JP5772892B2 - Method for producing coelenteramide or an analog thereof - Google Patents
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Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、セレンテラミド又はその類縁体の製造方法、及び緑色蛍光蛋白質(gFP)の製
造方法などに関する。
The present invention relates to a method for producing coelenteramide or an analog thereof, a method for producing green fluorescent protein (gFP), and the like.
生物発光に関与する蛋白質の一つに、カルシウム結合型発光蛋白質がある。この発光蛋
白質は、Ca2+と特異的に結合し瞬間的に発光する。カルシウム結合型発光蛋白質は、酸素
添加機能をもつ蛋白質と発光基質であるルシフェリンのペルオキシドを含む複合体である
。カルシウム結合型発光蛋白質において、酸素添加機能をもつ蛋白質はアポ蛋白質とよば
れる。また、ルシフェリンのペルオキシドは、セレンテラジンペルオキシド（２-hydrope
roxycoelenterazine）である。このようなカルシウム結合型蛋白質としては、具体的には
、イクオリン（aequorin）、クライティン−Ｉ（clytin-I）、クライティン−ＩＩ（clyt
in-II）、マイトロコミン（mitrocomin）、及びオベリン（obelin）などの腔腸動物由来
のものが知られている。
One of the proteins involved in bioluminescence is a calcium-binding photoprotein. This photoprotein specifically binds to Ca 2+ and emits light instantaneously. The calcium-binding photoprotein is a complex containing a protein having an oxygenation function and a peroxide of luciferin, which is a luminescent substrate. In the calcium-binding photoprotein, a protein having an oxygen addition function is called an apoprotein. Luciferin peroxide is coelenterazine peroxide (2-hydrope).
roxycoelenterazine). Specific examples of such calcium-binding proteins include aequorin, clytin-I, clytin-II (clyt).
in-II), mitrocomin, and obelin are known.
このうち、イクオリンは、発光クラゲであるオワンクラゲ（Aequorea aequorea）から
単離された発光蛋白質である（非特許文献１：Shimomura, In: Bioluminescence, Chemic
al principles and methods (2006) pp90-158, World Scientific Pub. Co.； 非特許文
献２：Shimomura et al., (1962) J. Cell. Comp. Physiol. 59, pp223-240）。このイク
オリンは、アポ蛋白質であるアポイクオリン（21.4kDa）とセレンテラジンのヒドロペル
オキシドとの非共有結合性複合体である（非特許文献３： Head et al., (2000) Nature,
405 372-376）。アポイクオリンは、189のアミノ酸残基から構成される単純ポリペプチ
ドであり、Ca2+結合部位に特徴的な3つのEFハンドモチーフを有する（非特許文献４：Ino
uye et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 3154-3158）。Ca2+の存在下で、
イクオリンは、分子内反応によって青い光を発し（λmax ＝ 〜460 nm）、アポイクオリ
ンとセレンテラミドとCO2とに分解する（非特許文献５： Shimomura & Johnson (1972) B
iochemistry 11, 1602-1608.; 非特許文献６： Shimomura & Johnson (1973) Tetrahedro
n Lett. 2963-2966）。この分解により得られたCa2+結合アポイクオリンとセレンテラミ
ドの複合体は、青色蛍光蛋白質(BFP)として知られている（非特許文献７： Shimomura &
Johnson (1975) Nature 256, 236-238）。
Among these, aequorin is a photoprotein isolated from Aequorea aequorea, which is a luminescent jellyfish (Non-patent Document 1: Shimomura, In: Bioluminescence, Chemic).
al principles and methods (2006) pp90-158, World Scientific Pub. Co .; Non-Patent Document 2: Shimomura et al., (1962) J. Cell. Comp. Physiol. 59, pp223-240). This aequorin is a noncovalent complex of apoprotein apoaequorin (21.4 kDa) and coelenterazine hydroperoxide (Non-patent Document 3: Head et al., (2000) Nature,
405 372-376). Apoaequorin is a simple polypeptide composed of 189 amino acid residues and has three EF hand motifs characteristic of the Ca 2+ binding site (Non-patent Document 4: Ino)
uye et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 3154-3158). In the presence of Ca 2+
Aequorin emits blue light by intramolecular reaction (λ max = ˜460 nm) and decomposes into apoaequorin, coelenteramide, and CO 2 (Non-patent Document 5: Shimomura & Johnson (1972) B
iochemistry 11, 1602-1608 .; Non-Patent Document 6: Shimomura & Johnson (1973) Tetrahedro
n Lett. 2963-2966). The complex of Ca 2+ -binding apoaequorin and coelenteramide obtained by this degradation is known as blue fluorescent protein (BFP) (Non-patent Document 7: Shimomura &
Johnson (1975) Nature 256, 236-238).
このBFPの蛍光発光スペクトルは、イクオリンの生物発光スペクトルと同一である（非
特許文献８：Shimomura, Biochem. J. 306 (1995) 537-543； 非特許文献９： Inouye, F
EBS Lett. 577 (2004) 105-110）。大腸菌より調製した組換えアポイクオリンは、EDTA
及び還元試薬の存在下、セレンテラジン及び酸素と共にインキュベートすることにより、
組換えイクオリンを再生することができる（非特許文献１０：Inouye et al., (1986) Bi
ochemistry 25: 8425-8429；非特許文献１１： Inouye et al., (1989) J. Biochem., 1
05, 473-477）。この組換えイクオリンは、高度に精製されている（非特許文献１２：Shi
momura & Inouye (1999) Protein Express. Purif. 16, 91-95）。組換えイクオリン
の発光特性は、天然のイクオリンの特性と一致している（非特許文献１３：Shimomura et
al., (1990) Biochem. J. 270 309-312）。イクオリン及び半合成イクオリンの結晶構造
が解析され（非特許文献３：Head et al., Nature, 405 (2000) 372-376；非特許文献１
４：Toma et al., (2005) Protein Science 14:409-416）、イクオリンのEFハンドモチ
ーフに対するMg2+の結合特性も、NMR分析によって調べられている（非特許文献１５：Oha
shi et al., (2005) J. Biochem. 138: 613-620）。
The fluorescence emission spectrum of BFP is the same as the bioluminescence spectrum of aequorin (Non-patent document 8: Shimomura, Biochem. J. 306 (1995) 537-543; Non-patent document 9: Inouye, F
EBS Lett. 577 (2004) 105-110). Recombinant apoaequorin prepared from E. coli is EDTA
And incubating with coelenterazine and oxygen in the presence of a reducing reagent,
Recombinant aequorin can be regenerated (Non-patent Document 10: Inouye et al., (1986) Bi
ochemistry 25: 8425-8429; Non-Patent Document 11: Inouye et al., (1989) J. Biochem., 1
05, 473-477). This recombinant aequorin is highly purified (Non-patent Document 12: Shi
momura & Inouye (1999) Protein Express. Purif. 16, 91-95). The luminescent properties of recombinant aequorin are consistent with those of natural aequorin (Non-patent Document 13: Shimomura et al.
al., (1990) Biochem. J. 270 309-312). Crystal structures of aequorin and semi-synthetic aequorin were analyzed (Non-patent document 3: Head et al., Nature, 405 (2000) 372-376; Non-patent document 1).
4: Toma et al., (2005) Protein Science 14: 409-416), the binding properties of Mg 2+ to the EF hand motif of aequorin have also been investigated by NMR analysis (Non-patent Document 15: Oha).
shi et al., (2005) J. Biochem. 138: 613-620).
最近、精製された組換えイクオリンからBFPが定量的に調製され（非特許文献９：Inouy
e, FEBS Lett. 577 (2004) 105-110；非特許文献１６：Inouye & Sasaki, FEBS Lett. 5
80 (2006) 1977-1982）、このBFPが実質的な発光活性を有し、ルシフェラーゼのようにセ
レンテラジンの酸化を触媒するということが明らかとなった。このBFPの発光強度は、Ca2
+結合アポイクオリンの発光強度の約10倍である（非特許文献９：Inouye, FEBS Lett. 57
7 (2004) 105-110）。すなわちこのBFPは、蛍光活性及びルシフェラーゼ活性を有する新
規の二機能性蛋白質である。更に、BFPは、EDTAの処理により蛍光発光最大ピーク約470nm
を有する緑色蛍光蛋白質(gFP)に変換される。gFPは、アポイクオリンとセレンテラミドと
の非共有結合性複合体であり、還元試薬の非存在下25℃で、セレンテラジンのインキュベ
ーションにより、イクオリンを再生することができる（非特許文献９：Inouye, FEBS Let
t. 577 (2004) 105-110）。EDTA及びジチオスレイトール(DTT)の存在下、様々なセレンテ
ラジンのアナログをBFP又はgFPと共にインキュベートすることにより、半合成イクオリン
も調製可能である（非特許文献１６：Inouye et al. & Sasaki, FEBS Lett. 580 (2006)
1977-1982）。更に、BFPのルシフェラーゼとしての発光活性は、セレンテラジン及びその
アナログを基質として、30〜300mMの濃度のイミダゾール添加によって活性化される（非
特許文献１７：Inouye & Sasaki (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 354: 650-65
5）。しかし、BFP及びgFPの用途開発において、重要な基礎情報であるセレンテラジンへ
の酸素添加のための蛋白質触媒領域又はアミノ残基は解決されていない。これらの問題解
決および用途開発において、容易に数十ミリグラムの量のBFP及びgFPを調製する必要があ
る。すなわち、アポイクオリンとセレンテラミドより高純度gFPを調製し、BFPへ変換する
方法の確立が必須である。
Recently, BFP was quantitatively prepared from purified recombinant aequorin (Non-patent Document 9: Inouy).
e, FEBS Lett. 577 (2004) 105-110; Non-Patent Document 16: Inouye & Sasaki, FEBS Lett. 5
80 (2006) 1977-1982), it became clear that this BFP has substantial luminescence activity and catalyzes the oxidation of coelenterazine like luciferase. The emission intensity of this BFP is Ca 2
+ Approximately 10 times the emission intensity of bound apoaequorin (Non-patent document 9: Inouye, FEBS Lett. 57
7 (2004) 105-110). That is, this BFP is a novel bifunctional protein having fluorescence activity and luciferase activity. Furthermore, BFP has a maximum fluorescence emission peak of about 470 nm by EDTA treatment.
Is converted to a green fluorescent protein (gFP) having gFP is a non-covalent complex of apoaequorin and coelenteramide, and aequorin can be regenerated by incubation of coelenterazine at 25 ° C. in the absence of a reducing reagent (Non-patent Document 9: Inouye, FEBS Let
t. 577 (2004) 105-110). Semi-synthetic aequorin can also be prepared by incubating various coelenterazine analogs with BFP or gFP in the presence of EDTA and dithiothreitol (DTT) (Non-patent Document 16: Inouye et al. & Sasaki, FEBS Lett . 580 (2006)
1977-1982). Furthermore, the luminescence activity of BFP as luciferase is activated by adding imidazole at a concentration of 30 to 300 mM using coelenterazine and its analog as a substrate (Non-patent Document 17: Inouye & Sasaki (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 354: 650-65
Five). However, in the development of applications of BFP and gFP, the protein catalytic region or amino residue for oxygen addition to coelenterazine, which is important basic information, has not been solved. In solving these problems and developing applications, it is necessary to easily prepare tens of milligrams of BFP and gFP. That is, it is essential to establish a method for preparing high-purity gFP from apoaequorin and coelenteramide and converting it to BFP.
ここで、BFP及びgFPを製造するための原料となるセレンテラミドの製造方法として、下
記式
方法が知られている（非特許文献６：Shimomura & Johnson, Tetrahedron Lett. (1973)
2963-2966）。この方法における、セレンテラミドの収率は約50％である。
Here, as a method for producing coelenteramide as a raw material for producing BFP and gFP, the following formula
2963-2966). The yield of coelenteramide in this method is about 50%.
上記状況において、高収率なセレンテラミド又はその類縁体の製造方法などが求められ
ていた。
In the above situation, there has been a demand for a method for producing high-yield coelenteramide or an analog thereof.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、セレンテラミドを、
Ｏ−メチルセレンテラミンからジ−Ｏ−メチルセレンテラミドを経由して合成する新しい
合成経路を確立するなどし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下に示す、セレンテラミド又はその類縁体の製造方法などを提
供する。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have obtained coelenteramide,
The present invention was completed by establishing a new synthesis route for synthesizing from O-methylcoelenteramine via di-O-methylcoelenteramide.
That is, this invention provides the manufacturing method of coelenteramide or its analog shown below.
（１）下記一般式（１）
（式中、
Ｒ１は、炭素数１〜３のアルキル、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルであり、
Ｒ２は、アミノであり、
Ｒ３は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数１〜７のアルキル、脂肪族環式基、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルである。）
を、
下記一般式（２）
（式中、
Ｘは、脱離基であり、
Ｒ４は、炭素数１〜３のアルキル、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルである。）
に反応させることを含む、
下記一般式（３）
（式中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４は、前記の通りである。）
の製造方法。
（２）一般式（１）において、
Ｒ１が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、フェネチル、３−フェニルプロピル、又は４−フェニルブチルである、上記（１）に記載の方法。
（３）一般式（１）において、
Ｒ３が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、s−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、α−メチルベンジル、フェネチル、３−フェニルプロピル、又は４−フェニルブチルである、上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）一般式（２）において、
Ｘが、塩素、臭素、ヨウ素、メタンスルホニルオキシ、ベンゼンスルホニルオキシ、トルエンスルホニルオキシ、又は（４−Ｒ４Ｏ）Ｃ６Ｈ４ＣＣＯＯ−（式中、Ｒ４は前記の通りである。）である、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）一般式（２）において、
Ｒ４が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、フェネチル、３−フェニルプロピル、又は４−フェニルブチルである、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）一般式（１）で表わされる化合物が、下記化合物
（７）一般式（２）で表わされる化合物が、下記化合物
（８）下記式
（９）下記一般式（３）
（式中、
Ｒ１は、炭素数１〜３のアルキル、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルであり、
Ｒ３は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数１〜７のアルキル、脂肪族環式基、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルであり、
Ｒ４は、炭素数１〜３のアルキル、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルである。）
（１０）下記式
（１１）下記一般式（３）
（式中、
Ｒ１は、炭素数１〜３のアルキル、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルであり、
Ｒ３は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数１〜７のアルキル、脂肪族環式基、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルであり、
Ｒ４は、炭素数１〜３のアルキル、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルである。）
よりＲ１で示す基及びＲ４で示す基を脱離させることを含む、
下記一般式（４）
（式中、Ｒ３は前記の通りである。）
の製造方法。
（１２）一般式（３）において、
Ｒ１が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、フェネチル、３−フェニルプロピル、又は４−フェニルブチルである、上記（１１）に記載の方法。
（１３）一般式（３）において、
Ｒ３が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、s−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、α−メチルベンジル、フェネチル、３−フェニルプロピル、又は４−フェニルブチルである、上記（１１）又は（１２）に記載の方法。
（１４）一般式（３）において、
Ｒ４が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、フェネチル、３−フェニルプロピル、又は４−フェニルブチルである、上記（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１５）一般式（３）で表わされる化合物が、下記化合物
（１６）下記式
（１７）カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤の存在下において、
下記一般式（４）
（式中、
Ｒ３は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数１〜７のアルキル、脂肪族環式基、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルである。）
を、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に反応させることを含む、緑色蛍光蛋白質（ｇＦＰ）の製造方法。
（１８）カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤の存在下において、下記式
（１９）前記反応を、還元剤の存在下において行う、上記（１７）又は（１８）に記載の方法。
（２０）下記一般式（１）
（式中、
Ｒ１は、炭素数１〜３のアルキル、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルであり、
Ｒ２は、アミノであり、
Ｒ３は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数１〜７のアルキル、脂肪族環式基、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルである。）
を、
下記一般式（２）
（式中、
Ｘは、脱離基であり、
Ｒ４は、炭素数１〜３のアルキル、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルである。）
に反応させて、
下記一般式（３）
（式中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４は、前記の通りである。）
を生成する工程と、
一般式（３）で表わされる化合物よりＲ １ で示す基及びＲ ４ で示す基を脱離させて、
下記一般式（４）
（式中、Ｒ ３ は前記の通りである。）
を生成する工程と、
カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの存在下、一般式（４）で表わされる化合物を、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に反応させることを含む、青色蛍光蛋白質（BFP）の製造方法。
(1) The following general formula (1)
R 1 is alkyl having 1 to 3 carbons or arylalkyl having 7 to 10 carbons;
R 2 is amino;
R 3 is alkyl having 1 to 7 carbons, an aliphatic cyclic group, or arylalkyl having 7 to 10 carbons which may be substituted with an aliphatic cyclic group. )
The
The following general formula (2)
X is a leaving group,
R 4 is alkyl having 1 to 3 carbons or arylalkyl having 7 to 10 carbons. )
Including reacting with
The following general formula (3)
Manufacturing method.
