JP5707317B2 - 液体クロマトグラフ，液体クロマトグラフ用カラム、および液体クロマトグラフ用カラムのフィルタ - Google Patents

Description

本発明は、液体クロマトグラフ，液体クロマトグラフ用カラム，液体クロマトグラフ用カラムのフィルタに関する。

液体クロマトグラフでは、分析対象試料を分離させるための分離カラムや、アミノ酸分析のときには試薬と混合し反応させる反応カラムが用いられる。このカラムに充填される充填剤がビーズ形状をしている場合、充填剤をカラム内に封止させる目的で、カラムの両端にフィルタが設けられる。フィルタのメッシュの大きさは、ビーズ形状の充填剤の粒径よりも小さく設定される。

このフィルタの材料として、鉄Ｆｅを主成分とし、クロムＣｒ，マンガンＭｎ，ニッケルＮｉ，モリブデンＭｏを含むステンレスが、従来から用いられている。このステンレスの種類によっては、クロムＣｒ，マンガンＭｎ，ニッケルＮｉ，モリブデンＭｏの他に、ニオブＮｂ，アルミニウムＡｌを含むことがある。ステンレスの主要な成分は、ニッケルＮｉを１０から１４％程度、主成分の鉄Ｆｅは７０％程度含有する。

アミノ酸，アミノ酸類縁物質およびそれらアミノ酸から構成されるタンパク質は、ステンレス素材の表面に吸着する性質を持っている。そのため、ステンレス素材を流路に使用している液体クロマトグラフ装置では、アミノ酸やタンパク質等の化学種を分析する際、流路の表面にこれらが吸着し、分析結果に悪影響を及ぼす可能性がある。

特に、アミノ酸の一種であるシスチンを含むペプチドやタンパク質は、鉄イオンと強い相互作用を示すことが知られている。非特許文献１によれば、硫黄原子を２個有するジサルファイドは金属表面の鉄原子に特異的に吸着し、一旦、鉄メルカプチドを形成する。最終的にはＣ−Ｓ結合が切断され、硫化鉄の状態でステンレス素材の表面を覆うことになる。この現象は、ジサルファイド吸着現象とよばれる。

また、シスチンを含むペプチドは、液体クロマトグラフのカラムに用いられるフィルタがステンレス素材の場合、ステンレス素材の表面に吸着し、分析結果であるクロマトグラムで得られるピークがすそ広がりになってしまうテーリング現象を引き起こす可能性がある。

さらに、ペプチドのフィルタへの吸着が極端な場合、大部分がカラムから溶出せず、試料の回収率が低下するという問題が生じてしまう。

：E. S. Forbes, et al: ASLE Trans., 16（1973）50

本発明の目的は、液体クロマトグラフにおいて、カラムのフィルタにおける鉄原子のジサルファイド吸着現象を回避することにより、クロマトグラムのピークのテーリング現象を防止し、試料の回収率の低下を防ぐことである。

上記課題を解決するために、本発明の実施態様は、液体クロマトグラフの分離カラムまたは反応カラムが、中空管状のカラムボディと、カラムボディの中空部に充填されたビーズ形状の充填剤と、充填剤の粒径よりも小さい寸法のメッシュを備えたフィルタと、フィルタを充填剤へ押し付けて充填剤を前記カラムボディ内に封止するキャップとを備え、フィルタの主成分がニッケル、あるいはハステロイ（登録商標）であることを特徴とする。

本発明によれば、液体クロマトグラフにおいて、カラムにおける鉄原子のジサルファイド吸着現象を回避し、アミノ酸，アミノ酸類縁物質およびそれらアミノ酸から構成されるタンパク質が流路に吸着することを防ぐことができ、クロマトグラムのピークのテーリング現象を防止し、試料の回収率の低下を防ぐことができる。

