JP5718059B2 - ブランク試料 - Google Patents

Description

本発明は、パーオキシダーゼ含有試薬を用いた被検物質の定量に用いられるブランク試料及びこれを用いた定量方法に関する。

測定対象物をそれと特異的に反応する酸化酵素と作用させて過酸化物を生成し、該過酸化物をパーオキダーゼ（以下、ＰＯＤと略記する場合がある）の存在下において発色基質と反応させて発色へと導く比色定量法において、測定系に含まれる過酸化物によりブランク値が上昇してくるという問題がある。特に、界面活性剤やプロテアーゼを含有する試薬を用いる測定系では、該物質により過酸化物が持ち込まれるためブランク値が上昇し易い。

過酸化物の影響を回避する方法としては、生理食塩水等を盲検として測定し過酸化物に由来するシグナルを差し引く方法や、試薬中の過酸化物を選択的に除去する方法がある。
しかし、生理食塩水等を盲検として測定する方法では、第一試薬に過酸化物が含有していると、第二試薬でパーオキシダーゼの存在下において発色へと導く二試薬系の場合、生理食塩水等の測定シグナルが正確なブランク値を反映せず、正確な検量線を作成できない場合があった。この場合、正確な定量を行うことができない。

また、試薬中の過酸化物を選択的に除去する方法として、プロテアーゼ含有試薬にカタラーゼを共存させて過酸化物を消去し、次いでアジ化ナトリウム等の添加によりカタラーゼを失活させた後に測定対象物を定量する方法が知られているが（特許文献１）、プロテアーゼ含有試薬には安定剤としてアジ化ナトリウムを配合する場合が多く、その場合には、ここにカタラーゼを安定に共存させることはできない。

特開２００４−４９０６３号公報

従って、本発明の課題は、測定系に含まれる過酸化物によるブランク値の上昇を抑制し、パーオキシダーゼを含有する試薬により被検物質を正確に定量することのできるブランク試料及びこれを用いた被検物質の定量方法を提供することにある。

本発明者は、生理食塩水等を盲検として測定する方法において正確なブランク値が得られない原因について種々検討したところ、パーオキシダーゼ（パーオキシダーゼ様活性）及び／又はカタラーゼを含有する測定試料及び校正試料においては、該試料に含まれるパーオキシダーゼ及び／又はカタラーゼにより測定試薬に含まれる過酸化物が消去されるのに対して、生理食塩水等をブランク試料とした場合、測定試薬に含まれる過酸化物が消去されずシグナルとして測り込まれるために、正確なブランク値が得られないことを見出した。
そして、さらに検討したところ、ブランク試料として生理食塩水等の代わりに、パーオキシダーゼ及び／又はカタラーゼを含有する試料を用いれば過酸化物によるシグナルを低減でき、正確なブランク値が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、パーオキシダーゼ含有試薬を用いた被検物質の定量に用いられるブランク試料であって、カタラーゼ及び／又はパーオキシダーゼを含有することを特徴とするブランク試料を提供するものである。
また、本発明は、上記ブランク試料を用いることを特徴とするパーオキシダーゼ含有試薬を用いた被検物質の定量方法を提供するものである。

本発明によれば、ブランク値を正確に求めて正確な検量線を作成することが可能となり、パーオキシダーゼ含有試薬、とりわけ第一試薬に過酸化物が含まれ、第二試薬でパーオキシダーゼの存在下において発色へと導く二試薬系の試薬により被検物質を正しく定量することができる。本発明のブランク試料は、検量線のキャリブレーション時に濃度０のブランク値が必要とされる際に特に有用である。

ブランク試料として生理食塩水、１０Ｕ／ｍＬＰＯＤ水溶液を用いたときの検量線を示す。 ブランク試料として生理食塩水、１０Ｕ／ｍＬＰＯＤ水溶液を用いたときの検量線を示す。

本発明のブランク試料に用いられるカタラーゼとしては、臨床検査に使用できるものであれば特に制限はなく、例えば、牛肝臓、人赤血球等の動物由来のカタラーゼ；アスペルギルス、ミクロコッカス、ロドシュードモナス等の細菌由来のカタラーゼ；遺伝子組換えにより作製したカタラーゼ等が挙げられる。

