JP5771934B2 - Cell staining method and cell staining kit - Google Patents
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Description
本願は、細胞、特に血液中の細胞を染色する細胞染色方法及び細胞染色用キットに関する。 This application, cells, especially relates to cell staining method and kit for cell staining to stain cells in the blood.
細胞の染色は、細胞を観察する上では欠かせない工程の一つである。目的とする細胞を染色することによって、当該目的とする細胞とそうでない他の細胞との区別が明確にできる。 Cell staining is one of the essential steps for observing cells. By staining the target cells, the target cells can be clearly distinguished from other cells that are not.
例えば、癌患者の血液中における腫瘍細胞の検出では、当該腫瘍細胞の染色が大いに重要である。 For example, in the detection of tumor cells in the blood of cancer patients, staining of the tumor cells is very important.
癌患者の血液中においては腫瘍細胞が存在している。そこで、循環する血液中の腫瘍細胞の有無や個数を検出することにより、癌に罹っているか否かあるいは、癌患者に対する治療の効果を判断することに利用できる。しかしながら、血液中に循環する腫瘍細胞の濃度は非常に低く、１０７〜１０８個の細胞中にわずか数個の低濃度で存在する。例えば、血液１０ｍｌのサンプルに対して含まれる腫瘍細胞は数個程度である。 Tumor cells are present in the blood of cancer patients. Therefore, by detecting the presence and number of tumor cells in the circulating blood, it can be used to determine whether or not the patient has cancer or the effect of treatment on cancer patients. However, the concentration of tumor cells circulating in the blood is very low and is present at only a few low concentrations in 10 7 to 10 8 cells. For example, about several tumor cells are contained in a 10 ml blood sample.
この癌に罹っているか否かの判断では、血液中の目的とする非常に少ない腫瘍細胞を染色し、その染色後の腫瘍細胞の有無を検出することによって判断している。従って、細胞の染色が十分でなければ、腫瘍細胞が血液中に存在するにも関らず、腫瘍細胞が検出できないということが起こり、正確な診断ができない。よって、目的細胞の染色が十分行われることが求められている。また、細胞を染色して観察するまでの何らかの工程において、細胞をロスしてしまうことが懸念されている。腫瘍細胞は非常に少ないため、数個の腫瘍細胞のロスであっても正確な診断に利用できない、ということが起こる。 The determination of whether or not the patient has cancer is made by staining very few target tumor cells in blood and detecting the presence or absence of the tumor cells after the staining. Therefore, if the cells are not sufficiently stained, the tumor cells cannot be detected even though the tumor cells are present in the blood, and an accurate diagnosis cannot be made. Therefore, there is a demand for sufficient staining of target cells. In addition, there is a concern that cells may be lost in some process until cells are stained and observed. The number of tumor cells is so small that even a loss of several tumor cells cannot be used for accurate diagnosis.
細胞を染色する技術として細胞等の検体の捕捉および染色処理を水平に保持したメンブレンフィルタ上で行うことが開示されており、該メンブレンフィルタの下面に吸収性および保水性に優れた毛細管濾過材を設け、細胞等の検体を含んだ溶液（以下、検体溶液ともいう）をメンブレンフィルタ上に注入し、濾過材による毛細管現象で濾過材に保水された検体溶液を吸引ポンプで吸引濾過すること、及び染色に必要な溶液をメンブレンフィルタ上に注入してメンブレンフィルタ上に捕捉された検体を浸した後、その溶液を吸引ポンプで吸引濾過することが開示されて（例えば、特許文献１参照）いる。しかしながら、この方法では、検体溶液を吸収する毛細管濾過材を吸引ポンプで吸引して吸引濾過を行っており、また、細胞をフィルタ上で染色液により染色処理する際にも、その染色液の濾過に吸引ポンプで吸引して吸引濾過を行っており、吸引ポンプによる吸引が強いとフィルタ上の細胞が破壊されてしまい検出すべき細胞のロスが生じる可能性があった。また、細胞をフィルタ上で染色液により染色処理する場合には、毛細管濾過材による染色液の吸収によって、細胞の染色が十分でないまま染色液が吸引されてしまい、細胞の染色が不十分であった。 As a technique for staining cells, it is disclosed that a sample such as a cell is captured and stained on a membrane filter that is held horizontally, and a capillary filter material excellent in absorbability and water retention is provided on the lower surface of the membrane filter. Providing a solution containing a specimen such as a cell (hereinafter also referred to as a specimen solution) onto the membrane filter, and suction-filtering the specimen solution retained in the filter medium by capillary action by the filter medium with a suction pump; and It has been disclosed to inject a solution necessary for staining onto a membrane filter, soak the specimen captured on the membrane filter, and then suction filter the solution with a suction pump (see, for example, Patent Document 1). However, in this method, capillary filtration material that absorbs the sample solution is sucked with a suction pump to perform suction filtration, and also when the cells are stained with a staining solution on the filter, the staining solution is filtered. In addition, suction filtration is performed by suction with a suction pump, and if suction by the suction pump is strong, cells on the filter are destroyed, and there is a possibility of loss of cells to be detected. In addition, when cells are stained with a staining solution on a filter, the staining solution is sucked without sufficient staining due to absorption of the staining solution by the capillary filtration material, and the cells are not sufficiently stained. It was.
