JP5774010B2 - インフルエンザウイルスのための免疫拡散アッセイ - Google Patents
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Description
(a)インフルエンザウイルス抗原を含む1つ以上の試験サンプルを調製する工程と、
(b)少なくとも5%(w/v)の洗剤で前記試験サンプルを処理する工程と、
(c)前記インフルエンザウイルス抗原に特異的な抗体を含有するゲルに、前記処理されたサンプルを塗布する工程と、
(d)前記サンプルをゲルに拡散させる工程。
(i)ワクチン又はそのサンプルを少なくとも5%(w/v)の洗剤で処理する工程と、
(ii)既知の濃度のインフルエンザウイルス抗原を含むレファレンスサンプルを少なくとも5%(w/v)の洗剤で処理する工程と、
(iii)前記処理されたワクチン又はそのサンプルと前記処理されたレファレンスサンプルとを、前記インフルエンザ抗原に特異的な抗体を含有するゲルに塗布する工程と、
(iv)前記サンプルを前記ゲルに拡散させる工程と、
(v)ワクチン又はそのサンプルによって形成されるゲルにおける沈殿環の寸法と、前記レファレンスサンプルによって形成される沈殿環の寸法とを測定する工程と、
(vi)工程(v)において測定された寸法を比較し、前記比較結果を用いて工程(iii)で塗布されたワクチン又はそのサンプル中のHA濃度を計算する工程。
(A)インフルエンザウイルス抗原を含む1つ以上の試験サンプルを調製する工程と、
(B)20μg抗原/mL未満、具体的には5〜20μg/mLの範囲、好適には7.5μg/mLの予測濃度を得るために前記試験サンプルを希釈する工程と、
(C)前記インフルエンザ抗原に特異的な抗体を含有するゲルに前記サンプルを塗布する工程と、
(D)前記サンプルをゲルに拡散させる工程。
OM174 (2−デオキシ−6−o−[2−デオキシ−2−[(R)−3−ドデカノイルオキシテトラ−デカノイルアミノ]−4−o−ホスホノ−β−D−グルコピラノシル]−2−[(R)−3−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−α−D−グルコピラノシルジヒドロジェンリン酸塩(国際公開第95/14026号パンフレット)、
OM 294 DP(3S,9R)3−−[(R)−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]−4−オキソ−5−アザ−9(R)−[(R)−3−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカノ−1,10−ジオール,1,10−ビス(ジヒドロジェンリン酸塩)(国際公開第99/64301号パンフレット及び同第00/0462号パンフレット)、
OM 197 MP−Ac DP(3S,9R)−3−[(R)−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]−4−オキソ−5−アザ−9−[(R)−3−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカノ−1,10−ジオール,1―ジヒドロジェンホスフェート10−(6−アミノヘキサン酸塩)(国際公開第01/46127号パンフレット)。
先行技術の従来のSRIDアッセイの使用と比較して、本発明の改変SRIDアッセイに従って、インフルエンザワクチンロットVFFLU04−14をそのHA含量について試験した。それは三価の分離ビリオンであり、3つの一価ウイルス抗原バルク(それぞれのインフルエンザ株、A/ニューカレドニアH1N1、A/ワイオミングH3N2及びB/江蘇から調製される)からなる不活性化されたインフルエンザワクチンである。この産生後、Zwittergent3−14(商標)1%(Calbiochem)を使用する従来のSRIDアッセイを用いることにより、3つの一価バルクのHA濃度を測定した。この濃度に基づくと、500μLのワクチン用量に各バルクが15μg含まれていた。したがって、用量中の3つの株のうちのいずれの予測HA濃度も30μg HA/mLである。次いで、このワクチンロットを2つの異なる形態に製剤化した。