ブランク試料中の上記カタラーゼの含有量は１０〜１０，０００，０００Ｕ／ｍＬ、好ましくは１００〜１，０００，０００Ｕ／ｍＬ、更に好ましくは１，０００〜１００，０００Ｕ／ｍＬである。

本発明のブランク試料に用いられるパーオキシダーゼとしては、臨床検査に使用できるものであれば特に制限はなく、例えば、西洋ワサビ、白血球、酵母等に由来するパーオキシダーゼ、遺伝子組換えにより作製したパーオキシダーゼ等が挙げられる。

ブランク試料中のパーオキシダーゼの含有量は０．０１〜１０，０００Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．１〜１，０００Ｕ／ｍＬ、更に好ましくは１〜１００Ｕ／ｍＬである。

ブランク試料は、カタラーゼ及び／又はパーオキシダーゼを精製水、生理食塩水、又は緩衝液で溶解したものを用いるのが好ましい。
上記緩衝液としては、ｐＨ４．０〜１０．０、好ましくはｐＨ５．０〜９．０の範囲で緩衝能を有する緩衝剤を含有するものが挙げられ、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸及びその塩類；グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸及びその塩類等、グッドの緩衝液等の両性緩衝液が挙げられる。
また、ブランク試料には、必要に応じて、例えば、界面活性剤、安定化剤、防腐剤等を添加することも可能である。

本発明のブランク試料は、パーオキシダーゼ含有試薬を用いた被検物質の定量に用いられる。ここで、パーオキシダーゼ含有試薬は、臨床検査に使用される試薬で、パーオキシダーゼを含有した酸化発色系の試薬であれば特に制限されず、例えば、測定対象物に、これに特異的に反応する酸化酵素を作用させて過酸化物を生成させ、該過酸化物をＰＯＤの存在下において発色基質と反応させて発色へと導く比色定量法に使用される試薬がある。
また、パーオキシダーゼ含有試薬は、一試薬系、二試薬系のいずれでもよいが、二試薬系であるのが好ましく、特に、第一試薬に発色基質を含有し、第二試薬にパーオキシダーゼを含有する二試薬系であるのが反応性や安定性の点から好ましい。

パーオキシダーゼ含有試薬中のパーオキシダーゼは、上記ブランク試料に用いられるパーオキシダーゼと同じものが用いられ、その試薬中の含有量は０．０１〜１０，０００Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．１〜１，０００Ｕ／ｍＬ、更に好ましくは０．５〜１００Ｕ／ｍＬである。

上記パーオキシダーゼ含有試薬は、パーオキシダーゼ、発色基質の他に、例えば、プロテアーゼ、界面活性剤等を含有するのが好ましい。パーオキシダーゼ含有試薬が上記二試薬系である場合、プロテアーゼや界面活性剤は第一試薬に処方されるのが好ましい。
上記発色基質としては、ＰＯＤの存在下、過酸化水素と反応して呈色するものであれば如何なるものでもよい。例えば、４−アミノアンチピリンと、フェノール系、ナフトール系又はアニリン系化合物との組み合わせ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとアニリン系化合物との組み合わせ等の他、フェノチアジン系化合物などの一分子酸化発色化合物が挙げられる。

４−アミノアンチピリンと組み合わせることができるフェノール系化合物としては、例えば、フェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、２，４，６−トリクロロフェノール等が挙げられ、ナフトール系化合物としては、例えば、１−ナフトール、１−ナフトール−２−スルホン酸、１−ナフトール−２−カルボン酸，１−ナフトール−８−スルホン酸，１−ナフトール−３−スルホン酸、１−ナフトール−４−スルホン酸等が挙げられ、アニリン系化合物としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＥＳＢｍＴ）、Ｎ，Ｎ−ジスルホブチル−ｍ−トルイジン（ＤＳＢｍＴ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（ヒドロキシエチル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン（ＡＤＯＳ）等が挙げられる。

その他、Ｎ−（カルボシキメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミン・ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジン・ナトリウム塩（ＤＡ−６７）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ−３−スルホプロピル−４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ−ＰＳ）、ジアミノベンチジン、ヒドロキシフェニルプロピオン酸、テトラメチルベンチジン、オルトフェニレンジアミン等の一分子酸化発色化合物が用いられる。