また別の態様として、吸収剤材料（吸収剤パッド）を覆うフィルタの表面に細胞懸濁液を添加し、懸濁液の溶液等はフィルタを通過して吸収剤材料に吸収させるとともに、フィルタの表面に細胞を捕捉させフィルタの表面に捕捉された細胞をスライド（スライドグラス）上に圧力転写した後、細胞（試料）が移されたスライドをスライド作製装置から取り出し、その後スライド上で当該細胞を染色することが開示されて（例えば、特許文献２参照）いる。この方法では、細胞の捕捉は吸収剤材料を覆うフィルタ上で行われているが、その後、フィルタ上に捕捉された細胞はスライド上に圧力転写により移され、当該スライド上で細胞の染色が行われている。すなわち、フィルタ上に捕捉された細胞は、スライド上に圧力転写により移された後に染色液により染色される。このように、細胞をフィルタ上からスライド上に移す場合には、細胞を全て移すことの困難性や圧力転写による細胞の破壊によって、細胞のロスが生じてしまっていた。 As another aspect, a cell suspension is added to the surface of the filter covering the absorbent material (absorbent pad), and the solution of the suspension passes through the filter and is absorbed by the absorbent material. After the cells are captured on the surface and the cells captured on the surface of the filter are pressure transferred onto the slide (slide glass), the slide to which the cells (sample) have been transferred is removed from the slide preparation device, and then the cells are removed from the slide on the slide. Dyeing is disclosed (for example, refer to Patent Document 2). In this method, cells are captured on a filter that covers the absorbent material, but then the cells captured on the filter are transferred onto the slide by pressure transfer, and the cells are stained on the slide. It has been broken. That is, the cells captured on the filter are transferred to the slide by pressure transfer and then stained with a staining solution. Thus, when cells are transferred from the filter to the slide, cell loss has occurred due to the difficulty of transferring all the cells and the destruction of the cells by pressure transfer.
このように特許文献１及び２に記載の方法では、細胞の染色が不十分であったり、細胞のロスが生じたりしており、このような結果、細胞の検出感度が低下していた。 As described above, in the methods described in Patent Documents 1 and 2, cell staining is insufficient or cell loss occurs, and as a result, the cell detection sensitivity is lowered.
本願発明は、このような問題に鑑み、細胞のロスを少なくし、十分に細胞の染色が可能である細胞染色方法、およびそれに用いられる細胞染色用キットを提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of such problems, the loss of cells reduced, and to provide sufficient cell staining method staining are possible cells, and kits for cell staining used therein.
本発明の上記目的は、以下の構成により達成することができる。 The above object of the present invention can be achieved by the following configuration.
１．水分吸収体上に接触して配置されたフィルタ上に、細胞懸濁液を添加して細胞を展開した後、前記フィルタを前記水分吸収体から離間し、離間された前記フィルタ上に細胞染色液を添加して細胞の染色を行い、その後前記細胞染色液を添加した前記フィルタを、前記細胞染色液が吸収される染色液吸収体上に接触して配置することを特徴とする細胞染色方法。 1. A cell suspension is added to a filter placed in contact with the moisture absorber to expand the cells, and then the filter is separated from the moisture absorber, and a cell staining solution is placed on the separated filter. A cell staining method comprising: staining the cells by adding the cell, and then placing the filter to which the cell staining solution has been added in contact with a staining solution absorber that absorbs the cell staining solution.
２．前記細胞懸濁液を添加する前に、前記フィルタを前記水分吸収体上に接触して配置する際には、前記水分吸収体の上面と前記フィルタの下面との少なくとも一方が濡れた状態となるように、前記水分吸収体及び前記フィルタの少なくとも一方に水分を付与することを特徴とする前記１に記載の細胞染色方法。 2. Before adding the cell suspension, when placing the filter in contact with the moisture absorber, at least one of the upper surface of the moisture absorber and the lower surface of the filter is wet. Thus, the cell staining method according to 1 above, wherein moisture is applied to at least one of the moisture absorber and the filter.
３．前記フィルタの孔径が０．１μｍ以上５０μｍ以下であることを特徴とする前記１または２に記載の細胞染色方法。 3. 3. The method for staining cells according to 1 or 2, wherein the filter has a pore size of 0.1 μm or more and 50 μm or less.
４．前記フィルタの前記水分吸収体からの離間は、前記細胞懸濁液中の細胞が前記フィルタ上に固定された後に行うことを特徴とする前記１〜３の何れか一項に記載の細胞染色方法。 4). 4. The cell staining method according to any one of 1 to 3, wherein the separation of the filter from the moisture absorber is performed after cells in the cell suspension are fixed on the filter. .
５．前記細胞の染色は、前記フィルタ上に前記細胞染色液を添加した後、３分間以上４０分間以下インキュベートすることにより行うことを特徴とする前記１〜４の何れか一項に記載の細胞染色方法。 5. The cell staining method according to any one of 1 to 4, wherein the cell staining is performed by adding the cell staining solution on the filter and then incubating for 3 minutes to 40 minutes. .
６．前記フィルタ上に前記細胞懸濁液を添加して細胞を展開する際に、強制的な吸引は行わないことを特徴とする前記１〜５の何れか一項に記載の細胞染色方法。 6). 6. The cell staining method according to any one of 1 to 5, wherein forced aspiration is not performed when the cell suspension is added to the filter to expand the cell.
７．前記水分吸収体は、複数の水分吸収体を積層したものであることを特徴とする前記１〜６の何れか一項に記載の細胞染色方法。 7). The cell staining method according to any one of 1 to 6, wherein the moisture absorber is a laminate of a plurality of moisture absorbers.
８．前記細胞懸濁液には、少なくとも血液中の稀少細胞を含んでいることを特徴とする前記１〜７の何れか一項に記載の細胞染色方法。 8). 8. The cell staining method according to any one of 1 to 7, wherein the cell suspension contains at least rare cells in blood.
９．前記染色液吸収体は前記水分吸収体であることを特徴とする前記１〜８の何れか一項に記載の細胞染色方法。 9. The cell staining method according to any one of 1 to 8, wherein the staining liquid absorber is the moisture absorber.
１０．前記１〜９の何れか一項に記載の細胞染色方法に用いられ、互いに接触・離間可能な前記フィルタと前記水分吸収体とを有することを特徴とする細胞染色用キット。 10. A kit for cell staining, which is used in the cell staining method according to any one of 1 to 9 and includes the filter and the water absorber that can contact and separate from each other.
