JP5765547B2 - 細胞を形質転換するための方法および組成物 - Google Patents
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Description
の方法は、任意の順序で、細胞に細胞のゲノムに組み込まれる受容体ベクターを導入し、この受容体ベクターは2つの不和合lox配列、L1およびL2を含んで成り、(b)細胞に、L1およびL2配列、またはL1およびL2配列と和合性の配列によりフランキング化された選択したDNAを含んで成る供与体ベクターを導入し、そして(c)L1およびL2をCreのような組換え酵素と接触させる工程を含んで成り、これにより選択したDNAを供与体ベクターから受容体ベクターに転移させる工程を含んで成る。組換え酵素は、タンパク質またはタンパク質をコードする遺伝子の状態で細胞に導入することができる。
L2と呼ぶ)を言う。例えばlox配列は、それらのヌクレオチド配列が特にそれらのスペーサー領域でわずか1ヌクレオチド異なれば、それらのヌクレオチド配列を不和合性にすることができる。対称的に、用語「和合性(compatible)lox配列」とは、組換え酵素により組換えを触媒される時、組換わることができる2つ以上のlox配列を言う。
直接トランスフェクトするウイルスベクターを含む。レトロウイルスを使用する場合の前提条件は、それらの使用の安全性、特に細胞増殖において野生型ウイルスの伝播の可能性に関する安全性を確保することである。複製−欠損レトロウイルスのみを産する特殊化された細胞系(「パッケージング細胞」と呼ばれる)の開発は、遺伝子治療のためのレトロウイルスの使用をますます広げ、そして欠損ウイルスは遺伝子治療を目的とする遺伝子導入の使用に十分に特徴が明らかとなっている(総説については、Miller,A.D.(1990)Blood 76:271を参照にされたい)。この組換えレトロウイルスは、レトロウイルスのコーディング配列の部分(gag、pol、env)が本発明のmALDHの突然変異したサブユニットをコードする核酸と置き換えられ、レトロウイルスの複製を欠損させるように構築することができる。複製欠損レトロウイルスは、次に標準的技法により、ヘルパーウイルスの使用を通して標的細胞を感染させるために使用することができるビリオンにパッケージされる。組換えレトロウイルスの作成および細胞をインビトロまたはインビボで、そのようなウイルスを用いて感染させるための手法は、分子生物学の現在の手法(Current Protocols in Molecular Biology)、Ausubel,F.M.ら(編集)、グリーネ出版アソシエイツ(Greene Publishing Associates)、(1989)、第9.10−9.14章、および他の標準的なラボラトリーマニュアルに見い出すことができる。適当なレトロウイルスの例には、当業者には周知のpLJ、pZIP、pWEおよびpEMを含む。異所性および両種指向性のレトロウイルス系の両方を調製するために、適当なパッケージングウイルス系の例は、ΨCrip、ΨCre、Ψ2およびΨAmを含む。レトロウイルスは種々の遺伝子を、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む多くの異なる細胞型にインビトロおよび/またはインビボで導入するために使用された(例えば、Eglitisら、(1985)Science 230:1395−1398;DanosおよびMulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460−6464を参照にされたい)。
ウイルス、ワクシニアウイルスおよび幾つかのRNAウイルスを含む。
って、1つの態様では、本発明の2つの不和合性lox配列は以下の配列を有する:
当業者は、本明細書に記載した本発明の特別な態様の多くの均等物を認識し、日常的な実験を使用するだけで確認することができるだろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図する。本明細書を通して引用するすべての技術文献および公開された特許明細書は、引用により本明細書に編入する。
材料および方法
DNA構築および細胞培養
