JP5738755B2 - 神経変性疾患を予防および治療するための方法 - Google Patents
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Description
本出願は35 U.S.C.§119の下で、2008年5月9日に出願された米国特許出願第61/051,866号に対する優先権を主張するものであり、その開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
本発明は、National Institute of Healthにより与えられた認可番号NIH 1 PO1 AT004511-02の下で米国政府の支援と共に為されたものである。米国政府は本発明において特定の権利を有する。
本発明は、神経変性疾患の予防および治療のためのブドウ種子抽出物の使用に関する。特に、本発明は、ブドウ種子抽出物またはそれから誘導された1種以上の化合物を含む医薬組成物を、アミロイドβもしくはそのオリゴマーの蓄積、凝集および/もしくは沈着を減少させ、ならびに/またはタウタンパク質もしくは他のタンパク質の誤った折畳み、蓄積および/もしくは凝集を減少させるのに十分な量で、神経変性疾患と診断されたか、またはそれを生じる危険性のある患者に投与することにより、該患者を治療する方法を提供する。
用語「認知症」とは、記憶および認知の他の領域の全体的な認知低下と関連する臨床症候群を指す。
ブドウ種子抽出物
本発明の一態様は、タンパク質の誤った折畳み、蓄積、凝集、および/または沈着に関連する神経変性疾患を治療または予防するためのブドウ種子抽出物から誘導された医薬組成物の使用に関する。本明細書で用いられる用語「ブドウ種子抽出物(GSE)」とは、ブドウの種子、皮または絞りかすから抽出された材料または1種以上の化合物を指す。
本発明の医薬組成物を、神経変性疾患に関連する危険因子または症状を有する被験者に投与することができる。被験者は、ヒト、または限定されるものではないが、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ヒツジ、ヤギ、ウシ、サル、チンパンジー、およびそのトランスジェニック種などのヒトより下等な動物であってよい。前記医薬組成物を、治療上有効量で、所望の結果を達成するのに必要な量で、およびそのような時間、前記被験者に投与する。本明細書で意図される神経変性疾患は、一般的には、その誤った折畳み、蓄積、凝集、および/または沈着などの、被験者の脳における1種以上のタンパク質またはペプチドのレベルの増加を特徴とする。これらの疾患としては、限定されるものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、前頭側頭認知症、および大脳皮質基底核変性症、ならびに/またはタウオパシーが挙げられる。タウオパシーは、特に、アルツハイマー病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、嗜銀顆粒性疾患、ピック病、および家族性前頭側頭認知症であってよい。
以下、本発明の実施形態を示す。
(1)被験者の神経変性疾患を治療する方法であって、ブドウ種子抽出物中のプロアントシアニジンの総重量に基づいて、約12重量%未満のガロイル化プロアントシアニジンを有するブドウ種子抽出物を含む有効量の医薬組成物を、それを必要とする被験者に投与することを含む、前記方法。
(2)神経変性疾患がアルツハイマー病である、(1)に記載の方法。
(3)神経変性疾患がパーキンソン病である、(1)に記載の方法。
(4)神経変性疾患がハンチントン病である、(1)に記載の方法。
(5)神経変性疾患がタウオパシーである、(1)に記載の方法。
(6)タウオパシーが、アルツハイマー病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、嗜銀顆粒性疾患、ピック病、および家族性前頭側頭認知症からなる群より選択される、(5)に記載の方法。
(7)医薬組成物を経口投与する、(1)に記載の方法。
(8)経口剤形が、粉末剤、錠剤、カプセル剤、口腔内崩壊錠、ソフトカプセル剤、水性薬剤、シロップ剤、エリキシル剤、およびサチェット剤からなる群より選択される、(7)に記載の方法。
(9)医薬組成物を経皮投与する、(1)に記載の方法。
(10)医薬組成物を経鼻投与する、(1)に記載の方法。
(11)被験者がヒト被験者である、(1)に記載の方法。
(12)医薬組成物が、抗酸化剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、およびその組合せからなる群より選択される活性成分をさらに含む、(1)に記載の方法。
(13)有効量が約100〜約1000 mg/日の用量である、(1)に記載の方法。
(14)用量が約200〜約600 mg/日である、(13)に記載の方法。
(15)投与の頻度が、毎月、二週間毎、毎週、または毎日である、(1)に記載の方法。
(16)投与の頻度が毎日である、(15)に記載の方法。
(17)投与が単回用量である、(16)に記載の方法。
(18)投与が分割用量である、(16)に記載の方法。
以下の実施例は単に本発明を例示するものであり、それらはいかなる意味でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
本実施例は、Aβのオリゴマー化を低下させるための、本発明の一実施形態に従う組成物の効果のin vitroでの証拠を提供する。
in vitroでのAβ 1-40 およびAβ 1-42 凝集アッセイ
ブドウ種子抽出産物、MegaNatural(登録商標)-AZを、Phenolics (Madera, CA)から取得した。in vitroでのAβ1-40およびAβ1-42凝集アッセイのためのAβ1-40およびAβ1-42ペプチドを、American Peptide (Sunnyvale, CA)から購入した。ペプチドをHFIP (Sigma)中に溶解し、室温で一晩乾燥し、10分間急速減圧乾燥した。ペプチドをdH2O中に1 mg/mlで溶解し、MNG-AZ GSE保存液を400μMでH2O中に溶解した。Aβ1-40およびAβ1-42(100μg/ml)を、1:1容量で様々な濃度のMNG-AZ GSEと混合し、37℃で3日間インキュベートした。Aβ凝集に対するMNG-AZの効果を、6E10抗体を用いるウェスタンブロット分析により分析した。
