JP5704827B2

JP5704827B2 - Fluorescence observation equipment

Info

Publication number: JP5704827B2
Application number: JP2010064693A
Authority: JP
Inventors: 平田　唯史; 唯史平田
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2010-03-19
Filing date: 2010-03-19
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2030-03-19
Also published as: JP2011196852A

Description

本発明は、蛍光観察装置に関するものである。 The present invention relates to a fluorescence observation apparatus.

多光子励起では、非線形効果により励起光の集光点近傍にある蛍光物質のみが励起され、集光点近傍以外では蛍光物質は励起されない。その原理を利用して、従来、標本における励起光の集光点を走査しながら蛍光を検出し、画像を再構成する多光子励起顕微鏡が知られている（例えば、非特許文献１参照）。 In the multiphoton excitation, only the fluorescent substance in the vicinity of the condensing point of the excitation light is excited by the non-linear effect, and the fluorescent substance is not excited except in the vicinity of the condensing point. Conventionally, a multi-photon excitation microscope is known that utilizes this principle to detect fluorescence while scanning a condensing point of excitation light in a specimen and reconstruct an image (see, for example, Non-Patent Document 1).

非特許文献１に開示されている多光子励起顕微鏡は、対物レンズと標本との間に、励起光の集光位置に向けて配置された複数の光ファイバを備えている。このような構成を有することで、対物レンズに入らなかった蛍光を光ファイバにより捉えて、蛍光画像のＳＮ比を高めるようになっている。 The multi-photon excitation microscope disclosed in Non-Patent Document 1 includes a plurality of optical fibers arranged between the objective lens and the specimen toward the condensing position of the excitation light. By having such a configuration, fluorescence that has not entered the objective lens is captured by an optical fiber, and the SN ratio of the fluorescence image is increased.

ＯＰＴＩＣＳＥＸＰＲＥＳＳ，ｐ．６４２１−６４３５，ＶＯＬ．１７，Ｎｏ．８，２００９OPTICS EXPRESS, p. 6421-6435, VOL. 17, no. 8, 2009

しかしながら、非特許文献１に開示されている多光子励起顕微鏡では、ファイバ先端が対物と標本との間にあるため、対物レンズを標本中に挿入することができず、標本の深い部分を観察することができないという不都合がある。例えば、表面から数ｍｍの深さにあるマウスの海馬などを観察することができない。 However, in the multiphoton excitation microscope disclosed in Non-Patent Document 1, since the tip of the fiber is between the objective and the specimen, the objective lens cannot be inserted into the specimen, and a deep part of the specimen is observed. There is an inconvenience that it cannot be done. For example, a mouse hippocampus at a depth of several mm from the surface cannot be observed.

また、表面からさらに深い部分を観察する場合、対物レンズと標本表面との距離を近づけてピント位置を標本深部に合わせる必要があるが、ファイバ先端が対物と標本との間にあるため、対物レンズを標本に近づけることができない。このため、標本内の深いところにピントを合わせられないという不都合がある。 In addition, when observing a deeper part from the surface, it is necessary to bring the objective lens and the sample surface closer together to adjust the focus position to the sample deep part. However, since the fiber tip is between the objective and the sample, the objective lens Cannot be brought close to the specimen. For this reason, there is an inconvenience that it is not possible to focus on a deep place in the specimen.

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、蛍光画像のＳＮ比を高めつつ、対物レンズと標本とを近づけて標本の深い部分を観察することができる蛍光観察装置を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above-described circumstances, and provides a fluorescence observation apparatus capable of observing a deep portion of a specimen by bringing the objective lens and the specimen closer while increasing the SN ratio of the fluorescent image. With the goal.

