JP5740112B2 - Nucleic acid primer set for LAMP amplification for coronavirus - Google Patents
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Description
本発明は、コロナウイルス由来の核酸を増幅および／または検出する手段に関する。 The present invention relates to a means for amplifying and / or detecting a coronavirus-derived nucleic acid.
コロナウイルスは、1本鎖の（+）鎖RNAゲノムを持つエンベロープウイルスである。細胞膜由来のウイルスエンベロープ表面に存在するクラブ様突起(Spike)によって太陽のコロナのような外観を持つことからこのように称される。ウイルス粒子形状は、直径60〜220nmの多形性であるが、楕円形あるいは、多形成の粒子を示すものも良く知られている。ウイルスの増殖は細胞質内で行われ、小胞体やゴルジ装置から出芽する。このウイルスはニドウイルス目、コロナウイルス科に分類されるが、コロナウイルス科は更に、コロナウイルス属、トロウイルス属に大別される。ヒトを含み様々な哺乳動物や鳥類に感染し、さまざまな疾病を引き起こす。主に呼吸器系、肝臓、小腸、中枢神経系等の疾患の原因となることが知られている。 Coronavirus is an enveloped virus with a single-stranded (+) RNA genome. It is called this because it has a solar corona-like appearance due to the club-like projections (Spikes) present on the surface of the viral envelope derived from the cell membrane. The virus particle shape is a polymorph with a diameter of 60 to 220 nm, but it is well known that an oval or polymorphic particle is shown. Virus growth occurs in the cytoplasm and buds from the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus. This virus is classified into Nidoviruses and Coronaviridae, and Coronaviridae is further classified into the genus Coronavirus and the genus Torovirus. Infects various mammals and birds including humans, causing various diseases. It is known to cause diseases such as respiratory system, liver, small intestine, central nervous system.
特に、コロナウイルス属ウイルスによって引き起こされる経済動物に対する重大な疾病には、牛コロナウイルス病（bovine coronavirus infection）、家畜伝染病予防法における届出伝染病である豚流行性下痢（porcine epidemic diarrhea;PED）や、豚伝染性胃腸炎（transmissible gastroenteritis of swine;TGE）が知られており、注目を集めている。一方、マウス、ラットなどの動物実験は、生命科学研究には必要不可欠である。再現性の高い動物実験を行うためには、病原微生物等を対象とした定期的な微生物モニタリングが必須である。それにより品質管理された実験動物が提供される。そのような状況において、マウスなどの実験動物では、最も重要な病原微生物の１つとしてコロナウイルス属ウイルスであるラットコロナウイルス（Rat coronavirus 、Rat sialodacryoadenitis coronavirus）や、マウス肝炎ウイルス（Murine hepatitis virus）を対象とした微生物モニタリングが定期的に実施されている。これまでの検査手法は、主に「血清抗体の検査」が用いられている。しかしながら、免疫不全動物や感染初期の動物では十分な抗体上昇がなく、囮動物を使用したとしても、あくまでも飼育室環境をモニターする形となり、実際に使用する実験動物自体の汚染の有無を直接検査することが出来ない。そのため、汚染を見逃す危険がある。これら抗体検査が無効な動物や、動物実験に関連した細胞及び配偶子などの汚染検査にはウイルス自体を特異的且つ迅速に検出する検査手法が求められている。 In particular, serious diseases for economic animals caused by coronavirus viruses include bovine coronavirus infection and porcine epidemic diarrhea (PED), a reported epidemic in the domestic animal epidemic prevention method. Also known is the transmissible gastroenteritis of swine (TGE). On the other hand, animal experiments such as mice and rats are indispensable for life science research. In order to conduct highly reproducible animal experiments, periodic microbial monitoring for pathogenic microorganisms and the like is essential. This provides quality-controlled laboratory animals. Under such circumstances, in laboratory animals such as mice, one of the most important pathogenic microorganisms is rat coronavirus (Rat coronavirus, Rat sialodacryoadenitis coronavirus) or murine hepatitis virus (Murine hepatitis virus). Targeted microbial monitoring is carried out regularly. As a conventional examination method, “serum antibody examination” is mainly used. However, there is no sufficient antibody rise in immunodeficient animals and animals in the early stages of infection, and even if rodents are used, the environment of the breeding room will be monitored, and the laboratory animals that are actually used will be inspected directly for contamination. I can't do it. Therefore, there is a risk of missing contamination. In order to test for contamination of animals in which these antibody tests are ineffective, or for contamination of cells and gametes associated with animal experiments, a test method for specifically and rapidly detecting the virus itself is required.
本発明は、コロナウイルス由来の核酸を特異的且つ迅速に増幅するためのプライマーセットを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a primer set for specifically and rapidly amplifying a nucleic acid derived from a coronavirus.
上記目的を達成するための手段は、
（１）コロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのLAMP増幅用核酸プライマーセットであって、前記LAMP増幅用核酸プライマーセットは、ＦIPプライマー、BIPプライマー、F３プライマー、Ｂ３プライマーを含み、
当該ＦＩＰプライマーは配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３若しくは配列番号１７若しくは配列番号４４またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含み、
当該ＢＩＰプライマーは配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１若しくは配列番号４５またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該Ｆ３プライマーは配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１４若しくは配列番号１９、配列番号３４、配列番号３５若しくは配列番号４６またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含み、および
当該Ｂ３プライマーは配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０若しくは配列番号２２またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含む
プライマーセット
である。
Means for achieving the above object are as follows:
(1) A LAMP amplification nucleic acid primer set for specifically amplifying a coronavirus-derived nucleic acid, wherein the LAMP amplification nucleic acid primer set includes a FIP primer, a BIP primer, an F3 primer, and a B3 primer,
The FIP primer comprises a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 44 or a complementary sequence thereof,
The BIP primer is selected from at least one selected from the group consisting of polynucleotides represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 45 or their complementary sequences. A polynucleotide comprising
The F3 primer comprises a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 46 or a complementary sequence thereof, and the B3 A primer is a primer set containing the polynucleotide shown by
本発明によれば、コロナウイルス由来の核酸を特異的且つ迅速に増幅するためのプライマーセットが提供される。 According to the present invention, a primer set for specifically and rapidly amplifying a coronavirus-derived nucleic acid is provided.
１．プライマー
本発明の１態様により、コロナウイルス由来の核酸を特異的且つ迅速に増幅するためのLAMP増幅用核酸プライマーセットが提供される。
1. Primer According to one embodiment of the present invention, a nucleic acid primer set for LAMP amplification for specifically and rapidly amplifying a nucleic acid derived from a coronavirus is provided.
ここにおける「ＬＡＭＰ法」は、それ自身公知の何れのＬＡＭＰ法をも含むが、好ましくはＲＴ−ＬＡＭＰ法である。ＲＴ-ＬＡＭＰ法とは、等温遺伝子増幅法であるＬＡＭＰ法の１種で、逆転写反応とＬＡＭＰ反応を同時に行う事によりＲＮＡを鋳型にＬＡＭＰ増幅できる方法である。ここにおいて「ＬＡＭＰ法」というとき、ＲＴ−ＬＡＭＰ法などを含むそれ自身公知の何れのＬＡＭＰ法を含む。「ＬＡＭＰ増幅」および「ＲＴ−ＬＡＭＰ増幅」とは、ＬＡＭＰ法またはＲＴ−ＬＡＭＰ法により行なわれる増幅または増幅工程を指す。 The “LAMP method” herein includes any LAMP method known per se, but is preferably the RT-LAMP method. The RT-LAMP method is one type of LAMP method, which is an isothermal gene amplification method, and is a method capable of performing LAMP amplification using RNA as a template by simultaneously performing a reverse transcription reaction and a LAMP reaction. Here, the “LAMP method” includes any known LAMP method including the RT-LAMP method. “LAMP amplification” and “RT-LAMP amplification” refer to an amplification or amplification step performed by the LAMP method or the RT-LAMP method.
一般的にＬＡＭＰ法は２種若しくは４領域または４種若しくは６領域のプライマーを用いる点がＰＣＲ法とは異なる。ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲを用いた方法に比べ増幅効率が優れていると共に、サンプル中の不純物の影響も受けにくい。そのため、簡便なサンプルの前処理で微量なコロナウイルス属に分類される微生物を検出することが可能である。 Generally, the LAMP method is different from the PCR method in that primers of two or four regions or four or six regions are used. The LAMP method is superior in amplification efficiency to the method using PCR and is not easily affected by impurities in the sample. Therefore, it is possible to detect microorganisms classified into a trace amount of coronavirus by simple sample pretreatment.
ＬＡＭＰ法におけるプライマー設計および得られる増幅産物について、図１および図２を参照して説明する。 The primer design in the LAMP method and the obtained amplification product will be described with reference to FIG. 1 and FIG.
図１は、検出されるべき二本鎖ＤＮＡと、合計４種類のプライマー配列、即ち、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーを示す。ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーは、各々二つの領域を含む。即ち、ＦＩＰはＦ１ｃとＦ２を含み、ＢＩＰはＢ２とＢ１ｃを含む。Ｆ３プライマーはＦ３領域を含む。Ｂ３プライマーはＢ３領域を含む。 FIG. 1 shows double-stranded DNA to be detected and a total of four types of primer sequences, ie, FIP primer, F3 primer, BIP primer, and B3 primer. The FIP primer and BIP primer each contain two regions. That is, FIP includes F1c and F2, and BIP includes B2 and B1c. The F3 primer contains the F3 region. The B3 primer contains the B3 region.
ここでＦ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃおよびＢ３ｃの各領域は、前記二本鎖ＤＮＡのうちの一本鎖ＤＮＡの５’→３’方向に向けてこの順で設定された領域である。またＢ３、Ｂ２、Ｂ１、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃおよびＦ３ｃの各領域は、その相補鎖の一本鎖ＤＮＡの５´→３´方向に向けてこの順で設定された領域である。Ｂ３とＢ３ｃ、Ｂ２とＢ２ｃ、Ｂ１とＢ１ｃ、Ｆ１ｃとＦ１、Ｆ２ｃとＦ２、Ｆ３ｃとＦ３は互いに相補鎖である。ここにおいて、ある配列名の配列は、当該配列名に「ｃ」を付した配列と互いに相補的な関係にあることを示す。例えば、「配列」という名称の配列がある場合、その相補鎖は「配列ｃ」と記載される。 Here, each region of F3, F2, F1, B1c, B2c, and B3c is a region set in this order from the 5 ′ → 3 ′ direction of the single-stranded DNA of the double-stranded DNA. The regions B3, B2, B1, F1c, F2c and F3c are regions set in this order from the 5 ′ to 3 ′ direction of the single-stranded DNA of the complementary strand. B3 and B3c, B2 and B2c, B1 and B1c, F1c and F1, F2c and F2, and F3c and F3 are complementary strands. Here, a sequence having a certain sequence name indicates that the sequence name is complementary to a sequence having “c” added thereto. For example, when there is a sequence named “sequence”, its complementary strand is described as “sequence c”.
このようなＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なうと、図１の二本鎖ＤＮＡの夫々の鎖から、図２に示すようなダンベル型のステム・アンド・ループ構造の増幅産物が得られる。その増幅機構については、例えば特開２００２−１８６７８１号公報を参照することが可能である。また、この４種のプライマーのほかにループプライマーを併せて用いてもよい。 When LAMP amplification is performed using such FIP primer, F3 primer, BIP primer, and B3 primer, a dumbbell-shaped stem and loop as shown in FIG. 2 is obtained from each strand of the double-stranded DNA of FIG. An amplification product of the structure is obtained. As for the amplification mechanism, for example, JP-A-2002-186871 can be referred to. In addition to these four types of primers, a loop primer may be used in combination.
ＲＴ−ＬＡＭＰ法が使用される場合、前記ＬＡＭＰ法反応液に逆転写活性を持つ酵素を添加して、逆転写反応を行いながらＬＡＭＰ増幅法を行えばよい。ＬＡＰＭ法であっても、ＲＴ−ＬＡＭＰ法であっても、同じ配列のプライマーを等しく使用することが可能である。 When the RT-LAMP method is used, an enzyme having reverse transcription activity may be added to the LAMP method reaction solution, and the LAMP amplification method may be performed while performing the reverse transcription reaction. Even in the LAPM method or the RT-LAMP method, primers having the same sequence can be used equally.
検出しようする配列であるターゲット配列は、一本鎖のループ部分またはステム部分の何れに対しても設定することが可能である。好ましくはループ部分に設定される。ターゲット配列とは、所望の増幅が行なわれた後に得られる増幅産物を検出する際に使用される配列である。ターゲット配列の有無の検出は、例えば、ターゲット配列に相補的なプローブとのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより行えばよい。 A target sequence, which is a sequence to be detected, can be set for either a single-stranded loop portion or stem portion. Preferably, it is set to the loop portion. The target sequence is a sequence used when detecting an amplification product obtained after desired amplification is performed. The presence / absence of the target sequence may be detected, for example, by detecting the presence / absence of hybridization with a probe complementary to the target sequence.
次に、一本鎖ループ部分にターゲット配列が位置するようにプライマーを設計する場合を説明する。図３を参照されたい。ターゲット配列（図３ではＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰおよびＢＰｃの何れかとして理解されればよい）が、領域Ｆ１とＦ２との間(この領域はＦ２領域を含んでもよい)、領域Ｆ２ｃとＦ１ｃとの間(この領域はＦ２ｃ領域を含んでもよい)、領域Ｂ１とＢ２との間(この領域はＢ２領域を含んでもよい)、および／または領域Ｂ２ｃとＢ１ｃとの間(この領域はＢ２ｃ領域を含んでもよい)の何れかに対応して位置するように、６つのプライマー領域を設定する。ターゲット配列は、上記それぞれの領域間に形成される一本鎖のループ部分のいずれの部位に位置するように設計されてもよい。ここで、プライマー領域Ｆ１とＦ２との間のループ部分には、Ｆ２領域自体も含まれてよい。こうして設定された６つのプライマー領域に基づいて４種類のプライマーを作製し、これらプライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なう。それにより、図４に示すような部分を一部として含むＬＡＭＰ増幅産物が得られる。このＬＡＭＰ増幅産物中においては、ターゲット配列ＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰ、ＢＰｃは増幅産物のダンベル構造における一本鎖ループ中に位置する。 Next, a case where the primer is designed so that the target sequence is located in the single-stranded loop portion will be described. Please refer to FIG. The target sequence (which may be understood as any of FPc, FP, BP and BPc in FIG. 3) is between regions F1 and F2 (this region may include the F2 region), and between regions F2c and F1c. (This region may include the F2c region), between the regions B1 and B2 (this region may include the B2 region), and / or between the regions B2c and B1c (this region includes the B2c region). 6 primer regions are set so as to correspond to any one of the above. The target sequence may be designed to be located at any part of the single-stranded loop portion formed between the respective regions. Here, the F2 region itself may be included in the loop portion between the primer regions F1 and F2. Four types of primers are prepared based on the six primer regions thus set, and LAMP amplification is performed using these primers. Thereby, a LAMP amplification product including a part as shown in FIG. 4 is obtained. In this LAMP amplification product, the target sequences FPc, FP, BP, and BPc are located in a single-stranded loop in the dumbbell structure of the amplification product.