本発明によれば、細胞の展開及び染色時に水分吸収体及びフィルタを適時に離間・接触することにより、細胞のロスが少なく、十分に細胞の染色を行うことが可能となった。また本発明を細胞検出に適用した際には、検出感度の低下を抑制することができた。 According to the present invention, by separating and contacting the water absorber and the filter at an appropriate time during cell development and staining, it is possible to perform sufficient cell staining with little cell loss. Moreover, when the present invention was applied to cell detection, it was possible to suppress a decrease in detection sensitivity.
本発明を実施の形態に基づいて説明するが、本発明は該実施の形態に限定されない。 Although the present invention will be described based on an embodiment, the present invention is not limited to the embodiment.
＜フィルタ＞
本発明に係るフィルタとは、細胞を保持でき、水分を透過させることができるものであれば何れのフィルタに限定されるものではないが、本発明で好ましく用いられるフィルタとしては、例えばポリエステル不織布にセルロースアセテートをコーティングした多孔質フィルタ、セルロース混合エステルタイプメンブレンフィルター、セルロースアセテートタイプメンブレンフィルタ、ＰＴＦＥタイプメンブレンフィルタ、トラックエッチングポリカーボネートタイプフィルタ等を挙げることができる。これらのフィルタの中でも、平面が比較的平滑かつ光透過性の特徴を有するものが特に好ましく、そのようなフィルタとしては、例えば、トラックエッチングポリカーボネートタイプフィルタを挙げることができる。フィルタの孔径は、０．１μｍ以上５０μｍ以下の範囲が好ましい。
<Filter>
The filter according to the present invention is not limited to any filter as long as it can retain cells and permeate moisture, but a filter preferably used in the present invention is, for example, a polyester nonwoven fabric. Examples thereof include a porous filter coated with cellulose acetate, a cellulose mixed ester type membrane filter, a cellulose acetate type membrane filter, a PTFE type membrane filter, and a track etching polycarbonate type filter. Among these filters, those having a relatively smooth plane and light-transmitting characteristics are particularly preferable, and examples of such a filter include a track etching polycarbonate type filter. The pore diameter of the filter is preferably in the range of 0.1 μm to 50 μm.
＜水分吸収体＞
本発明に係る水分吸収体とは、毛細管現象を利用して水分を吸収するものであればどのようなものでも良いが、例えば、綿、脱脂綿、濾紙、ペーパータオル・トイレットペーパー・ティッシュなどの各種吸水紙、ポリアクリル酸ナトリウムなどの高吸水性高分子（Ｓｕｐｅｒａｂｓｏｒｂｅｎｔ Ｐｏｌｙｍｅｒ：ＳＡＰ）を挙げることができる。
<Moisture absorber>
The moisture absorber according to the present invention may be any one that absorbs moisture by utilizing capillary action, but includes various types of water absorption such as cotton, absorbent cotton, filter paper, paper towels, toilet paper, and tissues. Examples thereof include superabsorbent polymer (SAP) such as paper and sodium polyacrylate.
＜細胞染色用キット＞
本発明に係る細胞染色用キットとは、上述したフィルタと水分吸収体と備えたキットである。細胞を展開する際に両者を重ねるなどして接触させ、フィルタ上に添加された細胞懸濁液の溶液を水分吸収体により吸収しながらフィルタ上に細胞を展開させ、細胞を染色する際には、水分吸収体をフィルタから離間してフィルム上の細胞の染色を行うことができるものである。さらに、細胞染色用キットは、細胞の染色後、フィルタに水分吸収体を接触させ、不要となった細胞染色液を水分吸収体で吸収するように用いることができるものであっても良い。
<Cell staining kit>
The cell staining kit according to the present invention is a kit provided with the above-described filter and moisture absorber. When spreading cells, they are placed in contact with each other, and the cells are spread on the filter while the cell suspension solution absorbed on the filter is absorbed by the moisture absorber. In addition, the cells on the film can be stained by separating the moisture absorber from the filter. Furthermore, the cell staining kit may be used so that after the cells are stained, the water absorber is brought into contact with the filter so that the unnecessary cell staining solution is absorbed by the water absorber.
＜水分吸収体一体型フィルタ＞
本発明に係る水分吸収体一体型フィルタとは、上述したフィルタと水分吸収体とを分離可能にあらかじめ積層し接着して一体化したフィルタである。当該フィルタ水分吸収体一体型デバイスは細胞の染色工程の前にフィルタと水分吸収体とを分離して細胞染色液を添加するように用いられるものである。
<Moisture absorber integrated filter>
The moisture absorber-integrated filter according to the present invention is a filter in which the above-described filter and the moisture absorber are laminated and bonded in advance so as to be separable. The filter-water-absorber-integrated device is used so that the filter and the water-absorber are separated and a cell staining solution is added before the cell staining step.
以下、本発明に係る具体的な細胞染色方法及び細胞染色用キットについて図面を用いて説明する。 Hereinafter, a specific cell staining method and a cell staining kit according to the present invention will be described with reference to the drawings.
図１は、本発明に係る細胞染色用キット（細胞染色用の水分吸収体一体型フィルタ）の一例を示す図である。 FIG. 1 is a view showing an example of a cell staining kit (a water-absorbing body integrated filter for cell staining) according to the present invention.
図１において、ガラス基板１上に、細胞染色用キットである水分吸収体２及びフィルタ３が積層して接触配置させたものである。本実施の形態においては、細胞染色用キットである水分吸収体２とフィルタ３とをその使用にあたり、水分吸収体２上にフィルタ３を単に重ねて配置しているが、予め水分吸収体２とフィルタ３とを分離可能に接着しておき、細胞染色用の水分吸収体一体型フィルタとしてそれを用いることもできる。水分吸収体２とフィルタ３との面積の大小関係は特に制限されるものではない。 In FIG. 1, on a glass substrate 1, a moisture absorber 2 and a filter 3 which are kits for cell staining are laminated and placed in contact with each other. In the present embodiment, when the moisture absorber 2 and the filter 3 which are cell staining kits are used, the filter 3 is simply placed on the moisture absorber 2, but the moisture absorber 2 and The filter 3 can be bonded to the filter 3 in a separable manner, and the filter 3 can be used as a moisture absorbent integrated filter for cell staining. The size relationship between the area of the moisture absorber 2 and the filter 3 is not particularly limited.