(2) In general formula (1),
The method according to (1) above, wherein R 1 is methyl, ethyl, propyl, isopropyl, benzyl, α-methylbenzyl, phenethyl, 3-phenylpropyl, or 4-phenylbutyl.
(3) In general formula (1),
R 3 is methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, s-butyl, t-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, t-pentyl, hexyl, heptyl, cyclopropylmethyl, cyclobutylmethyl, cyclopentylmethyl, cyclohexyl The method according to (1) or (2) above, which is methyl, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, α-methylbenzyl, phenethyl, 3-phenylpropyl, or 4-phenylbutyl.
(4) In general formula (2),
X is chlorine, bromine, iodine, methanesulfonyloxy, benzenesulfonyloxy, toluenesulfonyloxy, or (4-R 4 O) C 6 H 4 CCOO— (wherein R 4 is as described above). The method according to any one of (1) to (3) above.
(5) In the general formula (2),
R 4 is methyl, ethyl, propyl, isopropyl, benzyl, α-methylbenzyl, phenethyl, 3-phenylpropyl, or 4-phenylbutyl, according to any one of (1) to (4) above. Method.
(6) The compound represented by the general formula (1) is the following compound:
(7) The compound represented by the general formula (2) is the following compound:
(8) The following formula
(9) The following general formula (3)
(Where
R 1 is alkyl having 1 to 3 carbons or arylalkyl having 7 to 10 carbons;
R 3 is alkyl having 1 to 7 carbons, an aliphatic cyclic group, or arylalkyl having 7 to 10 carbons which may be substituted with an aliphatic cyclic group;
R 4 is alkyl having 1 to 3 carbons or arylalkyl having 7 to 10 carbons. )
(10) The following formula
(11) The following general formula (3)
R 1 is alkyl having 1 to 3 carbons or arylalkyl having 7 to 10 carbons;
R 3 is alkyl having 1 to 7 carbons, an aliphatic cyclic group, or arylalkyl having 7 to 10 carbons which may be substituted with an aliphatic cyclic group;
R 4 is alkyl having 1 to 3 carbons or arylalkyl having 7 to 10 carbons. )
Further removing the group represented by R 1 and the group represented by R 4 ,
The following general formula (4)
Manufacturing method.
(12) In the general formula (3),
The method according to (11) above, wherein R 1 is methyl, ethyl, propyl, isopropyl, benzyl, α-methylbenzyl, phenethyl, 3-phenylpropyl, or 4-phenylbutyl.
(13) In general formula (3),
R 3 is methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, s-butyl, t-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, t-pentyl, hexyl, heptyl, cyclopropylmethyl, cyclobutylmethyl, cyclopentylmethyl, cyclohexyl The method according to (11) or (12) above, which is methyl, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, α-methylbenzyl, phenethyl, 3-phenylpropyl, or 4-phenylbutyl.
(14) In the general formula (3),
R 4 is methyl, ethyl, propyl, isopropyl, benzyl, α-methylbenzyl, phenethyl, 3-phenylpropyl, or 4-phenylbutyl, according to any one of (11) to (13) above. Method.
(15) The compound represented by the general formula (3) is the following compound:
(16) The following formula
(17) In the presence of a chelating agent for removing calcium ions or divalent or trivalent ions replaceable with calcium ions,
The following general formula (4)
R 3 is alkyl having 1 to 7 carbons, an aliphatic cyclic group, or arylalkyl having 7 to 10 carbons which may be substituted with an aliphatic cyclic group. )
A method for producing green fluorescent protein (gFP), which comprises reacting apoprotein with a calcium-binding photoprotein apoprotein.
(18) In the presence of a chelating agent for removing calcium ions or divalent or trivalent ions replaceable with calcium ions, the following formula:
(19) The method according to (17) or (18) above, wherein the reaction is carried out in the presence of a reducing agent.
(20) The following general formula (1)
R 1 is alkyl having 1 to 3 carbons or arylalkyl having 7 to 10 carbons;
R 2 is amino;
R 3 is alkyl having 1 to 7 carbons, an aliphatic cyclic group, or arylalkyl having 7 to 10 carbons which may be substituted with an aliphatic cyclic group. )
The
The following general formula (2)
X is a leaving group,
R 4 is alkyl having 1 to 3 carbons or arylalkyl having 7 to 10 carbons. )
In response to
The following general formula (3)
Generating
By removing the group represented by R 1 and the group represented by R 4 from the compound represented by the general formula (3) ,
The following general formula (4)
( Wherein R 3 is as described above.)
Generating
A blue fluorescent protein comprising reacting a compound represented by the general formula ( 4 ) with an apoprotein of a calcium-binding photoprotein in the presence of calcium ion or a divalent or trivalent ion replaceable with calcium ion ( BFP) manufacturing method.
本発明のある態様のセレンテラミド又はその類縁体の製造方法によれば、従来の方法と
比較してセレンテラミド又はその類縁体を高収率で製造することができる。本発明の別の
態様によれば、簡易にgFPをアポイクオリンより直接調製可能となる。
According to a method for producing coelenteramide or an analog thereof according to an aspect of the present invention, coelenteramide or an analog thereof can be produced in a high yield as compared with a conventional method. According to another aspect of the present invention, gFP can be easily prepared directly from apoaequorin.
以下、本発明について詳細に説明する。
１．セレンテラミド又はその類縁体の製造方法
本発明では、セレンテラミド又はその類縁体を、Ｏ−メチルセレンテラミン又はその類
縁体からジ−Ｏ−メチルセレンテラミド又はその類縁体を経由して製造する。本発明のセ
レンテラミド又はその類縁体の製造方法のいくつかの態様では、Ｏ−メチルセレンテラミ
ン又はその類縁体からのセレンテラミド又はその類縁体の精製前の収率は、従来の製造方
法よりも高く、例えば、５５％以上、６０％、６５％以上、又は７０％以上である。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. In the present invention, coelenteramide or an analog thereof is produced from O-methylcoelenteramine or an analog thereof via di-O-methylcoelenteramide or an analog thereof. In some embodiments of the method for producing coelenteramide or an analog thereof of the present invention, the yield before purification of coelenteramide or an analog thereof from O-methylcoelenteramine or an analog thereof is higher than that of a conventional production method, For example, it is 55% or more, 60%, 65% or more, or 70% or more.
１．１．ジ−Ｏ−メチルセレンテラミド又はその類縁体の製造
本発明は、ジ−Ｏ−メチルセレンテラミド又はその類縁体（一般式（３）で表わされる
化合物）を提供する。すなわち、本発明は、下記一般式（３）
（式中、
Ｒ1は、炭素数１〜３のアルキル、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルであり、
Ｒ3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数１〜７のアルキル、脂肪族環
式基、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルであり、
Ｒ4は、炭素数１〜３のアルキル、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルである。）
を提供する。
1.1. Production of di-O-methylcoelenteramide or an analog thereof The present invention provides di-O-methylcoelenteramide or an analog thereof (a compound represented by the general formula (3)). That is, the present invention provides the following general formula (3)
R 1 is alkyl having 1 to 3 carbons or arylalkyl having 7 to 10 carbons;
R 3 is alkyl having 1 to 7 carbon atoms, an aliphatic cyclic group, or arylalkyl having 7 to 10 carbon atoms, which may be substituted with an aliphatic cyclic group,
R 4 is alkyl having 1 to 3 carbons or arylalkyl having 7 to 10 carbons. )
I will provide a.
一般式（３）中、Ｒ1で示される炭素数１〜３のアルキルとしては、例えば、メチル、
エチル、プロピル、又はイソプロピルが挙げられる。Ｒ1で示される炭素数７〜１０のア
リールアルキルとしては、例えば、ベンジル、α−メチルベンジル、フェネチル、３−フ
ェニルプロピル、又は４−フェニルブチルが挙げられる。本発明のいくつかの態様では、
Ｒ1は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、フ
ェネチル、３−フェニルプロピル、又は４−フェニルブチルである。好ましくは、Ｒ1は
、メチル、エチル、イソプロピル、又はベンジルである。
In general formula (3), examples of the alkyl having 1 to 3 carbon atoms represented by R 1 include methyl,
Examples include ethyl, propyl, or isopropyl. Examples of the arylalkyl having 7 to 10 carbon atoms represented by R 1 include benzyl, α-methylbenzyl, phenethyl, 3-phenylpropyl, and 4-phenylbutyl. In some aspects of the invention,
R 1 is methyl, ethyl, propyl, isopropyl, benzyl, α-methylbenzyl, phenethyl, 3-phenylpropyl, or 4-phenylbutyl. Preferably R 1 is methyl, ethyl, isopropyl or benzyl.
一般式（３）中、Ｒ3で示される、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数
１〜７のアルキルとしては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル
、イソブチル、s−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペ
ンチル、ヘキシル、ヘプチル、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペン
チルメチル、又はシクロヘキシルメチルが挙げられる。Ｒ3で示される脂肪族環式基とし
ては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、又はシクロヘキシルが
挙げられる。Ｒ3で示される炭素数７〜１０のアリールアルキルとしては、例えば、ベン
ジル、α−メチルベンジル、フェネチル、３−フェニルプロピル、又は４−フェニルブチ
ルが挙げられる。本発明のいくつかの態様では、Ｒ3は、メチル、エチル、プロピル、イ
ソプロピル、ブチル、イソブチル、s−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネ
オペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、シクロプロピルメチル、シクロブチル
メチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロプロピル、シクロブチル
、シクロペンチル、シクロヘキシル、α−メチルベンジル、フェネチル、３−フェニルプ
ロピル、又は４−フェニルブチルである。好ましくは、Ｒ3は、シクロヘキシルメチル、
シクロペンチルメチル、又はベンジルである。
In general formula (3), examples of the alkyl having 1 to 7 carbon atoms which may be substituted with an aliphatic cyclic group represented by R 3 include, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, s -Butyl, t-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, t-pentyl, hexyl, heptyl, cyclopropylmethyl, cyclobutylmethyl, cyclopentylmethyl, or cyclohexylmethyl. Examples of the aliphatic cyclic group represented by R 3 include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, and cyclohexyl. Examples of the arylalkyl having 7 to 10 carbon atoms represented by R 3 include benzyl, α-methylbenzyl, phenethyl, 3-phenylpropyl, and 4-phenylbutyl. In some embodiments of the invention, R 3 is methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, s-butyl, t-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, t-pentyl, hexyl, heptyl, cyclopropylmethyl. , Cyclobutylmethyl, cyclopentylmethyl, cyclohexylmethyl, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, α-methylbenzyl, phenethyl, 3-phenylpropyl, or 4-phenylbutyl. Preferably R 3 is cyclohexylmethyl,
Cyclopentylmethyl or benzyl.
一般式（３）中、Ｒ4で示される炭素数１〜３のアルキルとしては、例えば、メチル、
エチル、プロピル、又はイソプロピルが挙げられる。Ｒ4で示される炭素数７〜１０のア
リールアルキルとしては、例えば、ベンジル、α−メチルベンジル、フェネチル、３−フ
ェニルプロピル、又は４−フェニルブチルが挙げられる。本発明のいくつかの態様では、
Ｒ4は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、フ
ェネチル、３−フェニルプロピル、又は４−フェニルブチルである。好ましくは、Ｒ4は
、メチル、エチル、イソプロピル、又はベンジルである。
In the general formula (3), examples of the alkyl having 1 to 3 carbon atoms represented by R 4 include methyl,
Examples include ethyl, propyl, or isopropyl. Examples of the arylalkyl having 7 to 10 carbon atoms represented by R 4 include benzyl, α-methylbenzyl, phenethyl, 3-phenylpropyl, and 4-phenylbutyl. In some aspects of the invention,
R 4 is methyl, ethyl, propyl, isopropyl, benzyl, α-methylbenzyl, phenethyl, 3-phenylpropyl, or 4-phenylbutyl. Preferably R 4 is methyl, ethyl, isopropyl or benzyl.
本発明のいくつかの態様では、上記一般式（３）で表わされるジ−Ｏ−メチルセレンテ
ラミド又はその類縁体は、例えば、下記化合物からなる群から選択される化合物である。
In some embodiments of the present invention, the di-O-methylcoelenteramide represented by the general formula (3) or an analog thereof is, for example, a compound selected from the group consisting of the following compounds.
本発明の別の態様では、上記一般式（３）で表わされるジ−Ｏ−メチルセレンテラミド
類縁体は、例えば、下記化合物からなる群から選択される化合物である。
In another aspect of the present invention, the di-O-methylcoelenteramide analog represented by the general formula (3) is, for example, a compound selected from the group consisting of the following compounds.
本発明のさらに別の態様では、上記一般式（３）で表わされるジ−Ｏ−メチルセレンテ
ラミド類縁体は、例えば、下記化合物からなる群から選択される化合物である。
In still another aspect of the present invention, the di-O-methylcoelenteramide analog represented by the general formula (3) is, for example, a compound selected from the group consisting of the following compounds.
本発明のさらに別の態様では、上記一般式（３）で表わされるジ−Ｏ−メチルセレンテ
ラミド類縁体は、例えば、下記化合物からなる群から選択される化合物である。
In still another aspect of the present invention, the di-O-methylcoelenteramide analog represented by the general formula (3) is, for example, a compound selected from the group consisting of the following compounds.
本発明のさらに別の態様では、上記一般式（３）で表わされるジ−Ｏ−メチルセレンテ
ラミド類縁体は、例えば、下記化合物からなる群から選択される化合物である。
In still another aspect of the present invention, the di-O-methylcoelenteramide analog represented by the general formula (3) is, for example, a compound selected from the group consisting of the following compounds.
本発明のいくつかの態様では、ジ−Ｏ−メチルセレンテラミド又はその類縁体は、好ま
しくは、下記に示す化合物からなる群から選択される化合物である。
In some aspects of the invention, di-O-methylcoelenteramide or an analog thereof is preferably a compound selected from the group consisting of the compounds shown below.
本発明の別の態様では、ジ−Ｏ−メチルセレンテラミド類縁体は、好ましくは、下記に
示す化合物からなる群から選択される化合物である。
In another aspect of the present invention, the di-O-methylcoelenteramide analog is preferably a compound selected from the group consisting of the compounds shown below.
本発明のさらに別の態様では、ジ−Ｏ−メチルセレンテラミド類縁体は、好ましくは、
下記に示す化合物からなる群から選択される化合物である。
In yet another aspect of the invention, the di-O-methylcoelenteramide analog is preferably
It is a compound selected from the group consisting of the compounds shown below.
本発明のさらに別の態様では、ジ−Ｏ−メチルセレンテラミド類縁体は、好ましくは、
下記に示す化合物からなる群から選択される化合物である。
In yet another aspect of the invention, the di-O-methylcoelenteramide analog is preferably
It is a compound selected from the group consisting of the compounds shown below.
本発明のさらに別の態様では、ジ−Ｏ−メチルセレンテラミド類縁体は、好ましくは、
下記に示す化合物からなる群から選択される化合物である。
In yet another aspect of the invention, the di-O-methylcoelenteramide analog is preferably
It is a compound selected from the group consisting of the compounds shown below.
本発明の一つの態様では、ジ−Ｏ−メチルセレンテラミド又はその類縁体は、下記に示
すジ−Ｏ−メチルセレンテラミドである。
In one embodiment of the present invention, the di-O-methylcoelenteramide or an analog thereof is di-O-methylcoelenteramide shown below.