一方、プライマー領域Ｆ１ｃとＦ１、およびＢ１ｃとＢ１は、もともと相補的な配列を有しているので、相互に自己ハイブリダイゼーションを生じて二本鎖を形成する。 On the other hand, since the primer regions F1c and F1 and B1c and B1 originally have complementary sequences, self-hybridization occurs with each other to form a double strand.
増幅産物中に含まれるターゲット配列は、図４に示すように、ループ中に一本鎖の部分が存在する。その部分を利用すれば、変性操作を行なうことなく、各ターゲット配列に対して相補的なプローブ核酸（ＦＰ、ＦＰｃ、ＢＰ、ＢＰｃ）との特異的ハイブリダイゼーションが行なえる。 As shown in FIG. 4, the target sequence contained in the amplification product has a single-stranded portion in the loop. By using this portion, specific hybridization with probe nucleic acids (FP, FPc, BP, BPc) complementary to each target sequence can be performed without performing a denaturation operation.
特異的ハイブリダイゼーションとは、一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphisms:SNPs)または変異が存在する場合、その僅かの違いも検出することが可能であることを意味する。 Specific hybridization means that if there are single nucleotide polymorphisms (SNPs) or mutations, even slight differences can be detected.
コロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットは、ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであってよい。各プライマーは、対象となるコロナウイルスのゲノムの塩基配列を基に、Ｆ１、Ｆ２、F３、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３領域を決定することにより設計することが可能である。 The primer set for specifically amplifying a coronavirus-derived nucleic acid may be a LAMP amplification nucleic acid primer set. Each primer can be designed by determining the F1, F2, F3, B1, B2, and B3 regions based on the base sequence of the target coronavirus genome.
好ましいＦ１領域、Ｆ２領域、F３領域、Ｂ１領域、Ｂ２領域およびＢ３領域、並びにＬＰｆ領域およびＬＰｂ領域の例を表Ａ−１に示す。ＬＰｆ領域およびＬＰｂ領域は、ループプライマーのための領域である。ループプライマーについては後述する。
ここにおいて、表中の配列番号を示すカラムにおいて“（）”内に示される番号は、同じヌクレオチド配列を有する配列の配列番号を示す。 Here, in the column indicating the sequence number in the table, the number shown in “()” indicates the sequence number of the sequence having the same nucleotide sequence.
また、それを基に設計した好ましいＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＰｆおよびＬＰｂの例を表Ａ−２に示す。
表Ａ−１の領域を基に設計されたプライマーにより得られる増幅産物を検出するためのプローブ領域の例を表Ｂ−１に示す。
表Ｂ−１に示した領域を利用したプローブの例を表Ｂ−２に示す。
また、表Ａ−１の領域を基に設計したプライマーの例は表１に示されるものであってもよい。
表Ａ−１に記載される領域が、コロナウイルスのゲノムのどの位置に対応するのかを表２に示す。
表２には、複数種のコロナウイルスのゲノムについてアラインメントを示した。最下段には、塩基について全ての種が共通する塩基を有する位置には「＊」を示し、種により変異のある位置には「．」を記した。表２に示す領域は、コロナウイルス属において高度に保存された領域である。また、当該プライマーにより増幅される領域は、コロナウイルスを特定するために特徴的な領域である。 Table 2 shows the alignment of multiple coronavirus genomes. In the bottom row, “*” is indicated at a position where all species have a common base for the base, and “.” Is indicated at a position where there is a mutation depending on the species. The regions shown in Table 2 are highly conserved regions in the coronavirus genus. In addition, the region amplified by the primer is a characteristic region for specifying coronavirus.
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｆ１領域は配列番号２４７（または配列番号２４１）またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。また、当該Ｆ１領域は、配列番号２４７またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入による変異を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、表２の同アライメント上の同領域の他の配列を参照されたい。また、配列番号２４７、変異を含む配列番号２４７およびそれらの相補配列は、その配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。 In a preferred primer set, the F1 region may consist of or comprise the polynucleotide shown by SEQ ID NO: 247 (or SEQ ID NO: 241) or its complementary sequence. In the F1 region, 1 to 5, preferably 1 to several nucleotides at any position of the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 247 or its complementary sequence are substituted, deleted, and / or mutated by insertion. You may have. For examples of such polynucleotides, see other sequences in the same region on the same alignment in Table 2. SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 247 containing mutations, and their complementary sequences are such that 1 to 5, preferably 1 to several nucleotides at any position in the sequence are mixed nucleotides or universal nucleotides. May be.
ここで、ユニバーサルなヌクレオチドの例は、これらに限定するものではないが、デオキシイノシン（deoxyinosine；dI)や、Ｇｒｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社の3−ニトロピロール（Nitropyrrole）、5-ニトロインドール（Nitroindole）、デオキシリボルラノシル（deoxyribofuranosyl ；dP)、デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-D-リボフラノシル（deoxy-5'-dimethoxytrityl-D-ribofuranosyl ；dK)が含まれる。 Here, examples of universal nucleotides include, but are not limited to, deoxyinosine (dI), 3-nitropyrrole (Nitropyrrole), 5-nitroindole (Nitroindole), and deoxyrevolol from Gren Research. Lanosyl (deoxyribofuranosyl; dP), deoxy-5'-dimethoxytrityl-D-ribofuranosyl (dK) are included.
またここで、プライマーの各配列間またはその末端側には、１〜１００ヌクレオチド、好ましくは２〜３０ヌクレオチド程度の配列（例えば、スペーサーとして使用される配列）が含まれていてもよい。当該プライマーの長さは３０〜２００ヌクレオチド程度であってよく、好ましくは３５〜１００ヌクレオチド、更に好ましくは４３〜６０ヌクレオチドであってよい。 Here, a sequence of about 1 to 100 nucleotides, preferably about 2 to 30 nucleotides (for example, a sequence used as a spacer) may be included between each sequence of the primer or on the terminal side thereof. The length of the primer may be about 30 to 200 nucleotides, preferably 35 to 100 nucleotides, and more preferably 43 to 60 nucleotides.
混合ヌクレオチドは一般的に「ミックス塩基」とも称される。混合ヌクレオチドを使用する場合、当該箇所が異なる塩基、即ち、アデニン、チミン、シトシンおよびグアニンの何れかをある塩基を含む複数の配列からなるプライマーが、１つの反応系、例えば、１つの反応容器中で２以上または全て混合されて一緒に使用されればよい。 Mixed nucleotides are also commonly referred to as “mixed bases”. When mixed nucleotides are used, a primer consisting of a plurality of sequences containing different bases, i.e., adenine, thymine, cytosine and guanine, in one reaction system, for example, one reaction vessel. It is sufficient that two or more or all of them are mixed and used together.
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｆ２領域は、配列番号２４８（または配列番号２４２）およびそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＦ２領域に好ましい各配列は、その何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入の変異を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、表２のアライメント上の同領域の他の配列を参照して得られる配列またはその相補鎖であってもよく、例えば、配列番号２４９またはその相補配列であってもよい。また、配列番号２４８および配列番号２４９、並びに変異を含む配列番号２４８および配列番号２４９、並びにそれらの相補配列は、その配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。 In a preferred primer set, the F2 region may comprise at least one polynucleotide selected from the group consisting of the polynucleotides represented by SEQ ID NO: 248 (or SEQ ID NO: 242) and their complementary sequences, respectively. You may include. Each sequence preferred for such an F2 region may have substitution, deletion and / or insertion mutations in 1 to 5, preferably 1 to several nucleotides at any position. An example of such a polynucleotide may be a sequence obtained by reference to other sequences in the same region on the alignment of Table 2 or a complementary strand thereof, such as SEQ ID NO: 249 or a complementary sequence thereof. Also good. In addition, SEQ ID NO: 248 and SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 248 and SEQ ID NO: 249 including mutations, and their complementary sequences are 1 to 5, preferably 1 to several nucleotides at any position in the sequence. May be mixed nucleotides or universal nucleotides.
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｆ３領域は配列番号２５０（または配列番号３）またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＦ３領域に好ましい各配列は、その何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入の変異を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、表２のアライメント上の同領域の他の配列を参照して得られる配列またはその相補鎖であってもよく、例えば、配列番号２５１（または配列番号３１若しくは２４３）またはその相補配列であってもよい。また、配列番号２５０、変異を含む配列番号２５０およびそれらの相補配列は、その配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。 In a preferred primer set, the F3 region may consist of or comprise the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 250 (or SEQ ID NO: 3) or its complementary sequence. Each sequence preferred for such an F3 region may have substitution, deletion and / or insertion mutations in 1 to 5, preferably 1 to several nucleotides at any position. An example of such a polynucleotide may be a sequence obtained by referring to other sequences in the same region on the alignment of Table 2 or a complementary strand thereof, such as SEQ ID NO: 251 (or SEQ ID NO: 31 or 243). Or a complementary sequence thereof. In addition, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 250 containing a mutation, and their complementary sequences are such that 1 to 5, preferably 1 to several nucleotides at any position in the sequence are mixed nucleotides or universal nucleotides. May be.
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｂ１領域は配列番号２５２（または配列番号２４４）およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＢ１領域に好ましい各配列はその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入の変異を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、表２のアライメント上の同領域の他の配列を参照されたい。また、配列番号２５２、変異を含む配列番号２５２およびそれらの相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。 In a preferred primer set, the B1 region may be composed of the polynucleotide shown by SEQ ID NO: 252 (or SEQ ID NO: 244) and its complementary sequence, or may contain the polynucleotide. Each sequence preferred for such B1 region may have substitution, deletion and / or insertion mutations in 1 to 5, preferably 1 to several nucleotides at any position. For examples of such polynucleotides, see other sequences in the same region on the alignment in Table 2. Alternatively, 1 to 5, preferably 1 to several nucleotides at any position of SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 252 containing a mutation, and their complementary sequences may be mixed nucleotides or universal nucleotides.
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｂ２領域は配列番号２５３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＢ２領域に好ましい各配列はその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入の変異を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、表２のアライメント上の同領域の他の配列を参照されたい。また、配列番号２５３、変異を含む配列番号２５３およびそれらの相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。 In a preferred primer set, the B2 region may consist of the polynucleotide shown by SEQ ID NO: 253 and its complementary sequence, or may contain the polynucleotide. Each sequence preferred for such a B2 region may have substitution, deletion and / or insertion mutations in 1 to 5, preferably 1 to several nucleotides at any position. For examples of such polynucleotides, see other sequences in the same region on the alignment in Table 2. In addition, 1 to 5, preferably 1 to several nucleotides at any position of SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 253 including a mutation, and their complementary sequences may be mixed nucleotides or universal nucleotides.
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｂ３領域は配列番号２５４（または配列番号４）およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＢ３領域に好ましい各配列はその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入の変異を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、表２のアライメント上の同領域の他の配列を参照して得られる配列またはその相補鎖であってもよく、例えば、配列番号２５５またはその相補配列であってもよい。また、配列番号２５４および配列番号２５５、および変異を含む配列番号２５４および配列番号２５５、並びにそれらの相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。 In a preferred primer set, the B3 region may be composed of the polynucleotide shown by SEQ ID NO: 254 (or SEQ ID NO: 4) and its complementary sequence, or may contain the polynucleotide. Each sequence preferred for such B3 region may have substitution, deletion and / or insertion mutations in 1 to 5, preferably 1 to several nucleotides at any position. An example of such a polynucleotide may be a sequence obtained by reference to other sequences in the same region on the alignment of Table 2 or a complementary strand thereof, such as SEQ ID NO: 255 or a complementary sequence thereof. Also good. Further, SEQ ID NO: 254 and SEQ ID NO: 255, and SEQ ID NO: 254 and SEQ ID NO: 255 containing mutations, and 1 to 5, preferably 1 to several nucleotides at any position of their complementary sequences are mixed nucleotides or It may be a universal nucleotide.
上記のような領域を使用したプライマーを用いて、コロナウイルス属に分類される微生物あるいはその遺伝子を含有する検体試料に対してＬＡＭＰ法による増幅を行うと、図４で説明したように、ステム・アンド・ループ構造が形成され、一本鎖のループ構造内に含まれるコロナウイルス属に分類される微生物由来のターゲット配列が得られる。 When amplification by the LAMP method is performed on a specimen sample containing a microorganism classified into the coronavirus genus or its gene using a primer using the region as described above, as described in FIG. An and loop structure is formed, and a target sequence derived from a microorganism classified into the genus Coronavirus contained in a single-stranded loop structure is obtained.
表１に示したプライマーの中でもコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅するために好ましいプライマーセットの例は次の通りである。 Among the primers shown in Table 1, examples of preferable primer sets for specifically amplifying a coronavirus-derived nucleic acid are as follows.
当該ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号４４若しくは配列番号２６０またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも１種類のＦＩＰプライマーであり、
当該ＢＩＰプライマーが配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１若しくは配列番号４５またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも１種類のＢＩＰプライマーであり、
当該Ｆ３プライマーが配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１９、配列番号３４、配列番号３５若しくは配列番号４８またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも１種類のＦ３プライマーであり、および
当該Ｂ３プライマーが配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号36若しくは配列番号４７またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも１種類のＢ３プライマーである
ＦIPプライマー、ＢIPプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを含むプライマーセットである。
The FIP primer specifically detects a polynucleotide or a coronavirus-derived nucleic acid represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 260 or a complementary sequence thereof. At least one FIP primer comprising the polynucleotide containing a mutation within amplifiable range,
The BIP primer is at least one selected from the group consisting of polynucleotides represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 45 or their complementary sequences, respectively. At least one BIP primer comprising the polynucleotide containing a mutation to the extent that can specifically amplify a polynucleotide or a coronavirus-derived nucleic acid,
A polynucleotide or coronavirus-derived nucleic acid in which the F3 primer is represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 48 or a complementary sequence thereof At least one F3 primer comprising the above-mentioned polynucleotide containing a mutation within a range capable of specifically amplifying, and the B3 primer is SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, at least one polynucleotide comprising a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 36 or SEQ ID NO: 47 or a complementary sequence thereof, or the aforementioned polynucleotide containing a mutation within a range that can specifically amplify a nucleic acid derived from a coronavirus. BIP primer FIP primer, BIP primer, F3 primer A primer set comprising a timer and B3 primers.