図１に示すように、水分吸収体２上にフィルタ３を重ねるなどして接触させた状態で、フィルタ３上に細胞懸濁液を添加することにより、毛細管現象によって水分吸収体２で細胞懸濁液中の水分を吸収しつつ、細胞は、フィルタ水分吸収体一体型デバイスＡのフィルタ３上に細胞懸濁液を添加することにより展開する。 As shown in FIG. 1, by adding a cell suspension on the filter 3 with the filter 3 overlaid on the moisture absorber 2, the cell suspension is suspended by the moisture absorber 2 by capillary action. While absorbing the water in the suspension, the cells are developed by adding a cell suspension onto the filter 3 of the filter water absorber-integrated device A.
図２は、細胞懸濁液を水分吸収体２上に接触して配置されたフィルタ３に添加し細胞を展開した状態を模式的に示した図である。ここで、細胞４は、互いに重なることなくフィルタ３上に展開されている。水分吸収体２に接触した状態のフィルタ３上に細胞懸濁液が添加されると、水分吸収体２により細胞懸濁液の液体は吸収され、細胞４はフィルタ３上に重なることなく展開される。 FIG. 2 is a diagram schematically showing a state where the cell suspension is added to the filter 3 arranged in contact with the moisture absorber 2 and the cells are expanded. Here, the cells 4 are spread on the filter 3 without overlapping each other. When the cell suspension is added onto the filter 3 in contact with the moisture absorber 2, the fluid of the cell suspension is absorbed by the moisture absorber 2, and the cells 4 are developed without overlapping on the filter 3. The
図３に、本発明に係る細胞染色工程の概要を示す。 FIG. 3 shows an outline of the cell staining process according to the present invention.
図３の（ａ）に示すように、細胞４を含んだ細胞懸濁液５をフィルタ３上に添加した後、矢印に示すように細胞懸濁液５の液体は毛細管現象により水分吸収体に２吸収される。本発明では、この細胞４の展開工程、即ち細胞懸濁液５の濾過工程において、吸引ポンプ等を用いた強制的な吸引による液体の濾過・排出は行ない。 As shown in FIG. 3 (a), after the cell suspension 5 containing the cells 4 is added onto the filter 3, the liquid of the cell suspension 5 becomes a moisture absorber by capillary action as shown by the arrows. 2 absorbed. In the present invention, in the cell 4 spreading step, that is, the cell suspension 5 filtering step, the liquid is filtered and discharged by forced suction using a suction pump or the like.
一般に、吸引ポンプ等を用いた吸引排出を行う場合には、吸引圧が強いため、フィルタを支えるためにフィルタホルダを用いる。該フィルタホルダには例えば１０個程度の穴が設けられており、このようなフィルタホルダを介して吸引ポンプ等で吸引を行うと、フィルタホルダの穴の部分にのみ吸引圧がかかることになる。これにより、吸引圧に不均一が生じ、フィルタ上での細胞の展開においてフィルタの広い面積を利用できていなかった。すなわち、フィルタホルダの穴に対応するフィルタの位置に、細胞が重なって集積されたり、強い吸引圧によって細胞の破壊が生じたりしていた。このように、吸引ポンプ等を用いた強制的な吸引を伴う細胞懸濁液５の濾過では、細胞がフィルタ上に重なることなく、かつ細胞が破壊されずにフィルタ上に展開することができていなかった。一方、本発明では、上述したように水分吸収体による毛細管現象を利用することによって、細胞懸濁液５の水分を吸収するので、フィルタホルダを用いる必要がなく、緩やかに水分を吸収でき、細胞４がフィルタ上で重なることを防止し、かつ細胞が破壊されることもなく、フィルタ上に広く細胞を展開することができる。ここで、本実施の形態の水分吸収体２は１枚に限らず、２枚以上用いてフィルタ３上の水分を吸収しても良く、この場合、水分吸収体２を１枚用いた場合に比べて水分吸収量が増加し、水分吸収速度が速くなるので好ましい。水分吸収体２を用いる枚数は限定されるものではない。 In general, when performing suction and discharge using a suction pump or the like, the suction pressure is strong, so a filter holder is used to support the filter. The filter holder is provided with, for example, about 10 holes. When suction is performed with a suction pump or the like through such a filter holder, suction pressure is applied only to the hole portion of the filter holder. As a result, the suction pressure becomes non-uniform, and a wide area of the filter cannot be used for the cell development on the filter. That is, the cells are accumulated and accumulated at the position of the filter corresponding to the hole of the filter holder, or the cells are destroyed by a strong suction pressure. Thus, in the filtration of the cell suspension 5 with forced suction using a suction pump or the like, the cells can be developed on the filter without being overlaid on the filter and without being destroyed. There wasn't. On the other hand, in the present invention, since the moisture of the cell suspension 5 is absorbed by utilizing the capillary phenomenon due to the moisture absorber as described above, it is not necessary to use a filter holder, and the moisture can be absorbed slowly, It is possible to spread the cells widely on the filter without preventing the 4 from overlapping on the filter and without destroying the cells. Here, the moisture absorber 2 of the present embodiment is not limited to one, and two or more moisture absorbers may be used to absorb moisture on the filter 3. In this case, when one moisture absorber 2 is used. Compared to this, the amount of moisture absorption is increased, and the moisture absorption rate is increased, which is preferable. The number of sheets using the moisture absorber 2 is not limited.