また、本発明は、上記ジ−Ｏ−メチルセレンテラミド又はその類縁体の製造方法を提供
する。より具体的には、本発明は、Ｏ−メチルセレンテラミン又はその類縁体（一般式（
１）で表わされる化合物）を、４−メトキシフェニルアセチルハライド又はその類縁体（
一般式（２）で表わされる化合物）に反応させることを含む、上記ジ−Ｏ−メチルセレン
テラミド又はその類縁体（一般式（３）で表わされる化合物）の製造方法を提供する。す
なわち、本発明は、下記一般式（１）
（式中、
Ｒ1は、炭素数１〜３のアルキル、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルであり、
Ｒ2は、アミノであり、
Ｒ3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数１〜７のアルキル、脂肪族環
式基、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルである。）
を、
下記一般式（２）
（式中、
Ｘは、脱離基であり、
Ｒ4は、炭素数１〜３のアルキル、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルである。）
に反応させることを含む、
下記一般式（３）
（式中、
Ｒ1、Ｒ3、及びＲ4は、前記の通りである。）
の製造方法を提供する。
Moreover, this invention provides the manufacturing method of the said di-O-methylcoelenteramide or its analog. More specifically, the present invention relates to O-methylcoelenteramine or an analog thereof (general formula (
1), 4-methoxyphenylacetyl halide or its analog (
There is provided a process for producing the above di-O-methylcoelenteramide or an analog thereof (compound represented by the general formula (3)), which comprises reacting with the compound represented by the general formula (2). That is, the present invention provides the following general formula (1)
R 1 is alkyl having 1 to 3 carbons or arylalkyl having 7 to 10 carbons;
R 2 is amino;
R 3 is alkyl having 1 to 7 carbons, an aliphatic cyclic group, or arylalkyl having 7 to 10 carbons which may be substituted with an aliphatic cyclic group. )
The
The following general formula (2)
X is a leaving group,
R 4 is alkyl having 1 to 3 carbons or arylalkyl having 7 to 10 carbons. )
Including reacting with
The following general formula (3)
R 1 , R 3 , and R 4 are as described above. )
A manufacturing method is provided.
一般式（１）又は一般式（２）中、Ｒ1、Ｒ3、及びＲ4は、前述の一般式（３）での説
明の通りである。
In the general formula (1) or the general formula (2), R 1 , R 3 , and R 4 are as described in the general formula (3).
一般式（２）中、Ｘで示される脱離基としては、例えば、ハロゲン（例えば、塩素、臭
素、若しくはヨウ素）、スルホン酸の反応性残基（例えば、メタンスルホニルオキシ、ベ
ンゼンスルホニルオキシ、若しくはトルエンスルホニルオキシ）、又は酸無水物を形成せ
しめるアシルオキシ（例えば、（４-Ｒ4Ｏ）Ｃ6Ｈ4ＣＨ2ＣＯＯ-（式中、Ｒ4は前記の通
りである。））が挙げられる。なかでもハロゲンが好ましく、特に塩素がより好ましい。
In the general formula (2), examples of the leaving group represented by X include halogen (for example, chlorine, bromine, or iodine), sulfonic acid reactive residues (for example, methanesulfonyloxy, benzenesulfonyloxy, or Toluenesulfonyloxy), or acyloxy (for example, (4-R 4 O) C 6 H 4 CH 2 COO— (wherein R 4 is as defined above)) that forms an acid anhydride. Of these, halogen is preferable, and chlorine is more preferable.
上記一般式（１）で表わされるＯ−メチルセレンテラミン又はその類縁体として、例え
ば、下記化合物からなる群から選択される化合物を挙げることができる。
Examples of O-methylcoelenteramine represented by the general formula (1) or an analog thereof include compounds selected from the group consisting of the following compounds.
Ｏ−メチルセレンテラミン又はその類縁体は、好ましくは、下記化合物からなる群から
選択される化合物である。
O-methylcoelenteramine or an analog thereof is preferably a compound selected from the group consisting of the following compounds.
本発明の一つの態様では、Ｏ−メチルセレンテラミン又はその類縁体は、下記化合物で
ある。
In one embodiment of the present invention, O-methylcoelenteramine or an analog thereof is the following compound.
一般式（１）で表わされるＯ−メチルセレンテラミン又はその類縁体は、公知の製造方
法で製造することができ、或いは、市販のものを入手することができる。例えば、Kishi
et al., Tetrahedron Lett., 13, 2747-2748 (1972)、又はAdamczyk et al., Org. Prep.
Proced. Int., 33, 477-485 (2001)に記載の方法又はそれに準ずる方法で一般式（１）
で表わされるＯ−メチルセレンテラミン又はその類縁体を製造することができる。
O-methylcoelenteramine represented by the general formula (1) or an analog thereof can be produced by a known production method, or a commercially available product can be obtained. For example, Kishi
et al., Tetrahedron Lett., 13, 2747-2748 (1972), or Adamczyk et al., Org. Prep.
In the method described in Proced. Int., 33, 477-485 (2001) or a method analogous thereto, the general formula (1)
The O-methylcoelenteramine represented by these or its analog can be manufactured.
また、上記一般式（２）で表わされる４−メトキシフェニルアセチルハライド又はその
類縁体として、例えば、下記化合物からなる群から選択される化合物を挙げることができ
る。
Moreover, as 4-methoxyphenyl acetyl halide represented by the said General formula (2) or its analog, the compound selected from the group which consists of the following compound can be mentioned, for example.
４−メトキシフェニルアセチルハライド又はその類縁体は、好ましくは、下記化合物か
らなる群から選択される化合物である。
4-methoxyphenylacetyl halide or an analog thereof is preferably a compound selected from the group consisting of the following compounds.
本発明の一つの態様では、４−メトキシフェニルアセチルハライド又はその類縁体は、
下記に示す４−メトキシフェニルアセチルクロリドである。
In one embodiment of the present invention, 4-methoxyphenylacetyl halide or an analog thereof is
It is 4-methoxyphenyl acetyl chloride shown below.
一般式（２）で表わされる４−メトキシフェニルアセチルハライド又はその類縁体は、
公知の製造方法で製造することができ、或いは、市販のものを入手することができる。具
体的には、いずれの化合物も、対応するカルボン酸に対して過剰の塩化チオニルを作用さ
せて加熱還流した後、減圧濃縮するか、又は、ジクロロメタン溶媒中、触媒量のＮ、Ｎ-
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）存在下、対応するカルボン酸に対して二塩化オキサリル
を反応させた後、減圧濃縮するか、のいずれかの方法で製造することができる。また、４
-メトキシフェニルアセチルクロリドはAldrich社から、４-ベンジルオキシフェニルアセ
チルクロリド、及び４-メトキシフェニル酢酸無水物は東京化成工業から、購入すること
ができる。
4-methoxyphenylacetyl halide represented by the general formula (2) or an analog thereof is
It can be produced by a known production method, or a commercially available product can be obtained. Specifically, each compound is heated under reflux with an excess of thionyl chloride acting on the corresponding carboxylic acid, and then concentrated under reduced pressure, or a catalytic amount of N, N-
In the presence of dimethylformamide (DMF), the corresponding carboxylic acid can be reacted with oxalyl dichloride and then concentrated under reduced pressure. 4
-Methoxyphenylacetyl chloride can be purchased from Aldrich, and 4-benzyloxyphenylacetyl chloride and 4-methoxyphenylacetic anhydride can be purchased from Tokyo Chemical Industry.
一般式（３）で表わされるジ-Ｏ-メチルセレンテラミド又はその類縁体は、一般式（１
）で表わされるＯ-メチルセレンテラミン又はその類縁体と、一般式（２）で表わされる
４-メトキシフェニルアセチルハライド又はその類縁体とを、例えば、有機溶媒中、塩基
の存在下、又は塩基性有機溶媒中で反応させることで製造することができる。より具体的
には、ジ-Ｏ-メチルセレンテラミドは、後述の実施例に記載の方法又はそれに準ずる方法
を用いて製造することができる。
Di-O-methylcoelenteramide represented by the general formula (3) or an analog thereof is represented by the general formula (1
O-methylcoelenteramine or its analog represented by the formula (4) and 4-methoxyphenylacetyl halide or its analog represented by the general formula (2), for example, in an organic solvent, in the presence of a base, or basic It can manufacture by making it react in an organic solvent. More specifically, di-O-methylcoelenteramide can be produced using the method described in the examples below or a method analogous thereto.
ここで、本発明のジ−Ｏ−メチルセレンテラミド又はその類縁体の製造方法において使
用される有機溶媒又は塩基性有機溶媒は、種々のものを使用できるが、水系、又はアルコ
ール類以外の有機溶媒又は塩基性有機溶媒が特に好ましい。有機溶媒又は塩基性有機溶媒
は、例えば、ピリジン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロ
フラン、酢酸エチル、アセトン、トルエン、ジオキサン、又はエーテル等であり、これら
は単独で又は混合して使用することができる。
Here, as the organic solvent or basic organic solvent used in the method for producing di-O-methylcoelenteramide of the present invention or an analog thereof, various solvents can be used, but aqueous solvents or organic solvents other than alcohols can be used. Or a basic organic solvent is particularly preferable. The organic solvent or the basic organic solvent is, for example, pyridine, dichloromethane, chloroform, acetonitrile, tetrahydrofuran, ethyl acetate, acetone, toluene, dioxane, ether or the like, and these can be used alone or as a mixture.
本発明のジ-Ｏ-メチルセレンテラミド又はその類縁体の製造方法において使用される塩
基は、特に限定されず、種々のものを使用できる。例えば、ピリジン、トリエチルアミン
、ジイソプロピルエチルアミン、４-ジメチルアミノピリジン、ルチジン、又はコリジン
等であり、これらは単独で又は混合して使用することができる。
The base used in the method for producing di-O-methylcoelenteramide or an analog thereof of the present invention is not particularly limited, and various bases can be used. For example, pyridine, triethylamine, diisopropylethylamine, 4-dimethylaminopyridine, lutidine, collidine and the like can be used alone or in combination.
また、本発明のジ−Ｏ−メチルセレンテラミド又はその類縁体の製造方法において、反
応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、−２０℃〜２００℃で、１時間〜
７２時間、好ましくは、０℃〜１００℃で、６時間〜３６時間、より好ましくは、室温〜
５０℃で、１２時間〜２４時間である。
Moreover, in the manufacturing method of di-O-methylcoelenteramide or its analog of this invention, although reaction temperature and reaction time are not specifically limited, For example, -20 degreeC-200 degreeC, 1 hour-
72 hours, preferably 0 ° C. to 100 ° C., 6 hours to 36 hours, more preferably room temperature to
It is 12 to 24 hours at 50 ° C.
本発明の一つの態様は、下記式
１．２．セレンテラミド又はその類縁体の製造
本発明は、さらに、ジ−Ｏ−メチルセレンテラミド又はその類縁体（一般式（３）で表
わされる化合物）よりＲ1で示す基及びＲ4で示す基を脱離させることを含む、セレンテラ
ミド又はその類縁体（一般式（４）で表わされる化合物）の製造方法を提供する。すなわ
ち、本発明は、下記一般式（３）
（式中、
Ｒ1は、炭素数１〜３のアルキル、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルであり、
Ｒ3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数１〜７のアルキル、脂肪族環
式基、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルであり、
Ｒ4は、炭素数１〜３のアルキル、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルである。）
よりＲ1で示す基及びＲ4で示す基を脱離させることを含む、
下記一般式（４）
（式中、Ｒ3は、前述の通りである。）
の製造方法を提供する。
1.2. Production of coelenteramide or an analog thereof The present invention further eliminates a group represented by R 1 and a group represented by R 4 from di-O-methylcoelenteramide or an analog thereof (a compound represented by the general formula (3)). A method for producing coelenteramide or an analog thereof (compound represented by the general formula (4)). That is, the present invention provides the following general formula (3)
R 1 is alkyl having 1 to 3 carbons or arylalkyl having 7 to 10 carbons;
R 3 is alkyl having 1 to 7 carbon atoms, an aliphatic cyclic group, or arylalkyl having 7 to 10 carbon atoms, which may be substituted with an aliphatic cyclic group,
R 4 is alkyl having 1 to 3 carbons or arylalkyl having 7 to 10 carbons. )
The elimination of the group represented by R 1 and the group represented by R 4 ,
The following general formula (4)
A manufacturing method is provided.
本発明のセレンテラミド又はその類縁体の製造方法において、一般式（３）で表わされ
るジ−Ｏ−メチルセレンテラミド又はその類縁体は、前記で説明した通りである。ジ−Ｏ
−メチルセレンテラミド又はその類縁体として、例えば、前記本発明のジ−Ｏ−メチルセ
レンテラミド又はその類縁体の製造方法により製造した化合物を挙げることができる。
In the method for producing coelenteramide or an analog thereof according to the present invention, the di-O-methylcoelenteramide represented by the general formula (3) or an analog thereof is as described above. J-O
Examples of -methylcoelenteramide or an analog thereof include, for example, compounds produced by the above-described method for producing di-O-methylcoelenteramide or an analog thereof.
本発明のセレンテラミド又はその類縁体の製造方法において、Ｒ1で示す基及びＲ4で示
す基の脱離は通常の方法を用いて行うことができ、その脱離の方法は特に限定されない。
例えば、メチルの脱離は、実施例に記載の方法又はそれに準ずる方法を用いて行うことが
できる。
In the method for producing coelenteramide or an analog thereof according to the present invention, elimination of the group represented by R 1 and the group represented by R 4 can be carried out using an ordinary method, and the method of elimination is not particularly limited.
For example, elimination of methyl can be performed using the method described in the examples or a method analogous thereto.
ここで、本発明のセレンテラミド又はその類縁体の製造方法において使用する溶媒は、
種々のものを使用でき、非極性溶媒であるのが特に好ましい。溶媒は、例えば、ジクロロ
メタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、トルエン、ジオキサン又はエーテル等であ
り、これらは単独で又は混合して使用することができる。
Here, the solvent used in the method for producing coelenteramide or an analog thereof of the present invention,
Various solvents can be used, and nonpolar solvents are particularly preferred. Examples of the solvent include dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran, toluene, dioxane, ether, and the like, and these can be used alone or in combination.
また、本発明のセレンテラミド又はその類縁体の製造における反応温度及び反応時間は
、特に限定されないが、例えば、−１００℃〜２００℃で、１時間〜７２時間、好ましく
は、−２０℃〜１００℃で、６時間〜３６時間、より好ましくは、０℃〜５０℃で、１２
時間〜２４時間である。
Further, the reaction temperature and reaction time in the production of the coelenteramide of the present invention or an analog thereof are not particularly limited, but are, for example, −100 ° C. to 200 ° C., 1 hour to 72 hours, preferably −20 ° C. to 100 ° C. 6 hours to 36 hours, more preferably 0 ° C to 50 ° C,
Time to 24 hours.
本発明の方法により製造される上記一般式（４）で表わされるセレンテラミド又はその
類縁体として、例えば、下記化合物からなる群から選択される化合物を挙げることができ
る。
Examples of coelenteramide represented by the general formula (4) produced by the method of the present invention or an analog thereof include compounds selected from the group consisting of the following compounds.
セレンテラミド又はその類縁体は、好ましくは、下記化合物からなる群から選択される
化合物である。
Coelenteramide or an analog thereof is preferably a compound selected from the group consisting of the following compounds.
本発明の一つの態様では、セレンテラミド又はその類縁体は、下記に示すセレンテラミ
ドである。
In one embodiment of the present invention, the coelenteramide or an analog thereof is coelenteramide shown below.
本発明の一つの態様は、下記式
下記式
Following formula
２．蛍光蛋白質
図６に示すように、緑色蛍光蛋白質（gFP）は、EDTA等のカルシウムイオン又はカルシ
ウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤の存在下
、セレンテラミド又はその類縁体（一般式（４）で表わされる化合物）に、アポイクオリ
ン等のアポ蛋白質を反応させることにより製造することができる。また、gFPにカルシウ
ムイオンを加えることにより、青色蛍光蛋白質（BFP）を製造することができる。
2. Fluorescent protein As shown in FIG. 6, green fluorescent protein (gFP) is coelenteramide or its coexistent in the presence of calcium ions such as EDTA or a chelating agent for removing divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions. It can be produced by reacting an analog (a compound represented by the general formula (4)) with an apoprotein such as apoaequorin. In addition, blue fluorescent protein (BFP) can be produced by adding calcium ions to gFP.