プライマーセットにおいて使用されるＦIPプライマー、ＢIPプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーの組み合わせの例は、以下の（１）〜（９）よりなる群から少なくとも１選択された組み合わせであってよい。これらの組み合わせは、（１）〜（９）に示される他のプライマーやそれ自身公知の何れのプライマーと同時に使用されてもよい。１つの組み合わせに含まれる配列の並びは、ＦIPプライマー、ＢIPプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーの順である：
（１） 配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（２） 配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（３） 配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（４） 配列番号１３、配列番号１０、配列番号１４および配列番号１２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（５） 配列番号１３、配列番号１５、配列番号１４および配列番号１６によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（６） 配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（７） 配列番号１７、配列番号２１、配列番号１９および配列番号２２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
ここで、（１）〜（７）の組み合わせは、コロナウイルスを検出することが可能なプライマーの組み合わせである。更に、そこにおいて、少なくとも１つのプライマーの一部にコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでもよい。そのような範囲とは、分類学的にコロナウイルスと同定されるために必ずしも必要ではない範囲であればよい；
（８） 配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
ここで、（８）の組み合わせにおいては、各配列中に複数の塩基を示す1塩基表示による記号を含む。それらの記号の示す塩基の意味は通常当該技術分野において一般的に使用される意味である。即ち、「ｒ」はグアニンまたはアデニン、「ｙ」はチミンまたはシトシン、「ｍ」はアデニンまたはシトシン、「ｋ」はグアニンまたはチミン、「ｓ」はグアニンまたはシトシン、「ｗ」はアデニンまたはチミン、「ｂ」はグアニンまたはシトシンまたはチミン、「ｄ」はアデニンまたはグアニンまたはチミン、「ｈ」はアデニンまたはシトシンまたはチミン、「ｖ」はアデニンまたはグアニンまたはシトシン、「ｎ」はアデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミンである。本明細書においてもこの通りに意味する。（８）の組み合わせでプライマーセットを使用する場合には、ミックス塩基で使用することは、ユニバーサルにウイルスを増幅するためにより効果的である。また、そこにおいて、少なくとも１つのプライマーの一部にコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでもよい。そのような範囲とは、分類学的にコロナウイルスと同定されるために必ずしも必要ではない範囲であればよい；
（９） 配列番号５９、配列番号６０、配列番号５８および配列番号６１によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（ａ）配列番号６８、配列番号６９、配列番号６７および配列番号７０によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（ｂ）配列番号７７、配列番号７８、配列番号７６および配列番号７９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（ｃ）配列番号８６、配列番号８７、配列番号８５および配列番号８９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（ｄ）配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０３および配列番号１０６によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（ｄ）配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１２および配列番号１１５によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（ｆ）配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２１および配列番号１２４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；並びに
（ｇ）配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３０および配列番号１３３によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；を含むプライマーの組み合わせ；
ここにおいて、（９）の組み合わせに含まれるプライマーセットは、コロナウイルスの種を同定する、または判定するために使用することも可能なプライマーセットである。これらのプライマーセットによりユニバーサルにウイルスを増幅する場合には、全てのプライマーセットを使用する方が好ましい。特定の種のコロナウイルスを増幅したい場合には、種に応じて使用するプライマーセットを選択してよい。組み合わせ（ａ）および（ｆ）はウシコロナウイルス（Bovine coronavirus）、（ｂ）、（ｃ）、（ｇ）および（ｈ）はヒトコロナウイルス（Human coronavirus）、（ｄ）および（ｉ）はブタ血球凝集脳脊髄炎ウイルス（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus）にそれぞれ好ましい。また、そこにおいて、少なくとも１つのプライマーの一部にコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでもよい。
An example of the combination of FIP primer, BIP primer, F3 primer and B3 primer used in the primer set may be a combination selected from the group consisting of the following (1) to (9). These combinations may be used simultaneously with other primers shown in (1) to (9) or any primer known per se. The sequence of sequences included in one combination is in the order of FIP primer, BIP primer, F3 primer and B3 primer:
(1) A combination of primers comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 or their complementary sequences;
(2) a combination of primers comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 or their complementary sequences;
(3) a combination of primers each comprising a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(4) A combination of primers comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 12 or their complementary sequences;
(5) A combination of primers comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16 or their complementary sequences;
(6) A combination of primers comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 or polynucleotides respectively complementary thereto;
(7) A combination of primers comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 22 or their complementary sequences;
Here, the combination of (1) to (7) is a combination of primers capable of detecting a coronavirus. Furthermore, a mutation may be contained in a part of at least one primer as long as a nucleic acid derived from coronavirus can be specifically amplified. Such a range may be a range that is not necessarily required to be taxonomically identified as a coronavirus;
(8) A combination of primers comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 and SEQ ID NO: 47 or polynucleotides complementary thereto;
Here, in the combination (8), each sequence includes a symbol by a single base indicating a plurality of bases. The meanings of the bases indicated by these symbols are those commonly used in the art. That is, “r” is guanine or adenine, “y” is thymine or cytosine, “m” is adenine or cytosine, “k” is guanine or thymine, “s” is guanine or cytosine, “w” is adenine or thymine, “B” is guanine or cytosine or thymine, “d” is adenine or guanine or thymine, “h” is adenine or cytosine or thymine, “v” is adenine or guanine or cytosine, “n” is adenine or guanine or cytosine or It is thymine. This also means in this specification. When using a primer set in the combination of (8), using a mixed base is more effective for universally amplifying the virus. In addition, a mutation may be included in a part of at least one primer as long as the nucleic acid derived from coronavirus can be specifically amplified. Such a range may be a range that is not necessarily required to be taxonomically identified as a coronavirus;
(9) a primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 61 or a complementary sequence thereof;
(A) a primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 67 and SEQ ID NO: 70, or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(B) a primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 76 and SEQ ID NO: 79, or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(C) a primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 85 and SEQ ID NO: 89, or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(D) a primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 103 and SEQ ID NO: 106, or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(D) a primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 112 and SEQ ID NO: 115 or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(F) a primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 121 and SEQ ID NO: 124 or a complementary sequence thereof; and (g) SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132 A primer consisting of a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 130 and SEQ ID NO: 133 or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
Here, the primer set included in the combination of (9) is a primer set that can also be used to identify or determine a coronavirus species. When a virus is universally amplified with these primer sets, it is preferable to use all the primer sets. When it is desired to amplify a specific species of coronavirus, a primer set to be used may be selected depending on the species. Combinations (a) and (f) are bovine coronavirus, (b), (c), (g) and (h) are human coronavirus, (d) and (i) are pigs Each is preferred for hemagglutinating encephalomyelitis virus. In addition, a mutation may be included in a part of at least one primer as long as the nucleic acid derived from coronavirus can be specifically amplified.
前記（９）のプライマーセットは、コロナウイルスの種に応じた増幅を可能にするプライマーセットの組み合わせの例である。これらの組み合わせは、以下に示すような組み合わせにおいて、種特異的に増幅するためのプライマーセットとして使用されてもよい。また、上記（１）〜（９）および／または以下の（１０）〜（１７）に示される他のプライマーやそれ自身公知の何れのプライマーと同時に使用されてもよい。１つの組み合わせに含まれる配列の並びは、ＦIPプライマー、ＢIPプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーの順である：
（１０） 配列番号５９、配列番号６０、配列番号５８および配列番号６１によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（１１） 配列番号６８、配列番号６９、配列番号６７および配列番号７０によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（１２） 配列番号７７、配列番号７８、配列番号７６および配列番号７９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（１３） 配列番号８６、配列番号８７、配列番号８５および配列番号８９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（１４） 配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０３および配列番号１０６によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（１５） 配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１２および配列番号１１５によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（１６） 配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２１および配列番号１２４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；並びに
（１７） 配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３０および配列番号１３３によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ：
また、そこにおいて、少なくとも１つのプライマーの一部にコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでもよい。
The primer set (9) is an example of a combination of primer sets that enables amplification according to the coronavirus species. These combinations may be used as primer sets for species-specific amplification in the combinations shown below. Moreover, you may use simultaneously with the other primer shown by said (1)-(9) and / or the following (10)-(17), and any well-known primer. The sequence of sequences included in one combination is in the order of FIP primer, BIP primer, F3 primer and B3 primer:
(10) A combination of primers comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 61 or their complementary sequences;
(11) A combination of primers each consisting of a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 67 and SEQ ID NO: 70 or a polynucleotide respectively represented by their complementary sequences;
(12) A combination of primers comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 76, and SEQ ID NO: 79 or polynucleotides complementary thereto;
(13) A combination of primers comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 85, and SEQ ID NO: 89 or their complementary sequences;
(14) A combination of primers comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 103, and SEQ ID NO: 106, or polynucleotides represented by their complementary sequences;
(15) A primer combination comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 112 and SEQ ID NO: 115, or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(16) a combination of primers comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 121 and SEQ ID NO: 124 or their complementary sequences; and (17) SEQ ID NO: 131, sequence A combination of primers consisting of the polynucleotide respectively represented by No. 132, SEQ ID No. 130 and SEQ ID No. 133, or the polynucleotide respectively represented by the complementary sequence thereof:
In addition, a mutation may be included in a part of at least one primer as long as the nucleic acid derived from coronavirus can be specifically amplified.
上述のプライマーの組合わせに加えて、更にループプライマーを使用してもよい。ループプライマーを使用することにより更に効率よく増幅を行なうことが可能である。好ましいループプライマーの例は、前記ＬＰｆが、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４８、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号１０７、配列番号１１６、配列番号１２５若しくは配列番号１３４またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含み、前記ＬＰｂが配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号４９、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号１０８、配列番号１１７、配列番号１２６若しくは配列番号１３５またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む。 In addition to the primer combinations described above, loop primers may also be used. Amplification can be performed more efficiently by using a loop primer. Examples of preferred loop primers are that the LPf is SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89. A polynucleotide represented by SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 125 or SEQ ID NO: 134, or a complementary sequence thereof, or the polynucleotide comprising a mutation within a range capable of specifically amplifying a nucleic acid derived from a coronavirus, LPb is SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 126 or SEQ ID NO: 135 or a complementary sequence thereof In specific amplifiable range nucleic acids from a polynucleotide or coronavirus shown comprising the polynucleotide comprising the mutant.
ユニバーサルな増幅を行なう場合に好ましいループプライマーは、ＬＰｆが、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９であり、ＬＰｂが配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３である。ループプライマーは、ＬＰｆまたはＬＰｂの何れかを使用してもよく、これらを同時に使用してもよいが、好ましくはＬＰｆまたはＬＰｂを同時に使用する。 Preferred loop primers for performing universal amplification are LPf of SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, and LPb of SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30. SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33. As the loop primer, either LPf or LPb may be used, and these may be used simultaneously, but preferably LPf or LPb is used simultaneously.
本発明は、上記のようなプライマーセットをコロナウイルス属に分類される微生物に対して適用すれば、コロナウイルス属に特徴的な遺伝子型を反映する核酸が増幅される。得られる増幅産物の有無を判定することにより、コロナウイルスの検出を行うことが可能である。従って、試料におけるコロナウイルスの検出は、検出対象である試料について、当該プライマーセットを用いて増幅反応を行うことを含む。 In the present invention, when the primer set as described above is applied to a microorganism classified into a coronavirus genus, a nucleic acid reflecting a genotype characteristic of the coronavirus genus is amplified. Coronavirus can be detected by determining the presence or absence of the obtained amplification product. Therefore, detection of coronavirus in a sample includes performing an amplification reaction on the sample to be detected using the primer set.
増幅反応の条件は、それ自身公知の何れかの条件を利用すればよい。また、当該増幅反応を行った結果を基に当該試料はコロナウイルスが含まれていると判定すればよい。そのような判定により試料中のコロナウイルスを検出することが可能である。 As the conditions for the amplification reaction, any conditions known per se may be used. Moreover, what is necessary is just to determine with the said sample containing the coronavirus based on the result of performing the said amplification reaction. By such determination, it is possible to detect coronavirus in the sample.
例えば、上記増幅反応は、１チューブ当たり１プライマーセットで行ってもよく、あるいは１チューブに各種遺伝子型に対応した複数のプライマーセットを用いて行ってもよい。複数の遺伝子型を特定する必要がある場合は、後者の方法で行う方が効率的である。 For example, the amplification reaction may be performed with one primer set per tube, or may be performed with a plurality of primer sets corresponding to various genotypes in one tube. When it is necessary to specify a plurality of genotypes, the latter method is more efficient.
