JP5771563B2 - Monoclonal antibodies and methods for use in detecting cervical disease - Google Patents

Abstract

Compositions and methods for diagnosing high-grade cervical disease in a patient sample are provided. The compositions include monoclonal antibodies, and variants and fragments thereof, that specifically bind to MCM2. Monoclonal antibodies having the binding characteristics of an MCM2 antibody of the invention are further provided. Hybridoma cell lines that produce an MCM2 monoclonal antibody of the application are also disclosed herein. The compositions find use in practicing methods for diagnosing high-grade cervical disease comprising detecting overexpression of MCM2 in a cervical sample from a patient. Kits for practicing the methods of the application are further provided. Polypeptides comprising the amino acid sequence for an MCM2 epitope and methods of using these polypeptides in the production of antibodies are also encompassed by the present application.

Description

本発明は、ＭＣＭ２に結合することができる抗体、および、特に子宮頸疾患の診断にお
いて、これらの抗体を使用する方法に関する。 The present invention relates to antibodies capable of binding to MCM2 and methods of using these antibodies, particularly in the diagnosis of cervical disease.

子宮頸の癌腫は、女性において２番目に多い新生物であり、全ての女性の癌のおよそ１
２％を占め、年におよそ２５００００人の死亡の原因となる。非特許文献１。集団検診事
業が利用可能でない多くの発展途上国において、臨床的問題はより深刻である。これらの
国における子宮頸癌は、女性における癌での死亡の第１位の原因である。 Cervical carcinoma is the second most common neoplasm in women, approximately 1 of all women's cancers.
It accounts for 2% and causes approximately 250,000 deaths per year. Non-Patent Document 1. In many developing countries where mass screening services are not available, clinical problems are more serious. Cervical cancer in these countries is the leading cause of cancer death in women.

子宮頸癌の症例の大多数は、扁平上皮癌に相当するが、腺癌も見られる。子宮頸癌は、
形態学的に区別することができる明確な非侵襲性上皮内段階を経て発展するので、集団検
診によって防ぐことができる。非特許文献２。正常な細胞がどのようにして形質転換する
のかは理解されていないが、正常な重層上皮から子宮頸上皮内新生物（ＣＩＮ）を経て浸
潤癌への組織病理学的変化の連続スペクトルの概念が、長年にわたって広く認められてい
る。子宮頸癌への前駆体は、当該分野でＣＩＮまたは扁平上皮内病変（ＳＩＬ）としても
公知の、異形成である。扁平上皮内異常は、３層（ＣＩＮ）または２層（ベセズダ）シス
テムを用いることによって分類することができる。ベセズダシステム下で、ＣＩＮＩおよ
びＨＰＶ感染に対応する、低悪性度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）は、一般に、比較的侵襲
性疾患への進行のリスクの低い増殖性ＨＰＶ感染を示す。ＬＳＩＬおよびＨＳＩＬの両方
とも悪性腫瘍の潜在的前駆体として考察されているが、３層システムにおけるＣＩＮＩＩ
およびＣＩＮＩＩＩに対応する、高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）は、ＬＳＩＬより
も高い、子宮頸癌への進行のリスクを示す。患者試料はまた、このシステム下で、ＡＳＣ
ＵＳ（意義が不明な非定型扁平細胞）またはＡＧＵＳ（意義が不明な非定型腺細胞）とし
て分類することができる。 The majority of cases of cervical cancer correspond to squamous cell carcinoma, but adenocarcinoma is also found. Cervical cancer
It develops through a clear non-invasive intraepithelial stage that can be distinguished morphologically and can be prevented by mass screening. Non-Patent Document 2. It is not understood how normal cells transform, but the concept of a continuous spectrum of histopathological changes from normal stratified epithelium to cervical intraepithelial neoplasia (CIN) to invasive cancer Has been widely recognized for many years. The precursor to cervical cancer is dysplasia, also known in the art as CIN or squamous intraepithelial lesion (SIL). Squamous intraepithelial abnormalities can be classified by using a three-layer (CIN) or two-layer (Bethesda) system. Under the Bethesda system, low-grade squamous intraepithelial lesions (LSIL), which correspond to CINI and HPV infection, generally indicate proliferative HPV infection with a relatively low risk of progression to invasive disease. Both LSIL and HSIL have been considered as potential precursors of malignancy, but CINII in a three-layer system
And high-grade squamous intraepithelial lesions (HSIL), corresponding to CINIII, show a higher risk of progression to cervical cancer than LSIL. Patient samples can also be
It can be classified as US (atypical squamous cells of unknown significance) or AGUS (atypical glandular cells of unknown significance).

子宮頸癌と、１６、１８および３１型等のリスクの高い型のヒトパピローマウイルス（
ＨＰＶ）による感染との、強力な関連が確立されている。実際、多数の疫学的および分子
生物学的証拠によって、ＨＰＶ感染は子宮頸癌における原因因子として確立されている。
さらに、ＨＰＶは、高悪性度子宮頸疾患の８５％以上の症例において見られる。しかしな
がら、ＨＰＶ感染は非常に一般的であり、おそらくは３０歳を超える女性の５〜１５％で
起こるが、高悪性度の子宮頸疾患または癌を生じるＨＰＶ陽性の女性はほとんどいない。
ＨＰＶ単独の存在は感染のみの指標であり、高悪性度子宮頸疾患の指標ではなく、したが
って、ＨＰＶ感染単独の試験は、多くの偽陽性を生じる。例えば、非特許文献３を参照の
こと。 Cervical cancer and high-risk human papillomaviruses such as types 16, 18 and 31 (
A strong link has been established with infection by HPV. Indeed, numerous epidemiological and molecular biological evidence has established HPV infection as a causative factor in cervical cancer.
Furthermore, HPV is found in over 85% of cases of high grade cervical disease. However, HPV infection is very common and probably occurs in 5-15% of women over 30 years of age, but few HPV positive women develop high-grade cervical disease or cancer.
The presence of HPV alone is an infection-only indicator and not an indicator of high-grade cervical disease, so testing for HPV infection alone results in many false positives. For example, see Non-Patent Document 3.

現在の文献から、ＨＰＶが、下にある子宮頸の組織内で基底幹細胞に感染することが示
唆される。成熟ケラチノサイトへの幹細胞の分化は、重層子宮頸上皮への細胞の得られる
遊走とともに、ＨＰＶウイルス複製および細胞の再感染と関連付けられる。このウイルス
複製プロセスの間、細胞周期制御解除、活発な増殖、ＤＮＡ複製、転写活性化およびゲノ
ム不安定性を含む、いくつかの細胞変化が起こる（非特許文献４、非特許文献５、非特許
文献６）。 Current literature suggests that HPV infects basal stem cells within the underlying cervical tissue. Differentiation of stem cells into mature keratinocytes is associated with HPV virus replication and cell reinfection, along with the resulting migration of cells into the stratified cervical epithelium. During this viral replication process, several cellular changes occur, including cell cycle deregulation, active growth, DNA replication, transcriptional activation and genomic instability (Non-patent document 4, Non-patent document 5, Non-patent document). 6).

ほとんどのＨＰＶ感染は、自然界では一時的であり、ウイルス感染は１２ヶ月間のうち
にそれ自体で解決する。１つまたは複数の腫瘍形成サブタイプのＨＰＶでの持続性の感染
を生じる個体については、ＨＰＶ感染のない患者と比較して、新生物の発生のリスクがあ
る。子宮頸新生物の発生におけるＨＰＶの重要性を考慮すれば、ＨＰＶの臨床的検出は、
子宮頸新生物発生のリスクのある患者の同定における重要な診断手段になっている。子宮
頸疾患についてのＨＰＶベースのスクリーニングの臨床的有用性は、その陰性適中率にあ
る。正常なパパニコラウスミアの経緯と組み合わせたＨＰＶ陰性結果は、その後の１〜３
年間の、疾患のない状態および子宮頸新生物発生の低いリスクの優れた指標である。しか
しながら、陽性ＨＰＶ結果は、子宮頸疾患の症状を示さない。むしろこれは感染の指標で
ある。ＨＰＶ感染の大多数は一時的であり、１２ヶ月間のうちに自然になくなるが、リス
クの高いＨＰＶウイルスサブタイプでの持続性の感染は、子宮頸新生物の発生の、より高
いリスクを示す。ＨＰＶ試験を補うために、子宮頸新生物と関連のある分子マーカーの同
定によって、子宮頸疾患診断に対する臨床的特異性が向上すると予測される。 Most HPV infections are transient in nature and viral infections resolve themselves in 12 months. Individuals who develop persistent infection with one or more oncogenic subtypes of HPV are at risk of developing neoplasms compared to patients without HPV infection. Given the importance of HPV in the development of cervical neoplasms, the clinical detection of HPV is
It has become an important diagnostic tool in identifying patients at risk of developing cervical neoplasms. The clinical utility of HPV-based screening for cervical disease is in its negative predictive value. HPV negative results combined with normal Papanicolaou smear history are the subsequent 1-3
It is an excellent indicator of disease-free status and low risk of developing cervical neoplasia over the years. However, a positive HPV result does not indicate symptoms of cervical disease. Rather this is an indicator of infection. Although the majority of HPV infections are temporary and will disappear naturally within 12 months, persistent infection with high-risk HPV virus subtypes presents a higher risk of developing cervical neoplasms . To complement HPV testing, the identification of molecular markers associated with cervical neoplasms is expected to improve clinical specificity for cervical disease diagnosis.

パパニコラウ染色子宮頸スミア（パパニコラウスミア）の細胞学的調査は現在、子宮頸
癌を検出するための最適な方法である。パプ試験は、６０年にわたって実質的に変化しな
いままである主観的な方法である。しかしながら、その性能に関していくつかの懸念があ
る。単一のパプ試験の、報告されている感度（試験陽性である疾患陽性の割合）は低く、
幅広い変動を示す（３０〜８７％）。単一のパプ試験の特異性（試験陰性である疾患陰性
の割合）は、スクリーニング集団中８６％と低い場合があり、潜在する高悪性度疾患の判
定について、ＡＳＣＵＳ ＰＬＵＳ集団中で相当低い場合がある。Ｂａｌｄｗｉｎら、前
出を参照のこと。ＬＳＩＬまたはＣＩＮＩとして特徴付けられている相当なパーセンテー
ジのパパニコラウスミアは、実際、高悪性度病変について陽性である。さらに、１０％ま
でのパパニコラウスミアは、ＡＳＣＵＳ（意義が不明な非定型扁平細胞）として分類され
、すなわち、正常、中等度もしくは重症な病変、または腫瘍として、明確な類別を行うこ
とはできない。しかしながら、実験から、１０％までのこのＡＳＣＵＳ集団が、結果とし
て見落とされる高悪性度病変を有することが示される。例えば、非特許文献７を参照のこ
と。したがって、高悪性度子宮頸疾患の診断を実施するための信頼できる方法を実施する
ために、高悪性度子宮頸疾患において選択的に過剰発現される分子バイオマーカーおよび
これらのバイオマーカーの検出のための組成物が必要である。 Cytological investigation of Papanicolaou stained cervical smear (Papanicolaou smear) is currently the best method for detecting cervical cancer. The Pap test is a subjective method that remains substantially unchanged for 60 years. However, there are some concerns regarding its performance. The reported sensitivity of the single pape test (the proportion of disease positives that are test positive) is low,
Shows wide variation (30-87%). Specificity of a single pape test (proportion of disease negative that is test negative) may be as low as 86% in the screening population and may be significantly lower in the ASCUS PLUS population for the determination of potential high-grade disease. is there. See Baldwin et al., Supra. A significant percentage of Papanicolaou smear, characterized as LSIL or CINI, is indeed positive for high-grade lesions. Furthermore, up to 10% of Papanicolaou smears are classified as ASCUS (atypical squamous cells of unknown significance), i.e. they cannot be clearly classified as normal, moderate or severe lesions or tumors. However, experiments show that up to 10% of this ASCUS population has high-grade lesions that are overlooked as a result. For example, see Non-Patent Document 7. Therefore, to implement a reliable method for performing diagnosis of high-grade cervical disease, for the detection of molecular biomarkers that are selectively overexpressed in high-grade cervical disease and these biomarkers Of the composition is required.

ミニ染色体維持（ＭＣＭ）タンパク質は、真核生物ＤＮＡ複製において、本質的な役割
を果たす。ミニクロモソーム維持（ＭＣＭ）タンパク質は、ＤＮＡへの複製前複合体の負
荷、および二本鎖ＤＮＡ鎖のデノボ合成の間にヘリカーゼとして機能して二本鎖ＤＮＡを
解くのを助けることによって、ＤＮＡ複製の早期に機能する。ＭＣＭタンパク質のそれぞ
れは、それらの高度に保存された中央のドメインに、ＤＮＡ依存的ＡＴＰアーゼモチーフ
を有する。ＭＣＭタンパク質のレベルは、一般に、正常な細胞が細胞周期のＧ０期からＧ
１／Ｓ期に進むと、可変の様式で増大する。Ｇ０期に、ＭＣＭ２およびＭＣＭ５タンパク
質は、ＭＣＭ７およびＭＣＭ３タンパク質よりもずっと豊富でない。ＭＣＭ６はＭＣＭ２
、ＭＣＭ４、およびＭＣＭ７とともに複合体を形成し、これはヒストンＨ３に結合する。
また、ＭＣＭ４、ＭＣＭ６、およびＭＣＭ７の部分複合体はヘリカーゼ活性を有し、これ
はＭＣＭ６のＡＴＰ結合活性およびＭＣＭ４のＤＮＡ結合活性によって媒介される。例え
ば、その全てが参照によって全体が本明細書中に援用される、非特許文献８、非特許文献
９、非特許文献１０を参照のこと。 Minichromosome maintenance (MCM) proteins play an essential role in eukaryotic DNA replication. The minichromosome maintenance (MCM) protein functions as a helicase during loading of the pre-replication complex into DNA and de novo synthesis of the double-stranded DNA strand, thereby helping to break double-stranded DNA. To function early. Each of the MCM proteins has a DNA-dependent ATPase motif in their highly conserved central domain. The level of MCM protein is generally determined by normal cells from G0 to G
As it progresses to the 1 / S phase, it increases in a variable manner. In G0 phase, MCM2 and MCM5 proteins are much less abundant than MCM7 and MCM3 proteins. MCM6 is MCM2
, MCM4, and MCM7 form a complex that binds to histone H3.
The MCM4, MCM6, and MCM7 subcomplexes also have helicase activity, which is mediated by MCM6 ATP binding activity and MCM4 DNA binding activity. For example, see Non-Patent Document 8, Non-Patent Document 9, and Non-Patent Document 10, all of which are incorporated herein by reference in their entirety.

初期の刊行物から、ＭＣＭタンパク質、および具体的にはＭＣＭ−５が、子宮頸疾患（
非特許文献１１）、ならびに他の癌（非特許文献１２）の検出に有用であることが示され
ている。公開されている文献から、ＭＣＭ−５に対する抗体が、子宮頸新生物細胞を検出
することができることが示される。高悪性度子宮頸疾患の検出の特異性は、ＭＣＭ−５に
ついて示されていない（非特許文献１３）。ＭＣＭ−５発現の検出は高悪性度子宮頸疾患
に制限されないが、同定された低悪性度異形成、およびリスクの高いＨＰＶでの感染の後
に細胞周期に再び入った増殖細胞においても検出される。ＭＣＭ−５に加えて、ＭＣＭ−
２およびＭＣＭ−７を含むＭＣＭファミリーの他のメンバーが、組織試料中で子宮頸新生
物の検出のための潜在的に有用なマーカーであると示されている（非特許文献１４、非特
許文献１５）。最近の結果から、ＭＣＭ−７が、免疫化学形式を用いた高悪性度子宮頸疾
患の検出のための特異的マーカーであるようであることが示された（非特許文献１６、非
特許文献１７）。
Ｂａｌｄｗｉｎら（２００３年）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ３巻：１〜１０頁 Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ９５巻：１４９３２〜１４９３７頁 Ｗｒｉｇｈｔら（２００４年）Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏｌ．１０３：３０４〜３０９頁 Ｃｒｕｍ（２０００年）Ｍｏｄｅｒｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ１３巻：２４３〜２５１頁 Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら（２００３年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７７巻：１０１８６〜１０２０１頁 Ｐｅｔｔら（２００４年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４巻：１３５９〜１３６８頁 Ｍａｎｏｓら（１９９９年）ＪＡＭＡ２８１巻：１６０５〜１６１０頁 Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９９年）Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５巻：２１２１〜２１３２頁 Ｌｅｉら（２００１年）Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１４巻：１４４７〜１４５４頁 Ｉｓｈｉｍｉら（２００３年）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０巻：１０８９〜１１０１頁 Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９８年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９５巻：１４９３２〜１４９３７頁 Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９９年）Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５巻：２１２１〜２１３２頁 Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９８年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１４９３２〜１４９３７頁 Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９９年）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５巻：２１２１〜２１３２頁 Ｂｒａｋｅら（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３巻：８１７３〜８１８０頁 Ｂｒａｋｅら（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３巻：８１７３〜８１８０頁 Ｍａｌｉｎｏｗｓｋｉら（２００４年）Ａｃｔａ Ｃｙｔｏｌ．４３：６９６頁 From earlier publications, MCM proteins, and specifically MCM-5, have been found to have cervical disease (
Non-patent document 11) as well as other cancers (non-patent document 12) have been shown to be useful. Published literature indicates that antibodies against MCM-5 can detect cervical neoplastic cells. The specificity of detecting high-grade cervical disease has not been shown for MCM-5 (Non-patent Document 13). Detection of MCM-5 expression is not limited to high-grade cervical disease, but is also detected in proliferating cells that re-enter the cell cycle after identified low-grade dysplasia and high-risk HPV infection . In addition to MCM-5, MCM-
Other members of the MCM family, including 2 and MCM-7, have been shown to be potentially useful markers for the detection of cervical neoplasms in tissue samples (14). 15). Recent results indicate that MCM-7 appears to be a specific marker for the detection of high-grade cervical disease using an immunochemical format (Non-Patent Document 16, Non-Patent Document 17). ).
Baldwin et al. (2003) Nature Reviews Cancer 3: 1-10. Williams et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA Volume 95: 14932-14937. Wright et al. (2004) Obstet. Gynecol. 103: 304-309 Crum (2000) Modern Pathology 13: 243-251 Middleton et al. (2003) J. MoI. Virol. 77: 10186-10201 Pett et al. (2004) Cancer Res. Volume 64: 1359-1368 Manos et al. (1999) JAMA 281: 1605-1610 Freeman et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 2121-2132 Lei et al. (2001) J. MoI. Cell Sci. 114: 1447-1454 Ishimi et al. (2003) Eur. J. et al. Biochem. 270: 1089-1101 Williams et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U. S. A. Volume 95: 14932-14937 Freeman et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 2121-2132 Williams et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U. S. A. 95: 14932-14937 Freeman et al. (1999) Clin Cancer Res. 5: 2121-2132 Brake et al. (2003) Cancer Res. 63: 8173-8180 Brake et al. (2003) Cancer Res. 63: 8173-8180 Malinowski et al. (2004) Acta Cytol. 43: 696

したがって、当該分野において、高悪性度子宮頸疾患において選択的に過剰発現される
バイオマーカーの発現を検出することができる抗体に対する必要性がある。高悪性度疾患
を、早期ＨＰＶ感染および軽度の異形成等の、臨床的疾患と見なされない状態から区別す
るための方法において、かかる抗体を使用することができる。 Accordingly, there is a need in the art for antibodies that can detect the expression of biomarkers that are selectively overexpressed in high-grade cervical disease. Such antibodies can be used in methods to distinguish high-grade disease from conditions that are not considered clinical diseases, such as early HPV infection and mild dysplasia.