DNAベクターは、標準法を使用して作成した(Sambrook,J.ら、(1989)、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル−第2版(Molecular Cloning:A Laboratory Manual−2nd ed,)、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、米国)。オリゴヌクレオチドは、リサーチ ジェネティックス社(Research Genetics Inc.)により合成した。DNA構造の正確さは、シークエンシングにより確認した。LXSNレトロウイルスベクター(Miller,A.D.ら、(1989)Biotechniques 7:980−990)はD.Miller(シアトルのフレッドハッチンソン癌研究センター:Fred Hutchinson Cancer Research Center)により、ハイグロマイシンB(Lupton,S.D.ら、(1991)Mol.Cell.Biol.11:3374−3378)ホスホトランスフェラーゼ遺伝子はD.Housman(ケンブリッジ、MIT)により、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV−TK)遺伝子(Lupton、同上)はM.R.capecchi(ユタ州、ソルトレイクシティ)により、U19 SV40T突然変異遺伝子(Renfranz,P.J.ら、(1991)Cell 66:713−729)は、R.D.McKay(ケンブリッジ、MIT)およびG.Almazan(モンテレアル、マックギル大学)により、Cre組換え酵素遺伝子(Sauer,B.ら、(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5166−5170)はD.W.Ow(アルバニー、UC バークレー)より、CD24(Pawlink,R.ら(1994)Blood 84:2868−2877)が提供された。MSCV(ネズミ幹細胞ウイルス)レトロウイルスベクター(Hawley,P.G.ら(1994)Gene Therapy 1:136−138)、pBabeレトロウイルスベクター(Morgenstern,J.P.ら(1990)Nucl.Acies
Res.18:3587−3598)はR.Weinberg(ケンブリッジ、MIT)により、pcDNAはインビトロジーン社(Invitrogene Corp.)、そしてpOPRSVICATはストラタジーン社(Stratagene)により提供された。NIH3T3細胞はATCCから、BOSC23細胞(Pear,W.S.ら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8392−8396)W.PearおよびD.Baltimore(ニューヨーク、ロックフェラー大学)から得た。
パッケージング細胞系、BOSC23を記載されているように(Pear、同上Danos,O.ら、(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460−6464)増殖させた。プラスミドDNAはキアジェン(Qiagen)法(キアジェン社)により調製し、そしてBOS23細胞にリン酸カルシウム法(5プライム:3プライム社(5prime:3prime.Inc.))を使用してトランスフェクトした。実験のウイルス上清は、記載されているように回収し、そして濾過した(Pear、同上Danos、同上)。すべての感染は8μg/ml Polybrene(シグマ:Sigma)の存在中で行った。BOSC23からのウイルス上清は、安定なウイルス法を行うために使用した。ウイルス力価は、すでに記載した(Pear、同上、Dano
s、同上)標準的な計算法を使用して、NIH3T3細胞の感染および選択により見積もった。ヘルパーウイルスの検出は、すでに記載した(Pear、同上、Danos、同上)β−ガラクトシダーゼ起動アッセイにより行った。選択は感染の2日後に行った。
本明細書に記載のCre/loxが媒介する遺伝子導入系を使用する遺伝子組込み効率を実験するために、以下の手法を使用して行った。
電気穿孔した細胞 使用した構築物 #コロニー
(107細胞のうち)
E#1 3T3 lox 1-PGKNeo-lox2 530
および対照Cre発現ベクター
E#2 3T3 lox 1-Neo-lox2 10
および対照Cre発現ベクター
E#3 3T3 lox 1-Neo-lox2 2
およびCre発現ベクター
E#4 lox A-ハイグロ-TK lox 1-Neo-lox2 21
-loxBを含む3T3 および対照Cre発現ベクター
E#5 同じ lox 1-Neo-lox2 コンフルエント
およびCre発現ベクター (>105)
用した。宿主細胞は、組み込まれた受容体ベクターを含まなかった。したがって、E#3は、受容体ベクターは不在であるが(すなわち、効率的な組換えおよび遺伝子導入は無い)、Cre組換え酵素が存在中で付与された耐性を示す。予想どおり、これは大変低かった。
全体としてこれらの結果は、本発明のレトロウイルスのCre/loxが媒介する遺伝子導入系が、哺乳動物細胞の染色体への導入遺伝子の高度に効率的かつ安定な組込みに使用できることを証明している。
Claims (22)
- 哺乳動物細胞中で部位特異的組換えを起こす方法であって、組換え酵素を
