JP5726751B2 - フコシル化化合物の合成 - Google Patents
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Description
フコースキナーゼを発現するように細胞を形質転換する工程、
フコース‐1‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼを発現するように上記細胞を形質転換する工程、
フコシルトランスフェラーゼを発現するように上記細胞を形質転換する工程、
を含む。
発現プラスミドの構築および産生株の開発
外部から供給したフコースの分解を良好に防止するためには、鍵となる異化酵素フクロース‐1‐リン酸アルドラーゼをコードするfucA遺伝子を大腸菌株BW25113のゲノムから欠失させる必要があった。fucA欠失の構築には、(Datsenko & Wanner, 2000)の方法を適用した。T7プロモーターを用いた異種遺伝子発現については、λDE3溶原化キット(ノバジェン(Novagen))を用いて、誘導性T7RNAポリメラーゼを欠失大腸菌株BW25113 ΔfucAに組み込んだ。ここで、得られた株を大腸菌BW25113 ΔfucA(DE3)と称した。プラスミドpCOLA‐fkp‐fucPおよびpET‐futAcoは、pCOLADuet‐1およびpETDuet‐1発現ベクター(ノバジェン)を用いて構築した。構築に用いたすべてのプライマーを表2に挙げる。遺伝子fkp(GeneBank受託番号AY849806)は、バクテロイデス・フラジリスのゲノムDNA ATCC25285Dを用い、プライマーfkp‐NcoI‐フォワードおよびfkp‐NotI‐リバースによるPCRで増幅した。大腸菌K12のfucP遺伝子(GeneBank受託番号CP000948)は、プライマーFucP‐NdeI‐フォワードおよびFucP‐XhoI‐リバースを用い、大腸菌TOP10(インビトロジェン(Invitrogen),米国)のゲノムDNAから増幅した。fkpおよびfucPの両方を、それぞれ、pCOLADuet‐1の第一および第二のマルチクローニングサイト(MCS)へ、示した制限部位を用いて挿入した。得られたプラスミドはpCOLA‐fkp‐fucPと称した。H.pyroli株26695のfutA遺伝子(GeneBank受託番号AE000511)に、大腸菌内での発現のためのコドン最適化を施し、ジェンスクリプトコーポレーション(GenScript Corporation)(ピスカタウェイ,ニュージャージー州,米国)による合成により調製した。この遺伝子を、プライマーFutAco‐NcoI‐フォワードおよびFutAco‐BamHI‐リバースを用いて増幅し、pETDuet‐1の第一のMCSへ挿入してpET‐futAcoを得た。クローン遺伝子が正しく挿入されていることを、Duetベクターマニュアル(ノバジェン)に記載の推奨プライマーpACYCDuetUP1、pET‐Upstream、DuetDOWN‐1、DuetUP2、およびT7‐Terminatorを用い、制限分析およびシークエンシングによって確認した。ヘリコバクター・ピロリ NCTC364からのα1,2‐フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子fucT2を含有するプラスミドpCAW55は、C. Albermann(シュトゥットガルト大学、微生物学研究所(Institute for Microbiology, University of Stuttgart))の寄贈によるものであり、ベクターpJOE2702に基づいている(Stumpp et al., 2000)。遺伝子fucT2は、制限部位NdeI/PstIを介して挿入され、L‐ラムノース誘導性プロモーターrhaPBADの支配下にある。大腸菌BW25113 ΔfucA(DE3)は、電気穿孔法により発現ベクターを持ち手形質転換を行った(Dower et al., 1988)。本研究で用いたすべての細菌株を表1に挙げる。
培養条件および細胞抽出物の調製