新鮮に単離された低分子量(LMW)のAβ1-40およびAβ1-42ペプチドを、10 mMリン酸中の50μM MNG-AZ GSE、pH7.4の存在下または非存在下で、1μlの1(x1)、2(x2)、5(x5)または10(x10) mMのトリス(2,2'-ビピリジル)ジクロロルテニウム(II)(Ru(bpy))および1μlの20(x1)、40(x2)、100(x5)または200(x10) mMの過硫酸アンモニウム(APS)と混合した。混合物を1秒間照射し、5%β-メルカプトエタノールを含む10μlのトリシンサンプルバッファー(Invitrogen, CA)を用いてすぐにクエンチした。反応物をSDS-PAGEにかけ、銀染色(SilverXpress、Invitrogen, CA)に可視化した。グルタチオンS-トランスフェラーゼを、同様の条件下で架橋し、対照ペプチドとして用いた。
Aβのオリゴマー化の阻害に対するMNG-AZの効果を、図2に示す。合成Aβ1-42(2A)およびAβ1-40(2B)のオリゴマー化は、SDS-PAGE(図2Aおよび2B中のレーン1〜6:0、0.2、1、5、25および100μMのAβ;CTRはインキュベーションしないサンプルである)により示されるように、濃度依存的な様式でMNG-AZにより阻害された。PICUP化学(図2Cおよび2D中のレーン1および2:1x Ru(Bpy)ならびにそれぞれ、MNG-AZの存在下および非存在下でのAPSを含むAβペプチド;レーン3および4:2x Ru(Bpy)およびそれぞれ、MNG-AZの存在下または非存在下でのAPSを含むAβ;CTR:モノマー対照として用いた非架橋Aβ1-42(2C)またはAβ1-40(2D))後のAβ1-42(図2C)およびAβ1-40(図2D)のSDS-PAGEにおいても同様の結果が観察された。
本実施例は、本発明の一実施形態に従う組成物を投与するトランスジェニックマウスモデルのAβ神経病理に対するin vivoでの効果を示す。
Tg2576マウスおよびMNG-AZ GSE処理
成体でメスのTg2576マウス(Taconic, Germantown, Inc.)を、2つの異なる群:MNG-AZ GSE処理群および水対照群に割り当てた。MNG-AZ GSEを、1.2 g/Lの濃度でその飲料水に送達したところ、200 mg/kg/日の最終的な摂取が得られた。これは、体表面積に基づいて、種間で薬剤の等価な用量を変換するためのFDA基準を用いると1 gm/日のヒト用量と同等であった(mg/kgでのヒト等価用量=mg/kgでの動物用量 x (動物の体重kg/ヒトの体重kg)0.33)(http://www.fda.gov/cber/gdlns/dose.htm)。動物は前記液体および標準的な食餌に自由に接近できた。飲料溶液を3日毎に交換した。液体消費および動物の体重を、研究を通して毎週モニターした。処理の5ヶ月後、マウスを全身麻酔剤塩酸ケタミンおよびキシラジン(Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, Iowa)を用いて麻酔し、断頭術により犠牲にした。脳を収穫し、半分に切断した。一方の半球を、形態学的研究のために4%パラホルムアルデヒド中で24時間固定した。海馬および新皮質を反対の半球から切除し、急速冷凍し、液体窒素中で粉砕し、生化学的研究のために-80℃で保存した。
脳のAβペプチドの定量的評価のために、凍結粉砕された組織を5モル/Lのグアニジンバッファー中で均質化し、0.05%(vol/vol)のTween(登録商標)-20および1 mmol/LのPefablocプロテアーゼ阻害剤(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)を含有するリン酸緩衝生理食塩水中に1:10に希釈し、4℃で20分間遠心分離した。総Aβ1-40またはAβ1-42を、サンドイッチELISA(BioSource, Camarillo, CA)により定量した。Tg2576マウス中のAD型アミロイド量の立体的評価のために、新鮮に収穫された脳半球を、4%パラホルムアルデヒド中で一晩液浸固定し、50μmの名目上の厚さでビブラトーム上の前頭面中で切片化した。15回目毎に、切片を無作為の開始位置から選択し、チオフラビン-S染色のために加工した。全ての立体分析を、Zeissモーター駆動ステージおよびMSP65ステージ制御装置を装備したZeiss Axiophot光学顕微鏡、高解像度Zeiss ZVS-47Eデジタルカメラならびに特注設計されたソフトウェアNeuroZoomを実行するMacintosh G3コンピューターを用いて実施した。アミロイド量を、点計数のために小さいサイズのグリッド(50 X 50μm)を用いて、Cavalieri原理を使用して見積もった;この手順は、アミロイドプラークにより占有される画分体積の不偏推定値(新皮質または海馬体積の割合として表される)を提供した。プラーク体積の見積もり値を、X40倍率で体系的無作為サンプリング手順を用いて取得した。
可溶性Aβオリゴマーのレベルを、ドットブロットアッセイおよびウェスタンブロット分析の両方により測定した。具体的には、可溶性アミロイドペプチドを、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)を補給したPBS中に粉砕された皮質組織を溶解することにより抽出した。78,500 gで1時間、4℃で遠心分離した後、上清を分析した。5μgの総タンパク質をニトロセルロース膜上にスポットし、10%無脂肪乳を用いてブロックし、オリゴマー形態のAβを特異的に認識する抗体A11(Invitrogen, CA)と共にインキュベートした。室温で2時間インキュベートした後、ブロットをHRP結合ヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベートし、免疫反応性シグナルを、増強化学発光検出(SuperSignal Chemiluminescent Detection Kit, Pierce, Rockford, IL)を用いて可視化し、密度測定的に定量した(Quantity One, Bio-Rad)。また、同じサンプルをウェスタン分析にも用いた。75μgの総タンパク質を、10〜20%のトリス-トリシンゲルにより分離し、ニトロセルロース膜に移し、10%無脂肪乳を用いて1時間ブロックした。膜を6E10(Sigma)、またはA11と共にインキュベートした。免疫反応性シグナルを、増強化学発光検出を用いることにより可視化し、密度測定的に定量した。
ホロ-APPの発現を、C8抗体(ヒトAPP細胞質ドメインのAA676-695に対して生じた)を用いるウェスタンブロット分析により試験した。免疫沈降を、以前に記載のように(Wangら、FASEB J 2005; 19: 659-661)、sAPP-α、sAPP-βの検出のために実施した。α-、β-およびγ-セクレターゼ活性を、市販のキット(R & D Systems)を用いて評価した。ネプリリシンおよびインスリン分解酵素の発現を、市販の抗体を用いるウェスタンブロットにより分析した。
