleotide library composed of a group of polynucleotides encoding a plurality of polypeptides having an ICK scaffold, wherein the amino acid sequences of the polypeptides encoded by the polynucleotides are the following (i) to ( a polynucleotide library characterized by having an amino acid sequence randomized simultaneously in the region of iv);
(I) the amino acid sequence from the fourth C-terminal side of Cys-1 to the first N-terminal side of Cys-2 in the loop I region between Cys-1 and Cys-2;
(Ii) an amino acid sequence from the third C-terminal side of Cys-2 to the first N-terminal side of Cys-3 in the loop II region between Cys-2 and Cys-3;
(Iii) the amino acid sequence from the second C-terminal side of Cys-5 to the third N-terminal side of Cys-6 in the loop III region between Cys-5 and Cys-6; and (iv) from Cys-6 Amino acid sequence from the third C-terminal side to the C-terminal side of Cys-6 in the tail region on the C-terminal side.
[5] The polynucleotide library according to the above [4], wherein each polynucleotide constituting the polynucleotide library is a polynucleotide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of the following formula [1];
Formula [1]
DCLGF (X) 3 CIP (X) 4 CCRPNLVCS (X) 3 KWCKY (X) 2 (SEQ ID NO: 2)
(Wherein X is any amino acid residue).
[6] The polynucleotide library according to [4] or [5] above, wherein the polynucleotide library is incorporated in an expression vector.
[7] The polynucleotide library according to [6], wherein a secretory signal sequence is present upstream of the polynucleotide in the expression vector.
[8] The polynucleotide library according to [6] or [7], wherein in the expression vector, a polynucleotide encoding a target protein is incorporated on the same vector.
[9] A polynucleotide library composed of a group of transformed hosts transformed with the expression vector according to any one of [6] to [8].
[10] The polynucleotide library according to [9], wherein the transformed host is a gram-negative bacterium.
[11] A method for identifying a polypeptide having affinity for a target, comprising the following steps (a) to (d):
(A) A polypeptide library composed of a group of a plurality of polypeptides having an ICK scaffold, and the amino acid sequences of the respective polypeptides were simultaneously randomized in the following regions (i) to (iv) Preparing a polypeptide library characterized by having an amino acid sequence;
(I) the amino acid sequence from the fourth C-terminal side of Cys-1 to the first N-terminal side of Cys-2 in the loop I region between Cys-1 and Cys-2;
(Ii) an amino acid sequence from the third C-terminal side of Cys-2 to the first N-terminal side of Cys-3 in the loop II region between Cys-2 and Cys-3;
(Iii) the amino acid sequence from the second C-terminal side of Cys-5 to the third N-terminal side of Cys-6 in the loop III region between Cys-5 and Cys-6; and (iv) from Cys-6 An amino acid sequence from the third C-terminal side to the C-terminal side of Cys-6 in the tail region on the C-terminal side;
(B) contacting the polypeptide library with the target;
(C) selecting a polypeptide bound to the target; and (d) determining an amino acid sequence of the selected polypeptide.
[12] The method according to [11] above, wherein each polypeptide constituting the polypeptide library is a polypeptide comprising an amino acid sequence of the following formula [1];
Formula [1]
DCLGF (X) 3 CIP (X) 4 CCRPNLVCS (X) 3 KWCKY (X) 2 (SEQ ID NO: 2)
(Where X is any amino acid residue)
[13] A step of determining the amino acid sequence of the polypeptide in which each polypeptide constituting the polypeptide library in the step (a) is associated with a polynucleotide encoding each polypeptide ( The method according to [11] or [12], wherein d) is performed by determining a base sequence of a polynucleotide bound to the polypeptide.
[14] A method for identifying a polypeptide having affinity for a target, comprising the following steps (a) to (h):
(A) A polypeptide library composed of a group of a plurality of polypeptides having an ICK scaffold, and the amino acid sequences of the respective polypeptides were simultaneously randomized in the following regions (i) to (iv) A polypeptide library having an amino acid sequence and a polypeptide library in which each polypeptide constituting the polypeptide library is associated with a polynucleotide encoding each polypeptide is prepared. The step of:
(I) the amino acid sequence from the fourth C-terminal side of Cys-1 to the first N-terminal side of Cys-2 in the loop I region between Cys-1 and Cys-2;
(Ii) an amino acid sequence from the third C-terminal side of Cys-2 to the first N-terminal side of Cys-3 in the loop II region between Cys-2 and Cys-3;
(Iii) the amino acid sequence from the second C-terminal side of Cys-5 to the third N-terminal side of Cys-6 in the loop III region between Cys-5 and Cys-6; and (iv) from Cys-6 An amino acid sequence from the third C-terminal side to the C-terminal side of Cys-6 in the tail region on the C-terminal side;
(B) contacting the polypeptide library with the target;
(C) selecting a polypeptide bound to the target;
(D) a step of amplifying, transcribing and translating a polynucleotide encoding the selected polypeptide to produce a second polypeptide library, wherein the second polypeptide library is Each of the constituent polypeptides is present in a form associated with a polynucleotide encoding the respective polypeptide;
(E) contacting the second polypeptide library with the target;
(F) selecting a polypeptide bound to the target;
(G) repeating steps (d)-(f) if necessary; and (h) determining the amino acid sequence of the selected polypeptide.
[15] The method according to [14] above, wherein each polypeptide constituting the polypeptide library is a polypeptide comprising an amino acid sequence of the following formula [1];
Formula [1]
DCLGF (X) 3 CIP (X) 4 CCRPNLVCS (X) 3 KWCKY (X) 2 (SEQ ID NO: 2)
(Where X is any amino acid residue)
[16] A method for identifying a polypeptide having affinity for a target, comprising the following steps (a) to (h):
(A) a polynucleotide library that exists in the form of an expression vector, comprising a group of expression vectors comprising a polynucleotide encoding a plurality of polypeptides having an ICK scaffold, wherein the polynucleotide encoded by each polynucleotide A step of preparing a polynucleotide library, wherein the amino acid sequence of the peptide has an amino acid sequence that is simultaneously randomized in the following regions (i) to (iv):
(I) the amino acid sequence from the fourth C-terminal side of Cys-1 to the first N-terminal side of Cys-2 in the loop I region between Cys-1 and Cys-2;
(Ii) an amino acid sequence from the third C-terminal side of Cys-2 to the first N-terminal side of Cys-3 in the loop II region between Cys-2 and Cys-3;
(Iii) the amino acid sequence from the second C-terminal side of Cys-5 to the third N-terminal side of Cys-6 in the loop III region between Cys-5 and Cys-6; and (iv) from Cys-6 An amino acid sequence from the third C-terminal side to the C-terminal side of Cys-6 in the tail region on the C-terminal side;
(B) expressing the corresponding polypeptide in each of the transformed cells of each expression vector constituting the polynucleotide library;
(C) contacting each of the polypeptides with the target;
(D) selecting a polypeptide bound to the target;
(E) amplifying a polynucleotide in the transformed cell expressing the selected polypeptide to produce a second polynucleotide library;
(F) a step of expressing a corresponding polypeptide in each of the transformed cells of each expression vector constituting the second polynucleotide library;
(G) contacting each of the polypeptides with the target;
(H) selecting a polypeptide bound to the target;
(I) repeating steps (e)-(h) as necessary; and (j) determining the amino acid sequence of the selected polypeptide.
[17] The method according to [16] above, wherein each polynucleotide constituting the polynucleotide library is a polynucleotide encoding an amino acid sequence of the following formula [1];
Formula [1]
DCLGF (X) 3 CIP (X) 4 CCRPNLVCS (X) 3 KWCKY (X) 2 (SEQ ID NO: 2)
(Where X is any amino acid residue)
[18] A method for identifying a polypeptide having affinity for a target membrane protein, comprising the following steps (a) to (h):
(A) A polynucleotide encoding a plurality of polypeptides having an ICK scaffold is composed of a group of expression vectors inserted downstream of the secretory signal sequence, and the amino acid sequence of the polypeptide encoded by each polynucleotide is: A polynucleotide library having amino acid sequences that are simultaneously randomized in the following regions (i) to (iv), wherein the expression vector contains a polynucleotide encoding the target membrane protein: Providing a polynucleotide library;
(I) the amino acid sequence from the fourth C-terminal side of Cys-1 to the first N-terminal side of Cys-2 in the loop I region between Cys-1 and Cys-2;
(Ii) an amino acid sequence from the third C-terminal side of Cys-2 to the first N-terminal side of Cys-3 in the loop II region between Cys-2 and Cys-3;
(Iii) the amino acid sequence from the second C-terminal side of Cys-5 to the third N-terminal side of Cys-6 in the loop III region between Cys-5 and Cys-6; and (iv) from Cys-6 An amino acid sequence from the third C-terminal side to the C-terminal side of Cys-6 in the tail region on the C-terminal side;
(B) Expressing each expression vector constituting the polynucleotide library in a transformed gram-negative bacterium, the target membrane protein on the inner membrane surface, and the polypeptide encoded by each polynucleotide in the periplasmic space, respectively. The step of causing;
(C) contacting each of the polypeptides with the target membrane protein within the periplasmic space;
(D) forming a spheroplast of the transformed gram-negative bacterium and selecting a polypeptide bound to the target membrane protein;
(E) a second polynucleotide library obtained by amplifying a polynucleotide in a transformed cell expressing the selected polypeptide and inserting it into an expression vector, wherein each polynucleotide is inserted downstream of a secretory signal sequence. And producing a second polynucleotide library composed of a group of expression vectors containing a polynucleotide encoding the target membrane protein;
(F) Transforming each expression vector constituting the second polynucleotide library into a gram-negative bacterium, the target membrane protein on the inner membrane surface, and the polypeptide encoded by each polynucleotide in the periplasmic space A step of expressing each;
(G) contacting each of the polypeptides with the target membrane protein within the periplasmic space;
(H) forming a spheroplast of the transformed gram-negative bacterium and selecting a polypeptide bound to the target membrane protein;
(I) repeating steps (e)-(h) as necessary; and (j) determining the amino acid sequence of the selected polypeptide.
[19] A polypeptide comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 to 14, having a high affinity for the m2 receptor. ;
[20] An inhibitor of a m2 receptor comprising a polypeptide having any amino acid sequence of SEQ ID NOs: 3 to 14 and having a polypeptide having high affinity for the m2 receptor as an active ingredient.

本発明により、比較的低分子でシステイン残基数も少ない安定なICKスキャフォールドを利用したライブラリーが提供できたため、所望の標的タンパク質に親和性の高いポリペプチドを、簡便かつ効率よくスクリーニングすることが可能となった。また、グラム陰性菌のペリプラズミック空間内でも正確に折りたたまれた状態でポリペプチドをディスプレイできるため、膜タンパク質を標的としたハイスループットスクリーニング系にも適用できる。したがって、本発明により、所望の標的、特に膜タンパク質に特異的に結合する新規なポリペプチドを創製することができる。   According to the present invention, since a library using a stable ICK scaffold having a relatively small molecule and a small number of cysteine residues can be provided, a polypeptide having a high affinity for a desired target protein can be easily and efficiently screened. Became possible. In addition, since the polypeptide can be displayed in a correctly folded state in the periplasmic space of Gram-negative bacteria, it can also be applied to a high-throughput screening system targeting membrane proteins. Therefore, according to the present invention, a novel polypeptide that specifically binds to a desired target, particularly a membrane protein, can be created.

図１は、クモ毒由来ICKペプチドのスキャフォールド；システイン残基(C1-C6)の位置と本発明に係るランダム化した領域(濃いグレー部分)を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing a spider venom-derived ICK peptide scaffold; positions of cysteine residues (C1-C6) and randomized regions (dark gray portions) according to the present invention. 図２は、ICKペプチドファミリーのアラインメントを示す図である。FIG. 2 is a diagram showing an alignment of the ICK peptide family. 図３は、ペプチドPeak A4-1のHainantoxin-4に基づくホモロジーモデリングを示す図である。FIG. 3 is a diagram showing homology modeling based on Hainantoxin-4 of peptide Peak A4-1. 図４は、分子進化技術「iPS&S法」の工程を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing a process of the molecular evolution technique “iPS & S method”. 図５Ａは、プラスミドpGRII-Txの構成概要を示す図であり、図５Ｂは、膜タンパク質とペプチドの発現確認を示す写真である。FIG. 5A is a diagram showing an outline of the construction of plasmid pGRII-Tx, and FIG. 5B is a photograph showing confirmation of expression of membrane proteins and peptides. 図６は、プラスミドpGRII-Txの構成を示す図である。FIG. 6 shows the structure of plasmid pGRII-Tx. 図７は、プラスミドpGRII-USERの構成を示す図である。FIG. 7 shows the structure of plasmid pGRII-USER. 図８は、非特異的吸着ペプチドの除去工程を示す図である。FIG. 8 is a diagram showing a step of removing nonspecifically adsorbed peptides. 図９は、ペプチドA-1とA-2によるムスカリン受容体リガンドNMSとm2受容体との結合阻害アッセイの結果を示す図である。FIG. 9 is a diagram showing the results of a binding inhibition assay between muscarinic receptor ligand NMS and m2 receptor using peptides A-1 and A-2. 図１０Ａは、ペプチドA-1と非特異的結合ペプチドの構造概要を示す図である。図１０Ｂは、ペプチドが吸着する大腸菌のプラスミドの検出を示す図である。図１０Ｃは、ぺリプラズムに発現するペプチドの検出を示す図である。FIG. 10A is a diagram showing a structural outline of peptide A-1 and a non-specific binding peptide. FIG. 10B is a diagram showing detection of E. coli plasmid adsorbed with peptide. FIG. 10C is a diagram showing detection of peptides expressed in the periplasm. 図１１は、ペプチド標的特異性評価実験の概要を示す図である。FIG. 11 is a diagram showing an outline of the peptide target specificity evaluation experiment. 図１２は、「iPS&S法」におけるプラスミド、膜タンパク質、ポリペプチドの局在様態を示す図である。FIG. 12 is a diagram showing the localization of plasmids, membrane proteins, and polypeptides in the “iPS & S method”.

１．本発明のICKスキャフォールドを利用したポリペプチドライブラリー
（１）ICKスキャフォールドについて
本発明において「ICKスキャフォールド」とは、クモやサソリ毒に見いだされる30−70アミノ酸残基からなるポリペプチドにおいて、６個のシステイン残基(Cys-1−Cys-6)が、Cys-1とCys-4、Cys-2とCys-5、及びCys-3とCys-6でS-S結合することにより形成する三次構造(図１)をいう。図２に、ICKスキャフォールドを有する代表的なポリペプチドのアミノ酸配列のアラインメントを示す。図の右端の数字はアミノ酸の長さである。このアラインメントに示されるポリペプチドの名称とプロテインデータベースのアクセッション番号を以下の表に示す。
1. Polypeptide Library Using ICK Scaffold of the Present Invention (1) About ICK Scaffold In the present invention, “ICK scaffold” is a polypeptide consisting of 30-70 amino acid residues found in spider and scorpion venom. Tertiary structure formed by SS bonds of two cysteine residues (Cys-1-Cys-6) with Cys-1 and Cys-4, Cys-2 and Cys-5, and Cys-3 and Cys-6 (Fig. 1). FIG. 2 shows an amino acid sequence alignment of a representative polypeptide having an ICK scaffold. The number at the right end of the figure is the length of the amino acid. The name of the polypeptide shown in this alignment and the accession number of the protein database are shown in the table below.

図２の１行目に示すポリペプチドは、Grammostola spatulataから単離された新規なカルシウムチャネルブロッカー毒「A4-1」(特許文献３、非特許文献８)ポリペプチドである。
A4-1は、34アミノ酸を含むICK型の毒素であり、カルシウムチャネルに結合してこれらを阻害することが見いだされている。ICKモチーフを含むペプチドは既に数多く知られており、それぞれがNa+チャネル、Ca2+チャネル、K+チャネルのブロッカーや酵素阻害など様々な生物活性を持つことが知られている。このペプチドの遺伝子は加速進化により、標的分子との相互作用に関係する領域に積極的にアミノ酸置換のおこる塩基置換(変異)を導入しているのが特徴で、これが標的分子の多様性を生み出す原因となっている。本発明者らは、この点に着目してICKモチーフを崩さないループ部分やテール領域にランダム配列を導入してICK型ランダムペプチドライブラリーを設計することを着想した。
図２に、A4-1と、既知のチャネル阻害毒であるパウルトキシン(PaurTx3)やハイナントキシン(HnTx4)等の一次アミノ酸配列のマルチプルアラインメントを示す。相同な配列はブロックで示されている。
他のICK型ポリペプチドについても、図２のアラインメントに示されるICKモチーフをフレームワーク構造として利用することで、A4-1と同様のポリペプチドライブラリーを容易に作製することができる。 The polypeptide shown in the first line of FIG. 2 is a novel calcium channel blocker poison “A4-1” (Patent Document 3, Non-Patent Document 8) polypeptide isolated from Grammostola spatulata.
A4-1 is an ICK-type toxin containing 34 amino acids and has been found to bind to and inhibit calcium channels. Many peptides containing the ICK motif are already known, and each of them is known to have various biological activities such as Na + channel, Ca 2+ channel, K + channel blocker and enzyme inhibition. The gene of this peptide is characterized by the introduction of base substitution (mutation) that actively undergoes amino acid substitution in the region related to the interaction with the target molecule by accelerated evolution, which creates diversity of the target molecule It is the cause. The present inventors focused on this point and conceived of designing an ICK random peptide library by introducing a random sequence into a loop portion or tail region that does not disrupt the ICK motif.
FIG. 2 shows multiple alignments of primary amino acid sequences such as A4-1 and known channel-inhibiting toxins such as Pauloxin (PaurTx3) and Hynantoxin (HnTx4). Homologous sequences are indicated by blocks.
For other ICK-type polypeptides, a polypeptide library similar to A4-1 can be easily prepared by using the ICK motif shown in the alignment of FIG. 2 as a framework structure.