アジュバント添加されないままであるか(プレーン形態と呼ばれる)、又はスクアレン、α−トコフェロール、Tween80(商標)及び3D−MPLを含む水中油型エマルションをアジュバント添加した(OW形態と呼ばれる)かのいずれかである。従来のSRIDアッセイ(Zwittergent3−14(商標)1%)及び本発明の改変SRDアッセイ(Zwittergent3−14(商標)10%)に従って、2つの株(A/ワイオミングH3N2及びB/江蘇)の各製剤(プレーン及びOW)のHA含量を分析した。各々の試験された株に対して特異的であり且つ既知濃度のHAレファレンス抗原(Ref Agと称する)(NIBSCによって提供)を対照として用いて、各試験される株の両方の種類のワクチン製剤(プレーン及びOW)のHA含量を定量する。この実験に対する更なる対照として、各試験される株に対して特異的な一価バルクも使用した(モノバルクと称する)。上記の通り、これらの産生の終わり且つワクチンロットとして製剤化される前に、従来のSRIDアッセイ(Zwittergent3−14(商標)1%)によって各モノバルクのHA濃度を常に測定する。したがって、本実験に対する内部標準として、従来の及び改変SRIDアッセイの両方を使用して、製剤化されたワクチンVFFLU04−14と共に、各試験された株に対して特異的なモノバルクのHA濃度を再計算した。レファレンス抗原、製剤化されたワクチン及びモノバルクをZwittergent3−14(商標)1%又はZwittergent3−14(商標)10%の存在下で、室温にて攪拌しながら30分間インキュベートした。次いで、以下のスキームに従ってこれらを希釈した:1/1(未希釈)、3/4、1/2、1/4。Aワイオミング/H3N2株(WHOによって認定された研究所によって提供)に対して特異的な抗血清を含浸させたアガロースゲルにおけるウェルに前記株に関連する全ての希釈物をロードし、一方、B江蘇株(これもNIBSCによって提供)に対して特異的な抗血清を含浸させたアガロースゲルにおけるウェルに前記株に関連する希釈物をロードした。免疫拡散が生じ、ウェルのまわりに沈殿環が形成されるように湿室内で室温(20〜25℃)にて24時間ゲルをインキュベートした。その後、NaCl溶液にそれらを一晩浸漬し、蒸留水で軽く洗浄した。次に、ゲルを押圧し、乾燥させた。完全に乾燥したら、10分間Coomassie Brillant Blue溶液でゲルを染色し、明確に画定された染色領域が見えるようになるまで、メタノールと酢酸との混合物で2回脱色した。染色したゲルを乾燥させた後に、写真を撮影し、KS400装置(Carl Zeiss)を使用して、沈殿環の表面の測定を行った。任意の単位で表面を表す。各希釈物について、前記測定値を表1(AワイオミングH3N2株)及び表2(B江蘇株)に示す。値は、デュープリケートで各希釈物をそれぞれロードし、1つの希釈物当たり3つの異なる測定を行ったときの平均値を表す。
表面に対する抗原希釈物の用量−応答曲線を構築するために表面値を使用した。次いで、サンプルの濃度を、標準勾配比検定法(Finney,D.J.(1952年).Statistical Methods in Biological Assay.London:Griffin,Quoted in:Wood,JMら(1977年).J.Biol.Standard.5,237−247)に従って計算した。表3及び表4にA/ワイオミング/H3N2及びB/江蘇株についての濃度結果をそれぞれ示す。「予測μg HA/mL」列の値は、従来のSRIDアッセイ(Zwittergent3−14(商標)1%)を用いて測定された、ワクチンに製剤化する前のモノバルクの濃度から得られる。この濃度値に基づくと、500μLの用量に各モノバルクが15μg含まれており、その結果、ワクチンVFFLU04−14中の予測HA濃度値は30μg/mLであった。HA回収率は、HAの予測濃度に対応する100%の対照値と比較したものである。
結果−結論