これらの実験における全てのデータおよび値は、平均および平均の標準誤差(SEM)として表されたものである。平均間の差異を、2元反復測定ANOVAまたは両側スチューデントt検定を用いて分析した。全ての分析において、無帰仮説は0.05レベルで拒絶された。全ての統計学的分析を、Prism Statプログラム(GraphPad Software, Inc., San Diego CA)を用いて実施した。
Tg2576マウスの神経病理に対するMNG-AZ GSEの効果を、図7に例示する。図7Aおよび7Bは、5ヶ月の処理後のTg2576マウスにおける体重(7A)または液体消費(7B)に対するMNG-AZ GSEの効果を示す。図7Cは、ドットブロット分析におけるHMWオリゴマーAβペプチドに特異的な抗体を用いる脳中の可溶性の細胞外HMW-Aβペプチド含量の評価を提示する。図7Dは、Tg2576マウスの脳における可溶性細胞外HMWオリゴマーAβペプチド(抗体A11)およびモノマーAβペプチド(抗体6E10)のウェスタンブロット分析を示す。図7Eは、MNG-AZ GSEで処理されたマウスおよび対照マウスの脳中のAβ1-42およびAβ1-40ペプチド濃度の評価を示す。図7Fは、領域体積の割合としてのチオフラビン-S陽性体積として表されるMNG-AZ GSEで処理されたマウスおよび対照マウスにおける大脳皮質および海馬形成Aβアミロイドプラーク量の立体的評価を示す。図7F差し込み図は、未処理の対照(上側パネル)およびMNG-AZで処理されたTg2576マウス(下側パネル)における新皮質(CTX)および海馬形成(Hippo)におけるチオフラビン-S陽性Aβアミロイドプラーク神経病理の代表的な写真を示す。値は、平均±SEM、n=5〜6匹のマウス/群である。両側スチューデントt検定分析によれば、*p<0.05、**p<0.01である。図7Gは、MegaNatural(登録商標)-Goldのin vivoでの効力に関する平行試験の脳におけるAβ1-42およびAβ1-40ペプチド濃度の評価を示す。
本実施例は、Tg2576トランスジェニックマウスの認知機能に対する本発明のいくつかの実施形態に従う組成物を投与する効果を証明する。
Tg2576マウスを、5ヶ月間、MNG-AZ GSEで処理し、認知機能を11ヶ月齢時に評価した。空間学習記憶を、以前に記載のように(Morris, J Neurosci Methods 1984; 11: 47-60)、モリス水迷路行動試験により評価した。空間記憶を、学習期の間の学習試験の関数として、浸水した脱出プラットフォーム上に水から脱出する動物の待ち時間を記録することにより評価する。学習期の24時間後、視覚的刺激を変化させることなく脱出プラットフォームを除去することにより、マウスを探査試験において試験した。行動分析を、最少の刺激(例えば、騒音、運動、または光もしくは温度の変化)を有する環境において光周期の昼間部分の最後の4時間に一貫して行った。
図9は、細胞外HMWオリゴマーAβの減少と同時に起こるMNG-AZ GSEで処理したTg2576マウスにおける認知力低下の減衰を示す。図9Aおよび9Bは、モリス水迷路試験により決定されたTg2576マウスにおけるAβ関連空間記憶に対するMNG-AZ GSEの影響を示す。図9Aは、処理時間の関数としての待ち時間スコア(水からプラットフォームに脱出するのにかかる代表的な時間)を示す。図9Bは、標的四分円上でTg2576マウスが費やした時間の探査試験割合(%)を示す(残りのプール中で費やされた時間に対する、標的四分円領域中で費やされた時間の比率として計算する)。図9Cは、ドットブロット分析においてHMWオリゴマーAβペプチドに特異的な抗体を用いるTg2576マウスの脳中での可溶性細胞外HMW-Aβペプチド含量の評価を提示する。図9Cの差し込み図は、HMW-可溶性Aβ含量の代表的なドットブロット分析を示す。値は、群平均±SEM、n=7-9匹のマウス/群であり、両側スチューデントt検定分析によれば、図9Bにおいては、***p<0.0001、図9Cにおいては、*p<0.01である。
本実施例は、タウペプチドの凝集、予め形成されたタウ凝集体の解離、およびAD脳標本から得られた天然タウ原線維の安定性に対する、本発明の実施形態に従う組成物のin vitroでの効果を示す。
in vitroでのMNG-AZ抗タウ凝集体の生物活性の評価
タウの残基306〜311に対応する、6アミノ酸N-アセチル化ペプチド(Ac-306VQIVYK311)タウペプチドを商業的に入手する。この合成タウペプチドは、タウタンパク質の微小管結合領域中に認められる短いペプチド断片である。証拠は、この短いペプチド断片がタウの重合にとって必須であることを示唆している(Gouxら、J. Biol. Chem. 2004; 279: 26868-26875)。これは、短いAc-306VQIVYK311ペプチドが塩の存在下でフィラメント構造に自発的に凝集するというin vitroでの生物物理学的観察により支持される(Gouxら、2004、上掲)。Ac-306VQIVYK311ペプチドのオリゴマー化は、Gouxら、2004、上掲により記載されたように必須であった。簡単に述べると、合成タウペプチドを、20 mM MOPS, pH 7.2に溶解した。タウペプチドの重合を、2.2μMのペプチドおよび10μMのチオフラビン-S(ThS)を含む最終的な75μlの20 mM MOPS (pH 7.2)溶液中で行った。0.15 Mの最終濃度まで塩を添加することにより反応を開始させた。様々な濃度のMNG-AZの非存在下または存在下でのタウペプチド凝集の動力学を、凝集したペプチド種へのThSの結合の際のThS蛍光の増加を行うことにより1時間にわたって評価した;蛍光励起を436 nmで誘導し、蛍光放射を470 nmで検出した。
合成Ac-306VQIVYK311タウペプチドは、MNG-AZ GSEの非存在下で凝集した。タウ凝集体の形成後、様々な濃度のMNG-AZを反応物に添加し、GSEの添加に応答するタウ凝集体の含量の変化を、ThS蛍光を行うことによりモニターした。
PHFを、AD事例に由来する死後の脳標本から単離および精製し、いくつかのPHFサンプルを5秒間または1時間、MNG-AZ(100μM)で処理した。結果を電子顕微鏡(Hitachi H700)により観察した。