なお、A4-1の三次構造は、BioPackage(MolSoft L.L.C., California, USA)の３Ｄモデリングソフトウエア部品を用いて予測され、ループおよびβシートの形成に関与する残基は、既知のハイナントキシン(HnTx4) の構造と比較して推定された(図３)。図３において、二次構造の情報から得られる、β構造はリボン状矢印として示す。数字はループを形成するターンの開始および停止位置を示し、１番目のアミノ酸を１として表す。
図１、図２に示されるように、Cys-1とCys-4、Cys-2とCys-5、Cys-3とCys-6とのそれぞれの間のS-S結合によって、３箇所のループ状の領域(Cys-1とCys-2の間の領域、Cys-2とCys-3の間の領域、Cys-5とCys-6の間の領域)が形成され、それぞれループI、ループII、ループIIIとよぶ(Cys-4とCys-5の間には主にβシート構造が存在する。)。これら３つのループ領域、及びCys-6からＣ末端側のテール領域が、カルシウムチャネルと結合する領域であると予測される。 The tertiary structure of A4-1 is predicted using a 3D modeling software component of BioPackage (MolSoft LLC, California, USA). Residues involved in the formation of loops and β sheets are known hyantoxins (HnTx4 ) And was estimated (Fig. 3). In FIG. 3, the β structure obtained from the secondary structure information is shown as a ribbon-like arrow. The numbers indicate the start and stop positions of the turn forming the loop, and the first amino acid is represented as 1.
As shown in FIG. 1 and FIG. 2, three loops are formed by SS bonds between Cys-1 and Cys-4, Cys-2 and Cys-5, and Cys-3 and Cys-6. Regions (regions between Cys-1 and Cys-2, regions between Cys-2 and Cys-3, and regions between Cys-5 and Cys-6) are formed, loop I, loop II, and loop, respectively. It is called III (a β-sheet structure exists mainly between Cys-4 and Cys-5). These three loop regions and the tail region on the C-terminal side from Cys-6 are predicted to be regions that bind to calcium channels.

（２）ポリペプチドライブラリーについて
本発明のポリペプチドライブラリーにおいては、ICKスキャフォールドのループI，IIおよびIIIの領域とテール領域の一部のアミノ酸配列がランダム化されており、標的タンパク質と親和性の高いポリペプチドをスクリーニングするために用いられる。
標的タンパク質としては、本来の標的であるカルシウムチャネルのみならず、各種イオンチャネル、受容体、酵素、その他の天然および非天然の化合物を標的として選択することができる。しかし、好ましくは、膜表面でシグナル伝達に関わる膜受容体、薬物トランスポーター、イオンチャネル、細胞表面抗原などの膜タンパク質である。特に、リガンドが未知のＧタンパク質共役型受容体であるオーファンレセプターのリガンド検索に好ましく用いられる。
標的として、タンパク質以外に、糖類、糖タンパク質、核酸、低分子化合物に適用することもできる。
本明細書において、ポリペプチドライブラリーというとき、アミノ酸配列の異なる複数のポリペプチドの集合を意味し、ポリペプチドライブラリーのそれぞれのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの集合をポリヌクレオチドライブラリーと称する。
ランダム化とは、ポリペプチドの任意の所与の位置に２種類以上のアミノ酸残基が存在するようなポリペプチドの集合を用意することをいう。ランダム化されたポリペプチドにおいては、所与の位置に全ての可能なアミノ酸残基が同様の確率でまたは異なる確率で存在してもよく、所与の位置に選択された特定の２種類以上のアミノ酸残基が存在してもよい。例えば，配列中の特定の位置において２０種類のアミノ酸残基が各５％の確率で存在することができるが、各アミノ酸残基の存在の確率は５％に限定されず、様々でありうる。また、後述する子孫ライブラリーの場合に見られるように、前回のラウンドで得られた配列情報に基づいてアミノ酸配列の特定の位置のみをランダム化し、残りの位置の配列が固定されているようにライブラリーを作製してもよい。 (2) Polypeptide library In the polypeptide library of the present invention, the amino acid sequences of loops I, II, and III of the ICK scaffold and a part of the tail region are randomized and have affinity for the target protein. Used to screen for high polypeptides.
As target proteins, not only calcium channels, which are the original targets, but also various ion channels, receptors, enzymes, and other natural and non-natural compounds can be selected as targets. However, membrane proteins such as membrane receptors involved in signal transduction on the membrane surface, drug transporters, ion channels and cell surface antigens are preferred. In particular, it is preferably used for ligand search of orphan receptors, which are G protein-coupled receptors with unknown ligands.
In addition to proteins, the target can be applied to saccharides, glycoproteins, nucleic acids, and low molecular weight compounds.
In the present specification, the term “polypeptide library” means a set of a plurality of polypeptides having different amino acid sequences, and a set of polynucleotides encoding each polypeptide in the polypeptide library is referred to as a polynucleotide library.
Randomization refers to preparing a set of polypeptides such that two or more amino acid residues are present at any given position in the polypeptide. In a randomized polypeptide, all possible amino acid residues may be present at a given position with similar or different probabilities, and two or more specific types selected at a given position. An amino acid residue may be present. For example, 20 kinds of amino acid residues can be present at a specific position in the sequence with a probability of 5%, but the probability of the presence of each amino acid residue is not limited to 5% and may vary. In addition, as seen in the case of the offspring library described later, only a specific position of the amino acid sequence is randomized based on the sequence information obtained in the previous round, and the sequence of the remaining positions is fixed. A library may be created.

（３）ポリペプチドライブラリーの作製について
本発明のポリペプチドライブラリーを用いたスクリーニングの対象となる標的は、本来の標的であるタンパク質(カルシウムチャネル)のみならず、むしろそれとは異なる各種の標的を対象とし、それぞれの標的に対して親和性の高いポリペプチドを取得しようとするものであるため、実際に標的の認識、結合に関与する領域は、ループの先端部分、テール領域のごく狭い領域であると考えられるが、本発明者らの試行錯誤の結果、アミノ酸配列のみならずその周辺のアミノ酸配列も変更する必要があり、かつ全て同時に変更する必要があることがわかった。つまり、ループI、II、III領域及びテール領域それぞれにおいて、特定の２〜４アミノ酸残基を同時にランダム化してポリペプチドライブラリーとする必要がある。 (3) Production of polypeptide library Targets to be screened using the polypeptide library of the present invention are not limited to the original target protein (calcium channel), but rather to various different targets. Because it is intended to obtain a polypeptide with high affinity for each target, the region actually involved in target recognition and binding is a very narrow region of the loop tip and tail region. As a result of the trial and error by the present inventors, it has been found that not only the amino acid sequence but also the surrounding amino acid sequences need to be changed, and all of them need to be changed simultaneously. That is, it is necessary to simultaneously randomize specific 2 to 4 amino acid residues in each of the loop I, II, III region and tail region to form a polypeptide library.

すなわち、ICKスキャフォールドのアミノ酸配列中の下記の領域が同時にランダム化される。下記アミノ酸配列をランダム化することで、フレームワークを保ったまま、標的との結合特性の異なる種々のポリペプチドからなるライブラリーが得られる。
（ｉ）Cys-1とCys-2の間のループI領域中のCys-1のＣ末側４番目からCys-2のＮ末側１番目までのアミノ酸配列；
（ｉｉ）Cys-2とCys-3の間のループII領域中のCys-2のＣ末側３番目からCys-3のＮ末側１番目までのアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）Cys-5とCys-6の間のループIII領域中のCys-5のＣ末側２番目からCys-6のＮ末側３番目までのアミノ酸配列；および
（ｉｖ）Cys-6からＣ末端側のテール領域中のCys-6のＣ末側３番目からＣ末端までのアミノ酸配列。
上記(ｉ)〜(ｉｖ)領域の典型的な例としては、それぞれ図２の第１行に示されるポリペプチドＡ４−１のアミノ酸配列における(ｉ)６番目のメチオニンから８番目のリジンまでの３アミノ酸残基、(ｉｉ)１２番目のアスパラギン酸から１５番目のリジンまでの４アミノ酸残基，(ｉｉｉ)２５番目のアルギニンから２７番目のヒスチジンまでの３アミノ酸残基、及び(ｉｖ)３３番目のバリンから３４番目のフェニルアラニンまでの２アミノ酸残基からなるアミノ酸配列があげられる。
すなわち、本発明の典型的なポリペプチドライブラリーは、「A4-1」アミノ酸配列由来の、以下の式〔１〕で示されるアミノ酸配列を含む複数のポリペプチド群からなるライブラリーである。
式〔１〕：
DCLGF(X)3CIP(X)4CCRPNLVCS(X)3KWCKY(X)2 (配列番号２)
(式中、Xは任意のアミノ酸残基である)
このライブラリーでは１２アミノ酸残基がランダムとなり、ライブラリーが持つ配列のバリエーションは、理論上２０12＝約１０16通りと極めて多様である。
ICKスキャフォールドを有するポリペプチド、例えば図２に示されるポリペプチドについても、図２のアラインメントなどを参照することで、A4-1に基づくポリペプチドライブラリーと同様の手法で(ｉ)〜(ｉｖ)領域をランダム化したポリペプチドライブラリーを製造することができる。 That is, the following regions in the amino acid sequence of the ICK scaffold are simultaneously randomized. By randomizing the following amino acid sequences, a library composed of various polypeptides having different binding properties with the target can be obtained while maintaining the framework.
(I) the amino acid sequence from the fourth C-terminal side of Cys-1 to the first N-terminal side of Cys-2 in the loop I region between Cys-1 and Cys-2;
(Ii) an amino acid sequence from the third C-terminal side of Cys-2 to the first N-terminal side of Cys-3 in the loop II region between Cys-2 and Cys-3;
(Iii) the amino acid sequence from the second C-terminal side of Cys-5 to the third N-terminal side of Cys-6 in the loop III region between Cys-5 and Cys-6; and (iv) from Cys-6 Amino acid sequence from the third C-terminal side to the C-terminal side of Cys-6 in the tail region on the C-terminal side.
As typical examples of the above (i) to (iv) regions, (i) from the 6th methionine to the 8th lysine in the amino acid sequence of polypeptide A4-1 shown in the first row of FIG. 3 amino acid residues, (ii) 4 amino acid residues from the 12th aspartic acid to the 15th lysine, (iii) 3 amino acid residues from the 25th arginine to the 27th histidine, and (iv) the 33rd position Amino acid sequences consisting of 2 amino acid residues from valine to 34th phenylalanine.
That is, a typical polypeptide library of the present invention is a library composed of a plurality of polypeptide groups derived from the amino acid sequence “A4-1” and comprising an amino acid sequence represented by the following formula [1].
Formula [1]:
DCLGF (X) 3 CIP (X) 4 CCRPNLVCS (X) 3 KWCKY (X) 2 (SEQ ID NO: 2)
(Where X is any amino acid residue)
In this library, 12 amino acid residues are random, and the variation of the sequence of the library is theoretically extremely diverse, with 20 12 = about 10 16 .
With respect to a polypeptide having an ICK scaffold, for example, the polypeptide shown in FIG. 2, (i) to (iv) in the same manner as the polypeptide library based on A4-1 by referring to the alignment of FIG. Polypeptide libraries with randomized regions can be produced.

本発明のポリペプチドライブラリーは，通常のポリペプチド合成の技術を用いて、手動または自動により製造することができるが、以下２．又は３．以降で述べる対応するポリヌクレオチドライブラリーを作製し、当該ポリヌクレオチドライブラリーが形質転換宿主中で発現されることで作製されることが好ましい。   The polypeptide library of the present invention can be produced manually or automatically using a conventional polypeptide synthesis technique. Or 3. It is preferable that a corresponding polynucleotide library described below is prepared and the polynucleotide library is prepared by being expressed in a transformed host.

２．ディスプレイ型ポリペプチドライブラリーについて
（１）ディスプレイ技術
本発明のポリペプチドライブラリーを構成する各ポリペプチドは、それぞれのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在することが好ましい。すなわち、ポリペプチドとそれをコードするポリヌクレオチドが、「ディスプレイ技術」により１対１で対応づけられる。「ディスプレイ技術」としては、種々の公知の手法が適用できるが、例えば、ライブラリーの各メンバーポリペプチドを、ピューロマイシン等の化学物質を介して各ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと結合する方法を用いることができる(インビトロウイルス法)。このような無細胞翻訳系を利用した対応づけ技術には、cDNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、STABLE(非共有結合DNAディスプレイ)、マイクロビーズドロップレット法、共有結合DNAディスプレイなどがある。あるいは、ファージディスプレイ、イーストディスプレイ、バクテリアディスプレイ等のディスプレイ技術におけるように、個々のファージや細胞中に、ライブラリーの各メンバーポリペプチドとそれぞれのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの対が含まれていてもよい。
ここで、ポリペプチドライブラリーの各ポリペプチドに対応する各ポリヌクレオチドが、それぞれ１つの形質転換細胞内の発現ベクター中に組み込まれているとき、これらの各ポリヌクレオチドの群からなるポリヌクレオチドライブラリーは当該形質転換細胞で発現したポリペプチドライブラリーに対応している。本発明において、ポリヌクレオチドライブラリーというとき、通常各ポリヌクレオチドの群からなるポリヌクレオチドライブラリーを指すが、各ポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターの群、及び各発現ベクターが導入された各形質転換細胞の群もポリヌクレオチドライブラリーということができる。 2. About display type polypeptide library (1) Display technology It is preferable that each polypeptide which comprises the polypeptide library of this invention exists in the form matched with the polynucleotide which codes each polypeptide. That is, a polypeptide and a polynucleotide encoding the polypeptide are associated one-to-one by “display technology”. As the “display technology”, various known methods can be applied. For example, a method of binding each member polypeptide of a library to a polynucleotide encoding each polypeptide via a chemical substance such as puromycin. Can be used (in vitro virus method). Corresponding techniques using such cell-free translation systems include cDNA display, ribosome display, STABLE (non-covalent DNA display), microbead droplet method, and covalent DNA display. Alternatively, as in display technologies such as phage display, yeast display, and bacterial display, each phage or cell contains a pair of each member polypeptide of the library and a polynucleotide encoding each polypeptide. Also good.
Here, when each polynucleotide corresponding to each polypeptide in the polypeptide library is incorporated into an expression vector in one transformed cell, a polynucleotide library consisting of each group of these polynucleotides is It corresponds to the polypeptide library expressed in the transformed cells. In the present invention, the term “polynucleotide library” generally refers to a polynucleotide library consisting of a group of each polynucleotide. The group of expression vectors into which each polynucleotide is incorporated, and each transformation into which each expression vector has been introduced. A group of cells can also be referred to as a polynucleotide library.

（２）ポリヌクレオチドライブラリーの作製方法
本発明のポリヌクレオチドライブラリーは、ICKスキャフォールドを有するポリペプチドの特定の複数箇所の位置のアミノ酸が同時にランダム化されたポリペプチドライブラリーを発現するように、ランダム化するアミノ酸配列と対応した塩基配列がランダム化されている必要がある。
ポリヌクレオチドの具体的な作製方法は、周知の遺伝子への変異導入方法が用いられる。典型的にはランダム配列を入れる所望のアミノ酸残基の位置にトリプレットコドンNNS(ＮはＧ、Ｃ、Ｔ、Ａ、ＳはＧあるいはＣ)のヌクレオチドを導入したオリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせてPCRにより作製する(特許文献１，２などでも同様の手法が用いられている。UNIT 3.17 in “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, New York, N.Y. 1995の方法参照。)。その際、テール部にランダム導入するためのプライマーとしては、終止コドンをコードする塩基配列を用いることが好ましい。他に、酵素的に短いオリゴヌクレオチドを結合する方法(GENE, 164：49-53, 1995)や短いDNAをブロックとしてつなぐ人工遺伝子合成法(Slonomics社)などを用いることができる。
本発明のポリヌクレオチドライブラリーは、典型的にはICKスキャフォールドを有するポリペプチドライブラリーをコードする遺伝子ライブラリーとして提供され、発現ベクター中に組み込まれてポリペプチドを発現し対応付けられた状態となっている。例えば、ファージ表面や形質転換宿主表面でポリペプチドをディスプレイできれば、当該ポリペプチドと標的タンパク質との親和性を観察でき、親和性の高いポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が決定でき、直ちに複数ラウンドからなる分子進化システムに供し得る。 (2) Preparation method of polynucleotide library The polynucleotide library of the present invention expresses a polypeptide library in which amino acids at specific positions of a polypeptide having an ICK scaffold are simultaneously randomized. The base sequence corresponding to the amino acid sequence to be randomized must be randomized.
As a specific method for producing a polynucleotide, a well-known method for introducing a mutation into a gene is used. Typically, PCR is performed by combining oligonucleotide primers introduced with a triplet codon NNS (N is G, C, T, A, S is G or C) at the position of the desired amino acid residue into which a random sequence is inserted. (A similar method is also used in Patent Documents 1 and 2 and the like. See the method of UNIT 3.17 in “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, New York, NY 1995). In that case, it is preferable to use the base sequence which codes a stop codon as a primer for random introduction | transduction to a tail part. In addition, a method of binding short oligonucleotides enzymatically (GENE, 164: 49-53, 1995), an artificial gene synthesis method connecting short DNAs as blocks (Slonomics), or the like can be used.
The polynucleotide library of the present invention is typically provided as a gene library that encodes a polypeptide library having an ICK scaffold, and is incorporated into an expression vector so that the polypeptide is expressed and associated. ing. For example, if a polypeptide can be displayed on the surface of a phage or a transformed host, the affinity between the polypeptide and the target protein can be observed, and a polynucleotide sequence encoding a high affinity polypeptide can be determined. It can be used for a molecular evolution system.