高悪性度子宮頸疾患を診断するための組成物および方法が提供される。組成物は、本発
明の核バイオマーカータンパク質、具体的にはＭＣＭタンパク質、より具体的にはＭＣＭ
２に結合することができる、モノクローナル抗体を含む。これらのモノクローナル抗体の
抗原結合断片および変異体、これらの抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞株
、ならびに本発明のモノクローナル抗体を含むキットもまた、本明細書中に包含される。 Compositions and methods for diagnosing high-grade cervical disease are provided. The composition comprises a nuclear biomarker protein of the invention, specifically MCM protein, more specifically MCM
A monoclonal antibody capable of binding to 2; Also encompassed herein are antigen binding fragments and variants of these monoclonal antibodies, hybridoma cell lines capable of producing these antibodies, and kits comprising the monoclonal antibodies of the invention.

本発明の組成物は、高悪性度子宮頸疾患を診断するための方法において使用を提供する
。方法は、少なくとも１つの核バイオマーカーの過剰発現を検出することを含み、ここで
核バイオマーカーの過剰発現が高悪性度子宮頸疾患の指標である。具体的には、方法は、
本発明の抗体を使用して子宮頸試料中のＭＣＭ２の過剰発現を検出することを含む。 The composition of the present invention provides use in a method for diagnosing high grade cervical disease. The method includes detecting overexpression of at least one nuclear biomarker, wherein overexpression of the nuclear biomarker is an indicator of high grade cervical disease. Specifically, the method is
Detecting the overexpression of MCM2 in a cervical sample using the antibodies of the present invention.

本発明の組成物はさらに、ＭＣＭ２モノクローナル抗体に結合することができるエピト
ープを含む、単離されたポリペプチドを含む。これらのポリペプチドは、ＭＣＭ２抗体を
生成するための方法において使用を提供する。ＭＣＭ２エピトープのアミノ酸配列をコー
ドする、単離された核酸分子もまた、提供される。 The composition of the present invention further comprises an isolated polypeptide comprising an epitope capable of binding to the MCM2 monoclonal antibody. These polypeptides provide use in methods for generating MCM2 antibodies. Also provided is an isolated nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of the MCM2 epitope.

高悪性度子宮頸疾患を診断するための組成物および方法が提供される。組成物は、高悪
性度子宮頸疾患において選択的に過剰発現される核バイオマーカータンパク質、具体的に
はＭＣＭタンパク質、より具体的にはＭＣＭ２に結合することができる、モノクローナル
抗体を含む。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた開示さ
れる。本明細書中に記載されるモノクローナル抗体を含むキットが、さらに提供される。
本組成物は、患者における高悪性度子宮頸疾患を診断するための方法において使用を提供
する。 Compositions and methods for diagnosing high-grade cervical disease are provided. The composition comprises a monoclonal antibody that can bind to a nuclear biomarker protein, specifically MCM protein, more specifically MCM2, that is selectively overexpressed in high-grade cervical disease. Also disclosed are hybridoma cell lines that produce the monoclonal antibodies of the invention. Further provided are kits comprising the monoclonal antibodies described herein.
The composition provides use in a method for diagnosing high-grade cervical disease in a patient.

本発明の組成物は、ＭＣＭ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、またはその変異
体もしくは断片を含む。具体的には、２７Ｃ５．６および２６Ｈ６．１９と呼ばれるＭＣ
Ｍ２抗体が提供される。ＭＣＭ２モノクローナル抗体２７Ｃ５．６および２６Ｈ６．１９
を産生するハイブリドーマ細胞株は、２００５年４月１４日に２２０１１０−２２０９、
バージニア州マナッサスのアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）の特許
寄託機関に寄託され、それぞれ特許受託番号ＰＴＡ−６６６８およびＰＴＡ−６６６７を
割り振られた。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペス
ト条約の規定のもと維持される。これらの寄託は、単に当業者の便宜上なされたものであ
り、寄託が３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１２条のもと必要とされることを認めるものではない。 The composition of the invention comprises a monoclonal antibody that specifically binds to MCM2, or a variant or fragment thereof. Specifically, MC called 27C5.6 and 26H6.19
M2 antibodies are provided. MCM2 monoclonal antibodies 27C5.6 and 26H6.19
The hybridoma cell line producing
Deposited at the American Type Culture Collection (ATCC) Patent Depositary in Manassas, Virginia and assigned Patent Deposit Numbers PTA-6668 and PTA-6667, respectively. These deposits will be maintained under the provisions of the Budapest Treaty concerning the international recognition of deposits of microorganisms in patent proceedings. These deposits are merely made for the convenience of those skilled in the art, and the deposits are 35U. S. C. It does not admit that it is required under Article 112.

モノクローナル抗体２７Ｃ５．６、および２６Ｈ６．１９の結合特性を有する抗体もま
た、本明細書中に開示される。かかる抗体としては、これらの抗体との競合的結合アッセ
イにおいて競合する抗体、ならびにモノクローナル抗体２７Ｃ５．６または２６Ｈ６．１
９に結合することができるエピトープに結合する抗体が挙げられるが、これらに限定され
ない。ＭＣＭ２に特異的に結合する能力を保持するモノクローナル抗体２７Ｃ５．６およ
び２６Ｈ６．１９の変異体および断片もまた、提供される。組成物はさらに、本発明のモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株および少なくとも１つの本明細書中に
開示されるモノクローナル抗体を含むキットを含む。 Antibodies having the binding properties of monoclonal antibodies 27C5.6 and 26H6.19 are also disclosed herein. Such antibodies include antibodies that compete in competitive binding assays with these antibodies, as well as monoclonal antibodies 27C5.6 or 26H6.1.
Examples include, but are not limited to, antibodies that bind to epitopes that can bind to 9. Also provided are variants and fragments of monoclonal antibodies 27C5.6 and 26H6.19 that retain the ability to specifically bind to MCM2. The composition further includes a hybridoma cell line that produces a monoclonal antibody of the invention and a kit comprising at least one monoclonal antibody disclosed herein.

「抗体」および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造上の特徴を有する糖タンパク
質である。抗体は抗原に対する結合特異性を示すが、免疫グロブリンとしては、抗体、お
よび抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方が挙げられる。後者の種類のポリペプチドは
、例えば、リンパ系によって低レベルで産生され、骨髄腫によって増大したレベルで産生
される。 “Antibodies” and “immunoglobulins” (Igs) are glycoproteins having the same structural characteristics. While antibodies exhibit binding specificity for an antigen, immunoglobulins include both antibodies and other antibody-like molecules that lack antigen specificity. The latter type of polypeptide is produced, for example, at low levels by the lymphatic system and at increased levels by myeloma.

用語「抗体」および「抗体（複数）」は、天然に生じる形態の抗体ならびに単鎖抗体、
キメラおよびヒト化抗体ならびに多特異的抗体等の組換え抗体、ならびに前述のものの全
ての断片および誘導体を、広範に包含し、この断片および誘導体は、少なくとも抗原結合
部位を有する。抗体誘導体は、抗体に結合したタンパク質または化学的部分を含んでもよ
い。用語「抗体」は、最も広範な意味で使用され、完全に集合した抗体、抗原に結合する
ことができる抗体断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）_２、Ｆｖ、単鎖抗体、二重特異
性抗体）、および前述のものを含む組換えペプチドを包含する。本明細書中で使用される
場合、「ＭＣＭ２抗体」は、ＭＣＭ２（配列番号１）に特異的に結合する任意の抗体、ま
たはその変異体もしくは断片をいい、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗
体、および親抗体の抗原結合機能を保持するその断片を含む。 The terms “antibody” and “antibodies” refer to naturally occurring forms of antibodies as well as single chain antibodies,
Recombinant antibodies such as chimeric and humanized antibodies and multispecific antibodies, and all fragments and derivatives of the foregoing, are broadly encompassed, which fragments and derivatives have at least an antigen binding site. An antibody derivative may comprise a protein or chemical moiety attached to the antibody. The term “antibody” is used in the broadest sense and is a fully assembled antibody, an antibody fragment capable of binding to an antigen (eg, Fab ′, F ′ (ab) ₂ , Fv, single chain antibody, dual chain Specific antibodies), and recombinant peptides including those described above. As used herein, “MCM2 antibody” refers to any antibody that specifically binds to MCM2 (SEQ ID NO: 1), or a variant or fragment thereof, monoclonal antibody, polyclonal antibody, single chain antibody And fragments thereof that retain the antigen-binding function of the parent antibody.

本発明のＭＣＭ２抗体は、最適には、モノクローナル抗体である。用語「モノクローナ
ル抗体」は、本明細書中で使用される場合、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体
をいい、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在する場合がある、可能な天然
に生じる変異を除いて、同一である。 The MCM2 antibody of the present invention is optimally a monoclonal antibody. The term “monoclonal antibody” as used herein refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, ie, the individual antibodies comprising the population may be present in small amounts. , Except for possible naturally occurring mutations.

「天然の抗体」および「天然の免疫グロブリン」は、通常、２つの同一な軽（Ｌ）鎖お
よび２つの同一な重（Ｈ）鎖で構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タン
パク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されるが、ジ
スルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変化する。各重鎖
および軽鎖はまた、規則的に間隔を空けた鎖内のジスルフィド架橋を有する。各重鎖は一
方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続くいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖
は、一方の末端に可変ドメインを有し（Ｖ，）、そのもう一方の末端に定常ドメインを有
する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインとともに整列し、軽鎖可変ドメイ
ンは重鎖の可変ドメインとともに整列する。特定のアミノ酸残基が、軽および重鎖可変ド
メインの間に界面を形成すると考えられている。 “Natural antibodies” and “natural immunoglobulins” are usually heterotetrameric glycoproteins of about 150,000 daltons composed of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. is there. Each light chain is linked to the heavy chain by one covalent disulfide bond, but the number of disulfide bonds varies between heavy chains of different immunoglobulin isotypes. Each heavy and light chain also has regularly spaced intrachain disulfide bridges. Each heavy chain has at one end a variable domain (VH) followed by a number of constant domains. Each light chain has a variable domain at one end (V,) and a constant domain at the other end. The constant domain of the light chain is aligned with the first constant domain of the heavy chain, and the light chain variable domain is aligned with the variable domain of the heavy chain. Certain amino acid residues are thought to form an interface between light and heavy chain variable domains.

用語「可変」は、可変ドメインのある部分が抗体の間で配列が広範囲に異なり、その特
定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性に使用されることをいう。しかしなが
ら、可変性は抗体の可変ドメイン全体で均一に分布しているわけではない。これは、相補
性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つのセグメントまたは軽鎖および重鎖可変ドメインの
両方における超可変領域において濃縮される。可変ドメインの、より高度に保存された部
分は、フレームワーク（ＦＲ）領域と呼ばれる。天然の重および軽鎖の可変ドメインは、
それぞれ４つのＦＲ領域を含み、大部分、３つのＣＤＲによって連結されたｐシート配置
を採用し、これが連結したループを形成し、１５個の、いくつかの場合においては部分的
な、ｐシート構造を形成する。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域によって、他の鎖由来のＣＤ
Ｒとともに近接してともに保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ
ら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ． Ｎｏ．９１−３２４２、Ｉ巻、６４７〜６６９頁（１９９１年
）参照）。 The term “variable” refers to the fact that a portion of the variable domain varies widely in sequence between antibodies and is used for the binding and specificity of each particular antibody to that particular antigen. However, variability is not uniformly distributed throughout the variable domains of antibodies. This is enriched in three segments called complementarity determining regions (CDRs) or hypervariable regions in both the light and heavy chain variable domains. The more highly conserved portions of variable domains are called the framework (FR) region. Natural heavy and light chain variable domains are:
Adopting a p-sheet arrangement, each containing 4 FR regions, mostly connected by 3 CDRs, forming a connected loop, 15 and in some cases partial, p-sheet structures Form. The CDRs in each chain are derived from other chains by the FR region.
Are held together in close proximity to R and contribute to the formation of the antigen binding site of the antibody (Kabat
Et al., NIH Publ. No. 91-3242, volume I, pages 647-669 (1991)).

定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存的細胞毒性におけ
る抗体の関係等の種々のエフェクター機能を示す。 Constant domains are not directly involved in antibody binding to antigen, but exhibit various effector functions such as the relationship of antibodies in antibody-dependent cytotoxicity.

用語「超可変領域」は、本明細書中で使用される場合、抗原結合の原因である抗体のア
ミノ酸残基をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸
残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）お
よび８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５
（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂ
ｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏ
ｆ Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州ベセズダｉ２５［１９９１年］）および／または「超
可変ループ」由来の残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５
０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６３２（Ｈ
１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）、ＣｌｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ
、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１〜９１７頁［１９８７年］）を含む。「
フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書中で考えられる超可変領域残基以外の
可変ドメイン残基である。 The term “hypervariable region” when used herein refers to the amino acid residues of an antibody which are responsible for antigen binding. The hypervariable regions are amino acid residues derived from “complementarity determining regions” or “CDRs” (ie, residues 24-34 (L1), 50-56 (L2) and 89-97 (L3) in the light chain variable domain. ) As well as 31-35 (H1), 50-65 in the heavy chain variable domain
(H2) and 95-102 (H3), Kabat et al., Sequences of Pr
oteins of Immunological Internet, 5th edition, Pub
lic Health Service, National Institute o
f Health, Bethesda, MD, i25 [1991]) and / or residues from the “hypervariable loop” (ie residues 26-32 (L1), 5 in the light chain variable domain), 5
0-52 (L2) and 91-96 (L3) and 2632 in the heavy chain variable domain (H
1) 53-55 (H2) and 96-101 (H3), Clothia and Lesk
, J .; Mol. Biol. 196: 901-917 [1987]). "
“Framework” or “FR” residues are those variable domain residues other than the hypervariable region residues contemplated herein.

「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合ま
たは可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およ
びＦｖ断片；二重特異性抗体；直鎖状抗体（Ｚａｐａｔａら（１９９５年）Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｅｎｇ．８（１０）巻：１０５７〜１０６２頁）；単鎖抗体分子；ならびに抗体断片
から形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化によって、それぞれ単
一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一な抗原結合断片、および
容易に結晶化することができることを名前が反映している、残りの「Ｆｃ」断片が生成さ
れる。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋するこ
とができる、Ｆ（ａｂ’）２断片が生じる。 “Antibody fragments” comprise a portion of an intact antibody, preferably the antigen binding or variable region of the intact antibody. Examples of antibody fragments include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, and Fv fragments; bispecific antibodies; linear antibodies (Zapata et al. (1995) Protei
n Eng. 8 (10): 1057-1062); single chain antibody molecules; and multispecific antibodies formed from antibody fragments. The papain digestion of the antibody reflects two identical antigen-binding fragments, each called a “Fab” fragment, each with a single antigen-binding site, and the remaining “Fc” that can be easily crystallized. A fragment is generated. Pepsin treatment yields an F (ab ′) 2 fragment that has two antigen binding sites and can still crosslink the antigen.

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体断片である。二重鎖Ｆｖ
種において、この領域は、堅く非共有結合した、１つの重および１つの軽鎖可変ドメイン
の二量体からなる。単鎖Ｆｖ種において、軽鎖および重鎖が、二重鎖Ｆｖ種のものと類似
した「二量体」構造で結合することができるように、柔軟なペプチドリンカーによって１
つの重および１つの軽鎖可変ドメインを共有結合することができる。各可変ドメインの３
つのＣＤＲが相互作用してＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌ二量体の表面上の抗原結合部位を定義付けるのは、
この配置中である。集合的に、６つのＣＤＲによって抗原結合特異性が抗体に付与される
。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的なＣＤＲを３つしか含
まないＦｖの半分）であっても、完全な結合部位より親和性は低いが、抗原を認識して抗
原に結合する能力を有する。 “Fv” is the minimum antibody fragment which contains a complete antigen recognition and binding site. Double chain Fv
In species, this region consists of a dimer of one heavy and one light chain variable domain tightly and non-covalently linked. In a single chain Fv species, a flexible peptide linker allows the light and heavy chains to be joined in a “dimer” structure similar to that of the double chain Fv species.
One heavy and one light chain variable domain can be covalently linked. 3 for each variable domain
The two CDRs interact to define the antigen binding site on the surface of the V _H -V _L dimer,
This arrangement is in progress. Collectively, six CDRs confer antigen binding specificity to the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv containing only three CDRs specific for the antigen) has a lower affinity than the complete binding site, but recognizes the antigen and Has the ability to bind.

Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一の定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１）を
含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含む重鎖Ｃ_Ｈ
１ドメインのカルボキシ末端でのいくつかの残基の追加によって、Ｆａｂ’断片と異なる
。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書中では、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離
チオール基を担持するＦａｂ’の名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、間にヒ
ンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。 The Fab fragment also contains the constant domain of the light chain and the first constant domain (C _H 1) of the heavy chain. The Fab fragment is a heavy chain C _H containing one or more cysteines from the antibody hinge region.
It differs from the Fab ′ fragment by the addition of several residues at the carboxy terminus of one domain. Fab′-SH is the name of Fab ′ herein where the cysteine residue (s) of the constant domain carry a free thiol group. F (ab ′) 2 antibody fragments originally were produced as pairs of Fab ′ fragments which have hinge cysteines between them.