PHFをAD脳標本から単離した。PHFのいくつかのサンプルを、100μMのMNG-AZで10分間処理した。いくつかのサンプルのPHF(MNG-AZで予備処理)を、1μgのトリプシンと共に10分間さらにインキュベートした。結果を電子顕微鏡(Hitachi H700)により観察した。
MNG-AZはタウ凝集を阻害する
MNG-AZ GSEによるタウ凝集阻害の結果を図11に示す(MNG-AZは図11中ではMegNと表示されていることに注意)。合成Ac-306VQIVYK311タウペプチドは、反応時間の関数としてThS蛍光を増加させることにより反映されるように、塩の存在下で時間と共に凝集体を容易に形成する(図11A、時間の関数としての凝集したタウの蓄積を、ThS蛍光により評価した;0.22μM、2.2μMおよび22μMのGSEの濃度は、それぞれ、1:10、1:1、および10:1モル比のGSE:タウペプチドに対応する)。
MNG-AZは、予め形成されたAc-306VQIVYK311タウペプチド凝集体を解離することが示された。特に、1:1のモル比のMNG-AZ:タウペプチドに対応する、1.1μMのMNG-AZの添加は、時間の関数としてThS-陽性タウ凝集体の量を次第に低下させることにより反映されるように、予め形成されたタウペプチド凝集体の含量を減少させることができた(図12Aは、様々なMNG-AZ濃度(0.55〜4.4μM)でタウ凝集体含量のThS蛍光をプロットするものである)。予想されたように、より高い濃度のMNG-AZ(2.2μMおよび4.4μM MNG-AZ)を用いる平行試験も、予め形成されたタウペプチド凝集体の解離を促進した。MNG-AZは以下の図12Aおよび図12BにおいてはMegNと表示されていることに留意されたい。予め形成されたタウ凝集体を解離させるためのMNG-AZの用量依存的効果を、ThS蛍光放出の線形回帰分析により様々な濃度のMNG-AZ GSEの存在下でタウ凝集体の解離速度を算出することにより調査した(図12B)。1.1〜4.4μMの増加する濃度のMNG-AZ GSEの添加は、用量依存的様式で予め形成されたタウペプチド凝集体の解離を促進するようであった。換言すれば、凝集したタウペプチドの解離速度は、MNG-AZ GSEの濃度と直接相関していた(Pearson R=0.96654、p<0.05)。
電子顕微鏡により調査したタウ原線維の安定性に対するMNG-AZの効果を、図19に示す。図19Aは、ADに由来するPHFを示し、18.9 + 3.4 nmの平均幅と81.3 + 10.8 nmの平均らせんねじれ幅を有する典型的な系統的な原線維構造を示す、ならびにPHF1抗体を用いる免疫金標識が、PHFタイトコアに近いホスホセリン396/404エピトープを局在化させる。興味深いことに、単離されたPHFとGSEとのインキュベーションは、GSE曝露時間の増加と共に段階的なPHF展開を誘導した(図19B〜19D);GSEとの1時間のインキュベーションは、平均らせんねじれ(GSEで処理されたPHFの平均幅およびらせんねじれは、それぞれ、31.6 + 3.8および77.4 + 10.8 nmであった)に影響することなく、原線維の幅の67%の増加(31.6 + 3.8 nmに)を誘導した(図19C、19D)。さらに、GSE処理は、PHF1抗体に対する単離されたタウ原線維の免疫反応性を隠すことが判明した(図19Bおよび19C、図19Aと比較)。
疾患関連凝集性タンパク質のトランスジェニック過剰発現の誘導性Gal4/UAS系(Brandら、Development, 1993; 118: 401-415)を用いるショウジョウバエモデルは、R406W突然変異体タウを過剰発現させることによるタウオパシー、およびQ93httexonlを過剰発現させることによるハンチントン病の態様を上手くモデル化した(例えば、Sangら、NeuroRx. 2005; 2: 438-446.; Bergerら、Hum Mol Genet 2006; 15: 433-442を参照されたい)。特に、眼を形成する細胞中でのR406Wの過剰発現(ey>R406W)は、眼の劇的な減少または眼の完全な欠如を誘導する;形成する眼は異常な形態を示す。さらに、UAS-Q93httexonlを含むトランスジェニック系におけるパン神経(pan-neural)パターンでのGal4の発現(elav-Gal4)は、神経変性の成体開始および寿命の減少をもたらす。
ey>R406Wハエの眼の表現型の試験
ey>R406W卵を仕入れ、対照食餌(即席ハエ培地処方4-24ブルー)または2.8μg/mlのMNG-AZ GSE(またはGSPE、図13および14中)を補給した食餌で飼育した。ショウジョウバエの眼を顕微鏡下で観察した。
elav-Gal4を用いるパン神経パターンでQ93httexonlを過剰発現するオスのハエ(elav> Q93httexonl)を、羽化の1日以内に回収し、対照食餌または2.8μg/mlのMNG-AZ GSEを補給した食餌と共にバイアルあたり10匹を入れた。生存するハエを毎日計数し、2〜3日毎に新鮮なバイアルに移した。
GSEはショウジョウバエの眼におけるR406Wタウ過剰発現を抑制する
眼の発生初期でのR406Wの過剰発現は、小さい眼をもたらすか、または眼をなくす(図13A)が、GSE処理は眼の大きさの低下を抑制した(図13B)(オスの眼を示す)。ey>R406W表現型の範囲は試験によって変化したので、試験を個別に行った。代表的な実験に由来するオスの眼の視覚的スコアリングを羽化の3日以内に収集した(0=眼なし、4=ほぼ正常な眼)(図13C)。存在しない眼の数は、同じ試験においてGSE処理(右側)の際に減少した(図13D)。
GSEで処理したelav>Q93httexonlハエは、未処理の対照と比較して全体の寿命の有意な増加を特徴とすることがわかった(図14)。平均で、対照食餌上の50%のelav>Q93httexonlオスが、GSE上でのものが20%しか死ななかったのと比較して、20日目までに死んだ。
本実施例は、Aβの自己集合および細胞毒性を減少させるための、本発明の一実施形態に従う組成物の効果に関する証拠を提供する。
化合物および試薬
化合物を、Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO)から取得し、それらは入手可能な最高純度のものであった。Medysin #1(「Med1」)を、Aurora Fine Chemicals Ltd., Graz, Austriaから取得した。MegaNatural-AZ(MNG-AZ)を、Polyphenolics(Madera, CA)から取得した(MNG-AZおよびMed1は共に、Aβとの混合物中で言及される場合、「化合物」と呼ばれることもある)。水を二重蒸留し、Milli-Q系(Millipore Corp., Bedford, MA)を用いて脱イオン化した。