また、上記増幅反応は、これに限定するものではないが、例えば、ＲＴ−ＬＡＭＰ法場合、反応液は以下の組成であってもよい；
ＲＴ−ＬＡＭＰ法の反応液組成
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭ ＫＣＬ
８ｍＭ ＭｇＳＯ４
１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
16 U Bst DNA polymerase
0.625U AMV Reverse transcriptase
このような組成の反応液で、総量２５μＬで反応を行う際には、下記の濃度でそれぞれのプライマーを持ち込んでもよい；
プライマー添加量
ＦＩＰプライマー ４０ｐｍｏＬ
ＢＩＰプライマー ４０ｐｍｏＬ
Ｆ３プライマー ５ｐｍｏＬ
Ｂ３プライマー ５ｐｍｏＬ。
The amplification reaction is not limited to this. For example, in the case of the RT-LAMP method, the reaction solution may have the following composition;
Reaction solution composition of RT-
10 mM KCL
8 mM MgSO 4
10 mM (NH 4 ) 2 SO 4
0.1% Tween20
0.8M Betaine
1.4 mM dNTPs
16 U Bst DNA polymerase
0.625U AMV Reverse transcriptase
When the reaction is carried out with a reaction solution having such a composition in a total volume of 25 μL, each primer may be brought in at the following concentration;
Primer addition amount FIP primer 40pmoL
BIP primer 40pmoL
F3 primer 5pmoL
ここで「試料」は「検体」または「検体試料」とも称してよく、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、フェレット、オナガザル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、アザラシ、ネズミイルカなどの哺乳類、鳥類などの体液、組織、細胞、並びに水、湖水、川水、海水および土壌などの環境に存在する何れかの物質であってもよい。例えば、血液、血清、白血球、尿、***、唾液、組織、バイオプシー、口腔内粘膜、培養細胞、喀痰等であってもよい。また、当該試料は、コロナウイルス属に分類される微生物あるいはその遺伝子が含まれている可能性の疑われる物質であってよい。そのような物質をそれ自身公知の手段により、核酸の増幅に適した状態に前処理したものであってもよく、何れの前処理もなされなくてもよい。例えば、そのような前処理の例は、変性、濾過、核酸抽出、不純物除去などを含む。 Here, “sample” may also be referred to as “specimen” or “specimen sample”, for example, human, mouse, rat, guinea pig, hamster, ferret, rhesus monkey, rabbit, dog, cat, cow, pig, sheep, seal, mouse It may be any substance present in the body fluids such as mammals such as dolphins, body fluids such as birds, tissues, cells, and water, lake water, river water, sea water and soil. For example, blood, serum, leukocytes, urine, semen, saliva, tissue, biopsy, oral mucosa, cultured cells, sputum and the like may be used. The sample may be a substance suspected of containing a microorganism classified into the genus Coronavirus or a gene thereof. Such a substance may be pretreated by means known per se into a state suitable for nucleic acid amplification, and any pretreatment may not be performed. For example, examples of such pretreatment include denaturation, filtration, nucleic acid extraction, impurity removal, and the like.
以上のようなプライマーセットを用いて核酸の増幅を行うことにより、簡便、安価、高速に、特異的にコロナウイルスを増幅することが可能である。これを利用して、試料に含まれる核酸を当該プライマーまたはプライマーセットを用いるＬＡＭＰ増幅反応に供し、増幅反応の結果生じた増幅産物の有無を判定することにより、当該試料にコロナウイルスを特異的に検出することが可能である。 By performing nucleic acid amplification using the primer set as described above, it is possible to specifically amplify coronaviruses simply, inexpensively and at high speed. Using this, the nucleic acid contained in the sample is subjected to the LAMP amplification reaction using the primer or primer set, and the presence or absence of the amplification product resulting from the amplification reaction is determined, so that the coronavirus is specifically detected in the sample. It is possible to detect.
従来の方法では、特異性を配列検出の際の特異性は、一般的にＰＣＲ法で増幅した目的遺伝子産物をＤＮＡチップにより検出している。この場合、ＰＣＲにより生成される産物は２本鎖であるため、プローブとハイブリダイゼーション反応させると、相補鎖がプローブに対するコンペティターとなりハイブリ効率が低く検出感度が悪い。そのような方法において、また従来では、ターゲットを１本鎖にするために、相補鎖を分解する、または分離するといった方法も取られている。これらの場合、酵素の使用、磁気ビーズの使用などによる高価な価格となったり、操作が煩雑性になったりする。また、コロナウイルス属に分類される微生物は、培養が難しく、適切な培養条件を整えたとしても、時間がかかる。このような問題も本発明を用いることにより解決される。 In the conventional method, the specificity at the time of sequence detection is generally detected by a DNA chip for the target gene product amplified by the PCR method. In this case, since the product generated by PCR is a double strand, when a hybridization reaction is carried out with the probe, the complementary strand becomes a competitor to the probe, resulting in low hybridization efficiency and poor detection sensitivity. In such a method, and conventionally, in order to make the target single-stranded, a method of decomposing or separating the complementary strand has been taken. In these cases, the price becomes high due to the use of an enzyme, the use of magnetic beads, etc., and the operation becomes complicated. In addition, microorganisms classified into the coronavirus genus are difficult to culture, and even if appropriate culture conditions are prepared, it takes time. Such a problem is also solved by using the present invention.
これまで、迅速診断法としては特異的な抗体を使って抗原−抗体反応を介して検出する方法や、ＤＮＡ配列中の特徴的な配列を含む領域をポリメラーゼチェインリアクション（PCR）で増幅し、電気泳動法により検出する方法などが知られていた。しかしながら、前者の方法では近縁株等との区別が難しいことや、感染初期には抗体が検出できない事が知られている。また、後者のＰＣＲを利用する方法は、サーマルサイクラーのような複雑な温度制御装置が必要なことや簡便性に課題があるなどの不利点がある。またＰＣＲ法では、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合にはその生成物が鋳型となり増幅してしまい、誤った判定をしてしまう可能性がある。実際に、プライマーの末端の１塩基相違のみでは特異的な増幅を制御することは困難である。このような問題も本発明を用いることにより解決される。 To date, rapid diagnostic methods include detection using a specific antibody via an antigen-antibody reaction, and a region containing a characteristic sequence in a DNA sequence is amplified by polymerase chain reaction (PCR). A method of detecting by electrophoresis is known. However, it is known that the former method is difficult to distinguish from closely related strains and that antibodies cannot be detected in the early stage of infection. Further, the latter method using PCR has disadvantages such as requiring a complicated temperature control device such as a thermal cycler and having a problem in simplicity. In addition, in the PCR method, if complementary strand synthesis is performed by mistake, the product becomes a template and amplifies, which may cause an erroneous determination. Actually, it is difficult to control specific amplification only by one base difference at the end of the primer. Such a problem is also solved by using the present invention.
ここで、本明細書に記載される核酸に関する情報を表３に纏めて示す。
２．プローブ
本発明は更に、上述のポリペプチドプライマーにより増幅されたコロナウイルスに由来する核酸を検出および／または分類するためのプローブおよびプローブセットもまた提供する。
2. Probes The present invention further provides probes and probe sets for detecting and / or classifying nucleic acids derived from coronavirus amplified by the polypeptide primers described above.
プローブは、所望の種を特異的に検出するためのプローブであってもよく、また、幾つかの種を特異的に検出するためのプローブであってもよい。このようなプローブは、例えば、上述のプライマーにより増幅されたステム・アンド・ループ構造を有するポリヌクレオチドの一本鎖のループ部分の領域に対して結合するように設定されればよい。また、当該プローブは好ましくは、約１０〜6０塩基長、約１２〜40塩基長などであればよい。 The probe may be a probe for specifically detecting a desired species, or may be a probe for specifically detecting several species. Such a probe should just be set so that it may couple | bond with the area | region of the single-stranded loop part of the polynucleotide which has the stem and loop structure amplified by the above-mentioned primer, for example. In addition, the probe preferably has a length of about 10 to 60 bases or about 12 to 40 bases.
当該増幅産物を検出するためのプローブは、検出する細ウイルス株の保持する遺伝的多型や変異などに応じて変化させてもよい。上述したプローブは、何れも各表に示した配列の任意の位置の塩基が1つまたは数個置換あるいは欠失あるいは塩基を挿入された配列からなってもよい。また、核酸プローブの構造も特に限定されるものではなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、メチルホスホネート骨格の核酸、その他の人工核酸鎖を用いることが可能である。また、これらのキメラ核酸でもよい。 The probe for detecting the amplification product may be changed according to the genetic polymorphism or mutation held by the fine virus strain to be detected. Each of the probes described above may be composed of a sequence in which one or several bases at any position in the sequences shown in each table are substituted, deleted, or inserted. The structure of the nucleic acid probe is not particularly limited, and DNA, RNA, PNA, LNA, methylphosphonate skeleton nucleic acid, and other artificial nucleic acid chains can be used. These chimeric nucleic acids may also be used.
例えば、好ましいプローブは、図３に示すようなステム・アンド・ループ構造のプライマー領域Ｆ１とＦ２との間(この領域はＦ２領域を含んでもよい)、プライマー領域Ｆ２ｃとＦ１ｃとの間(この領域はＦ２ｃ領域を含んでもよい)、プライマー領域Ｂ１とＢ２との間(この領域はＢ２領域を含んでもよい)、および／またはプライマー領域Ｂ２ｃとＢ１ｃとの間(この領域はＢ２ｃ領域を含んでもよい)の何れかの位置に対応するように選択されてよい。この選択は検出しようとするウイルス種に特異的な配列が適宜選択されるように行えばよい。或いは複数種を同時且つ特異的に、または広い範囲のウイルス種に亘り包括的、即ち、ユニバーサルに検出を行ってもよい。 For example, a preferred probe is between the primer regions F1 and F2 having a stem and loop structure as shown in FIG. 3 (this region may include the F2 region), between the primer regions F2c and F1c (this region). May include the F2c region), between the primer regions B1 and B2 (this region may include the B2 region), and / or between the primer regions B2c and B1c (this region may include the B2c region). ) May be selected to correspond to any of the positions. This selection may be performed so that a sequence specific to the virus species to be detected is appropriately selected. Alternatively, multiple species may be detected simultaneously and specifically, or comprehensively, ie, universally, over a wide range of virus species.
本発明に従うプローブの例は、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４５、配列番号１４６および配列番号１４７並びにそれらの相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に検出可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドによりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプローブ群から選択される少なくとも１であってもよい。これらのプローブは組み合わされて使用されてもよく、その塩基にミックス塩基が含まれている塩基がミックス塩基として使用されてもよい。これらのプローブを組み合わせたミックス塩基として、および／または単独でミックス塩基として使用可能である場合にはそのミックス塩基として使用することが、ユニバーサルな検出のためにより有利であるので好ましい。これらのプローブセットにより、コロナウイルス属、特にグループ2aに分類される微生物をユニバーサルに検出することが可能である。グループ２ａに含まれるコロナウイルスの例はウシコロナウイルス(Bovine coronavirus)、マウス肝炎ウイルス(Murine（Mouse） hepatitis virus)、ヒトコロナウイルス、ブタ血球凝集脳脊髄炎ウイルスおよびラットコロナウイルス（Rat coronavirus）であるが、これらに限るものではない。 Examples of probes according to the invention are SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, and SEQ ID NO: 147 and at least one selected from the group of probes consisting of the polynucleotides indicated by the polynucleotides each containing a mutation to the extent that the polynucleotides indicated by SEQ ID NO: 147 and their complementary sequences or nucleic acids derived from coronavirus can be specifically detected It may be. These probes may be used in combination, and a base containing a mixed base in the base may be used as the mixed base. It is preferable to use these probes as a mixed base in combination and / or when used alone as a mixed base, because it is more advantageous for universal detection. With these probe sets, it is possible to universally detect microorganisms classified into the coronavirus genus, particularly group 2a. Examples of coronaviruses included in group 2a are bovine coronavirus, mouse hepatitis virus (Murine (Mouse) hepatitis virus), human coronavirus, swine hemagglutinating encephalomyelitis virus and rat coronavirus (Rat coronavirus). There are, but are not limited to these.
また、当該プローブは、所望の種を検出するためのプローブであってもよい。そのようなプローブは、例えば、上述のプライマーにより増幅されたステム・アンド・ループ構造を有するポリヌクレオチドの一本鎖のループ部分の領域に対して結合するように設定されればよい。また、当該プローブは好ましくは、約１０〜6０塩基長、約１２〜40塩基長などであればよい。所望の種を検出するためのプローブは、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４５、配列番号１４６および配列番号１４７、並びにそれらの相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に検出可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドによりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプローブ群から選択される少なくとも１であってもよい。また、複数の種を同時に検出するために、上記の配列から２または２以上選択して組み合わせて使用されてもよい。また、検出したいウイルス種のためのプローブを所望に応じて選択し、それらを組み合わせて、プローブセットとして使用してもよい。２種以上のプローブが選択され組み合わされて使用されてもよく、それぞれの配列からなる全てのプローブが一緒に使用されてもよい。また、これらの配列を構成する何れかの１以上の塩基がミックス塩基で設計されてもよい。また、複数種類の塩基に対して対合可能な修飾塩基で置換するように設計されてもよい。更に、このようなプローブは所望の種を検出することに加えて、或いは当該検出に代えてウイルスの型分けのために使用してもよい。更に、組み合わせて使用して、および／またはミックス塩基で使用してユニバーサルにウイルスを検出するために使用されてもよい。 The probe may be a probe for detecting a desired species. Such a probe should just be set so that it may couple | bond with the area | region of the single-stranded loop part of the polynucleotide which has the stem and loop structure amplified by the above-mentioned primer, for example. In addition, the probe preferably has a length of about 10 to 60 bases or about 12 to 40 bases. Probes for detecting the desired species are SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53. SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120 , SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 1 6 and SEQ ID NO: 147, and a polynucleotide selected from the group consisting of the polynucleotides indicated by the polynucleotides indicated by the above-mentioned polynucleotides containing mutations to the extent that the polynucleotides indicated by the complementary sequences thereof or the nucleic acid derived from coronavirus can be specifically detected. It may be at least 1. In order to detect a plurality of species at the same time, two or more of the above sequences may be selected and used in combination. In addition, probes for virus species to be detected may be selected as desired and combined to be used as a probe set. Two or more types of probes may be selected and used in combination, or all probes consisting of the respective sequences may be used together. Further, any one or more bases constituting these sequences may be designed as a mixed base. Moreover, you may design so that it may substitute with the modified base which can be paired with respect to multiple types of bases. Further, such probes may be used for virus typing in addition to or in place of detecting the desired species. Furthermore, it may be used in combination and / or universally to detect viruses using mixed bases.
ウイルス種に対応するプローブの組み合わせの例を表４および表５に示す。
また、何れのプローブも、例えば、コロナウイルス・ピロリの場合などのように、同一種内での配列変異が明らかになっているなどの場合には、同一種内の配列変異に対応するために異なる配列からなるプローブを複数使用してよい。 In addition, in order to cope with the sequence variation within the same species, for example, in the case where the sequence variation within the same species has been clarified, such as in the case of coronavirus pylori, A plurality of probes having different sequences may be used.
何れのプローブおよびプローブセットも、上述した増幅産物を所望に応じて検出するために使用されてよい。当該プローブは、固相基体表面に固定化されたものであってもよく、典型的にはＤＮＡチップとして構成されたものが用いられてよく、また他のマイクロアレイを構成するプローブとして用いられてもよい。 Any probe and probe set may be used to detect the amplification products described above as desired. The probe may be immobilized on the surface of a solid phase substrate, typically a DNA chip may be used, or may be used as a probe constituting another microarray. Good.