ＭＣＭ２抗体の断片は、それらが全長抗体の所望の親和性を保持する限りは、本発明に
よって包含される。したがって、例えば、ＭＣＭ２抗体の断片は、ＭＣＭ２抗原に結合す
る能力を保持する。かかる断片は、対応する全長抗体と同様の特性によって特徴付けられ
、すなわち、断片は、ＭＣＭ２に特異的に結合する。かかる断片は、本明細書中で、「抗
原結合」断片と呼ばれる。 Fragments of MCM2 antibodies are encompassed by the present invention so long as they retain the desired affinity of the full length antibody. Thus, for example, a fragment of an MCM2 antibody retains the ability to bind to an MCM2 antigen. Such a fragment is characterized by properties similar to the corresponding full-length antibody, ie the fragment specifically binds to MCM2. Such fragments are referred to herein as “antigen-binding” fragments.

抗体の、適した抗原結合断片は、全長抗体の一部、一般にはその抗原結合または可変領
域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖ断片ならびに単
鎖抗体分子が挙げられるが、これらに限定されない。「Ｆａｂ」によって、軽鎖、および
重鎖の一部で構成される、免疫グロブリンの一価抗原結合断片が意図される。Ｆ（ａｂ’
）_２によって、両方の軽鎖、および両方の重鎖の一部を含む、免疫グロブリンの二価抗原
結合断片が意図される。「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片によって、抗体のＶ_Ｈお
よびＶ_Ｌドメインを含む断片が意図され、ここでこれらのドメインは、単一のポリペプチ
ド鎖中に存在する。例えば、参照によって本明細書中に援用される、米国特許第４９４６
７７８号、第５２６０２０３号、第５４５５０３０号、および第５８５６４５６号を参照
のこと。一般に、Ｆｖポリペプチドはさらに、抗原結合のためのｓＦｖの所望の構造の形
成を可能にする、Ｖ_ＨとＶ_Ｌドメインとの間のポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖの総
説については、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編（Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク州）、２６９〜３１５頁中のＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９
９４年）を参照のこと。 Suitable antigen binding fragments of an antibody include a portion of a full length antibody, generally the antigen binding or variable region thereof. Examples of antibody fragments include, but are not limited to, Fab, F (ab ′) ₂ , and Fv fragments and single chain antibody molecules. By “Fab” is intended a monovalent antigen-binding fragment of an immunoglobulin that is composed of a light chain and part of a heavy chain. F (ab '
) By ₂ is intended a bivalent antigen-binding fragment of an immunoglobulin that contains both light chains and part of both heavy chains. By “single chain Fv” or “sFv” antibody fragment is intended a fragment comprising the V _H and V _L domains of an antibody, wherein these domains are present in a single polypeptide chain. For example, US Pat. No. 4,946, incorporated herein by reference.
778, 5260203, 5455030, and 5856456. In general, the Fv polypeptide further comprises a polypeptide linker between the _VH and _VL domains that allows formation of the desired structure of the sFv for antigen binding. For a review of sFv, see The Pharmacology of Monoclonal An
tibodies, volume 113, edited by Rosenburg and Moore (Springe)
r-Verlag, New York) Pluckthun (19), pages 269-315
94).

抗体または抗体断片は、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ３
４８巻：５５２〜５５４頁（１９９０年）および米国特許第５５１４５４８号に記載され
ている技術を用いて生じた抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａ
ｃｋｓｏｎら（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ３５２巻：６２４〜６２８頁およびＭａｒｋｓ
ら（１９９１年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２２２巻：５８１〜５９７頁は、それぞれ
ファージライブラリーを使用する、ネズミおよびヒト抗体の単離を記載している。その後
の刊行物は、チェーンシャフリング（Ｍａｒｋｓら（１９９２年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ１０巻：７７９〜７８３頁）、ならびに非常に大きなファージライブラリーを構
築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびｉｎ ｖｉｖｏ組換え（Ｗａｔｅ
ｒｈｏｕｓｅら（１９９３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１巻：２２６
５〜２２６６頁）による高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の生成を記載している。したがっ
て、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハ
イブリドーマ技術に対する、実現性のある代案である。 Antibodies or antibody fragments are described, for example, in McCafferty et al. (1990) Nature 3
48: 552-554 (1990) and can be isolated from antibody phage libraries generated using the techniques described in US Pat. No. 5,514,548. Cla
ckson et al. (1991) Nature 352: 624-628 and Marks.
(1991) J. Am. Mol. Biol. 222: 581-597 describe the isolation of murine and human antibodies using phage libraries, respectively. Later publications include chain shuffling (Marks et al. (1992) Bio / Techno.
log 10: 779-783), and combinatorial infection and in vivo recombination (Wate as strategies for constructing very large phage libraries)
rhouse et al. (1993) Nucleic. Acids Res. Volume 21: 226
Describes the production of high affinity (nM range) human antibodies. These techniques are therefore viable alternatives to traditional monoclonal antibody hybridoma technology for the isolation of monoclonal antibodies.

抗体断片の生成のために、種々の技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は
、インタクトな抗体のタンパク質分解消化によって導かれた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ
ら（１９９２年）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ２４巻：１０７〜１１７頁（１９９２年）およびＢｒｅｎ
ｎａｎら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９巻：８１頁参照）。しかしながら、これら
の断片は、現在、組換え宿主細胞によって直接生成することができる。例えば、抗体断片
は、上述の抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−
ＳＨ断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収し、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）
_２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ１０巻：１６３〜１６７頁）。別の手法によると、Ｆ（ａｂ’）_２断片は、組換え
宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片の生成のための他の技術は、当
業者に明らかになろう。 Various techniques have been developed for the production of antibody fragments. Traditionally, these fragments were derived by proteolytic digestion of intact antibodies (eg, Morimoto).
(1992) Journal of Biochemical and Bioph.
ysical Methods 24: 107-117 (1992) and Bren
nan et al. (1985) Science 229: 81). However, these fragments can now be produced directly by recombinant host cells. For example, antibody fragments can be isolated from the antibody phage libraries described above. Alternatively, Fab′−
SH fragments are recovered directly from E. coli and chemically coupled to F (ab ′).
_Two fragments can be formed (Carter et al. (1992) Bio / Technol
ogy10: 163-167). According to another approach, F (ab ′) ₂ fragments can be isolated directly from recombinant host cell culture. Other techniques for the production of antibody fragments will be apparent to those skilled in the art.

好ましくは、本発明の抗体は、性質がモノクローナルである。上で示したように、「モ
ノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を意図し、すなわち
、集団を構成する個々の抗体は、少量存在する場合がある、可能性な天然に生じる変異を
除いて同一である。用語は、抗体の種または供給源に関して限定されない。用語は、免疫
グロブリン全体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および抗体の抗原結合機能を
保持する他のもの等の断片を包含する。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単
一の抗原性部位、すなわち、本明細書中で下記に定義されるようなＭＣＭ２タンパク質内
の特定のエピトープを対象とする。さらに、異なる決定基（エピトープ）を対象とする異
なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物と対照的に、各モノクロー
ナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。装飾成句「モノクローナル」は、実質
的に均質な抗体の集団から得られるような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗
体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモ
ノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ２５６巻：４９５頁に
最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製されてもよく、または組換えＤＮＡ方
法によって作製されてもよい（例えば、米国特許第４８１６５６７号参照）。「モノクロ
ーナル抗体」はまた、例えばＣｌａｃｋｓｏｎら（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ３５２巻：
６２４〜６２８頁、Ｍａｒｋｓら（１９９１年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２２２巻：
５８１〜５９７頁、および米国特許第５５１４５４８号に記載されている技術を用いて、
ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。 Preferably, the antibodies of the present invention are monoclonal in nature. As indicated above, “monoclonal antibody” intends an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, ie, the individual antibodies that make up the population may be present in small amounts. Except for naturally occurring mutations. The term is not limited regarding the species or source of the antibody. The term encompasses whole immunoglobulins and fragments such as Fab, F (ab ′) 2, Fv, and others that retain the antigen-binding function of the antibody. Monoclonal antibodies are highly specific and are directed to a single antigenic site, ie, a specific epitope within the MCM2 protein as defined herein below. Furthermore, in contrast to conventional (polyclonal) antibody preparations that typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen. The decorative phrase “monoclonal” indicates the character of the antibody as obtained from a population of substantially homogeneous antibodies and should not be construed as requiring production of the antibody by any particular method. For example, monoclonal antibodies used in accordance with the present invention may be made by the hybridoma method first described in Kohler et al. (1975) Nature 256: 495, or may be made by recombinant DNA methods ( For example, see US Pat. No. 4,816,567). “Monoclonal antibodies” can also be described, for example, by Clackson et al. (1991) Nature 352:
624-628, Marks et al. (1991) J. MoI. Mol. Biol. Volume 222:
Using the techniques described in pages 581-597 and US Pat. No. 5,514,548,
It may be isolated from a phage antibody library.

モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ２５６巻：４９５
〜４９６頁の方法、またはその改変を用いて、調製することができる。典型的には、抗原
を含む溶液でマウスを免疫化する。免疫化は、生理食塩水中の、好ましくはフロイント完
全アジュバント等のアジュバント中の、抗原含有溶液を混合または乳化すること、および
混合物または乳濁液を非経口的に注入することによって、行うことができる。当該分野で
公知の任意の免疫化の方法を用いて、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。
動物の免疫化の後、脾臓（および場合により、いくつかの大きいリンパ節）を取り除き、
単一の細胞に解離させる。細胞懸濁液を、目的の抗原でコーティングしたプレートまたは
ウェルに適用することによって、脾臓細胞をスクリーニングしてもよい。抗原に特異的な
膜結合免疫グロブリンを発現しているＢ細胞（すなわち、抗体産生細胞）はプレートに結
合し、洗い落とされない。次いで、得られたＢ細胞、または全ての解離した脾臓細胞を、
骨髄腫細胞と融合してモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを形成するよう誘導し、選
択培地中で培養する。得られた細胞を段階希釈によって播種し、目的の抗原に特異的に結
合する（かつ関連のない抗原に結合しない）抗体の生成についてアッセイする。次いで、
選択されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）分泌ハイブリドーマを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例
えば、組織培養瓶または中空繊維リアクター中）、またはｉｎ ｖｉｖｏ（マウスにおけ
る腹水として）のいずれかで培養する。モノクローナル抗体はまた、反復免疫化多重部位
技術（ＲＩＭＭＳ）を用いて生成することができる。例えば、その全ての全体が参照によ
って本明細書中に援用される、Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋら（１９９７年）Ｈｙｂｒｉｄｏｍ
ａ１６（４）巻：３８１〜３８９頁、Ｗｒｉｎｇら（１９９９年）Ｊ． Ｐｈａｒｍ．
Ｂｉｏｍｅｄ． Ａｎａｌ．１９（５）巻：６９５〜７０７頁、およびＢｙｎｕｍら（１
９９９年）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１８（５）巻：４０７〜４１１頁を参照のこと。 Monoclonal antibodies are described in Kohler et al. (1975) Nature 256: 495.
Can be prepared using the methods on page -496, or modifications thereof. Typically, mice are immunized with a solution containing the antigen. Immunization can be performed by mixing or emulsifying the antigen-containing solution in saline, preferably in an adjuvant such as Freund's complete adjuvant, and injecting the mixture or emulsion parenterally. . The monoclonal antibodies of the present invention can be obtained using any immunization method known in the art.
After immunization of the animal, remove the spleen (and possibly some large lymph nodes)
Dissociate into single cells. Spleen cells may be screened by applying the cell suspension to a plate or well coated with the antigen of interest. B cells expressing membrane-bound immunoglobulin specific for the antigen (ie, antibody producing cells) bind to the plate and are not washed away. The resulting B cells, or all dissociated spleen cells, are then
They are induced to fuse with myeloma cells to form monoclonal antibody-producing hybridomas and cultured in selective media. The resulting cells are seeded by serial dilution and assayed for the production of antibodies that specifically bind to the antigen of interest (and do not bind to unrelated antigens). Then
Selected monoclonal antibody (mAb) secreting hybridomas are cultured either in vitro (eg, in tissue culture bottles or hollow fiber reactors) or in vivo (as ascites in mice). Monoclonal antibodies can also be generated using repeated immunization multi-site technology (RIMMS). For example, Kilpatrick et al. (1997) Hybridom, which is incorporated herein by reference in its entirety.
a16 (4): 381-389, Wring et al. (1999) J. MoI. Pharm.
Biomed. Anal. 19 (5): 695-707, and Bynum et al. (1
999) Hybridoma 18 (5): 407-411.

ハイブリドーマの使用の代案として、参照によって本明細書中に援用される米国特許第
５５４５４０３号、第５５４５４０５号、および第５９９８１４４号に開示されているよ
うに、ＣＨＯ細胞株等の細胞株において抗体を生成することができる。簡潔に述べると、
それぞれ軽鎖および重鎖を発現することができるベクターで細胞株をトランスフェクトす
る。別々のベクター上の２つのタンパク質をトランスフェクトすることによって、キメラ
抗体を生成することができる。別の利点は、抗体の正しいグリコシル化である。モノクロ
ーナル抗体はまた、バイオマーカータンパク質で組換えコンビナトリアル免疫グロブリン
ライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングし、
それによって、バイオマーカータンパク質に結合する免疫グロブリンライブラリーメンバ
ーを単離することによって、同定および単離することができる。ファージディスプレイラ
イブラリーを生成およびスクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔ
ｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１、およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡ
Ｐ（商標）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２）。また、
抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングにおける使用について特に影
響を受けやすい方法および試薬の例は、例えば、米国特許第５２２３４０９号、ＰＣＴ公
開第ＷＯ９２／１８６１９号、第ＷＯ９１／１７２７１号、第ＷＯ９２／２０７９１号、
第ＷＯ９２／１５６７９号、第ＷＯ９３／０１２８８号、第ＷＯ９２／０１０４７号、第
９２／０９６９０号、および第９０／０２８０９号、Ｆｕｃｈｓら（１９９１年）Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９巻：１３７０〜１３７２頁、Ｈａｙら（１９９２年）Ｈｕｍ．
Ａｎｔｉｂｏｄ． Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ３巻：８１〜８５頁、Ｈｕｓｅら（１９８９
年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６巻：１２７５〜１２８１頁、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３
年）ＥＭＢＯ Ｊ．１２巻：７２５〜７３４頁に見ることができる。 As an alternative to the use of hybridomas, antibodies are generated in cell lines such as CHO cell lines as disclosed in US Pat. Nos. 5,545,403, 5,545,405, and 5,998,144, which are incorporated herein by reference. can do. Simply put,
The cell line is transfected with a vector capable of expressing the light and heavy chains, respectively. Chimeric antibodies can be generated by transfecting two proteins on separate vectors. Another advantage is the correct glycosylation of the antibody. Monoclonal antibodies also screen a recombinant combinatorial immunoglobulin library (eg, an antibody phage display library) with a biomarker protein;
Thereby, it can be identified and isolated by isolating immunoglobulin library members that bind to the biomarker protein. Kits for generating and screening phage display libraries are commercially available (eg, P
harmacia Recombinant Page Antibody System
em, catalog number 27-9400-01, and Stratagene SurfZA
P ™ Page Display Kit, catalog number 240612). Also,
Examples of methods and reagents that are particularly sensitive for use in generating and screening antibody display libraries are described, for example, in US Pat. No. 5,223,409, PCT Publication Nos. WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791. ,
WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, 92/09690, and 90/02809, Fuchs et al. (1991) Bio.
/ Technology 9: 1370-1372, Hay et al. (1992) Hum.
Antibody. Hybridomas 3: 81-85, Huse et al. (1989)
Science 246: 1275-1281, Griffiths et al. (1993).
Year) EMBO J.M. 12: 725-734.

本発明のいくつかの態様において、抗体は、組織学的ではなく細胞学的試料の望ましい
染色に基づいて選択してもよい。すなわち、特定の実施形態において、抗体は、最終的な
試料型（例えば、細胞学調製物）を考慮して、結合特異性について選択される。ＭＣＭ２
等の、目的の特定のバイオマーカーを対象とする抗体を選択し、複数工程のスクリーニン
グプロセスによって精製する。抗体選択のためのかかる方法は、その全体が参照によって
本明細書中に援用される、２００５年３月２３日に提出された、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎ
ｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｖ
ｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ」と題された係属中の米国出願第１１／０８７２２７号に記載
されている。 In some embodiments of the invention, antibodies may be selected based on the desired staining of the cytological sample rather than histological. That is, in certain embodiments, antibodies are selected for binding specificity in view of the final sample type (eg, cytological preparation). MCM2
Antibodies directed to a specific biomarker of interest such as are selected and purified by a multi-step screening process. Such a method for antibody selection is described in "Methods an" filed Mar. 23, 2005, which is incorporated herein by reference in its entirety.
d Compositions for the Detection of Cerv
described in pending US application Ser. No. 11/087227 entitled “ical Disease”.

本発明のモノクローナル抗体の結合特性を有する抗体もまた提供される。「結合特性」
または「結合特異性」は、抗体に関して使用される場合、抗体が比較抗体と同じまたは同
様の抗原エピトープを認識することを意味する。かかる抗体の例としては、例えば、競合
的結合アッセイにおいて本発明のモノクローナル抗体と競合する抗体が挙げられる。当業
者は、標準的な方法を用いて、抗体が競合的に別の抗体を妨げるかどうかを判定すること
ができる。 Antibodies having the binding properties of the monoclonal antibodies of the invention are also provided. "Bonding properties"
Or “binding specificity”, when used in reference to an antibody, means that the antibody recognizes the same or similar antigenic epitope as the comparative antibody. Examples of such antibodies include, for example, antibodies that compete with the monoclonal antibodies of the invention in a competitive binding assay. One skilled in the art can determine whether an antibody competitively interferes with another antibody using standard methods.