Aβペプチドを以前に記載のように合成、精製し、特性評価した(Walshら、J Biol Chem 1997; 272: 22364-22372)。簡単に述べると、合成を、予め充填されたWang樹脂上での9-フルオレニルメトキシカルボニルに基づく方法を用いる自動化ペプチド合成装置(モデル433A、Applied Biosystems, Foster City, CA)上で実施した。ペプチドを、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)を用いて精製した。定量的アミノ酸分析および質量分析により、それぞれのペプチドについて、それぞれ予想された組成物および分子量が得られた。精製されたペプチドを、-20℃で凍結乾燥物として保存した。グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)の保存溶液を、60 mM NaOH中に250μMの濃度で凍結乾燥物を溶解することにより調製した。使用前に、アリコートを10 mMリン酸ナトリウム、pH 7.4中に10倍に希釈した。
Aβの凝集体を含まない保存溶液を、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて調製した。実験ペプチド濃度で、名目上のモノマー画分は急速平衡においてモノマーと低分子オリゴマーの混合物を含むため、この画分を低分子量(LMW)Aβと呼んだ。Aβを調製するために、ジメチルスルホキシド中の200μlの2 mg/ml(名目濃度)ペプチド溶液を、超音波洗浄器(Branson Ultrasonics, Danbury, CT)を用いて1分間超音波処理した後、16,000 x gで10分間遠心分離した。得られた上清を、0.5 ml/分の流速で10 mMリン酸バッファー、pH 7.4を用いるSuperdex 75 HRカラム上で分画した。Aβピークの中央を50秒の間に収集し、全ての実験のためにすぐに用いた。10μlのアリコートをアミノ酸分析のために取得して、それぞれの調製物中のペプチド濃度を定量的に決定した。典型的には、Aβ1-40およびAβ1-42の濃度は、それぞれ、30〜40μMおよび10〜20μMであった。
Aβサンプルを上記で特定されたように調製した後、0.5 mlのアリコートを1 mlの微小遠心チューブ中に入れた。試験化合物をエタノール中に2.5 mMの最終濃度となるように溶解した後、10 mMリン酸、pH 7.4で希釈して、10および50μMの濃度を作製した。次いで、それぞれの化合物の0.5 mlを、Aβの個別のチューブに添加し、約20μM(Aβ1-40)および約10μM(Aβ1-42)の最終ペプチド濃度ならびに5および25μMの最終阻害剤濃度を得た。かくして、化合物:ペプチド比は、低い方の化合物濃度では約1:4(Aβ1-40)および約1:2(Aβ1-42)であり、高い方の化合物濃度では5:4(Aβ1-40)および5:2(Aβ1-42)であった。ペプチドのみを含む対照チューブには、0.5 mlのバッファーを入れた。これらのチューブを、攪拌せずに0〜7日間、37℃でインキュベートした。
それらの調製の直後に、PICUP技術を用いてサンプルを架橋した。簡単に述べると、18μlのタンパク質溶液に、1μlの1 mM Ru(bpy)および1μlの20 mM過硫酸アンモニウム(APS)を添加した。Aβ1-40およびAβ1-42の最終タンパク質:Ru(bpy):APSモル比は、それぞれ、0.29:1:20および0.16:1:20であった。この混合物に可視光線を1秒間照射した後、5%β-メルカプトエタノールを含有する10μlのトリシンサンプルバッファー(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて反応をクエンチした。モノマーおよびオリゴマーの頻度分布の決定をSDS-PAGEおよび銀染色を用いて達成した。簡単に述べると、20μlのそれぞれ架橋されたサンプルを10〜20%勾配のトリシンゲル上で電気泳動し、銀染色(SilverXpress, Invitrogen)により可視化した。架橋していないサンプルをそれぞれの実験における対照として用いた。強度プロファイルを作製し、それぞれのオリゴマー型の相対量を算出するために、密度測定を実施し、One-Dscanソフトウェア(v.2.2.2; BD Biosciences Bioimaging, Rockville, MD)を用いて基線補正データのピーク領域を決定した。いくつかの実験においては、Ru(bpy)およびAPSのモル量を、2、5、10および20の因子により、ペプチドと比較して増加させた。
Aβ溶液のCDスペクトルを、サンプル調製の直後またはインキュベーションの2、3、6もしくは7日後に獲得した。CD測定を、反応混合物から200μLアリコートを取り出し、このアリコートを1 mm経路長のCDキュベット(Hellma, Forest Hills, NY)に添加し、J-810分光偏光計(JASCO, Tokyo, Japan)中でスペクトルを獲得することにより行った。CDキュベットを、分光計への導入前に氷上で維持した。温度平衡後、CDスペクトルを、100 nm/分の走査速度、0.2 nm解像度、約190〜260 nm、22℃で記録した。10回の走査を獲得し、データをそれぞれのサンプルについて平均した。生データを、製造業者の説明書に従ってバッファースペクトルの平滑化および減算により加工した。
10μLのサンプルを、10 mMリン酸バッファー(pH 7.4)に溶解した190μLのThTに添加し、混合物を手短にボルテックスした。Hitachi F-4500蛍光計を用いて、10秒間隔で3回、蛍光を決定した。励起波長および放出波長は、それぞれ450および482 nmであった。サンプルの蛍光を、3回の読み取り値を平均し、ThTブランクの蛍光を減算することにより決定した。
各サンプルの10μlアリコートを、グロー放電した、炭素コーティングされたFormvarグリッド(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)上にスポットし、20分間インキュベートした。次いで、液滴を等量の水中の2.5%(v/v)グルタルアルデヒドと置換し、さらに5分間インキュベートした。最後に、ペプチドを8μlの水中の1%(v/v)濾過(0.2μm)酢酸ウラニル(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)で染色した。この溶液を逃し、グリッドを空気乾燥させた。サンプルをJEOL CX100透過型電子顕微鏡を用いて試験した。