上記プロテアーゼとしては、微生物由来、動物由来、植物由来等何れでもよく、特に限定はされない。具体的には、プロテイナーゼＫ、トリプシン、ブロメライン、カルボキシペプチダーゼ、パパイン、ペプシン、アミノペプチダーゼ等研究用途の市販品として容易に入手できるもの、ニュートラルプロテイナーゼ、トヨチームＮＥＰ（以上、東洋紡社製）、酸性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、モルシン、ＡＯプロテアーゼ、ペプチダーゼ（以上、キッコーマン社製）、スミチームＣＰ、スミチームＴＰ、スミチームＬＰ５０Ｄ（以上、新日本化学工業社製）、サモアーゼＰＣ１０Ｆ、プロチンＰＣ、プロチンＰＣ１０Ｆ、プロチンＰＳ１０、プロチンＮＹ１０、プロチンＮＬ１０、プロチンＮＣ２５（以上、大和化成社製）、アクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）、プロナーゼＥ（ロシュ社製）、ウマミザイム、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ（以上、アマノエンザイム社製）等工業用として市販されているものが挙げられる。

上記界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤の何れでもよい。
非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、グリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物等が挙げられる。これらの非イオン性界面活性剤のうち、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、例えば、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとしては、例えば、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等が挙げられる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルとしては、例えば、ポリオキシエチレングリコールモノラウレート、ポリオキシエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレングリコールジステアレート、ポリオキシエチレングリコールモノオレエート等が挙げられる。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート等が挙げられる。ソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンジステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンセスキオレエート等が挙げられる。ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルとしては、例えば、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルアミンとしては、例えば、ポリオキシエチレンラウリルアミン、ポリオキシエチレンステアリルアミン等が挙げられる。グリセリン脂肪酸エステルとしては、例えば、ステアリン酸モノグリセライド、オレイン酸モノグリセライド等が挙げられる。脂肪酸アルカノールアミドとしては、例えば、ラウリン酸ジエタノールアミド等が挙げられる。ショ糖脂肪酸エステルとしては、例えば、ショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル等が挙げられる。

陽イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪族アミン塩、脂肪族４級アンモニウム塩等が挙げられる。このうち、脂肪族アミン塩としては、例えば、モノラウリルアミン、モノステアリルアミン、ジステアリルアミン、トリステアリルアミン等の高級脂肪族アミン等と、塩酸、硫酸等の無機酸或いは酢酸、乳酸、クエン酸等の低級カルボン酸等との塩等が挙げられ、具体的にはラウリルアミン酢酸塩、ステアリルアミン酢酸塩等が挙げられる。
脂肪族４級アンモニウム塩としては、例えば、ラウリルトリメチルアンモニウム、ステアリルトリメチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、ジデシルジメチルアンモニウム、ベンジルメチルテトラデシルアンモニウム等の高級脂肪族アンモニウム等と塩素、臭素等の塩等が挙げられ、具体的にはラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、セチルトリメチルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロライド等が挙げられる。

陰イオン性界面活性剤としては、例えば、カルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステル塩、リン酸エステル塩等が挙げられる。このうち、カルボン酸塩としては、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸等と、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属等との塩等が挙げられ、具体的にはオレイン酸カリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチル−β−アラニンナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム等が挙げられる。スルホン酸塩としては、例えば、ラウリルベンゼンスルホン酸等のアルキルベンゼンスルホン酸、ジプロピルナフチレンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸等のナフタレンスルホン酸、ジオクチルスルホコハク酸等のスルホコハク酸等と、ナトリウム等の塩等が挙げられ、具体的にはラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ジプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等が挙げられる。硫酸エステル塩としては、例えば、ラウリル硫酸エステル等の高級アルコール硫酸エステル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸等エステル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸等エステルと、ナトリウム、アンモニウム等との塩等が挙げられ、具体的にはラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等の高級アルコール硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩エステル塩等が挙げられる。リン酸エステル塩としては、例えば、モノステアリルリン酸エステル、モノラウリルリン酸エステル、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸等と、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属等との塩等が挙げられ、具体的にはモノステアリルリン酸ナトリウム、モノラウリルリン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸カリウム等が挙げられる。