「エピトープ」によって、それに対して抗体が生成され、それに対して抗体が結合する
、抗原分子の部分が意図される。「ＭＣＭ２エピトープ」は、ＭＣＭ２タンパク質の、Ｍ
ＣＭ２モノクローナル抗体が結合する部分を含む。エピトープは、直鎖状アミノ酸残基（
すなわち、エピトープ内の残基は直鎖状の様式で次々に連続して配置される）、非直鎖状
アミノ酸残基（本明細書中では「非直鎖状エピトープ」と呼ぶ。これらのエピトープは連
続して配置されない）、または直鎖状および非直鎖状アミノ酸残基の両方を含むことがあ
る。典型的には、エピトープは、短いアミノ酸配列、例えば長さ約５アミノ酸である。エ
ピトープを同定するための体系的な技術は当該分野で公知であり、例えば、米国特許第４
７０８８７１号中、および下記の実施例に記載されている。簡潔に述べると、ある方法に
おいて、抗原由来の１組の重複しているオリゴペプチドを合成し、各ピンに特有のオリゴ
ペプチドを有するピンの固相配列に結合させる。ピンの配列は、例えばバイオマーカー特
異的モノクローナル抗体に対する結合について、全ての９６種のオリゴペプチドを同時に
アッセイすることができる、９６ウェルマイクロタイタープレートを含んでもよい。ある
いは、ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏＬａｂｓ）が、現在、エピトープマッピングのために市販されている。これらの方法
を用いて、所定の抗体が結合するエピトープを同定するために、あらゆる可能な連続した
アミノ酸のサブセットに対する結合親和性を判定してもよい。エピトープはまた、エピト
ープ長ペプチド配列を使用して、抗体を得る動物を免疫化する場合、推論によって同定し
てもよい。 By “epitope” is intended the portion of an antigen molecule against which an antibody is generated and to which an antibody binds. “MCM2 epitope” is the MCM2 protein M
Includes a portion to which the CM2 monoclonal antibody binds. An epitope is a linear amino acid residue (
That is, residues within an epitope are arranged one after the other in a linear fashion, non-linear amino acid residues (referred to herein as “non-linear epitopes.” These epitopes May not be arranged sequentially), or may contain both linear and non-linear amino acid residues. Typically, an epitope is a short amino acid sequence, eg, about 5 amino acids in length. Systematic techniques for identifying epitopes are known in the art, eg, US Pat.
708871 and in the examples below. Briefly, in one method, a set of overlapping oligopeptides from an antigen are synthesized and bound to a solid phase sequence of pins with a unique oligopeptide for each pin. The array of pins may include a 96 well microtiter plate that can assay all 96 oligopeptides simultaneously for binding to, for example, a biomarker specific monoclonal antibody. Alternatively, phage display peptide library kit (New England B
ioLabs) is currently marketed for epitope mapping. Using these methods, the binding affinity for any possible contiguous subset of amino acids may be determined in order to identify the epitope to which a given antibody binds. Epitopes may also be identified by inference when epitope length peptide sequences are used to immunize animals from which antibodies are obtained.

本発明はまた、ＭＣＭ２モノクローナル抗体を結合するためのエピトープを含む、単離
されたポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドは、モノクローナル抗体に結合す
る抗原（すなわち、ＭＣＭ２）の一部に対応する。かかるポリペプチドは、ＭＣＭ２に選
択的に結合する抗体を生成するための方法において使用を提供する。抗体の生成において
ポリペプチドを使用できるかどうかは、本明細書中で「抗原活性」と呼ばれる。例えば、
配列番号３、４、および１４に示されるアミノ酸配列（配列番号１に示されるＭＣＭ２ア
ミノ酸配列中の、それぞれ残基３６９〜３８２、６８８〜７１０、および６８３〜６９２
に対応する）は、ＭＣＭ２モノクローナル抗体、より具体的にはモノクローナル抗体２７
Ｃ５．６および２６Ｈ６．１９によって認識される、エピトープを含む。詳細については
実施例４を参照のこと。元々のポリペプチドの抗原活性を保持する配列番号３、４、およ
び１４に示されるＭＣＭ２エピトープ配列の変異体および断片もまた、提供される。本発
明はさらに、ＭＣＭ２エピトープを含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子
、ならびにその変異体および断片を含む。 The invention also encompasses an isolated polypeptide comprising an epitope for binding the MCM2 monoclonal antibody. These polypeptides correspond to the portion of the antigen that binds to the monoclonal antibody (ie, MCM2). Such polypeptides provide use in methods for generating antibodies that selectively bind to MCM2. The ability to use a polypeptide in the production of antibodies is referred to herein as “antigenic activity”. For example,
The amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3, 4, and 14 (residues 369-382, 688-710, and 683-692 in the MCM2 amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, respectively)
Corresponds to MCM2 monoclonal antibody, more specifically monoclonal antibody 27
Contains epitopes recognized by C5.6 and 26H6.19. See Example 4 for details. Variants and fragments of the MCM2 epitope sequences shown in SEQ ID NOs: 3, 4, and 14 that retain the antigenic activity of the original polypeptide are also provided. The invention further includes isolated nucleic acid molecules that encode polypeptides comprising the MCM2 epitope, and variants and fragments thereof.

ＭＣＭ２エピトープを含む本発明のポリペプチドは、本明細書中で上述されたように、
ＭＣＭ２に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するための方法において使用する
ことができる。かかるポリペプチドはまた、ポリクローナルＭＣＭ２抗体の生成において
使用することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、ＭＣＭ２エピトープ（すなわち
、免疫原）を含むポリペプチドで、適した対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、または
他の哺乳動物）を免疫化することによって調製することができる。免疫化した対象中の抗
体力価は、固定したバイオマーカータンパク質を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
を用いる等の標準的な技術によって、経時的にモニタリングすることができる。免疫化の
後の適当な時点、例えば抗体力価が最も高いときに、対象から抗体産生細胞を得て、Ｋｏ
ｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ２５６巻：４９５〜４９７
頁によって元々記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚ
ｂｏｒら（１９８３年）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ４巻：７２頁）、ＥＢＶハイブリ
ドーマ技術（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ、ＲｅｉｓｆｅｌｄおよびＳｅｌｌ編（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎ
ｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク）、７７〜９６頁中のＣｏｌｅら（１９８５年））ま
たはトリオーマ技術等の標準的な技術によって、使用してモノクローナル抗体を調製する
ことができる。ハイブリドーマを生成するための技術は周知である（一般に、Ｃｏｌｉｇ
ａｎら編（１９９４年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク
）、Ｇａｌｆｒｅら（１９７７年）Ｎａｔｕｒｅ２６６巻：５５０５２頁、Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．、
ニューヨーク州中のＫｅｎｎｅｔｈ（１９８０年）、およびＬｅｒｎｅｒ（１９８１年）
Ｙａｌｅ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．、５４巻：３８７〜４０２頁参照）。 A polypeptide of the invention comprising an MCM2 epitope, as described herein above,
It can be used in a method for generating monoclonal antibodies that specifically bind to MCM2. Such polypeptides can also be used in the production of polyclonal MCM2 antibodies. For example, polyclonal antibodies can be prepared by immunizing a suitable subject (eg, rabbit, goat, mouse, or other mammal) with a polypeptide comprising an MCM2 epitope (ie, an immunogen). The antibody titer in the immunized subject is determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using immobilized biomarker protein.
Can be monitored over time by standard techniques such as Obtaining antibody-producing cells from the subject at an appropriate time after immunization, eg, when the antibody titer is highest,
hler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497.
Hybridoma technology originally described by page, human B cell hybridoma technology (Koz
Bor et al. (1983) Immunol. Today 4: 72), EBV hybridoma technology (Monoclonal Antibodies and Cancer T)
edited by herapi, Reisfeld and Sell (Alan R. Liss, In
c. (New York, NY), Cole et al. (1985) in pages 77-96) or by standard techniques such as trioma technology can be used to prepare monoclonal antibodies. Techniques for generating hybridomas are well known (in general, Collig
an et al. (1994) Current Protocols in Immunolo
gy (John Wiley & Sons, Inc., New York, NY), Galfred et al. (1977) Nature 266: 55052, Monocl.
onal Antibodies: A New Dimension In Biol
official Analyzes (Plenum Publishing Corp.,
Kenneth (1980) and Lerner (1981) throughout New York
Yale J.J. Biol. Med. 54: 387-402).

モノクローナル抗体のアミノ酸配列変異体または本明細書中に記載されるＭＣＭ２エピ
トープを含むポリペプチドもまた、本発明に包含される。変異体は、目的の抗体をコード
するクローニングされたＤＮＡ配列中の変異によって調製することができる。変異誘発お
よびヌクレオチド配列変化の方法は、当該分野で周知である。例えば、参照によって本明
細書中に援用される、ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３年）Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌｉａｎ Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク）、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５年）Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８２巻：４８８〜４９２頁、Ｋｕｎｋ
ｅｌら（１９８７年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４巻：３６７〜３８２頁、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク
）、米国特許第４８７３１９２号、およびそこで引用されている参考文献を参照のこと。
目的のポリペプチドの生物学的活性に影響を及ぼさない、適当なアミノ酸置換基に関する
手引きは、参照によって本明細書中に援用される、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅｓ
． Ｆｏｕｎｄ．、ワシントン，Ｄ．Ｃ．）中のＤａｙｈｏｆｆら（１９７８年）のモデ
ルに見ることができる。あるアミノ酸を、同様の特性を有する別のアミノ酸と交換するこ
と等の、保存的置換が、好ましい場合がある。保存的置換の例としては、 Also encompassed by the invention are amino acid sequence variants of the monoclonal antibody or polypeptides comprising the MCM2 epitope described herein. Variants can be prepared by mutations in the cloned DNA sequence encoding the antibody of interest. Methods for mutagenesis and nucleotide sequence changes are well known in the art. For example, Walker and Gaastra (1983) Techni, which is incorporated herein by reference.
ques in Molecular Biology (Mac Millian Pub
listing Company, New York), Kunkel (1985) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492, Kunk
el et al. (1987) Methods Enzymol. 154: 367-382,
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Lab
See the Manual Manual (Cold Spring Harbor, New York), US Pat. No. 4,873,192, and references cited therein.
For guidance on suitable amino acid substituents that do not affect the biological activity of the polypeptide of interest, see Atlas of Protein, which is incorporated herein by reference.
Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res)
. Found. Washington, D .; C. ) In the model of Dayhoff et al. (1978). Conservative substitutions may be preferred, such as replacing one amino acid with another having similar properties. Examples of conservative substitutions are

が挙げられるが、これらに限定されない。

However, it is not limited to these.

目的のポリペプチドの変異体の構築において、変異体が所望の活性、すなわちバイオマ
ーカーに対する同様の結合親和性を有し続けるように、修飾が行われる。明らかに、変異
体ポリペプチドをコードするＤＮＡ中で行われる任意の変異は、配列をリーディングフレ
ームの外に配置してはならず、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を生じる可能性のある相補
領域を生じない。欧州特許出願公開第７５４４４号を参照のこと。 In the construction of a variant of the polypeptide of interest, modifications are made so that the variant continues to have the desired activity, ie, similar binding affinity for the biomarker. Obviously, any mutations made in the DNA encoding the mutant polypeptide should not place the sequence out of the reading frame, and preferably will contain complementary regions that may result in secondary mRNA structure. Does not occur. See European Patent Application Publication No. 75444.

好ましくは、参照ポリペプチドの変異体は、参照抗体分子のアミノ酸配列に対して、ま
たは参照抗体分子の、より短い部分に対して、少なくとも７０％または７５％配列同一性
、好ましくは少なくとも８０％または８５％配列同一性、より好ましくは少なくとも９０
％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を有
する。より好ましくは、分子は、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％配列同
一性を共有する。本発明の目的のために、同一率は、ギャップ開始ペナルティが１２、ギ
ャップ延長ペナルティが２、ＢＬＯＳＵＭ行列が６２のアフィンギャップ検索を用いた、
Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを用いて判定される。Ｓｍｉｔｈ
−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１
９８１年）Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．２巻：４８２〜４８９頁に教示されている
。変異体は、例えば、１〜１５個のわずかなアミノ酸残基、６〜１０個等の１〜１０個の
少ないアミノ酸残基、わずか５つ、わずか４、３、２、またはさらには１つのアミノ酸残
基だけ、参照抗体と異なる場合がある。 Preferably, variants of the reference polypeptide are at least 70% or 75% sequence identity, preferably at least 80% or to the amino acid sequence of the reference antibody molecule, or to a shorter portion of the reference antibody molecule. 85% sequence identity, more preferably at least 90
It has an amino acid sequence with%, 91%, 92%, 93%, 94% or 95% sequence identity. More preferably, the molecules share at least 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity. For the purposes of the present invention, the same rate used an affine gap search with a gap opening penalty of 12, a gap extension penalty of 2, and a BLOSUM matrix of 62.
Determined using the Smith-Waterman homology search algorithm. Smith
-Waterman homology search algorithm is Smith and Waterman (1
981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489. Variants are, for example, 1-15 few amino acid residues, 1-10 fewer amino acid residues, such as 6-10, only 5, only 4, 3, 2, or even one amino acid Only residues may differ from the reference antibody.

２つのアミノ酸配列の最適な整列に関して、変異体アミノ酸配列の連続したセグメント
は、参照アミノ酸配列に関して、さらなるアミノ酸残基または欠失したアミノ酸残基を有
する場合がある。参照アミノ酸配列との比較のために使用される連続したセグメントは、
少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基を含み、３０、４０、５０個またはそれより多
いアミノ酸残基を含む場合がある。保存的残基置換またはギャップと関連した配列同一性
の補正を行うことができる（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズム参照
）。 For optimal alignment of two amino acid sequences, a contiguous segment of the variant amino acid sequence may have additional or deleted amino acid residues with respect to the reference amino acid sequence. The contiguous segment used for comparison with the reference amino acid sequence is
It contains at least 20 consecutive amino acid residues and may contain 30, 40, 50 or more amino acid residues. Corrections for sequence identity associated with conservative residue substitutions or gaps can be made (see Smith-Waterman homology search algorithm).

本発明のＭＣＭ２モノクローナル抗体は、下記のような検出可能な物質で標識して、試
料中のバイオマーカータンパク質検出を促進してもよい。かかる抗体は、本発明の方法の
実施において使用を提供する。本発明の抗体および抗体断片は、検出可能な物質に結合さ
せて、抗体結合の検出を促進することができる。単語「標識」は、本明細書中で使用され
る場合、「標識」抗体を生じるように抗体に直接または間接的に結合させる、検出可能な
化合物または組成物をいう。標識は、それ自体検出可能（例えば、放射性同位体標識また
は蛍光標識）であるか、または、酵素標識の場合、検出可能である基質化合物もしくは組
成物の化学的変化を触媒してもよい。抗体を標識する目的のための、検出可能な物質の例
としては、種々の酵素、置換基、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質
が挙げられる。適した酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適し
た置換基複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン
が挙げられ、適した蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオ
レセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン
、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例としてはルミノールが
挙げられ、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリ
ンが挙げられ、適した放射性物質の例としては、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、または^３
Ｈが挙げられる。 The MCM2 monoclonal antibody of the present invention may be labeled with a detectable substance as described below to facilitate biomarker protein detection in the sample. Such antibodies provide use in the practice of the methods of the invention. The antibodies and antibody fragments of the invention can be conjugated to a detectable substance to facilitate detection of antibody binding. The word “label” as used herein refers to a detectable compound or composition that is conjugated directly or indirectly to the antibody to yield a “labeled” antibody. The label is itself detectable (eg, a radioisotope label or fluorescent label) or, in the case of an enzyme label, may catalyze a chemical change in the substrate compound or composition that is detectable. Examples of detectable substances for the purpose of labeling antibodies include various enzymes, substituents, fluorescent materials, luminescent materials, bioluminescent materials, and radioactive materials. Examples of suitable enzymes include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, or acetylcholinesterase, and examples of suitable substituent complexes include streptavidin / biotin and avidin / biotin, suitable Examples of fluorescent materials include umbelliferone, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dichlorotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride or phycoerythrin, examples of luminescent materials include luminol, and examples of bioluminescent materials Include luciferase, luciferin, and aequorin, and examples of suitable radioactive materials include ¹²⁵ I, ¹³¹ I, ³⁵ S, or ³
H.

少なくとも１つの本発明のＭＣＭ２モノクローナル抗体を含むキットが、さらに提供さ
れる。「キット」によって、ＭＣＭ２の発現を特異的に検出するための、少なくとも１つ
の試薬、すなわち抗体を含む任意の製造（例えば、包装または容器）が意図される。キッ
トは、本発明の方法を行うための単位として、販売促進、配送、または販売されてもよい
。また、キットは、キットおよびその使用のための方法について記載している包装挿入物
を含んでもよい。 Further provided is a kit comprising at least one MCM2 monoclonal antibody of the invention. By “kit” is intended any manufacture (eg, packaging or container) that includes at least one reagent, ie, an antibody, to specifically detect MCM2 expression. The kit may be promoted, distributed, or sold as a unit for performing the methods of the present invention. The kit may also include a packaging insert describing the kit and methods for its use.

本発明のキットは、一般に、ＭＣＭ２を対象とする少なくとも１つのモノクローナル抗
体、抗体結合の検出のための化学物質、対比染色剤、および、場合により、陽性染色細胞
の同定を促進するための青みづけ剤を含む。本発明にキットにおいて、抗原−抗体結合を
検出する任意の化学物質を使用してもよい。いくつかの実施形態において、検出化学物質
は、二次抗体に結合した標識ポリマーを含む。例えば、抗原−抗体結合部位での色原体の
沈殿を触媒する酵素に結合した二次抗体が提供されてもよい。かかる酵素、および抗体結
合の検出においてそれらを使用するための技術は、当該分野で周知である。一実施形態に
おいて、キットは、ＨＲＰ標識ポリマーに結合した二次抗体を含む。結合した抗体と適合
性のある色原体（例えば、ＨＲＰ標識二次抗体の場合のＤＡＢ）、および非特異的染色を
ブロックするための過酸化水素等の溶液が、さらに提供されてもよい。他の実施形態にお
いて、モノクローナル抗体に結合するマウスプローブ試薬の使用、その後の、マウスプロ
ーブ試薬に結合するＨＲＰに結合したデキストランポリマーの添加によって、バイオマー
カータンパク質への抗体結合が検出される。かかる検出試薬は、例えばＢｉｏｃａｒｅ
Ｍｅｄｉｃａｌから市販されている。 The kits of the invention generally comprise at least one monoclonal antibody directed to MCM2, a chemical for detection of antibody binding, a counterstain, and optionally a bluing to facilitate the identification of positively stained cells. Contains agents. Any chemical that detects antigen-antibody binding may be used in the kit of the present invention. In some embodiments, the detection chemical comprises a labeled polymer attached to a secondary antibody. For example, a secondary antibody conjugated to an enzyme that catalyzes precipitation of a chromogen at an antigen-antibody binding site may be provided. Such enzymes and techniques for using them in detecting antibody binding are well known in the art. In one embodiment, the kit includes a secondary antibody conjugated to an HRP labeled polymer. A chromogen compatible with the bound antibody (eg, DAB in the case of HRP-labeled secondary antibody) and a solution such as hydrogen peroxide to block non-specific staining may further be provided. In other embodiments, antibody binding to the biomarker protein is detected by use of a mouse probe reagent that binds to a monoclonal antibody, followed by the addition of a dextran polymer conjugated to HRP that binds to the mouse probe reagent. Such detection reagents are, for example, Biocare
Commercially available from Medical.