３．iPS&S法に用いるためのライブラリー
本発明のライブラリーは、本発明者らが開発した下記４．の「ペリプラズム内分泌・選択法(iPS&S法)」によるハイスループットスクリーニング系で用いることができる。当該iPS&S法が適用される場合には、本発明のポリペプチドライブラリーを構成する各ポリペプチドは、１個のグラム陰性菌宿主(例えば大腸菌)にそれぞれのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター(プラスミド)が形質転換により導入されているので、１宿主細菌ごとに１種類のポリペプチドのみが発現している。また、用いる発現ベクターには、あらかじめ(又は同時に)標的膜タンパク質をコードするDNAが組み込まれており、ICKポリペプチドをコードするDNAを導入する位置の上流には分泌シグナル配列が存在している(又は分泌シグナル配列を繋いで導入されている)ため、宿主細菌内で細菌の内膜表面には標的膜タンパク質が発現しており、ICKポリペプチドはペリプラズム間隙内に分泌されている(図５、図１２を参照。)。
iPS&S法に用いることができる宿主細菌としては、ペリプラズム間隙を有するどのようなグラム陰性細菌であっても適用可能であるが、好ましくは大腸菌である。また、ポリヌクレオチドライブラリーを導入するために用いる発現ベクターとしては、宿主細菌に適合する適宜の公知発現ベクター、好ましくは発現プラスミドを用いることができる。 3. Library for use in iPS & S method The library of the present invention is the following 4. Can be used in a high-throughput screening system based on the “periplasm endocrine / selection method (iPS & S method)”. When the iPS & S method is applied, each polypeptide constituting the polypeptide library of the present invention is an expression vector containing a polynucleotide encoding each polypeptide in one Gram-negative bacterial host (for example, E. coli). Since (plasmid) is introduced by transformation, only one type of polypeptide is expressed per host bacterium. In addition, the expression vector to be used has a DNA encoding the target membrane protein incorporated in advance (or simultaneously), and a secretory signal sequence exists upstream of the position where the DNA encoding the ICK polypeptide is introduced ( Alternatively, the target membrane protein is expressed on the surface of the bacterial inner membrane in the host bacterium, and the ICK polypeptide is secreted into the periplasmic space (FIG. 5, See FIG.
As a host bacterium that can be used in the iPS & S method, any gram-negative bacterium having a periplasmic space can be applied, but Escherichia coli is preferable. As an expression vector used for introducing the polynucleotide library, an appropriate known expression vector suitable for a host bacterium, preferably an expression plasmid can be used.

典型的な大腸菌発現用プラスミドの調製法について以下に述べる。
ランダム化したポリヌクレオチドの5’側に、大腸菌のペリプラズム間隙に輸送するためのシグナル配列に続いて精製用のタグ配列をアミノ末端側に配し、かつ外膜タンパク質(OmpAなど)及び大腸菌のペリプラズム間隙内酵素(DsbCなど)との融合タンパク質として発現させるように、プロモーター配列を含む制御配列を付加し、3’側には停止コドンが付加するようにプラスミドを設計する。
標的膜タンパク質分子(ムスカリン性アセチルコリンm2受容体)とマルトース結合タンパク質との融合タンパク質をコードするDNAがプロモーター配列と共に、同一の発現プラスミド内に挿入されるように設計することが好ましい。
ここで、ヒトm2受容体のcDNA塩基配列は、DNAデータベースAccession No. BC106742から得られる。
その際の宿主微生物としては、ペリプラズム間隙を有するグラム陰性細菌であり、その発現ベクターが入手可能であればどのような細菌であってもよいが、典型的には大腸菌を用いる。なお、形質転換手法及び培養条件などは通常の遺伝子組換え手法が適用できる。 A method for preparing a typical plasmid for E. coli expression is described below.
A signal sequence for transport to the periplasmic space of E. coli is placed on the 5 'side of the randomized polynucleotide, followed by a tag sequence for purification on the amino terminal side, and outer membrane proteins (such as OmpA) and E. coli periplasm A plasmid is designed so that a control sequence including a promoter sequence is added and a stop codon is added on the 3 ′ side so that the protein is expressed as a fusion protein with an interstitial enzyme (such as DsbC).
It is preferable that the DNA encoding the fusion protein of the target membrane protein molecule (muscarinic acetylcholine m2 receptor) and maltose binding protein is designed so as to be inserted into the same expression plasmid together with the promoter sequence.
Here, the cDNA base sequence of the human m2 receptor is obtained from the DNA database Accession No. BC106742.
The host microorganism in this case is a Gram-negative bacterium having a periplasmic space, and any bacterium can be used as long as its expression vector is available, but typically E. coli is used. In addition, a normal gene recombination technique can be applied to the transformation technique and culture conditions.

４．スクリーニング方法
（１）本発明のポリペプチドライブラリーを用いたスクリーニング方法
本発明は、本発明のポリペプチドライブラリーを用いて標的タンパク質と結合しうるポリペプチドを同定する方法を提供する。この方法においては、まず本発明のポリペプチドライブラリーを標的と接触させる。ポリペプチドライブラリーと標的との接触は、菌体内中にポリペプチドライブラリーと標的とを共発現することにより行うことができる。接触の条件は、標的との親和性の高いポリペプチドが標的と結合したまま残り、親和性の低いポリペプチドが結合しないように設定することができる。また、標的の特性、本発明にしたがって選択されるべきポリペプチドの用途、予測される非特異的結合の程度などを考慮することができる。
ポリペプチドの同定に際しては、複数のラウンドの選択を行うことができ、その場合には、ラウンドごとに接触の条件を変更してもよい。
次のラウンドには、ポリペプチドライブラリーのうち，標的と結合していないポリペプチドを除去し，標的と結合したポリペプチドを選択する。この選択工程を容易にするためには，複数の方法がある。一つの方法はポリペプチドライブラリーおよび標的のいずれかを固相に固定化しておくことである。固相としては、ガラスまたはプラスチックのプレート、ビーズ、多孔性粒子、膜、磁気粒子などの、当該技術分野において知られる任意のものを用いることができる。このようにして選択されたポリペプチドを回収して、そのアミノ酸配列を決定することにより，標的と結合するポリペプチドを同定することができる。
あるいは、ポリペプチドライブラリーをマイクロアレイのフォーマットで、各コンパートメントにどのような配列のポリペプチドが存在するかがわかるように製造して、標的と接触させてもよい。マイクロアレイに標識した標的を加えてインキュベートした後，未結合ポリペプチドを洗い流し、マイクロアレイ上に残存する標識を検出する。標的が結合しているコンパートメントの位置から、標的と結合しうるポリペプチドの配列を知ることができる。 4). Screening Method (1) Screening Method Using the Polypeptide Library of the Present Invention The present invention provides a method for identifying a polypeptide that can bind to a target protein using the polypeptide library of the present invention. In this method, the polypeptide library of the present invention is first contacted with a target. Contact between the polypeptide library and the target can be performed by co-expressing the polypeptide library and the target in the microbial cells. The contact condition can be set so that a polypeptide having a high affinity for the target remains bound to the target and a polypeptide having a low affinity does not bind. In addition, the characteristics of the target, the use of the polypeptide to be selected according to the present invention, the expected degree of non-specific binding, etc. can be taken into account.
In identifying a polypeptide, a plurality of rounds can be selected, and in that case, the contact conditions may be changed for each round.
In the next round, polypeptides that do not bind to the target are removed from the polypeptide library, and the polypeptides that bind to the target are selected. There are several ways to facilitate this selection process. One method is to immobilize either the polypeptide library or the target on a solid phase. As the solid phase, any known in the art such as glass or plastic plate, beads, porous particles, membranes, magnetic particles, etc. can be used. By recovering the polypeptide thus selected and determining its amino acid sequence, the polypeptide that binds to the target can be identified.
Alternatively, a polypeptide library may be produced in a microarray format so that it can be seen what sequence of polypeptide is present in each compartment and contacted with the target. After adding the labeled target to the microarray and incubating, unbound polypeptide is washed away and the label remaining on the microarray is detected. From the position of the compartment to which the target is bound, the sequence of the polypeptide that can bind to the target can be known.

（２）ディスプレイ型ライブラリーを用いる場合のスクリーニング法
本発明のディスプレイ型ライブラリーを用いる場合は、本発明のポリペプチドライブラリーを構成する各ポリペプチドが、それぞれのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在するように、ポリペプチドライブラリーを製造する。このようなポリペプチド・ポリヌクレオチドライブラリーを用いると、ポリヌクレオチドの塩基配列を決定することにより、標的と結合したポリペプチドのアミノ酸配列の決定を容易に行うことができる。
さらに、ポリヌクレオチドと対応づけられた形のポリペプチドライブラリーを用いると、標的に結合したポリペプチドの群を選択した後、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの群を回収して、これを増幅し、転写し、および翻訳することにより、第２のポリペプチドライブラリーを製造することができる。この第２のポリペプチドライブラリーは、個々のポリペプチドは元のポリペプチドライブラリーと同じランダム化領域およびフレームワーク領域を有するが、ライブラリー全体として標的との親和性が増加しており、ランダム化領域の配列の多様性が減少しているはずである。本明細書においてはこの多様性の減少を「濃縮」と称する。次に、この第２のポリペプチドライブラリーを用いて、最初の工程と同様に標的と結合するポリペプチドを選択し、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから第３のポリペプチドライブラリーを製造する。このようにして、多数ラウンドの選択およびライブラリーの生成を行うことにより、標的との親和性がより高いポリペプチドの集合を得ることができる。 (2) Screening method when using display type library When using the display type library of the present invention, each polypeptide constituting the polypeptide library of the present invention corresponds to a polynucleotide encoding each polypeptide. Polypeptide libraries are produced so that they exist in a labeled form. When such a polypeptide / polynucleotide library is used, the amino acid sequence of the polypeptide bound to the target can be easily determined by determining the base sequence of the polynucleotide.
Furthermore, when a polypeptide library in a form associated with a polynucleotide is used, after selecting a group of polypeptides bound to a target, a group of polynucleotides encoding the polypeptide is recovered and amplified. By transcribing and translating, a second polypeptide library can be produced. In this second polypeptide library, individual polypeptides have the same randomized and framework regions as the original polypeptide library, but the overall library has increased affinity for the target and the randomized regions The sequence diversity should be reduced. This reduction in diversity is referred to herein as “concentration”. Next, using this second polypeptide library, a polypeptide that binds to the target is selected in the same manner as in the first step, and a third polypeptide library is produced from the polynucleotide encoding this polypeptide. In this way, by performing multiple rounds of selection and library generation, a collection of polypeptides with higher affinity for the target can be obtained.

（３）試験管内分子進化法について
本発明のポリペプチド−ポリヌクレオチドライブラリーのサイズが小さい場合(ランダム化する対象のアミノ酸配列領域が少ない場合)、は下記の公知の試験管内分子進化技術が適用できる。または、上記した十分に選択、濃縮されてサイズの小さくなった高親和性ポリペプチド−ポリヌクレオチドに対して当該分子進化技術を適用することで、より高親和性のポリペプチド−ポリヌクレオチドを取得することができる。
具体的には、１ラウンド目のスクリーニング終了後、２ラウンド目の第２のポリペプチドライブラリーを分子進化の手法を適用して作製することができる。すなわち、標的に結合するとして選択されたポリペプチドの配列を決定した後、その配列の一部をさらにランダム化したいわゆる子孫ライブラリーを作製する手法である。配列の一部のランダム化とは、例えば、選択されたポリペプチドのランダム化領域のアミノ酸配列に１個あるいは複数の変異を導入し、残りのアミノ酸配列は固定化したアミノ酸配列を設計する。 (3) In vitro molecular evolution method When the size of the polypeptide-polynucleotide library of the present invention is small (when the amino acid sequence region to be randomized is small), the following known in vitro molecular evolution technology is applied. it can. Alternatively, a higher-affinity polypeptide-polynucleotide is obtained by applying the molecular evolution technique to the high-affinity polypeptide-polynucleotide that has been sufficiently selected, concentrated and reduced in size. be able to.
Specifically, after completion of the first round of screening, a second polypeptide library of the second round can be prepared by applying a molecular evolution technique. That is, after determining the sequence of a polypeptide selected to bind to a target, a technique for preparing a so-called progeny library in which a part of the sequence is further randomized. Randomization of a part of the sequence means, for example, that one or more mutations are introduced into the amino acid sequence of the randomized region of the selected polypeptide, and the remaining amino acid sequence is designed to be an immobilized amino acid sequence.

その際には、ある領域(例えばループＩ)のアミノ酸配列は固定して別の領域(例えばループII)のアミノ酸配列に１個あるいは複数の変異を導入したアミノ酸配列を設計する、選択された複数のポリペプチドのランダム化領域に現れたアミノ酸残基をシャッフリングしてこれらを混成させた新たなアミノ酸配列を設計する、などの方法により行うことが好ましい。
このようにして、一部のアミノ酸配列が前ラウンドで選択されたポリペプチドのアミノ酸配列と同じであり残りのアミノ酸が異なる複数のポリペプチドの群からなる第２のポリペプチドライブラリーを製造することができる。次に、この第２のポリペプチドライブラリーを用いて標的と結合するポリペプチドを選択し、以下同様にして、複数のラウンドの選択およびライブラリーのさらなるランダム化を行うことができる。このようにして、標的に結合しうるポリペプチドにさらに変異を導入して人工的な分子進化を促進することが可能となる。
通常、好ましくは２〜１０ラウンド、より好ましくは３〜８ラウンド繰り返すことで、より標的親和性の高いポリペプチドを得ることができる。
また、本発明のライブラリーは、例えば１０15種類などのサイズの大きいライブラリーであるため、十分に選択・濃縮を繰り返した後のラウンドで、上記分子進化の手法を適用することが好ましい。すなわち、例えば１０15種類のライブラリーを用いる場合、１ラウンド目では、例えば１０6種類を選択し、２ラウンド目では、まずこれをそのまま増幅(多様性は増えない)して２回目のセレクションをする。順次、各ラウンドでは増幅、形質転換(もしくは転写・翻訳)、選択を繰り返し、５ラウンド以上、選択・濃縮を繰り返すと、１０グループぐらいにペプチド配列に収束してくる。最終的に選ばれた配列に対して、上記分子進化の手法を適用し、さらに親和性や特異性を高める操作を施す。 In that case, the amino acid sequence of a certain region (for example, loop I) is fixed, and an amino acid sequence in which one or more mutations are introduced into the amino acid sequence of another region (for example, loop II) is selected. It is preferable to carry out by a method such as designing a new amino acid sequence in which amino acid residues appearing in the randomized region of the polypeptide are shuffled to hybridize them.
In this way, it is possible to produce a second polypeptide library comprising a group of a plurality of polypeptides having a partial amino acid sequence identical to the amino acid sequence of the polypeptide selected in the previous round and the remaining amino acids being different. it can. This second polypeptide library can then be used to select polypeptides that bind to the target, and so on, for multiple rounds of selection and further randomization of the library. In this way, it is possible to further introduce a mutation into a polypeptide that can bind to a target to promote artificial molecular evolution.
Usually, a polypeptide with higher target affinity can be obtained by preferably repeating 2 to 10 rounds, more preferably 3 to 8 rounds.
In addition, since the library of the present invention is a library having a large size such as 10 15 types, it is preferable to apply the above-described molecular evolution method in a round after sufficiently selecting and concentrating. That is, for example, when 10 15 kinds of libraries are used, for example, 10 6 kinds are selected in the first round, and in the second round, they are first amplified as they are (the diversity does not increase), and the second selection is performed. To do. Sequentially, amplification, transformation (or transcription / translation), and selection are repeated in each round. When selection and enrichment are repeated for 5 rounds or more, the peptide sequences converge to about 10 groups. The above-described molecular evolution method is applied to the finally selected sequence, and an operation for further increasing the affinity and specificity is performed.

