JP5767708B2 - ヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α(TNF−α)抗体およびその抗原結合性フラグメント(Fab)およびその使用方法 - Google Patents
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Description
b1)KS−7F:前記重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号27で示され、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号31で示される。
b2)KS−7A:前記重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号25で示され、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号31で示される。
b3)KS−2E:前記重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号25で示され、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号29で示される。
c1)KS−7F:Fabの重鎖フラグメントのコード配列は配列表の配列番号28で示され、且つFabの軽鎖のコード配列は配列表の配列番号32で示される。
c2)KS−7A:Fabの重鎖フラグメントのコード配列は配列表の配列番号26で示され、且つFabの軽鎖のコード配列は配列表の配列番号32で示される。
c3)KS−2E:Fabの重鎖フラグメントのコード配列は配列表の配列番号26で示され、且つFabの軽鎖のコード配列は配列表の配列番号30で示される。
d1)ヒト腫瘍壊死因子αに関連した病気の予防および/または治療のための薬の調整、または、
d2)ヒト腫瘍壊死因子αを中和するための生成物の調整、または
d3)ヒト腫瘍壊死因子αを定性的もしくは定量的に検出するためのキットの調整。
本実施例では、ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体の3つのFab(Fabは重鎖Fdフラグメントと抗体の軽鎖から成る)、即ちKS−2E,KS−7A,およびKS−7Fを含む。
(1)軽鎖および重鎖の配列の取得
ヒトの腫瘍壊死因子α(R&D社,カタログ番号:210−TA−050)の免疫性を付与したマウスから、ハイブリドーマ細胞を得て、モノクローナルスクリーニングを行い、全RNAを抽出し、テンプレートとして用い、重鎖可変領域のヌクレオチド配列を一般的なプライマーである、P1:5’−GCGAATTCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG−3’、P2:5’−TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG−3’を用い、PCRにより増幅し、且つ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、一般的なプライマーP3:5’−GACATTCTGMTSACMCAGMCTCC−3’、P4:5’−GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC−3’を用い、PCRにより増幅した。目的のバンドを含むゲル断片を、回収のために切り取った。抗体の軽鎖および重鎖の増幅産物は夫々、ベクターpMD18−T(TaKaRa社、カタログ番号:D101C)に挿入した。単一のコロニーを別々に選び、抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を確認するためにシークエンシングを行った。
アミノ酸配列の相同性の比較は、生成物の軽鎖可変領域とヒト化抗体の軽鎖可変領域、および、生成物の重鎖可変領域とヒト化抗体の重鎖可変領域とを比較した。配列相同性は、IgBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)、およびIMGT(ImMunoGeneTics,IMGT:http://www.imgt.org)で夫々検索した。検索結果に基づいて、軽鎖および重鎖共に相同性の高い配列を有する抗体をヒト化抗体のテンプレートとして選んだ。生成物の重鎖可変領域VHを、より配列の相同性が高いヒト化抗体IGHV3−15*07(登録番号:M99406)のフレームワーク領域へ接合し、生成物の軽鎖可変領域VKは、より配列の相同性が高いヒト化抗体IGKV6−21*01(登録番号:X63399)のフレームワーク領域へ接合した。
KS−2E、KS−7A、およびKS−7Fを含む。KS−2Eの重鎖フラグメントのアミノ酸配列は、配列表の配列番号25で示され、そのヌクレオチド配列は配列番号26で示され、且つ、KS−2Eの軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号29で示され、そのヌクレオチド配列は配列番号30で示される。KS−7Aの重鎖フラグメントのアミノ酸配列は、配列表の配列番号25で示され、そのヌクレオチド配列は配列番号26で示され、且つKS−7Aの軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号31で示され、そのヌクレオチド配列は配列番号32で示される。KS−7Fの重鎖フラグメントのアミノ酸配列は、配列表の配列番号27で示され、そのヌクレオチド配列は配列番号28で示され、且つKS−7Fの軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号31で示され、そのヌクレオチド配列は配列番号32で示される。