また、図６に示すように、BFPは、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能
な２価若しくは３価のイオンの存在下、セレンテラミド又はその類縁体にアポイクオリン
等のアポ蛋白質を反応させることによっても製造することができる。また、EDTA等のカル
シウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するた
めのキレート剤の存在下、gFPに、セレンテラジン又はその類縁体を反応させることで、
イクオリン等のカルシウム結合型発光蛋白質を製造することも出来る。
As shown in FIG. 6, BFP can also be obtained by reacting coelenteramide or an analog thereof with apoprotein such as apoaequorin in the presence of calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions. Can be manufactured. In addition, by reacting coelenterazine or its analog with gFP in the presence of a chelating agent for removing calcium ions such as EDTA or divalent or trivalent ions that can be substituted with calcium ions,
Calcium-binding photoproteins such as aequorin can also be produced.
２．１．緑色蛍光蛋白質（gFP）
２．１．１．緑色蛍光蛋白質（gFP）の製造方法
本発明の緑色蛍光蛋白質（gFP）の製造方法において製造する緑色蛍光蛋白質（gFP）は
、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に、セレンテラミド又はその類縁体が配位し
た複合体である。gFPは、光の励起を受けて蛍光を発生することができる。
2.1. Green fluorescent protein (gFP)
2.1.1. Method for Producing Green Fluorescent Protein (gFP) The green fluorescent protein (gFP) produced in the method for producing the green fluorescent protein (gFP) of the present invention is coordinated with coelenteramide or its analog to the apoprotein of the calcium-binding photoprotein. It is a complex. gFP can generate fluorescence upon excitation of light.
本発明では、gFPを、セレンテラミド又はその類縁体から次のように製造する。すなわ
ち、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除
去するためのキレート剤の存在下において、セレンテラミド又はその類縁体（例えば、一
般式（４）で表わされる化合物）を、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に反応さ
せることで、gFPを製造する。
In the present invention, gFP is produced from coelenteramide or an analog thereof as follows. That is, coelenteramide or an analog thereof (for example, a compound represented by the general formula (4)) in the presence of a chelating agent for removing calcium ions or divalent or trivalent ions replaceable with calcium ions, GFP is produced by reacting with apoprotein, a calcium-binding photoprotein.
本発明においてgFPを製造するのに用いるセレンテラミド又はその類縁体は、例えば、
前記一般式（４）で表わされる化合物である。一般式（４）で表わされる化合物は前記で
説明した通りである。セレンテラミド又はその類縁体として、例えば、前記本発明のセレ
ンテラミド又はその類縁体の製造方法により製造した化合物を挙げることができる。
In the present invention, coelenteramide used to produce gFP or an analog thereof is, for example,
It is a compound represented by the general formula (4). The compound represented by the general formula (4) is as described above. As coelenteramide or its analog, the compound manufactured by the manufacturing method of the coelenteramide or its analog of the said this invention can be mentioned, for example.
本発明においてgFPを製造するのに用いるキレート剤は、カルシウムイオン又はカルシ
ウムイオンと置換可能な２若しくは３価のイオンと強く結合するものであれば良く、特に
制限されない。キレート剤の例として、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレン
グリコールビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＥＧＴＡ）
、ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミノシクロヘキサンＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＣｙＤＴ
Ａ）、又はＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）等を挙げることがで
きる。ここで、カルシウムイオンと置換可能な２価又は３価のイオンとは、カルシウムイ
オンに代えてカルシウム結合型発光蛋白質と反応させた場合に、発光反応を起こす２価又
は３価のイオンのことである。つまり、カルシウム結合型発光蛋白質に対して、カルシウ
ムイオンと同等の作用をするものである。カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換
可能な２価又は３価のイオンは、例えば、カルシウムイオン（Ｃａ2+）、マグネシウムイ
オン（Ｍｇ2+）、ストロンチウムイオン（Ｓｒ2+）、バリウムイオン（Ｂａ2+）、鉛イオ
ン（Ｐｂ2+）、コバルトイオン（Ｃｏ2+）、ニッケルイオン（Ｎｉ2+）、カドミウムイオ
ン（Ｃｄ2+）、イットリウムイオン（Ｙ3+）、ランタンイオン（Ｌａ3+）、サマリウムイ
オン（Ｓｍ3+）、ユウロピウムイオン（Ｅｕ3+）、ジスプロシウムイオン（Ｄｙ3+）、ツ
リウムイオン（Ｔｍ3+）、又はイットリビウムイオン（Ｙｂ3+）等を挙げることができる
。これらのうち、２価の金属イオンが好ましい。より好ましくは遷移金属以外の２価の金
属イオン、例えばＣａ2+、Ｓｒ2+、又はＰｂ2+等である。
The chelating agent used for producing gFP in the present invention is not particularly limited as long as it binds strongly to calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions. Examples of chelating agents include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ethylene glycol bis (β-aminoethyl ether) N, N, N ′, N′-tetraacetic acid (EGTA)
, Trans-1,2-diaminocyclohexane N, N, N ′, N′-tetraacetic acid (CyDT
A) or N- (2-hydroxyethyl) iminodiacetic acid (HIDA). Here, divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions are divalent or trivalent ions that cause a luminescent reaction when reacted with a calcium-binding photoprotein instead of calcium ions. is there. That is, it acts on calcium-binding photoproteins in the same manner as calcium ions. Examples of calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions include calcium ions (Ca 2+ ), magnesium ions (Mg 2+ ), strontium ions (Sr 2+ ), and barium ions (Ba 2+ ). ), Lead ion (Pb 2+ ), cobalt ion (Co 2+ ), nickel ion (Ni 2+ ), cadmium ion (Cd 2+ ), yttrium ion (Y 3+ ), lanthanum ion (La 3+ ), Examples include samarium ion (Sm 3+ ), europium ion (Eu 3+ ), dysprosium ion (Dy 3+ ), thulium ion (Tm 3+ ), and yttrium ion (Yb 3+ ). Of these, divalent metal ions are preferred. More preferred are divalent metal ions other than transition metals, such as Ca 2+ , Sr 2+ , or Pb 2+ .
gFPの製造のために用いるキレート剤の量は、gFP再生に影響しなければ、その濃度は特
に制限されない。イオンアポイクオリン1molには、3molのカルシウムイオンが結合するこ
とが示されていることより、例えば、3mol 以上が好ましい。
The amount of the chelating agent used for the production of gFP is not particularly limited as long as it does not affect gFP regeneration. For example, 3 mol or more is preferable because 1 mol of ion apoaequorin is shown to bind 3 mol of calcium ions.
本発明においてgFPを製造するのに用いるカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質は
、例えば、アポイクオリン、アポクライティン−Ｉ、アポクライティン−ＩＩ、アポオベ
リン、アポマイトロコミン、アポミネオプシン又はアポベルボイン等である。本発明のあ
る態様では、アポ蛋白質は、アポイクオリン、アポクライティン−Ｉ、アポクライティン
−ＩＩ、アポオベリン、又はアポマイトロコミン等であり、例えば、アポイクオリンであ
る。アポ蛋白質は、天然から採取したものであっても、遺伝子工学的に製造したものであ
ってよい。さらに、アポ蛋白質は、gFPを形成できるものであれば、そのアミノ酸配列を
天然のものから遺伝子組換え技術によって変異させたものであってもよい。
The apoprotein of the calcium-binding photoprotein used for producing gFP in the present invention is, for example, apoaequorin, apocritin-I, apocritin-II, apooverin, apomytrocomin, apomineopsin or apovelvoin . In one embodiment of the present invention, the apoprotein is apoaequorin, apocrytin-I, apocrytin-II, apoovelin, or apomytrocomine, for example, apoaequorin. The apoprotein may be collected from nature or may be produced by genetic engineering. Furthermore, as long as the apoprotein can form gFP, its amino acid sequence may be mutated from a natural one by a gene recombination technique.
天然から採取した発光蛋白質のアポ蛋白質（天然型アポ蛋白質）の塩基配列及びアミノ
酸配列は、次の通りである。すなわち、天然型アポイクオリンの塩基配列を配列番号１に
、アミノ酸配列を配列番号２に示す。天然型アポクライティン−Ｉの塩基配列を配列番号
３に、アミノ酸配列を配列番号４に示す。天然型アポクライティン−ＩＩの塩基配列を配
列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６に示す。天然型アポマイトロコミンの塩基配列を
配列番号７に、アミノ酸配列を配列番号８に示す。天然型天然型アポオベリンの塩基配列
を配列番号９に、アミノ酸配列を配列番号１０に示す。天然型アポベルボインの塩基配列
を配列番号１１に、アミノ酸配列を配列番号１２に示す。
The nucleotide sequence and amino acid sequence of the apoprotein (natural apoprotein) of the photoprotein collected from nature are as follows. That is, the base sequence of natural apoaequorin is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2. The nucleotide sequence of natural apocrytin-I is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4. The base sequence of natural apocritin-II is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 6. The base sequence of natural apomitrocomine is shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 8. The base sequence of natural type natural apooverin is shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 10. The base sequence of natural apovelvoin is shown in SEQ ID NO: 11, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 12.
組換え技術によって変異させたアポ蛋白質は、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる
群から選択される蛋白質である。
The apoprotein mutated by the recombinant technique is, for example, a protein selected from the group consisting of the following (a) to (c).
（ａ）天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿
入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ
蛋白質活性若しくは機能を有する蛋白質、
（ｂ）天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配
列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性若しくは機能を有する
蛋白質、及び
（ｃ）天然型アポ蛋白質の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミ
ノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性若しくは機能を
有する蛋白質。
(A) a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of a natural apoprotein, and having an apoprotein activity or function of a calcium-binding photoprotein ,
(B) a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of a natural apoprotein and having an apoprotein activity or function of a calcium-binding photoprotein, and (c) a natural apoprotein It consists of an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the protein base sequence, and has an apoprotein activity or function of a calcium-binding photoprotein protein.
上記「天然型アポ蛋白質」は、例えば、アポイクオリン、アポクライティン−Ｉ、アポ
クライティン−ＩＩ、アポオベリン、アポマイトロコミン、アポミネオプシン、又はアポ
ベルボイン等である。本発明のある態様では、アポ蛋白質は、アポイクオリン、アポクラ
イティン−Ｉ、アポクライティン−ＩＩ、アポオベリン、又はアポマイトロコミン等であ
り、好ましくは、アポイクオリンである。これらの天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列又は
塩基配列は、前記の通りである。
The above-mentioned “natural type apoprotein” is, for example, apoaequorin, apocrytin-I, apocrytin-II, apoovelin, apomytrocomin, apomineopsin, or apovelvoin. In one embodiment of the present invention, the apoprotein is apoaequorin, apocrytin-I, apocritin-II, apoovelin, or apomytrocomine, and preferably apoaequorin. The amino acid sequences or base sequences of these natural apoproteins are as described above.
上記「カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性又は機能」とは、例えば、アポ蛋
白質がセレンテラジンのペルオキシド若しくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結
合してカルシウム結合型発光蛋白質を形成する活性又は機能を意味する。「蛋白質がセレ
ンテラジンのペルオキシド若しくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合してカル
シウム結合型発光蛋白質を形成する」とは、具体的には、（１）蛋白質が、セレンテラジ
ンのペルオキシド若しくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合して発光蛋白質を
形成すること、だけではなく（２）蛋白質が、酸素存在下に、セレンテラジン若しくはそ
の誘導体と接触することにより、蛋白質とセレンテラジンのペルオキシド若しくはセレン
テラジン類縁体のペルオキシドとを含有する発光蛋白質（複合体）を形成すること、をも
意味する。ここで、「接触」とは、蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体とを同一の反
応系に存在させることを意味し、例えば、セレンテラジン又はその類縁体を収容した容器
に蛋白質を添加すること、蛋白質を収容した容器にセレンテラジン又はその類縁体を添加
すること、又は蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体とを混合すること、などが含まれ
る。また、「セレンテラジン類縁体」は、セレンテラジンと同様に、アポ蛋白質として、
イクオリン等のカルシウム結合型発光蛋白質を構成しうる化合物を指す。セレンテラジン
又はその類縁体は、例えば、セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン
、ｃｌ−セレンテラジン、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、ｃｈ−セレンテ
ラジン、ｈｃｈ−セレンテラジン、ｆｃｈ−セレンテラジン、ｅ−セレンテラジン、ｅｆ
−セレンテラジン、ｅｃｈ−セレンテラジン、又はｈｃｐ−セレンテラジン等である。こ
れらのセレンテラジン又はその類縁体の入手方法は、後に記載する。
The above-mentioned “apoprotein activity or function of calcium-binding photoprotein” means, for example, the activity or function of apoprotein binding to the coelenterazine peroxide or the peroxide of coelenterazine analog to form a calcium-binding photoprotein. Specifically, “a protein binds to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of coelenterazine to form a calcium-binding photoprotein” specifically, (1) the protein binds to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of coelenterazine analog. (2) A photoprotein containing a protein and a peroxide of coelenterazine or a coelenterazine analog by contacting the coelenterazine or a derivative thereof in the presence of oxygen. It also means forming a (complex). Here, “contact” means that a protein and coelenterazine or an analog thereof are present in the same reaction system, for example, adding a protein to a container containing coelenterazine or an analog thereof, For example, adding coelenterazine or an analog thereof to the container accommodated, or mixing the protein with coelenterazine or an analog thereof. In addition, “coelenterazine analog” is similar to coelenterazine as an apoprotein,
It refers to a compound that can constitute a calcium-binding photoprotein such as aequorin. Coelenterazine or its analogs include, for example, coelenterazine, h-coelenterazine, f-coelenterazine, cl-coelenterazine, n-coelenterazine, cp-coelenterazine, ch-coelenterazine, hch-coelenterazine, fch-coelenterazine, e-coelenterazine, ef
-Coelenterazine, ech-coelenterazine, or hcp-coelenterazine. Methods for obtaining these coelenterazines or their analogs will be described later.
上記「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列」に
おける「１〜複数個」の範囲は、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９
個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜
２個、１個である。欠失、置換、挿入若しくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ない
ほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生
じてもよい。このような領域は、"Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laborato
ry Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)"、 "Ausbel
F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wil
ey and Sons (1987-1997)"、"Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)"、"Proc. Natl. Acad
. Sci. USA, 79, 6409 (1982)"、"Gene, 34, 315 (1985)"、"Nuc. Acids. Res., 13, 443
1 (1985)"、又は"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)"等に記載の部位特異的
変異導入法を用いて、取得することができる。
The range of “1 to plural” in the above “amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added” is, for example, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10 1-9
1 to 8, 1 to 7, 1 to 6 (1 to several), 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to
Two and one. Generally, the smaller the number of amino acids deleted, substituted, inserted or added, the better. Two or more of the amino acid residue deletions, substitutions, insertions and additions may occur simultaneously. Such a region is described in "Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laborato
ry Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) "," Ausbel
FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wil
ey and Sons (1987-1997) "," Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982) "," Proc. Natl. Acad
Sci. USA, 79, 6409 (1982) "," Gene, 34, 315 (1985) "," Nuc. Acids. Res., 13, 443
1 (1985) ", or" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) "or the like.
また、上記「９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」における「９０％以上」の範
囲は、例えば、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％
以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％
以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％
以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上である。上記同一性の数値は、一般的に大き
いほど好ましい。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Altz
shul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)、など参照）等の解析プログラムを
用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーター
を用いる。
The range of “90% or more” in the “amino acid sequence having 90% or more identity” is, for example, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95%.
Or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2%
99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7%
Above, it is 99.8% or more, or 99.9% or more. In general, the larger the numerical value of identity, the better. The identity of amino acid sequences and base sequences is determined by BLAST (for example, Altz
shul SF et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990), etc.). When using BLAST, the default parameters of each program are used.
また、上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは
、天然型アポ蛋白質の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は天然型
アポ蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとし
て、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザン
ハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、
ＤＮＡ）をいう。具体的には、コロニー或いはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化
したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブ
リダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Saline-sodium citrate）溶
液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ
／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することに
より同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
The above-mentioned “polynucleotide hybridizing under stringent conditions” refers to a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of the natural apoprotein or a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the natural apoprotein. A polynucleotide (for example, a polynucleotide obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern hybridization method, or the like using all or part of the probe as a probe (for example,
DNA). Specifically, hybridization was performed at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 mol / L NaCl using a filter on which a polynucleotide derived from colony or plaque was immobilized, and then 0.1 to 2 Double-concentration SSC (Saline-sodium citrate) solution (composition of single-concentration SSC solution is 150 mmol / L sodium chloride, 15 mmol
/ L consisting of sodium citrate) and a polynucleotide that can be identified by washing the filter under 65 ° C conditions.