（４）iPS&S法を用いたスクリーニング方法
iPS&S法においては、ポリヌクレオチドとそれに対応したポリペプチドから構成されるポリペプチドライブラリーは、大腸菌内に導入したベクターとそれにより発現したポリペプチドが標的に結合したときに初めて形成される(図４)。すなわち、標的となる膜タンパク質は大腸菌の内膜に発現させるとともに、ポリペプチドはペリプラズム間隙に発現させる(図１２)。標的にポリペプチドが結合したときには、スフェロプラストとポリペプチドが複合体を形成し、ポリヌクレオチドとポリペプチドが間接的に対応づけられる。標的にポリペプチドが結合しないときには、スフェロプラストと複合体を形成することができないのでPCRしてもポリヌクレオチドのライブラリーを構成することができない。したがって、ポリペプチドライブラリーを構成したポリヌクレオチドライブラリーのみが第２のポリヌクレオチドライブラリーとなり、試験管内分子進化がきわめて簡便に適用でき、より標的親和性の高いポリペプチドを効率的に取得できる。 (4) Screening method using iPS & S method
In the iPS & S method, a polypeptide library composed of a polynucleotide and a corresponding polypeptide is first formed when a vector introduced into Escherichia coli and a polypeptide expressed thereby bind to a target (FIG. 4). . That is, the target membrane protein is expressed in the inner membrane of E. coli, and the polypeptide is expressed in the periplasmic space (FIG. 12). When the polypeptide binds to the target, the spheroplast and the polypeptide form a complex, and the polynucleotide and the polypeptide are indirectly associated with each other. When the polypeptide does not bind to the target, it cannot form a complex with spheroplasts, and thus a library of polynucleotides cannot be constructed even by PCR. Therefore, only the polynucleotide library constituting the polypeptide library becomes the second polynucleotide library, and molecular evolution in vitro can be applied very simply, and a polypeptide with higher target affinity can be efficiently obtained.

具体的には、大腸菌などの外膜を除いてスフェロプラストの状態にした後、洗浄して非結合性のペプチドを除去する。
次いで、内膜表面に発現している膜タンパク質と結合したポリペプチドを選択する。
その際の選択方法としては、そのＮ末端側に付加したタグ(Strep-tagなど)を用いてStreptactinビーズで選択してくる方法が典型的であり、タグとしては、他にT7、ヒスチジン、FLAGタグ等があり、磁気ビーズ、セファロースビーズ、アガロースビーズ、多孔性等のビーズ、プレート又はメンブレンを用いて選択してもよい。
選択された、ビーズに固定された状態の「ポリペプチド−膜タンパク質−スフェロプラスト複合体」のスフェロプラスト細胞内部のプラスミドDNAを単離し、当該プラスミドDNA中でポリヌクレオチドライブラリーを構成するポリヌクレオチド配列をPCRで増幅する。
当該増幅されたポリヌクレオチド配列をもとに同様の発現プラスミドを作製し、形質転換、発現、選択という２ラウンド以降のサイクルを複数回繰り返して、より標的膜タンパク質に対する親和性の高いポリヌクレオチドを濃縮する。
第２ラウンド以降の選択のラウンドにおいては、ポリペプチド−膜タンパク質−スフェロプラスト複合体のインキュベーション時間を減少させたり、洗浄の回数を増加させたり、温度を上げることにより、 選択圧を順次高くして、より結合親和性の高いポリペプチドを濃縮することができる。 Specifically, after removing the outer membrane such as Escherichia coli into a spheroplast state, washing is performed to remove the non-binding peptide.
Subsequently, the polypeptide couple | bonded with the membrane protein currently expressed on the inner membrane surface is selected.
As a selection method at that time, a method of selecting with Streptactin beads using a tag (Strep-tag or the like) added to the N-terminal side is typical. Other tags include T7, histidine, FLAG There are tags, etc., and magnetic beads, sepharose beads, agarose beads, porous beads, plates, or membranes may be used.
The plasmid DNA inside the spheroplast cell of the selected “polypeptide-membrane protein-spheroplast complex” fixed to the beads is isolated, and the polynucleotide constituting the polynucleotide library in the plasmid DNA is isolated. The nucleotide sequence is amplified by PCR.
Based on the amplified polynucleotide sequence, a similar expression plasmid is prepared, and the cycles of transformation, expression, and selection are repeated multiple times, and the polynucleotide with higher affinity for the target membrane protein is concentrated. To do.
In the second and subsequent rounds of selection, the selection pressure is increased gradually by decreasing the incubation time of the polypeptide-membrane protein-spheroplast complex, increasing the number of washes, or increasing the temperature. Thus, a polypeptide having a higher binding affinity can be concentrated.

確認、評価のための手法としては、標的膜タンパク質遺伝子をあらかじめ卵母細胞や培養細胞に導入して発現させた系を用意し、選択されたポリペプチドと標的膜タンパク質を含む膜画分との親和性を測定する手法が用いられる。他には、膜タンパク質を介して起こる様々なシグナル伝達、例えば細胞内カルシウム、cAMP、アラキドン酸濃度の変化や電位変化をそれぞれの感受性蛍光色素により測定したり、放射性同位元素等による細胞内外のフラックス測定をしたり、標的膜タンパク質を含む人工脂質膜再構成系を基板に固定して、それとポリペプチドとの相互作用を表面プラズモン共鳴(SPR)や水晶発振マイクロバランス(QCM)等の装置で測定する手段がある。あるいは細胞の増殖、生死、分化などの変化を調べる手段がある。   As a method for confirmation and evaluation, a system in which a target membrane protein gene is introduced and expressed in advance in an oocyte or a cultured cell is prepared, and the selected polypeptide and a membrane fraction containing the target membrane protein are mixed. A technique for measuring affinity is used. In addition, various signal transductions that occur through membrane proteins, such as changes in intracellular calcium, cAMP, and arachidonic acid concentrations and potential changes, are measured with each sensitive fluorescent dye, and intracellular and extracellular fluxes due to radioisotopes, etc. Measurement or immobilizing an artificial lipid membrane reconstitution system containing target membrane proteins on a substrate and measuring their interaction with the polypeptide using a device such as surface plasmon resonance (SPR) or quartz oscillation microbalance (QCM) There is a means to do. Alternatively, there are means for examining changes such as cell proliferation, life and death, and differentiation.

５．本発明のスクリーニングで得られた標的との高親和性ポリペプチドの用途
本発明の標的としては、タンパク質、糖類、脂質、低分子化合物など種々のものが対象になるので、各標的を特異的に認識するポリペプチドを提供することができるので、得られたポリペプチドは、試料中の標的を検出するための検出試薬、タンパク質精製用のアフィニティー担体などとして用いることができる。例えば、ウイルス抗原蛋白や癌抗原の検出用、糖タンパク質の糖鎖の同定用などに用いることができる。
また、本発明における好ましい標的は、生体膜表面で各種情報伝達に関わっている膜タンパク質である。したがって、例えば各種膜レセプター、薬物トランスポーター、イオンチャネルなどのアゴニスト、アンタゴニストの探索の他、オーファンレセプターのリガンド物質の探索にも有用であり、それ自体に治療剤や診断薬などの薬理作用が期待できるほか、将来の創薬開発のリード化合物を提供できる。
本発明の実施例では、標的として典型的な膜タンパク質であるムスカリン性アセチルコリン受容体m2サブタイプ(m2)受容体を用いて、６ラウンドのスクリーニング工程の後に、m2受容体に高い親和性のあるグループＡ〜Ｆの１０ポリペプチド(PepA〜PepF)を同定することができた。そのうちで発現量が高かった３ポリペプチド(PepA-1、PepA-2及びPepC)に対して卵母細胞を用いた系により高親和性を確認し、本発明のライブラリーを用いたスクリーニングが有効であることを実証した。
これらポリペプチド自身にm2受容体との結合のアンタゴニスト、又はアゴニストとしての用途があると同時に、当該ポリペプチドを免疫原として用いることでm2リガンドを認識する抗体が提供できることも期待できる。m2受容体は、ムスカリン受容体のうちでも脳、心臓や平滑筋に局在し、特に心臓では専らm2サブタイプが発現している受容体であるから、当該受容体の作用をブロックする、又は活性化させる薬剤のリード化合物として用いることで、さらに有効な神経疾患、心臓疾患(抗不整脈など)、消化器系疾患(消化性潰瘍など)の治療薬の提供が可能になる。 5. Use of high-affinity polypeptide with target obtained by screening of the present invention As the target of the present invention, various targets such as proteins, saccharides, lipids, low-molecular compounds are targeted. Since a polypeptide to be recognized can be provided, the obtained polypeptide can be used as a detection reagent for detecting a target in a sample, an affinity carrier for protein purification, and the like. For example, it can be used for detection of viral antigen proteins and cancer antigens, identification of glycoprotein sugar chains, and the like.
Moreover, the preferable target in this invention is the membrane protein which is concerned with various information transmission on the biological membrane surface. Therefore, it is useful not only for searching for agonists and antagonists such as various membrane receptors, drug transporters, ion channels, etc., but also for searching for orphan receptor ligand substances, which itself have pharmacological actions such as therapeutic agents and diagnostic agents. In addition to expectations, we can provide lead compounds for future drug development.
In an embodiment of the present invention, a typical membrane protein, muscarinic acetylcholine receptor m2 subtype (m2) receptor, is used as a target, and has high affinity for m2 receptor after 6 rounds of screening steps. Ten polypeptides (PepA-PepF) from group AF could be identified. High affinity was confirmed by the system using oocytes for the 3 polypeptides (PepA-1, PepA-2 and PepC) whose expression levels were high, and screening using the library of the present invention was effective. It proved that.
These polypeptides themselves can be used as antagonists or agonists for binding to the m2 receptor, and at the same time, it can be expected that antibodies that recognize m2 ligands can be provided by using the polypeptides as immunogens. The m2 receptor is a receptor that is localized in the brain, heart, and smooth muscle among the muscarinic receptors, and in particular the m2 subtype is expressed in the heart, so that the action of the receptor is blocked, or By using it as a lead compound for a drug to be activated, it becomes possible to provide more effective therapeutic agents for neurological diseases, heart diseases (such as antiarrhythmia), and digestive system diseases (such as peptic ulcer).

６．本発明の実施態様
以下に、実施例で作成し使用したA4-1に基づくライブラリーを例として、本発明のICKインビボライブラリーの構造および作製方法、ならびにこれをiPS&S法で用いて試験管分子進化させた場合について、標的と親和性の高いポリペプチドのスクリーニング方法を実施態様として説明する。なお、本発明は、当該実施態様には限定されない。 6). Embodiments of the Invention Hereinafter, the structure and production method of the ICK in vivo library of the present invention, and a test tube molecule using the same in the iPS & S method, taking as an example the library based on A4-1 created and used in the Examples In the case of evolution, a method for screening a polypeptide having a high affinity for a target will be described as an embodiment. Note that the present invention is not limited to this embodiment.

（１）ポリペプチドライブラリー
A4-1のICKスキャフォールドに基づいて作製されたポリペプチドライブラリーは、下記のアミノ酸配列からなる式〔１〕のポリペプチドの群から構成される。
式〔１〕
DCLGF(X)3CIP(X)4CCRPNLVCS(X)3KWCKY(X)2 (配列番号２)
(式中、Xは任意のアミノ酸残基である)
ここで、式〔１〕は、カルシウムチャネルの結合に関与すると推定されているアミノ酸を含む３つのループ領域およびテール領域がランダム化されている構造を有する。図１に示されるように、ループを形成していると予測される領域およびその周辺のアミノ酸残基をランダム化した。さらに、テール領域のアミノ酸残基もランダム化した。ベータシートを形成しているアミノ酸は変更していない。 (1) Polypeptide library
A polypeptide library prepared based on the A4-1 ICK scaffold is composed of a group of polypeptides of the formula [1] consisting of the following amino acid sequences.
Formula [1]
DCLGF (X) 3 CIP (X) 4 CCRPNLVCS (X) 3 KWCKY (X) 2 (SEQ ID NO: 2)
(Where X is any amino acid residue)
Here, the formula [1] has a structure in which three loop regions including amino acids presumed to be involved in calcium channel binding and a tail region are randomized. As shown in FIG. 1, the region predicted to form a loop and the surrounding amino acid residues were randomized. In addition, tail region amino acid residues were also randomized. The amino acids forming the beta sheet are not changed.

（２）ICKインビボライブラリー用のコンストラクトの調製
A4-1遺伝子を含むためには、ループおよびＣ末端部分のアミノ酸配列をランダム化したA4-1遺伝子の５’側にスペーサー、大腸菌のDsbCタンパク質、OmpAのシグナル配列、Strep・tagII配列、SD配列およびプロモーター配列を付加し、３’側には停止コドンが付加するように設計した。さらに、これらの上流には標的となるムスカリン性アセチルコリン受容体がマルトース結合タンパク質とフュージョンする形で付加されている。プロモーター配列およびSD配列は、A4-1遺伝子の大腸菌での転写および翻訳に、DsbCタンパク質およびOmpA配列は、A4-1遺伝子から発現されるポリペプチドがペリプラズム間隙に移行するように、Strep・tagII配列は、ライブラリーの精製に用いるための配列である。得られた全長コンストラクトを直接配列決定して確認している。 (2) Preparation of construct for ICK in vivo library
In order to include A4-1 gene, the amino acid sequence of the loop and C-terminal part is randomized on the 5 'side of A4-1 gene, spacer, Escherichia coli DsbC protein, OmpA signal sequence, Strep / tagII sequence, SD sequence And a promoter sequence were added, and a stop codon was added on the 3 ′ side. Furthermore, a target muscarinic acetylcholine receptor is added upstream of these in the form of fusion with maltose binding protein. Promoter sequence and SD sequence for transcription and translation of A4-1 gene in E. coli, and DsbC protein and OmpA sequence for Strep / tagII sequence so that the polypeptide expressed from A4-1 gene moves into the periplasmic space. Is a sequence for use in purification of the library. The resulting full-length construct is confirmed by direct sequencing.

具体的には、以下の手順で行った。
ムスカリン性アセチルコリン受容体m2サブタイプは、Furukawaらの方法(H. Furukawa and T. Haga： J. Biochem. (2000) 127, 151-161)に従い、マルトース結合タンパク質(MBP)との融合タンパク質として大腸菌内膜に発現させた。一方、ICKモチーフを持つポリペプチドは、大腸菌の外膜タンパク質OmpAのシグナルペプチド配列に続いて精製用のタグ配列Strep tag IIをアミノ末端側に配して、ジスルフィド異性化酵素DsbCとの融合タンパク質としてペリプラズムに発現させるようにプラスミドの構築を行った(図５Ａ)。このプラスミドDNAを用いて大腸菌のトランスフォーメーションを行った。MBP(43kDa)と融合したm2(35kDa)およびDsbC(25kDa)と融合したICK型ペプチド(4kDa)の発現は、それぞれ抗MBP抗体および抗Strep-tag抗体によるWesternブロット法により、理論値のサイズ(78kDaと29kDa)のバンドが確認できた(図５Ｂ)。図５Ａに示す受容体とペプチドをタンデムにコードするプラスミドDNAにより大腸菌の形質転換を行うことにより、受容体を内膜に発現し、同時にペプチドをペリプラズム間隙に分泌する発現系を構築することができた。 Specifically, the following procedure was used.
The muscarinic acetylcholine receptor m2 subtype is expressed in E. coli as a fusion protein with maltose binding protein (MBP) according to the method of Furukawa et al. (H. Furukawa and T. Haga: J. Biochem. (2000) 127, 151-161). Expressed in the intima. On the other hand, the polypeptide with the ICK motif is a fusion protein with the disulfide isomerase DsbC by placing the signal peptide sequence of the outer membrane protein OmpA of Escherichia coli followed by the purification tag sequence Strep tag II on the amino terminal side. A plasmid was constructed so as to be expressed in the periplasm (FIG. 5A). Using this plasmid DNA, E. coli was transformed. Expression of m2 (35 kDa) fused with MBP (43 kDa) and ICK type peptide (4 kDa) fused with DsbC (25 kDa) was determined by Western blotting with anti-MBP antibody and anti-Strep-tag antibody, respectively, according to the theoretical size ( 78 kDa and 29 kDa) bands were confirmed (FIG. 5B). By transforming E. coli with plasmid DNA that encodes the receptor and peptide shown in FIG. 5A in tandem, an expression system that expresses the receptor on the inner membrane and simultaneously secretes the peptide into the periplasmic space can be constructed. It was.

（３）スクリーニング及び分子進化工程
本発明のICKライブラリーとm2受容体をともに大腸菌内のペリプラズム間隙で発現させる。その後、大腸菌の外膜を除きスフェロプラストの状態にし、Strep・tactinビーズとともにインキュベートする。数回洗浄した後に、m2受容体に結合したポリペプチドを含むICKを溶出する。溶出した生成物をPCR増幅し、非特異的結合成分との差分処理(Subtraction)をした後にベクターに導入する。このベクターを大腸菌にトランスフォーメーションし、上述のようにICKとm2受容体を共発現させる。このようにして、複数ラウンドの選択およびポリペプチドライブラリー生成を行うことができる。第２ラウンド以降の選択のラウンドにおいては、ICKと標的とのインキュベーション時間を減少させ、洗浄の回数を増加させることにより、選択圧を順次高くして、より結合親和性の高いポリペプチドを濃縮することができる。 (3) Screening and molecular evolution process Both the ICK library of the present invention and the m2 receptor are expressed in the periplasmic space in E. coli. Thereafter, the outer membrane of E. coli is removed to form a spheroplast and incubated with Strep • tactin beads. After several washes, ICK containing the polypeptide bound to the m2 receptor is eluted. The eluted product is amplified by PCR, introduced into a vector after subtraction with a non-specific binding component (Subtraction). This vector is transformed into E. coli and co-expressed with ICK and m2 receptor as described above. In this way, multiple rounds of selection and polypeptide library generation can be performed. In the second and subsequent rounds of selection, by decreasing the incubation time between ICK and the target and increasing the number of washings, the selection pressure is sequentially increased to concentrate a polypeptide having a higher binding affinity. be able to.