核酸プローブを固相、例えば、基体に固定化する場合は、末端にアミノ基、チオール基、ビオチン、などの官能基を導入してもよく、更に、官能基とヌクレオチドの間にスペーサーを導入してもよい。ここで用いられるスペーサーの種類は特に限定されないが、例えばアルカン骨格、エチレングリコール骨格などを用いてよい。また、一部の塩基がユニバーサルなヌクレオチドに置換されてもよい。本発明使用可能なユニバーサルなヌクレオチドの例は、deoxyinosine(dI)や、Gren Research社の3-Nitropyrrole、5-Nitroindole、deoxyribofuranosyl (dP)、deoxy-5'-dimethoxytrityl-D-ribofuranosyl (dK)などを含む。 When the nucleic acid probe is immobilized on a solid phase, for example, a substrate, a functional group such as an amino group, a thiol group, or biotin may be introduced at the end, and a spacer is introduced between the functional group and the nucleotide. May be. Although the kind of spacer used here is not specifically limited, For example, you may use alkane frame | skeleton, ethylene glycol frame | skeleton, etc. Some bases may be substituted with universal nucleotides. Examples of universal nucleotides that can be used in the present invention include deoxyinosine (dI), Gren Research 3-Nitropyrrole, 5-Nitroindole, deoxyribofuranosyl (dP), deoxy-5'-dimethoxytrityl-D-ribofuranosyl (dK), etc. Including.
本発明で使用する検出法は、これらに特に限定されるものではないが、濁度、可視光、蛍光、化学発光、電気化学発光、化学蛍光、蛍光エネルギー転移法、ＥＳＲなどの光学的な手法や、電流、電圧、周波数、伝導度、抵抗などの電気的な性質を利用することも可能である。 The detection method used in the present invention is not particularly limited to these, but optical methods such as turbidity, visible light, fluorescence, chemiluminescence, electrochemiluminescence, chemiluminescence, fluorescence energy transfer method, ESR, etc. It is also possible to use electrical properties such as current, voltage, frequency, conductivity, and resistance.
基体に核酸プローブが固相されたＤＮＡチップの例を以下に説明する。図５のＤＮＡチップは、核酸プローブ固定化チップの非限定的な１例であるである。ＤＮＡチップ１は、基体２に固定化領域３を具備する。核酸プローブ４は該固定化領域３に固定化される。このようなＤＮＡチップ１は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体２に配置される固定化領域３の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。このようなＤＮＡチップは、蛍光を用いた検出方法のために好適に用いられてよい。1つの固定化領域には、独立した１つの信号として得ることが必要な情報を得るために必要な１種類または１種類以上の核酸プローブまたはプローブセットが固定化される。
An example of a DNA chip in which a nucleic acid probe is solid-phased on a substrate will be described below. The DNA chip in FIG. 5 is a non-limiting example of a nucleic acid probe-immobilized chip. The
図６のＤＮＡチップは、核酸プローブ固定化チップの非限定的な１例であるである。図６のＤＮＡチップ１１は、基体１２に電極１３を具備する。核酸プローブ１４は電極１３に固定化される。電極１３は、パット１５に接続される。電極１３からの電気的情報はパット１５を介して取得される。このようなＤＮＡチップ１１は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体１２に配置される電極１３の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。さらに、本例のＤＮＡチップは、必要に応じて、参照電極及び対極を具備してもよい。1つの固定化領域には、独立した１つの信号として得ることが必要な情報を得るために必要な１種類または１種類以上の核酸プローブまたはプローブセットが固定化される。
The DNA chip in FIG. 6 is a non-limiting example of a nucleic acid probe-immobilized chip. The
本発明で用いるプローブを固定化するための表面は、特に限定されるものではないが、樹脂ビーズ、磁気ビーズ、金属微粒子、マイクロタイタープート、ガラス基板、シリコン基板、樹脂製基板、電極基板などを用いることができる。 The surface for immobilizing the probe used in the present invention is not particularly limited, but resin beads, magnetic beads, metal fine particles, microtiter plates, glass substrates, silicon substrates, resin substrates, electrode substrates, etc. Can be used.
本発明で使用する基体の材料は、特に限定されるものではない。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素、等の無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。 The base material used in the present invention is not particularly limited. For example, inorganic insulating materials such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon carbide, silicon oxide, and silicon nitride can be used. In addition, polyethylene, ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylic resin, polyacrylonitrile, Use organic materials such as polystyrene, acetal resin, polycarbonate, polyamide, phenol resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene / acrylonitrile copolymer, acrylonitrile butadiene styrene copolymer, silicone resin, polyphenylene oxide, polysulfone, etc. it can.
例えば、電気的な性質を利用する場合、電極を基体に配置することが好ましい。電極は特に限定されるものではないが、例えば、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム、タングステン等の金属単体及びそれらの合金、あるいはグラファイト、グラシーカーボン等の炭素等、またはこれらの酸化物、化合物であってよい。更に、酸化珪素等の半導体化合物や、CCD、FET、CMOSなど各種半導体デバイスを用いてもよい。 For example, when using electrical properties, it is preferable to place the electrode on the substrate. The electrode is not particularly limited. For example, simple metals such as gold, gold alloy, silver, platinum, mercury, nickel, palladium, silicon, germanium, gallium, tungsten, and alloys thereof, or graphite, glassy Carbon such as carbon, or oxides or compounds thereof may be used. Furthermore, various semiconductor devices such as semiconductor compounds such as silicon oxide, CCD, FET, and CMOS may be used.
抽出方法は特に限定される物ではなく、フェノール−クロロホルム法等の液−液抽出法や担体を用いる固液抽出法を用いることができる。また、市販の核酸抽出方法ＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、（社製）等を利用することも可能である。次に、抽出した核酸成分を鋳型にＲＴ-ＬＡＭＰ増幅を行った後、遺伝子検出用電極とでハイブリダイゼーション反応を行う。反応溶液は、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストランや、サケ***DNA、牛胸腺DNA、EDTA、界面活性剤などを添加することが可能である。ここに抽出・増幅した核酸成分を添加の上、核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応に供与する。反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操作で反応速度を高めることもできる。反応温度は10℃〜90℃の範囲で、また反応時間は1分以上1晩程度行う。ハイブリダイゼーション反応後の洗浄には、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いる。 The extraction method is not particularly limited, and a liquid-liquid extraction method such as a phenol-chloroform method or a solid-liquid extraction method using a carrier can be used. Further, a commercially available nucleic acid extraction method QIAamp (manufactured by QIAGEN), (manufactured by Co., Ltd.) or the like can be used. Next, RT-LAMP amplification is performed using the extracted nucleic acid component as a template, and then a hybridization reaction is performed with the gene detection electrode. The reaction solution is carried out in a buffer solution having an ionic strength ranging from 0.01 to 5 and a pH ranging from 5 to 10. In this solution, it is possible to add dextran sulfate, which is a hybridization accelerator, salmon sperm DNA, bovine thymus DNA, EDTA, a surfactant, and the like. The extracted / amplified nucleic acid component is added to this and then donated to the hybridization reaction with the nucleic acid probe. During the reaction, the reaction rate can be increased by an operation such as stirring or shaking. The reaction temperature is in the range of 10 ° C to 90 ° C, and the reaction time is about 1 minute to overnight. For washing after the hybridization reaction, a buffer solution having an ionic strength of 0.01 to 5 and a pH of 5 to 10 is used.
抽出・増幅したサンプル核酸は、あらかじめFITCやCy3、Cy5、ローダミンなどの蛍光色素やビオチン、ハプテン、オキシダーゼやポスファターゼ等の酵素や、フェロセンやキノン類等の電気化学的に活性な物質で標識するか、あるいは前述した物質で標識したセカンドプローブを用いることで検出が可能になる。 Extracted and amplified sample nucleic acid is labeled in advance with fluorescent dyes such as FITC, Cy3, Cy5, rhodamine, enzymes such as biotin, hapten, oxidase and phosphatase, and electrochemically active substances such as ferrocene and quinones. Alternatively, detection can be performed by using a second probe labeled with the aforementioned substance.
電気化学的に活性な核酸結合物質を用いた検出を行う場合は、以下のような手順で検出を行う。基体を洗浄後、電極表面に形成した二本鎖部分に選択的に結合する核酸結合物質を作用させ、電気化学的な測定を行ってよい。ここで用いられる核酸結合物質は特に限定される物ではないが、例えば、ヘキスト33258、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレーター等を用いることが可能である。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。核酸結合物質の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には1ng/ml〜1mg/mlの範囲で使用する。この際、イオン強度0.001〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いる。電極を核酸結合物質と反応させた後、電気化学的な測定を行う。電気化学的な測定は、3電極タイプ、すなわち参照電極、対極、作用極、あるいは2電極タイプ、すなわち対極、作用極で行う。測定では、核酸結合物質が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、核酸結合物質に由来する反応電流値を測定する。この際、電位は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは、定電位を印加することができる。測定には、ポテンショスタット、デジタルマルチメーター、ファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御する。得られた電流値を基に、検量線から標的遺伝子の濃度を算出する。遺伝子検出用電極を用いた遺伝子検出装置は、遺伝子抽出部、遺伝子反応部、核酸結合物質反応部、電気化学測定部、洗浄部等から構成される。 When detection is performed using an electrochemically active nucleic acid binding substance, detection is performed according to the following procedure. After the substrate is washed, a nucleic acid binding substance that selectively binds to the double-stranded portion formed on the electrode surface may be allowed to act to perform electrochemical measurement. The nucleic acid binding substance used here is not particularly limited. For example, Hoechst 33258, acridine orange, quinacrine, dounomycin, metallointercalator, bisintercalator such as bisacridine, trisintercalator, polyintercalator, etc. It is possible to use. Furthermore, these intercalators can be modified with an electrochemically active metal complex such as ferrocene or viologen. The concentration of the nucleic acid binding substance varies depending on the type, but is generally used in the range of 1 ng / ml to 1 mg / ml. At this time, a buffer solution having an ionic strength of 0.001 to 5 and a pH of 5 to 10 is used. After the electrode is reacted with the nucleic acid binding substance, electrochemical measurement is performed. The electrochemical measurement is performed with a three-electrode type, that is, a reference electrode, a counter electrode, and a working electrode, or a two-electrode type, that is, a counter electrode and a working electrode. In the measurement, a potential higher than the potential at which the nucleic acid binding substance reacts electrochemically is applied, and the reaction current value derived from the nucleic acid binding substance is measured. At this time, the potential can be swept at a constant speed, applied with a pulse, or a constant potential can be applied. For the measurement, current and voltage are controlled by using a potentiostat, a digital multimeter, a function generator or the like. Based on the obtained current value, the concentration of the target gene is calculated from the calibration curve. A gene detection apparatus using a gene detection electrode includes a gene extraction unit, a gene reaction unit, a nucleic acid binding substance reaction unit, an electrochemical measurement unit, a washing unit, and the like.
３．アッセイキット
本発明に従うと、コロナウイルスの検出および／または分類するためのアッセイキットが提供されてもよい。そのようなアッセイキットは、上述のプライマーまたはプライマーセットとプローブまたはプローブセットとを含めばよい。当該アッセイキットは、当該プライマーまたはプライマーセットおよびプローブまたはプローブセットに加えて、ＬＡＭＰ増幅に必要なバッファーを含んでもよく、ハイブリダイゼーションに必要なバッファー、並びにそこにおいて当該増幅および／またはハイブリダイゼーションを行うための容器を具備してもよい。また、アッセイキットに含まれるプローブは基体に固定化されていてもよい。その場合の基体は上述した何れかの基体であればよい。
3. Assay Kit According to the present invention, an assay kit for detecting and / or classifying coronavirus may be provided. Such an assay kit may comprise a primer or primer set as described above and a probe or probe set. The assay kit may contain a buffer necessary for LAMP amplification in addition to the primer or primer set and probe or probe set, and a buffer necessary for hybridization, and for performing the amplification and / or hybridization there. The container may be provided. Moreover, the probe contained in the assay kit may be immobilized on a substrate. The substrate in that case may be any of the substrates described above.
４．コロナウイルス属の検出および分類方法
本発明に従うと、更に、コロナウイルスを検出する方法が提供される。当該検出方法は、上記したプライマー、プローブおよび増幅方法を利用することによって、更に、コロナウイルス属に分類される微生物の検出および属レベルまたは種レベルで遺伝子型分類を行う方法である。
4). Coronavirus Detection and Classification Method According to the present invention, a method for detecting a coronavirus is further provided. The detection method is a method of further detecting microorganisms classified into a coronavirus genus and genotyping at the genus level or species level by using the above-described primers, probes, and amplification methods.
そのような方法は、試料に含まれる核酸を上述の何れかのプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅する工程と、前記増幅により生じた増幅産物と上述の何れかのプローブとを反応することと、前記反応の結果から試料に存在するコロナウイルスを検出および／または分類することを具備すればよい。 Such a method includes a step of amplifying a nucleic acid contained in a sample using any of the above primer sets, reacting the amplification product generated by the amplification with any of the above probes, What is necessary is just to comprise detecting and / or classifying the coronavirus which exists in a sample from the result of reaction.
また、上述の何れかのプライマーセットを用いて、試料についてＬＡＭＰ増幅反応またはＲＴ−ＬＡＭＰ増幅を行うことと、当該増幅反応により生じた増幅産物と、上述の何れかのプローブとを反応し、それにより生じるハイブリダイズの有無を検出することにより試料におけるコロナウイルスの存在の有無を判定する、および／または試料に含まれるコロナウイルスを分類することを具備する方法であってもよい。 In addition, using any of the above primer sets, the sample is subjected to a LAMP amplification reaction or RT-LAMP amplification, and the amplification product generated by the amplification reaction is reacted with any of the above probes. The method may comprise determining the presence or absence of coronavirus in the sample by detecting the presence or absence of hybridization caused by the above and / or classifying the coronavirus contained in the sample.