ハイブリダイゼーションは、Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)、Ausbel F. M.
et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and
Sons (1987-1997)、又はGlover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniq
ues, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実
験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
Hybridization was performed using Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory.
Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), Ausbel FM
et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley and
Sons (1987-1997) or Glover DM and Hames BD, DNA Cloning 1: Core Techniq
It can be carried out according to the methods described in experimental documents such as ues, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995).
ここで言う「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジ
ェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな
条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミ
ド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×
デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、42℃の条件である。「高スト
リンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5(w/v)％SDS、50％(v
/v)ホルムアミド、50℃の条件である。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする
相補性が高くなる。具体的には、例えば、これらの条件において、温度を上げるほど高い
相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待でき
る。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度
、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ
、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現する
ことが可能である。
The “stringent conditions” referred to herein may be low stringent conditions, medium stringent conditions, or high stringent conditions. “Low stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% (w / v) SDS, 50% (v / v) formamide, 32 ° C. “Medium stringent conditions” are, for example, 5 × SSC, 5 ×
Denhardt's solution, 0.5% (w / v) SDS, 50% (v / v) formamide at 42 ° C. “High stringent conditions” include, for example, 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5 (w / v)% SDS, 50% (v
/ v) Formamide at 50 ° C. The tighter the conditions, the higher the complementarity required for duplex formation. Specifically, for example, it can be expected that a polynucleotide (eg, DNA) having high homology as the temperature is increased can be efficiently obtained under these conditions. However, multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered as factors that affect hybridization stringency. Those skilled in the art will select these factors as appropriate. It is possible to achieve similar stringency.
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct
Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合
は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーション
を一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファー
で洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。
In addition, when using a commercially available kit for hybridization, for example, Alkphos Direct
Labeling Reagents (manufactured by Amersham Pharmacia) can be used. In this case, follow the protocol attached to the kit, incubate with the labeled probe overnight, and then wash the membrane with a primary wash buffer containing 0.1% (w / v) SDS at 55 ° C. , Hybridized DNA can be detected.
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、BLAST等の解析プログラ
ムにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、アポ蛋白質のアミノ酸配列
をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上
、85％以上、88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上
、99.3％以上、99.5％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するDNA
をあげることができる。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、前述した方法を用い
て決定できる。
As other polynucleotides that can be hybridized, when calculated using the default parameters by an analysis program such as BLAST, the polynucleotide encoding the amino acid sequence of the apoprotein is about 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 92% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.3% or more, 99.5% Above, DNA with 99.7% or more, 99.8% or more, 99.9% or more identity
Can give. The identity of amino acid sequences and base sequences can be determined using the method described above.
本発明のいくつかの態様において、アポ蛋白質は、全てのシステイン残基をセリン残基
で置換したものである。gFPは、アポ蛋白質中のシステイン残基の遊離ＳＨ基が酸化され
てＳ−Ｓ結合を生成すると、化学発光活性を失う。したがって、システイン残基がセリン
残基で置換されＳ−Ｓ結合を生じることができなくなったアポ蛋白質は、化学発光活性を
ほとんど失わず、Ｓ−Ｓ結合を生じないため活性が持続する。
In some embodiments of the invention, the apoprotein has all cysteine residues replaced with serine residues. gFP loses chemiluminescence activity when the free SH group of a cysteine residue in an apoprotein is oxidized to form an SS bond. Therefore, an apoprotein in which a cysteine residue is substituted with a serine residue and cannot generate an SS bond hardly loses chemiluminescence activity and does not generate an SS bond, so that the activity continues.
gFPの製造のために用いるセレンテラミド又はその類縁体の量は、特に制限されないが
、アポ蛋白質1molに対して、例えば、1mol〜5mol、好ましくは、1mol〜2mol、さらに好ま
しくは、1mol〜1.2molである。
The amount of coelenteramide or its analog used for the production of gFP is not particularly limited, but for example, 1 mol to 5 mol, preferably 1 mol to 2 mol, more preferably 1 mol to 1.2 mol with respect to 1 mol of apoprotein. is there.
gFPの製造において、セレンテラミド又はその類縁体とアポ蛋白質との反応は、還元剤
の存在下で行うのが好ましい。ここで用いる還元剤としては、例えば、ジチオトレイトー
ル(DTT)、又はメルカプトエタノール等を挙げることができる。gFP再生に影響しなければ
、gFPの製造のために用いる還元剤の量は、特に制限されないが、アポイクオリンには、
３カ所のシステイン残基が存在することより、S-S 結合形成を防ぐ濃度であるのが好まし
い。例えば、最終濃度が、1 mMジチオトレイトールや0.1％メルカプエタノールである。
In the production of gFP, the reaction between coelenteramide or its analog and apoprotein is preferably carried out in the presence of a reducing agent. Examples of the reducing agent used here include dithiothreitol (DTT) and mercaptoethanol. The amount of reducing agent used for the production of gFP is not particularly limited as long as it does not affect gFP regeneration.
Since there are three cysteine residues, the concentration is preferably such that SS bond formation is prevented. For example, the final concentration is 1 mM dithiothreitol or 0.1% mercapethanol.
gFPの製造における反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、０℃〜42
℃で、０.1時間〜2時間、4℃〜37℃で、0.1時間〜2時間、又は4℃〜15℃で、0.1時間〜24
時間である。
Although the reaction temperature and reaction time in manufacture of gFP are not specifically limited, For example, 0 degreeC-42
0.1 ° C to 2 hours at 4 ° C, 0.1 to 2 hours at 4 ° C to 37 ° C, or 0.1 to 24 hours at 4 ° C to 15 ° C
It's time.
このようにして得たgFPは、さらに精製に供しても良い。gFPの精製は、通常の分離・精
製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム
沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で
、又は適宜組み合わせて用いることができる。
The gFP thus obtained may be further subjected to purification. The purification of gFP can be performed according to a normal separation / purification method. Separation / purification methods include, for example, ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, dialysis, ultrafiltration, etc., alone or in appropriate combination. be able to.
本発明のいくつかの態様は、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価
若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤の存在下において、下記式
）の製造方法を提供する。本発明の一つの態様では、図５に示すように、EDTAの存在下、
セレンテラミドをアポイクオリンに反応させることにより、gFPを製造する。
Some embodiments of the present invention have the following formula in the presence of a chelating agent for removing calcium ions or divalent or trivalent ions replaceable with calcium ions:
). In one embodiment of the invention, as shown in FIG. 5, in the presence of EDTA,
GFP is produced by reacting coelenteramide with apoaequorin.
２．１．２．緑色蛍光蛋白質（gFP）の利用
（１）レポーター蛋白質としての利用
gFPは、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することが
できる。例えば、アポ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを、目的のプロモーター又は
他の発現制御配列（例えば、エンハンサーなど）に融合したベクターを構築する。前記ベ
クターを宿主細胞に導入し、さらに、これに、セレンテラミド又はその類縁体を、カルシ
ウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するため
のキレート剤の存在下で接触させることで、gFPを生成させ、gFPに由来する蛍光を検出す
ることにより、目的のプロモーター又は他の発現制御配列の活性を測定することができる
。
2.1.2. Use of green fluorescent protein (gFP) (1) Use as a reporter protein
gFP can be used as a reporter protein for measuring transcriptional activity of a promoter and the like. For example, a vector is constructed in which a polynucleotide encoding an apoprotein is fused to a target promoter or other expression control sequence (for example, an enhancer). The vector is introduced into a host cell, and coelenteramide or an analog thereof is contacted in the presence of calcium ion or a chelating agent for removing a divalent or trivalent ion that can replace the calcium ion. Thus, the activity of the target promoter or other expression control sequence can be measured by generating gFP and detecting fluorescence derived from gFP.
（２）検出マーカとしての利用
gFPは、蛍光による検出マーカとして利用することができる。検出マーカは、例えば、
イムノアッセイ又はハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用
することができる。gFPを化学修飾法など通常用いられる方法により目的物質（蛋白質或
いは核酸など）と結合させて使用することができる。このような検出マーカを用いた検出
方法は、通常の方法によって行うことができる。また、本発明の検出マーカは、例えば、
アポ蛋白質と目的物質との融合蛋白質として発現させ、マイクロインジェクション法など
の手法により細胞内に導入し、さらに、これに、セレンテラミド又はその類縁体を、カル
シウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するた
めのキレート剤の存在下で接触させることでgFPを生成させること等によって、前記目的
物質の分布を測定するために利用することもできる。このような目的物質などの分布の測
定は、蛍光イメージング等の検出法などを利用して行うこともできる。なお、アポ蛋白質
は、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入する以外に、細胞内で発
現させて用いることもできる。
(2) Use as a detection marker
gFP can be used as a fluorescent detection marker. The detection marker is, for example,
It can be used for detection of a target substance in an immunoassay or a hybridization assay. gFP can be used by binding to a target substance (protein or nucleic acid) by a commonly used method such as a chemical modification method. A detection method using such a detection marker can be performed by a normal method. The detection marker of the present invention is, for example,
It is expressed as a fusion protein of an apoprotein and a target substance, introduced into a cell by a technique such as microinjection, and further, coelenteramide or an analog thereof can be replaced with calcium ions or calcium ions. It can also be used to measure the distribution of the target substance by, for example, generating gFP by contacting in the presence of a chelating agent for removing trivalent ions. Such measurement of the distribution of the target substance can also be performed using a detection method such as fluorescence imaging. In addition, the apoprotein can be expressed in the cell and used in addition to being introduced into the cell by a technique such as a microinjection method.
（３）アミューズメント用品の材料
gFPは、アミューズメント用品の材料の蛍光材として好適に使用することができる。ア
ミューズメント用品としては、たとえば、蛍光シャボン玉、蛍光アイス、蛍光飴、蛍光絵
の具等があげられる。アミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができ
る。
(3) Amusement equipment materials
gFP can be suitably used as a fluorescent material for amusement goods. Examples of amusement goods include fluorescent soap bubbles, fluorescent ice, fluorescent glaze, fluorescent paints, and the like. The amusement article can be manufactured by a usual method.
２．２．青色蛍光蛋白質（BFP）
２．２．１．青色蛍光蛋白質（BFP）の製造方法
前記本発明の製造方法により製造したgFPに、カルシウムイオン又はカルシウムイオン
と置換可能な２価若しくは３価のイオンを加えることにより、青色蛍光蛋白質(BFP)を製
造することができる。或いは、青色蛍光蛋白質(BFP)は、カルシウムイオン又はカルシウ
ムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの存在下、前記本発明の方法により製造
したセレンテラミド又はその類縁体（一般式（４）で表わされる化合物）に、カルシウム
結合型アポ蛋白質を反応させることによっても製造することができる。本発明において製
造する青色蛍光蛋白質（BFP）は、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に、セレン
テラミド又はその類縁体が配位した複合体である。BFPは、光の励起を受けて蛍光を発生
することができるとともに、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若
しくは３価のイオンと反応して発光することもできる。
2.2. Blue fluorescent protein (BFP)
2.2.1. Blue fluorescent protein (BFP) production method Blue fluorescent protein (BFP) is produced by adding calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions to the gFP produced by the production method of the present invention. can do. Alternatively, blue fluorescent protein (BFP) is coelenteramide produced by the method of the present invention or an analog thereof (general formula (4)) in the presence of calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions. It can also be produced by reacting a compound represented) with a calcium-binding apoprotein. The blue fluorescent protein (BFP) produced in the present invention is a complex in which coelenteramide or an analog thereof is coordinated to an apoprotein of a calcium-binding photoprotein. BFP can generate fluorescence upon receiving excitation of light, and can also emit light by reacting with calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions.
「カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオン」は、前記の説明と同様である。BFPの製造のために用いるカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの量は、特に制限されないが、BFPの製造のために用いるカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの量は、BFP再生に影響しなければ、その濃度は特に制限されない。イオンアポイクオリン1molには、3molのカルシウムイオンが結合することが示されていることより、3mol 以上が好ましい。 “Calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions” is the same as described above. The amount of calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions used for producing BFP is not particularly limited, but calcium ions or divalent that can be substituted for calcium ions used for producing BFP is not limited. Alternatively , the concentration of trivalent ions is not particularly limited as long as it does not affect the BFP regeneration. Since 1 mol of ion apoaequorin is shown to bind 3 mol of calcium ions, 3 mol or more is preferable.
BFPの製造において、セレンテラミド又はその類縁体とアポ蛋白質との反応は、還元剤
の存在下で行うのが好ましい。ここで用いる還元剤としては、例えば、ジチオトレイトー
ル(DTT)、又はメルカプトエタノール等を挙げることができる。
BFP再生に影響しなければ、BFPの製造のために用いる還元剤の量は、特に制限されない
が、アポイクオリンには、３カ所のシステイン残基が存在することより、S-S 結合形成を
防ぐ濃度であるのが好ましい。例えば、最終濃度が、1 mMジチオトレイトール や0.1％メ
ルカプエタノールである。
In the production of BFP, the reaction between coelenteramide or its analog and an apoprotein is preferably carried out in the presence of a reducing agent. Examples of the reducing agent used here include dithiothreitol (DTT) and mercaptoethanol.
The amount of reducing agent used for the production of BFP is not particularly limited as long as it does not affect BFP regeneration, but apoaequorin has a concentration that prevents SS bond formation due to the presence of three cysteine residues. Preferably there is. For example, the final concentration is 1 mM dithiothreitol or 0.1% mercapethanol.
BFPの製造における反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、0℃〜42℃
で、0.1時間〜2時間、4℃〜37℃で、0.1時間〜2時間、又は4℃〜15℃で、0.1時間〜24時
間である。
Although the reaction temperature and reaction time in the production of BFP are not particularly limited, for example, 0 ° C. to 42 ° C.
And 0.1 to 2 hours, 4 to 37 ° C., 0.1 to 2 hours, or 4 to 15 ° C. and 0.1 to 24 hours.
このようにして得たBFPは、さらに精製に供しても良い。BFPの精製は、通常の分離・精
製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム
沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で
、又は適宜組み合わせて用いることができる。
The BFP thus obtained may be further subjected to purification. Purification of BFP can be performed according to a normal separation / purification method. Separation / purification methods include, for example, ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, dialysis, ultrafiltration, etc., alone or in appropriate combination. be able to.
２．２．２．青色蛍光蛋白質(BFP)の利用
（１）発光触媒としての利用
本発明のBFPは、発光基質に作用しそれを発光させるので、発光触媒として利用できる
。そこで、本発明は、BFPに、セレンテラジン又はその類縁体を接触させることを含む、
発光方法を提供する。ここで、「接触」とは、BFPとセレンテラジン又はその類縁体とを
同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、セレンテラジン又はその類縁体を収容
した容器にBFPを添加すること、BFPを収容した容器にセレンテラジン又はその類縁体を添
加すること、又はBFPとセレンテラジン又はその類縁体とを混合すること、などが含まれ
る。
2.2.2. Utilization of blue fluorescent protein (BFP) (1) Utilization as luminescent catalyst The BFP of the present invention acts on a luminescent substrate to cause it to emit light, and thus can be utilized as a luminescent catalyst. Therefore, the present invention includes contacting coelenterazine or an analog thereof with BFP,
A light emitting method is provided. Here, “contact” means that BFP and coelenterazine or an analogue thereof are present in the same reaction system, for example, adding BFP to a container containing coelenterazine or an analogue thereof, For example, adding coelenterazine or an analog thereof to the container accommodated, or mixing BFP and coelenterazine or an analog thereof.