−表1及び表2は、両方共、沈殿環の表面値を表し、Zwittergent10%の使用は、Zwittergent1%とは対照的に、アジュバント添加されていないサンプルによって形成される環の大きさに対して全く影響を及ぼさないことを示す。実際、Ref Ag行を参照すると、使用されたZwittergent濃度にかかわらず表面値は類似している。プレーンワクチンの行又はモノバルクの行を参照しても同じ結論が導かれる。Zwittergent1%の使用と比較して、Zwittergentを10%使用しても、表面値の差はみられない。この所見は、両方の試験株、すなわちA/ワイオミングH3N2(表1を参照)及びB/江蘇(表2を参照)に当てはまる。
本発明の改変SRIDアッセイに従って、インフルエンザワクチンロットEFLAA004AをそのHA含量について試験した。前記ロットは、A/ブリズベーン/H1N1株を含む四価のインフルエンザワクチンである。この産生後、Zwittergent3−14(商標)1%(Calbiochem)を使用する従来のSRIDアッセイを用いることにより、A/ブリズベーン/H1N1の一価バルク、すなわち、モノバルクのHA濃度を測定した。このモノバルクは、30μg/mLの濃度でワクチンが含まれており、これはこの実験における予測濃度を表す。次いで、スクアレン、α−トコフェロール及びTween80(商標)を含む水中油型エマルションアジュバントと共にこのワクチンロットを製剤化した。本発明(Zwittergent3−14(商標)10%)の改変SRDアッセイに従ってA/ブリズベーン/H1N1株のHA含量を分析した。この株のHA含量を定量することを可能にする対照として、この株に特異的であり且つ既知濃度のHAレファレンス抗原(Ref Agと称する)(NIBSCによって提供)を使用した。この実験に対する更なる対照として、製剤化前に得られるこの株の一価のバルクも用いた(モノバルクと称する)。これらの産生の終わり且つワクチンロットとして製剤化される前に、従来のSRIDアッセイ(Zwittergent3−14(商標)1%)によって各モノバルクのHA濃度を測定した。したがって、本実験用の内部標準として、改変SRIDアッセイを使用して、アジュバント添加されたワクチンEFLAA004Aと共にこのモノバルクのHA濃度を再計算した。まず、レファレンス抗原及びモノバルクを、製剤化EFLAA004Aワクチンにおいて使用されるものと同比率の同アジュバント組成物と混合した。次いで、アジュバント添加されたレファレンス抗原、アジュバント添加されたワクチン、及びアジュバント添加されたモノバルクを、撹拌しながら30分間Zwittergent3−14(商標)10%の存在下でインキュベートした。次いで、以下のスキームに従ってこれらを希釈した:1/1(未希釈)、3/4、1/2、1/4。A/ブリズベーン/H1N1株(WHOが認定した研究所によって提供)に対して特異的な抗血清を含浸させたアガロースゲルにおけるウェルに希釈物を全てロードした。実施例1に記載されているようにアッセイの残りを行った。
結果−結論
−表6は、改変SRIDアッセイを使用した場合に求められたHA濃度を示す、すなわちZwittergent10%では、水中油型エマルションをアジュバント添加されたワクチンロットに対して、予測濃度と類似の結果が得られる。予測濃度は、アジュバントと共にモノバルクを製剤化する前に測定された濃度に相当する。したがって、2つの値の間で違いがみられないので、これは、Zwittergent10%を使用することによって、アジュバント添加されていない同じワクチンと比較して、アジュバント添加されたワクチン中のHA濃度が過小評価されないことを示す。
これらの結果は、Zwittergent10%を使用する本発明の改変SRIDアッセイが、アジュバント添加されたワクチン中のHA濃度を測定するための信頼でき且つ正確な改良法を提供することを示唆する。更に、実施例1から結論付けられるように、この改変SRIDアッセイは、アジュバント添加されていないワクチンで実施される測定に全く影響を与えないので、この方法は両方の種類のワクチン製剤、すなわち、アジュバント添加された製剤及びされていない製剤に適している。