本発明のキットはさらに、ペルオキシダーゼブロッキング試薬（例えば、過酸化水素）
、タンパク質ブロッキング試薬（例えば、精製カゼイン）、および対比染色剤（例えば、
ヘマトキシリン）を含んでもよい。青みづけ剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０およびアジ化
ナトリウムを含む、水酸化アンモニウムまたはＴＢＳ、ｐＨ７．４）が、キット中でさら
に提供されて、陽性染色細胞の検出を促進してもよい。キットはまた、品質管理目的で、
陽性および陰性対照試料を含んでもよい。 The kit of the present invention further comprises a peroxidase blocking reagent (eg, hydrogen peroxide)
, Protein blocking reagents (eg, purified casein), and counterstains (eg,
Hematoxylin). A bluing agent (eg, ammonium hydroxide or TBS, pH 7.4, including Tween-20 and sodium azide) may be further provided in the kit to facilitate detection of positive stained cells. The kit is also for quality control purposes.
Positive and negative control samples may be included.

別の実施形態において、本発明のキットは、２つのＭＣＭ２モノクローナル抗体、より
具体的にはモノクローナル抗体２７Ｃ５．６および２６Ｈ６．１９を含む。２つのＭＣＭ
２モノクローナル抗体およびトポイソメラーゼＩＩα（Ｔｏｐｏ２Ａ）を対象とする第三
の抗体を含むキットがさらに提供される。キット中に複数の抗体が存在する場合、各抗体
は、個々の試薬として、または、あるいは目的の抗体の全てを含む抗体カクテルとして、
提供されてもよい。さらに、キット試薬のいずれかまたは全ては、密閉容器等の、それら
を外部環境から保護する容器内で提供されてもよい。本発明のキットは、高悪性度子宮頸
疾患の診断において有用であり、パプ染色のための試薬（例えば、ＥＡ５０およびオレン
ジＧ）をさらに含んでもよい。 In another embodiment, the kit of the invention comprises two MCM2 monoclonal antibodies, more specifically monoclonal antibodies 27C5.6 and 26H6.19. 2 MCMs
Further provided is a kit comprising two monoclonal antibodies and a third antibody directed to topoisomerase IIα (Topo2A). If multiple antibodies are present in the kit, each antibody is either as an individual reagent or as an antibody cocktail containing all of the antibodies of interest.
May be provided. Further, any or all of the kit reagents may be provided in a container that protects them from the external environment, such as a sealed container. The kit of the present invention is useful in diagnosis of high-grade cervical disease, and may further contain reagents for Papu staining (for example, EA50 and Orange G).

本発明の組成物は、その全体が参照によって本明細書中に援用される、２００５年３月
２３日に提出された、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ」と題された係
属中の米国出願第１１／０８７２２７号に開示されているもの等の患者における高悪性度
子宮頸疾患の診断のための方法において使用を提供する。「高悪性度子宮頸疾患を診断す
る」は、例えば、子宮頸疾患の存在を診断または検出すること、疾患の進行をモニタリン
グすること、および高悪性度子宮頸疾患の指標である細胞または試料を同定または検出す
ることを含むよう意図される。用語、高悪性度子宮頸疾患を診断すること、検出すること
、および同定することは、本明細書中で交換可能に使用される。「高悪性度子宮頸疾患」
によって、膣拡大鏡によって前悪性病状、悪性病状、中程度から深刻な異形成、および子
宮頸癌と分類される状態が意図される。基礎にある高悪性度子宮頸疾患としては、ＣＩＮ
ＩＩ、ＣＩＮＩＩＩ、ＨＳＩＬ、上皮内癌、腺癌、および癌（ＦＩＧＯ Ｉ〜ＩＶ期）の
組織学的同定が挙げられる。 The compositions of the present invention are disclosed in “Methods and Compositions for, filed Mar. 23, 2005, which is incorporated herein by reference in its entirety.
There is provided use in a method for the diagnosis of high-grade cervical disease in a patient such as that disclosed in pending US application Ser. No. 11/087227 entitled “The Detection of Cervical Disease”. “Diagnosing high-grade cervical disease” refers to, for example, diagnosing or detecting the presence of cervical disease, monitoring disease progression, and cells or samples that are indicative of high-grade cervical disease. It is intended to include identifying or detecting. The terms diagnosing, detecting, and identifying high-grade cervical disease are used interchangeably herein. "High-grade cervical disease"
Contemplates conditions classified by the vaginal magnifier as premalignant, malignant, moderate to severe dysplasia, and cervical cancer. The underlying high-grade cervical disease is CIN
Histological identification of II, CINIII, HSIL, carcinoma in situ, adenocarcinoma, and cancer (FIGO stage I-IV).

本発明の方法は、高悪性度子宮頸疾患において選択的に過剰発現される少なくとも１つ
の核バイオマーカーの過剰発現を検出することを含む。「核バイオマーカー」によって、
細胞の核において主に発現されるタンパク質の任意の遺伝子が意図される。核バイオマー
カーは、細胞の他の部分において、より低い程度発現されてもよい。「高悪性度子宮頸疾
患において選択的に過剰発現される」によって、高悪性度子宮頸疾患において目的の核バ
イオマーカーが過剰発現されるが、いかなる異形成、未成熟な化生細胞も存在しないＬＳ
ＩＬ、ＣＩＮＩ、ＨＰＶ感染試料として分類される状態、および臨床的疾患と見なされな
い他の状態においては過剰発現されないことが意図される。したがって、本発明の核バイ
オマーカーの検出によって、基礎にある高悪性度子宮頸疾患の指標である試料の、良性の
増殖、早期ＨＰＶ感染、または軽度の異形成の指標である試料からの区別が可能になる。
特に重要な核バイオマーカーとしては、ＭＣＭタンパク質、特にＭＣＭ２、およびＴｏｐ
ｏ２Ａが挙げられる。 The method of the invention comprises detecting overexpression of at least one nuclear biomarker that is selectively overexpressed in high-grade cervical disease. “Nuclear biomarkers”
Any gene of a protein that is primarily expressed in the nucleus of the cell is contemplated. Nuclear biomarkers may be expressed to a lesser extent in other parts of the cell. “Selectively overexpressed in high-grade cervical disease” overexpresses the target nuclear biomarker in high-grade cervical disease, but does not have any dysplastic, immature metaplastic cells LS
It is intended not to be overexpressed in conditions classified as IL, CINI, HPV infected samples, and other conditions that are not considered clinical diseases. Thus, detection of the nuclear biomarker of the present invention can distinguish a sample that is an indicator of the underlying high-grade cervical disease from a sample that is an indicator of benign growth, early HPV infection, or mild dysplasia. It becomes possible.
Particularly important nuclear biomarkers include MCM proteins, especially MCM2, and Top
o2A.

本発明の特定の態様において、方法は、患者から子宮頸試料を得ること、試料を少なく
とも１つの本発明のＭＣＭ２モノクローナル抗体と接触させること、およびＭＣＭ２への
抗体の結合を検出することを含む。他の実施形態において、試料を、ＭＣＭ２に特異的に
結合する少なくとも２つのモノクローナル抗体、具体的にはモノクローナル抗体２７Ｃ５
．６および２６Ｈ６．１９と接触させる。さらなる実施形態において、試料を、これらの
２つのＭＣＭ２モノクローナル抗体、およびＴｏｐｏ２Ａに特異的に結合する第三の抗体
と接触させる。抗体結合を検出するための技術は、当該分野で周知である。目的のバイオ
マーカーへの抗体結合は、抗体結合のレベル、およびしたがって、バイオマーカータンパ
ク質発現のレベルに対応する、検出可能なシグナルを発生する、化学的試薬の使用によっ
て検出してもよい。抗体−抗原結合を検出するための任意の方法を用いて、本発明の方法
を行ってもよい。 In certain embodiments of the invention, the method comprises obtaining a cervical sample from a patient, contacting the sample with at least one MCM2 monoclonal antibody of the invention, and detecting binding of the antibody to MCM2. In other embodiments, the sample is at least two monoclonal antibodies that specifically bind to MCM2, specifically monoclonal antibody 27C5.
. Contact with 6 and 26H6.19. In further embodiments, the sample is contacted with these two MCM2 monoclonal antibodies and a third antibody that specifically binds to Topo2A. Techniques for detecting antibody binding are well known in the art. Antibody binding to the biomarker of interest may be detected by the use of chemical reagents that generate a detectable signal that corresponds to the level of antibody binding and thus the level of biomarker protein expression. Any method for detecting antibody-antigen binding may be used to carry out the methods of the invention.

本明細書中で使用される場合、「子宮頸試料」は、バイオマーカーの発現を検出するこ
とができる、子宮頸由来の細胞、組織、または体液の、任意の採取試料をいう。かかる身
体試料の例としては、婦人科学的液体、生検、およびスミアが挙げられるが、これらに限
定されない。子宮頸試料は、例えば領域を擦過もしくは綿棒でふき取ること、または針を
用いて体液を吸引することを含む種々の技術によって、患者から得てもよい。子宮頸試料
を収集するための方法は、当該分野で周知である。特定の実施形態において、子宮頸試料
は、特に液体ベースの調製物中に、子宮頸細胞を含む。一実施形態において、子宮頸試料
は、例えばＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）（ＴｒｉＰａｔｈ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．
）またはＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）調製物（ＣＹＴＹＣ，Ｉｎｃ．）等の、液体ベー
スの細胞学標本調製ガイドラインに従って収集される。子宮頸試料は、拡大して調べるた
めに、スライドガラスに移してもよい。標本を保存し、調査を促進するために、定着液お
よび染色液をスライドガラス上の細胞に適用してもよい。一実施形態において、子宮頸試
料を収集および処理して、参照によって本明細書中に援用される米国特許第５３４６８３
１号に示されるような、単層試料を提供してもよい。 As used herein, a “cervical sample” refers to any collected sample of cervical-derived cells, tissue, or body fluid from which biomarker expression can be detected. Examples of such body samples include, but are not limited to, gynecological fluids, biopsies, and smears. Cervical samples may be obtained from the patient by various techniques including, for example, rubbing or wiping the area with a cotton swab, or aspirating bodily fluids with a needle. Methods for collecting cervical samples are well known in the art. In certain embodiments, the cervical sample comprises cervical cells, particularly in a liquid-based preparation. In one embodiment, a cervical sample is obtained, for example, from SurePath® (TriPath Imaging, Inc.).
) Or ThinPrep® preparations (CYTYC, Inc.) and other fluid-based cytological specimen preparation guidelines. The cervical sample may be transferred to a glass slide for enlargement and examination. Fixer and stain may be applied to the cells on the glass slide to preserve the specimen and facilitate the investigation. In one embodiment, cervical samples are collected and processed, US Pat. No. 5,346,683, incorporated herein by reference.
A monolayer sample as shown in No. 1 may be provided.

当業者は、本発明の方法中の工程のいずれかまたは全てが、手動または自動の様式で人
員によって実行することができることを認識するであろう。したがって、子宮頸試料調製
、抗体、および抗体結合の検出の工程は、自動化されてもよい。本発明の方法はまた、従
来のパプ染色技術と組み合わせて、高悪性度子宮頸疾患の、より正確な診断を可能にして
もよい。 One skilled in the art will recognize that any or all of the steps in the methods of the present invention can be performed by personnel in a manual or automated manner. Thus, the steps of cervical sample preparation, antibodies, and antibody binding detection may be automated. The method of the present invention may also be combined with conventional Papu staining techniques to enable a more accurate diagnosis of high-grade cervical disease.

以下の実施例は、例示のために提供され、限定のために提供されるのではない。   The following examples are provided by way of illustration and not by way of limitation.

（実施例１）
（ＭＣＭ２に対するマウスモノクローナル抗体の生成）
ＭＣＭ２に特異的なマウスモノクローナル抗体を生成した。抗原（免疫原性ポリペプチ
ド）は、全長組換えヘキサヒスチジン標識ＭＣＭ２タンパク質であった。バキュロウイル
ス発現系を用いて、Ｔｎｉ細胞中で抗原を発現させた。具体的には、ヘキサヒスチジン標
識ＭＣＭ２のコード配列（配列番号１０）を、Ｔｎｉ細胞中での発現のために、ｐＦａｓ
ｔＢａｃｌプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。バキュロウイルス
発現系を用いて組換えタンパク質を生成するための方法は、当該分野で周知である。Ｎｉ
＋２イオンを負荷したキレート化アガロース（ＱｉａｇｅｎのＮｉ−ＮＴＡ）を用いて標
識ＭＣＭ２タンパク質を精製し、免疫原として使用した。免疫原性ＭＣＭ２ポリペプチド
のアミノ酸配列を、配列番号１１中に提供する。 Example 1
(Generation of mouse monoclonal antibody against MCM2)
A mouse monoclonal antibody specific for MCM2 was generated. The antigen (immunogenic polypeptide) was full length recombinant hexahistidine labeled MCM2 protein. The antigen was expressed in Tni cells using a baculovirus expression system. Specifically, the hexahistidine-labeled MCM2 coding sequence (SEQ ID NO: 10) is expressed in pFas for expression in Tni cells.
Cloned into tBacl plasmid (Invitrogen). Methods for producing recombinant proteins using baculovirus expression systems are well known in the art. Ni
Labeled MCM2 protein was purified using chelated agarose loaded with +2 ions (Qiagen's Ni-NTA) and used as an immunogen. The amino acid sequence of the immunogenic MCM2 polypeptide is provided in SEQ ID NO: 11.

マウス免疫化およびハイブリドーマ融合を、本質的に、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５年）
Ｎａｔｕｒｅ２５６巻：４９５〜４９６頁に記載されているように行った。溶液中の免疫
原性標識ＭＣＭ２タンパク質で、マウスを免疫化した。免疫化したマウスから抗体産生細
胞を単離し、骨髄腫細胞と融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを形成さ
せた。ハイブリドーマを選択培地中で培養した。得られた細胞を段階希釈によって播種し
、ＭＣＭ２を特異的に結合する（かつ関連のない抗原に結合しない）抗体の生成について
アッセイした。目的のモノクローナル抗体がＭＣＭ２タンパク質とのみ反応してヘキサヒ
スチジン標識と反応しなかったことを確かめるために、選択されたハイブリドーマを、Ｍ
ＣＭ２−ＦＬＡＧ標識タンパク質に対してスクリーニングした。ＭＣＭ２−ＦＬＡＧタン
パク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１２および１３に示す。
次いで、選択されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）分泌ハイブリドーマを培養した。 Mouse immunization and hybridoma fusion were essentially performed by Kohler et al. (1975).
Nature 256: 495-496. Mice were immunized with immunogenic labeled MCM2 protein in solution. Antibody-producing cells were isolated from the immunized mice and fused with myeloma cells to form monoclonal antibody-producing hybridomas. Hybridomas were cultured in selective media. The resulting cells were seeded by serial dilution and assayed for the production of antibodies that specifically bind MCM2 (and do not bind unrelated antigens). To confirm that the monoclonal antibody of interest reacted only with the MCM2 protein and did not react with the hexahistidine label, the selected hybridoma was
Screened against CM2-FLAG labeled protein. The nucleotide and amino acid sequences of the MCM2-FLAG protein are shown in SEQ ID NOs: 12 and 13, respectively.
The selected monoclonal antibody (mAb) secreting hybridoma was then cultured.

組換えプロテインＡコート樹脂（ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（登録商標）、Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ，Ｉｎｃ．）を用いて、「枯渇した」ハイブリドーマ細胞（すなわち、生存能が０〜１
５％の間に低下するまで増殖した細胞）の培養培地上清から抗体を精製した。低ｐＨとそ
れに続く迅速なｐＨの中和を用いて、抗体を溶出させた。２８０ｎＭで相当な吸光度を有
する画分を貯留した。得られた貯留をＰＢＳに透析した。精製された抗体を、さらなる特
徴付けに供した。ＭＣＭ２モノクローナル抗体２６Ｈ６．１９および２７Ｃ５．６は、両
方ともＩｇＧ_１アイソタイプであると判定された。これらの抗体のエピトープマッピング
の詳細を後述する。 Recombinant protein A coat resin (STREAMLINE (registered trademark), Amersha
m, Inc. ) To “depleted” hybridoma cells (ie, viability from 0 to 1).
The antibody was purified from the culture medium supernatant of cells grown to a decrease of between 5%. The antibody was eluted using low pH followed by rapid pH neutralization. Fractions with substantial absorbance at 280 nM were pooled. The resulting pool was dialyzed against PBS. The purified antibody was subjected to further characterization. MCM2 monoclonal antibodies 26H6.19 and 27C5.6 were both determined to be IgG ₁ isotypes. Details of epitope mapping of these antibodies will be described later.

（実施例２）
（ハイブリドーマ細胞からのモノクローナル抗体の単離）
以下の手順を用いて、ハイブリドーマ細胞からモノクローナル抗体を単離する。 (Example 2)
(Isolation of monoclonal antibody from hybridoma cells)
Monoclonal antibodies are isolated from hybridoma cells using the following procedure.

（培地調製）
・無菌の１０００ｍｌ保存瓶に１００ｍｌのハイクローンウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を加え
る。
・１０ｍｌのＭＥＭ非必須アミノ酸溶液を加える。
・１０ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン−Ｌ−グルタミン溶液を加える。
・ＥｘＣｅｌｌ６１０−ＨＳＦ培地でおよそ１０００ｍｌまで適量にする。
・無菌のキャップを瓶上に置き、きつく締める。穏やかに渦を巻かせて混合する。
・１０００ｍｌの無菌酢酸真空フィルターユニット（０．２μｍ）を真空ポンプシステム
に連結させる。
・無菌酢酸真空フィルターユニットに培地溶液のおよそ半分を穏やかに注ぎ、減圧をオン
にする。
・一旦培地の最初の半分がろ過されると、残った培地をフィルターユニットに注ぎ、ろ過
を続ける。
・全ての培地がろ過された後、真空フィルターユニットから真空ホースを分離し、減圧ポ
ンプをオフにする。フィルター瓶からフィルターユニットの容器部分を取り除く。新しい
無菌の瓶のキャップを瓶上に置く。
・２℃〜１０℃で保存する。光から保護する。 (Medium preparation)
Add 100 ml high clone fetal bovine serum (FBS) to a sterile 1000 ml storage bottle.
Add 10 ml of MEM non-essential amino acid solution.
Add 10 ml penicillin-streptomycin-L-glutamine solution.
・ Adjust the volume to approximately 1000 ml with ExCell610-HSF medium.
• Place a sterile cap on the bottle and tighten tightly. Gently swirl to mix.
• Connect a 1000 ml sterile acetic acid vacuum filter unit (0.2 μm) to the vacuum pump system.
Gently pour approximately half of the media solution into a sterile acetic acid vacuum filter unit and turn on the vacuum.
• Once the first half of the medium is filtered, pour the remaining medium into the filter unit and continue filtering.
• After all media has been filtered, disconnect the vacuum hose from the vacuum filter unit and turn off the vacuum pump. Remove the container part of the filter unit from the filter bottle. Place a new sterile bottle cap on the bottle.
Store at 2 ° C to 10 ° C. Protect from light.