本発明の発光方法に用いる発光基質は、例えばセレンテラジン又はその類縁体である。
「セレンテラジンの類縁体」とは、セレンテラジンと同様に、アポ蛋白質として、イクオ
リン等のカルシウム結合型発光蛋白質を構成しうる化合物を指す。発光基質として用いる
セレンテラジン又はその類縁体は、例えば、セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、ｆ−
セレンテラジン、ｃｌ−セレンテラジン、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、
ｃｈ−セレンテラジン、ｈｃｈ−セレンテラジン、ｆｃｈ−セレンテラジン、ｅ−セレン
テラジン、ｅｆ−セレンテラジン、ｅｃｈ−セレンテラジン、又はｈｃｐ−セレンテラジ
ン等であり、好ましくは、セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、又はｅ−セレンテラジ
ンである。これらのセレンテラジン又はその類縁体は、例えば、Shimomura et al. (1988
) Biochem.J. 251, 405-410、Shimomura et al. (1989) Biochem.J. 261, 913-920、又は
Shimomura et al. (1990) Biochem.J. 270,309-312に記載の方法又はそれに準ずる方法で
製造することができる。或いは、チッソ株式会社、和光純薬社、又はプロメガ社等から各
種市販されているので、これらの市販のものを、本発明の発光方法に用いても良い。
The luminescent substrate used in the luminescent method of the present invention is, for example, coelenterazine or an analog thereof.
The term “coelenterazine analog” refers to a compound that can constitute a calcium-binding photoprotein such as aequorin as an apoprotein, like coelenterazine. Coelenterazine or its analog used as a luminescent substrate is, for example, coelenterazine, h-coelenterazine, f-
Coelenterazine, cl-coelenterazine, n-coelenterazine, cp-coelenterazine,
ch-coelenterazine, hch-coelenterazine, fch-coelenterazine, e-coelenterazine, ef-coelenterazine, ech-coelenterazine, or hcp-coelenterazine, and preferably coelenterazine, h-coelenterazine, or e-coelenterazine. These coelenterazines or analogs thereof are described in, for example, Shimomura et al. (1988
) Biochem. J. 251 , 405-410, Shimomura et al. (1989) Biochem. J. 261 , 913-920, or
It can be produced by the method described in Shimomura et al. (1990) Biochem. J. 270 , 309-312 or a method analogous thereto. Alternatively, since various types are commercially available from Chisso Corporation, Wako Pure Chemical Industries, or Promega Corporation, these commercially available products may be used in the light emitting method of the present invention.
これらのセレンテラジン及びその類縁体をBFPに接触させ、接触させたBFPの触媒作用に
よって、セレンテラジン又はその類縁体が対応するセレンテラミド又はその類縁体に酸化
される際（この時、二酸化炭素が放出される）、発光が生じる。通常発光時間は、０．５
〜３時間であるが、条件の選択により、発光時間を更に長時間とすることも、又は発光時
間を更に短時間とすることも可能である。
When these coelenterazines and their analogs are brought into contact with BFP, and when the coelenterazine or its analogs are oxidized to the corresponding coelenteramide or its analogs by the catalytic action of the contacted BFP (at this time, carbon dioxide is released) ), Light emission occurs. Normal light emission time is 0.5
Although it is ˜3 hours, the light emission time can be made longer or the light emission time can be made shorter depending on the selection of conditions.
（２）レポーター蛋白質としての利用
BFPは、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することも
できる。アポ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを、目的のプロモーター又は他の発現
制御配列（例えば、エンハンサーなど）に融合したベクターを構築する。前記ベクターを
宿主細胞に導入し、さらに、これに、本発明の方法で製造したセレンテラミド又はその類
縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオン
を接触させ、本発明の蛍光蛋白質に由来する蛍光を検出することにより、目的のプロモー
ター又は他の発現制御配列の活性を測定することができる。ここで、「接触」とは、宿主
細胞とセレンテラミド又はその類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可
能な２価若しくは３価のイオンとを同一の培養系・反応系に存在させることを意味し、例
えば、宿主細胞の培養容器にセレンテラミド又はその類縁体及びカルシウムイオン又はカ
ルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを添加すること、宿主細胞とセレ
ンテラミド又はその類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若
しくは３価のイオンとを混合すること、宿主細胞をセレンテラミド又はその類縁体及びカ
ルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの存在下で
培養することなどが含まれる。
(2) Use as a reporter protein
BFP can also be used as a reporter protein for measuring transcriptional activity of promoters and the like. A vector is constructed in which a polynucleotide encoding an apoprotein is fused to a target promoter or other expression control sequence (for example, an enhancer). The vector is introduced into a host cell, and is further contacted with coelenteramide produced by the method of the present invention or an analog thereof and calcium ion or divalent or trivalent ion that can be substituted with calcium ion, and By detecting fluorescence derived from the fluorescent protein, the activity of the target promoter or other expression control sequence can be measured. Here, “contact” means that a host cell, coelenteramide or an analog thereof, and calcium ions or divalent or trivalent ions capable of substituting calcium ions are present in the same culture system / reaction system. For example, adding coelenteramide or its analog and calcium ion or divalent ion that can replace calcium ion to a host cell culture vessel, host cell and coelenteramide or analog thereof and calcium ion or calcium ion And divalent or trivalent ions that can be substituted, and culturing host cells in the presence of coelenteramide or its analogs and calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions, etc. Is included.
（３）検出マーカとしての利用
BFPは、蛍光による検出マーカとして利用することができる。本発明の検出マーカは、
例えば、イムノアッセイ又はハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検
出に利用することができる。BFPを化学修飾法など通常用いられる方法により目的物質（
蛋白質或いは核酸など）と結合させて使用することができる。このような検出マーカを用
いた検出方法は、通常の方法によって行うことができる。
(3) Use as a detection marker
BFP can be used as a fluorescent detection marker. The detection marker of the present invention is
For example, it can be used for detection of a target substance in an immunoassay or a hybridization assay. The target substance (
It can be used in combination with protein or nucleic acid. A detection method using such a detection marker can be performed by a normal method.
また、本発明の検出マーカは、例えば、アポ蛋白質と目的物質との融合蛋白質として発
現させ、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、さらに、これに
本発明の方法により製造したセレンテラミド又はその類縁体及びカルシウムイオン又はカ
ルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを接触させること等によって、前
記目的物質の分布を測定するために利用することもできる。ここで、「接触」とは、細胞
とセレンテラミド又はその類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な
２価若しくは３価のイオンとを同一の培養系・反応系に存在させることを意味し、例えば
、細胞の培養容器にセレンテラミド又はその類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウム
イオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを添加すること、細胞とセレンテラミド又
はその類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価の
イオンとを混合すること、宿主細胞をセレンテラミド又はその類縁体及びカルシウムイオ
ン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの存在下で培養すること
などが含まれる。
The detection marker of the present invention is expressed, for example, as a fusion protein of an apoprotein and a target substance, introduced into a cell by a technique such as a microinjection method, and further coelenteramide produced by the method of the present invention or It can also be used to measure the distribution of the target substance by contacting the analog and calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions. Here, “contact” means that cells, coelenteramide or an analog thereof, and calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions are present in the same culture system / reaction system, For example, coelenteramide or its analogs and calcium ions or divalent ions that can replace calcium ions can be added to cell culture vessels, and cells and coelenteramide or analogs thereof can be replaced with calcium ions or calcium ions Mixing with divalent or trivalent ions, and culturing host cells in the presence of coelenteramide or its analogs and calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions. .
このような目的物質などの分布の測定は、蛍光イメージング等の検出法などを利用して
行うこともできる。なお、アポ蛋白質は、マイクロインジェクション法などの手法により
細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることもできる。
Such measurement of the distribution of the target substance can also be performed using a detection method such as fluorescence imaging. In addition, the apoprotein can be expressed in the cell and used in addition to being introduced into the cell by a technique such as a microinjection method.
（４）アミューズメント用品の材料
BFPは、光の励起をうけて蛍光を生じる。よって、BFPは、アミューズメント用品の材料
の蛍光基材として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえ
ば、蛍光シャボン玉、蛍光アイス、蛍光飴、蛍光絵の具等があげられる。本発明のアミュ
ーズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。
(4) Amusement equipment materials
BFP generates fluorescence under the excitation of light. Therefore, BFP can be suitably used as a fluorescent base material for amusement material. Examples of amusement goods include fluorescent soap bubbles, fluorescent ice, fluorescent glaze, fluorescent paints, and the like. The amusement product of the present invention can be manufactured by a usual method.
３．カルシウム結合型発光蛋白質
図６に示すように、イクオリン等のカルシウム結合型発光蛋白質は、EDTA等のカルシウ
ムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するための
キレート剤の存在下、gFPに、セレンテラジン又はその類縁体を反応させることで、製造
することが出来る。
3. Calcium-binding photoprotein As shown in FIG. 6, calcium-binding photoproteins such as aequorin are present in the presence of a chelating agent for removing calcium ions such as EDTA or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions. Below, it can manufacture by making coelenterazine or its analog react with gFP.
３．１．カルシウム結合型発光蛋白質の製造
本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、本発明のgFPから製造することができる。す
なわち、本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、gFPに、発光基質であるセレンテラジ
ン又はその類縁体を反応させることによって、得ることができる。
3.1. Production of calcium-binding photoprotein The calcium-binding photoprotein of the present invention can be produced from the gFP of the present invention. That is, the calcium-binding photoprotein of the present invention can be obtained by reacting gFP with coelenterazine, which is a luminescent substrate, or an analog thereof.
gFPとセレンテラジン又はその類縁体の反応は、gFPとセレンテラジン又はその類縁体を
接触させることにより行う。「接触」とは、本発明のgFPとセレンテラジン又はその類縁
体とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、セレンテラジン又はその類縁体
を収容した容器に本発明のgFPを添加すること、本発明のgFPを収容した容器に本発明のセ
レンテラジン又はその類縁体を添加すること、又は本発明のgFPとセレンテラジン又はそ
の類縁体とを混合すること、などが含まれる。
The reaction between gFP and coelenterazine or an analog thereof is performed by bringing gFP into contact with coelenterazine or an analog thereof. “Contact” means that the gFP of the present invention and coelenterazine or an analog thereof are present in the same reaction system. For example, the gFP of the present invention is added to a container containing coelenterazine or an analog thereof. , Adding coelenterazine of the present invention or an analog thereof to a container containing the gFP of the present invention, or mixing the gFP of the present invention with coelenterazine or an analog thereof, and the like.
本発明のカルシウム結合型発光蛋白質の製造に用いるセレンテラジン又はその類縁体は
、例えば、セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｃｌ−セレンテ
ラジン、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、ｃｈ−セレンテラジン、ｈｃｈ−
セレンテラジン、ｆｃｈ−セレンテラジン、ｅ−セレンテラジン、ｅｆ−セレンテラジン
、ｅｃｈ−セレンテラジン、又はｈｃｐ−セレンテラジン等であり、好ましくは、セレン
テラジン、ｈ−セレンテラジン、又はｅ−セレンテラジンである。これらのセレンテラジ
ン又はその類縁体の入手方法は、前記の通りである。
Coelenterazine or its analogs used for producing the calcium-binding photoprotein of the present invention include, for example, coelenterazine, h-coelenterazine, f-coelenterazine, cl-coelenterazine, n-coelenterazine, cp-coelenterazine, ch-coelenterazine, hch-
Coelenterazine, fch-coelenterazine, e-coelenterazine, ef-coelenterazine, ech-coelenterazine, or hcp-coelenterazine, and preferably coelenterazine, h-coelenterazine, or e-coelenterazine. The method for obtaining these coelenterazines or their analogs is as described above.
カルシウム結合型発光蛋白質の製造のために用いるセレンテラジン又はその類縁体の量
は、特に制限されないが、gFP 1molに対して、例えば、1.2 mol 以上である。
The amount of coelenterazine or its analog used for producing the calcium-binding photoprotein is not particularly limited, but is, for example, 1.2 mol or more with respect to 1 mol of gFP.
カルシウム結合型発光蛋白質の製造における反応温度及び反応時間は、特に限定されな
いが、例えば、0℃〜42℃で、0.1時間〜2時間、4℃〜37℃で、0.1時間〜2時間、又は4℃
〜15℃で、0.1時間〜24時間である。
The reaction temperature and reaction time in the production of the calcium-binding photoprotein are not particularly limited. For example, the reaction temperature is 0 to 42 ° C, 0.1 to 2 hours, 4 to 37 ° C, 0.1 to 2 hours, or 4 ℃
At -15 ° C, 0.1 hour to 24 hours.
本発明の好ましい態様では、蛍光蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体との反応を、
還元剤の存在下において行う。このとき用いる還元剤は、例えば、ジチオトレイトール（
DTT）、又はメルカプトエタノール等である。カルシウム結合型発光蛋白質の製造のため
に用いる還元剤の量は、再生に影響しなければ、特に制限されないが、アポイクオリンに
は、３カ所のシステイン残基が存在することより、S-S 結合形成を防ぐ濃度であるのが好
ましい。例えば、最終濃度が、1 mMジチオトレイトールや0.1％メルカプエタノールであ
る。
In a preferred embodiment of the present invention, the reaction between the fluorescent protein and coelenterazine or an analog thereof is performed.
It is carried out in the presence of a reducing agent. The reducing agent used at this time is, for example, dithiothreitol (
DTT), or mercaptoethanol. The amount of the reducing agent used for the production of the calcium-binding photoprotein is not particularly limited as long as it does not affect the regeneration. However, since apoaequorin has three cysteine residues, it can form SS bonds. The concentration to prevent is preferred. For example, the final concentration is 1 mM dithiothreitol or 0.1% mercapethanol.
３．２．カルシウム結合型発光蛋白質の利用
（１）カルシウムイオンの検出又は定量
本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、カルシウムイオンの作用によって発光する発
光蛋白質（ホロ蛋白質）である。よって、本発明の発光蛋白質は、カルシウムイオンの検
出又は定量に使用することができる。
3.2. Use of calcium-binding photoprotein (1) Detection or quantification of calcium ions The calcium-binding photoprotein of the present invention is a photoprotein (holoprotein) that emits light by the action of calcium ions. Therefore, the photoprotein of the present invention can be used for detection or quantification of calcium ions.
カルシウムイオンの検出又は定量を行う場合には、アポ蛋白質とセレンテラジン類縁体
のペルオキシドとからなる発光蛋白質を使用する。発光蛋白質は、前述した方法に従って
製造することができる。カルシウムイオンの検出又は定量は、検体溶液を直接発光蛋白質
溶液に添加し、発生する発光を測定することにより行うことができる。或いは、検体溶液
に発光蛋白質溶液を添加し、発生する発光を測定することにより、カルシウムイオンを検
出又は定量することもできる。カルシウムイオンの検出は、例えば、検体溶液を直接発光
蛋白質溶液に添加し、発生する発光を測定することにより行うことができる。或いは、検
体溶液に発光蛋白質溶液を添加し、発生する発光を測定することによりカルシウムイオン
を検出することもできる。
When detecting or quantifying calcium ions, a photoprotein consisting of an apoprotein and a peroxide of coelenterazine analog is used. The photoprotein can be produced according to the method described above. Detection or quantification of calcium ions can be performed by directly adding the sample solution to the photoprotein solution and measuring the generated luminescence. Alternatively, calcium ions can be detected or quantified by adding a photoprotein solution to the sample solution and measuring the generated luminescence. The detection of calcium ions can be performed, for example, by adding the sample solution directly to the photoprotein solution and measuring the generated luminescence. Alternatively, calcium ions can be detected by adding a photoprotein solution to the sample solution and measuring the generated luminescence.
カルシウムイオンの検出又は定量は、カルシウムイオンによる本発明の発光蛋白質の発
光を、発光測定装置を用いて測定することにより行うことができる。発光測定装置として
は、市販されている装置、例えば、Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ ９６０（ベルトールド社製）など
を使用することができる。カルシウムイオン濃度の定量は、発光蛋白質を用いて、既知の
カルシウムイオン濃度に対する発光標準曲線を作成することにより、測定可能である。
The detection or quantification of calcium ions can be performed by measuring the luminescence of the photoprotein of the present invention by calcium ions using a luminescence measuring device. As the luminescence measuring device, a commercially available device, for example, Centro LB 960 (manufactured by Bertrand) can be used. Quantification of the calcium ion concentration can be measured by creating a luminescence standard curve for a known calcium ion concentration using a photoprotein.
（２）生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法
本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法
による分子間相互作用の原理を利用した生理機能の解析や酵素活性の測定等の分析方法に
利用することができる。
(2) Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) Method The calcium-binding photoprotein of the present invention is analyzed for physiological function and measurement of enzyme activity using the principle of intermolecular interaction by bioluminescence resonance energy transfer (BRET) method. It can be used for analysis methods such as.