大腸菌株を、100μgmL−1のアンピシリンおよび/または50μgmL−1のカナマイシンを含有する2xYTブロス(Sambrook & Russell, 2001)10mL中に播種し、ロータリーシェーカー中で37℃にて一晩インキュベートした。翌日、適切な抗生物質を添加した新しい2xYTブロス30mLに、一晩培養物から1/100にて播種し、十分に通気しながらロータリーシェーカー中で37℃にてインキュベートした。培養物の光学密度(OD600nm)が約0.5に達した時点で、誘導因子イソプロピル‐1‐チオ‐β‐D‐ガラクトピラノシド(IPTG)および/またはL‐ラムノースを、それぞれ0.1mMおよび0.1%の濃度で添加した。この培養物を、一定の振とう下にて28℃でさらに一晩(約15時間)インキュベートした。光度活性分析のために、細胞培養物のアリコートを取り出し、細胞をペレット化し、重量/体積で5倍の50mM Tris‐HCl(pH7.5)に再懸濁させた。細胞ペレットの重量の4倍のガラスビーズを添加し、得られた懸濁液に5分間ずつ2回のボルテックス攪拌を施すと同時に、その間にさらに5分間氷上に静置した。細胞デブリを遠心分離(13,200rpm、5分間、4℃)により除去し、得られた粗抽出物を4℃で保存した。
SDS‐PAGE
異種タンパク質の発現を、SDS‐PAGE(Sambrook & Russell, 2001)により確認した。タンパク質抽出物を1× SDSゲルローディングバッファー中に調製し、ポリアクリルアミドゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。
酵素光度計分析
Fkp活性を測定するために、ホスホエノールピルビン酸(PEP)の脱リン酸化の際にピルビン酸キナーゼ(PK)によって基質として用いられる、ATPから生じるADPの量により酵素のフコースキナーゼ活性を測定し、一方、得られたピルビン酸は次に、NADHを消費しながらL‐乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)によりL‐乳酸へ変換された。対応する反応を図2にまとめる。各1,000μLの反応を、10mMのL‐フコース、15mMのPEP、5mMのMgSO4、各々0.2mMのATPおよびNADH、ならびに各々5UのPKおよびLDHを含有する65mMのMOPSバッファー(pH7.5)中で実施した。25μLの粗抽出物の添加後、NADHのNADへの酸化を、V‐630 Bio spectrophotometer(ジャスコ社(JASCO GmbH),ドイツ)を用い、340nmの吸光度の減少によってモニタリングした。
同様に、FucT活性を(図3に示すように)、PEPからピルビン酸への変換の下にてPKによってGTPへとリン酸化されたGDP(供与体GDP‐L‐フコースから)の発生によって測定した。LDHが、NADHの消費を伴うピルビン酸をL‐乳酸へ還元する最終反応を触媒した。細胞抽出物(25μL)の試験は、50mM Tris‐HClバッファー(pH7.5)中に10mM ラクトース、100μM GDP‐L‐フコース、5mM MgSO4、各々0.2mMのATPおよびNADH、ならびに各々5UのPKおよびLDHを含有する反応液1,000μL中にて行った。NADHの減少を340nmでモニタリングした。
オリゴ糖の検出
HPLCシステム(シマズ(Shimadzu),ドイツ)に接続したアンテックレイデン(Antec Leyden)(オランダ)製のDecade IIパルス式電気化学検出器(pulsed amperometric detector)、およびCarboPac PA20カラム(ダイオネクス(Dionex),ドイツ)を用いた高速陰イオン交換クロマトグラフィ(HPAED)でサンプルを分析した。検出器の感度は、印加パルス電位0.05‐Vにて50μAに設定した。単糖、二糖、およびオリゴ糖を、10mM 水酸化ナトリウムを用いて流速0.4mL分−1で溶出した。10mM NaOHによる30分間の定組成溶出後、カラムを200mM NaOHで20分間洗浄して保持時間を一定とし、その後10mM NaOHで20分間の再生を行った。
3H‐フコース供給実験
大腸菌BW25113 ΔfucA(DE3)細胞を、ベクターpCOLADuet‐1、pETDuet‐1、pCOLA‐fkp‐fucP、およびpET‐futAcoで形質転換し、以下の菌株を作出した:
大腸菌BW25113 ΔfucA(DE3)pCOLADuet‐1 pETDuet‐1
大腸菌BW25113 ΔfucA(DE3)pCOLA‐fkp‐fucP
大腸菌BW25113 ΔfucA(DE3)pCOLA‐fkp‐fucP pET‐futAco
大腸菌における効率的なL‐フコースサルベージ経路の確立