液体クロマトグラフの概略構成を示す構成図である。 分離カラムの構成を示す縦断面図である。

以下、図面を参照して本発明の実施例を説明する。

〔装置の概要〕
図１は、液体クロマトグラフの概略構成を示す構成図である。一般に、液体クロマトグラフをアミノ酸の分析に使用する場合は、アミノ酸分析計と呼ばれる。各構成機器をつなぐ線分は、配管等の流路を表す。分析対象試料を運搬する第１緩衝液が容器１に、第２緩衝液が容器２に、第３緩衝液が容器３に、第４緩衝液が容器４に保管されている。また、分離カラムを洗浄し再生するためのカラム再生液が容器５に保管されている。図示しない制御装置により、電磁弁６Ａ，６Ｂ，６Ｃ，６Ｄ，６Ｅの開閉が制御され、緩衝液ポンプ７により選ばれた緩衝液が流路へ送液される。緩衝液は、緩衝液中のアンモニアを除去するアンモニアフィルタ８を通過し、オートサンプラ９で分析対象試料が注入され、分離カラム１０へ達する。分離カラム１０では、分析対象試料、たとえばアミノ酸が分離し、ミキサ１３へ送られる。一方、ニンヒドリン試薬が容器１１に保管されており、ニンヒドリン試薬ポンプ１２により、ニンヒドリン試薬がミキサ１３へ送られる。ミキサ１３で分離したアミノ酸とニンヒドリン試薬とが混合し、反応カラム１４で加熱されて両者が反応し、反応により発色したアミノ酸のルーエマンパープル色が検出器１５で検出され、データ処理装置１６にデータが送られる。データ処理装置１６では、クロマトグラムが作成され、画面表示およびデータの保存が行われる。

〔分離カラムのフィルタ〕
図２は、分離カラムの構成を示す縦断面図である。分離カラム１０は、管形状のカラムボディ１７の内部に充填剤１８が充填され、両端部をカラムフィルタ１９で封止したものである。また、カラムフィルタ１９の周囲をパッキン２０で押さえて漏れ止めとするとともに、フィッティングキャップ２１をカラムボディ１７にねじ込む等で、カラムフィルタ１９を充填剤１８に押し付けて封止するようにしている。

表１は、ハステロイ（登録商標）、ステンレス、チタンについて、鉄およびニッケルの含有量と、耐食性を示す一覧表である。耐食性については、摂氏２４度の環境下で、３０％塩酸水溶液を連続して吹き付けたとき、腐食速度はハステロイ（登録商標）が最も遅いので、ハステロイ（登録商標）が耐食性に優れていることがわかる。本発明の実施例では、このカラムフィルタ１９の素材として、ニッケル系合金を採用し、特に、ハステロイ（登録商標）を使用する。カラムフィルタ１９のフィルタ部分の仕様は、充填剤であるイオン交換樹脂の粒径３マイクロメートルに対して、公称０．５マイクロメートルのろ過精度のものを用いている。また、カラムフィルタ１９の外径は４．６ミリメートル、厚さは１．６ミリメートルである。

ハステロイ（登録商標）は、主成分がニッケルであり、鉄は１から１８重量％しかないため、ジサルファイド吸着現象がほとんど引き起こされない。したがって、アミノ酸を分析対象試料としたとき、アミノ酸の一種であるジサルファイド系分子シスチンのカラムフィルタ１９への吸着が避けられるので、得られたクロマトグラムのピークのテーリング現象を抑えることができる。同様に、ジサルファイド系分子であるホモシスチン、システイン・ホモシステイン・ジスルフィドなども、クロマトグラムのピークのテーリング現象を抑えることができる。

さらに、カラムフィルタ１９のフィルタ部分にペプチドが吸着してしまうと、流れを塞ぎ、分離カラム１０から試料の大部分が溶出してこないことがありうるので、分析ができなくなる。本実施例によれば、アミノ酸の成分がカラムフィルタ１９に吸着しないので、アミノ酸試料の回収率の低下を防ぐことができる。

ジサルファイド系アミノ酸を構成分子に持つペプチドやタンパク質を分析対象試料としたときの回収率については、発明者らの実験によれば、カラムフィルタにステンレスを用いた場合５０％、ハステロイ（登録商標）を用いた場合１００％であった。