（最初のハイブリドーマ細胞培養）
・予め温めた３７℃のＨ_２Ｏ槽でストックハイブリドーマ凍結培養物のバイアルを解凍す
る。
・凍結バイアルの外側に７０％エタノールを噴霧する。
・解凍したバイアルを生物学的安全キャビネットに移す。
・凍結バイアルから細胞を取り除き、細胞を１５ｍｌ遠心チューブに移す。
・７ｍｌの細胞培養培地を、解凍した細胞を含む１５ｍｌ遠心チューブに滴下する。
・解凍した細胞および培養培地を含む１５ｍｌ遠心チューブを５分間２００ｇの力で遠心
分離する。
・細胞を遠心分離している間に、４５ｍｌの細胞培養培地を無菌のＴ−２２５フラスコに
加える。
・遠心分離の後、細胞ペレットの存在について、チューブを目視検査する。
・細胞ペレットを押しのけないように注意しながら、遠心チューブから培地を除去する。
注意：細胞ペレットがかき乱された場合、遠心分離工程を繰り返す。
・５ｍｌの細胞培養培地を、ペレット化した細胞を含む１５ｍｌ遠心チューブに加える。
ピペットで移して細胞ペレットを培地に再懸濁する。
・再懸濁した細胞および培養培地の内容物全体を、４５ｍｌの培地を含むＴ−２２５フラ
スコに移す。
・Ｔ−２２５フラスコにキャップをする。
・インタクトな細胞の存在について顕微鏡下で観察する。Ｔ−２２５フラスコを直ちにＣ
Ｏ２インキュベータに置き、細胞を一晩インキュベートさせた。 (First hybridoma cell culture)
• Thaw vials of stock hybridoma frozen cultures in a pre-warmed 37 ° C H ₂ O bath.
Spray the outside of the freeze vial with 70% ethanol.
• Transfer thawed vials to the biological safety cabinet.
Remove the cells from the freeze vial and transfer the cells to a 15 ml centrifuge tube.
• Drip 7 ml of cell culture medium into a 15 ml centrifuge tube containing thawed cells.
• Centrifuge a 15 ml centrifuge tube containing thawed cells and culture medium for 5 minutes at 200 g force.
While the cells are being centrifuged, add 45 ml of cell culture medium to a sterile T-225 flask.
• After centrifugation, visually inspect the tube for the presence of a cell pellet.
Remove the medium from the centrifuge tube, taking care not to push the cell pellet.
Note: If the cell pellet is disturbed, repeat the centrifugation process.
Add 5 ml of cell culture medium to a 15 ml centrifuge tube containing the pelleted cells.
Pipette to resuspend cell pellet in media.
• Transfer the entire contents of the resuspended cells and culture medium to a T-225 flask containing 45 ml of medium.
Cap the T-225 flask.
• Observe the presence of intact cells under a microscope. Immediately remove the T-225 flask with C
Place in an O2 incubator and allow cells to incubate overnight.

（ハイブリドーマ細胞株の拡大）
・細胞培養物を、生存能、濃度、および混入の存在についてモニタリングし続ける。
・最初のＴ−２２５フラスコの細胞懸濁液を、濃度がおよそ６０００００個の細胞／ｍｌ
〜８０００００個の細胞／ｍｌおよび合計２００〜２５０ｍｌの培地になるまでモニタリ
ングおよび調節する。
・細胞を押しのけ、最小細胞密度要件を満たすように、必要に応じてさらなる培地を加え
る。細胞懸濁液を分割して、１つの新しい無菌のＴ−２２５フラスコに移す。２×Ｔ−２
２５フラスコをＣＯ２インキュベータに入れる。
・濃度がおよそ６０００００個の細胞／ｍｌ〜８０００００個の細胞／ｍｌ、および各フ
ラスコについて合計２００〜２５０ｍｌの間の培地になるまで、２×Ｔ−２２５フラスコ
の細胞をモニタリングする。
・細胞を押しのけ、最小細胞密度要件を満たすように、必要に応じてさらなる培地を加え
る。細胞懸濁液を分割して、合計４×Ｔ−２２５フラスコの２つの新しい無菌のＴ−２２
５フラスコに移す。全てのフラスコをＣＯ２インキュベータに戻す。
・細胞をモニタリングし、細胞濃度がＴ−２２５フラスコ当たりおよそ２５０ｍｌの総体
積（または合計およそ１０００ｍｌ）でおよそ６０００００個の細胞／ｍｌ〜８００００
０個の細胞／ｍｌになるまで、４×Ｔ−２２５フラスコ中で体積を調節する。
・０％〜１５％の最終的な生存能で細胞が枯渇するまで増殖するまで、４×Ｔ−２２５フ
ラスコの細胞をモニタリングし続ける。ここで、細胞培養物上清は、清澄工程の準備がで
きている。 (Expansion of hybridoma cell lines)
Continue to monitor the cell culture for viability, concentration, and presence of contamination.
• The cell suspension of the first T-225 flask was diluted to a concentration of approximately 600000 cells / ml
Monitor and adjust until ˜800,000 cells / ml and a total of 200-250 ml of medium.
• Dislodge cells and add additional media as needed to meet minimum cell density requirements. Divide the cell suspension and transfer to one new sterile T-225 flask. 2 x T-2
Place 25 flasks in a CO2 incubator.
Monitor the cells in 2 × T-225 flasks until the concentration is approximately 600,000 cells / ml to 800,000 cells / ml and a total of 200-250 ml of medium for each flask.
• Dislodge cells and add additional media as needed to meet minimum cell density requirements. Divide the cell suspension into two new sterile T-22 in a total of 4 × T-225 flasks.
Transfer to 5 flasks. Return all flasks to the CO2 incubator.
Monitor cells and cell concentration is approximately 600,000 cells / ml to 80,000 in a total volume of approximately 250 ml per T-225 flask (or a total of approximately 1000 ml)
Adjust volume in 4 × T-225 flask until 0 cells / ml.
Continue monitoring the cells in the 4 × T-225 flask until they grow to depletion with a final viability of 0-15%. Here, the cell culture supernatant is ready for the clarification step.

（上清の清澄）
・卓上遠心分離機をオンにする。５００ｍｌチューブアダプタをローターバスケットに入
れ、蓋を閉めて温度を４℃±４℃に設定する。
・無菌的技術を用いて、ここで枯渇している４つ全てのＴ−２２５フラスコから、２×５
００ｍｌコニカル遠心チューブに培地を注ぐ。
・２×５００ｍｌは釣り合いが取れていることを確認する。釣り合わせる必要があれば、
上清を一方のチューブから他方のチューブに移す。
・枯渇した上清を１３５０ｇ（±４０ｇ）で１５分間、２℃〜１０℃で遠心分離する。
・遠心分離が完了した後、上清を無菌の１０００ｍｌ保存瓶に無菌的に傾瀉し、無菌のキ
ャップを締める。
・１ｍｌを無菌的にマイクロ遠心チューブに移す。マイクロ遠心チューブを試料とともに
２℃〜１０℃で保存する（光から保護する）。
・清澄させた上清試料は、Ｅａｓｙ−Ｔｉｔｅｒ（登録商標）アッセイを用いたＩｇＧ評
価の準備ができている。 (Clarification of supernatant)
• Turn on the tabletop centrifuge. Place the 500 ml tube adapter in the rotor basket, close the lid and set the temperature to 4 ° C. ± 4 ° C.
Using aseptic technique, 2x5 from all 4 T-225 flasks depleted here
Pour the medium into a 00 ml conical centrifuge tube.
・ Check that 2 x 500 ml is balanced. If you need to balance,
Transfer the supernatant from one tube to the other.
Centrifuge the depleted supernatant at 1350 g (± 40 g) for 15 minutes at 2 ° C. to 10 ° C.
• After centrifugation is complete, aseptically decant the supernatant into a sterile 1000 ml storage bottle and tighten the sterile cap.
• Aseptically transfer 1 ml to a microcentrifuge tube. Store the microcentrifuge tube with the sample at 2 ° C to 10 ° C (protect from light).
• The clarified supernatant sample is ready for IgG evaluation using the Easy-Titer® assay.

（バッファー調製）
（結合バッファー）
・およそ６００ｍｌのＤＩ Ｈ_２Ｏを清潔なビーカーに加える。
・７７．２８ｍｌのホウ酸溶液（４％Ｗ／Ｖ）を加える。清潔な撹拌棒で、室温で撹拌す
る。
・２３３．７６ｇの塩化ナトリウムを計り、撹拌し続けながら溶液に入れる。
・ＤＩ Ｈ_２Ｏで溶液をおよそ９５０ｍｌにし、撹拌し続ける。
・塩化ナトリウムが溶解し、溶液が透明になったら、水酸化ナトリウムでｐＨを９．０±
０．２に調節する。
・溶液を清潔な１０００ｍｌメスシリンダーに移し、ＤＩ Ｈ_２Ｏで１０００ｍｌまで適
量にする。
・完了したバッファーを適切な保存瓶に移す。このバッファーは、使用前に７日間まで保
存してもよい。
・このプロセス全体を繰り返して、さらなる０．２ｌ〜１．０ｌの結合バッファーを調製
する。 (Buffer preparation)
(Binding buffer)
Add approximately 600 ml of DI H ₂ O to a clean beaker.
Add 77.28 ml of boric acid solution (4% W / V). Stir at room temperature with a clean stir bar.
Measure 233.76 g of sodium chloride and add to the solution with continued stirring.
Bring solution to approximately 950 ml with DI H ₂ O and continue to stir.
When the sodium chloride is dissolved and the solution becomes clear, the pH is adjusted to 9.0 ± with sodium hydroxide.
Adjust to 0.2.
Transfer the solution to a clean 1000 ml graduated cylinder and make up to 1000 ml with DI H ₂ O.
• Transfer the completed buffer to an appropriate storage bottle. This buffer may be stored for up to 7 days before use.
Repeat the entire process to prepare an additional 0.2 l to 1.0 l of binding buffer.

（溶出バッファー）
・１．７２５ｇの一塩基のリン酸ナトリウムを計り、清潔な撹拌棒を有する清潔な２５０
ｍｌビーカーに入れる。
・３．６７６ｇのクエン酸ナトリウムを計り、同じ清潔な２５０ｍｌビーカーに入れる。
・およそ１７５ｍｌのＤＩ Ｈ_２Ｏを加え、溶解するまで室温で撹拌する。
・４．３８ｇの塩化ナトリウムを計り、撹拌し続けながら溶液に入れる。
・溶液をＤＩ Ｈ_２Ｏでおよそ２２５ｍｌにし、撹拌し続ける。
・塩化ナトリウムが溶解して溶液が透明になったら、塩酸でｐＨを３．５±０．２に調節
する。
・溶液を清潔な２５０ｍｌメスシリンダーに移し、ＤＩ Ｈ_２Ｏで２５０ｍｌまで適量に
する。
・５００ｍｌ無菌酢酸真空フィルターユニット（０．２μｍ）を減圧ポンプシステムに連
結し、溶液をろ過滅菌する。
・フィルターを取り除き、無菌のキャップで容器を閉める。 (Elution buffer)
• Clean 250 with 1.725 g monobasic sodium phosphate and clean stir bar
Place in a ml beaker.
• Weigh 3.676 g of sodium citrate and place in the same clean 250 ml beaker.
Add approximately 175 ml DI H ₂ O and stir at room temperature until dissolved.
• Weigh 4.38 g of sodium chloride and add to the solution with continued stirring.
Make the solution approximately 225 ml with DI H ₂ O and continue to stir.
When the sodium chloride is dissolved and the solution becomes clear, adjust the pH to 3.5 ± 0.2 with hydrochloric acid.
Transfer the solution to a clean 250 ml graduated cylinder and make up to 250 ml with DI H ₂ O.
Connect a 500 ml sterile acetic acid vacuum filter unit (0.2 μm) to the vacuum pump system and filter sterilize the solution.
Remove the filter and close the container with a sterile cap.

（抗体吸着）
・清澄させた上清（約１Ｌ）を、清潔な撹拌棒を有する清潔な４０００ｍｌプラスチック
ビーカーに注ぐ。
・およそ等量（約１Ｌ）の結合バッファーを、清澄させた上清を含む清潔な４０００ｍｌ
プラスチックビーカーに加える。清潔な撹拌棒を加える。
・清潔なラップでビーカーを覆い、「抗体結合」と貼り紙をする。
・表１のデータを用いて、必要なＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（登録商標）プロテインＡのおよ
その量を計算する。 (Antibody adsorption)
Pour the clarified supernatant (about 1 L) into a clean 4000 ml plastic beaker with a clean stir bar.
• Clean 4000 ml containing clarified supernatant with approximately equal volume (approximately 1 L) of binding buffer
Add to plastic beaker. Add a clean stir bar.
• Cover the beaker with a clean wrap and paste “antibody binding”.
Use the data in Table 1 to calculate the approximate amount of STREAMLINE® Protein A required.

・清潔な使い捨てカラムおよびバルブ組み立て品をリングスタンドおよびクランプに固定
する。バルブを閉める。
・瓶を数回逆さにすることによって、適切な量のＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビー
ズを混合する。必要な体積を抜き取り、使い捨てカラムに入れる。
・１０ｍｌのＤＩ Ｈ_２ＯでＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを洗浄する。バル
ブを開き、ＤＩ Ｈ_２Ｏを排出させる。バルブを閉める。さらなる１０ｍｌのＤＩ Ｈ_２
Ｏで繰り返す。
・１０ｍｌの結合バッファーでＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを洗浄する。バ
ルブを開き、結合バッファーを排出させる。バルブを閉める。さらなる１０ｍｌの結合バ
ッファーで繰り返す。
・ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを約１０ｍｌの清澄させた上清および結合バ
ッファー溶液（４０００ｍｌビーカーから）に再懸濁し、ビーズを、清澄させた上清およ
び結合バッファー溶液を含む４０００ｍｌビーカーに移す。必要に応じて繰り返して、い
かなる残ったビーズも移す。完了したら、カラムおよびバルブを廃棄する。
・２℃〜１０℃でおよそ１８時間、混合物を活発に混合させる。
・混合が完了したら、撹拌プレートをオフにし、緩衝された上清およびビーズ懸濁液を含
む「抗体結合」ビーカーを実験台領域に戻す。ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズ
をビーカーの底に沈殿させる（およそ５分間）。
・清潔な使い捨てカラムおよびバルブ組み立て品をリングスタンドおよびクランプに固定
する。バルブを閉める。
・清潔な２５０ｍｌ瓶または適した容器に「カラム洗浄液−結合後」と貼り紙をする。
・清潔なプラスチックビーカーに「上清−結合後」と貼り紙をする。
・４０００ｍｌビーカーから、清潔な、貼り紙をした２ｌプラスチックビーカーに、上清
を傾瀉し、４０００ｍｌビーカーの底にビーズを残す。「上清−結合後」溶液を含む２０
００ｍｌビーカーを、清潔なラップで覆い、２℃〜１０℃で保存する。
・およそ１５ｍｌの結合バッファーを、傾瀉した４０００ｍｌ「抗体結合」ビーカーに加
える。ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを再懸濁し、それらをカラムに移す。バ
ルブを開き、結合バッファーを「カラム洗浄液−結合後」容器に排出させる。排出すると
きにバルブを閉める。
・さらなる結合バッファーを加えること、混合すること、および先立つ工程のようにカラ
ムに移すことによって、「抗体結合」ビーカー中のいかなる残ったＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ
プロテインＡビーズも移す。排出するときにバルブを閉める。
・表２のデータを用いて、カラム中のＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを洗浄す
るのに必要な結合バッファーのおよその量を計算する。

• Secure clean disposable column and valve assembly to ring stand and clamp. Close the valve.
• Mix the appropriate amount of STREAMLINE Protein A beads by inverting the bottle several times. Remove the required volume and place in a disposable column.
· Wash the STREAMLINE Protein A beads in DI _{H 2} O in 10 ml. Open the valve and drain DI H ₂ O. Close the valve. An additional 10 ml of DI H ₂
Repeat with O.
• Wash the STREAMLINE Protein A beads with 10 ml binding buffer. Open the valve and drain the binding buffer. Close the valve. Repeat with an additional 10 ml of binding buffer.
Resuspend STREAMLINE Protein A beads in approximately 10 ml of clarified supernatant and binding buffer solution (from 4000 ml beaker) and transfer beads to 4000 ml beaker containing clarified supernatant and binding buffer solution. Repeat as necessary to transfer any remaining beads. When complete, discard the column and valve.
• Mix the mixture vigorously at 2-10C for approximately 18 hours.
• When mixing is complete, turn off the stir plate and return the “antibody-bound” beaker containing the buffered supernatant and bead suspension to the laboratory area. Allow the STREAMLINE Protein A beads to settle to the bottom of the beaker (approximately 5 minutes).
• Secure clean disposable column and valve assembly to ring stand and clamp. Close the valve.
• Label a clean 250ml bottle or suitable container with "column wash-after binding".
・ Apply “Supernatant—After Binding” to a clean plastic beaker.
• Decant the supernatant from a 4000 ml beaker into a clean, lapped 2 l plastic beaker, leaving the beads at the bottom of the 4000 ml beaker. 20 containing “supernatant-post-binding” solution
Cover a 00 ml beaker with clean wrap and store at 2-10 ° C.
Add approximately 15 ml binding buffer to a decanted 4000 ml “antibody binding” beaker. Resuspend the STREAMLINE Protein A beads and transfer them to the column. Open the valve and allow the binding buffer to drain into the “column wash—after binding” container. Close the valve when discharging.
Any remaining STREAMLINE in the “antibody binding” beaker by adding additional binding buffer, mixing, and transferring to the column as in the previous step.
Also transfer protein A beads. Close the valve when discharging.
• Use the data in Table 2 to calculate the approximate amount of binding buffer needed to wash the STREAMLINE Protein A beads in the column.