E.coli株Top10に上述の作成したFab発現ベクター(KS−2E、KS−7A、KS−7F、を夫々発現する3つのFab発現ベクターを含む)をトランスフォームし、その後、クロラムフェニコールと共に2−YTプレート(ペプトン1.6%、酵母エキス1%、NaCl 0.5%、および寒天末1.5%)上に蒔いた。翌日、いくつかの単一コロニーを選択するために適切なコロニー密度のプレートを選んだ。各陽性のコロニーから、8つの単一コロニーを選び、96穴ディープウェルプレートに蒔き、発現用のIPTGを用いて誘導した。各単一コロニーを、クロラムフェニコールを含む6mLの2−YT液体培地(ペプトン1.6%、酵母エキス1%、およびNaCl 0.5%)入りのチューブに加え、37℃、12時間、250rpmで振とうした。細菌懸濁液の0.2μLを各チューブからピペットで取り、保管のためにクロラムフェニコールを含む2−YTプレート上に移した。5mLの細菌懸濁液を、500mLのクロラムフェニコール含有2−YT液体培地に播種し、OD600が0.6に達するまで、33℃、300rmpで培養した。IPTGは3時間の誘導時間で様々なFabの発現を誘導させるために、培地へ最終濃度50μΜの濃度で加えた。誘導した発現が完了した後に、培地を10℃、15分間、5100rpmで遠心分離した。上清を廃棄し、バクテリアの沈殿を40mLの予冷したTES溶液で完全に再懸濁した。水で20%まで薄め予冷したTES66mLを、再懸濁したバクテリアの溶液へ再び加え、氷上で40分間インキュベートし、その後、4℃、10分、13000rpmで遠心分離した。遠心分離の後、Fabタンパク質(KS−2E、KS−7A、またはKS−7Fタンパク質)を含むぺリプラズム抽出物である上清を集めた。ぺリプラズム抽出物をG−25(GE社,17−0034−01)カラムを通して、脱塩した。プロテインG(GE社、17−0618−04)充填済みカラムを準備し、平衡溶液(20mMリン酸緩衝液、pH6.5)で平衡にし、タンパク質サンプルをロードした。サンプルのロード後、カラムを平衡溶液で連続して洗い、次に平衡溶液(0.1M Gly−HCl、pH2.5)で直接的に溶出した。溶出画分を集め、その収集前に分画収集チューブに1.0Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)を、トリス緩衝液と溶出画分が1:9の体積比率となるように添加しておき、溶出画分をpH7.0に迅速に調節した。収集した液体は目的のタンパク質を含む。タンパク質の純度をSDS−PAGEによって分析し、タンパク質サンプル中のタンパク質濃度を測定した。最後に、タンパク質サンプルをサブパッケージし、−80℃で保管し、これにより、高純度のFabタンパク質(3つのタンパク質、KS−2E、KS−7AおよびKS−7Fを含む)を得た。
1)ELISAによる腫瘍壊死因子αへのヒト化Fabの結合分析
腫瘍壊死因子αに結合するFabを次の手順によりスクリーニングした。ELISAプレートを、1ウェルあたり基質として100ngのヒト由来腫瘍壊死因子α(R&D社,カタログ番号:210−TA−050)でコーティングした。Fabタンパク質(手順2で準備した、3つのタンパク質、KS−2E、KS−7AおよびKS−7Fを含む)40nMを2倍希釈したものを添加し、インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトC−Kappa二次抗体(シグマ社,カタログ番号:K3502)を加え、最後に、TMBを反応の進行のために加え、2M硫酸は反応を止めるために入れ、これにより、腫瘍壊死因子α結合Fabタンパク質を測定した。このようなスクリーニング手順により、高い活性の3つのFabを得た。それはKS−2E、KS−7FおよびKS−7Aであり、これらのタンパク質は全体で2つの異なるVH(VH01およびVH02;VH01のアミノ酸配列は配列番号25で示され、ヌクレオチド配列は配列番号26で示され、VH02のアミノ酸配列は配列番号27で示され、ヌクレオチド配列は配列番号28で示される)、および2つの異なるVK(VK03およびVK05;VK03のアミノ酸配列は配列番号29で示され、且つそのヌクレオチド配列は配列番号30で示され、VK05のアミノ酸配列は配列番号31で示され、且つヌクレオチド配列は32で示される(表1))を含む。