次に、図３の（ｂ）に示すように、フィルタ３と水分吸収体２とを離間もしくは分離する。フィルタ３と水分吸収体２とを離間することによって、フィルタ３上に液体を添加したとしても、当該液体はフィルタ３上に保持される状態とすることができる。 Next, as shown in FIG. 3B, the filter 3 and the moisture absorber 2 are separated or separated. Even if a liquid is added onto the filter 3 by separating the filter 3 and the moisture absorber 2, the liquid can be held on the filter 3.
細胞が展開されたフィルタ３を水分吸収体２から離間した後、フィルタ３上に細胞染色液６を添加する。図３（ｃ）は、細胞染色液６をフィルタ３上に添加した図を示している。細胞染色液６を用いて、細胞４を十分に蛍光観察できる程度に染色する必要があり、細胞染色液６による湿潤状態でしばらくの間インキュベートし細胞４をフィルタ３上で染色する。インキュベートする時間としては、細胞の種類により異なり一概には規定できないが、細胞４が十分に染色される時間であれば特に限定されない。好ましくは３〜４０分間の間の時間インキュベートすることである。約３〜４０分間インキュベートすることによって、細胞４を十分に染色できる。特に細胞４が血液中の稀少細胞であれば、後述する蛍光観察に支障がなく細胞４を検出できる。インキュベートする環境としては、室温であれば問題なく、細胞を破壊しない環境であれば良い。 After separating the filter 3 in which the cells are spread from the moisture absorber 2, the cell staining solution 6 is added onto the filter 3. FIG. 3C shows a diagram in which the cell staining solution 6 is added on the filter 3. The cell staining solution 6 needs to be stained to such an extent that the fluorescence of the cell 4 can be sufficiently observed. The cell 4 is stained on the filter 3 by incubating for a while in a wet state with the cell staining solution 6. The incubation time differs depending on the cell type and cannot be defined unconditionally, but is not particularly limited as long as the cells 4 are sufficiently stained. It is preferable to incubate for a period of 3 to 40 minutes. By incubating for about 3 to 40 minutes, the cells 4 can be sufficiently stained. In particular, if the cell 4 is a rare cell in blood, the cell 4 can be detected without any trouble in fluorescence observation described later. As an environment for incubating, there is no problem at room temperature, and any environment that does not destroy cells may be used.
細胞の染色方法としては、例えば核内のＤＮＡを染色するＤＡＰＩ染色やヘキスト染色、細胞種に特異的な抗体を用いる免疫染色を用いることができる。免疫染色としては、例えば白血球共通抗原ＣＤ４５、腫瘍マーカーＣＫ（サイトケラチン）を対象とした特異的抗体を用いて染色が行われる。液交換の対象となる液体としては、細胞を固定するＰＦＡなどの液体、検体を希釈するための懸濁液または希釈液、特定の細胞を検出するための各種反応試薬および洗浄試薬としてＰＢＳなどがある。 As a method for staining cells, for example, DAPI staining for staining DNA in the nucleus, Hoechst staining, or immunostaining using an antibody specific to a cell type can be used. As immunostaining, for example, staining is performed using specific antibodies directed against leukocyte common antigen CD45 and tumor marker CK (cytokeratin). Liquids subject to liquid exchange include liquids such as PFA that immobilize cells, suspensions or dilutions for diluting specimens, various reaction reagents for detecting specific cells, and PBS as a washing reagent. is there.
フィルタ３上で、細胞染色液６により細胞４を十分染色した後、細胞染色液６をフィルタ３上から除くために、細胞染色液６を保持しているフィルタ３の下から水分吸収体２を染色液吸収体として接触させる。図３（ｄ）は、十分な細胞の染色が行われた後、細胞染色液６を保持したままのフィルタ３を、水分吸収体２上に積層して接触配置された状態を示している。図３（ｄ）の矢印で表した様に、細胞染色液６は水分吸収体２に毛細管現象を利用して吸収されていく。細胞染色液６を水分吸収体２に吸収させる場合でも、上述したように水分吸収体２は２枚用いてもよく、１枚に限定されない。この場合も水分吸収体２の枚数が多ければ多いほど水分吸収量が増加する。 After the cells 4 are sufficiently stained with the cell stain 6 on the filter 3, the moisture absorber 2 is removed from under the filter 3 holding the cell stain 6 in order to remove the cell stain 6 from the filter 3. Contact as a dye absorber. FIG. 3D shows a state in which the filter 3 with the cell staining solution 6 held thereon is stacked on the moisture absorber 2 and contacted after sufficient cell staining has been performed. As shown by the arrow in FIG. 3D, the cell staining solution 6 is absorbed by the moisture absorber 2 using capillary action. Even when the cell stain 6 is absorbed by the moisture absorber 2, two moisture absorbers 2 may be used as described above, and the number is not limited to one. Also in this case, the amount of moisture absorption increases as the number of moisture absorbers 2 increases.
細胞が染色された後、必要に応じて、細胞染色液６の洗浄処理を行っても良い。当該洗浄処理においても、細胞染色液６を水分吸収体２で吸収した後、フィルタ３と水分吸収体２とを分離した状態で、洗浄液をフィルタ３上に添加し、その後再び水分吸収体２をとり付けて、洗浄液を吸収するという工程を経ても良い。 After the cells are stained, the cell staining solution 6 may be washed as necessary. Also in the washing treatment, after the cell staining solution 6 is absorbed by the moisture absorber 2, the washing solution is added to the filter 3 in a state where the filter 3 and the moisture absorber 2 are separated, and then the moisture absorber 2 is again used. A step of attaching and absorbing the cleaning liquid may be performed.