・適切な体積の結合バッファーで、適切な洗浄の回数、カラム中のＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ
プロテインＡビーズを洗浄し、「カラム洗浄液−結合後」容器に流出液を収集し続ける。
・完了したら、バルブを閉める。「カラム洗浄液−結合後」容器を２℃〜１０℃で保存す
る。
・表３から、カラム中のＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを溶出させるのに必要
な溶出バッファーおよび中和バッファーの総体積を判定する。

STREAMLINE in the column with the appropriate volume of binding buffer and the appropriate number of washes
Wash the Protein A beads and continue to collect the effluent in the “column wash—after binding” container.
・ When completed, close the valve. Store the column wash solution after binding at 2 ° C to 10 ° C.
• From Table 3, determine the total volume of elution buffer and neutralization buffer required to elute the STREAMLINE Protein A beads in the column.

・９つの無菌コニカル遠心チューブに「溶出抗体」、画分＃（１〜９）と貼り紙をする。
・画分当たりに必要な、適切な体積の中和バッファー（上述の表「Ｃ」から判定する）を
、９つの「溶出抗体」画分チューブのそれぞれに入れ、カラムバルブ流出口下にしっかり
と置く。
・中和バッファーを含む「溶出抗体」チューブのそれぞれに溶出液を収集しながら、画分
当たりに必要な、適切な体積の溶出バッファー（上述の表３から判定する）で、画分ごと
にカラム中のＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを溶出させる。
・溶出が完了したら、数回渦を巻かせることによって、各「溶出抗体」画分チューブを穏
やかに混合する。およそ５０μｌの画分＃３を取り除き、ｐＨ試験紙片上に置いて、溶出
液がおよそｐＨ６．５〜８．５の間に中和されていることを確実にする。必要な場合、ｐ
Ｈを範囲内にするのに必要な場合、さらなる中和バッファーまたは溶出バッファーを加え
る。
・ｐＨ評価が完了したら、２８０ｎｍ〜４００ｎｍで各画分の試料の吸光度スキャンを行
って、透析プロセスへの進行の前に、溶出液中のＩｇＧのおよその濃度を判定する。

• Label nine sterile conical centrifuge tubes with “eluting antibody”, fractions # (1-9).
• Place the appropriate volume of neutralization buffer required per fraction (determined from Table “C” above) into each of the nine “eluted antibody” fraction tubes and firmly under the column valve outlet. Put.
Collect the eluate in each of the “eluted antibody” tubes containing the neutralization buffer, and column with each fraction with the appropriate volume of elution buffer (determined from Table 3 above) required per fraction. Elute the STREAMLINE Protein A beads inside.
• When elution is complete, gently mix each “eluted antibody” fraction tube by swirling several times. Remove approximately 50 μl of fraction # 3 and place on pH test paper strip to ensure that the eluate is neutralized between approximately pH 6.5 and 8.5. P if necessary
Add additional neutralization buffer or elution buffer if necessary to bring H within range.
When the pH evaluation is complete, perform an absorbance scan of each fraction sample at 280-400 nm to determine the approximate concentration of IgG in the eluate before proceeding to the dialysis process.

Ａ２８０〜Ａ４００値が０．２００以上である場合、画分を溶出液貯留の一部として受
け入れる。 If the A280-A400 value is 0.200 or greater, the fraction is accepted as part of the eluate pool.

Ａ２８０〜Ａ４００値が０．２００未満である場合、画分を溶出液貯留の一部として受
け入れない。
・無菌コニカル遠心チューブに「溶出抗体」、「溶出液貯留」と貼り紙をし、貯留の一部
として受け入れられた全ての画分を合わせる。
・溶出貯留の試料の吸光度スキャンを行って、透析プロセスへの進行の前に、溶出液中の
ＩｇＧのおよその濃度を判定する。
・溶出液貯留の体積を評価し、ＩｇＧのおよその総ｍｇを計算する。
・溶出液貯留の体積：＿ｍｌ×＿ＩｇＧ ｍｇ／ｍｌ＝ＩｇＧの＿総ｍｇ
（抗体透析）
・「溶出抗体」チューブを２℃から１０℃に移す。
・溶出液のおよその体積および表４のデータを用いて、抗体溶出液を透析するのに必要な
透析管系のおよその長さを計算する。 If the A280-A400 value is less than 0.200, the fraction is not accepted as part of the eluate pool.
• Place “eluting antibody” and “eluate reservoir” on a sterile conical centrifuge tube and combine all accepted fractions as part of the reservoir.
Perform an absorbance scan of the sample in the elution pool to determine the approximate concentration of IgG in the eluate before proceeding to the dialysis process.
Evaluate the volume of the eluate pool and calculate the approximate total mg of IgG.
-Volume of eluate reservoir: _ml x _IgG mg / ml = _total mg of IgG
(Antibody dialysis)
• Transfer the “Eluted Antibody” tube from 2 ° C. to 10 ° C.
Use the approximate volume of eluate and the data in Table 4 to calculate the approximate length of the dialysis tubing required to dialyze the antibody eluate.

・必要な、適切な長さの透析管系を切断する。（Ｓｐｅｃｔａ／Ｐｏｒ（登録商標）２再
生セルロース膜、１２０００〜１４０００ダルトン分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、１６
ｍｍ直径、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、カタログ番号１３
２６７８）
・透析膜管系を１０００ｍｌのＤＩＨ_２Ｏ中で３０分より長い間水和する。
・表５のデータを用いて、抗体溶出液を透析するのに必要な透析バッファーのおよその体
積を計算する。

• Cut the appropriate length of dialysis tubing required. (Specta / Por® 2 Regenerated Cellulose Membrane, 12000-14000 Dalton Molecular Weight Cutoff (MWCO), 16
mm diameter, Spectrum Laboratories Inc. , Catalog number 13
2678)
Hydrate the dialysis membrane tubing in 1000 ml DIH ₂ O for more than 30 minutes.
• Use the data in Table 5 to calculate the approximate volume of dialysis buffer required to dialyze the antibody eluate.

・適切な量の透析バッファーを、適した大きさのプラスチックビーカーに入れる。ビーカ
ーに「透析抗体」と貼り紙をする。清潔な撹拌棒を加え、ビーカーを２℃〜１０℃で冷蔵
庫または低温室内の撹拌プレートに置く。
・透析管系をＤＩ−Ｈ_２Ｏ中で徹底的にすすぐ。２つの末端の結び目を透析管系の一端か
らおよそ７ｃｍで結びつけ、透析管系をしっかりと固定する。
・およそ５ｍｌのＤＩ−Ｈ_２Ｏを透析管系に加える。
・透析管系に、「溶出抗体」収集チューブの溶出抗体を充填する。
・２つの末端の結び目を、透析管系の残った開放端から７ｃｍで結びつけ、しっかりと固
定する。上部空間が、およそ表４から導かれるものであることを確実にする。
・充填し、閉鎖した透析管系を、適切な体積の１×ＰＢＳ（表５から）を含む透析貯蔵器
に入れる。
・清潔なラップでビーカーを覆う。透析試料が自由に回転するが透析物の渦に引き下ろさ
れないように、撹拌プレート上で速度を調節する。透析は、合計２４時間の期間中３回の
バッファー交換ありで、２℃〜１０℃で起こるべきである。

• Place the appropriate amount of dialysis buffer in a suitably sized plastic beaker. Put “dialysis antibody” on the beaker. Add a clean stir bar and place the beaker on a stir plate in a refrigerator or cold room at 2-10 ° C.
- thoroughly rinse the dialysis tubing in the _{DI-H 2} O in. Tie two end knots approximately 7 cm from one end of the dialysis tubing to secure the dialysis tubing securely.
· Add approximately _{DI-H 2} O of 5ml into the dialysis tubing.
• Fill the dialysis tubing with the eluted antibody from the “Eluted Antibody” collection tube.
• Tie two end knots 7 cm from the remaining open end of the dialysis tubing and secure securely. Ensure that the headspace is approximately derived from Table 4.
Place the filled and closed dialysis tubing into a dialysis reservoir containing the appropriate volume of 1 × PBS (from Table 5).
• Cover the beaker with a clean wrap. The speed is adjusted on the stir plate so that the dialyzed sample rotates freely but is not pulled down by the dialysate vortex. Dialysis should occur at 2 ° C to 10 ° C with 3 buffer changes over a total period of 24 hours.

（抗体ろ過）
・無菌収集チューブに「透析抗体」と貼り紙をする。
・透析した試料管系を透析ビーカーから取り除く。一端で透析管系を切開し、透析した試
料を「透析抗体」遠心チューブに移す。
・別の無菌収集チューブに「透析抗体」と貼り紙をする。
・最終的な透析された体積を保持するのに十分な容量を有する無菌のＬｕｅｒ Ｌｏｋ注
射器を選択する。
・Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）注射器フィルターを、注射器の開口部に取り付ける（０
．２μｍ ＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎ（登録商標）膜、低タンパク質結合、Ｇｅｌｍａｎ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号４１９２）。注射器からプランジャを取り除き、
注射器を直立して保持しながら、透析したモノクローナル抗体を「透析抗体」チューブか
ら注射器に移す。プランジャを戻す。
・Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）注射器フィルターを、開放した無菌の、張り紙をした「
透析抗体」収集チューブ上に保持し、注射器プランジャを押し下げて、精製された抗体を
「精製抗体」チューブにろ過する。
・ろ過が完了したら、「精製抗体」チューブにキャップをし、２℃〜１０℃で保存する。
・Ａ２８０手順を用いて、精製されたモノクローナル抗体の濃度を判定する。 (Antibody filtration)
・ Put “dialysis antibody” on a sterile collection tube.
Remove the dialyzed sample tube system from the dialysis beaker. The dialysis tubing is dissected at one end and the dialyzed sample is transferred to a “dialysis antibody” centrifuge tube.
• Put “dialysis antibody” on another sterile collection tube.
Select a sterile Luer Lok syringe with sufficient volume to hold the final dialyzed volume.
• Attach an Acrodisc® syringe filter to the syringe opening (0
. 2 μm HT Tuffryn® membrane, low protein binding, Gelman L
laboratories, catalog number 4192). Remove the plunger from the syringe,
While holding the syringe upright, the dialyzed monoclonal antibody is transferred from the “dialysis antibody” tube to the syringe. Return the plunger.
• Acrodisc® syringe filter was opened, sterile, and lined “
Hold on the “dialysis antibody” collection tube and depress the syringe plunger to filter the purified antibody into the “purified antibody” tube.
• When filtration is complete, cap the “purified antibody” tube and store at 2 ° C. to 10 ° C.
Determine the concentration of purified monoclonal antibody using the A280 procedure.

（実施例３）
（エピトープマッピングの一般的方法）
（一般的手法）
エピトープマッピングを行って、特定のモノクローナル抗体によって認識される抗原性
タンパク質（すなわち、エピトープ）内の直鎖状アミノ酸配列を同定する。エピトープマ
ッピングのための一般的な手法は、一般的に異種発現系において、全長タンパク質、なら
びにタンパク質の種々の断片（すなわち、トランケートされた形態）の発現を必要とする
。次いで、これらの種々の組換えタンパク質を用いて、特定のモノクローナル抗体が１つ
または複数のトランケートされた形態の標的タンパク質に結合することができるかどうか
を判定する。繰り返すトランケーションの使用および重複するアミノ酸領域を有する組換
えタンパク質の生成によって、調査中のモノクローナル抗体によって認識される領域を同
定することが可能である。ウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡを採用して、調査中
の特定のモノクローナル抗体が１つまたは複数の組換えタンパク質断片を結合することが
できるかどうかを判定する。この手法は、エピトープを含むペプチド領域を最終的に同定
し、いくつかの場合において、エピトープを正確に８〜１１アミノ酸配列にさらに精密に
することができる。 (Example 3)
(General method of epitope mapping)
(General method)
Epitope mapping is performed to identify linear amino acid sequences within antigenic proteins (ie, epitopes) that are recognized by specific monoclonal antibodies. Common approaches for epitope mapping generally require the expression of full-length proteins, as well as various fragments (ie, truncated forms) of proteins in heterologous expression systems. These various recombinant proteins are then used to determine whether a particular monoclonal antibody can bind to one or more truncated forms of the target protein. By using repeated truncation and the generation of recombinant proteins with overlapping amino acid regions, it is possible to identify regions recognized by the monoclonal antibody under investigation. Western blot analysis or ELISA is employed to determine whether the particular monoclonal antibody under investigation can bind one or more recombinant protein fragments. This approach can ultimately identify the peptide region that contains the epitope, and in some cases, can further refine the epitope to exactly 8-11 amino acid sequences.

（構築物設計および考案）
エピトープマッピングの最初の工程は、ネステッド遺伝子トランケーションの設計であ
る。頻繁に、さらなる分析のために、遺伝子は４つの等しい部分に分割される。 (Construction design and design)
The first step in epitope mapping is the design of nested gene truncation. Frequently, the gene is divided into four equal parts for further analysis.

（遺伝子クローニング戦略）
一般的なクローニング戦略は、ＰＣＲベースのクローン化された遺伝子断片の生成で始
まる。クローン化断片を効率的に発現させるために、特に小さいアミノ酸領域を使用する
場合、クローン化断片は融合タンパク質として、すなわち、系において安定して発現され
る別の担体タンパク質に融合されて、発現される。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、担
体タンパク質として頻繁に使用される。ＧＦＰは、融合パートナーの一部として含まれて
トランケーション断片を安定化させ、その後のｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質発現工程の間
に発現を向上させる。ＧＦＰはまた、抗ＧＦＰ抗体を用いた融合タンパク質発現の追跡を
可能にする。 (Gene cloning strategy)
A general cloning strategy begins with the generation of PCR-based cloned gene fragments. In order to efficiently express the cloned fragment, especially when using small amino acid regions, the cloned fragment is expressed as a fusion protein, i.e. fused to another carrier protein that is stably expressed in the system. The Green fluorescent protein (GFP) is frequently used as a carrier protein. GFP is included as part of the fusion partner to stabilize the truncation fragment and improve expression during the subsequent in vitro protein expression step. GFP also allows tracking of fusion protein expression using anti-GFP antibodies.

いずれかのメガ−プライミング手法を用いて、またはｐＳｃｒｅｅｎ−ＧＦＰベクター
へのプラスミドクローニングの使用によって、ＧＦＰ−タンパク質構築物を作製するため
のクローニングを行う。一般に、トランケーション断片を、ＧＦＰ、およびメガプライミ
ングと呼ばれる技術を用いたタンパク質発現に必要な制御配列に融合させる。 Cloning to create a GFP-protein construct is performed using any mega-priming technique or by using plasmid cloning into the pScreen-GFP vector. In general, truncation fragments are fused to GFP and regulatory sequences necessary for protein expression using a technique called megapriming.

メガプライミングは、それぞれの断片の末端の相同な領域アニーリングすることおよび
アニーリングした一本鎖ＤＮＡを熱安定性ＤＮＡポリメラーゼで伸長させることによる、
２つ以上のＤＮＡ断片の結合である。このプロセスによって、２つ以上の、より小さい断
片から、それらの共有する配列によってそれらを連結して、１つの大きなＤＮＡ断片が生
じる。次いで、大きな断片を、標準的ＰＣＲを用いて増幅する。 Megapriming is by annealing a homologous region at the end of each fragment and extending the annealed single-stranded DNA with a thermostable DNA polymerase.
The binding of two or more DNA fragments. This process joins two or more smaller fragments together by their shared sequence to produce one large DNA fragment. The large fragment is then amplified using standard PCR.

メガプライミングをうまく使用できない場合、トランケーション断片を、ＧＦＰおよび
タンパク質発現制御配列を含むプラスミドにクローニングすることができる。このクロー
ニングによって、エピトープマッピングに必要なＧＦＰ／断片融合が生じる。次いで、残
りのプロトコルを後述のように進めることができる。 If megapriming cannot be used successfully, the truncation fragment can be cloned into a plasmid containing GFP and protein expression control sequences. This cloning results in the GFP / fragment fusion required for epitope mapping. The remaining protocols can then proceed as described below.

（タンパク質発現）
次いで、例えばメガプライミングによって作製される、発現構築物を、ラピッドトラン
スレーションシステム（ＲＴＳ）に導入する。ＲＴＳは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物
由来の、無細胞タンパク質発現系である。この系によって、ＤＮＡ鋳型からのタンパク質
の迅速な（３〜４時間）発現が可能になる。 (Protein expression)
The expression construct, made for example by megapriming, is then introduced into a rapid translation system (RTS). RTS is a cell-free protein expression system derived from E. coli lysate. This system allows for rapid (3-4 hours) expression of the protein from the DNA template.

ＲＴＳが十分なレベルのタンパク質発現を生じない場合、トランケーション断片をＧＦ
Ｐタンパク質発現プラスミドにクローニングする。次いで、これらの融合プラスミドを、
タンパク質発現のために最適化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に形質転換する。タンパ
ク質発現を、増殖している細菌の培養物中に誘導し、生長の後、細胞を溶解させる。次い
で、複雑な細胞溶解物中のタンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ
）によって分離し、残りのプロトコルは以下と同じである。 If RTS does not produce sufficient levels of protein expression,
Cloning into P protein expression plasmid. These fusion plasmids are then
Transform into an E. coli strain optimized for protein expression. Protein expression is induced in growing bacterial cultures, and after growth, the cells are lysed. The proteins in complex cell lysates are then purified by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).
The rest of the protocol is the same as

（タンパク質検出およびエピトープマッピング）
ＲＴＳによって生成されたタンパク質断片を、ＰＡＧＥを用いて分離し、ニトロセルロ
ース膜に移す。次いで、膜結合タンパク質を、溶液中で、調査中の抗体に曝露する。抗体
／タンパク質結合を、当該分野で公知の比色技術を用いて同定する。 (Protein detection and epitope mapping)
Protein fragments produced by RTS are separated using PAGE and transferred to a nitrocellulose membrane. The membrane-bound protein is then exposed to the antibody under investigation in solution. Antibody / protein binding is identified using colorimetric techniques known in the art.

全長タンパク質およびトランケートされたタンパク質断片のいくつかのサブセットの抗
体結合は、陽性の結果を構成する。タンパク質の特定の部分がないことによって抗体結合
が排除される場合、エピトープはこの断片上にある。 Antibody binding of several subsets of full-length proteins and truncated protein fragments constitutes a positive result. An epitope is on this fragment when antibody binding is eliminated by the absence of a specific portion of the protein.

マッピングされる抗体が、ニトロセルロース膜に結合しているタンパク質を認識しない
場合、例えばＥＬＩＳＡまたは免疫沈降等の、抗体／タンパク質相互作用を検出するため
の代替的方法が用いられる。抗体／タンパク質相互作用を検出するための方法は、当該分
野で周知である。 If the antibody being mapped does not recognize the protein bound to the nitrocellulose membrane, alternative methods for detecting antibody / protein interactions are used, such as, for example, ELISA or immunoprecipitation. Methods for detecting antibody / protein interactions are well known in the art.