具体的には、以下の手順でm2受容体結合ペプチドをスクリーニングした。
形質転換した大腸菌においては、それぞれのペリプラズムで発現したICK型ペプチドとm2受容体が相互作用する。この中で強い結合活性のあるものを選択した。それには先ず、大腸菌の外膜を除いてスフェロプラストの状態にして、非結合性のペプチドを除去する。受容体と結合したペプチドは、そのＮ末端側に付加したStrep-tagを用いてStreptactinビーズで選択してくる。即ち、Streptactin‐[Strep-tag‐ペプチド]‐[m2受容体‐大腸菌(スフェロプラスト)]の複合体が選択されてくる。m2受容体と結合するペプチドの配列情報は、同時に釣られてくる大腸菌が持つプラスミドDNAに含まれるため、この配列をPCRで増幅して、２ラウンド目以降の発現・選択のサイクルを続けて、目的の配列遺伝子を濃縮する(図４)。
選択のサイクルを６ラウンド行った結果、以下の６グループ１０種類のペプチドを同定した。 Specifically, m2 receptor binding peptides were screened by the following procedure.
In transformed E. coli, the ICK peptide expressed in each periplasm interacts with the m2 receptor. Among these, those having strong binding activity were selected. For this purpose, first, the outer membrane of Escherichia coli is removed to form spheroplasts, and unbound peptides are removed. Peptides bound to the receptor are selected with Streptactin beads using a Strep-tag added to the N-terminal side. That is, a complex of Streptactin- [Strep-tag-peptide]-[m2 receptor-Escherichia coli (spheroplast)] is selected. Since the sequence information of the peptide that binds to the m2 receptor is contained in the plasmid DNA of Escherichia coli that is caught at the same time, this sequence is amplified by PCR, and the expression and selection cycles after the second round are continued. The sequence gene of interest is concentrated (FIG. 4).
As a result of 6 rounds of selection cycles, the following 6 groups and 10 types of peptides were identified.

（４）本発明のスクリーニングで得られるポリペプチド
以下の実施例に示されるように、本発明においては、６ラウンドの選択およびライブラリーの生成により、m2受容体と結合しうる１０種類のペプチドを同定した。２〜４程度のアミノ酸変異を１グループとすると大きく６グループに分けられる。
以下、それぞれをグループＡ〜Ｆといい、グループ内のポリペプチドをPepA〜Fという。(なお、基のライブラリーでランダム化した領域を下線で示す)
（Ａ）グループＡ
グループＡのポリペプチドは、下記の式〔２〕で表される。
式〔２〕：
DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVX 1 X 2 KWCKYX 3 X 4 (配列番号３)
(式中、X1はV,L又はGであり、X2はA又はGであり、X3はA,P,Y又はなくてもよく、
X4はN,I,L又はなくてもよい。)
具体的には、以下の４つのポリペプチドである。

PepA-1：DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVVAKWCKY (配列番号４)
PepA-2：DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVVAKWCKYAN (配列番号５)
PepA-3：DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVLGKWCKYPI (配列番号６)
PepA-4：DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVGAKWCKYYL (配列番号７)
（Ｂ）グループＢ
PepB：DCLGFRWRCIPGINLCCRPNLVCSNSKKWCKYVM (配列番号８)
（Ｃ）グループＣ
PepC：DCLGFSMGCIPNQVRCCRPNLVCSVDLKWCKYSH (配列番号９)
（Ｄ）グループＤ
PepD：DCLGFRWSCIPWEASCCRPNLVCSDWKKWCKYIL (配列番号１０)
（Ｅ）グループＥ
PepE：DCLGFLGWCIPREELCCRPNLVCSNNWKWCKYTI (配列番号１１)
（Ｆ）グループＦ
グループＦのポリペプチドは、下記の式〔３〕で表される。
式〔３〕：
DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYX 5 X 6 (配列番号１２)
(式中、X5はA又はDであり、X6はL又はYである。)
具体的には、以下の２つのポリペプチドである。
PepF-1：DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYAL (配列番号１３)
PepF-2：DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYDY (配列番号１４) (4) Polypeptides obtained by screening of the present invention As shown in the following examples, in the present invention, 10 types of peptides capable of binding to the m2 receptor were selected by 6 rounds of selection and library generation. Identified. If 2 to 4 amino acid mutations are defined as 1 group, they can be roughly divided into 6 groups.
Hereafter, each is called group AF, and the polypeptide in a group is called PepA-F. (Note that the area randomized in the original library is underlined)
(A) Group A
The group A polypeptide is represented by the following formula [2].
Formula [2]:
DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VX 1 X 2 KWCKY X 3 X 4 (SEQ ID NO: 3)
(Wherein X 1 is V, L or G, X 2 is A or G, X 3 may be A, P, Y or absent,
X 4 may be N, I, L or absent. )
Specifically, it is the following four polypeptides.

PepA-1: DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VVA KWCKY (SEQ ID NO: 4)
PepA-2: DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VVA KWCKY AN (SEQ ID NO: 5)
PepA-3: DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VLG KWCKY PI (SEQ ID NO: 6)
PepA-4: DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VGA KWCKY YL (SEQ ID NO: 7)
(B) Group B
PepB: DCLGF RWR CIP GINL CCRPNLVCS NSK KWCKY VM (SEQ ID NO: 8)
(C) Group C
PepC: DCLGF SMG CIP NQVR CCRPNLVCS VDL KWCKY SH (SEQ ID NO: 9)
(D) Group D
PepD: DCLGF RWS CIP WEAS CCRPNLVCS DWK KWCKY IL (SEQ ID NO: 10)
(E) Group E
PepE: DCLGF LGW CIP REEL CCRPNLVCS NNW KWCKY TI (SEQ ID NO: 11)
(F) Group F
The group F polypeptide is represented by the following formula [3].
Formula [3]:
DCLGF EVV CIP GMLD CCRPNLVCS TVS KWCKY X 5 X 6 (SEQ ID NO: 12)
(In the formula, X 5 is A or D, and X 6 is L or Y.)
Specifically, it is the following two polypeptides.
PepF-1: DCLGF EVV CIP GMLD CCRPNLVCS TVS KWCKY AL (SEQ ID NO: 13)
PepF-2: DCLGF EVV CIP GMLD CCRPNLVCS TVS KWCKY DY (SEQ ID NO: 14)

これらのポリペプチドのうち発現量が十分なものについて、以下の手順でm2受容体結合ペプチドの特性解析を行った。
ムスカリン性アセチルコリン受容体(mAChR)m1, m2, m3およびm4サブタイプは、それぞれのcDNAから合成したRNAをアフリカツメガエル卵母細胞に微小注入して細胞膜上に受容体を発現させ、受容体を含む膜画分として調製した。PepCは大腸菌において遺伝子組換え体として発現し、それを精製した。受容体の結合競合物質として[3H]-N-methylscopolamine([3H]-NMS)を用い、ペプチドとの結合競合実験を行った。
その結果、365nM PepCはm2とNMSとの結合を37.5％阻害した。一方m1、m3、m4に対する阻害率は、438nMにおいてそれぞれ6.0％、10.4％、6.2％であり、PepCは他のmAChRサブタイプと区別してm2受容体を特異的に阻害することが分かった。
上記６種類のポリペプチドのうち、m2受容体に対して高い親和性を示すことが確認されたポリペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである。
PepA-1：DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVVAKWCKY (配列番号４)
PepA-2：DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVVAKWCKYAN (配列番号５)
PepC：DCLGFSMGCIPNQVRCCRPNLVCSVDLKWCKYSH (配列番号９) Among these polypeptides, those with sufficient expression levels were characterized for m2 receptor binding peptides by the following procedure.
The muscarinic acetylcholine receptor (mAChR) m1, m2, m3 and m4 subtypes contain receptors expressed on the cell membrane by microinjecting RNA synthesized from their respective cDNA into Xenopus oocytes. Prepared as a membrane fraction. PepC was expressed as a gene recombinant in E. coli and purified. [ 3 H] -N-methylscopolamine ([ 3 H] -NMS) was used as a receptor binding competitor, and binding competition experiments with peptides were performed.
As a result, 365 nM PepC inhibited the binding between m2 and NMS by 37.5%. On the other hand, the inhibition rates for m1, m3, and m4 were 6.0%, 10.4%, and 6.2% at 438 nM, respectively. It was found that PepC specifically inhibits the m2 receptor as distinguished from other mAChR subtypes.
Among the six types of polypeptides described above, the amino acid sequences of the polypeptides confirmed to have high affinity for the m2 receptor are as follows.
PepA-1: DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VVA KWCKY (SEQ ID NO: 4)
PepA-2: DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VVA KWCKY AN (SEQ ID NO: 5)
PepC: DCLGF SMG CIP NQVR CCRPNLVCS VDL KWCKY SH (SEQ ID NO: 9)

したがって、本発明のICKライブラリーを用いることで、標的タンパク質に対して高い親和性を有するポリペプチドが複数種類容易に取得することができる。そして、得られたポリペプチド類、例えば本実施例で得られたm2受容体高親和性ポリペプチド類は、m2受容体との結合の阻害剤として、種々の疾患の治療に有用であると考えられる。   Therefore, by using the ICK library of the present invention, a plurality of types of polypeptides having high affinity for the target protein can be easily obtained. The obtained polypeptides, for example, the m2 receptor high affinity polypeptides obtained in this example, are considered to be useful for the treatment of various diseases as inhibitors of binding to the m2 receptor. .

以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
なお、本発明の実施例で用いた遺伝子組換え技術、PCR法、その他の手法などの具体的な手順や条件は、特に断らない限り、Sambrook and Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NY(2001)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III(組換えDNA技術)」、東京化学同人 (1992); R. Wu ed.,"Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, PartB) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法により行うことができる。
また、本発明で引用した先行文献又は特許出願明細書の記載内容は、本明細書の記載として組み入れるものとする。 EXAMPLES The present invention will be described below in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
The specific procedures and conditions such as gene recombination techniques, PCR methods, and other methods used in the examples of the present invention are, unless otherwise specified, Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); DM Glover et al. Ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1995; Secondary Biochemistry Experiment Course 1, Genetic Research Method II ", Tokyo Kagaku Doujin (1986); Japan Biochemical Society, New Biochemistry Experiment Course 2, Nucleic Acid III (Recombinant DNA Technology), Tokyo Chemical Doujin (1992); R Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. Ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Pa rtB) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987), etc., or a method described in the literature cited therein or a method substantially similar thereto. it can.
Moreover, the description content of the prior art literature or the patent application specification cited in the present invention is incorporated as the description of this specification.

（実施例１）クモ毒ポリペプチドの分子骨格をもつポリペプチドライブラリーの作製
バクテリアディスプレイ法による進化工学を用いて、標的と結合しうるクモ毒様ポリペプチドを取得するために、ICKモチーフのポリペプチドPeak A4-1の３つのループ領域とテール領域をランダム化したポリペプチドライブラリーを作製した。クモ毒様ポリペプチドのシステインのフレームワークは、いくつかの短い神経毒の間で保存されていることが知られている。カルシウムイオンチャネルへの結合に関与すると推定されているアミノ酸を含む部分およびその周辺のアミノ酸残基をランダム化した。 (Example 1) Preparation of polypeptide library having molecular backbone of spider venom polypeptide In order to obtain a spider venom-like polypeptide capable of binding to a target using evolutionary engineering by bacterial display method, polypeptide of ICK motif A polypeptide library in which the three loop regions and the tail region of Peak A4-1 were randomized was prepared. The cysteine framework of spider venom-like polypeptides is known to be conserved among several short neurotoxins. The amino acid residues in and around the part containing amino acids presumed to be involved in binding to calcium ion channels were randomized.

（１−１） クモ毒様ポリペプチドライブラリー用の全長コンストラクトの調製
クモ毒様ポリペプチドライブラリー用の全長コンストラクトは、PeakA4-1toxin cDNAを鋳型とし、そのループ部分３ヶ所およびＣ末端部分のアミノ酸配列をランダムした。即ち、PeakA4-1toxinの塩基配列上、ループIのM6−K8(３アミノ酸)、ループIIのD12−K15(４アミノ酸)、ループIVのR25−H27(３アミノ酸)およびＣ末端のV33−F34(２アミノ酸)をランダム化した。ポリペプチドコード領域の最後は２つの停止コドン(TGAおよびTAG)を導入し、さらに１９塩基対の3’‐ノンコーディング領域を付加するよう設計した。
PeakA4-1toxinを鋳型とする上述のヌクレオチド配列を15 bpのオーバーラップを含む２つのオリゴヌクレオチドで合成し、PCRにより全長を合成した。オリゴヌクレオチドは慣用のオペロンバイオテクノロジー株式会社により合成した。２つのフラグメントは共に、ループ配列に対応するランダム化ヌクレオチドを含む。第１のフラグメントは３つのランダム化領域を含む。第２のフラグメントはＣ末端の１つのランダム化領域、停止コドンおよび3’ノンコーディング領域を含む。これら２つのフラグメントの3’側にオーバーラップ配列を含む。この実験に用いたオリゴヌクレオチドの一覧を以下に示す。ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴを表し、ＳはＣまたはＧを表す。

F1：5’-GACTGTTTAGGATTT(NNS)3TGCATCCCC(NNS)4TGCTGTCGTCCAAACCTTGTATGCAGT(NNS)3 AAATGGTGTAAATAT-3’ (配列番号１５)
F2：5’-ATCTGCAGAATTCGCCCTTCTATCA(SNN)2 ATATTTACACCATTT-3’ (配列番号１６)

下線を付した配列はPCR用のオーバーラップ配列を示す。
PCRは、2.5U/μlのPfuTurboCx Hotstart DNAポリメラーゼ(STRATAGENE)および100pmolのフラグメントを用いて製造元から供給されたバッファ中で行った。94℃を30秒間、55℃を30秒間および72℃を30秒間で３サイクル行った。 (1-1) Preparation of full-length construct for spider venom-like polypeptide library The full-length construct for spider venom-like polypeptide library uses PeakA4-1toxin cDNA as a template, and contains the amino acid sequences of its loop part and C-terminal part. Random. That is, on the base sequence of PeakA4-1toxin, M6-K8 (3 amino acids) of Loop I, D12-K15 (4 amino acids) of Loop II, R25-H27 (3 amino acids) of Loop IV and V33-F34 (C-terminal) 2 amino acids) were randomized. The end of the polypeptide coding region was designed to introduce two stop codons (TGA and TAG) and add a 19 base pair 3'-noncoding region.
The above nucleotide sequence using PeakA4-1toxin as a template was synthesized with two oligonucleotides containing 15 bp overlap, and the full length was synthesized by PCR. Oligonucleotides were synthesized by conventional operon biotechnology. Both fragments contain randomized nucleotides corresponding to the loop sequence. The first fragment contains three randomized regions. The second fragment contains one randomized region at the C-terminus, a stop codon and a 3 ′ non-coding region. These 2 fragments contain an overlapping sequence 3 '. A list of oligonucleotides used in this experiment is shown below. N represents A, G, C or T, and S represents C or G.

F1: 5'-GACTGTTTAGGATTT (NNS) 3 TGCATCCCC (NNS) 4 TGCTGTCGTCCAAACCTTGTATGCAGT (NNS) 3 AAATGGTGTAAATAT -3 '(SEQ ID NO: 15)
F2: 5'-ATCTGCAGAATTCGCCCTTCTATCA (SNN) 2 ATATTTACACCATTT -3 '(SEQ ID NO: 16)

Underlined sequences indicate overlapping sequences for PCR.
PCR was performed in buffer supplied by the manufacturer with 2.5 U / μl PfuTurboCx Hotstart DNA polymerase (STRATAGENE) and 100 pmol fragment. Three cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 30 seconds were performed.

（１−２） 配列決定による初期ライブラリーの質の評価
次に、上述で得られた全長コンストラクトを用いてライブラリーをプラスミドベクターpCR2.1TOPO(Invitrogen)にクローニングして、１０個の単一コロニーを無作為に取り出し、配列決定した。１０個のクローンのすべてにおいて、ランダム化した領域の塩基配列は異なっており、ライブラリーが適切な多様性からなることが確認された。ヌクレオチドの組成についても、ＳについてはＣまたはＧのいずれか、Ｎについては４つのヌクレオチドのいずれかを含むことが確認された。したがって、上述の方法により作製したライブラリーは、多様性および質の点で満足しうるものであった。 (1-2) Evaluation of initial library quality by sequencing Next, the library was cloned into the plasmid vector pCR2.1TOPO (Invitrogen) using the full-length construct obtained above, and 10 single colonies were obtained. Were randomly picked and sequenced. In all 10 clones, the base sequence of the randomized region was different, confirming that the library was of appropriate diversity. The nucleotide composition was also confirmed to contain either C or G for S and any of the 4 nucleotides for N. Therefore, the library prepared by the method described above was satisfactory in terms of diversity and quality.

（実施例２）膜タンパク質とポリペプチドライブラリーを発現するプラスミドベクターの構築
大腸菌内で発現させたm2は内膜に、ポリペプチドはペリプラズム間隙に発現するように設計した。また、それらの発現量および個々の大腸菌で大きな差が出ないようにするため、一つのベクターにタンデムに並べて発現できるようにした。 Example 2 Construction of Plasmid Vector Expressing Membrane Protein and Polypeptide Library It was designed that m2 expressed in E. coli was expressed in the inner membrane and polypeptide was expressed in the periplasmic space. Moreover, in order to prevent a large difference between their expression levels and individual E. coli, expression was made in a single vector in tandem.