また、例えば、そのようなコロナウイルス属に分類される微生物の感染や存在を検出する方法は；
本発明に従うプライマーから任意に選択される少なくとも１つのプライマーを含む複数のプライマーを使用して、ＬＡＭＰ反応またはＲＴ−ＬＡＭＰ反応により試料について核酸鎖増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応後に増幅産物の有無を検出する工程と、
を具備すればよい。当該試料は、予め核酸を抽出する工程に供されてもよい。
Also, for example, a method for detecting the infection and presence of microorganisms classified as such coronaviruses;
Performing a nucleic acid strand amplification reaction on a sample by a LAMP reaction or an RT-LAMP reaction using a plurality of primers including at least one primer arbitrarily selected from primers according to the present invention;
Detecting the presence or absence of an amplification product after the amplification reaction;
What is necessary is just to comprise. The sample may be subjected to a step of extracting nucleic acid in advance.
「ＬＡＭＰ増幅」とはそれ自身公知の何れかの条件下でＬＡＭＰ増幅を行なうことをいう。「ＲＴ-ＬＡＭＰ増幅」とは、逆転写を行いながらＬＡＭＰ反応により増幅対象の核酸を増幅することをいう。当該ＬＡＭＰ増幅は、上述の何れかのプライマーを用いて増幅対象の核酸を増幅可能なそれ自身公知の何れの条件で行なえばよい。 “LAMP amplification” refers to performing LAMP amplification under any known condition. “RT-LAMP amplification” refers to amplifying a nucleic acid to be amplified by a LAMP reaction while performing reverse transcription. The LAMP amplification may be performed under any known conditions that can amplify the nucleic acid to be amplified using any of the primers described above.
当該増幅産物と当該プローブとの反応は、上述の何れかのプローブを用いてハイブリダイズが可能なそれ自身公知の何れかの条件で行えばよい。 The reaction between the amplification product and the probe may be performed under any of the conditions known per se that allow hybridization using any of the probes described above.
LAMP産物に特徴的な複雑な高次構造が、ハイブリダイゼーション反応時においてプローブが結合した基体と物理的な障害を起こす要因となり、その結果ハイブリダイゼーション効率に悪影響を及ぼすことが見出されている（たとえば、特開2005-95043を参照されたい）。そのような悪影響を受けないようにするために、本発明に従うプローブは、従来のターゲット配列の位置とは異なり、一本鎖のループ部分にコロナウイルス属に分類される微生物由来のターゲット配列が位置するようにプライマーを設計した。 It has been found that the complex higher-order structure characteristic of the LAMP product causes a physical obstacle to the substrate to which the probe is bound during the hybridization reaction, and as a result, adversely affects the hybridization efficiency ( For example, see JP 2005-95043). In order to avoid such adverse effects, the probe according to the present invention differs from the position of the conventional target sequence in that a target sequence derived from a microorganism classified into the genus Coronavirus is located in a single-stranded loop portion. Primers were designed to
本発明によれば、簡便、安価、高速にコロナウイルス属に分類される微生物の検出および属レベルまたは種レベルで遺伝子型を分類する方法が提供される。 According to the present invention, there is provided a method for detecting microorganisms classified into the genus coronavirus at a high speed, at a low cost, and at a high speed and classifying genotypes at the genus level or species level.
以上のようなことから、問題となるウイルスに特徴的な遺伝子配列の存在の検出と迅速な同定を行うことの出来る方法が臨床診断現場や微生物モニタリング、疫学研究、その他様々な分野において求められている。これまで、迅速診断法としてはウイルスＲＮＡから逆転写酵素によりＤＮＡを作成した上、前記DNA配列中の特徴的な配列を含む領域をポリメラーゼチェインリアクション（PCR）で増幅し、電気泳動法により検出する方法（ＲＴ-ＰＣＲ法）などが知られている。しかしながら、PCRを利用する方法は、サーマルサイクラーのような複雑な温度制御装置が必要なことや簡便性に課題があるなどの不利点がある。またPCR法では、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合にはその生成物が鋳型となり増幅してしまい、誤った判定をしてしまう可能性がある。実際に、プライマーの末端の1塩基相違のみでは特異的な増幅を制御することは困難である。特異性を配列検出の際の特異性を挙げる方法としては、一般的にPCR法で増幅した目的遺伝子産物をDNAチップにより検出する手法が挙げられるが、PCRにて生成される産物が2本鎖であるため、プローブとハイブリダイゼーション反応させる場合に、相補鎖がプローブに対するコンペティターとなりハイブリ効率が低く検出感度が悪いのが問題であった。そこで、ターゲットを1本鎖にするために、相補鎖を分解する、または分離するといった方法がとられているが、いずれも、酵素の使用、磁気ビーズの使用などによる高価格化、操作における煩雑性が課題として残されており、これらに代わる新しい手法が求められている。 From the above, methods that can detect and quickly identify the presence of gene sequences characteristic of the virus in question are being sought in clinical diagnostic settings, microbial monitoring, epidemiological research, and other various fields. Yes. Up to now, as a rapid diagnosis method, DNA is prepared from viral RNA by reverse transcriptase, and a region containing a characteristic sequence in the DNA sequence is amplified by polymerase chain reaction (PCR) and detected by electrophoresis. A method (RT-PCR method) and the like are known. However, the method using PCR has disadvantages such as requiring a complicated temperature control device such as a thermal cycler and a problem in simplicity. Also, in the PCR method, if complementary strand synthesis is performed by mistake, the product will be amplified as a template and may be erroneously determined. Actually, it is difficult to control specific amplification only by one base difference at the end of the primer. As a method for raising the specificity in sequence detection, there is generally a technique of detecting a target gene product amplified by PCR using a DNA chip, but the product generated by PCR is double-stranded. Therefore, when the hybridization reaction with the probe is performed, the problem is that the complementary strand becomes a competitor to the probe, the hybridization efficiency is low, and the detection sensitivity is poor. Therefore, in order to make the target single-stranded, methods such as decomposing or separating complementary strands are used, but all of them are expensive due to the use of enzymes, magnetic beads, etc., and complicated operation Therefore, there is a need for new methods to replace them.
［例］
以下に、本発明による核酸検知方法について例を用いて具体的に説明する。
[Example]
Hereinafter, the nucleic acid detection method according to the present invention will be specifically described with reference to examples.
今回、発明者らは、コロナウイルス グループ２ａ（Coronavirus group 2a）および2bを構成するウイルス種では、ウイルスゲノム解析の結果nucleocapsid proteinをコードする遺伝子配列の一部領域が、ウイルス種毎にユニークな配列を保持しながら高度に保存されていることを見出した。そこで、先ず、コロナウイルス グループ２ａおよび２ｂの代表列としてＭＨＶ及びＳＤＡＶを用い、前記遺伝子領域において検知に最適なPrimer/Probe設計遺伝子配列を検討した（例１−６）。選定されたプライマーおよびプローブを用いて様々な検体を検出した。その結果、望ましい検出特性（検出信号量および検出特異性）が得られることが確認された。 In this study, the inventors of the virus species constituting Coronavirus group 2a (Coronavirus group 2a) and 2b, a partial region of the gene sequence encoding nucleocapsid protein as a result of virus genome analysis is a unique sequence for each virus species. And found that it is highly conserved. Therefore, first, using Primer / Probe designed gene sequences for detection in the gene region, MHV and SDAV were used as representative columns of coronavirus groups 2a and 2b (Example 1-6). Various specimens were detected using the selected primers and probes. As a result, it was confirmed that desirable detection characteristics (detection signal amount and detection specificity) were obtained.
次に、他のコロナウイルス２ａの種および株、即ち、ウシコロナウイルス、ヒトコロナウイルス ＨＫＵ１、ヒトコロナウイルス ＯＣ４３、ブタ血球凝集脳脊髄炎ウイルス、およびグループ2b（例として、ＳＡＲＳコロナウイルス）についても、前述したＭＨＶおよびＳＤＡＶを代表として選定した最適なプライマーおよびプローブに対応する遺伝子配列領域にプライマーおよびプローブを設計した。それぞれの核酸検出特性を確認した。それにより、望ましい検出特性が得られることを確認した。詳細を以下に記す。 Next, for other coronavirus 2a species and strains, namely bovine coronavirus, human coronavirus HKU1, human coronavirus OC43, swine hemagglutinating encephalomyelitis virus, and group 2b (eg, SARS coronavirus) Primers and probes were designed in gene sequence regions corresponding to the optimal primers and probes selected as representatives of the aforementioned MHV and SDAV. Each nucleic acid detection characteristic was confirmed. Thereby, it was confirmed that desirable detection characteristics were obtained. Details are described below.
例１
＜プライマーセットの選択＞
MHV（Murine hepatitis virus、アクセション番号NC_001846, NC_006852, AF208067, AF190408, AF190408, AF201929, AF700211, AY910861, M35253, M35254, M35255, M35256, M80644））からアライメントを作成し、変異のない、または変異頻度の少ない領域を選んでプライマーを設計した。MHVの一部をクローニングしたプラスミド（103copies/reaction）をテンプレートにして、以下の組成にて63℃90分Realoop-30（モリテックス社製）を用いてLAMP増幅を行った。プライマーの組み合わせと増幅結果（濁度立上がり時間）を合わせて表１に示す。濁度立上がり時間80分未満が３種、80分以上が４種得られた。このうち、上位４種を候補として選択し、ループプライマーの設計を行った。結果を表６に示す。
<Selection of primer set>
MHV (Murine hepatitis virus, accession numbers NC_001846, NC_006852, AF208067, AF190408, AF190408, AF201929, AF700211, AY910861, M35253, M35254, M35255, M35256, M80644)) Primers were designed by selecting a small area. LAMP amplification was performed using Realoop-30 (manufactured by Moritex Corporation) at 63 ° C. for 90 minutes with a plasmid (10 3 copies / reaction) obtained by cloning a part of MHV as a template. The primer combinations and amplification results (turbidity rise time) are shown in Table 1. Three types of turbidity rise times of less than 80 minutes and four types of turbidity rise times of 80 minutes or more were obtained. Of these, the top four were selected as candidates, and loop primers were designed. The results are shown in Table 6.
LAMP反応液組成（１×）
FIP 40 pmol
BIP 40 pmol
F3 5 pmol
B3 5 pmol
(Lfc/Lb 20 pmol)
2×Reaction Mixture 12.5 μl
8 U/μl Bst DNA polymerase 1μl
Template 1μl
Distilled Water Up to 25μl。
LAMP reaction solution composition (1x)
(Lfc /
2 x Reaction Mixture 12.5 μl
8 U / μl
Template 1μl
Distilled Water Up to 25 μl.
Reaction Mixture（反応時濃度）
Tris-HCl (pH8.8) 20 mM
KCL 10 mM
MgSO4 8 mM
(NH4)SO4 10 mM
Tween-20 0.1 %
Betaine 0.8 M
dNTPs 1.4 mM each。
Reaction Mixture
Tris-HCl (pH8.8) 20 mM
(NH4)
Tween-20 0.1%
Betaine 0.8 M
dNTPs 1.4 mM each.
＜ループプライマーの選択＞
上記で候補となったプライマーセットに対し、定法に従ってループプライマーを設計して合成した。上述の反応組成に20pmolのループプライマーを追加して同様にLAMP増幅を行った。テンプレートは添加前に９５℃５分処理したものを使用した。プライマーの組合せと増幅結果を合わせて表７に示す。この実験から各プライマーセットに対する良好なループプライマーを選択した。
Loop primers were designed and synthesized from the candidate primer sets described above according to a conventional method. LAMP amplification was similarly performed by adding 20 pmol of a loop primer to the above reaction composition. A template treated at 95 ° C. for 5 minutes before addition was used. The primer combinations and amplification results are shown in Table 7. Good loop primers for each primer set were selected from this experiment.
＜プライマーセットの最終選択＞
プライマー中に変異塩基があると増幅特性を悪化させるため、変異に富む実際の検体を網羅的に検出するには、変異が存在しない箇所をプライマーにすることが望ましい。したがって、絞り込まれた４種のプライマーセットのうち、最も変異確率の少ない、セット１−１が最良であると判断した。調査した配列中に存在する変異数は、以下の表で表される。
If there is a mutated base in the primer, the amplification characteristics are deteriorated. Therefore, in order to comprehensively detect actual samples rich in mutation, it is desirable to use a portion where no mutation exists as a primer. Therefore, it was judged that the set 1-1 having the lowest mutation probability among the four kinds of narrowed down primer sets was the best. The number of mutations present in the investigated sequences is represented in the following table.
上述の検討により、MHVを良好にLAMP増幅可能なプライマーセットを見出すことができた。 As a result of the above examination, it was possible to find a primer set capable of well LAMP amplification of MHV.
ＭＨＶについて上記プライマーでＬＡＭＰ増幅した結果を図７に示す。レーン２および３はＨＭＶのＬＡＭＰ産物についての結果である。レーン１は１００ｂｐラダーのマーカーである。
The results of LAMP amplification of MHV with the above primers are shown in FIG.
例２
＜SDAV（Rat sialodacryoadenitis coronavirus）用プライマーの設計＞
SDAV（Rat sialodacryoadenitis coronavirus、アクセション番号 AF207551）は、ラットに感染するコロナウイルスであるが、MHVと配列が類似していることから、共通のプライマーで増幅できる可能性が高い。そこで、SDAVも対応可能なプライマーとするため、プライマーセット１−１，１７−１それぞれに対応する領域の配列を調べ、表９に示すプライマーの組み合わせで増幅を行った。
<Design of primers for SDAV (Rat sialodacryoadenitis coronavirus)>
SDAV (Rat sialodacryoadenitis coronavirus, Accession No. AF207551) is a coronavirus that infects rats, but its sequence is similar to MHV, so it is highly likely that it can be amplified with a common primer. Therefore, in order to make the primer compatible with SDAV, the sequence of the region corresponding to each of the primer sets 1-1 and 17-1 was examined, and amplification was performed using the primer combinations shown in Table 9.
対応するプライマーは等量の混合とした。その結果、この混合プライマーはMHV、SDAVのいずれも濁度立上がり時間30分未満で増幅可能であることが示された。 The corresponding primers were mixed in equal amounts. As a result, it was shown that this mixed primer can be amplified in both MHV and SDAV with a turbidity rise time of less than 30 minutes.
例３
＜変異株用プライマーの設計＞
プライマーセット1-1について、プライマー領域にある変異箇所を調べたところ、F2領域、F3領域、B3領域およびLPb領域に頻度の高い変異があることがわかった。そこで、これら変異株も良好に増幅できるよう、表１０のプライマーを新たに追加して増幅を行った。
<Design of primers for mutants>
When primer sites 1-1 were examined for mutation sites in the primer region, it was found that there were frequent mutations in the F2 region, F3 region, B3 region, and LPb region. Therefore, amplification was performed by newly adding the primers shown in Table 10 so that these mutant strains could be amplified well.