SRIDアッセイによりインフルエンザワクチンロットDFLUA038AAをそのHA含量について評価した。前記ロットは、A/カリフォルニア/H1N1株を含む一価のインフルエンザワクチンである。この産生後、Zwittergent3−14(商標)1%を使用する従来のSRIDアッセイを用いることにより、一価バルク、すなわち、モノバルクのHA濃度を測定した。アッセイを行うとき、標準曲線(NIBSCによって提供、X179)を引くために対照として、この株に特異的な既知濃度のHAレファレンス抗原を使用した。モノバルクは、これら実験における予測濃度を表す15μg/mLの濃度でワクチン中に含まれていた。次いで、スクアレン、α−トコフェロール及びTween80(商標)を含む水中油型エマルションアジュバントと共にこのワクチンロットを製剤化した。SRIDアッセイによってHA含量を分析し、以下を試験した:(a)Zwittergent3−14(商標)の用量範囲:1%(v/w)、5%(v/w)、10%(v/w)、15%(v/w)、及び20%(v/w)、並びに(b)Empigen、Zwittergent3−12(商標)及びTriton−X100(商標)等の異なる洗剤。既知濃度であり且つA/カリフォルニア/H1N1株(NIBSCによって提供、X181)に特異的なHAレファレンス抗原(Ref Agと称する)を対照として用いて標準曲線を引いた。レファレンス抗原に、製剤化されたDFLUA038AAワクチンで用いられるものと同じアジュバントを同じ比率で添加した。(i)最初の実験では、Zwittergent3−14(商標)10%(v/w)をアジュバント添加されたレファレンス抗原を添加した。アジュバント添加されたワクチンの異なるサンプルに、それぞれ、1%(v/w)、5%(v/w)、10%(v/w)、15%(v/w)及び20%(v/w)のZwittergent3−14(商標)を添加した。(ii)第2の実験では、様々なアジュバント添加されたレファレンス抗原サンプルに、Triton−X100(商標)1%(v/w)及びTriton−X100(商標)3.6%(v/w)を添加した。アジュバント添加されたワクチンの様々なサンプルに、それぞれ、TritonX−100(商標)を1%(v/w)及び3.6%(v/w)添加した。(iii)第3の実験では、様々なアジュバント添加されたレファレンス抗原サンプルに、それぞれ、Empigen(商標)1%(v/w)及びEmpigen(商標)10%(v/w)を添加した。アジュバント添加されたワクチンの様々なサンプルに、それぞれ、Empigen(商標)を1%(v/w)及び10%(v/w)添加した。(iv)第4の実験では、アジュバント添加されたレファレンス抗原及びアジュバント添加されたワクチンに、Zwittergent3−12(商標)10%(v/w)を添加した。室温で撹拌しながら30分間、それぞれの洗剤と共に上記のアジュバント添加されたレファレンス抗原サンプル及びアジュバント添加されたワクチンサンプルを全てインキュベートした。次いで、以下のスキームに従いこれらを全て希釈した:1/1(未希釈)、3/4、1/2、1/4。A/カリフォルニア/H1N1株に対して特異的な抗血清を含浸させたアガロースゲルにおけるウェルに希釈物を全てロードした。実施例1に記載されているようにアッセイの残りを行った。
結果−結論
−表8は、Zwittergent3−14(商標)条件の中で、Zwittergent3−14(商標)1%(当技術分野において使用される割合)のみが、予測濃度(HA回収率は83%である)よりも低いHA濃度しか得られず、これは、実施例1及び2で既に得られている所見、すなわち、Zwittergent3−14(商標)1%は、アジュバント添加されたワクチンの評価に使用されるとき、HA濃度を過小評価する等、正確な結果が得られないということを確認する。これに反して、Zwittergent3−14(商標)5%、10%、15%又は20%を用いてSRIDアッセイを行う場合、生じるHA濃度は予測濃度に達する(HA回収率は130%及び135%である)。様々な洗剤条件を試験する、最初の従来のSRIDアッセイ(Zwittergent3−14(商標)1%)を行っている間のレファレンス抗原(15μg HA/mLの濃度(予測濃度)でワクチンロットDFLUA038AA中にA/カリフォルニア/H1N1株を含んでいた)と、後続の改変SRIDアッセイを行っている間のレファレンス抗原とが同一ではなかったという事実によって、濃度が予測濃度より高いという所見が説明される。