更に、腫瘍壊死因子αの中和における前記の3つのヒト化Fab(KS−2E、KS−7FおよびKS−7A)の生物活性は、細胞生物学実験であるL929細胞毒性試験で検証した。この実験では、対数増殖期の1×104個のL929細胞を、96穴プレートのDMEM(10%FBS、Gibco社)培地中に播種した。24時間後に、ヒト由来腫瘍壊死因子α(R&D社,カタログ番号:210−TA−050)を0.5ng/mL、およびアクチノマイシンD(Fluka)を0.5μg/mL加えた。細胞を4つの群に分け、前記の3つのヒト化Fab、および対照の抗体RemicadeのFabフラグメントを各群にそれぞれ添加し、細胞を別途24時間培養した。最後に、細胞の生存率をCCK8キット(Dojindo研究所)で分析した。結果を図2に示す。この結果は、前記の3つのヒト化Fabは、腫瘍壊死因子αを効率的に中和する生物活性を発揮できることを示し、その中で、腫瘍壊死因子αの中和においてKS−7Aの生物活性は、ヒト−マウスキメラ抗体RemicadeのFabフラグメントの生物活性よりも優れていた。図2のデータは、3回行った実験の平均値±標準偏差である。
更に、前記のヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のFabフラグメントの抗原への親和性を増加させるために、ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のFabの発現ベクター内の、重鎖VH02 CDR3および軽鎖VK05 CDR3の親和性成熟ライブラリーを別々に作成した。重鎖と軽鎖のCDR3領域は、抗体の抗原への結合のために最も重要な領域であるので、CDR3領域の部位飽和変異誘導を行いスクリーニングすることが、より高い親和性を有する抗体作成につながる可能性がある。重鎖および軽鎖のCDR3の部位飽和変異誘導ライブラリーの作成のために、部位特異的変異誘導のための一組のプライマーを設計し、PCR反応で使用した。PCR反応により増幅した反応生成物は、一組のプライマーと同一の縮重比率で共に混在しており、ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のFabの発現ベクターにクローニングした。軽鎖CDR3の特定部位の突然変異誘発ライブラリーの作成は、以下のように行った。プライマー5シリーズおよび軽鎖下流プライマー6(5’−CGGAATTCCGTACGTTTCACTTCCAGATTGG−3’)を用い、且つ目的部分のDNA産物を産生するための鋳型として軽鎖のDNAを用い、PCRを行い、DNA産物をFab発現ベクターにクローニングし、エレクトロトランスファーを行い、軽鎖CDR3の特定部位の突然変異誘発ライブラリーの作成のために播種した。プライマー5シリーズはCDR3の変異部位を含み、総じて表3に記載の19個のプライマーを含む。CDR3の重鎖の特定部位の突然変異誘発ライブラリーの作成は、以下のように行った。変異プライマー7シリーズおよび重鎖下流プライマー8(5’−CCGCTCGAGGCGCTCACGGTCAGGGTGGTGCCCTG−3’)を用い、且つ目的部分のDNA産物を産生するための鋳型として重鎖のDNAを用い、PCRを行い、DNA産物をFab発現ベクターにクローニングし、エレクトロトランスファーを行い、重鎖CDR3の特定部位の突然変異誘発ライブラリーの作成のために播種した。プライマー7シリーズはCDR3の変異部位を含み、総じて表4に記載の22個のプライマーを含む。最終的に確立した軽鎖および重鎖の変異ライブラリーより、抗腫瘍壊死因子α(R&D社)への高い結合能を有する抗腫瘍壊死因子α抗体のFabを、ELISAの結果に基づき選択した。高い活性を有する2つの重鎖可変領域、即ち、SH01およびSH02を得るために重鎖変異体をスクリーニングした。また高い活性を有する6つ軽鎖可変領域、即ち、SH03、SH04、SH05、SH06、SH07およびSH08を得るために軽鎖変異体をスクリーニングした。
この実施例は、それぞれFA01およびFA02の名称を持つ2つのヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のFabに関する。FA01の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号15で示され(そのヌクレオチド配列は配列表の配列番号16で示される)、その軽鎖定常領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号19で示され(そのヌクレオチド配列は配列表の配列番号20で示される)、その重鎖Fdフラグメントの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号1で示され(そのヌクレオチド配列は配列表の配列番号2で示され)、その重鎖定常領域CH1のアミノ酸配列は配列表の配列番号33で示される(そのヌクレオチド配列は配列表の配列番号34で示される)。FA02の軽鎖可変領域は、配列表の配列番号9で示され(そのヌクレオチド配列は配列表の配列番号10で示される)、その軽鎖定常領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号19で示され(そのヌクレオチド配列は配列表の配列番号20で示される)、その重鎖Fdフラグメントの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号1で示され(そのヌクレオチド配列は配列表の配列番号2で示され)、その重鎖定常領域CH1のアミノ酸配列は配列表の配列番号33で示される(そのヌクレオチド配列は配列表の配列番号34で示される)。
2つのヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のFabを作成する過程は実施例1と同様である。前記の2つのヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のFabの重鎖および軽鎖をコードするDNAを、FA01に関するpFA01Fab発現ベクターを得るため、FA02に関するpFA02Fab発現ベクターを得るために、それぞれpTLRベクターの対応する領域に挿入した。前記の実施例1に記載の手順に従い、高純度のFA01およびFA02タンパク質を得た。
L929細胞毒性試験によって、前記の2つのヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のFab(FA01およびFA02)の生物活性を解析した。手順の詳細は実施例1と同様である。OD450値の結果を、EC50を計算するためにソフトウェアGraphPadプリズム5に入力した。結果を表5に示す。この結果は、FA01およびFA02の活性がRemicade抗体のFabフラグメントの活性より強力であることを示唆する。
手順1.ヒト化腫瘍壊死因子α抗体IgGに関する組み換え発現ベクターの作成
実施例1および2において得た、2つの重鎖Fdフラグメント(SH01とSH02をそれぞれ含む)および6つの軽鎖(SH03、SH05、SH04、SH06、SH07およびSH08をそれぞれ含む)をコードするDNAフラグメントを、表6に示す様に相互に結合し、オーバーラップ伸長PCR(overlap extension PCR)によりIgG1 Fc定常領域に関するDNAフラグメントを共に組み立て、組み換えにより発現プラスミドpcDNA3.1(+)に挿入した。CHO細胞を、作成した組み換え発現プラスミドでトランスフェクションし、完全長ヒト化抗体を発現させた。
KS01(Glu)、KS03(Glu)、KS05(Glu)、KS06(Glu)、KS09(Glu)およびKS10(Glu)の重鎖可変領域をコードするDNA配列はすべて、配列表の配列番号2(ヌクレオチド配列の第1〜3番目はGAGである)で示され、且つ配列番号1(第1番目のアミノ酸はGluである)に示される重鎖の可変領域をコードする。KS01(Gln)、KS03(Gln)、KS05(Gln)、KS06(Gln)、KS09(Gln)およびKS10(Gln)の重鎖可変領域をコードするDNA配列はすべて、ヌクレオチド配列の第1〜3番目をCAGに置換した配列表の配列番号2で示され、且つ配列番号1で示される重鎖可変領域(第1番目のアミノ酸はGlnである)をコードする。KS02、KS04、KS07、KS08、KS11およびKS12の重鎖可変領域をコードするDNA配列はすべて、配列表の配列番号4で示され、配列番号3のように示される重鎖可変領域をコードし、KS01(Glu),KS01(Gln)およびKS02の軽鎖可変領域をコードするDNA配列の全ては配列表の配列番号6で示され、且つ配列番号5に示される軽鎖可変領域をコードする。KS03(Glu)、KS03(Gln)およびKS04の軽鎖可変領域をコードするDNA配列はすべて、配列表の配列番号10で示され、配列番号9で示される軽鎖可変領域をコードする。KS05(Glu)、KS05(Gln)およびKS08の軽鎖可変領域をコードするDNA配列はすべて、配列表の配列番号8に示され、配列番号7に示されるような軽鎖可変領域をコードする。KS06(Glu)、KS06(Gln)およびKS07の軽鎖可変領域をコードするDNA配列はすべて、配列表の配列番号12に示され、配列番号11に示される軽鎖可変領域をコードする。KS09(Glu)、KS09(Gln)およびKS11の軽鎖可変領域をコードするDNA配列はすべて、配列表の配列番号14に示され、配列番号13に示される軽鎖可変領域をコードする。KS10(Glu)、KS10(Gln)およびKS12の軽鎖可変領域をコードするDNA配列はすべて、配列表の配列番号16に示され、配列番号15に示される軽鎖可変領域をコードする。18個の抗体の重鎖定常領域をコードするDNA配列は配列表の配列番号18で示され、配列番号17で示される重鎖定常領域をコードする。18個の抗体の軽鎖定常領域をコードするDNA配列は配列表の配列番号20で示され、配列番号19で示される軽鎖定常領域をコードする。
手順1で得た軽鎖組み換えプラスミドおよび重鎖組み換えプラスミドを、完全長ヒト化抗体を発現させるためにCHO細胞に同時導入した。表6に示されるような組み合わせに対応するプラスミドを、従来方法によりCHO細胞にそれぞれ安定的に同時導入した後、12個の対応する完全長組み換え抗体が細胞培養の上清に分泌された。上清を対応する完全長IgG抗体を得るために精製した。精製の手順の詳細は以下の通りである。
Mabselect Sure(GE社製)、Superdex200(GE社製)
アフィニティー平衡化緩衝液(PBS):0.2Mリン酸水素ナトリウム:82.5mL/L;0.2Mナトリウム二水素ナトリウム:17.5mL/L;2M塩化ナトリウム:75mL/L;に超純水を加えて、完全にかき混ぜてよく混合し、1M水酸化ナトリウムまたは1M塩化水素を用いてpHを7.1〜7.3に調整した。
アフィニティー溶出緩衝液:NaCl 2.922g/L、無水酢酸ナトリウム 0.49g/L、氷酢酸 2.9mL/L添加、pH3.4〜3.6。
アフィニティー再生緩衝液:5.8mL/L氷酢酸、pH3.0。
アフィニティー定置洗浄(CIP)緩衝液:1M水酸化ナトリウム100mL/L。