フコシルトランスフェラーゼの受容体基質としてラクトースが用いられたことから、β‐ガラクトシダーゼ欠損(lacZ−)大腸菌株BW25113を選択して、急速なラクトース分解の問題を回避した(Datsenko & Wanner, 2000)。L‐フコースもまた、野生型大腸菌により、フクロースへの異性化、フクロース‐1‐リン酸へのリン酸化、並びに、それに続くフクロース‐1‐リン酸のグリセリン‐3‐リン酸及びL‐ラクトアルデヒドへの逆アルドール開裂を介して効果的に分解され得る。供給されたフコースの分解を阻止するために、フコース分解経路の鍵となる異化酵素フクロース‐1‐リン酸アルドラーゼ(FucA)をコードする遺伝子fucAを、大腸菌株BW25113のゲノムから欠失させた。得られた大腸菌株BW25113 ΔfucAは、フコースならびにラクトースを唯一の炭素源とするM9最小培地(minimal plates)上で成長することができなかった。遺伝子組換えファージλDE3による溶原化により、T7プロモーターによって作動される発現ベクターの使用に適合する大腸菌株BW25113 ΔfucA(DE3)を得た。フコースからGDP‐フコースへのヌクレオチド活性化の能力は、自然界では非常に限られており、長い間いくつかの哺乳類(ヒト、ブタ、マウス)で知られるだけであった。フコースのヌクレオチド活性化は、ここで、2つの連続する酵素反応段階によって媒介され、それぞれ、第一は、フコースキナーゼの触媒によるフコースのフコース‐1‐リン酸へのリン酸化、およびこれに続くグアニリルトランスフェラーゼの触媒によるフコース‐1‐リン酸のGDP‐フコースへの変換である。哺乳類の場合、フコースサルベージ経路は2つの別個の酵素触媒反応を含むが、最近発見された細菌および植物のタンパク質は、両方の酵素活性を有する。大腸菌内におけるヒトフコースキナーゼの異種発現は、ほとんど検出されない活性が得られただけであった(Hinderlich et al., 2002)。生化学的研究から、哺乳類フコキナーゼは、高度に制御された酵素であることが示された(Park et al., 1998)。最近発見されたB.flagilisのFkp酵素がフコースの活性化により適しているかどうかを試験し、かつ大腸菌内でのフコシル化オリゴ糖の合成のために効率的にGDP‐フコースを提供するために、本発明者らは、B.fragilisのゲノムDNAからの遺伝子を増幅し、これを異種発現のために細菌発現ベクター中へクローニングした。
酵素活性の光度検出
誘導培養物由来の粗抽出物に、上述の共役酵素分析法において補助酵素(auxiliary enzymes)を用いることで、フコースキナーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性についての試験を施した。明らかに、大腸菌BW25113 ΔfucA(DE3)内にてNADHオキシダーゼおよび/またはホスファターゼ活性のバックグランドが大きく、これが、再現性のない結果、ならびに種々の菌株におけるフコースキナーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性の測定値が低いことの原因であった。従って、酵素活性は、細胞内産物の形成(GDP‐フコースおよびフコシルラクトース)をモニタリングすることで測定することとした。
遺伝子組換え大腸菌によるGDP‐フコースおよび3‐フコシルラクトース産生のための外部から供給された3H‐L‐フコースの利用についての試験
本実験は、バクテロイデス・フラジリスからのフコースサルベージ経路二機能性酵素Fkpによる、フコースおよびラクトースからGDP‐フコース産生を介する3‐フコシルラクトース産生の確認を目的としたものである。ネガティブコントロール大腸菌株BW25113 ΔfucA(DE3)pCOLADuet‐1 pETDuet‐1、さらには、Fkpおよびフコースパーミアーゼを発現する大腸菌株BW25113 ΔfucA(DE3)pCOLA‐fkp‐fucP、ならびにFkp、フコース‐パーミアーゼ、およびα1,3‐フコシルトランスフェラーゼを発現する大腸菌株BW25113 ΔfucA(DE3)pCOLA‐fkp‐fucP pET‐futAcoを、上述のようにして処理した。これらの菌株から得られた細胞抽出物をTLCプレートに適用し、上述のようにして発色させ、ラジオ‐TLCリーダーで分析した。加えて、3H‐標識L‐フコース標準をTLCプレートに適用し、発色させた(図5参照)。L‐フコースおよびL‐フクロース‐1‐リン酸、GDP‐L‐フコース、ならびに3‐フコシルラクトースに対する非放射性標準を、TLCおよびそれに続くアニスアルデヒド溶液による染色によって同様に分析した(データ示さず)。
遺伝子組換え大腸菌による2’‐フコシルラクトースおよび3‐フコシルラクトース産生の試験