細胞染色後の細胞４の観察には、細胞染色液あるいは更に洗浄液を除去した後に細胞４を保持しているフィルタ３を、水分吸収体２から分離してスライドグラス上に置き、蛍光顕微鏡を用いて細胞像を観察する。この時、細胞４が保持されているフィルタ３の面をスライドグラス側になるように置いて密着させると、さらにその後の取り扱いによっても細胞のロスを防ぐことができるので好ましい。 For the observation of the cells 4 after cell staining, the filter 3 holding the cells 4 after removing the cell staining solution or further the washing solution is separated from the moisture absorber 2 and placed on a slide glass, and a fluorescence microscope is used. And observe the cell image. At this time, it is preferable to place the surface of the filter 3 holding the cells 4 on the side of the slide glass so that the cells 4 can be prevented from being lost by further handling.
蛍光顕微鏡としては、蛍光を測定できるものなら特に限定されるものではないが、例えば、蛍光顕微鏡としては、ＣａｒｌＺｅｉｓｓ社ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｄ１などを用いることができる。 The fluorescence microscope is not particularly limited as long as it can measure fluorescence. For example, Carl Zeiss Observer D1 can be used as the fluorescence microscope.
図４及び５は細胞染色後の細胞４の蛍光顕微鏡による、細胞像を示す。 4 and 5 show cell images of the cells 4 after cell staining using a fluorescence microscope.
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention, this invention is not limited to these.
《フィルタ及び水分吸収体の一体化》
フィルタ（ＧＥ社ニュークリポアメンブレン（φ０．４μｍ））下面をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で濡らし、水分吸収体（ＧＥ社ブロッティング用濾紙ＧＢ００５）上面に合わせてＰＢＳで濡れているフィルタ下面をとり付けて水分吸収体とフィルタとを一体化した（以下、フィルタ水分吸収体一体化デバイスともいう）。
<Integration of filter and moisture absorber>
Wet the bottom surface of the filter (GE New Clipore Membrane (φ0.4μm)) with PBS (Phosphor Buffered Saline), and attach the bottom surface of the filter wetted with PBS to the top surface of the water absorber (GE blotting filter paper GB005). The moisture absorber and the filter were integrated (hereinafter also referred to as a filter moisture absorber integrated device).
《細胞懸濁液の調製》
Ｊｕｒｋａｔ細胞を３％パラホルムアルデヒドにて処理した後、当該処理後のＪｕｒｋａｔ細胞をＰＢＳに懸濁して細胞懸濁液（５．５×１０５細胞／ｍｌ）を調製した。
<Preparation of cell suspension>
Jurkat cells were treated with 3% paraformaldehyde, and the treated Jurkat cells were suspended in PBS to prepare a cell suspension (5.5 × 10 5 cells / ml).
実施例１
《染色方法Ａで染色したＪｕｒｋａｔ細胞》
上記で作製したフィルタ水分吸収体一体化デバイスのフィルタ上面に、上記で調製したＪｕｒｋａｔ細胞の細胞懸濁液を１０μｌ添加した。フィルタ上面の水分を、約５〜１０分間、十分にフィルタ水分吸収体一体化デバイスの水分吸収体に吸収させた。
Example 1
<< Jurkat cells stained with staining method A >>
10 μl of the cell suspension of the Jurkat cell prepared above was added to the upper surface of the filter of the filter moisture absorber integrated device produced above. The moisture on the upper surface of the filter was sufficiently absorbed by the moisture absorber of the filter moisture absorber integrated device for about 5 to 10 minutes.
その後、フィルタ水分吸収体一体化デバイスのフィルタと水分吸収体とをフィルタ上に捕捉されている細胞を落とさないよう分離し、分離したフィルタを空洞の筒状支持体上部に載せ、細胞染色液α（Ａｎｔｉ ＣＤ４５ Ａｌｅｘａ ４８８ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を細胞が補足されているフィルタ上に添加した。添加後、約３０分間湿潤状態にてインキュベートした。インキュベート後、細胞染色液αを上面に保持しているフィルタの下面に、再び水分吸収体をとり付け水分吸収体とフィルタ下面を接触させることでフィルタ水分吸収体一体化デバイスとし、細胞染色液αを水分吸収体に吸収させた。 Thereafter, the filter and the moisture absorber of the filter moisture absorber integrated device are separated so as not to drop the cells trapped on the filter, and the separated filter is placed on the hollow cylindrical support, and the cell staining solution α (Anti CD45 Alexa 488 conjugate) was added onto the filter supplemented with cells. After the addition, it was incubated in a wet state for about 30 minutes. After the incubation, the moisture absorber is again attached to the lower surface of the filter holding the cell staining solution α on the upper surface, and the moisture absorber and the lower surface of the filter are brought into contact with each other to obtain a filter moisture absorber integrated device. Was absorbed by the moisture absorber.
その後、細胞を洗浄するために、１００μｌの洗浄液ＰＢＳを、フィルタ上面に３回に分けて添加して、細胞染色液αを洗い流した。 Then, in order to wash | clean a cell, 100 microliters washing | cleaning liquid PBS was added to the filter upper surface in 3 steps, and the cell dyeing liquid (alpha) was washed away.
次に、フィルタ水分吸収体一体化デバイスを再びフィルタと水分吸収体とにフィルタ上に捕捉されている細胞を落とさないよう分離し、分離したフィルタを空洞の筒状支持体上部に載せ、細胞染色液β（ＤＡＰＩ）をフィルタ上に添加した。添加後、約５分間湿潤状態でインキュベートした。インキュベート後、細胞染色液βを上面に保持しているフィルタの下面に、再び水分吸収体をとり付け水分吸収体とフィルタ下面を接触させることでフィルタ水分吸収体一体化デバイスとし、細胞染色液βを水分吸収体に吸収させた。 Next, the filter moisture absorber integrated device is separated again into the filter and moisture absorber so as not to drop the cells trapped on the filter, and the separated filter is placed on the top of the hollow cylindrical support, and cell staining is performed. Liquid β (DAPI) was added onto the filter. After the addition, it was incubated in a wet state for about 5 minutes. After the incubation, the moisture absorber is again attached to the lower surface of the filter holding the cell staining solution β on the upper surface, and the moisture absorber and the lower surface of the filter are brought into contact with each other to obtain a filter moisture absorber integrated device. Was absorbed by the moisture absorber.