ゲル濾過クロマトグラフィー溶液(PBS):0.2Mリン酸水素ナトリウム:82.5mL/L;0.2Mリン酸二水素ナトリウム:17.5mL/L;2M塩化ナトリウム:75mL/L;超純水を加え、完全にかき混ぜよく混合し、1M水酸化ナトリウムまたは1M塩化水素を用いて、pHを6.8に調整した。
遠心分離:サンプルは、10〜15分、5000〜6000rpmで遠心分離した。
ろ過:遠心分離の後、サンプルの上清はH7(0.45+0.2μm)フィルターでろ過した。
AKTA精製システム(AKTA purification system)およびアフィニティー・クロマトグラフィー・カラム(Mabselect or Mabselect Sure)を設置する。カラム体積の2倍体積量の超純水で洗浄する。基線が安定するまでカラム体積の5倍体積量のアフィニティー平衡化緩衝液で洗浄し、サンプルを注入する。サンプルの注入後、カラム体積の5〜10倍体積量のアフィニティー平衡化緩衝液で洗浄する。その後、カラムをアフィニティー溶出緩衝液で、1カラム体積量で連続して溶出し、280nmのメジャー吸光度ピーク(major absorbance peak)に対応する画分を集めた。そのカラムはカラム体積の3倍体積量のアフィニティー再生緩衝液で溶出した。アフィニティー平衡化緩衝液で中性のpHになるように洗浄した。カラム体積の5倍体積量のMabselect CIP緩衝液もしくはMabselect Sure CIP緩衝液を用い、定置洗浄を行う。基線が安定するまで、カラム体積の3倍体積量のアフィニティー平衡化緩衝液で洗浄する。基線が安定するまで、カラム体積の3倍体積量の超純水で洗浄する。カラム体積の3倍体積量の20%エタノールで洗浄し、アフィニティー・クロマトグラフィー・カラムを保管する。
AKTA精製システムおよびSuperdex 200ゲル濾過クロマトグラフィーカラムを設置する。5mL/分に流量を調整して、1カラム体積量の超純粋で洗浄し、カラム体積の2倍体積量のSuperdex 200カラム・クロマトグラフィー平衡化液で洗浄する。2.5mL/分に流量を調整して、アフィニティー・クロマトグラフィー・ピークに対応する画分を集め、pH値を調整し、カラム上に直接注入した。サンプル注入の後、Superdex 200カラム・クロマトグラフィー平衡化液で溶出し、目的の280nmピークを集めた。引き続き1カラム体積量で洗浄した。クロマトグラフィーカラムは0.01M水酸化ナトリウムで保管した。
手順2で得た12個のヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体IgGを、L929細胞毒性試験(操作の詳細は実施例1に述べた通り)により腫瘍壊死因子αの中和の生物活性を試験し、その結果のOD450値を得て、EC50を計算するためにソフトウェアGraphPadプリズム5に入力した。腫瘍壊死因子αの活性を抑制するための12個のヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体IgGのEC50値を表7に示した。その結果は、ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体の生物活性はかなり増加し、KS10は最も高い生物活性があることを示す。従って、更なる抗体活性の詳細な調査は、主としてKS10に関して行った。
ヒト腫瘍壊死因子α(R&D社,210−TA−050)およびNHS−LCLC−ビオチン(Thermo−fisher社製,カタログ番号:21338)をモル比で1:3の比率で一様に混合し、1時間室温で保持した。その後、残りのNHS−LCLCビオチンは、PD−10脱塩カラム(GE社製、カタログ番号:17−0851−01)によって取り除いた。得られた最終結合産物は50μg/mLのビオチン−ヒト腫瘍壊死因子αであった。
SPFグレード、半分が雄で半分が雌、体重140〜180g、72匹の4〜6週齢Sprague Dawleyラット(laboratory animal license:SCXK(Sichuan)2008−24)を使用した。ラットを1週間慣らし、無作為に1群12匹で6群、即ち、正常群、負対照群、モデル対照群、KS10 5mg/kg群、KS10 10mg/kg群およびKS10 20mg/kg群に分けた。試験の初めに、正常群を除く各群のラットに10%抱水クロラール(350mg/kg)で麻酔をかけた。モデリングの前に、ラットに3つの異なる量のKS10(5mg/kg、10mg/kgおよび20mg/kg)を尾静脈注入し、負対照群およびモデル対照群のラットには等量の食塩水を尾静脈注入した。15分後に、0.5mg/mLのヒト腫瘍壊死因子α(R&D社,カタログ番号:210−TA−050)(1%BSAで溶かし、60μL/ラットの量を注入した)を1mLの注射器で、3つのKS10投与群およびモデル対照群に急性関節炎(1つの足首のモデリング)を引き起こすために、ラットの左足首の関節腔に注入し、等量の1%BSAを負対照群ラットの左足首の関節腔に注入した。注入の成功は、関節腔の両側のくぼみの漸次腫脹によって示された。正常群ラットには前記の注入は行わなかった。