また、カラムフィルタ１９には耐酸性や耐腐食性も要求される。例えば、４０成分アミノ酸生体液分析法の場合、緩衝液として酸性度ｐＨ２．８の数十ミリモル／Ｌのクエン酸リチウム系緩衝液が送液される。ハステロイ（登録商標）は耐酸性金属であり、試料液体の酸性度がｐＨ２まで使用可能である。また、前出の表１からわかるように、ステンレスやチタンに較べて耐食性が優れている。

〔反応カラムのフィルタ〕
アミノ酸分析計では、アミノ酸成分を分離カラム１０で分離した後に、ニンヒドリン反応試薬と混合し、反応カラム１４で摂氏１３５度に加温することによりルーエマンパープル色が生成されるので、検出器１５で可視光５７０ナノメートルの吸光度を検出する。この混合から発色反応までを行うデバイスとして、柱状リアクタを反応カラム１４に使用する。反応カラム１４の構造は、図２に示した分離カラム１０と同様であり、カラムボディの内径は３から６ミリメートル、長さ４０から８０ミリメートルである。この内部に、粒径１００マイクロメートル程度で、化学反応上不活性な球形あるいは破砕型のセラミックス系ビーズなどが充填剤として充填されている。反応カラム１４からのこのビーズの流出を防止する目的で、両端部にフィルタを設けている。

反応カラム４１には、分離カラム１０を通過したアミノ酸が送られるが、反応カラム１４のフィルタでジサルファイド吸着現象が起きてしまうと、クロマトグラムのピークのテーリング現象や試料の回収率の低下が起こる。したがって、反応カラム１４のフィルタにもハステロイ（登録商標）を用いる。粒径が５０から１００マイクロメートルのビーズ粒子を封止する目的のため、フィルタ部分は１から３０マイクロメートルを選択する。外径は３から６ミリメートル、厚さは０．５から２．５ミリメートルである。

図１に示したミキサ１３から反応カラム１４へ送られるニンヒドリン反応試薬は、数モル／Ｌの酢酸リチウム系緩衝液で酸性度がｐＨ６程度であるため、反応カラム１４に使用するフィルタに耐酸性は必要ないと考えられる。しかし、ミキサ１３で緩衝液にニンヒドリン反応試薬が混合されるところ、万一ニンヒドリン反応試薬が送液されなかった場合、摂氏１３５度程度の高温下に、酸性度ｐＨ２.８の数十ミリモル／Ｌのクエン酸リチウム系緩衝液が送液されるため、反応カラム１４のフィルタも耐酸性を備える必要がある。

ステンレス製のフィルタに、摂氏１３５度の環境下で酸性度ｐＨ２．８の緩衝液を送液した場合、２４時間経過後の観察で腐食が認められた。これに対して、ハステロイ（登録商標）製のフィルタを同じ条件で緩衝液を送液しても、全く腐食が認められなかった。

以上述べたように、本発明によれば、液体クロマトグラフにおいて、カラムのフィルタにおける鉄原子のジサルファイド吸着現象を回避し、アミノ酸，アミノ酸類縁物質およびそれらアミノ酸から構成されるタンパク質が流路に吸着することを防ぐことができるため、クロマトグラムのピークのテーリング現象を防止して、試料の回収率の低下を防止できる。そして、分析ごとにより安定した結果を得ることが可能となり、定量分析の正確さや再現性が向上する。

１，２，３，４，５，１１ 容器
６Ａ，６Ｂ，６Ｃ，６Ｄ，６Ｅ 電磁弁
７ 緩衝液ポンプ
８ アンモニアフィルタ
９ オートサンプラ
１０ 分離カラム
１２ ニンヒドリン試薬ポンプ
１３ ミキサ
１４ 反応カラム
１５ 検出器
１６ データ処理装置
１７ カラムボディ
１８ 充填剤
１９ カラムフィルタ
２０ パッキン
２１ フィッティングキャップ