したがって、正確なHA濃度の測定を提供する様々なZwittergent3−14(商標)条件の能力を比較するために、Zwittergent3−14(商標)10%(実施例1及び2において正確な測定値を提供することが示されている割合)(表8の最後の列を参照)を用いたときに得られる回収率値に対して回収率値を正規化した。HA回収率の正規化された値は、Zwittergent3−14(商標)5%(100%)、Zwittergent3−14(商標)15%(104%)及びZwittergent3−14(商標)20%(104%)が、Zwittergent3−14(商標)10%を使用したときに得られるHA濃度と類似のHA濃度に達することを可能にすることを示す。これらの結果は、5%、10%、15%及び20%が全て、水中油型エマルションを含むインフルエンザワクチンにおけるHA濃度の正確な測定値を提供するZwittergent3−14(商標)の割合を示すことを示唆する。
Claims (13)
- 少なくとも以下の工程:
(a)インフルエンザウイルス抗原を含む1つ以上の試験サンプルを調製する工程と、
(b)少なくとも10%(w/v)の両性イオン性界面活性剤で前記試験サンプルを処理する工程と、
(c)前記インフルエンザウイルス抗原に特異的な抗体を含むゲルに、前記処理された試験サンプルを塗布する工程と、
(d)前記サンプルをゲルに拡散させる工程と、
を含む、免疫拡散アッセイを行う方法。 - 前記処理された試験サンプルによってゲル中に形成される沈殿環の寸法を求める更なる工程(e)を含む、請求項1記載の方法。
- 既知の濃度のインフルエンザウイルス抗原を含むレファレンスサンプルを調製し、試験サンプルと同一条件で処理し、同様にゲルに塗布する、請求項1又は2記載の方法。
- インフルエンザ抗原が赤血球凝集素(HA)である、請求項1から3のいずれか記載の方法。
- 処理されたレファレンスサンプルによってゲル中に形成される沈殿環の寸法を求める更なる工程(f)を含む、請求項3又は4記載の方法。
- 工程(e)において求められた寸法と工程(f)において求められた寸法とを比較し、その比較結果を用いて、工程(c)で塗布された試験サンプル中の抗原濃度を計算する更なる工程(g)を含む、請求項5記載の方法。
- 試験サンプルが不活性化されたインフルエンザワクチンである、請求項1から6のいずれか記載の方法。
- 少なくとも以下の工程:
(i)ワクチン又はそのサンプルを少なくとも10%(w/v)の両性イオン性界面活性剤で処理する工程と、
(ii)既知の濃度のインフルエンザウイルス抗原を含むレファレンスサンプルを少なくとも10%(w/v)の両性イオン性界面活性剤で処理する工程と、
(iii)前記処理されたワクチン又はそのサンプルと前記処理されたレファレンスサンプルとを、前記インフルエンザ抗原に特異的な抗体を含有するゲルに塗布する工程と、
(iv)前記サンプルを前記ゲルに拡散させる工程と、
(v)ワクチン又はそのサンプルによって形成されるゲルにおける沈殿環の寸法と前記レファレンスサンプルによって形成される沈殿環の寸法とを求める工程と、
(vi)工程(v)において求められた寸法を比較し、その比較結果を用いて工程(iii)で塗布されたワクチン又はそのサンプル中のHA濃度を計算する工程と、
を含む、インフルエンザウイルス抗原を含むワクチンのHA濃度を定量する方法。 - 試験サンプル又はワクチンとレファレンスサンプルとがアジュバントを含む、請求項1から8のいずれか記載の方法。
- アジュバントが少なくとも水中油型エマルションを含む、請求項9記載の方法。
- 水中油型エマルションがスクアレン、α-トコフェロール及びTween80(商標)を含む、請求項10記載の方法。
- 試験サンプル又はワクチンの安定性をモニターするための請求項6から11のいずれか記載の方法の使用。
- 試験サンプル又はワクチンが4℃、室温、30℃及び37℃からなる群より選択される温度で、7日間、14日間、30日間、1ヶ月間、6ヶ月間、12ヶ月間、及び18ヶ月間からなる群より選択される期間保存された後、試験サンプル中のインフルエンザウイルス抗原の含量、又はワクチン中のHAの含量を定量する、請求項12記載の使用。
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