40匹の健康なLewisラットを、正常群、モデル群、負対照群、KS10群に分けた。ラットに、10%抱水クロラール(0.35mL/kg1回投与)を腹腔内に注入した。ラットに麻酔をかけた後、モデル群および負対照群のそれぞれのラットに、毛様体筋の平らな部分を通してガラス体に生理食塩水10μLを注入し(30 G1/2針を使用)、4mg/mLのKS10溶解液(PBSで作成した)を10μL、KS10群のラットそれぞれに同様に注入した。30分後、10μLのヒト腫瘍壊死因子α(約0.5mg/mL)をモデル群およびKS10群の各ラットの静脈内に注入し、10μLの1%BSAを負対照群の各ラットの静脈内に注入した。最初の投与によりモデルが形成されてから24時間および48時間後に、ラットを麻酔し、細隙灯の下観察し、それぞれ採点した。採点基準は、文献(Fleisher LN,Ferrell JB,Smith MG,McGahan MC,“Lipid mediators of tumor necrosis factor−α−induced uveitis”Invest Ophthalmol Vis Sci,1991 Jul;32(8):2393−9)および改訂版を参照したものであり、虹彩の充血0〜2(0:充血なし、1:少し充血、2:重度の充血)、縮瞳0〜1(0:正常な瞳孔、1:縮瞳)、前房滲出0〜2(0:前房滲出なし、1:少し前房滲出;2:重度の前房滲出)、暗瞳孔(caligo pupillae)または虹彩後癒着0〜2(0:癒着なし、1:一方の部位で癒着、2:両方の部位で癒着)である。
Claims (21)
- 重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域を含み、
前記重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号1または3の配列で示され、
前記軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号15、9、11、7、13および5の配列のいずれか一つで示され、且つ
前記配列番号1の第1番目のアミノ酸はグルタミン酸またはグルタミンであることを特徴とするヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体または前記抗体の抗原結合性フラグメントFab。 - 下記a)〜l)のいずれか一つであり、配列番号1の第1番目のアミノ酸はグルタミン酸またはグルタミンである請求項1に記載のヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体。
a)配列番号1の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH01、および配列番号15の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH08、を有するKS10。
b)配列番号1の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH01、および配列番号9の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH05、を有するKS03。
c)配列番号1の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH01、および配列番号11の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH06、を有するKS06。
d)配列番号3の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH02、および配列番号15の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH08、を有するKS12。
e)配列番号3の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH02、および配列番号9の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH05、を有するKS04。
f)配列番号3の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH02、および配列番号11の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH06、を有するKS07。
g)配列番号3の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH02、および配列番号5の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH03、を有するKS02。
h)配列番号3の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH02、および配列番号7の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH04、を有するKS08。
i)配列番号3の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH02、および配列番号13の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH07、を有するKS11。