pCOLA‐fkp‐fucP、およびfutAcoまたはfucT2遺伝子のいずれかを別個の発現ベクター中に有する大腸菌株BW25113 ΔfucA(DE3)、ならびに空ベクターpCOLADuet‐1およびpETDuet‐1を有する大腸菌BW25113 ΔfucA(DE3)(ネガティブコントロール)を、2xYTブロス中で成長させ、IPTGおよび/またはL‐ラムノースを用いて、28℃にて15時間、タンパク質発現を誘導した。続いて細胞をPBSで洗浄し、L‐フコース、ラクトースおよびグアノシン、IPTG、およびL‐ラムノースを添加した改変M9培地中に再懸濁させた。発酵フェーズの後(28℃、15時間)、細胞を採取し、上清を回収し、上述のようにして細胞溶解物を調製した。
大腸菌JM109細胞内でのGDP‐フコースの発現
Fkpの発現に起因する細胞内GDP‐フコース含有量の上昇が、プラスミドからのFkpを発現する大腸菌株およびFkpのコピーを持たない大腸菌株の平行培養によって示された。この場合、大腸菌株JM109(DE3)ΔfucAを、Fkpを持たないコントロール株として用いた。Fkpを発現する菌株は、同じ大腸菌株JM109(DE3)ΔfucAであるが、こちらはプラスミドpCOLA‐fkp‐fucPを含有し、従ってフコースキナーゼ/フコース‐1‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼFkp、およびフコースパーミアーゼFucPをコードする遺伝子を有していた。遺伝子は、ベクターpCOLADuet‐1(ノバジェン,英国)のマルチクローニングサイト(MCS)1および2にてクローン化したが、いずれのMCSもT7プロモーター/オペレーターの5’側に隣接することから、両方の遺伝子の発現はいずれもIPTGの添加によって誘導することができる。
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Claims (8)
- Bacteroides属細菌由来でありフコースキナーゼおよびフコース‐1‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼの活性を有する二機能性酵素を発現するように細胞を形質転換する工程、および
フコシルトランスフェラーゼを発現するように前記細胞を形質転換する工程、
を含み、
前記細胞が、Escherichia属、Klebsiella属、Helicobacter属、Bacillus属、Lactobacillus属、Streptococcus属、Lactococcus属、Pichia属、Sacchromyces属、およびKluyveromyces属から成る群より選択される微生物であり、
前記細胞のフコースに対する異化経路が、フコース‐1‐リン酸アルドラーゼ遺伝子、フコースイソメラーゼ遺伝子、およびフクロースキナーゼ遺伝子から成る群より選択される1もしくは複数の遺伝子を不活性化することによって不活性化される、
フコシルラクトースまたはラクトジフコテトラオースを産生する能力を有する遺伝子組換え細胞を作製するための方法。 - 前記フコシルトランスフェラーゼが、Helicobacter属、Escherihia属、Yersinia属、Enterococcus属、Shigella属、Klebsiella属、Salmonella属、Bacteroides属、Dictyostelium属、Arabidopsis属、Drosophila属、Homo属、Bos属、Mus属、Rattus属、Gallus属、Canis属、およびSus属から成る群より選択される生物から得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記フコシルラクトースが2’‐フコシルラクトースまたは3‐フコシルラクトースである、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の方法で得られる、遺伝子組換え細胞。
- 請求項4に記載の細胞を、フコースおよび受容体基質を含む培地中にて適切な培養条件下で培養する工程を含む、フコシルラクトースまたはラクトジフコテトラオースを作製するための方法。
- 前記受容体基質が、単糖、二糖、もしくはオリゴ糖、またはペプチドである、請求項5に記載の方法。
- 前記受容体基質が、ラクトース、2’‐フコシルラクトース、または3‐フコシルラクトースである、請求項5または請求項6に記載の方法。
- 前記フコシルラクトースが2’‐フコシルラクトースまたは3‐フコシルラクトースである、請求項5〜請求項7のいずれか1項に記載の方法。
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