例えば、本発明の発光蛋白質をドナー蛋白質として使用し、有機化合物又は蛍光蛋白質
をアクセプター蛋白質として使用して、両者の間で生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥ
Ｔ）を起こすことにより蛋白質間の相互作用を検出することができる。本発明のある態様
では、アクセプター蛋白質として使用する有機化合物は、Hoechist3342、Indo-1又はDAP1
などである。本発明の別の態様では、アクセプター蛋白質として使用する蛍光蛋白質は、
緑色蛍光蛋白質（GFP）、青色蛍光蛋白質（BFP）、変異GFP蛍光蛋白質又はフィコビリン
などである。本発明の好ましい態様において、解析する生理機能は、オーファン受容体（
特にG蛋白質共役受容体）、アポトーシス、又は遺伝子発現による転写調節などである。
また、本発明の好ましい態様において、分析する酵素は、プロテアーゼ、エステラーゼ又
はリン酸化酵素などである。
For example, when the photoprotein of the present invention is used as a donor protein and an organic compound or a fluorescent protein is used as an acceptor protein, bioluminescence resonance energy transfer (BRE) between the two is used.
By causing T), the interaction between proteins can be detected. In one embodiment of the present invention, the organic compound used as the acceptor protein is Hoechist3342, Indo-1, or DAP1.
Etc. In another aspect of the present invention, the fluorescent protein used as the acceptor protein is:
Examples include green fluorescent protein (GFP), blue fluorescent protein (BFP), mutant GFP fluorescent protein, or phycobilin. In a preferred embodiment of the present invention, the physiological function to be analyzed is an orphan receptor (
In particular, G protein-coupled receptors), apoptosis, or transcriptional regulation by gene expression.
In a preferred embodiment of the present invention, the enzyme to be analyzed is a protease, esterase or phosphorylase.
ＢＲＥＴ法による生理機能の解析は、公知の方法で行うことができ、例えば、Biochem.
J. 2005, 385, 625-637、又はExpert Opin. Ther Tarets, 2007 11: 541-556などに記載
の方法に準じて行うことができる。また、酵素活性の測定も、公知の方法で行うことがで
き、例えば、Nat Methods 2006, 3:165-174、又はBiotechnol J. 2008, 3:311-324などに
記載の方法に準じて行うことができる。
Analysis of physiological functions by the BRET method can be performed by a known method, for example, Biochem.
J. 2005, 385, 625-637, or Expert Opin. Ther Tarets, 2007 11: 541-556. The enzyme activity can also be measured by a known method, for example, according to the method described in Nat Methods 2006, 3: 165-174 or Biotechnol J. 2008, 3: 311-324. Can do.
なお、本明細書に記載した全ての文献及び刊行物は、その目的にかかわらず参照により
その全体を本明細書に組み込むものとする。
It should be noted that all documents and publications described in this specification are incorporated herein by reference in their entirety regardless of their purposes.
また、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業
者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を実施できる
。発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態
様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに
限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明
細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
The objects, features, advantages, and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and those skilled in the art can easily implement the present invention from the description of the present specification. it can. The best mode for carrying out the invention and specific examples show preferred embodiments of the present invention and are shown for illustration or description, and the present invention is not limited thereto. Not what you want. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications can be made based on the description of the present specification within the spirit and scope of the present invention disclosed herein.
[実施例１]
セレンテラミドの合成
[Example 1]
Synthesis of coelenteramide
合成に使用した4-メトキシフェニルアセチルクロライド(Aldrich社)、BBr3の1.0M CH2C
l2溶液(Aldrich社)、及びその他のすべての化学試薬は市販のものであり、そのまま使用
した。
分析用薄層クロマトグラフィー（TLC）には、あらかじめシリカゲルが塗布された（0.2
5mm）シリカゲルプレート(MERCK社、シリカゲル60 F254、カタログ番号1.05715.0009)を
用いた。
分取カラムクロマトグラフィーには、シリカゲル（関東化学社、シリカゲル60N、球状
、中性、カタログ番号37563-84）を使用した。
融点(Mp.)は、YANACO MP-J3を使用して測定した（未補正）。1H（300 MHz）核磁気共鳴
スペクトル（NMRスペクトル）、および13C（75.5 MHz）NMRスペクトルは、Varian社製Gem
ini-300を用いてDMSO-d6(CIL社)中で測定した。1H NMRの化学シフトの基準には、測定溶
媒であるDMSO-d 6中の残存非重水素化ジメチルスルホキシドのピークをδ2.49とした。13
C NMRの化学シフトの基準には、測定溶媒であるDMSO-d6のピークをδ 39.7とし、それぞ
れ単位ppmで示した。また、結合定数（J）は単位Hzで示した。略号s、m及びbrはそれぞれ
、singlet、multiplet及びbroadを表す。赤外分光（IR）スペクトルは、DRS-8000Aを備え
た分光計SHIMADZU IRPrestige-21を用い、拡散反射法により測定し、吸収帯は単位cm-1で
示した。高分解能質量分析(HRMS)は、電子衝撃イオン化(EI)法の条件下で、質量分析計JE
OL JMS-700を用いて行った。
4-Methoxyphenylacetyl chloride (Aldrich) used for synthesis, BBr 3 1.0M CH 2 C
l The 2 solution (Aldrich) and all other chemical reagents were commercially available and were used as they were.
Silica gel was pre-applied to analytical thin layer chromatography (TLC) (0.2%).
5 mm) silica gel plates (MERCK, silica gel 60 F 254 , catalog number 1.05715.0009) were used.
For preparative column chromatography, silica gel (Kanto Chemical Co., Inc., silica gel 60N, spherical, neutral, catalog number 37563-84) was used.
Melting point (Mp.) Was measured using YANACO MP-J3 (uncorrected). 1 H (300 MHz) nuclear magnetic resonance spectrum (NMR spectrum) and 13 C (75.5 MHz) NMR spectrum are from Varian Gem
Measurement was performed in DMSO-d6 (CIL) using ini-300. As a reference for the chemical shift of 1 H NMR, the peak of the remaining non-deuterated dimethyl sulfoxide in DMSO-d 6 as the measurement solvent was designated as Δ2.49. 13
As the standard of chemical shift of C NMR, the peak of DMSO-d 6 which is a measurement solvent was designated as δ 39.7, and each was expressed in ppm. Further, the coupling constant (J) is shown in unit Hz. The abbreviations s, m and br represent singlet, multiplet and broad, respectively. Infrared spectroscopy (IR) spectrum was measured by a diffuse reflection method using a spectrometer SHIMADZU IRPrestige-21 equipped with DRS-8000A, and the absorption band was shown in the unit cm −1 . High resolution mass spectrometry (HRMS) is based on the mass spectrometer JE under the conditions of electron impact ionization (EI).
We used OL JMS-700.
セレンテラミドの合成スキーム
セレンテラミドジメチルエーテル（IV）
アルゴン雰囲気下、ピリジン中の2-アミノ-3-ベンジル-5-（4-メトキシフェニル）ピラ
ジン（II）（セレンテラミンメチルエーテルともいう）（Kishi et al., Tetrahedron Le
tt., 13, 2747-2748（1972）；Adamczyk et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477-48
5（2001））（502 mg、1.72 mmol）の溶液（5 mL）に対し、4-（ジメチルアミノ）ピリジ
ン（DMAP)（21.1 mg、172 μmol）及び4-メトキシフェニルアセチルクロリド（III)（527
μL、3.45 mmol）を続けて室温で加え、混合物を同じ温度で22.5時間攪拌した。これに
対し炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（100 mL）を加え、ジクロロメタン（50 mL×3）を用
いて混合物の抽出を行った。有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下
で濃縮した。トルエン（20 mL×3）を用い、残留ピリジンを共沸して除去した。残渣をシ
リカゲルカラムクロマトグラフィー（85 g、ジクロロメタン/酢酸エチル＝9/1）により精
製し、淡黄色固体であるとしてセレンテラミドジメチルエーテル（IV）（617 mg、81.5%
）を得た。酢酸エチルからの再結晶によって分析的に純粋なサンプルとして無色の固体を
得た（全部で2回の再結晶により、458 mg、60.5%を得た）。
Coelenteramide dimethyl ether (IV)
2-amino-3-benzyl-5- (4-methoxyphenyl) pyrazine (II) (also called coelenteramine methyl ether) in pyridine under an argon atmosphere (Kishi et al., Tetrahedron Le
tt., 13, 2747-2748 (1972); Adamczyk et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477-48
5 (2001)) (502 mg, 1.72 mmol), 4- (dimethylamino) pyridine (DMAP) (21.1 mg, 172 μmol) and 4-methoxyphenylacetyl chloride (III) (527
μL, 3.45 mmol) was subsequently added at room temperature and the mixture was stirred at the same temperature for 22.5 hours. To this, a saturated aqueous solution of sodium hydrogen carbonate (100 mL) was added, and the mixture was extracted with dichloromethane (50 mL × 3). The organic extract was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure. Residual pyridine was removed azeotropically using toluene (20 mL × 3). The residue was purified by silica gel column chromatography (85 g, dichloromethane / ethyl acetate = 9/1) and coelenteramide dimethyl ether (IV) (617 mg, 81.5% as a pale yellow solid)
) Recrystallization from ethyl acetate gave a colorless solid as an analytically pure sample (total of 2 recrystallizations yielded 458 mg, 60.5%).
Mp. 189.5-191 ℃; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ3.61 (s, 2H), 3.73 (s, 3H), 3.80
(s, 3H), 4.03 (s, 2H), 6.88-6.93 (AA'BB', 2H), 7.02-7.07 (2 ( AA'BB', 4H), 7.12
-7.30 (m, 5H), 8.00-8.05 (AA'BB', 2H), 8.87 (s, 1H), 10.43 (s, 1H); 13C NMR (75.
5 MHz, DMSO-d6) δ 41.6, 55.1, 55.3, 113.9 (2C), 114.5 (2C), 126.2, 127.5, 128.0
(2C), 128.1, 128.2 (2C), 129.0 (2C), 130.2 (2C), 137.1, 138.3, 143.7, 148.2, 15
0.5, 158.2, 160.7, 170.3; IR (KBr, cm-1) 698, 833, 1034, 1177, 1256, 1495, 1514,
1543, 1672, 2833, 2957, 3265; HRMS (EI) m/z 439.1898 (M+, C27H25N3O3 requires 4
39.1896)。
Mp. 189.5-191 ° C; 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ3.61 (s, 2H), 3.73 (s, 3H), 3.80
(s, 3H), 4.03 (s, 2H), 6.88-6.93 (AA'BB ', 2H), 7.02-7.07 (2 (AA'BB', 4H), 7.12
-7.30 (m, 5H), 8.00-8.05 (AA'BB ', 2H), 8.87 (s, 1H), 10.43 (s, 1H); 13 C NMR (75.
5 MHz, DMSO-d 6 ) δ 41.6, 55.1, 55.3, 113.9 (2C), 114.5 (2C), 126.2, 127.5, 128.0
(2C), 128.1, 128.2 (2C), 129.0 (2C), 130.2 (2C), 137.1, 138.3, 143.7, 148.2, 15
0.5, 158.2, 160.7, 170.3; IR (KBr, cm -1 ) 698, 833, 1034, 1177, 1256, 1495, 1514,
1543, 1672, 2833, 2957, 3265; HRMS (EI) m / z 439.1898 (M + , C 27 H 25 N 3 O 3 requires 4
39.1896).
セレンテラミド（I）
アルゴン雰囲気下、無水ジクロロメタン中、セレンテラミドジメチルエーテル（IV)（6
60 mg、1.50 mmol）の溶液（20 mL）を、0 ℃で10分かけて三臭化ホウ素（6.01 mL、6.01
mmol）の1.0 Mジクロロメタン溶液に加え、同じ温度で15分間、混合物を攪拌した。混合
物を室温になるまで暖め、21時間攪拌し続けた。これに対し炭酸水素ナトリウム飽和水溶
液（100 mL）を加え、混合物を減圧下で濃縮してジクロロメタンを除去した。残留懸濁水
溶液をろ過し、回収した固体を真空で乾燥させ、淡黄色固体としてセレンテラミド（I)（
570 mg、92.3））%）を得た。この純度のサンプルは、gFP及びBFPなどの製造において十
分に利用することができる。
エタノールからの再結晶によって分析的に純粋なサンプルとして無色の固体を得た（10
3 mg、16.7%）。
Coelenteramide (I)
Coelenteramide dimethyl ether (IV) (6) in anhydrous dichloromethane under argon atmosphere
60 mg, 1.50 mmol) in solution (20 mL) at 0 ° C. over 10 minutes with boron tribromide (6.01 mL, 6.01
mmol) in 1.0 M dichloromethane and the mixture was stirred at the same temperature for 15 min. The mixture was warmed to room temperature and kept stirring for 21 hours. To this was added saturated aqueous sodium bicarbonate (100 mL) and the mixture was concentrated under reduced pressure to remove dichloromethane. The residual aqueous suspension was filtered and the collected solid was dried in vacuo to give a coelenteramide (I) (
570 mg, 92.3))%) was obtained. Samples of this purity can be fully utilized in the production of gFP and BFP.
Recrystallization from ethanol gave a colorless solid as an analytically pure sample (10
3 mg, 16.7%).
Mp. 242-243 ℃ (dec.); 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 3.54 (s, 2H), 4.01 (s, 2H)
, 6.69-6.75 (AA'BB', 2H), 6.84-6.90 (AA'BB', 2H), 7.00-7.06 (AA'BB', 2H), 7.11-7
.24 (m, 5H), 7.89-7.95 (AA'BB', 2H), 8.80 (s, 1H), 9.28 (br s, 1H), 9.85 (br s,
1H), 10.35 (s, 1H); 13C NMR (75.5 MHz, DMSO-d6) δ41.7, 115.2 (2C), 115.8 (2C),
125.7, 126.2, 126.6, 128.0 (2C), 128.2 (2C), 129.0 (2C), 130.2 (2C), 136.8, 138.
4, 143.4, 148.6, 150.5, 156.2, 159.1, 170.5; IR (KBr, cm-1) 704, 1157, 1229, 126
7, 1364, 1450, 1493, 1516, 1545, 1593, 1611, 1673, 3022, 3285, 3385; HRMS (EI) m
/z 411.1582 (M+, C25H21N3O3 requires 411.1583)。
Mp. 242-243 ° C (dec.); 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 3.54 (s, 2H), 4.01 (s, 2H)
, 6.69-6.75 (AA'BB ', 2H), 6.84-6.90 (AA'BB', 2H), 7.00-7.06 (AA'BB ', 2H), 7.11-7
.24 (m, 5H), 7.89-7.95 (AA'BB ', 2H), 8.80 (s, 1H), 9.28 (br s, 1H), 9.85 (br s,
1H), 10.35 (s, 1H); 13 C NMR (75.5 MHz, DMSO-d 6 ) δ41.7, 115.2 (2C), 115.8 (2C),
125.7, 126.2, 126.6, 128.0 (2C), 128.2 (2C), 129.0 (2C), 130.2 (2C), 136.8, 138.
4, 143.4, 148.6, 150.5, 156.2, 159.1, 170.5; IR (KBr, cm -1 ) 704, 1157, 1229, 126
7, 1364, 1450, 1493, 1516, 1545, 1593, 1611, 1673, 3022, 3285, 3385; HRMS (EI) m
/ z 411.1582 (M + , C 25 H 21 N 3 O 3 requires 411.1583).
[実施例２]
細菌細胞由来の組換えヒスチジン標識アポイクオリンの発現及び精製
組換えヒスチジン標識アポイクオリンは、大腸菌のペリプラズムに発現させた。使用し
た宿主株は、大腸菌WA802株（CGSC 5610）である。大腸菌WA802株に導入した組換えヒス
チジン標識アポイクオリン発現ベクターpiP-His-HEを、piP-HEΔ2Eから構築した（Inouye
& Sahara, Protein Express. Purifi. (2007) 53: 384-389 参照）。
[Example 2]
Expression and purification of recombinant histidine-labeled apoaequorin from bacterial cells Recombinant histidine-labeled apoaequorin was expressed in the periplasm of E. coli. The host strain used is E. coli strain WA802 (CGSC 5610). A recombinant histidine-tagged apoaequorin expression vector piP-His-HE introduced into E. coli strain WA802 was constructed from piP-HEΔ2E (Inouye
& Sahara, Protein Express. Purifi. (2007) 53: 384-389).