（２−１） クモ毒様ポリペプチドライブラリーとムスカリン性アセチルコリン受容体ｍ２をコードするプラスミドの作製
pGRIIMBPM2LDHNDATG＋(H. Furukawa and T. Haga： J. Biochem. (2000) 127, 151-161)は、膜タンパク質であるムスカリン性アセチルコリン受容体(m2)にマルトース結合タンパク質(MBP)をフュージョンタンパク質として大腸菌の内膜に発現するベクターである。このベクターのm2の下流にある制限酵素サイト(HindIII)を切断した。
pET27b(+)(Invitrogen)は、大腸菌によるタンパク質の発現用のベクターとして用いられている。このベクターのrbsからT7terminatorの配列をPCRした。そのPCR産物をIn-Fusion PCR Cloning System(Clontech)を用いて上記のベクターにクローニングを行った(pGRII-IF)。

PCR forward：5’-GTCTGCAGGCAAGCTTCTAGAAATAATTTTGTTTAA-3’(配列番号１７)
PCR reverse：5’-GGCCAGTGCCAAGCTTTATGCTAGTTATTGCTCAG-3’ (配列番号１８)

pET40b(+)(Invitrogen)は、大腸菌内で発現したポリペプチドをペリプラズム間隙に移行させるのに関与するDsbC配列を468nt(塩基配列番号)から1115ntに含むベクターである。このDsbC配列を、pET40b(+)をテンプレートとしてPCRにて調製し(PCR forward 1およびreverse 1)、SacIIにて切断した(フラグメント１)。A4-1をテンプレートにPCR forward 2およびreverse 2でPCRを行い、SacIIで切断した(フラグメント２)。その後、PCR1フラグメントおよびPCR2フラグメントをライゲーションし、これをテンプレートにPCR forward 3およびPCR reverse 2を用いてPCRを行った(フラグメント３)。このPCRにてStrep・tagII−DsbC−A4-1のフラグメントができ、これをNheIで切断した。pET27b(+)上にあるXbaIサイト(380nt)をQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE)にてTCTAGAをTGTAGAにし、pelBのシグナル配列とOmpAのシグナル配列を交換したものを作製した。これをテンプレートにして、PCR forward 4およびPCR reverse 3にてPCRを行った。これにより、T7プロモーターからOmpAを含んだフラグメントを作製し(フラグメント４)、NheIで切断した。フラグメント３および４をライゲーションし、さらにこれをテンプレートにしてPCR forward 4およびPCR reverse 2でPCRを行った後、pCR2.1にクローニングした。クローニングしたプラスミドからPstIおよびEcoRIで切り出しを行いそのフラグメントをpGRII-IFベクターの同じ制限酵素サイトにクローニングした(pGRII-Tx、図6参照)。

PCR forward 1：5’-CTCAGTTCGAAAAAGGCGCCGATGACGCGGCAATT-3’(配列番号１９)
PCR reverse 1：5’-TTTTGCCGCGGCTTCTTTACCGCTGGT-3’ (配列番号２０)
PCR forward 2：5’-GAAGCCGCGGCAAAAGACTGTTTAGGA-3’ (配列番号２１)
PCR reverse 2：5’-GAATTCTTAAAATACATA-3’ (配列番号２２)
PCR forward 3：5’-CTAGCTAGCTGGAGCCACCCTCAGTTCGAAAAA-3’ (配列番号２３)
PCR reverse 3：5’-CTGAGGGTGGCTCCAGCTAGCGGCCTGCGCAA-3’ (配列番号２４)
PCR forward-4：5’-CTGCAGTCGATCCCGCGAAATTAA-3’ (配列番号２５) (2-1) Preparation of spider venom-like polypeptide library and plasmid encoding muscarinic acetylcholine receptor m2
pGRIIMBPM2LDHNDATG + (H. Furukawa and T. Haga: J. Biochem. (2000) 127, 151-161) is a membrane protein muscarinic acetylcholine receptor (m2) that uses maltose binding protein (MBP) as a fusion protein. A vector expressed in the inner membrane. The restriction enzyme site (HindIII) downstream of m2 of this vector was cleaved.
pET27b (+) (Invitrogen) is used as a vector for protein expression by E. coli. The T7terminator sequence was PCR-encoded from rbs of this vector. The PCR product was cloned into the above vector using In-Fusion PCR Cloning System (Clontech) (pGRII-IF).

PCR forward: 5'-GTCTGCAGGCAAGCTTCTAGAAATAATTTTGTTTAA-3 '(SEQ ID NO: 17)
PCR reverse: 5'-GGCCAGTGCCAAGCTTTATGCTAGTTATTGCTCAG-3 '(SEQ ID NO: 18)

pET40b (+) (Invitrogen) is a vector comprising a DsbC sequence involved in transferring a polypeptide expressed in E. coli to the periplasmic space from 468 nt (base sequence number) to 1115 nt. This DsbC sequence was prepared by PCR using pET40b (+) as a template (PCR forward 1 and reverse 1) and cleaved with SacII (fragment 1). PCR was performed with PCR forward 2 and reverse 2 using A4-1 as a template, and digested with SacII (fragment 2). Thereafter, the PCR1 fragment and the PCR2 fragment were ligated, and PCR was performed using PCR forward 3 and PCR reverse 2 as a template (fragment 3). This PCR produced a Strep • tagII-DsbC-A4-1 fragment, which was cleaved with NheI. An XbaI site (380 nt) on pET27b (+) was changed to TGTAGA using QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE), and the signal sequence of pelB and the signal sequence of OmpA were exchanged. Using this as a template, PCR was performed by PCR forward 4 and PCR reverse 3. As a result, a fragment containing OmpA was prepared from the T7 promoter (fragment 4) and cleaved with NheI. Fragments 3 and 4 were ligated, PCR was performed with PCR forward 4 and PCR reverse 2 using this as a template, and then cloned into pCR2.1. The cloned plasmid was excised with PstI and EcoRI, and the fragment was cloned into the same restriction enzyme site of the pGRII-IF vector (pGRII-Tx, see FIG. 6).

PCR forward 1: 5'-CTCAGTTCGAAAAAGGCGCCGATGACGCGGCAATT-3 '(SEQ ID NO: 19)
PCR reverse 1: 5'-TTTTGCCGCGGCTTCTTTACCGCTGGT-3 '(SEQ ID NO: 20)
PCR forward 2: 5'-GAAGCCGCGGCAAAAGACTGTTTAGGA-3 '(SEQ ID NO: 21)
PCR reverse 2: 5'-GAATTCTTAAAATACATA-3 '(SEQ ID NO: 22)
PCR forward 3: 5'-CTAGCTAGCTGGAGCCACCCTCAGTTCGAAAAA-3 '(SEQ ID NO: 23)
PCR reverse 3: 5'-CTGAGGGTGGCTCCAGCTAGCGGCCTGCGCAA-3 '(SEQ ID NO: 24)
PCR forward-4: 5'-CTGCAGTCGATCCCGCGAAATTAA-3 '(SEQ ID NO: 25)

USER friendly DNA engineering method(New England Biolabs)のUSER cassette配列をオペロンバイオテクノロジー株式会社にて２つのフラグメントに合成した。PCR forward 1およびPCR reverseでPCR行い、USER cassetteを作製した。これをテンプレートにしてPCR forward 2およびreverseでPCRを行った。PCR産物をSacIIにて切断した(SacII-USER)。このフラグメントとSacIIで切断したpGRII-Txをライゲーションし、上記のPCR forward 4(配列番号２５)と下記PCR reverse(配列番号２７)でPCRを行い、pCR2.1にクローンニングした。得られたプラスミドからPstIおよびEcoRIで切り出しを行い、これをpGRII-Txのおなじサイトにクローニングした(pGRII-USER、図７参照)。得られたベクターの配列はDNAシークエンサーにて確認した。

PCR forward 1：5’-CTGCAGGCTGAGGAGACATCTAGAGGATCCT-3’(配列番号２６)
PCR reverse：5’-GCTGAGGGAAAGTCTAGAGGATCCTCT-3’ (配列番号２７)
PCR forward 2：5’-TCCCCGCGGCTTTTGCTGAGGAGACATCT-3’ (配列番号２８)

このベクターをXbaIおよびNt.BbvCI(New England Biolabs)で切断した(m2-USER)。このベクターをUSER friendly DNA engineering methodを用いたクローニング用のベクターとして以下の実験に用いた。
ランダム化したポリペプチドを、調製したベクターにクローニングする際には、ランダム化ポリペプチドをコードするヌクレオチドを用いて、PfuTurboCx Hotstart DNAポリメラーゼでPCR(95℃で30秒間、50℃で30秒間、72℃で30秒間)を25サイクルした。PCR産物、m2-USERおよびUSER enzyme(New England Biolabs)を混合し、室温で15分間反応させた。反応液にLigation High(TOYOBO)を添加し、さらに15分間反応させた。最終的に得られた反応液を大腸菌にトランスフォーメーションし、LB−アンピシリン(75μg/ml)のプレートにまいて、一晩培養した。PCRに用いたプライマーを以下に示す。ここで、UはUracilを示している。

PCR forward：5’-GGAGACAUCAGACTGTTTAGGA-3’(配列番号２９)
PCR reverse：5’-GGGAAAGUATCTGCAGAATT-3’ (配列番号３０)
The USER cassette sequence of USER friendly DNA engineering method (New England Biolabs) was synthesized into two fragments by Operon Biotechnology Co., Ltd. PCR was performed with PCR forward 1 and PCR reverse to prepare a USER cassette. Using this as a template, PCR was performed by PCR forward 2 and reverse. The PCR product was cleaved with SacII (SacII-USER). This fragment was ligated with pGRII-Tx cleaved with SacII, PCR was performed with the above PCR forward 4 (SEQ ID NO: 25) and the following PCR reverse (SEQ ID NO: 27), and cloned into pCR2.1. The obtained plasmid was excised with PstI and EcoRI and cloned into the same site of pGRII-Tx (pGRII-USER, see FIG. 7). The sequence of the obtained vector was confirmed with a DNA sequencer.

PCR forward 1: 5'-CTGCAGGCTGAGGAGACATCTAGAGGATCCT-3 '(SEQ ID NO: 26)
PCR reverse: 5'-GCTGAGGGAAAGTCTAGAGGATCCTCT-3 '(SEQ ID NO: 27)
PCR forward 2: 5'-TCCCCGCGGCTTTTGCTGAGGAGACATCT-3 '(SEQ ID NO: 28)

This vector was cut with XbaI and Nt.BbvCI (New England Biolabs) (m2-USER). This vector was used in the following experiments as a cloning vector using the USER friendly DNA engineering method.
When cloning a randomized polypeptide into a prepared vector, PCR (95 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds, 72 ° C) with PfuTurboCx Hotstart DNA polymerase using nucleotides encoding the randomized polypeptide. For 30 seconds) for 25 cycles. PCR products, m2-USER and USER enzyme (New England Biolabs) were mixed and allowed to react for 15 minutes at room temperature. Ligation High (TOYOBO) was added to the reaction solution, and the mixture was further reacted for 15 minutes. The finally obtained reaction solution was transformed into Escherichia coli, spread on a plate of LB-ampicillin (75 μg / ml), and cultured overnight. The primers used for PCR are shown below. Here, U indicates Uracil.

PCR forward: 5'-GGAGACAUCAGACTGTTTAGGA-3 '(SEQ ID NO: 29)
PCR reverse: 5'-GGGAAAGUATCTGCAGAATT-3 '(SEQ ID NO: 30)

（２−２） 大腸菌での発現確認
大腸菌にベクターをトランスフォーメーションし、発現誘導をかけた後に膜タンパク質およびポリペプチドの発現の確認を行った。大腸菌を6000x gで10分間で集菌し、20mMのTris-HCl(pH7.5)にて洗浄した。その細胞を用いてペリプラズム画分およびスフェロプラスト画分を調製した。スフェロプラスト画分は、緩衝液(20mM Tris-HCl (pH7.4)、1mM EDTA，25％Sucrose，0.5mM phenylmethylsulphonyl fluoride)に懸濁し、超音波処理した。150000x gで1時間の遠心分離により、細胞を回収し、これを緩衝液(20mM Tris-HCl(pH7.4)，500mM NaClおよび1mM EDTA)で懸濁した。150000x gで1時間の遠心分離で細胞を回収し、20mM Tris-HCl(pH7.4)で懸濁することで膜画分を得た。ペリプラズム画分および膜画分を電気泳動(SDS-PAGE)に供し、ウエスタンブロットにて発現の確認をした。ペリプラズム画分はStrep・tagII抗体を用いてポリペプチドの発現を、膜画分はMBP抗体によりm2の検出をした。その結果、ペリプラズム画分には、約29kDaにポリペプチドに付加したStrep・tagIIのバンドを、また膜内膜画分では、約78 kDaにm2に付加したMBPのバンドを検出した(図５Ｂ)。これらの結果により、ポリペプチド発現はペリプラズム間隙に、m2受容体の発現は内膜にそれぞれ確認できた。 (2-2) Confirmation of expression in Escherichia coli The vector was transformed into Escherichia coli, and after expression induction, the expression of membrane protein and polypeptide was confirmed. E. coli was collected at 6000 × g for 10 minutes and washed with 20 mM Tris-HCl (pH 7.5). The periplasmic fraction and spheroplast fraction were prepared using the cells. The spheroplast fraction was suspended in a buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA, 25% Sucrose, 0.5 mM phenylmethylsulphonyl fluoride) and sonicated. The cells were collected by centrifugation at 150,000 × g for 1 hour and suspended in a buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 500 mM NaCl, and 1 mM EDTA). Cells were collected by centrifugation at 150,000 × g for 1 hour and suspended in 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) to obtain a membrane fraction. Periplasmic fraction and membrane fraction were subjected to electrophoresis (SDS-PAGE), and expression was confirmed by Western blot. The periplasm fraction was detected for polypeptide expression using Strep • tagII antibody, and the membrane fraction was detected for m2 using MBP antibody. As a result, a band of Strep • tagII added to the polypeptide at about 29 kDa was detected in the periplasm fraction, and a band of MBP added to m2 at about 78 kDa was detected in the inner membrane fraction (FIG. 5B). . Based on these results, polypeptide expression was confirmed in the periplasmic space and m2 receptor expression was confirmed in the inner membrane.

（実験例３）クモ毒様ポリペプチドライブラリーからのm2受容体結合ポリペプチドの選択
（３−１） クモ毒様ポリペプチドの発現とm2受容体への結合
大腸菌中で発現させたm2およびクモ様ポリペプチドは培養中に菌体内のペリプラズム間隙で反応する。ペリプラズム間隙を反応の場とすることでそれぞれの大腸菌でポリペプチドとm2の反応ができる。ランダム化ポリペプチドを配したベクターを大腸菌にトランスフォーメーションし、一晩培養したプレートからLB-アンピシリンの液体培地で菌体を回収し、OD600が0.6に達するまで増殖させた。培養物を0.5 mM IPTGで20℃で24時間誘導した。 (Experimental example 3) Selection of m2 receptor binding polypeptide from spider venom-like polypeptide library (3-1) Expression of spider venom-like polypeptide and binding to m2 receptor m2 and spider-like expressed in E. coli The polypeptide reacts in the periplasmic space within the cell during culture. By using the periplasmic space as the reaction field, each E. coli can react with the polypeptide and m2. The vector containing the randomized polypeptide was transformed into E. coli, and the cells were collected from the overnight culture plate in a liquid medium of LB-ampicillin and grown until the OD 600 reached 0.6. Cultures were induced with 0.5 mM IPTG for 24 hours at 20 ° C.

（３−２） スフェロプラストの調製
スフェロプラストは大腸菌にある内膜および外膜の２つのうち、外膜だけを除去した状態である。このようにすることで内膜に発現したm2に結合しているポリペプチドをポリペプチドスフェロプラスト複合体として回収することができる(図４)。大腸菌の培養液から細胞を6000x gの遠心10分間で回収し、20mM Tris-HCl(pH7.5)にて２回洗浄した。回収した細胞を、高張液(20mM Tris-HCl (pH7.5)，0.5mM EDTA，20％Sucrose，1mM phenylmethylsulphonyl fluoride)に懸濁し、氷上で10分間インキュベーションした。12000 x gで10分間の遠心分離により、細胞を回収した。これを低張液(50mM Tris-HCl (pH7.5))に懸濁し、氷上で10分間インキュベーションした。12000x gで10分間の遠心分離により、回収した画分をスフェロプラストとした。 (3-2) Preparation of Spheroplast Spheroplast is in a state where only the outer membrane is removed from the inner membrane and the outer membrane in Escherichia coli. In this way, the polypeptide bound to m2 expressed in the inner membrane can be recovered as a polypeptide spheroplast complex (FIG. 4). Cells were collected from the culture broth of E. coli by centrifugation at 6000 × g for 10 minutes, and washed twice with 20 mM Tris-HCl (pH 7.5). The collected cells were suspended in a hypertonic solution (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 mM EDTA, 20% Sucrose, 1 mM phenylmethylsulphonyl fluoride) and incubated on ice for 10 minutes. Cells were harvested by centrifugation at 12000 xg for 10 minutes. This was suspended in a hypotonic solution (50 mM Tris-HCl (pH 7.5)) and incubated on ice for 10 minutes. The fraction collected by centrifugation at 12000 × g for 10 minutes was used as spheroplast.