j)配列番号1の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH01、および配列番号5の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH03、を有するKS01。
k)配列番号1の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH01、および配列番号7の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH04、を有するKS05。
l)配列番号1の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH01、および配列番号13の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH07、を有するKS09。 - 重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域を含み、
前記重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号27の第1〜120番目、または配列番号25の第1〜120番目に相当し、
前記軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号31の第1〜109番目に相当する
ヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗原結合性フラグメントFab。 - 定常領域のアミノ酸配列がヒト抗体の重鎖の定常領域のアミノ酸配列と同一である重鎖、および
定常領域のアミノ酸配列がヒト抗体の軽鎖の定常領域のアミノ酸配列と同一である軽鎖から成る請求項1または2に記載のヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体。 - 前記重鎖の定常領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号17の配列で示され、且つ
前記軽鎖の定常領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号19の配列で示される
請求項1、2または4に記載のヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体。 - 前記重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号21の配列で示され、
前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号23の配列で示され、且つ
前記配列番号21の第1番目のアミノ酸はグルタミン酸またはグルタミンである請求項1、2、4、および5のいずれか一つに記載のヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体。 - 前記重鎖の可変領域および重鎖の定常領域CH1から成る重鎖フラグメントと、
前記軽鎖の可変領域および軽鎖の定常領域から成る軽鎖から成り、
前記CH1のアミノ酸配列はヒト抗体重鎖の定常領域CH1のアミノ酸配列と同一であり、且つ
前記軽鎖の定常領域のアミノ酸配列はヒト抗体軽鎖の定常領域のアミノ酸配列と同一である請求項1または3に記載の抗原結合性フラグメントFab。 - 前記CH1のアミノ酸配列は配列表の配列番号33の配列で示され、且つ
前記軽鎖の定常領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号19の配列で示される
請求項1、3または7のいずれかに記載の抗原結合性フラグメントFab。 - 下記b1)〜b3)のいずれか一つである請求項3、7または8のいずれかに記載の抗原結合性フラグメントFab。
b1)KS−7F:前記重鎖フラグメントのアミノ酸配列は配列表の配列番号27で示され、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号31で示される。
b2)KS−7A:前記重鎖フラグメントのアミノ酸配列は配列表の配列番号25で示され、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号31で示される。
b3)KS−2E:前記重鎖フラグメントのアミノ酸配列は配列表の配列番号25で示され、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号29で示される。 - 抗原結合性フラグメントAはFab、Fab’、F(ab’)2、Fv、重鎖の可変領
域、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントまたは軽鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントであり、
抗原結合性フラグメントBはFab’、F(ab’)2、Fv、重鎖の可変領域、軽鎖
の可変領域、重鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントまたは軽鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントである
請求項1、2、4、5および6のいずれかに記載の抗体に由来する抗原結合性フラグメントA、または
請求項1、3、7、8および9のいずれかに記載のFabに由来する抗原結合性フラグメントB。 - 下記A)〜C)のいずれか一つのタンパク質をコードする遺伝子。
A)請求項1、2、4、5および6のいずれか一つに記載の抗体。
B)請求項1、3、7、8および9のいずれか一つに記載のFab。
C)請求項10に記載の抗原結合性フラグメント。 - 請求項1、2、4、5および6のいずれか一つに記載の抗体、および配列表の配列番号2または4の配列で示される請求項10に記載の抗原結合性フラグメントA、の重鎖の可変領域のコード配列、
請求項1、2、4、5および6のいずれか一つに記載の抗体、および配列表の配列番号16、10、12、8、14および6のいずれか一つの配列で示される請求項10に記載の抗原結合性フラグメントA、の軽鎖の可変領域のコード配列、
請求項1、3、7、8および9のいずれか一つに記載のFab、および配列表の配列番号2、4、28、および26のいずれか一つの配列の第1〜360番目と同一の請求項10に記載の抗原結合性フラグメントB、の重鎖の可変領域のコード配列、または
請求項1、3、7、8および9のいずれか一つに記載のFab、および配列表の配列番号16、10、12、8、14、6、32、および30のいずれか一つの配列の第1〜327番目に相当する請求項10に記載の抗原結合性フラグメントB、の軽鎖の可変領域のコード配列、
である請求項11に記載のタンパク質をコードする遺伝子。 - 前記抗体の重鎖の定常領域のコード配列は配列表の配列番号18の配列で示され、且つ
前記抗体の軽鎖の定常領域のコード配列は配列表の配列番号20の配列で示され、
前記FabのCH1のコード配列は配列表の配列番号34の配列で示され、且つ
前記Fabの軽鎖の定常領域のコード配列は配列表の配列番号20の配列で示される
請求項11または12に記載のタンパク質をコードする遺伝子。 - 前記抗体の重鎖の定常領域のコード配列は配列表の配列番号22の配列で示され、且つ前記抗体の軽鎖の定常領域のコード配列は配列表の配列番号24の配列で示され、
請求項3、7、8および9のいずれか一つに記載のFabのコード配列は、下記c1)〜c3)のいずれか一つである
請求項11〜13のいずれか一つに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
c1)KS−7F:Fabの重鎖フラグメントのコード配列は配列表の配列番号28で示され、且つFabの軽鎖のコード配列は配列表の配列番号32で示される。
c2)KS−7A:Fabの重鎖フラグメントのコード配列は配列表の配列番号26で示され、且つFabの軽鎖のコード配列は配列表の配列番号32で示される。
c3)KS−2E:Fabの重鎖フラグメントのコード配列は配列表の配列番号26で示され、且つFabの軽鎖のコード配列は配列表の配列番号30で示される。 - 遺伝子材料であって、
請求項11〜14のいずれか一つに記載の遺伝子を含む
組み換えベクター、組み換え菌、組み換え細胞株、組み換えウイルス、または発現カセットである遺伝子材料。 - 前記組み換えベクターは、前記Fab、抗体、または抗原結合性フラグメントを発現させるための原核生物または真核生物発現ベクターであり、
前記組み換え菌は、前記遺伝子を有する大腸菌であり、
前記組み換え細胞株は、前記遺伝子を組み込んだ哺乳動物細胞株であり、
前記組み換えウイルスは、前記遺伝子を運搬する組み換えアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである
請求項15に記載の遺伝子材料。 - 前記組み換え細胞株は、CHO細胞株、または293細胞株およびその亜系統である請求項16に記載の遺伝子材料。
- d1)ヒト腫瘍壊死因子αに関連する病気の予防および/または治療のための薬の調整、
d2)ヒト腫瘍壊死因子αを中和するための生成物の調整、または
d3)ヒト腫瘍壊死因子αを定性的もしくは定量的に検出するためのキットの調整
のための、
請求項1、2、4、5および6のいずれか一つに記載の抗体、
請求項1、3、7、8および9のいずれか一つに記載のFab、
請求項10に記載の抗原結合性フラグメント、
請求項11〜14のいずれか一つに記載の遺伝子、または
請求項15〜17のいずれか一つに記載の遺伝子材料、
の使用方法。 - 補助材料および有効成分を含み、
前記有効成分は、
請求項1、2、4、5および6のいずれか一つに記載の抗体、
請求項1、3、7、8および9のいずれか一つに記載のFab、
請求項10に記載の抗原結合性フラグメント、
請求項11〜14のいずれか一つに記載の遺伝子、および
請求項15〜17のいずれか一つに記載の遺伝子材料の少なくとも一つを含み、
前記補助材料は薬学的に許容できる担体または賦形剤である
医薬組成物。 - 前記ヒト腫瘍壊死因子αに関連する病気は、ヒト腫瘍壊死因子αの増加が原因の病気である請求項18に記載の使用方法。
- 前記ヒト腫瘍壊死因子αに関連する病気は、関節リウマチ、自己免疫性ぶどう膜炎、クローン病、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、または若年性特発性関節炎である請求項20に記載の使用方法。
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