(a)該哺乳動物細胞のゲノムに組込まれる受容体ベクターであって、互いに組換わることができない2つのlox配列、L1およびL2を含む受容体ベクター、および
(b)該哺乳動物細胞のゲノム中には組込まれない供与体ベクターであって、該組込まれる受容体ベクターの過剰量で存在している供与体ベクター、
と接触させる工程を含んで成り、かつ、該供与体ベクターは受容体ベクター中に含まれる同じL1およびL2配列がそれぞれ両側に配置された状態でβ−グロビンポリペプチドをコードするDNAを含み、該組換え酵素はCreであり、これによりβ−グロビンポリペプチドをコードするDNAをL1およびL2配列での組換えにより供与体ベクターから受容体ベクターへ転移させることを、特徴とする上記方法。 - 受容体ベクターがレトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ベクターから成る群から選択される、請求項1記載の方法。
- L1およびL2がそれらのスペーサー配列中の1個以上の点突然変異により異なる請求項1記載の方法。
- L1およびL2が、それぞれLoxP1およびLox511ヌクレオチド配列(配列番号1および2)を含んで成る請求項1記載の方法。
- 受容体ベクターがレトロウイルスベクターである請求項1記載の方法。
- 選択したDNAで哺乳動物細胞を形質転換する方法であって、次の記載順で、
(a)哺乳動物細胞に、細胞のゲノムに組込まれる受容体ベクターであって、互いに組換わることができない2つの不和合性lox配列、L1およびL2を含む受容体ベクターを導入する工程、
(b)哺乳動物細胞に、受容体ベクター中に含まれる同じL1およびL2配列がそれぞれ両側に配置された状態で選択したDNAとしてのβ−グロビンポリペプチドをコードするDNAを含む供与体ベクターであって、該組込まれる受容体ベクターの過剰量で存在している供与体ベクターを導入する工程、および
(c)L1およびL2をCreと接触させ、これによりβ−グロビンポリペプチドをコードするDNAの供与体ベクターから受容体ベクターへの転移を引き起こす工程、
を含んで成る、上記方法。 - 受容体ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである請求項6記載の方法。
- L1およびL2が、それらのスペーサー配列中で少なくとも1個のヌクレオチド付加、欠失または置換により異なる請求項6記載の方法。
- L1またはL2のいずれかが、LoxP1ヌクレオチド配列(配列番号1)を含んで成る、請求項6記載の方法。
- L1またはL2のいずれかが、Lox511ヌクレオチド配列(配列番号2)を含んで成る、請求項6記載の方法。
- L1およびL2が、それぞれLoxP1およびLox511ヌクレオチド配列(配列番号1および2)を含んで成る、請求項6記載の方法。
- L1およびL2が同じ方向性を有する、請求項6記載の方法。
- 哺乳動物細胞にCre組換え酵素をコードする遺伝子を導入する工程をさらに含んで成る、請求項6記載の方法。
- Cre組換え酵素をコードする遺伝子が発現ベクターに含まれている、請求項13記載の方法。
- Cre組換え酵素をコードする遺伝子が、受容体ベクターまたは供与体ベクターのいずれかに含まれている、請求項13記載の方法。
- 供与体ベクターが哺乳動物細胞に電気穿孔法により導入される、請求項6記載の方法。
- 供与体ベクターおよびCre組換え酵素をコードする遺伝子の両方が、哺乳動物細胞に電気穿孔法により導入される、請求項13記載の方法。
- 供与体ベクター、受容体ベクター、または供与体および受容体ベクターの両方が、さらに選択可能なマーカー遺伝子を含んで成る請求項6記載の方法。
- (a)宿主哺乳動物細胞のゲノムに組込むことができる受容体ベクターであって、互いに組換わることができない2つのlox配列、L1およびL2を含む受容体ベクター、
(b)受容体ベクター中に含まれる同じL1およびL2配列がそれぞれ両側に配置された状態でβ−グロビンポリペプチドをコードするDNAを含む供与体ベクターであって、該組込まれる受容体ベクターの過剰量で存在している供与体ベクター、および
(c)L1およびL2配列で組換えを促進できる組換え酵素Creをコードする一過性発現ベクター、
を含んで成るCre/loxが媒介する遺伝子導入系。 - 受容体ベクターが、レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ベクターから成る群から選択される、請求項19記載の系。
- L1およびL2がそれらのスペーサー配列中の1個以上の点突然変異により異なる請求項19記載の系。
- L1およびL2が、それぞれLoxP1およびLox511ヌクレオチド配列(配列番号1および2)を含んで成る、請求項19記載の系。
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