その後、細胞を洗浄するために、１００μｌの洗浄液ＰＢＳを、フィルタ上面に３回に分けて添加して、細胞染色液βを洗い流し、染色方法Ａで染色したＪｕｒｋａｔ細胞を得た。 Thereafter, in order to wash the cells, 100 μl of washing solution PBS was added to the upper surface of the filter in three portions to wash away the cell staining solution β, and Jurkat cells stained with staining method A were obtained.
得られた、細胞像の蛍光顕微鏡による拡大図を図４（ａ）に全体図を図５（ａ）に示す。 An enlarged view of the obtained cell image by a fluorescence microscope is shown in FIG. 4 (a), and an overall view is shown in FIG. 5 (a).
比較例１
《染色方法Ｂで染色したＪｕｒｋａｔ細胞》
実施例１において、細胞染色液αを添加する際に、フィルタ水分吸収体一体化デバイスを分離せずに、細胞染色液αを添加したこと、及び細胞染色液βを添加する際に、フィルタ水分吸収体一体化デバイスを分離せずに、細胞染色液βを添加したこと、を除いては、実施例１と同様の操作を行って、染色方法Ｂで染色したＪｕｒｋａｔ細胞を得た。
Comparative Example 1
<< Jurkat cells stained with staining method B >>
In Example 1, when adding the cell stain solution α, the cell stain solution α was added without separating the filter moisture absorber integrated device, and when the cell stain solution β was added, Jurkat cells stained by staining method B were obtained by performing the same operation as in Example 1 except that the cell staining solution β was added without separating the absorbent integrated device.
得られた、細胞像の蛍光顕微鏡による拡大図を図４（ｂ）に示す。 An enlarged view of the obtained cell image by a fluorescence microscope is shown in FIG.
比較例２
《染色方法Ｃで染色したＪｕｒｋａｔ細胞》
上記で作製したフィルタ水分吸収体一体化デバイスのフィルタ上面に、上記で調製したＪｕｒｋａｔ細胞の細胞懸濁液を１０μｌ添加した。フィルタ上面の水分を、約５〜１０分間、十分に水分吸収体フィルタ一体化デバイスの水分吸収体に吸収させた。
Comparative Example 2
<< Jurkat cells stained with staining method C >>
10 μl of the cell suspension of the Jurkat cell prepared above was added to the upper surface of the filter of the filter moisture absorber integrated device produced above. The moisture on the upper surface of the filter was sufficiently absorbed by the moisture absorber of the moisture absorber filter integrated device for about 5 to 10 minutes.
その後、フィルタを水分吸収体から分離し、分離したフィルタの細胞を保持している面（上面）を下にしてスライドグラス上に載置し、細胞が破壊されない程度にフィルタを上から押圧し、約３分間静置した後、スライドグラスからフィルタを剥離し細胞をスライドグラスに転写した。 Then, the filter is separated from the moisture absorber, placed on the slide glass with the surface (upper surface) holding the cells of the separated filter down, and pressed from above so that the cells are not destroyed, After leaving still for about 3 minutes, the filter was peeled from the slide glass and the cells were transferred to the slide glass.
細胞が転写されたスライドグラス上に細胞染色液α（Ａｎｔｉ ＣＤ４５ Ａｌｅｘａ ４８８ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を添加した。添加後、約３０分間湿潤状態にてインキュベートした。インキュベート後、細胞染色液αをピペットにより吸引した。 Cell staining solution α (Anti CD45 Alexa 488 conjugate) was added on the slide glass onto which the cells were transferred. After the addition, it was incubated in a wet state for about 30 minutes. After incubation, the cell staining solution α was aspirated with a pipette.
細胞を洗浄するために、１００μｌの洗浄液ＰＢＳを、スライドグラス上に３回に分けて添加して、細胞染色液αを洗い流した。残存した洗浄液ＰＢＳをピペットにて吸引した後、細胞染色液β（ＤＡＰＩ）をスライドグラス上に添加した。添加後、約５分間湿潤状態でインキュベートした。インキュベート後、細胞染色液βをピペットにて吸引し、その後、細胞を洗浄するために、１００μｌの洗浄液ＰＢＳを、フィルタ上面に３回に分けて添加して、細胞染色液βを洗い流し、残存した洗浄液ＰＢＳをピペットにて吸引し、染色方法Ｃで染色したＪｕｒｋａｔ細胞を得た。 In order to wash the cells, 100 μl of washing solution PBS was added in three portions on the slide glass to wash away the cell staining solution α. The remaining washing solution PBS was aspirated with a pipette, and then cell staining solution β (DAPI) was added onto the slide glass. After the addition, it was incubated in a wet state for about 5 minutes. After incubation, the cell staining solution β was aspirated with a pipette, and then 100 μl of washing solution PBS was added to the upper surface of the filter in three portions to wash the cells, and the cell staining solution β was washed away and remained. The washing solution PBS was aspirated with a pipette to obtain Jurkat cells stained with staining method C.
得られた、細胞像の蛍光顕微鏡による拡大図を図４（ｃ）に全体図を図５（ｂ）に示す。 An enlarged view of the obtained cell image with a fluorescence microscope is shown in FIG. 4 (c) and an overall view is shown in FIG. 5 (b).
＜染色されたＪｕｒｋａｔ細胞の評価＞
染色方法Ａ〜Ｃで染色した各々のＪｕｒｋａｔ細胞の評価を以下のように行った。結果を表１及び表２に示した。
<Evaluation of stained Jurkat cells>
Each Jurkat cell stained with staining methods A to C was evaluated as follows. The results are shown in Tables 1 and 2.