ラット褐色細胞腫PC12細胞を、15%(v/v)ウマ血清、2.5%(v/v)ウシ胎仔血清、100単位/mlペニシリン、0.1 mg/mlのストレプトマイシン、および25μg/mlアンホテリシンBを含有するF-12K培地(ATCC, Manassas, VA)中、75 cm2フラスコ(#430641, Corning Inc., Corning, NY)中、空気中の5%(v/v)CO2を用いて37℃で培養した。アッセイのための細胞を調製するために、培地を除去し、細胞を、0.5%(v/v)ウシ胎仔血清、100単位/mlペニシリン、0.1 mg/mlのストレプトマイシン、および25μg/mlアンホテリシンBを含有するF-12K培地で1回穏やかに洗浄した。次いで、この後者の培地であるが、100μg/mlの神経成長因子(Invitrogen, CA)を含む培地を添加した後、フラスコを攪拌することにより、細胞懸濁液を調製した。トリパンブルーを用いる細胞計数後、細胞を96穴アッセイプレート(Costar #3610, Corning Inc., Corning, NY)中、30,000細胞/ウェル(90μl総量/ウェル)の密度で塗布した。細胞の神経成長因子により誘導される分化を48時間進行させ、この時点で毒性アッセイを行った。
一元分画ANOVAおよび複数比較試験を統計学的分析のために使用し、GraphPad Prism(バージョン4.0a、GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)の統計手順を用いて行った。0.05未満のp値を有意であると考えた。
Aβオリゴマー化
PICUP架橋の非存在下では、Aβ1-40モノマー(図15A、レーン2)のみならびにAβ1-42モノマーおよびトリマー(図15B、レーン2)が観察された。Aβ1-42トリマーバンドはSDSにより誘導される人工物であることが示された。架橋後、Aβ1-40はオーダー2-4のモノマーとオリゴマーの混合物として存在したが(図15A、レーン3)、Aβ1-42はオーダー2-6のモノマーとオリゴマーを含んでいた(図15B、レーン3)。
Aβおよびそのオリゴマーの二次構造に対するMNG-AZの効果を、CD分光法により調査した(図3)。単独でインキュベートした場合、Aβ1-40およびAβ1-42は、大きく障害されたコンフォーマーの初期スペクトル特性をもたらした(図3Aおよび3C)。これらのスペクトルの主な特徴は、約198 nmを中心とする大規模の最小値であった。その後3日間のインキュベーションの間に、大きいコンフォメーションの遷移が起こり、最終的にはα-へリックスとβ-シート特性の混合物の集団が得られた(約195、約210、および約220 nmでの屈折率を参照)。対照的に、MNG-AZの存在下では遷移は観察されなかった(図3Bおよび3D)。MNG-AZで処理されたAβ1-40およびAβ1-42の全てのスペクトルは、大きく障害されたコンフォーマーの集団を示したが、これはMNG-AZが、Aβの異常な凝集に関与するAβの二次構造、特にβ-シートの形成を上手く妨げることを示している。
ThT結合を用いて、Aβ1-40およびAβ1-42の調製物中のβ-シート構造のレベルを決定した。化合物の非存在下では、Aβ1-40は、約2日の遅延期間、および約3日のThT結合を上手く増加させる期間(原線維形成と相関)と共に、約5日後の結合プラトーを特徴とする疑似S字型結合曲線を示した(図4)。Aβ1-40を、1:4または5:4の化合物:ペプチド比でMed1と共にインキュベートした場合、結合曲線は、実験誤差の範囲内で、未処理のペプチドのものと同一であった(図4A)。対照的に、MNG-AZによって有意な効果がもたらされた(図4B)。これらは、遅延時間のMNG-MZ濃度依存的増加、β-シート増殖率の低下、および最終的なβ-シートレベルの低下を含んでいた(表1)。Aβ1-40集合のほぼ完全な阻害が、より高い(25μM)のMNG-MZ濃度を用いて観察された。
二次構造パラメーターはAβ集合状態と相関していたが、それらは、それ自体が集合体の四次構造を確立せず、これは電子顕微鏡によってより良好に観察された(図5)。未処理のAβ1-40およびAβ1-42のサンプル中では、古典的なアミロイド原線維が観察された(それぞれ、図5Aおよび5B)。Aβ1-40原線維は、約220 nmのらせん周期性を示す、約7 nmの直径を有する、分枝していないらせんフィラメントであった。Aβ1-42は、幅約8 nmの分枝していないフィラメントを形成し、らせん構造の程度は変化していた。さらに、Aβ1-42集合体については、幅約12 nmのより厚い、直鎖状の分枝していないフィラメントが観察された。より低い(5μM)のMNG-AZ濃度では、原線維は未処理のAβにより形成されたものよりも薄かった(4対8 nm)(図5C)。さらに、多くの小さく比較的不定形の凝集体が観察された。25μMのMNG-MZを用いるAβ1-40の処理は、原線維数を顕著に減少させ、短い原線維および不定形の凝集体の相対数を増加させた(図5E)。Aβ1-42集合体に対するMNG-AZの効果は、原線維数および長さが減少し、不定形凝集体の頻度が増加する点で類似していた(図5Dおよび5F)。
Aβの毒性アッセイの結果を図6に示す。図6A-6Dにおいては、左側の群は0日のインキュベーション後の毒性結果(ペプチドAβ1-40およびAβ1-42の両方について)であり、中央の群はAβ1-40についての3日のインキュベーション後の毒性結果(図6Aおよび6B)またはAβ1-42についての2日のインキュベーション後の毒性結果(図6Cおよび6D)であり、右側の群は7日のインキュベーション後の毒性結果(両ペプチドについて)である。1セットの実験において(図6Aおよび6C)、ペプチドをMed1またはMNG-AZと同時インキュベートした。2回目のセットの実験においては(図6Bおよび6D)、Med1およびMNG-AZを、インキュベーション後に、および分化したPC12細胞に混合物を添加する直前に添加した。
本実施例は、特定の型のタウオパシーをモデル化するタウ突然変異体(R406W)を担持するショウジョウバエ表現型、およびタウオパシーのトランスジェニックJNPL3マウスモデルに対する、本発明の実施形態に従う組成物のin vivoでの利益を示す。
ey>R406Wハエの眼の表現型の試験
この試験は、実施例5に提供された試験の続きであった。簡単に述べると、ey>R406Wを仕入れ、2.8μg/mlのMNG-AZ GSE(またはGSPE、図21中)を補給した4-24即席ハエ培地または等量の水を補給した対照食餌(GSE溶媒、ビヒクル対照)で飼育した。ハエを成体になるまで継続的にGSE(またはビヒクル)で処理した。ショウジョウバエの眼を顕微鏡下で観察した。