両性界面活性剤としては、例えば、カルボキシベタイン類、スルホベタイン類、グリシン類、アラニン類、２−アルキルイミダゾリンの誘導体類、アミンオキサイド類等が挙げられる。このうちカルボキシベタイン類としては、例えば、ラウリン酸アミドプロピルベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ’−カルボキシメチル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等が挙げられる。スルホベタイン類としては、例えば、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン等が挙げられる。グリシン類としては、例えば、ラウリルジアミノエチルグリシンナトリウム等が挙げられる。２−アルキルイミダゾリンの誘導体類としては、例えば、２−ラウロイル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミイダゾリニウムベタイン等の２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等が挙げられる。アミンオキサイド類としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等が挙げられる。

また、パーオキシダーゼ含有試薬には、種々の目的のため必要に応じて、防腐剤、安定化剤等を添加することも可能である。

本発明における被検物質としては、パーオキシダーゼ含有試薬により定量できるものであれば特に制限されないが、全血中の成分又は血球由来の成分が好ましい。全血中の成分又は血球由来の成分としては、例えば、糖化タンパク質、グルコース等が挙げられ、特にヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）、グルコースが好ましい。

本発明のブランク試料を用いて被検物質を定量する方法としては、例えば、被検物質をそれと特異的に反応する酸化酵素と作用させて過酸化物を生成させ、該過酸化物をパーオキダーゼの存在下において発色基質と反応させて発色へと導いて比色定量し、被検物質を定量する方法が挙げられる。具体的には、パーオキシダーゼ含有試薬を上記二試薬系の試薬として用いる場合、先ず、ブランク試料、既知濃度の被検物質及び濃度未知の被検物質を含む試料をそれぞれ第一試薬と反応させ、次いで第二試薬とそれぞれ反応させた後、各試料を用いた場合の吸光度変化量をそれぞれ測定し、ブランク試料及び既知濃度の被検物質を用いた場合の測定値より検量線を作成する。濃度未知の被検物質を含む試料の測定値を、作成した検量線に照らし合わせ、該試料中の被検物質の濃度を算出する。

被検物質がＨｂＡ１ｃの場合、その定量方法として、酵素法による測定が好適に用いられる。酵素法としては、例えば、特開平２−１９５８９９号公報、特開平２−１９５９００号公報、特開平５−１９２１９３号公報、特開平６−４６８４６号公報、特開平７−２８９２５３号公報、特開平８−１５４６７２号公報、特開平８−３３６３８６号公報に記載の方法が挙げられ、具体的には、糖化ヘモグロビンよりプロテアーゼを用いて糖化アミノ酸／ペプチドを切り出し、次に該糖化アミノ酸／ペプチドと反応する酸化酵素を作用させて過酸化水素を生成させ、さらにパーオキシダーゼの存在下で発色基質を発色に導くことにより糖化ヘモグロビンを比色定量する。

また、ＨｂＡ１ｃを上記二試薬系の試薬により定量する場合、第一試薬にヘモグロビンを安定化するヘモグロビン安定化剤が含有されているのが好ましい。ヘモグロビン安定化剤の第一試薬中の含有量は、０．０００１〜０．１質量％（以下、単に％）、好ましくは０．００１〜０．１質量％である。
上記ヘモグロビン安定化剤としては、ヘモグロビンを安定化するものであれば特に制限はなく、例えば、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム、シアン化ナトリウム、シアン化カリウム、好ましくは、アジ化ナトリウム、アジ化カリウムが挙げられる。

以下に実施例をもって本願発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ グルコース定量における添加回収試験
１．試料の作製
＜ブランク試料＞
・比較品；生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）
・本発明品；１０Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ水溶液（１０，０００Ｕのパーオキシダーゼ（東洋紡社製）を、精製水１Ｌで溶解した）
＜校正用試料＞
・グルコース濃度既知ヒト全血（グルコース濃度９４ｍｇ／ｄＬ）
＜グルコース添加ヒト全血試料＞
０、２００、４００、６００、８００、１０００ｍｇ／ｄＬの濃度のグルコース水溶液１００μＬとヒト全血（グルコース濃度が９４ｍｇ／ｄＬである全血）９００μＬを混合した。