（蛍光値）
蛍光値を求めるために、細胞染色液αを用いて染色した染色方法Ａ〜Ｃの各々のＪｕｒｋａｔ細胞を観察した。染色方法Ａ〜Ｃで染色したＪｕｒｋａｔ細胞については、フィルタ水分吸収体一体化デバイスを分離し、フィルタの細胞を保持している面（上面）がスライドグラスと接触するようにして、フィルタをスライドグラス上に置いた。その後、蛍光顕微鏡（ｃａｒｌｚｅｉｓｓ社Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｄ１）を用いて細胞像を観察した。染色方法Ｃで染色したＪｕｒｋａｔ細胞については、スライドグラス上にあるので、そのまま、上記した蛍光顕微鏡を用いて細胞像を観察した。
(Fluorescence value)
In order to obtain the fluorescence value, Jurkat cells of each of staining methods A to C stained with the cell staining solution α were observed. For Jurkat cells stained by staining methods A to C, separate the filter water-absorber-integrated device, and make the filter slide glass so that the surface (upper surface) holding the filter cells is in contact with the slide glass Placed on top. Then, the cell image was observed using the fluorescence microscope (Carl Zeiss Observer D1). Since the Jurkat cells stained by staining method C are on a slide glass, the cell images were observed as they were using the above-described fluorescence microscope.
蛍光値は、細胞染色液αで染色したＪｕｒｋａｔ細胞によるものであり、Ｃａｒｌｚｅｉｓｓ社ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ内の濃度測定アルゴリズムを用いて細胞７個あたりのＡｌｅｘａ４８８の強度（単位はソフトウェア独自単位［Ｇｒｅｙ］）として求めた。結果を表１に示した。 Fluorescence values were obtained from Jurkat cells stained with cell stain α, and were determined as the intensity of Alexa 488 per 7 cells (unit is software-specific unit [Grey]) using a concentration measurement algorithm in Carlzeiss AxioVision. . The results are shown in Table 1.
（細胞数）
最終的に得られた細胞数を求めるために、細胞染色液βを用いて染色した染色方法Ａ〜Ｃの各々のＪｕｒｋａｔ細胞を、上記蛍光値の測定で使用した蛍光顕微鏡を用いて観察した。
(Number of cells)
In order to determine the number of cells finally obtained, each Jurkat cell of staining methods A to C stained with cell staining solution β was observed using the fluorescence microscope used in the measurement of the fluorescence value.
表１及び表２より本発明の染色方法Ａで染色したＪｕｒｋａｔ細胞は蛍光値及び細胞数ともに優れていることがわかった。染色方法Ｃで染色したＪｕｒｋａｔ細胞は、蛍光値が低く染色工程で十分に染色されていないことがわかった。図４の（ｂ）は、染色方法Ｂで染色を行ったＪｕｒｋａｔ細胞であるが、他の染色方法（Ａ及びＣ）に比べて、明らかに検出精度の低い細胞像であった。比較例である染色方法Ｃで染色したＪｕｒｋａｔ細胞では、細胞をスライドグラスに転写して染色工程を行っているので、転写の際に細胞のロスがみられ最終的に得られる細胞数が少なくなっていた。図５の（ａ）及び（ｂ）から明らかなようにＪｕｒｋａｔ細胞の数に違いがみられた。全体的な細胞数が少ないために、蛍光値も染色方法Ａで染色したＪｕｒｋａｔ細胞に比べ低いことがわかった。 From Tables 1 and 2, it was found that Jurkat cells stained with the staining method A of the present invention were excellent in both fluorescence value and cell number. It was found that the Jurkat cells stained by staining method C had a low fluorescence value and were not sufficiently stained in the staining step. FIG. 4 (b) shows Jurkat cells stained by staining method B, but the cell image was clearly lower in detection accuracy than other staining methods (A and C). In the Jurkat cells stained with the staining method C, which is a comparative example, the cells are transferred to a slide glass and the staining process is performed. Therefore, cell loss is observed during the transfer, and the number of cells finally obtained is reduced. It was. As is clear from FIGS. 5A and 5B, there was a difference in the number of Jurkat cells. Since the total number of cells was small, the fluorescence value was found to be lower than that of Jurkat cells stained with staining method A.
本発明では、フィルタ水分吸収体一体型デバイスを用いて染色工程を行っており、染色が十分に行われ、かつ細胞のロスも少ない細胞の染色が行える。また、該フィルタ水分吸収体一体化デバイスでは、フィルタを２枚積層して用いた場合、実施例１のフィルタ１枚のみの場合に比べて、吸収できる水分量が多くなり、水分量が多い場合に適していることがわかった。 In the present invention, the dyeing process is performed using the filter-water-absorber-integrated device, so that the cells can be dyed sufficiently and the cells are not lost. Further, in the filter moisture absorber integrated device, when two filters are stacked and used, the amount of moisture that can be absorbed is larger than the case of only one filter of Example 1, and the amount of moisture is large. It was found to be suitable for.
なお、以上の実施の形態においては、細胞の十分な染色が行われた後、不要となった細胞の染色液をフィルタから除去する際に用いる染色液吸収体として、細胞懸濁液の濾過に使用した水分吸収体を再びフィルタに接触させて細胞染色液やその洗浄液を吸収する例を示したが、染色液吸収体としては、別の新たな水分吸収体を用いても、また更に当該水分吸収体とは種類の異なる吸収体を用いても良いことは勿論である。 In the above embodiment, after the cells have been sufficiently stained, the cell suspension is used as a staining solution absorber for removing unnecessary cell staining solution from the filter. Although an example has been shown in which the used water absorber is brought into contact with the filter again to absorb the cell staining solution and its washing solution, as the staining solution absorber, another new moisture absorber may be used, or the water content may be further increased. Of course, an absorber of a different type from the absorber may be used.
１ ガラス基板
２ 水分吸収体
３ フィルタ
４ 細胞
５ 細胞懸濁液
６ 細胞染色液
1 Glass substrate 2 Moisture absorber 3 Filter 4 Cell 5 Cell suspension 6 Cell stain
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