（３−３） m2受容体結合ポリペプチドの選択
上述のようにスフェロプラストを調製した後、クモ様ポリペプチドに付加したStrep・tagIIをStrep tactin (Magnetic Beads, QIAGEN)で結合させた。これを緩衝液(10mM Tris-HCl (pH8.0)，1mM EDTA，1M NaCl，0.1％TritonX-100)で十分洗浄し、非特異的に結合している物質を除去した(図４)。ビオチン溶液で溶出することで特異的に結合しているポリペプチドスフェロプラスト複合体をStrep tactinより回収した。この回収した溶液を用いてPCR(95℃で30秒間、50℃で30秒間、72℃で30秒間)を３０サイクルした。以下にPCRで用いたプライマーの配列を示す。ここで[Bio]はビオチンが付加されていることを示す。

PCR forward：5’- [Bio]-GAGGGACATCAGACTGTTTAGGA-3’(配列番号３１)
PCR reverse：5’-TTCGCCCTTCGACTGAGGGAAAGT-3’ (配列番号３２)
(3-3) Selection of m2 receptor-binding polypeptide After preparing spheroplasts as described above, Strep • tagII added to the spider-like polypeptide was bound with Strep tactin (Magnetic Beads, QIAGEN). This was thoroughly washed with a buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Triton X-100) to remove non-specifically bound substances (FIG. 4). Polypeptide spheroplast complexes that were specifically bound by elution with a biotin solution were recovered from Strep tactin. Using this recovered solution, PCR (95 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 30 seconds) was cycled 30 times. The primer sequences used in PCR are shown below. Here, [Bio] indicates that biotin is added.

PCR forward: 5 '-[Bio] -GAGGGACATCAGACTGTTTAGGA-3' (SEQ ID NO: 31)
PCR reverse: 5'-TTCGCCCTTCGACTGAGGGAAAGT-3 '(SEQ ID NO: 32)

（３−４） m2受容体結合ポリペプチドの配列の確認
m2に結合するポリペプチドの配列を明らかにするために、ポリペプチドのアミノ酸配列をコードしているプラスミドを回収してそのDNA配列をDNAシークエンサーで確認した。６ラウンド終了後に得られたコロニーを無作為に選び、菌体をLB−アンピシリンの培地中でOD600が0.6に達するまで培養した。菌体を回収後、プラスミドをWizard MagneSil Plasmid Purification System(Promega)により得た。得られたプラスミドの濃度をOD260により測定し、サンプルあたり200ngになるようにプレートに分注した。シークエンスは株式会社ベックスに依頼し、プラスミドに含まれるポリペプチドのDNA配列を確認した。ランダム化した配列の類似性に基づいて６つのグループに分けることができた。これらグループのポリペプチド配列上の非ランダム化配列に変異は入っていなかった。
選択のサイクル６ラウンド終了後、１０種類のペプチドを同定した。２〜４程度のアミノ酸変異を１グループとすると大きく６グループに分けられる。以下、それぞれをグループＡ〜Ｆといい、グループ内のポリペプチドをPepA〜Fという。(なお、基のライブラリーでランダム化した領域を下線で示す)
（Ａ）グループＡ
グループＡのポリペプチドは、下記の式〔２〕で表される。
式〔２〕：
DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVX 1 X 2 KWCKYX 3 X 4 (配列番号３)
(式中、X1はV,L又はGであり、X2はA又はGであり、X3はA,P,Y又はなくてもよく、
X4はN,I,L又はなくてもよい。)
具体的には、以下の４つのポリペプチドである。
PepA-1：DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVVAKWCKY (配列番号４)
PepA-2：DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVVAKWCKYAN (配列番号５)
PepA-3：DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVLGKWCKYPI (配列番号６)
PepA-4：DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVGAKWCKYYL (配列番号７)
（Ｂ）グループＢ
PepB：DCLGFRWRCIPGINLCCRPNLVCSNSKKWCKYVM (配列番号８)
（Ｃ）グループＣ
PepC：DCLGFSMGCIPNQVRCCRPNLVCSVDLKWCKYSH (配列番号９)
（Ｄ）グループＤ
PepD：DCLGFRWSCIPWEASCCRPNLVCSDWKKWCKYIL (配列番号１０)
（Ｅ）グループＥ
PepE：DCLGFLGWCIPREELCCRPNLVCSNNWKWCKYTI (配列番号１１)
（Ｆ）グループＦ
グループＦのポリペプチドは、下記の式〔３〕で表される。
式〔３〕：
DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYX 5 X 6 (配列番号１２)
(式中、X5はA又はDであり、X6はL又はYである。)
具体的には、以下の２つのポリペプチドである。
PepF-1：DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYAL (配列番号１３)
PepF-2：DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYDY (配列番号１４) (3-4) Confirmation of sequence of m2 receptor binding polypeptide
In order to elucidate the sequence of the polypeptide that binds to m2, a plasmid encoding the amino acid sequence of the polypeptide was recovered and the DNA sequence was confirmed with a DNA sequencer. Colonies obtained after 6 rounds were randomly selected, and the cells were cultured in LB-ampicillin medium until OD 600 reached 0.6. After collecting the cells, the plasmid was obtained by Wizard MagneSil Plasmid Purification System (Promega). The concentration of the obtained plasmid was measured by OD 260 and dispensed to a plate so that the concentration was 200 ng per sample. The sequence was commissioned to Bex Corporation to confirm the DNA sequence of the polypeptide contained in the plasmid. Based on randomized sequence similarity, it could be divided into 6 groups. There were no mutations in the non-randomized sequences on the polypeptide sequences of these groups.
Ten peptides were identified after 6 rounds of selection cycle. If 2 to 4 amino acid mutations are defined as 1 group, they can be roughly divided into 6 groups. Hereafter, each is called group AF, and the polypeptide in a group is called PepA-F. (Note that the area randomized in the original library is underlined)
(A) Group A
The group A polypeptide is represented by the following formula [2].
Formula [2]:
DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VX 1 X 2 KWCKY X 3 X 4 (SEQ ID NO: 3)
(Wherein X 1 is V, L or G, X 2 is A or G, X 3 may be A, P, Y or absent,
X 4 may be N, I, L or absent. )
Specifically, it is the following four polypeptides.
PepA-1: DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VVA KWCKY (SEQ ID NO: 4)
PepA-2: DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VVA KWCKY AN (SEQ ID NO: 5)
PepA-3: DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VLG KWCKY PI (SEQ ID NO: 6)
PepA-4: DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VGA KWCKY YL (SEQ ID NO: 7)
(B) Group B
PepB: DCLGF RWR CIP GINL CCRPNLVCS NSK KWCKY VM (SEQ ID NO: 8)
(C) Group C
PepC: DCLGF SMG CIP NQVR CCRPNLVCS VDL KWCKY SH (SEQ ID NO: 9)
(D) Group D
PepD: DCLGF RWS CIP WEAS CCRPNLVCS DWK KWCKY IL (SEQ ID NO: 10)
(E) Group E
PepE: DCLGF LGW CIP REEL CCRPNLVCS NNW KWCKY TI (SEQ ID NO: 11)
(F) Group F
The group F polypeptide is represented by the following formula [3].
Formula [3]:
DCLGF EVV CIP GMLD CCRPNLVCS TVS KWCKY X 5 X 6 (SEQ ID NO: 12)
(In the formula, X 5 is A or D, and X 6 is L or Y.)
Specifically, it is the following two polypeptides.
PepF-1: DCLGF EVV CIP GMLD CCRPNLVCS TVS KWCKY AL (SEQ ID NO: 13)
PepF-2: DCLGF EVV CIP GMLD CCRPNLVCS TVS KWCKY DY (SEQ ID NO: 14)

（３−５） ポリペプチドの調製
得られたm2結合ポリペプチドについてさらに詳細に調べるために、全てのクローンからポリペプチドを調製した。ポリペプチドは、pBAD/TOPOThio融合発現キット(Invitrogen)を一部改変して用いチオレドキシン融合タンパク質として調製した。改変した部分は、pBAD/TOPOThioベクターのチオレドキシンのＮ末端側にStrep・tagIIを挿入した点およびエンテロキナーゼ認識配列のＣ末端側にPreScission酵素(GE Healthcare)の認識配列を挿入した点である。m2結合ポリペプチドをコードするプラスミドからDNAを増幅し、pBAD/TOPOThio改変ベクター中にクローニングし、大腸菌にトランスフォームした。配列決定によりフレームの確認をした。
ポジティブクローンをLB−アンピシリンの培地中でOD600が0.5に達するまで培養した。培養物を0.02％アラビノースで25℃で3時間誘導した。3000rpmで20分間で細胞を回収し、超音波処理をした。溶解物を遠心分離し、上清(可溶性画分)およびペレット(不溶性画分)に分離し、SDS-PAGEで解析した。可溶性画分は発現したポリペプチドのStrep・tagIIについてStrep tactin(IBA GmbH)アフィニティーカラムで非変性条件化で結合させ、融合タンパク質をPreScission酵素で切断した。融合タンパク質が除かれたポリペプチドを回収し、Lowry法によりタンパク質の定量をした。
ここで、得られた１０ポリペプチドのうち、PepA-1、PepA-2及びPepCについては発現量が充分確保できたので、この３ポリペプチドを以下の各結合実験に供し、m2受容体との親和性、特異性を客観的に評価する。 (3-5) Preparation of polypeptide In order to investigate the obtained m2 binding polypeptide in more detail, a polypeptide was prepared from all clones. The polypeptide was prepared as a thioredoxin fusion protein using a partially modified pBAD / TOPOThio fusion expression kit (Invitrogen). The modified part is the point where Strep • tagII was inserted into the N-terminal side of thioredoxin of the pBAD / TOPOThio vector and the recognition sequence of PreScission enzyme (GE Healthcare) was inserted into the C-terminal side of the enterokinase recognition sequence. DNA was amplified from a plasmid encoding an m2-binding polypeptide, cloned into a pBAD / TOPOThio modified vector, and transformed into E. coli. The frame was confirmed by sequencing.
Positive clones were cultured in LB-ampicillin medium until OD 600 reached 0.5. Cultures were induced with 0.02% arabinose at 25 ° C. for 3 hours. Cells were collected for 20 minutes at 3000 rpm and sonicated. The lysate was centrifuged, separated into a supernatant (soluble fraction) and a pellet (insoluble fraction) and analyzed by SDS-PAGE. The soluble fraction was bound to the expressed polypeptide Strep • tagII on a Strep tactin (IBA GmbH) affinity column under non-denaturing conditions, and the fusion protein was cleaved with PreScission enzyme. The polypeptide from which the fusion protein had been removed was recovered, and the protein was quantified by the Lowry method.
Here, among the obtained 10 polypeptides, expression levels of PepA-1, PepA-2 and PepC were sufficiently ensured. Therefore, these 3 polypeptides were subjected to the following binding experiments, and were used with the m2 receptor. Objectively evaluate affinity and specificity.

（３−６） ポリペプチドとm2受容体との結合実験
ポリペプチドの活性および結合様式を評価するために、上記ポリペプチドのうちのPepA-1、PepA-2及びPepCを用いてm2との結合実験を行った。m2は、アフリカツメガエルの卵母細胞にm2タンパク質をコードするcRNAを導入し、細胞膜上に発現した膜画分を用いた。m2の結合競合物質として、トリチウム標識した[3H]-N-methylscopolamine([3H]-NMS)を用い、これを緩衝液(20mM Tris-malate(pH7.5))に溶解した。精製したポリペプチド、膜画分および[3H]-NMSを混合し、30℃で60分間インキュベートした。反応液をグラスフィルタに通し膜画分をトラップし、20mMリン酸カリウム緩衝液でよく洗浄して非特異的な結合を除去した。グラスフィルタを乾燥させ、バイアルに移しシンチレーションカクテル中でシンチレーションカウンタを測定した。PepA-1は6.0μMで54.6％、PepA-2は5.4μMで46.0％、PepCは365nMで37.5％の結合阻害が示され、m2に対するアンタゴニスト作用がみられた(図９)。 (3-6) Binding experiment between polypeptide and m2 receptor In order to evaluate the activity and binding mode of the polypeptide, binding to m2 using PepA-1, PepA-2 and PepC among the above polypeptides. The experiment was conducted. For m2, a membrane fraction expressed on the cell membrane was introduced by introducing cRNA encoding the m2 protein into Xenopus oocytes. Tritium-labeled [ 3 H] -N-methylscopolamine ([ 3 H] -NMS) was used as an m2 binding competitor, and this was dissolved in a buffer (20 mM Tris-malate (pH 7.5)). Purified polypeptide, membrane fraction and [ 3 H] -NMS were mixed and incubated at 30 ° C. for 60 minutes. The reaction solution was passed through a glass filter, the membrane fraction was trapped, and washed well with 20 mM potassium phosphate buffer to remove non-specific binding. The glass filter was dried, transferred to a vial and the scintillation counter was measured in a scintillation cocktail. PepA-1 showed 54.6% inhibition at 6.0 μM, PepA-2 showed inhibition of binding at 5.4 μM at 46.0%, and PepC at 365 nM at 37.5%.

（３−７） ポリペプチドとｍ２以外のムスカリン性アセチルコリン受容体サブタイプとの結合実験
ムスカリン性アセチルコリン受容体には、m2以外にもm1、m3およびm4のサブタイプがある。ポリペプチドの特異性を明らかにするためにサブタイプに対する結合実験を行った。これら受容体のcRNAをそれぞれ調製し、上述と同様の方法でサブタイプに対する結合阻害を測定した。PepCは438 nMの濃度で、m1に対して6.0％、m3に対して10.4％およびm4に対して6.2％の阻害があり、またｍ2に対しては365 nMで37.5％の結合阻害が見られた。このことは、PepCがムスカリン性アセチルコリン受容体サブタイプの中でm2を選択的に阻害することを示す。 (3-7) Binding experiment between polypeptide and muscarinic acetylcholine receptor subtype other than m2 The muscarinic acetylcholine receptor includes m1, m3 and m4 subtypes in addition to m2. In order to elucidate the specificity of the polypeptide, binding experiments for subtypes were performed. CRNA of each of these receptors was prepared, and binding inhibition to subtypes was measured by the same method as described above. PepC has a concentration of 438 nM, 6.0% inhibition against m1, 10.4% against m3 and 6.2% inhibition against m4, and 37.5% inhibition of binding at 365 nM against m2. It was. This indicates that PepC selectively inhibits m2 among muscarinic acetylcholine receptor subtypes.

（実験例４）m2結合ポリペプチドの標的特異性評価
（４−１） 非特異的吸着ポリペプチドの除去
ランダム化したポリペプチドがm2以外の内膜タンパク質等に結合する非特異的吸着が予想されることから、この非特異的結合を除くためにサブトラクションをした。予めm2を除いたベクター(Non-m2-USER)を用意し、これにランダム化ポリペプチドをクローニングした。大腸菌にトランスフォーメーションし、一晩培養したプレートからコロニーを回収した。回収した菌培養液のOD600が0.6に達するまで培養し、0.5mM IPTGで24時間誘導した。遠心分離により菌体を回収し、スフェロプラストを調製した。これをStrep tactinで回収し、F1およびF2でPCR(95℃で30秒間、50℃で30秒間、72℃で30秒間)を30サイクルしたものを非特異的吸着のDNAとした。このPCRでは、リバースプライマーの5’側にビオチンを付したもの使った。非特異的吸着DNAをアビジンコートの磁気ビーズ(MAGNOTEX-SA,TAKARA BIO INC.)に結合させ、アルカリ処理することで結合させたDNAを一本鎖にし、磁気ビーズ結合の非特異的吸着一本鎖DNA(Non-speDI)を準備した(図８)。以下にPCRに使用したF1およびF2の配列を示す。[Bio]はビオチンを付していることを示している。

PCR forward：5’-GAGGAGACATCAGACTGTTTAGGA-3’ (配列番号３１)
PCR reverse：5’- [Bio]-TTCGCCCTTCGACTGAGGGAAAGT-3’(配列番号３２)

m2を含むベクターで調製して得られたm2結合ポリペプチドをコードするDNAをPCRにて調製した。このPCR産物を熱処理により一本鎖にして、Non-speDIと50℃でアニーリングをした。これにより非特異的なDNAはNon-speDIのDNAと二本鎖を形成する。アニーリング後に二本鎖を形成しなかったDNAを磁気ビーズにより回収し、回収したDNAをテンプレートにPCRしたものを次に進めた(図８)。 (Experimental example 4) Target specificity evaluation of m2-binding polypeptide (4-1) Removal of non-specifically adsorbed polypeptide Nonspecific adsorption in which a randomized polypeptide binds to inner membrane proteins other than m2 is expected. Therefore, subtraction was performed to remove this non-specific binding. A vector (Non-m2-USER) from which m2 had been removed in advance was prepared, and a randomized polypeptide was cloned into this vector. Colonies were recovered from plates that had been transformed into E. coli and cultured overnight. The collected bacterial culture was cultured until the OD 600 reached 0.6 and induced with 0.5 mM IPTG for 24 hours. Bacterial cells were collected by centrifugation to prepare spheroplasts. This was recovered with Strep tactin, and PCR with F1 and F2 (95 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds) for 30 cycles was used as nonspecifically adsorbed DNA. In this PCR, biotin was added to the 5 ′ side of the reverse primer. Nonspecifically adsorbed DNA is bound to avidin-coated magnetic beads (MAGNOTEX-SA, TAKARA BIO INC.). Strand DNA (Non-speDI) was prepared (FIG. 8). The sequences of F1 and F2 used for PCR are shown below. [Bio] indicates that biotin is attached.