２．ブランク試料、校正用試料及びグルコース添加ヒト全血試料の測定
生化学自動分析装置ＪＣＡ−ＢＭ９１３０（日本電子）を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。
＜基質試薬（第一試薬）＞
以下の成分を含む１００ｍＭ ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、同仁化学研究所社製）緩衝液、ｐＨ６．０
１ｍＭ ＥＳＢｍＴ（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｓｕｌｆｏｂｕｔｙｌ−ｍ−ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ、積水メディカル社製）
１Ｕ／ｍＬ Ｍｕｔａｒｏｔａｓｅ（天野エンザイム社製）
０．１％プルロニックＦ８８（ポリオキシエチレン（２００）ポリオキシプロピレン（４０）グリコール、ＡＤＥＫＡ社製）
＜発色試薬（第二試薬）＞
以下の成分を含む１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．０
２ｍＭ ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業社製）
２Ｕ／ｍＬ パーオキシダーゼ（東洋紡社製）
２００Ｕ／ｍＬ グルコースオキシダーゼ（東洋紡社製）

各試料５μＬを精製水１００μＬで希釈した希釈試料１５μＬ及び第一試薬６０μＬをセルに分注し３７℃で５分間加温後、主波長５９８ｎｍ、副波長８０５ｎｍの吸光度を測定した（Ａｂｓ１）。続いて第二試薬２０μＬを添加し、３７℃で５分間加温後、主波長５９８ｎｍ、副波長８０５ｎｍの吸光度を測定した（Ａｂｓ２）。
各試料のＡｂｓ１（ＯＤ）及びＡｂｓ２（ＯＤ）から、下記式Ａを用いて各試料の吸光度変化量（測定値）を算出した。
式Ａ：吸光度変化量（ΔＡｂｓ）＝Ａｂｓ２−Ａｂｓ１×７５÷９５
各試料の感度を表１に示す。

表１から明らかなように、ブランク試料として生理食塩水を測定したときは過酸化物を測り込むため、過酸化物のシグナルが生じるのに対し、１０Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ水溶液を測定したときは試料が含有するパーオキシダーゼ活性により過酸化物は消去されるため、ブランク値が低減されていた。

３．検量線の作成
ブランク試料（生理食塩水、１０Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ水溶液）と校正用試料の２点より一次検量線を作成した。図１に示す。

４．グルコース添加ヒト全血試料の定量
上記３で作成した検量線を用いて、グルコース添加ヒト全血試料のグルコース濃度を算出した結果を表２に示す。

表２から分かるように、１０Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ水溶液をブランク試料として使用したときはグルコースの添加回収率は概ね１００％の回収率であったのに対して、生理食塩水をブランク試料として使用したときにはグルコースの回収率は大きな誤差が生じた。このように検量線作成において、過酸化物を含む試薬で測定を行うとき、パーオキシダーゼを含有するブランク試料を盲検として測定することにより正確な測定ができることが判明した。

実施例２ ＨｂＡ１ｃの定量
１．試料の作製
＜ブランク試料＞
・比較品；生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）
・本発明品；１０Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ水溶液（１０，０００Ｕのパーオキシダーゼ（東洋紡社製）を、精製水１Ｌで溶解した）
＜校正用試料＞
・ヘモグロビンＡ１ｃ校正用試料Ｌ（ＨｂＡ１ｃ（％）５．２７％、凍結乾燥品）、（積水メディカル製、ＨｂＡ１ｃコントロールＬ）
・ヘモグロビンＡ１ｃ校正用試料Ｍ（ＨｂＡ１ｃ（％）７．６４％、凍結乾燥品）、（積水メディカル製、ＨｂＡ１ｃコントロールＭ）
・ヘモグロビンＡ１ｃ校正用試料Ｈ（ＨｂＡ１ｃ（％）１０．８１％、凍結乾燥品）、（積水メディカル製、ＨｂＡ１ｃコントロールＨ）
いずれも下記検体希釈液３００μＬで溶解して測定に供した。
なお、校正用試料であるＨｂＡ１ｃコントロールのＨｂ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）及びＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）は、ＨｂＡ１ｃコントロールをノルディアＮ ＨｂＡ１ｃ用ＨｂＡ１ｃ前処理液（積水メディカル製）３００μＬで溶解したものを、ノルディアＮ ＨｂＡ１ｃ試薬（積水メディカル製）で測定して値を付した。
＜ＨｂＡ１ｃ実検体試料＞
予め、４℃、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した試料（ＮａＦ添加血漿８例）の血球層１５μＬを下記検体希釈液５００μＬで希釈して、溶血させた溶血試料を測定に供した。