対応するプライマーの混合量は等量とした。その結果、この混合プライマーは変異のない基準株、変異株のいずれも配列でも濁度立上がり時間30分未満で増幅可能であることが示された。 The mixing amount of the corresponding primer was equal. As a result, it was shown that this mixed primer can be amplified with a turbidity rise time of less than 30 minutes for both the reference strain and the mutant strain without mutation.
例４
＜RT-LAMP＞
プライマーセット１-1および変異対応追加プライマーを混合したLAMP増幅液（上述の例１の記載の組成と同様）に、0.625UのAMV transcriptaseを添加し、実際のMHVウイルス（譲渡された２つの基準株A59, JHM ）およびSDAVウイルスのRT-LAMP（６３℃６０分）を行った。その結果、抽出検体の段階希釈液において良好な増幅であった。
<RT-LAMP>
Add 0.625U AMV transcriptase to the LAMP amplification solution (same composition as described in Example 1 above) mixed with primer set 1-1 and mutation-added additional primer, and add the actual MHV virus (two transferred standards) Strains A59, JHM) and SDAV virus RT-LAMP (63 ° C. for 60 minutes). As a result, the amplification was good in the serial diluted solution of the extracted specimen.
例５
Probe配列設計
前記プライマーセットにて増幅されたＬＡＭＰ産物検出用プローブを選定するため、ＬＡＭＰ産物の1本鎖核酸領域にハイブリダイゼーションが可能な設計にて複数の候補配列を選定した。３’末端チオール修飾を持つ合成核酸として表１１に示すプローブ候補を準備した。
Probe sequence design In order to select a probe for detecting the LAMP product amplified by the primer set, a plurality of candidate sequences were selected by a design capable of hybridization to the single-stranded nucleic acid region of the LAMP product. Probe candidates shown in Table 11 were prepared as synthetic nucleic acids having a 3 ′ terminal thiol modification.
例6
＜プローブの選定＞
図6に模式的に示すような構成の核酸プローブ固定化電極を作製した。基板１２に配置された金電極１３に対して、プローブ候補となる配列の合成核酸（３’末端がチオール修飾されている）７〜１０をスポットすることにより配列毎に固定化した。
Example 6
<Selection of probe>
A nucleic acid probe-immobilized electrode having a configuration as schematically shown in FIG. 6 was produced. Synthetic nucleic acids (sequences of 3 ′ ends with thiol modification) 7 to 10 as probe candidates were spotted on the
また、同様にネガティブコントロールプローブもスポットした。その後、超純水で洗浄し、風乾し、電流検知型の核酸チップを作製した。作製した核酸チップを２×ＳＳＣの塩を添加したＬＡＭＰ産物に浸漬し、３５℃で60分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。LAMP産物は、標準株配列を持つプラスミドをテンプレートに増幅したものを用いた。更に、この電極を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含むリン酸緩衝液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定の結果を表４に示す。 Similarly, negative control probes were spotted. Thereafter, it was washed with ultrapure water and air-dried to produce a current detection type nucleic acid chip. The prepared nucleic acid chip was immersed in a LAMP product to which 2 × SSC salt was added and allowed to stand at 35 ° C. for 60 minutes to carry out a hybridization reaction. As the LAMP product, a plasmid amplified with a plasmid having a standard strain sequence was used. Furthermore, this electrode was immersed in a phosphate buffer containing 50 μM Hoechst 33258 as an intercalating agent for 15 minutes, and then the oxidation current response of Hoechst 33258 molecules was measured. The results of current measurement are shown in Table 4.
電極に固定化したプローブは、領域中に存在する変異をあらかじめ考慮したものを複数用意した。30nA以上の増加量を示す最適なプローブ、20-30nAの増加量を示す良好なプローブが得られ、MHV検出用核酸チップに搭載するプローブ配列を選択することができた。また、今回選定した最適なプローブを用いた場合、上述の例２から得られたＳＤＡＶ由来ＬＡＭＰ産物を検出サンプルとして使用したばあいについても、何れのプローブ配列からも30nA以上の電流増加量が得られることを確認した。 For the probes immobilized on the electrodes, a plurality of probes in consideration of mutations existing in the region were prepared. An optimal probe showing an increase of 30 nA or more and a good probe showing an increase of 20-30 nA were obtained, and the probe sequence to be mounted on the nucleic acid chip for MHV detection could be selected. In addition, when the optimal probe selected this time is used, when the SDAV-derived LAMP product obtained from Example 2 above is used as a detection sample, an increase in current of 30 nA or more is obtained from any probe sequence. It was confirmed that
例７
検出対象である、ＭＨＶ及びＳＤＡＶはＲＮＡウイルスである事から、ゲノム配列には多様な変異（バリエーション）が存在する。そこで、公表されている全てのＭＨＶ及びＳＤＡＶゲノム配列情報を基に、例１−６にて選定されてきた最適プライマーおよびプローブ領域の変異発生状況を確認した（表11を参照されたい）。
Example 7
Since MHV and SDAV, which are detection targets, are RNA viruses, there are various variations (variations) in the genome sequence. Therefore, based on all the published MHV and SDAV genome sequence information, the state of mutation occurrence in the optimal primer and probe regions selected in Example 1-6 was confirmed (see Table 11).
具体的には、それぞれの変異に対応する鋳型配列を合成遺伝子により作成したと伴に、全パターンについて変異対応プライマーおよびプローブを準備した。配列変異を含むウイルス配列検知を試みた。その結果、何れの組み合わせにおいてもプライマーおよびプローブ配列と検体がフルマッチであれば、30nA以上の電流増加量にて検出が可能であることを確認した。なお、近縁ウイルスであるBovine coronavirus、Human coronavirus HKU1、Human coronavirus OC43、Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus等の配列を持つ鋳型核酸を検体として適用した場合、何れのプライマーおよびプローブの組み合わせにおいても、優位な電流値増加（20ｎＡ以上）は認められなかった。 Specifically, a template sequence corresponding to each mutation was prepared by a synthetic gene, and mutation-compatible primers and probes were prepared for all patterns. Attempts were made to detect viral sequences containing sequence variations. As a result, it was confirmed that in any combination, detection was possible with a current increase of 30 nA or more if the primer and probe sequences and the specimen were in full match. In addition, when a template nucleic acid having a sequence such as Bovine coronavirus, Human coronavirus HKU1, Human coronavirus OC43, Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus, etc., which are related viruses, is applied as a specimen, a superior current value is obtained in any combination of primers and probes. An increase (over 20 nA) was not observed.
以上の事から、ＭＨＶ及びＳＤＡＶにおいては、上述の例１−６にて選定されたプライマーおよびプローブ領域を用いることで、望ましい検出特性（即ち、検出信号量および検出特異性）が得られること、必要に応じてプライマーおよびプローブの配列を一部改変することで、ウイルス配列変異に対しても検出特性を損なうことなく対応可能であることが確認できた。 From the above, in MHV and SDAV, it is possible to obtain desirable detection characteristics (that is, detection signal amount and detection specificity) by using the primer and probe regions selected in Example 1-6 above. It was confirmed that by modifying the primer and probe sequences partially as necessary, it was possible to cope with virus sequence mutations without impairing the detection characteristics.
ＨＭＶの陽性検体を用いて検出を行った結果を図８示す。また、陰性検体を用いた結果を図９に示す。 FIG. 8 shows the result of detection using a positive sample of HMV. Moreover, the result using a negative sample is shown in FIG.
例８
他のCoronavirus group 2a（Bovine coronavirus NC_003045、Human coronavirus HKU1 NC_005147、Human coronavirus OC43 NC_006577、Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus NC_007732）、 2b（ＳＡＲＳcoronavirus NC_004718）についても、上述の例１−７で示されたＭＨＶおよびＳＤＡＶを代表として選定した最適なプライマーおよびプローブの設計に対応する遺伝子領域を特定した。それぞれのウイルス種に対応したプライマーおよびプローブを構築した（表12を参照されたい）。
As for other Coronavirus group 2a (Bovine coronavirus NC_003045, Human coronavirus HKU1 NC_005147, Human coronavirus OC43 NC_006577, Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus NC_007732), 2b (SARV coronavirus NC_004718), the AV represented by SD in Example 1-7 above and the MHV represented by SD The gene region corresponding to the optimal primer and probe design selected as was identified. Primers and probes corresponding to each virus type were constructed (see Table 12).
ＭＨＶ及びＳＤＡＶを含めたCoronavirus group 2a、2bに対する検出特性を確認した。その結果、構築したプライマーおよびプローブにて、Coronavirus group 2a、2bの分類されるウイルス種を特異的かつ十分な信号量にて検知できることが確認できた
（表１3を参照されたい）。
例９
検出対象である、Coronavirus group 2a、2bはＲＮＡウイルスである事から、ゲノム配列には多様な変異（バリエーション）が存在する。そこで、上述の例７同様、公表されている全てのBovine coronavirus、Human coronavirus HKU1、Human coronavirus OC43、Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus、ＳＡＲＳcoronavirusのゲノム配列情報を元に、前述の例において選定されてきた最適なプライマーおよびプローブの領域の変異発生状況を確認。それぞれの変異に対応する鋳型配列を合成遺伝子により作成したと伴に、全パターンについて変異対応プライマーおよびプローブを準備した。それらを用いて配列変異を含むウイルス配列検出を試みた。その結果、何れの組み合わせにおいてもプライマーおよびプローブ配列と検体がフルマッチであれば、30nA以上の電流増加量にて検出が可能であることを確認した。検出結果の例を図１０〜図１２に示す。図１０はorcine hemagglutinating encephalomyelitis virus 陽性検体を用いて得た結果の例である。図１１は、Ｂｏｖｉｎｅ corona virus 陽性検体を当てた結果である。図１２は、陰性検体を当てた結果を示す。
Example 9
Since Coronavirus groups 2a and 2b, which are detection targets, are RNA viruses, there are various variations (variations) in the genome sequence. Therefore, as in Example 7 above, the optimal primers that have been selected in the above examples based on all published Bovine coronavirus, Human coronavirus HKU1, Human coronavirus OC43, Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus, and SARS coronavirus genome sequence information. Confirmation of mutation occurrence in the probe region. A template sequence corresponding to each mutation was prepared by a synthetic gene, and mutation-compatible primers and probes were prepared for all patterns. They were used to detect viral sequences containing sequence mutations. As a result, it was confirmed that in any combination, detection was possible with a current increase of 30 nA or more if the primer and probe sequences and the specimen were in full match. Examples of detection results are shown in FIGS. FIG. 10 is an example of results obtained using an orcine hemagglutinating encephalomyelitis virus positive specimen. FIG. 11 shows the result of applying a Bovine corona virus positive specimen. FIG. 12 shows the result of applying a negative sample.
なお、変異対応を行なったプライマーおよびプローブを使用した場合であっても、表13に示したのと同様、近縁ウイルス間での交差反応による２０ｎＡ以上の優位な電流値増加は全く認められなかった。この事は、配列の更に異なる他のウイルス属・ウイルス種や、他の微生物との交差反応を生じないことを示唆する。 Even when primers and probes that have been mutated are used, as shown in Table 13, there is no significant increase in current value of 20 nA or more due to cross-reactions between related viruses. It was. This suggests that cross-reactions with other virus genera / virus species with different sequences and other microorganisms do not occur.
考察
以上の事から、本発明にて選定されたプライマーおよびプローブ領域を用いることで、コロナウイルス グループ2aおよび2bの検出ならびに種判別および／またはタイピングを、望ましい検出特性（即ち、検出信号量および検出特異性）にて行な得ることが示された。また必要に応じてプライマーおよびプローブの配列を一部改変する事で、コロナウイルス グループ2aおよび2bを構成するウイルス種およびウイルス配列変異に対して、検出特性を損なうことなく対応可能であることが確認できた。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された実施形態を付記する。
[１] コロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのLAMP増幅用核酸プライマーセットであって、前記LAMP増幅用核酸プライマーセットは、ＦIPプライマー、BIPプライマー、F３プライマー、Ｂ３プライマーを含み、
当該ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７若しくは配列番号４４またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも１種類のＦＩＰプライマーであり、
当該ＢＩＰプライマーが配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１若しくは配列番号４５またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも１種類のＢＩＰプライマーであり、
当該Ｆ３プライマーが配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１９、配列番号３４、配列番号３５若しくは配列番号４６またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも１種類のＦ３プライマーであり、および
当該Ｂ３プライマーが配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号36若しくは配列番号４７またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも１種類のＢ３プライマーである
プライマーセット。
[２] 前記[１]に記載のプライマーセットであって、前記ＦIPプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーの組み合わせが以下からなる群より少なくとも１選択され、前記増幅がコロナウイルス由来の核酸の増幅であるプライマーセット；
（１） 配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（２） 配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（３） 配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（４） 配列番号１３、配列番号１０、配列番号１４および配列番号１２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（５） 配列番号１３、配列番号１５、配列番号１４および配列番号１６によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（６） 配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（７） 配列番号１７、配列番号２１、配列番号１９および配列番号２２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（８） 配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー、ここで、各配列により示されるポリヌクレオチドがミックス塩基であるプライマー；ならびに
（９） 配列番号５９、配列番号６０、配列番号５８および配列番号６１によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
配列番号６８、配列番号６９、配列番号６７および配列番号７０によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
配列番号７７、配列番号７８、配列番号７６および配列番号７９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
配列番号８６、配列番号８７、配列番号８５および配列番号８９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０３および配列番号１０６によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１２および配列番号１１５によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２１および配列番号１２４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；並びに
配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３０および配列番号１３３によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；からなるプライマー。
[３] 前記[１]また[２]に記載のプライマーセットであって、前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーの組み合わせが以下からなる群より少なくとも１選択されるプライマーセット；
（１０） 配列番号５９、配列番号６０、配列番号５８および配列番号６１によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（１１） 配列番号６８、配列番号６９、配列番号６７および配列番号７０によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（１２） 配列番号７７、配列番号７８、配列番号７６および配列番号７９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（１３） 配列番号８６、配列番号８７、配列番号８５および配列番号８９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（１４） 配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０３および配列番号１０６によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（１５） 配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１２および配列番号１１５によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（１６） 配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２１および配列番号１２４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；並びに
（１７） 配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３０および配列番号１３３によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー。
[４] 前記LAPM増幅用核酸プライマーセットが、更に、ループプライマーＬＰｆおよびＬＰｂを含み、前記ＬＰｆが、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４８、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号１０７、配列番号１１６、配列番号１２５若しくは配列番号１３４またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含み、前記ＬＰｂが配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号４９、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号１０８、配列番号１１７、配列番号１２６若しくは配列番号１３５またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む前記［１］〜［３］の何れか１項に記載のプライマーセット。
[５] コロナウイルスに由来する核酸を特異的に増幅する方法であって、試料を前記［１］〜［４］の何れか１項に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅することを具備する方法。
[６] コロナウイルスを検出および／または分類する方法であって、
試料に含まれる核酸を前記［１］〜［４］の何れか１項に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅することと、
前記ＬＡＭＰ増幅により生じた反応産物と、
配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に検出可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含むプローブ群；および／または
配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４５、配列番号１４６および配列番号１４７並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に検出可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含むプローブ群；
より形成されるプローブ群から選択される少なくとも１種類のプローブから選択される少なくとも１種類のプローブと、
を反応することと、
前記反応の結果から、試料に存在するコロナウイルスを検出および／または分類することと
を具備する方法。
[７] 前記［６］に記載の方法であって、前記プローブ群が基体に固定化されている方法。
[８] コロナウイルスの検出および／または分類するためのアッセイキットであって、
前記［１］〜［３］の何れか１項に記載のプライマーセットと、
前記プライマーセットを用いて得られた増幅産物からコロナウイルスを特異的に検出および／または分類するためのプローブであり、
配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に検出可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含むプローブ群；および／または
配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４５、配列番号１４６および配列番号１４７、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に検出可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含むプローブ群；
より形成されるプローブ群から選択される少なくとも１種類のプローブと、
を含むことを特徴とするアッセイキット。
[９] 前記［８］に記載のアッセイキットであって、前記プローブ群が基体に固定化されているアッセイキット。
Consideration From the above, by using the primer and probe region selected in the present invention, detection of coronavirus groups 2a and 2b and species discrimination and / or typing have desirable detection characteristics (ie, detection signal amount and detection). It has been shown that it can be done with specificity. In addition, by modifying the primer and probe sequences as necessary, it has been confirmed that the virus species and virus sequence mutations that make up the coronavirus groups 2a and 2b can be handled without compromising detection characteristics. did it.