JNPL3マウスモデルを、運動機能不全により反映される、年齢関連神経変性をもたらすヒト家族性P301L突然変異タウを発現するように遺伝子操作する。JNPL3マウスを、典型的には、約12ヶ月齢までに発生し始める突然変異タウを介する運動障害の開始の前である、約7ヶ月齢で開始して、150 mg/kg BW/日のMNG-AZ GSEで処理した。後肢伸長試験(図22に示される)を用いて、4点評価系に基づいて運動機能障害を評価した。
GSE処理はR406W突然変異タウを有するハエにおける異常な眼の表現型を抑制した
成体のR406W突然変異タウを有するハエに由来する眼は、野生型の成体ハエ(図21Aおよび21D)と比較して、大きさの低下および異常な形態(図21Bおよび21E)を特徴とする。対照的に、GSEで処理した突然変異タウを有するハエは、眼の大きさの非常に減少した異常性を示した(図21Cおよび21F)。
継続的なGSE処理は、体重または水分消費の変化(示していない)などのJNPL3マウスに対する検出可能な有害な効果をもたらさなかった。JNPL3マウスのGSE処理は、このマウスモデルにおいて加齢と共に通常生じる運動障害の重篤度を低下させた(図23A)。運動障害の減衰と同時に、GSE処理はまた、未処理のJNPL3対照群と比較して、JNPL3マウスの死亡率も有意に低下させた(図23BはJNPL3マウスの死亡率が13ヶ月で約30%低下したことを示す)(Logrank統計、p=0.05;死亡率:未処理マウス=27%、GSEで処理されたマウス=0%)。
本実施例は、ポリグルタミンを含有するhttタンパク質種の凝集に対する、本発明の実施形態に従う組成物のin vitroでの効果を示す。
httタンパク質種を、エクジソン類似体、ムリステロンAを用いる誘導の際にhtt融合タンパク質を発現し、蛍光htt凝集体を形成する、増強GFPに融合されたhttタンパク質の最初の17アミノ酸と103個のグルタミンを含むエクジソン誘導性ポリグルタミン含有Htt融合タンパク質(Htt103Q-EGFP)を含有するPC-12細胞系を用いて取得した(Apostolら、Proc Nat Acad Sci 2003; 100:5950-5955)。GFP-Htt融合タンパク質を、0.2μMのムリステロンAにより誘導し、MNG-AZ GSE(12.5μMおよび25μM)処理の非存在下および存在下でのGFP-Htt融合タンパク質の凝集を蛍光顕微鏡およびウェスタンブロット分析により評価した。GSEの非存在下および存在下でのhtt凝集体の蓄積を、凝集体へのGFP-Htt融合タンパク質の動員後の蛍光放出により反映させた。
GSE処理は、用量依存的様式で蛍光htt凝集体の蓄積を有意に低下させた:より高い用量のGSE処理は、高分子量のHtt凝集体のより顕著な低下をもたらした(図24A)。この結果はまた、独立したウェスタンブロット分析によっても裏付けられた(図24B)。
本実施例は、elav>Q93httexonlショウジョウバエHDモデル、およびHDのR6/2トランスジェニックJNPL3マウスモデルに対する、本発明の実施形態に従う組成物のin vivoでの利益を示す。
HDハエの運動機能および死亡率の評価
elav>Q93httexonlショウジョウバエHDモデルを、これらの試験において用いた。このHDモデルは、93個のポリグルタミル残基を担持する、ヒトhtt遺伝子のエクソン1によりコードされるトランケートされたヒト突然変異httタンパク質の選択的、パン神経過剰発現を達成するelav-Gal4/UAS調節系を含む(Sangら、NeuroRx, 2005; 2: 438-446)。これは、眼の光受容体細胞の破壊、クライミング能力の障害、および寿命の減少などの成体開始神経変性を誘導する(Sangら、2005、上掲)。
これらの試験を、最も一般的に用いられるトランスジェニックマウスHDモデルである、Bates博士とその同僚により元々作成されたR6/2マウスHDモデル(Mangiariniら、Cell, 1996; 87:493-506)を用いて行った。R6/2マウスは、148〜153個のポリグルタミン反復を担持するhttエクソン1断片を発現する。突然変異httの調節は、ヒトhttプロモーターにより駆動される。R6/2マウスは、非常に活動的な神経学的表現型を示し、前臨床実現可能性試験にとって理想的である明確な実験評価項目を提供する(Ramaswamyら、ILAR J, 2007; 48: 356-73)。
ショウジョウバエHDモデルにおける運動機能および死亡率
elav>Q93httexonlハエの運動能力を、ハエが軽度のHD表現型を示した9日目に評価した場合、GSE処理は9日目にクライミングアッセイにおける運動性能を改善することがわかった(約40%の対照、処理されていないハエおよび約50%のGSE処理されたハエが、クライミング課題を上手く達成した)(図25A)。しかしながら、この観察は、統計学的有意性に到達しなかった。elav>Q93httexonlハエがより重篤な運動機能障害を生じた16日目に評価した場合、有意により大きい割合のGSE処理されたハエは、対照のハエと比較してクライミング課題を上手く達成した(約15%の処理されていないハエおよび約47%のGSEで処理されたハエが、クライミング課題を上手く達成した)(図25B)。これらの結果は、GSEはin vivoで生物活性を示し、このショウジョウバエHDモデルにおける運動機能障害を軽減させることを示唆している。
R6/2マウスの運動機能の試験においては、動物がほとんど発症前である6週齢で、対照群とGSE処理群との間に行動の差異は認められなかった。マウスの運動機能を、運動機能障害の開始の間に9週齢で、およびHD表現型が中程度の運動機能障害に進行した11週齢で、試験し続けた。GSE処理は、図27に示されるように、両方の臨床疾患開始(9週齢)および進行(11週齢)で、R6/2 HDマウスにおける運動機能を有意に改善した(棒グラフは、ロータロッド上に留まることができた動物の時間(秒)の平均 + SEMを表す。スチューデントのt検定による統計学的分析、*p<0.05はGSE処理群と対照非処理群とを比較するものである)。
Claims (42)
- 被験者の神経変性疾患の治療において使用するためのブドウ種子抽出物を含む組成物であって、前記ブドウ種子抽出物が、該ブドウ種子抽出物中のプロアントシアニジンの総重量に基づいて12重量%未満のガロイル化プロアントシアニジンを有し、且つ未精製のブドウ種子抽出物を酵母培養物又はタンナーゼ酵素で処理することにより得られたものである、前記組成物。