（エピトープ位置選定をさらに精密にする）
上述のプロトコルは、エピトープの位置選定をタンパク質のおよそ４分の１まで狭くす
るだけなので、エピトープの位置選定をさらに分析するために、エピトープを含むと判定
された４分の１のタンパク質に関するプロセスを繰り返す必要がある。非常に大きなタン
パク質については、このプロセスを２〜３回繰り返して、８〜１５アミノ酸までエピトー
プを狭める必要がある場合がある。 (Further refine the epitope location selection)
Because the above protocol only narrows the epitope localization to approximately one-fourth of the protein, a further process for the quarter-protein determined to contain the epitope is required for further analysis of the epitope localization. Need to repeat. For very large proteins, this process may need to be repeated 2-3 times to narrow the epitope to 8-15 amino acids.

（実施例４）
（ＭＣＭ２モノクローナル抗体２７Ｃ５．６および２６Ｈ６．１９についてのエピトー
プの特徴付け）
本質的に実施例３に記載されているように、ＭＣＭ２モノクローナル抗体２７Ｃ５．６
および２６Ｈ６．１９についてのエピトープマッピングを行った。具体的には、ＰＣＲを
用いて、ＭＣＭ２遺伝子トランケーションを作製し、それに続くＲＴＳによって組換えＭ
ＣＭ２タンパク質断片を生成し、最後にウエスタンブロッティングによってＭＣＭ２への
抗体結合を検出した。２回目のＰＣＲにおいてＧＦＰをＭＣＭ２遺伝子トランケーション
と結合させて、ＲＴＳにおける確固として安定した発現を確実にした。 Example 4
Epitope characterization for MCM2 monoclonal antibodies 27C5.6 and 26H6.19
MCM2 monoclonal antibody 27C5.6 essentially as described in Example 3.
And epitope mapping for 26H6.19. Specifically, PCR is used to generate MCM2 gene truncation, followed by recombinant M
CM2 protein fragments were generated and finally antibody binding to MCM2 was detected by Western blotting. In the second round of PCR, GFP was combined with the MCM2 gene truncation to ensure robust and stable expression in RTS.

ＭＣＭ２の全長コード配列（配列番号２、ＮＭ＿００４５２６）は、２７１５ｂｐのサ
イズを有する。しかしながら、組換えＭＣＭ２タンパク質の発現に使用され、ＭＣＭ２抗
体の生成の間にマウスの免疫化に使用されたｃＤＮＡは、２６８８ｂｐの遺伝子サイズを
有した（配列番号５）。使用した、トランケートされたＭＣＭ２ ｃＤＮＡは、ＭＣＭ２
タンパク質の５’末端を欠く２７ｂｐ領域、具体的には断片 The full length coding sequence of MCM2 (SEQ ID NO: 2, NM_004526) has a size of 2715 bp. However, the cDNA used for expression of recombinant MCM2 protein and used for immunization of mice during the generation of MCM2 antibody had a gene size of 2688 bp (SEQ ID NO: 5). The truncated MCM2 cDNA used was MCM2
27 bp region lacking the 5 'end of the protein, specifically a fragment

を有した。ＭＣＭ２−２７Ｃ５．６抗体をエピトープマッピングするために、以下の連続
的工程を行った。

Had. To epitope map the MCM2-27C5.6 antibody, the following sequential steps were performed.

ＭＣＭ２遺伝子は大きく（＞１０００ｂｐ）、必要なＰＣＲの繰り返しの数を最小限に
する必要があるので、遺伝子を、およそ４００ｂｐの６つの領域［１〜６］に等分した。
２回目のＰＣＲサイクルの間のメガプライミングを可能にする相同な配列およびｐＳｃｒ
ｅｅｎ−ＧＦＰプラスミドへのサブクローニングの第二の選択肢のための制限酵素認識部
位を含む、重複する配列を、第一のＰＣＲの間に目的の遺伝子に付加する。１回目のＰＣ
Ｒによって、以下のものを含むトランケートされたＭＣＭ２ヌクレオチド配列（配列番号
５）の断片が生じた。領域［１］は１〜４２６ｂｐであり、領域［１〜２］は１〜８８８
ｂｐであり、領域［１〜３］は１〜１３７７ｂｐであり、領域［１〜４］は１〜１８４５
ｂｐであり、領域［１〜５］は１〜２２４１ｂｐであり、領域［１〜６］は１〜２６８８
ｂｐであり、最後に、領域［２〜６］は４２７〜２６８８ｂｐであった。個々の領域（例
領域［５］）は発現されず、領域間の連結配列中に存在した、欠けているエピトープが防
がれた。 Since the MCM2 gene is large (> 1000 bp) and the number of required PCR repeats needs to be minimized, the gene was equally divided into six regions [1-6] of approximately 400 bp.
Homologous sequences and pScr that allow megapriming during the second PCR cycle
Overlapping sequences, including restriction enzyme recognition sites for the second option of subcloning into the een-GFP plasmid, are added to the gene of interest during the first PCR. First PC
R produced a fragment of the truncated MCM2 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 5), including: The region [1] is 1 to 426 bp, and the region [1 to 2] is 1 to 888.
bp, region [1-3] is 1-1377 bp, region [1-4] is 1-1845
bp, region [1-5] is 1-2241 bp, region [1-6] is 1-2688
bp, and finally region [2-6] was 427-2688 bp. Individual regions (example region [5]) were not expressed, preventing missing epitopes present in the connecting sequences between the regions.

断片サイズはメガプライミングには大きすぎる場合、ＭＣＭ２の１回目のＰＣＲ産物を
、ｐＳＣＲＥＥＮ−ＧＦＰ（ＢａｍＨ１−Ｘｈｏ１）にサブクローニングした。成功しな
かった唯一のトランケーションは、全長領域［１〜６］であった。全長遺伝子の増幅に使
用した元々のプライマー、およびトランケーションを、操作して制限酵素認識部位（５’
末端ＢＡＭＨ１、３’末端ＸＨＯ１）に含めて、ｐＳＣＲＥＥＮ−ＧＦＰへの直接のサブ
クローニングを可能にした。 If the fragment size was too large for megapriming, the first PCR product of MCM2 was subcloned into pSCREEN-GFP (BamH1-Xho1). The only truncation that was not successful was the full length region [1-6]. The original primers and truncation used to amplify the full-length gene were manipulated to manipulate the restriction enzyme recognition site (5 '
Included in the terminal BAMH1, 3 ′ terminal XHO1) to allow direct subcloning into pSCREEN-GFP.

ＲｏｃｈｅのＲＴＳ１００大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＹキットを用いたＲＴＳ反応にお
けるタンパク質生成のための鋳型として、作製したＧＦＰ−遺伝子融合を用いた。ＲＴＳ
からのタンパク質生成物をアセトン沈殿させ、変性ポリアクリルアミドゲルに直接ロード
し、ウエスタンブロッティングによって分析した。ウエスタンブロットを、２７Ｃ５．６
モノクローナル抗体およびＧＦＰ抗体で直接プローブした。 The prepared GFP-gene fusion was used as a template for protein production in an RTS reaction using Roche's RTS100 E. coli HY kit. RTS
The protein product from was acetone precipitated, loaded directly onto a denaturing polyacrylamide gel and analyzed by Western blotting. Western blot was analyzed using 27C5.6.
Probed directly with monoclonal and GFP antibodies.

１回目のＲＴＳの産物を、ＧＦＰ抗体およびＭＣＭ２モノクローナル抗体２７Ｃ５．６
の両方でプローブした。領域［１〜３］で陽性のバンドを検出した。領域［１〜３］によ
って包含される断片を開始配列として用いて、上述のプロセスを繰り返した。 The product of the first round of RTS was designated as GFP antibody and MCM2 monoclonal antibody 27C5.6.
Probed with both. A positive band was detected in region [1-3]. The above process was repeated using the fragment encompassed by region [1-3] as the starting sequence.

２回目のＲＴＳによって、領域ＭＣＭ２−３Ｑ３（   By the second RTS, the region MCM2-3Q3 (

配列番号１のアミノ酸残基３５５〜３８２に対応する）中の２７Ｃ５．６抗体についての
陽性の結果が生じた。領域ＭＣＭ２−３Ｑ３によって包含される断片を開始配列として用
いて、上述のプロセスを繰り返した。

A positive result was produced for the 27C5.6 antibody in amino acid residues 355-382 of SEQ ID NO: 1). The above process was repeated using the fragment encompassed by region MCM2-3Q3 as the starting sequence.

３回目のＲＴＳによって、領域ＭＣＭ２−３Ｑ３．２（   By the third RTS, the region MCM2-3Q3.2 (

配列番号１のアミノ酸残基３６９〜３８２に対応する）中の２７Ｃ５．６抗体についての
陽性の結果が生じた。領域ＭＣＭ２−３Ｑ３．１（

A positive result was obtained for the 27C5.6 antibody in amino acid residues 369-382 of SEQ ID NO: 1). Region MCM2-3Q3.1 (

配列番号１のアミノ酸残基３５５〜３６８に対応する）またはＭＣＭ２−３Ｑ３．２（

Corresponding to amino acid residues 355-368 of SEQ ID NO: 1) or MCM2-3Q3.2 (

配列番号１のアミノ酸残基３６２〜３７５に対応する）中で、陽性の結果は得られなかっ
た。

No positive results were obtained in amino acid residues 362-375 of SEQ ID NO: 1.

結果
最初の結果から、ＭＣＭ２モノクローナル抗体２７Ｃ５．６のエピトープは、ＭＣＭ２
タンパク質のＮ末端領域内に位置していることが示された。引き続きのＭＣＭ２タンパク
質のトランケーションから、２７Ｃ５．６によって認識されるエピトープが、具体的には
配列番号１のアミノ酸残基３６９〜３８２（ Results From the initial results, the epitope of MCM2 monoclonal antibody 27C5.6 is MCM2
It was shown to be located within the N-terminal region of the protein. Subsequent truncation of the MCM2 protein revealed that the epitope recognized by 27C5.6 was specifically amino acid residues 369-382 of SEQ ID NO: 1 (

）に対応する、１４アミノ酸領域内に位置することが示された。さらなる回のＲＴＳによ
って、エピトープ位置選定をさらに精密にすることができるかもしれない。

) Corresponding to the 14 amino acid region. Further rounds of RTS may allow for more precise epitope location.

上述の同一のプロセスを用いて、ＭＣＭ２モノクローナル抗体２６Ｈ６．１９のエピト
ープを同定した。最初の結果から、エピトープがＭＣＭ２タンパク質のＣ末端領域内に位
置することが示された。エピトープを、具体的には配列番号１のアミノ酸残基６８８〜７
１０（ Using the same process described above, the epitope of MCM2 monoclonal antibody 26H6.19 was identified. Initial results indicated that the epitope is located within the C-terminal region of the MCM2 protein. The epitope, specifically amino acid residues 688-7 of SEQ ID NO: 1
10 (

）に対応する、２３アミノ酸領域に予備的に限定した。さらなる分析によって、ＭＣＭ２
モノクローナル抗体２６Ｈ６．１９のエピトープを、配列番号１のアミノ酸残基６８３〜
６９２（

) Corresponding to the 23 amino acid region. Further analysis revealed that MCM2
The epitope of monoclonal antibody 26H6.19 is determined from amino acid residues 683 to SEQ ID NO: 1.
692 (

）を含む１０アミノ酸領域に、さらに精密にした。

The 10 amino acid region containing) was further refined.

Claims (20)

ＭＣＭ２に特異的に結合することができるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、該モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、以下：
（ａ）ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６８として寄託されているハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６によって産生されるモノクローナル抗体、
（ｂ）ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６７として寄託されているハイブリドーマ細胞株２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体、
（ｃ）（ａ）のモノクローナル抗体の６つの相補性決定領域を含むモノクローナル抗体であって、（ａ）のモノクローナル抗体と同様の結合親和性を有するモノクローナル抗体、
（ｄ）（ｂ）のモノクローナル抗体の６つの相補性決定領域を含むモノクローナル抗体であって、（ｂ）のモノクローナル抗体と同様の結合親和性を有するモノクローナル抗体、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のモノクローナル抗体の抗原結合断片であって、断片がＭＣＭ２に特異的に結合する能力を維持している、抗原結合断片、
からなる群から選択される、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。 A monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof capable of specifically binding to MCM2, wherein the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof is:
(A) a monoclonal antibody produced by the hybridoma cell line 27C5.6 deposited at ATCC under patent accession number PTA-6668;
(B) a monoclonal antibody produced by the hybridoma cell line 26H6.19 deposited at ATCC under patent accession number PTA-6667;
(C) a monoclonal antibody comprising six complementarity determining regions of the monoclonal antibody of (a), the monoclonal antibody having the same binding affinity as the monoclonal antibody of (a) ,
(D) a monoclonal antibody comprising six complementarity determining regions of the monoclonal antibody of (b), the monoclonal antibody having the same binding affinity as the monoclonal antibody of (b) ,
(E) an antigen-binding fragment of a monoclonal antibody of (a)-(d), wherein the fragment maintains the ability to specifically bind to MCM2,
A monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof selected from the group consisting of: ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６８として寄託されているハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６によって産生されるモノクローナル抗体。   A monoclonal antibody produced by the hybridoma cell line 27C5.6 deposited at ATCC under patent accession number PTA-6668. ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６７として寄託されているハイブリドーマ細胞株２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体。   A monoclonal antibody produced by the hybridoma cell line 26H6.19 deposited at ATCC under patent accession number PTA-6667. ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６８として寄託されている、ハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６。   The hybridoma cell line 27C5.6, deposited with the ATCC under patent accession number PTA-6668. ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６７として寄託されている、ハイブリドーマ細胞株２６Ｈ６．１９。   Hybridoma cell line 26H6.19, deposited with ATCC under patent accession number PTA-6667. 請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生することができる、ハイブリドーマ細胞株。   A hybridoma cell line capable of producing the monoclonal antibody according to claim 1. 少なくとも１つの請求項１に記載のモノクローナル抗体を含む、高悪性度子宮頸疾患を診断するためのキット。   A kit for diagnosing high-grade cervical disease, comprising at least one monoclonal antibody according to claim 1. モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６８として寄託されているハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６によって産生されるモノクローナル抗体、またはＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６７として寄託されているハイブリドーマ細胞株２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項７に記載のキット。   The monoclonal antibody is produced by the hybridoma cell line 27C5.6 deposited at ATCC as patent deposit number PTA-6668, or the hybridoma cell line 26H6.19 deposited at ATCC as patent deposit number PTA-6667. The kit according to claim 7, which is a monoclonal antibody produced by 少なくとも２つの抗体を含み、第一の抗体が、ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６８として寄託されているハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６によって産生されるモノクローナル抗体であり、第二の抗体が、ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６７として寄託されているハイブリドーマ細胞株２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項７に記載のキット。   The first antibody is a monoclonal antibody produced by the hybridoma cell line 27C5.6 deposited at ATCC as patent accession number PTA-6668, and the second antibody is patented to ATCC. The kit according to claim 7, which is a monoclonal antibody produced by the hybridoma cell line 26H6.19 deposited under accession number PTA-6667. Ｔｏｐｏ２Ａに特異的に結合する抗体をさらに含む、請求項９に記載のキット。   The kit according to claim 9, further comprising an antibody that specifically binds to Topo2A. 各抗体が別々の抗体試薬として提供される、請求項９に記載のキット。   The kit of claim 9, wherein each antibody is provided as a separate antibody reagent. 抗体の全てが抗体カクテルとして提供される、請求項９に記載のキット。   The kit of claim 9, wherein all of the antibodies are provided as an antibody cocktail. 前記キットがペルオキシダーゼブロッキング試薬、タンパク質ブロッキング試薬、ＭＣＭ２への抗体結合を検出するための化学物質、対比染色剤、青みづけ剤、および使用のための手引きをさらに含む、請求項７に記載のキット。 8. The kit of claim 7, wherein the kit further comprises a peroxidase blocking reagent, a protein blocking reagent, a chemical for detecting antibody binding to MCM2 , a counterstain, a bluing agent, and instructions for use. パプ染色のための試薬をさらに含む、請求項７に記載のキット。   The kit according to claim 7, further comprising a reagent for Papu staining. パプ染色のための試薬がＥＡ５０およびオレンジＧを含む、請求項１４に記載のキット。   The kit according to claim 14, wherein the reagent for Papu staining comprises EA50 and Orange G. ａ）患者から得られた子宮頸試料と、ＭＣＭ２に特異的に結合する少なくとも１つの請求項１に記載のモノクローナル抗体とを接触させること、および
ｂ）ＭＣＭ２への抗体の結合を検出すること
を含む、患者における高悪性度子宮頸疾患の診断のために、子宮頸試料におけるＭＣＭ２の発現を検出する方法。 contacting a cervical sample obtained from a patient with at least one monoclonal antibody according to claim 1 that specifically binds to MCM2, and b) detecting binding of the antibody to MCM2. including, for the diagnosis of high-grade cervical disease in a patient, how to detect expression of MCM2 in cervical sample. モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６８として寄託されているハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６によって産生されるモノクローナル抗体、またはＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６７として寄託されているハイブリドーマ細胞株２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項１６に記載の方法。   The monoclonal antibody is produced by the hybridoma cell line 27C5.6 deposited at ATCC as patent deposit number PTA-6668, or the hybridoma cell line 26H6.19 deposited at ATCC as patent deposit number PTA-6667. The method of claim 16, which is a monoclonal antibody produced by 試料と、ＭＣＭ２に特異的に結合する少なくとも２つのモノクローナル抗体とを接触させることを含み、第一の抗体が、ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６８として寄託されているハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６によって産生されるモノクローナル抗体であり、第二の抗体が、ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６７として寄託されているハイブリドーマ細胞株２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項１６に記載の方法。   Contacting the sample with at least two monoclonal antibodies that specifically bind to MCM2, wherein the first antibody is produced by hybridoma cell line 27C5.6 deposited at ATCC as patent accession number PTA-6668. 17. The method of claim 16, wherein the second antibody is a monoclonal antibody produced by the hybridoma cell line 26H6.19 deposited at ATCC as patent accession number PTA-6667. 試料と、Ｔｏｐｏ２Ａに特異的に結合する抗体とを接触させることをさらに含む、請求項１８に記載の方法。   19. The method of claim 18, further comprising contacting the sample with an antibody that specifically binds to Topo2A. 抗体と試料とを、個々の抗体試薬として連続的に、または抗体カクテルとして同時に接触させる、請求項１８に記載の方法。   19. The method of claim 18, wherein the antibody and sample are contacted sequentially as individual antibody reagents or simultaneously as an antibody cocktail.