In the following, the embodiments described in the scope of the claims of the present application are appended.
[1] A LAMP amplification nucleic acid primer set for specifically amplifying a coronavirus-derived nucleic acid, wherein the LAMP amplification nucleic acid primer set includes a FIP primer, a BIP primer, an F3 primer, and a B3 primer,
Range in which the FIP primer can specifically amplify a polynucleotide or a coronavirus-derived nucleic acid represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 44 or a complementary sequence thereof At least one FIP primer comprising the polynucleotide comprising a mutation at
The BIP primer is at least one selected from the group consisting of polynucleotides represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 45 or their complementary sequences, respectively. At least one BIP primer comprising the polynucleotide containing a mutation to the extent that can specifically amplify a polynucleotide or a coronavirus-derived nucleic acid,
A polynucleotide or coronavirus-derived nucleic acid in which the F3 primer is represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 46 or a complementary sequence thereof At least one F3 primer comprising said polynucleotide comprising a mutation to the extent that it can be specifically amplified, and
The polynucleotide or coronavirus-derived nucleic acid in which the B3 primer is represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 36 or SEQ ID NO: 47 or its complementary sequence At least one B3 primer comprising the polynucleotide containing a mutation within a range capable of specifically amplifying
Primer set.
[2] The primer set according to [1], wherein at least one combination of the FIP primer, the BIP primer, the F3 primer, and the B3 primer is selected from the following group, and the amplification is derived from a coronavirus A primer set that is an amplification of the nucleic acid of
(1) Primers comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 or their complementary sequences;
(2) A primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(3) Primers comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 or their complementary sequences;
(4) Primers comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 12 or their complementary sequences;
(5) Primers comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16 or their complementary sequences;
(6) Primers comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 or their complementary sequences;
(7) A primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 22 or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(8) a primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 and SEQ ID NO: 47 or a complementary sequence thereof, wherein the polynucleotide represented by each sequence is A primer that is a mixed base; and
(9) a primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 61 or a complementary sequence thereof;
A primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 67, and SEQ ID NO: 70, or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
Primers consisting of polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 76 and SEQ ID NO: 79 or their complementary sequences;
Primers consisting of polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 85 and SEQ ID NO: 89 or their complementary sequences;
A primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 103, and SEQ ID NO: 106, or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
Primers consisting of polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 112, and SEQ ID NO: 115 or their complementary sequences;
Primers consisting of polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 121 and SEQ ID NO: 124 or their complementary sequences; and
A primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 130 and SEQ ID NO: 133, or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
[3] The primer set according to [1] or [2], wherein the combination of the FIP primer, the BIP primer, the F3 primer, and the B3 primer is selected from the group consisting of: ;
(10) A primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 61 or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(11) Primers comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 67, and SEQ ID NO: 70 or their complementary sequences;
(12) A primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 76, and SEQ ID NO: 79 or a complementary sequence thereof;
(13) A primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 85 and SEQ ID NO: 89 or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(14) A primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 103 and SEQ ID NO: 106, or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(15) A primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 112 and SEQ ID NO: 115 or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(16) a primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 121 and SEQ ID NO: 124 or a complementary sequence thereof; and
(17) A primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 130 and SEQ ID NO: 133 or a polynucleotide complementary thereto.
[4] The nucleic acid primer set for LAPM amplification further includes loop primers LPf and LPb, and the LPf comprises SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 48, Specifically, a polynucleotide or a coronavirus-derived nucleic acid represented by SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 134 or a complementary sequence thereof Including the polynucleotide containing a mutation within an amplifiable range, wherein the LPb is SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 49, sequence SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 117, Any of the above [1] to [3] comprising the polynucleotide represented by the sequence number 126 or the sequence number 135 or its complementary sequence, or the polynucleotide containing a mutation within a range capable of specifically amplifying a nucleic acid derived from a coronavirus The primer set according to Item 1.
[5] A method for specifically amplifying a nucleic acid derived from a coronavirus, comprising amplifying a sample using the primer set according to any one of [1] to [4]. Method.
[6] A method for detecting and / or classifying coronavirus,
LAMP amplification of the nucleic acid contained in the sample using the primer set according to any one of [1] to [4],
A reaction product generated by the LAMP amplification;
As long as the polynucleotide or coronavirus-derived nucleic acid indicated by SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43, and their complementary sequences can be specifically detected, respectively. A group of probes comprising said polynucleotide comprising a mutation; and / or
At least one type of probe selected from at least one type of probe selected from a group of probes formed by:
Reacting with
Detecting and / or classifying coronavirus present in the sample from the results of the reaction;
A method comprising:
[7] The method according to [6], wherein the probe group is immobilized on a substrate.
[8] An assay kit for detecting and / or classifying coronavirus,
The primer set according to any one of [1] to [3],
A probe for specifically detecting and / or classifying coronavirus from an amplification product obtained using the primer set,
As long as the polynucleotide or coronavirus-derived nucleic acid indicated by SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43, and their complementary sequences can be specifically detected, respectively. A group of probes comprising said polynucleotide comprising a mutation; and / or
At least one probe selected from a group of probes formed by:
An assay kit comprising:
[9] The assay kit according to [8], wherein the probe group is immobilized on a substrate.
１・・ＤＮＡチップ、２・・基体、３・・固定化領域、４・・核酸プローブ、１１・・ＤＮＡチップ、１２・・基体、１３・・電極、１４・・核酸プローブ、１５・・パット 1 .... DNA chip, 2 .... substrate, 3 .... immobilization region, 4 .... nucleic acid probe, 11..DNA chip, 12..substrate, 13..electrode, 14..nucleic acid probe, 15..pad
Claims (8)
（１） 配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（２） 配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（３） 配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（４） 配列番号１３、配列番号１０、配列番号１４および配列番号１２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（５） 配列番号１３、配列番号１５、配列番号１４および配列番号１６によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（６） 配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（７） 配列番号１７、配列番号２１、配列番号１９および配列番号２２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（８） 配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー、ここで、各配列により示されるポリヌクレオチドがミックス塩基であるプライマーセット；
（９） 配列番号５９、配列番号６０、配列番号５８および配列番号６１によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（１０） 配列番号６８、配列番号６９、配列番号６７および配列番号７０によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（１１） 配列番号７７、配列番号７８、配列番号７６および配列番号７９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（１２） 配列番号８６、配列番号８７、配列番号８５および配列番号８９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（１３） 配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０３および配列番号１０６によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（１４） 配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１２および配列番号１１５によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（１５） 配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２１および配列番号１２４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；並びに
（１６） 配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３０および配列番号１３３によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット。 A nucleotide primer set for LAMP amplification for specifically amplifying nucleic acid derived from coronaviruses, the nucleotide primer set for LAMP amplification, includes an FIP primer, BIP primer, F3 primer, a B3 primer, the F IP primer A primer set in which at least one combination of the B IP primer, the F3 primer and the B3 primer is selected from the group consisting of the following, and the amplification is amplification of a nucleic acid derived from a coronavirus;
(1) a primer set comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(2) a primer set comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(3) Primer sets comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 or their complementary sequences;
(4) a primer set comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 12 or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(5) Primer sets comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16 or their complementary sequences;
(6) A primer set comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(7) a primer set comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 22 or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(8) a primer comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 and SEQ ID NO: 47 or a complementary sequence thereof, wherein the polynucleotide represented by each sequence is A primer set that is a mixed base;
(9) Primer sets comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 61 or polynucleotides complementary thereto;
(10) Primer sets comprising polynucleotides respectively represented by SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 67, and SEQ ID NO: 70 or their complementary sequences;
(11) A primer set comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 76 and SEQ ID NO: 79 or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(12) A primer set comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 85, and SEQ ID NO: 89, or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(13) A primer set comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 103 and SEQ ID NO: 106 or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(14) A primer set comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 112, and SEQ ID NO: 115 or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(15) a primer set comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 121 and SEQ ID NO: 124 or a complementary sequence thereof; and
(16) A primer set comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 130 and SEQ ID NO: 133, or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof.
（１７） 配列番号５９、配列番号６０、配列番号５８および配列番号６１によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（１８） 配列番号６８、配列番号６９、配列番号６７および配列番号７０によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（１９） 配列番号７７、配列番号７８、配列番号７６および配列番号７９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（２０） 配列番号８６、配列番号８７、配列番号８５および配列番号８９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（２１） 配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０３および配列番号１０６によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（２２） 配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１２および配列番号１１５によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（２３） 配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２１および配列番号１２４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；並びに
（２４） 配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３０および配列番号１３３によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット。 The primer set according to claim 1 , wherein a combination of the FIP primer, the BIP primer, the F3 primer, and the B3 primer is selected from the group consisting of:
(1 7 ) A primer set comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 61, or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(1 8 ) A primer set comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 67 and SEQ ID NO: 70, or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
(1 9 ) A primer set comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 76, and SEQ ID NO: 79, or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
( 20 ) a primer set comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 85 and SEQ ID NO: 89, or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
( 21 ) a primer set comprising a polynucleotide represented by each of SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 103 and SEQ ID NO: 106, or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
( 22 ) a primer set comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 112 and SEQ ID NO: 115, or a polynucleotide respectively represented by a complementary sequence thereof;
( 23 ) a primer set comprising a polynucleotide respectively represented by SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 121 and SEQ ID NO: 124 or a complementary sequence thereof; and ( 24 ) SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, a primer set comprising a polynucleotide represented by each of the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 130 and SEQ ID NO: 133 or a complementary sequence thereof.
試料に含まれる核酸を請求項１〜３の何れか１項に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅することと、
前記ＬＡＭＰ増幅により生じた反応産物と、
配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含むプローブ群；および／または
配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４５、配列番号１４６および配列番号１４７並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含むプローブ群；
より形成されるプローブ群から選択される少なくとも１種類のプローブから選択される少なくとも１種類のプローブと、
を反応することと、
前記反応の結果から、試料に存在するコロナウイルスを検出および／または分類することと
を具備する方法。 A method for detecting and / or classifying coronavirus comprising:
LAMP amplification of the nucleic acid contained in the sample using the primer set according to any one of claims 1 to 3 ,
A reaction product generated by the LAMP amplification ;
SEQ ID NO 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43, and a probe group comprising the polynucleotide shown respectively by their complementary sequences; and / or SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 82, Sequence number 83, sequence number 84, sequence number 91, sequence number 92, sequence number 93, sequence number 100, sequence number 101, sequence number 102, sequence number 109, sequence number 110, sequence number 111, sequence number 118, sequence number 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 13 , SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 145, probe group comprising SEQ ID NO: 146 and SEQ ID NO: 147 and the polynucleotide represented respectively by their complementary sequences;
At least one type of probe selected from at least one type of probe selected from a group of probes formed by:
Reacting with
Detecting and / or classifying coronavirus present in the sample from the result of the reaction.
請求項１または２に記載のプライマーセットと、
前記プライマーセットを用いて得られた増幅産物からコロナウイルスを特異的に検出および／または分類するためのプローブであり、
配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含むプローブ群；および／または
配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４５、配列番号１４６および配列番号１４７、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含むプローブ群；
より形成されるプローブ群から選択される少なくとも１種類のプローブと、
を含むことを特徴とするアッセイキット。 An assay kit for detection and / or classification of coronavirus,
The primer set according to claim 1 or 2 ,
A probe for specifically detecting and / or classifying coronavirus from an amplification product obtained using the primer set ,
SEQ ID NO 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43, and a probe group comprising the polynucleotide shown respectively by their complementary sequences; and / or SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 82, Sequence number 83, sequence number 84, sequence number 91, sequence number 92, sequence number 93, sequence number 100, sequence number 101, sequence number 102, sequence number 109, sequence number 110, sequence number 111, sequence number 118, sequence number 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 13 , SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146 and SEQ ID NO: 147, and a probe group comprising a polynucleotide indicated respectively by their complementary sequences;
At least one probe selected from a group of probes formed by:
An assay kit comprising:
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