２．ブランク試料、Ａ１ｃ検量線作成用試料及びＡ１ｃ検体試料の測定
日立７１７０形自動分析装置を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。
＜検体希釈液＞
１０ｍＭ 亜硝酸ナトリウム
＜プロテアーゼ含有基質試薬（第一試薬）＞
以下の成分を含む５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ７．０
１．５％ アンヒトール２０ＢＳ（花王社製）
２．０ｍｇ／ｍＬ プロチンＰＣ１０Ｆ（大和化成工業社製）
１ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（東京化成工業社製）
０．０１％ アジ化ナトリウム（キシダ化学社製）
５０μＭ ＤＡ−６７（１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム、和光純薬工業社製）
＜発色試薬（第二試薬）＞
以下の成分を含む５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ７．０
１０Ｕ／ｍＬ フルクトシルペプチドオキシダーゼ（キッコーマン社製）
１Ｕ／ｍＬ パーオキシダーゼ（東洋紡社製）

＜測定パラメータ＞
分析方式：３ポイントエンド
測定波長（Ｈｂ、副／主）：８００／５０５
（ＨｂＡ１ｃ、副／主）：８００／６６０
測光ポイント（Ｈｂ）：０−１４
（ＨｂＡ１ｃ）：１６−３４
反応時間：１０分
サンプル量：１２μＬ
第一試薬：１８０μＬ（Ｒ１） 第３試薬（Ｒ２）：６０μＬ

各試料１２μＬ及び第一試薬１８０μＬをセルに分注し３７℃で５分間加温後、主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍの吸光度の差（Ａｂｓ１）、及び主波長５０５ｎｍ、副波長８００ｎｍの吸光度の差（Ａｂｓ３）を測定した。続いて第二試薬６０μＬを添加し、３７℃で５分間加温後、主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍの吸光度の差を測定した（Ａｂｓ２）。
各試料のＡｂｓ１（ｍＯＤ）及びＡｂｓ２（ｍＯＤ）から下記式Ｂを用いて各試料の吸光度変化量（測定値）を算出した。
式Ｂ：吸光度変化量（ΔＡｂｓ）＝Ａｂｓ２−Ａｂｓ１×１９２÷２５２
各試料の感度を表３に示す。

表３から明らかなように、ブランク試料として生理食塩水を測定したときは過酸化物を測り込むため、過酸化物のシグナルが生じるのに対し、１０Ｕ／ｍＬＰＯＤ水溶液を測定したときはパーオキシダーゼ活性により過酸化物は消去されるため、ブランク値が低減されていた。

３．検量線の作成
ブランク試料（生理食塩水、１０Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ水溶液）と校正用試料の４点のΔＡｂｓよりＨｂＡ１ｃの検量線を作成した。検量線のグラフを図２に示す。図２から明らかなように、生理食塩水をブランク試料として検量線を作成した場合、ブランク試料の感度が校正用試料の感度を上回ることにより、特にＨｂＡ１ｃ低濃度域において正確な測定値を算出できないのに対し、１０Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ水溶液をブランク試料として検量線を作成した場合、ブランク試料、校正用試料の４点がほぼ直線上に位置し正確な定量が可能となった。
また、ブランク試料（生理食塩水、１０Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ水溶液）とブランク試料と校正用試料（ＨｂＡ１ｃコントロールＬ）の２点のＡｂｓ３よりＨｂの検量線を作成した。

４．実検体試料のＨｂＡ１ｃの定量
上記３で作成した検量線を用いて、実検体試料のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）及びＨｂ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を算出し、さらに下記式Ｃ（日本糖尿病学会グリコヘモグロビン標準化ＨｂＡ１ｃ値に換算するために自動分析装置の項目間演算式、日本臨床化学会 糖尿病関連指標専門委員会：ＡＤＡ、ＥＡＳＤ、ＩＦＣＣ、ＩＤＦによるヘモグロビンＡ１ｃ測定の国際標準化に関するコンセンサス・ステートメントに対する糖尿病関連指標専門委員会の見解、臨床化学 ３６、３１０（２００７））を用いてＨｂＡ１ｃ（％）を算出した。
式Ｃ ＨｂＡ１ｃ（％）＝ＨｂＡ１ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）÷Ｈｂ（μｍｏｌ／Ｌ）×９６．３＋１．６２
結果を表４に示す。なお、対照としてＨＰＬＣ法でＨｂＡ１ｃ（％）の定量を行った。