- 神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項1に記載の使用するための組成物。
- 神経変性疾患がパーキンソン病である、請求項1に記載の使用するための組成物。
- 神経変性疾患がハンチントン病である、請求項1に記載の使用するための組成物。
- 神経変性疾患がタウオパシーである、請求項1に記載の使用するための組成物。
- タウオパシーが、アルツハイマー病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、嗜銀顆粒性疾患、ピック病、及び家族性前頭側頭認知症から成る群より選択される、請求項5に記載の使用するための組成物。
- 組成物が経口剤形の医薬組成物である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用するための組成物。
- 経口剤形が、粉末剤、錠剤、カプセル剤、口腔内崩壊錠、ソフトカプセル剤、水性薬剤、シロップ剤、エリキシル剤、及びサチェット剤から成る群より選択される、請求項7に記載の使用するための組成物。
- 組成物が、経皮投与のための剤形の医薬組成物である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用するための組成物。
- 組成物が、経鼻投与のための剤形の医薬組成物である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用するための組成物。
- 被験者がヒト被験者である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の使用するための組成物。
- 組成物が、抗酸化剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、及びその組合せから成る群より選択される活性成分をさらに含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の使用するための組成物。
- 組成物中のブドウ種子抽出物の量が100〜1000 mgである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の使用するための組成物。
- 組成物中のブドウ種子抽出物の量が200〜600 mgである、請求項13に記載の使用するための組成物。
- 組成物が、毎月、二週間毎、毎週、又は毎日の投与のために製剤化されるものである、請求項1〜14のいずれか1項に記載の使用するための組成物。
- 組成物が、毎日の投与のために製剤化されるものである、請求項1〜15のいずれか1項に記載の使用するための組成物。
- 組成物が、単回用量での投与のために製剤化されるものである、請求項16に記載の使用するための組成物。
- 組成物が、分割用量での投与のために製剤化されるものである、請求項16に記載の使用するための組成物。
- 組成物が経口投与されるものである、請求項1に記載の使用するための組成物。
- 組成物が、粉末剤、錠剤、カプセル剤、口腔内崩壊錠、ソフトカプセル剤、水性薬剤、シロップ剤、エリキシル剤、及びサチェット剤から成る群より選択される形態である、請求項19に記載の使用するための組成物。
- 被験者の神経変性疾患を治療するための組成物の調製におけるブドウ種子抽出物の使用であって、前記ブドウ種子抽出物が、該ブドウ種子抽出物中のプロアントシアニジンの総重量に基づいて12重量%未満のガロイル化プロアントシアニジンを有し、且つ未精製のブドウ種子抽出物を酵母培養物又はタンナーゼ酵素で処理することにより得られたものである、前記使用。
- 神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項21に記載の使用。
- 神経変性疾患がパーキンソン病である、請求項21に記載の使用。
- 神経変性疾患がハンチントン病である、請求項21に記載の使用。
- 神経変性疾患がタウオパシーである、請求項21に記載の使用。
- タウオパシーが、アルツハイマー病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、嗜銀顆粒性疾患、ピック病、及び家族性前頭側頭認知症から成る群より選択される、請求項25に記載の使用。
- 組成物が経口剤形の医薬組成物である、請求項21〜26のいずれか1項に記載の使用。
- 経口剤形が、粉末剤、錠剤、カプセル剤、口腔内崩壊錠、ソフトカプセル剤、水性薬剤、シロップ剤、エリキシル剤、及びサチェット剤から成る群より選択される、請求項27に記載の使用。
- 組成物が、経皮投与のための剤形の医薬組成物である、請求項21〜26のいずれか1項に記載の使用。
- 組成物が、経鼻投与のための剤形の医薬組成物である、請求項21〜26のいずれか1項に記載の使用。
- 被験者がヒト被験者である、請求項21〜30のいずれか1項に記載の使用。
- 組成物が、抗酸化剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、及びその組合せから成る群より選択される活性成分をさらに含む、請求項21〜31のいずれか1項に記載の使用。
- 組成物中のブドウ種子抽出物の量が100〜1000 mgである、請求項21〜32のいずれか1項に記載の使用。
- 組成物中のブドウ種子抽出物の量が200〜600 mgである、請求項33に記載の使用。
- 組成物が、毎月、二週間毎、毎週、又は毎日の投与のために製剤化されるものである、請求項21〜34のいずれか1項に記載の使用。
- 組成物が、毎日の投与のために製剤化されるものである、請求項21〜35のいずれか1項に記載の使用。
- 組成物が、単回用量での投与のために製剤化されるものである、請求項36に記載の使用。
- 組成物が、分割用量での投与のために製剤化されるものである、請求項36に記載の使用。
- 組成物が経口投与されるものである、請求項21に記載の使用。
- 組成物が、粉末剤、錠剤、カプセル剤、口腔内崩壊錠、ソフトカプセル剤、水性薬剤、シロップ剤、エリキシル剤、及びサチェット剤から成る群より選択される形態である、請求項39に記載の使用。
- ブドウ種子抽出物が、Aβオリゴマーの形成の減少、タウタンパク質の凝集の減少、httタンパク質の凝集の減少又はこれらの組合せにおいて有効である、請求項1に記載の組成物。
- ブドウ種子抽出物が、Aβオリゴマーの形成の減少、タウタンパク質の凝集の減少、httタンパク質の凝集の減少又はこれらの組合せにおいて有効である、請求項21に記載の使用。
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