すなわち、piP-HEΔ2EをEcoRI及びHindIIIで切断した。そして、piP-HEΔ2EのEcoRI/Hi
ndIII部位に、6つのヒスチジン残基を含むヒスチジンタグリンカーセット（配列番号１３
：5'AAT TCC CAC CAT CAC CAT CAC CAT GGT A 3' 及び配列番号１４：5'AG CTT ACC ATG
GTG ATG GTG ATG GTG GG 3'）を挿入した。これにより、プラスミドpiP-His-HEを作成し
た。このプラスミドは、リポ蛋白質(lpp)プロモーター及びlacオペレーターの制御下に、
外膜蛋白質A (OmpA)のシグナルペプチド配列及び6個のヒスチジン残基を有する。
That is, piP-HEΔ2E was cleaved with EcoRI and HindIII. And EcoRI / Hi of piP-HEΔ2E
A histidine tag linker set containing 6 histidine residues at the ndIII site (SEQ ID NO: 13
: 5'AAT TCC CAC CAT CAC CAT CAC CAT GGT A 3 'and SEQ ID NO: 14: 5'AG CTT ACC ATG
GTG ATG GTG ATG GTG GG 3 ′) was inserted. Thereby, plasmid piP-His-HE was prepared. This plasmid is under the control of the lipoprotein (lpp) promoter and the lac operator.
It has a signal peptide sequence of outer membrane protein A (OmpA) and 6 histidine residues.
アポイクオリンの発現に関しては、piP-His-HEを導入した大腸菌を、アンピシリン(50
μg/ml)を含む10mlのLB培地中で、30℃で16時間増殖させ、これを、3Lの坂口フラスコ中
の50μlの消泡剤（Disform CE475、日本油脂東京）を含有する400mlのLB培地に加えた。
往復式振盪（170rpm/分）を行いながら37℃で18時間培養した後、5,000gで5分間の遠心分
離を行い、1Lの培養液から細胞を回収した。回収した細胞を、90mlの50mM Tris-HCl(pH7.
6)に懸濁した後、Branson社（コネチカット州ダンベリー）のモデル250 Sonifierを使用
して超音波処理を行った。4℃、12,000gで20分間の遠心分離で得られた上清を、50mM Tri
s-HCl(pH7.6)でカラムを平衡化したニッケルキレートカラム（ファルマ社、1.5×4.0cm）
に供した。140mlの50mM Tris-HCl(pH7.6)でカラムを洗浄し、0.1Mイミダゾールを含む50m
M Tris-HCl (pH7.6) 100mlを用いて、吸着アポイクオリン蛋白質を溶出した。
For the expression of apoaequorin, Escherichia coli introduced with piP-His-HE was treated with ampicillin (50
in 16 ml LB medium containing 10 μg / ml) at 30 ° C. for 16 hours, and this was grown in 400 ml LB medium containing 50 μl of antifoam (Disform CE475, Nippon Oil & Fat Tokyo) in a 3 L Sakaguchi flask. Added to.
The cells were cultured at 37 ° C. for 18 hours while performing reciprocal shaking (170 rpm / min), and then centrifuged at 5,000 g for 5 minutes to recover cells from 1 L of the culture solution. The collected cells were washed with 90 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.
After suspending in 6), sonication was performed using a Model 250 Sonifier from Branson (Danbury, Conn.). The supernatant obtained by centrifugation at 12,000 g for 20 minutes at 4 ° C was added to 50 mM Trim
Nickel chelate column equilibrated with s-HCl (pH 7.6) (Pharmacia, 1.5 x 4.0 cm)
It was used for. The column was washed with 140 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) and 50 m containing 0.1 M imidazole.
The adsorbed apoaequorin protein was eluted using 100 ml of M Tris-HCl (pH 7.6).
精製収率のまとめを表１に示した。1L の培養菌体からアポイクオリンを150 mg 得た。 A summary of the purification yield is shown in Table 1. 150 mg of apoaequorin was obtained from 1 L of cultured cells.
アポイクオリンの更なる精製は、0.1Mイミダゾールを用いてニッケルキレートカラムか
ら溶出したアポイクオリン(26mg)を、10mM EDTA及び5mM ジチオスレイトールを含む30mM
Tris-HCl(pH7.6) (TED緩衝液) 5mlに溶解し、4℃で18時間放置した。この混合液に100μl
の0.1M酢酸を加えることにより、白色のアポイクオリンを含む沈殿物を生成させる。この
白色沈殿物を、10,000 x gで10分間遠心分離を行うことによって回収した。得られた沈殿
物を5mlのTED緩衝液に加え、されに8μlの25％アンモニウア溶液を加え溶解した後、不溶
性の沈殿物を遠心分離によって除去し、その上清を精製アポイクオリンとした。
Further purification of apoaequorin was achieved by using apoaequorin (26 mg) eluted from a nickel chelate column with 0.1 M imidazole, 30 mM containing 10 mM EDTA and 5 mM dithiothreitol.
It was dissolved in 5 ml of Tris-HCl (pH 7.6) (TED buffer) and left at 4 ° C. for 18 hours. 100 μl in this mixture
Of 0.1 M acetic acid produces a precipitate containing white apoaequorin. The white precipitate was collected by centrifuging at 10,000 xg for 10 minutes. The obtained precipitate was added to 5 ml of TED buffer, and 8 μl of 25% ammonia solution was dissolved therein. Then, the insoluble precipitate was removed by centrifugation, and the supernatant was used as purified apoaequorin.
[実施例３]
蛋白質分析
市販のキット（Bio-Rad社、カリフォルニア州リッチモンド）及び基準としてのウシ血
清アルブミン（Pierce社、イリノイ州ロックフォード）を用い、Bradfordの色素結合法（
Anal. Biochem. (1976)72, 248-254）によって、蛋白質の濃度を決定した。
また、Laemmli（Nature (1970) 227, 680-685）の記載の通りに、12％分離ゲル（テフ
コ株式会社、東京）を用い、還元性条件下でSDS-PAGE分析を行った。その結果、図１に示
すように、本精製法によって得られた精製アポイクオリンの純度は95％以上であることが
明らかとなった。
[Example 3]
Using a commercially available kit for protein analysis (Bio-Rad, Richmond, Calif.) And bovine serum albumin (Pierce, Rockford, Ill.) As a standard, Bradford's dye binding method (
Anal. Biochem. (1976) 72, 248-254), the protein concentration was determined.
Further, as described in Laemmli (Nature (1970) 227, 680-685), SDS-PAGE analysis was performed under reducing conditions using a 12% separation gel (Tefco Corporation, Tokyo). As a result, as shown in FIG. 1, it was revealed that the purity of the purified apoaequorin obtained by this purification method was 95% or more.
[実施例４]
セレンテラミド及びアポイクオリンからの合成BFPの調製
10mM CaCl2及び1mM DTTを含む1mlの50mM Tris-HCl(pH 7.6)中、アポイクオリン（0.5mg
、22nmol）及び10μlのセレンテラミド（無水メタノール中1.2μg/μl、29nmol）を混合
し、この混合物を4℃で16時間静置することにより、合成BFP(syn-BFP)を調製した。続い
て、遠心濃縮器Vivaspin 2(10,000 MWCO、Sartorius AG、ドイツ)を用いて4℃、5,000 x
gで20分間処理し、混合物を0.1 mlまで濃縮した。濃縮された溶液は、長波UVランプ（366
nm）の下で強い青色発光を示した。
[Example 4]
Preparation of synthetic BFP from coelenteramide and apoaequorin
Apoaequorin (0.5 mg) in 1 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 10 mM CaCl 2 and 1 mM DTT
, 22 nmol) and 10 μl coelenteramide (1.2 μg / μl in anhydrous methanol, 29 nmol), and this mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours to prepare a synthetic BFP (syn-BFP). Subsequently, using a centrifugal concentrator Vivaspin 2 (10,000 MWCO, Sartorius AG, Germany) at 4 ° C, 5,000 x
Treated with g for 20 minutes and concentrated the mixture to 0.1 ml. The concentrated solution is a long wave UV lamp (366
nm).
セレンテラミド及びアポイクオリンからの合成gFPの調製
アポイクオリン及びセレンテラミドからの合成gFP (syn-gFP)の調製に関しては、10mM
EDTA及び 1mM DTTを含む1mlの50mM Tris-HCl(pH 7.6)中、アポイクオリン（0.5mg、22nmo
l）及び10μlのセレンテラミド（無水メタノール中1.2μg/μl、29nmol）を混合し、この
混合物を4℃で16時間静置することにより、合成gFP(syn-gFP)を調製した。335nmで励起す
ることにより、図２に示す蛍光発光スペクトルを得た。アポイクオリンとセレンテラミド
により、蛍光能を有するsyn-gFP の生成が確認された。
一方、syn-gFP及びsyn-BFP 調製溶液に、還元剤であるDTTが添加することにより、表２
にまとめたように、syn-gFP及びsyn-BFPを短時間に、効率良く調製することができること
が明らかとなった。
Preparation of synthetic gFP from coelenteramide and apoaequorin For the preparation of synthetic gFP (syn-gFP) from apoaequorin and coelenteramide, 10 mM
Apoaequorin (0.5 mg, 22 nmo) in 1 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing EDTA and 1 mM DTT
l) and 10 μl coelenteramide (1.2 μg / μl in anhydrous methanol, 29 nmol) were mixed, and this mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours to prepare a synthetic gFP (syn-gFP). The fluorescence emission spectrum shown in FIG. 2 was obtained by exciting at 335 nm. Apoaequorin and coelenteramide confirmed the production of syn-gFP with fluorescence.
On the other hand, by adding DTT as a reducing agent to syn-gFP and syn-BFP preparation solutions, Table 2
As summarized in the above, it was revealed that syn-gFP and syn-BFP can be efficiently prepared in a short time.
[実施例５]
吸収スペクトル及び蛍光スペクトルの測定
Jasco（日本分光株式会社、東京）のV-560分光光度計（帯域幅：0.5nm、レスポンス：
中程度、スキャン速度：100 nm/分）により、石英セル（光路長10mm）を用いて25℃で吸
収スペクトルを測定した。また、JascoのFP-6500蛍光分光光度計（発光／励起帯域幅: 3
nm、レスポンス：0.5 sec、スキャン速度：1000nm/分）を用いて蛍光スペクトルを測定し
た。
得られたsyn-gFPの蛍光スペクトルは、図３に示すように、イクオリンより調製したgFP
のスペクトルと一致した。また、表３に示すように、調製したsyn-BFPの吸収スペクトル
における280 nmと330 nm の比率は、イクオリンより調製したBFPとほぼ同じかそれ以上の
比を示すことから、同等物が作ることが可能となった。
[Example 5]
Measurement of absorption and fluorescence spectra
Jasco (JASCO Corporation, Tokyo) V-560 spectrophotometer (bandwidth: 0.5nm, response:
The absorption spectrum was measured at 25 ° C. using a quartz cell (optical path length 10 mm) at a medium scan rate of 100 nm / min. Jasco's FP-6500 fluorescence spectrophotometer (emission / excitation bandwidth: 3
nm, response: 0.5 sec, scan speed: 1000 nm / min).
As shown in FIG. 3, the fluorescence spectrum of the obtained syn-gFP is gFP prepared from aequorin.
Consistent with the spectrum. Moreover, as shown in Table 3, the ratio of 280 nm and 330 nm in the absorption spectrum of the prepared syn-BFP is almost the same as or higher than that of BFP prepared from aequorin. Became possible.
[実施例６]
発光活性のアッセイ
反応混合物(100μl)は、50mM Tris-HCl(pH7.6)-10mM CaCl2中にセレンテラジン（0.5μ
g、1μlのエタノール中に溶解）を含有していた。蛋白質溶液を加えることにより反応を
開始させ（1μgのBFP及びsyn-BFP）、浜松ホトニクス社製のR4220P光電子増倍管を備えた
アトー株式会社（東京）製のAB2200照度計を用いて、発光強度を1分間記録した。1ngの精
製組換えイクオリンの最大強度(Imax)は、8.8×105 rlu（relative light units：相対発
光量）を示した。
合成セレンテラミドを用いて調製したsyn-BFPは、図４に示すように、イクオリンより
調製したBFPと同等の発光活性を有していた。
[Example 6]
Luminescent activity assay reaction mixture (100 μl) was mixed with coelenterazine (0.5 μl) in 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) -10 mM CaCl 2.
g, dissolved in 1 μl of ethanol). The reaction was initiated by adding the protein solution (1 μg of BFP and syn-BFP), and the luminescence intensity was measured using an AB2200 illuminometer manufactured by Atto Corporation (Tokyo) equipped with an R4220P photomultiplier tube manufactured by Hamamatsu Photonics. Was recorded for 1 minute. The maximum intensity (I max ) of 1 ng of purified recombinant aequorin was 8.8 × 10 5 rlu (relative light units).
As shown in FIG. 4, syn-BFP prepared using synthetic coelenteramide had a luminescent activity equivalent to that of BFP prepared from aequorin.
［配列表フリーテキスト］
〔配列番号：１〕天然型アポイクオリンの塩基配列である。
〔配列番号：２〕天然型アポイクオリンのアミノ酸配列である。
〔配列番号：３〕天然型アポクライティン−Ｉの塩基配列である。
〔配列番号：４〕天然型アポクライティン−Ｉのアミノ酸配列である。
〔配列番号：５〕天然型アポクライティン−ＩＩの塩基配列である。
〔配列番号：６〕天然型アポクライティン−ＩＩのアミノ酸配列である。
〔配列番号：７〕天然型アポマイトロコミンの塩基配列である。
〔配列番号：８〕天然型アポマイトロコミンのアミノ酸配列である。
〔配列番号：９〕天然型アポオベリンの塩基配列である。
〔配列番号：１０〕天然型アポオベリンのアミノ酸配列である。
〔配列番号：１１〕天然型アポベルボインの塩基配列である。
〔配列番号：１２〕天然型アポベルボインのアミノ酸配列である。
〔配列番号：１３〕実施例で用いたヒスチジンタグリンカーセットの塩基配列である。
〔配列番号：１４〕実施例で用いたヒスチジンタグリンカーセットの塩基配列である。
[Sequence Listing Free Text]
[SEQ ID NO: 1] This is the base sequence of natural apoaequorin.
[SEQ ID NO: 2] is the amino acid sequence of natural apoaequorin.
[SEQ ID NO: 3] This is the base sequence of natural apocrytin-I.
[SEQ ID NO: 4] is an amino acid sequence of natural apocrytin-I.
[SEQ ID NO: 5] This is the base sequence of natural apocrytin-II.
[SEQ ID NO: 6] is the amino acid sequence of natural apocrytin-II.
[SEQ ID NO: 7] is the base sequence of natural apomytrocomin.
[SEQ ID NO: 8] is an amino acid sequence of natural apomytrocomin.
[SEQ ID NO: 9] This is the base sequence of natural apooverin.
[SEQ ID NO: 10] is the amino acid sequence of natural apooverin.
[SEQ ID NO: 11] This is the base sequence of natural apovelvoin.
[SEQ ID NO: 12] is an amino acid sequence of natural apovelvoin.
[SEQ ID NO: 13] This is the base sequence of the histidine tag linker set used in the examples.
[SEQ ID NO: 14] This is the base sequence of the histidine tag linker set used in the examples.
Claims (3)
下記一般式（４）
（式中、
Ｒ３は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数１〜７のアルキル、脂肪族環式基、又は炭素数７〜１０のアリールアルキルである。）
を、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に反応させることを含む、緑色蛍光蛋白質（ｇＦＰ）またはその類縁体の製造方法。 In the presence of a chelating agent and a reducing agent for removing calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions,
The following general formula (4)
R 3 is alkyl having 1 to 7 carbons, an aliphatic cyclic group, or arylalkyl having 7 to 10 carbons which may be substituted with an aliphatic cyclic group. )
A method for producing a green fluorescent protein (gFP) or an analog thereof , which comprises reacting a fluorescent protein with an apoprotein of a calcium-binding photoprotein.
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