＜ＨＰＬＣ法によるＨｂＡ１ｃ値の測定＞
東ソー自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ−７２３Ｇ８を用い、ＨｂＡ１ｃ（％）を測定した。

表４から分かるように、１０Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ水溶液をブランク試料として使用したときに測定値は対照であるＨＬＣ−７２３ Ｇ８に対して、ＨｂＡ１ｃ（％）で＋０．１〜−０．３％の差異であった。それに対して生理食塩水をブランク試料として使用したときに、測定値は特にＨｂＡ１ｃ低濃度の試料においてＨｂＡ１ｃ（％）で最大２．６％の誤差が生じる結果であった。このように検量線作成において、過酸化物を含む試薬で測定を行うとき、パーオキシダーゼを含有するブランク試料を盲検として測定することにより正確な測定ができることが判明した。

実施例３ ブランク試料の測定１．ブランク試料の作製

・比較品；生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）
・本発明品；５０，０００Ｕ／ｍＬ カタラーゼ水溶液（和光純薬工業社製）
・本発明品；１０，０００Ｕ／ｍＬ カタラーゼ（和光純薬工業社製）＋１，０００Ｕ／ｍＬ ＰＯＤの混合溶液

２．測定
日立７１７０形自動分析装置を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。
＜界面活性剤含有基質試薬（第一試薬）＞
以下の成分を含む１００ｍＭ ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、同仁化学研究所社製）緩衝液、ｐＨ６．０
１ｍＭ ＥＳＢｍＴ（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｓｕｌｆｏｂｕｔｙｌ−ｍ−ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ、積水メディカル社製）
１Ｕ／ｍＬ Ｍｕｔａｒｏｔａｓｅ（天野エンザイム社製）
１％プルロニックＦ８８（ポリオキシエチレン（２００）ポリオキシプロピレン（４０）グリコール、ＡＤＥＫＡ社製）
＜発色試薬（第二試薬）＞
以下の成分を含む１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．０
２ｍＭ ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業社製）
２Ｕ／ｍＬ パーオキシダーゼ（東洋紡社製）
２００Ｕ／ｍＬ グルコースオキシダーゼ（東洋紡社製）

各試料３μＬ及び第一試薬１８０μＬをセルに分注し３７℃で５分間インキュベートした後、６００ｎｍの吸光度と８００ｎｍの吸光度を測定した（Ａｂｓ１）。続いて第二試薬６０μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、６００ｎｍの吸光度と８００ｎｍの吸光度を測定した（Ａｂｓ２）。
各試料のＡｂｓ１（ＯＤ）及びＡｂｓ２（ＯＤ）から、下記式Ｄを用いて各試料の吸光度変化量（測定値）を算出した。
式Ｄ：吸光度変化量（ΔＡｂｓ）＝Ａｂｓ２−Ａｂｓ１×１８３÷２４３）
各試料の感度を表５に示す。

表５から明らかなように、ブランク試料として生理食塩水を測定したときは過酸化物を測り込むため、過酸化物のシグナルが生じるのに対し、本発明品を測定したときは試料が含有するカタラーゼ、ＰＯＤ活性により過酸化物は消去されるため、ブランクが低減されていた。

Claims (2)

1. 第一試薬に発色基質、プロテアーゼ及びヘモグロビン安定化剤を含有し、第二試薬にパーオキシダーゼを含有する二試薬系の試薬を用いたヘモグロビンＡ１ｃの定量に用いられるブランク試料であって、カタラーゼ及び／又はパーオキシダーゼを含有することを特徴とするブランク試料。
2. 請求項１記載のブランク試料を用いることを特徴とする第一試薬に発色基質、プロテアーゼ及びヘモグロビン安定化剤を含有し、第二試薬にパーオキシダーゼを含有する二試薬系の試薬を用いたヘモグロビンＡ１ｃを含む試料中のヘモグロビンＡ１ｃの定量方法。

Images