Claims (4)

1. 移動相を送液する第１のポンプと、
   前記第１のポンプから送液された移動相流路中に液体試料を注入する試料注入部と、
   前記試料が注入された移動相から試料成分を分離する分離カラムと、
   前記分離カラムよりも下流側に配置され、前記分離カラムにより分離された試料成分に反応試薬を送り出す第２のポンプと、
   前記分離カラムにより分離された試料成分と、前記第２のポンプにより送り出された反応試薬との合流部よりも下流側に配置され、前記試料成分と、前記第２のポンプにより送り出された反応試薬とを加熱反応させることにより、前記試料成分を化学的に修飾する反応カラムと、
   前記反応カラムにより修飾された試料成分を検出する検出器と、を備え、
   前記液体試料中の少なくともジサルファイド系アミノ酸を含む試料成分を分析する液体クロマトグラフ用の前記反応カラムであって、
   中空管状のカラムボディと、
   該カラムボディの中空部に充填されたビーズ状の充填剤と、
   該充填剤の粒径よりも小さい寸法のメッシュを備えたフィルタと、
   該フィルタを前記充填剤へ押し付けて前記充填剤を前記カラムボディ内に封止するキャップとを備え、
   前記フィルタがハステロイ（登録商標）であることを特徴とする液体クロマトグラフ用の反応カラム。
2. 移動相を送液する第１のポンプと、
   前記第１のポンプから送液された移動相流路中に液体試料を注入する試料注入部と、
   前記試料が注入された移動相から試料成分を分離する分離カラムと、
   前記分離カラムよりも下流側に配置され、前記分離カラムにより分離された試料成分に反応試薬を送り出す第２のポンプと、
   前記分離カラムにより分離された試料成分と、前記第２のポンプにより送り出された反応試薬との合流部よりも下流側に配置され、前記試料成分と、前記第２のポンプにより送り出された反応試薬とを加熱反応させることにより、前記試料成分を化学的に修飾する反応カラムと、
   前記反応カラムにより修飾された試料成分を検出する検出器と、を備え、
   前記液体試料中の少なくともジサルファイド系アミノ酸を含む試料成分を分析する液体クロマトグラフ用の前記反応カラムのフィルタであって、
   前記反応カラムに充填された充填剤の粒径よりも小さいメッシュを有し、材質がハステロイ(登録商標)であることを特徴とする液体クロマトグラフ用の反応カラムのフィルタ。
3. 液体試料中の少なくともジサルファイド系アミノ酸を含む試料成分を分析する液体クロマトグラフであって、
   移動相を送液する第１のポンプと、
   前記第１のポンプから送液された移動相流路中に前記液体試料を注入する試料注入部と、
   前記試料が注入された移動相から試料成分を分離する分離カラムと、
   前記分離カラムよりも下流側に配置され、前記分離カラムにより分離された試料成分に反応試薬を送り出す第２のポンプと、
   前記分離カラムにより分離された試料成分と、前記第２のポンプにより送り出された反応試薬との合流部よりも下流側に配置され、前記試料成分と、前記第２のポンプにより送り出された反応試薬とを加熱反応させることにより、前記試料成分を化学的に修飾する反応カラムと、
   前記反応カラムにより修飾された試料成分を検出する検出器と、を備え、
   前記反応カラムは、
   中空管状のカラムボディと、
   該カラムボディの中空部に充填されたビーズ状の充填剤と、
   該充填剤の粒径よりも小さい寸法のメッシュを備えたフィルタと、
   該フィルタを前記充填剤へ押し付けて前記充填剤を前記カラムボディ内に封止するキャップとを備え、
   前記フィルタがハステロイ（登録商標）であることを特徴とする液体クロマトグラフ。
4. 請求項３に記載された液体クロマトグラフであって、
   当該第２のポンプにより送り出される反応試薬は、ニンヒドリンを含む試薬であることを特徴とする液体クロマトグラフ。

Images