PCR forward: 5'-GAGGAGACATCAGACTGTTTAGGA-3 '(SEQ ID NO: 31)
PCR reverse: 5 '-[Bio] -TTCGCCCTTCGACTGAGGGAAAGT-3' (SEQ ID NO: 32)

DNA encoding the m2-binding polypeptide obtained by preparing with a vector containing m2 was prepared by PCR. This PCR product was made into a single strand by heat treatment and annealed with Non-speDI at 50 ° C. As a result, non-specific DNA forms a double strand with Non-speDI DNA. DNA that did not form a double strand after annealing was recovered with magnetic beads, and the PCR was performed using the recovered DNA as a template (FIG. 8).

（４−２）選択されたm2結合ポリペプチドの標的特異性の評価
グループAのPepA-1(配列番号４)を用いてm2を特異的に標的にしているのかを評価した。PepA-1のプラスミドからDNAを増幅し、m2を含まないベクター(Non-m2-USER)にクローニングした。また対照となるペプチドとして、６ラウンドまでセレクションに残ったが、ポリペプチドのランダム化配列の所で停止コドンが入ったもの(truncated peptide)をクローニングして比較した(図１０Ａ)。これらをそれぞれ大腸菌にトランスフォーメーションし、一晩培養した。培養したプレートからコロニーを回収し、0.5mM IPTGで24時間誘導した。遠心分離により、回収した菌体からスフェロプラストを調製し、Strep・tactinで回収した。回収したスフェロプラストを使ってPCRを行い、電気泳動によりバンドが検出されるかをみた。Truncated peptideではバンドが現れ、一方、PepA-1を発現したサンプルからはバンドは見られなかったことから、PepA-1は大腸菌内膜などに非特異的に吸着していたのではなく、m2と特異的に結合していたことが確認できた(図１０Ｂ、図１１参照)。また、この時に両方のペプチドがペリプラズムに発現していることは、回収したペリプラズム画分を電気泳動とウエスタンブロットで解析することにより確認した(図１０Ｃ)。 (4-2) Evaluation of target specificity of selected m2 binding polypeptide It was evaluated whether m2 was specifically targeted using group A PepA-1 (SEQ ID NO: 4). DNA was amplified from the plasmid of PepA-1 and cloned into a vector containing no m2 (Non-m2-USER). In addition, as a control peptide, the peptide remained in the selection until 6 rounds, but a peptide containing a stop codon at the polypeptide randomized sequence (truncated peptide) was cloned and compared (FIG. 10A). Each of these was transformed into E. coli and cultured overnight. Colonies were collected from the cultured plates and induced with 0.5 mM IPTG for 24 hours. Spheroplasts were prepared from the collected cells by centrifugation and collected with Strep / tactin. PCR was performed using the collected spheroplasts to see if bands were detected by electrophoresis. On the other hand, a band appeared in the Truncated peptide, while no band was seen in the sample that expressed PepA-1. It was confirmed that they were specifically bound (see FIGS. 10B and 11). At this time, it was confirmed that both peptides were expressed in the periplasm by analyzing the collected periplasm fraction by electrophoresis and Western blotting (FIG. 10C).

＜ICK scaffold polypeptide library＞
１．Polypeptide A4-1
DCLGFMRKCIPDNDKCCRPNLVCSRTHKWCKYVF
２．A4-1-based polypeptide library
DCLGF(X)3CIP(X)4CCRPNLVCS(X)3KWCKY(X)2
(X＝any amino acid)
３．PepA(Group A)
DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVX1X2KWCKYX3X4
(X1＝V,L or G、X2＝A or G、X3＝A,P,Y or not、X4＝N,I,L or not)
４．PepA-1
DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVVAKWCKY
５．PepA-2
DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVVAKWCKYAN
６．PepA-3
DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVLGKWCKYPI
７．PepA-4
DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVGAKWCKYYL
８．PepB(Group B)
DCLGFRWRCIPGINLCCRPNLVCSNSKKWCKYVM
９．PepC(Group C)
DCLGFSMGCIPNQVRCCRPNLVCSVDLKWCKYSH
１０．PepD(Group D)
DCLGFRWSCIPWEASCCRPNLVCSDWKKWCKYIL
１１．PepE(Group E)
DCLGFLGWCIPREELCCRPNLVCSNNWKWCKYTI
１２．PepF(Group F)
DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYX5X6
(X5＝A or D、X6＝L or Y)
１３．PepF-1
DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYAL
１４．PepF-2
DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYDY
１５．A4-1 random forward primer
GACTGTTTAGGATTT(NNS)3TGCATCCCC(NNS)4TGCTGTCGTCCAAACCTTGTATGCAGT(NNS)3AAATGGTGTAAATAT
(N=A,G,C orT,S=C or G)
１６．A4-1 random reverse primer
ATCTGCAGAATTCGCCCTTCTATCA(SNN)2ATATTTACACCATTT
(N=A,G,C orT,S=C or G)
１７．27rbs forward primer
GTCTGCAGGCAAGCTTCTAGAAATAATTTTGTTTAA
１８．27T7term reverse primer
GGCCAGTGCCAAGCTTTATGCTAGTTATTGCTCAG
１９．Strep40DsbC forward primer
CTCAGTTCGAAAAAGGCGCCGATGACGCGGCAATT
２０．SacIIDsbC reverse primer
TTTTGCCGCGGCTTCTTTACCGCTGGT
２１．SacIIA4-1 forward primer
GAAGCCGCGGCAAAAGACTGTTTAGGA
２２．ERA4-1 reverse primer
GAATTCTTAAAATACATA
２３．NheStrep forward primer
CTAGCTAGCTGGAGCCACCCTCAGTTCGAAAAA
２４．NheOmpSS reverse primer
CTGAGGGTGGCTCCAGCTAGCGGCCTGCGCAA
２５．27T7prom forward primer
CTGCAGTCGATCCCGCGAAATTAA
２６．PstNt USER forward primer
CTGCAGGCTGAGGAGACATCTAGAGGATCCT
２７．Nt USER reverse primer
GCTGAGGGAAAGTCTAGAGGATCCTCT
２８．SacIINt USER forward primer
TCCCCGCGGCTTTTGCTGAGGAGACATCT
２９．TxUser forward primer
GGAGACAUCAGACTGTTTAGGA
３０．TxUser reverse primer
GGGAAAGUATCTGCAGAATT
３１．Tx(biotin)forward primer
GAGGGACATCAGACTGTTTAGGA
３２．Tx(biotin)reverse primer
TTCGCCCTTCGACTGAGGGAAAGT <ICK scaffold polypeptide library>
1. Polypeptide A4-1
DCLGFMRKCIPDNDKCCRPNLVCSRTHKWCKYVF
2. A4-1-based polypeptide library
DCLGF (X) 3 CIP (X) 4 CCRPNLVCS (X) 3 KWCKY (X) 2
(X = any amino acid)
3. PepA (Group A)
DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVX 1 X 2 KWCKYX 3 X 4
(X 1 = V, L or G, X 2 = A or G, X 3 = A, P, Y or not, X 4 = N, I, L or not)
4). PepA-1
DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVVAKWCKY
5. PepA-2
DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVVAKWCKYAN
6). PepA-3
DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVLGKWCKYPI
7). PepA-4
DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVGAKWCKYYL
8). PepB (Group B)
DCLGFRWRCIPGINLCCRPNLVCSNSKKWCKYVM
9. PepC (Group C)
DCLGFSMGCIPNQVRCCRPNLVCSVDLKWCKYSH
10. PepD (Group D)
DCLGFRWSCIPWEASCCRPNLVCSDWKKWCKYIL
11. PepE (Group E)
DCLGFLGWCIPREELCCRPNLVCSNNWKWCKYTI
12 PepF (Group F)
DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYX 5 X 6
(X 5 = A or D, X 6 = L or Y)
13. PepF-1
DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYAL
14 PepF-2
DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYDY
15. A4-1 random forward primer
GACTGTTTAGGATTT (NNS) 3 TGCATCCCC (NNS) 4 TGCTGTCGTCCAAACCTTGTATGCAGT (NNS) 3 AAATGGTGTAAATAT
(N = A, G, C orT, S = C or G)
16. A4-1 random reverse primer
ATCTGCAGAATTCGCCCTTCTATCA (SNN) 2 ATATTTACACCATTT
(N = A, G, C orT, S = C or G)
17.27rbs forward primer
GTCTGCAGGCAAGCTTCTAGAAATAATTTTGTTTAA
18. 27T7term reverse primer
GGCCAGTGCCAAGCTTTATGCTAGTTATTGCTCAG
19. Strep40DsbC forward primer
CTCAGTTCGAAAAAGGCGCCGATGACGCGGCAATT
20. SacIIDsbC reverse primer
TTTTGCCGCGGCTTCTTTACCGCTGGT
21. SacIIA4-1 forward primer
GAAGCCGCGGCAAAAGACTGTTTAGGA
22. ERA4-1 reverse primer
GAATTCTTAAAATACATA
23. NheStrep forward primer
CTAGCTAGCTGGAGCCACCCTCAGTTCGAAAAA
24. NheOmpSS reverse primer
CTGAGGGTGGCTCCAGCTAGCGGCCTGCGCAA
25.27T7prom forward primer
CTGCAGTCGATCCCGCGAAATTAA
26. PstNt USER forward primer
CTGCAGGCTGAGGAGACATCTAGAGGATCCT
27. Nt USER reverse primer
GCTGAGGGAAAGTCTAGAGGATCCTCT
28. SacIINt USER forward primer
TCCCCGCGGCTTTTGCTGAGGAGACATCT
29. TxUser forward primer
GGAGACAUCAGACTGTTTAGGA
30. TxUser reverse primer
GGGAAAGUATCTGCAGAATT
31. Tx (biotin) forward primer
GAGGGACATCAGACTGTTTAGGA
32. Tx (biotin) reverse primer
TTCGCCCTTCGACTGAGGGAAAGT

Claims (2)

標的タンパク質に対して親和性を有するポリペプチドの調製方法であって、下記(ａ)〜(ｅ)の工程を含む方法；
（ａ）グラム陰性細菌で発現可能な発現ベクターの群から構成されるポリヌクレオチドライブラリーを用意する工程であって、
当該各発現ベクターには、スキャフォールドを有する複数のポリペプチドであって、かつ、当該各ポリペプチドにおける相互作用に関与する領域のアミノ酸配列がランダム化された当該複数のポリペプチドをそれぞれコードする複数のポリヌクレオチドのうちの各ポリヌクレオチドが挿入されており、
当該各ポリヌクレオチドの上流に分泌シグナル配列があり、
標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドがタンデムに連結されている、
当該各発現ベクターの群から構成されるポリヌクレオチドライブラリーを用意する工程；
（ｂ）当該ポリヌクレオチドライブラリーを構成する当該各発現ベクターを、形質転換グラム陰性細菌において発現させる工程であって、
当該標的タンパク質を内膜表面に、また当該各ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドをペリプラズム間隙内にそれぞれ発現させる工程；
（ｃ）当該各ポリペプチドを、当該ペリプラズム間隙内で当該標的タンパク質と接触させる工程；
（ｄ）当該形質転換したグラム陰性細菌のスフェロプラストを形成させて、当該標的タンパク質と結合したポリペプチドを選択する工程；
（ｅ）当該選択されたポリペプチドを発現した形質転換細胞中のポリヌクレオチドを増幅して、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのアミノ酸配列を決定する工程。 A method for preparing a polypeptide having affinity for a target protein, comprising the following steps (a) to (e):
(A) preparing a polynucleotide library composed of a group of expression vectors that can be expressed in Gram-negative bacteria,
Each expression vector includes a plurality of polypeptides each having a scaffold and each of which encodes the plurality of polypeptides in which the amino acid sequences of the regions involved in the interaction in each polypeptide are randomized. Each of the polynucleotides of is inserted,
There is a secretory signal sequence upstream of each of the polynucleotides,
The polynucleotide encoding the target protein is linked in tandem,
Preparing a polynucleotide library composed of a group of each expression vector;
(B) a step of expressing each expression vector constituting the polynucleotide library in a transformed gram-negative bacterium,
Expressing the target protein on the inner membrane surface and the polypeptide encoded by each polynucleotide in the periplasmic space;
(C) contacting each polypeptide with the target protein within the periplasmic space;
(D) forming a spheroplast of the transformed gram-negative bacterium and selecting a polypeptide that binds to the target protein;
(E) A step of amplifying a polynucleotide in a transformed cell expressing the selected polypeptide and determining an amino acid sequence of the polypeptide encoded by the polynucleotide. 標的のタンパク質に対して親和性を有するポリペプチドの調製方法であって、下記(ａ)〜(ｊ)の工程を含む方法；
（ａ）グラム陰性細菌で発現可能な発現ベクターの群から構成されるポリヌクレオチドライブラリーを用意する工程であって、
当該各発現ベクターには、スキャフォールドを有する複数のポリペプチドであって、かつ、当該各ポリペプチドにおける相互作用に関与する領域のアミノ酸配列がランダム化された当該複数のポリペプチドをそれぞれコードする複数のポリヌクレオチドのうちの各ポリヌクレオチドが挿入されており、
当該各ポリヌクレオチドの上流に分泌シグナル配列があり、
標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドがタンデムに連結されている、
当該各発現ベクターの群から構成されるポリヌクレオチドライブラリーを用意する工程；
（ｂ）当該ポリヌクレオチドライブラリーを構成する当該各発現ベクターを、形質転換グラム陰性細菌において発現させる工程であって、
当該標的タンパク質を内膜表面に、また当該各ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドをペリプラズム間隙内にそれぞれ発現させる工程；
（ｃ）当該各ポリペプチドを、当該ペリプラズム間隙内で当該標的タンパク質と接触させる工程；
（ｄ）当該形質転換グラム陰性細菌のスフェロプラストを形成させて、当該標的タンパク質と結合したポリペプチドを選択する工程；
（ｅ）当該選択されたポリペプチドを発現した形質転換細胞中のポリヌクレオチドを増幅して発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターの群から構成される第２のポリヌクレオチドライブラリーを製造する工程であって、
当該各発現ベクターに挿入された当該各ポリヌクレオチドは分泌シグナル配列の下流に挿入されており、かつ、当該各発現ベクターは当該標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む
第２のポリヌクレオチドライブラリーを製造する工程、；
（ｆ）当該第２のポリヌクレオチドライブラリーを構成する当該各発現ベクターを形質転換グラム陰性細菌において発現させる工程であって、
当該標的タンパク質を内膜表面に、また当該各ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドをペリプラズム間隙内にそれぞれ発現させる工程；
（ｇ）当該各ポリペプチドを、当該ペリプラズム間隙内で当該標的タンパク質と接触させる工程；
（ｈ）当該形質転換グラム陰性細菌のスフェロプラストを形成させて、当該標的タンパク質と結合したポリペプチドを選択する工程；
（ｉ）必要により工程(ｅ)−(ｈ)を繰り返す工程；そして
（ｊ）選択されたポリペプチドのアミノ酸配列を決定する工程。
A method for preparing a polypeptide having affinity for a target protein, comprising the following steps (a) to (j):
(A) preparing a polynucleotide library composed of a group of expression vectors that can be expressed in Gram-negative bacteria,
Each expression vector includes a plurality of polypeptides each having a scaffold and each of which encodes the plurality of polypeptides in which the amino acid sequences of the regions involved in the interaction in each polypeptide are randomized. Each of the polynucleotides of is inserted,
There is a secretory signal sequence upstream of each of the polynucleotides,
The polynucleotide encoding the target protein is linked in tandem,
Preparing a polynucleotide library composed of a group of each expression vector;
(B) a step of expressing each expression vector constituting the polynucleotide library in a transformed gram-negative bacterium,
Expressing the target protein on the inner membrane surface and the polypeptide encoded by each polynucleotide in the periplasmic space;
(C) contacting each polypeptide with the target protein within the periplasmic space;
(D) forming a spheroplast of the transformed gram-negative bacterium and selecting a polypeptide bound to the target protein;
(E) a step of amplifying a polynucleotide in a transformed cell expressing the selected polypeptide and inserting it into an expression vector to produce a second polynucleotide library comprising the group of expression vectors. There,
Each of the polynucleotides inserted into each of the expression vectors is inserted downstream of the secretory signal sequence, and each of the expression vectors produces a second polynucleotide library containing a polynucleotide encoding the target protein. A process of performing;
(F) expressing each expression vector constituting the second polynucleotide library in a transformed gram-negative bacterium,
Expressing the target protein on the inner membrane surface and the polypeptide encoded by each polynucleotide in the periplasmic space;
(G) contacting each polypeptide with the target protein within the periplasmic space;
(H) forming a spheroplast of the transformed gram-negative bacterium and selecting a polypeptide bound to the target protein;
(I) repeating steps (e)-(h) as necessary; and (j) determining the amino acid sequence of the selected polypeptide.
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