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、励起光を標本に照射する一方、前記標本からの蛍光を集光する対物光学系と、該対物光学系の径方向外側に配置され、前記標本からの蛍光を取り込む付加光学系と、前記対物光学系および前記付加光学系により集光された前記標本からの蛍光を検出する光検出部とを備え、前記付加光学系が、前記標本からの蛍光の入射面である蛍光取り込み窓と、該蛍光取り込み窓に入射した蛍光を導光する導光部とを有し、前記蛍光取り込み窓が、前記対物光学系の光軸に略垂直に形成され、前記対物光学系の先端の位置よりも該対物光学系の基端側に位置する蛍光観察装置を採用する。 In order to achieve the above object, the present invention employs the following means.
The present invention provides an objective optical system that irradiates a specimen with excitation light while condensing fluorescence from the specimen, and an additional optical system that is disposed radially outside the objective optical system and captures fluorescence from the specimen. A light detection unit that detects fluorescence from the specimen collected by the objective optical system and the additional optical system, and the additional optical system includes a fluorescence capturing window that is an incident surface of fluorescence from the specimen; A light guide portion for guiding the fluorescence incident on the fluorescence capturing window, the fluorescence capturing window being formed substantially perpendicular to the optical axis of the objective optical system, and from the position of the tip of the objective optical system In addition, a fluorescence observation apparatus positioned on the base end side of the objective optical system is employed.

本発明によれば、励起光が標本に照射されることで発生した蛍光を対物光学系により集光するとともに、対物光学系に入射しなかった標本からの蛍光を付加光学系により取り込むことができる。そして、このように対物光学系および付加光学系により集光された蛍光を光検出部により検出し、これら蛍光を合成して標本の画像を生成することで、画像のＳＮ比を高めることができ、精度の高い観察を行うことができる。 According to the present invention, fluorescence generated by irradiating the specimen with excitation light can be collected by the objective optical system, and fluorescence from the specimen that has not entered the objective optical system can be captured by the additional optical system. . Then, the fluorescence collected by the objective optical system and the additional optical system is detected by the light detection unit, and the fluorescence is combined to generate a sample image, thereby increasing the SN ratio of the image. Highly accurate observation can be performed.

この場合において、付加光学系を対物光学系の径方向外側に配置することで、対物レンズ先端を標本に近づけた際に、付加光学系が邪魔になることはない。そのため、対物レンズ先端を標本に近づけて、標本の表面から深い位置にピントを合わせることができ、標本の深部の観察精度を向上することができる。 In this case, by arranging the additional optical system on the outer side in the radial direction of the objective optical system, the additional optical system does not get in the way when the tip of the objective lens is brought close to the sample. Therefore, the tip of the objective lens can be brought close to the sample to focus on a deep position from the surface of the sample, and the observation accuracy of the deep part of the sample can be improved.

上記発明において、前記付加光学系の前記蛍光取り込み窓が、前記対物光学系の光軸方向に移動可能に設けられていることとしてもよい。
標本の深部においては、集光点で励起されて発生した蛍光が標本中を進む距離が、散乱の平均自由行程（散乱で妨害されること無く進むことのできる距離の平均値）を越える場合がある。この場合、散乱されずに標本表面に直接達する蛍光は非常に少なく、ほとんどの蛍光が標本内で多重散乱して標本表面に達する。多重散乱した蛍光は、さまざまな方向の成分を持って標本表面から射出されるので、標本表面から付加光学系までの距離が離れていると、標本表面からの出射方向が付加光学系から外れてしまい、付加光学系に取り込まれる蛍光が急激に減少する。 In the above invention, the fluorescence capturing window of the additional optical system may be provided so as to be movable in the optical axis direction of the objective optical system.
In the deep part of the sample, the distance that the fluorescence generated by excitation at the focal point travels through the sample may exceed the mean free path of scattering (the average value of the distance that can travel without being disturbed by scattering). is there. In this case, very little fluorescence reaches the sample surface without being scattered, and most of the fluorescence reaches the sample surface by multiple scattering within the sample. Multiple scattered fluorescence is emitted from the sample surface with components in various directions, so if the distance from the sample surface to the additional optical system is far, the emission direction from the sample surface deviates from the additional optical system. As a result, the fluorescence taken into the additional optical system rapidly decreases.

したがって、付加光学系を対物光学系の光軸方向に移動可能にすることで、標本に対して対物光学系の位置を固定した状態で、付加光学系を標本に近接または密着させることができる。これにより、付加光学系により多くの散乱光を取り込むことができ、画像のＳＮ比を高めて観察精度を向上することができる。 Therefore, by making the additional optical system movable in the direction of the optical axis of the objective optical system, the additional optical system can be brought close to or in close contact with the specimen while the position of the objective optical system is fixed with respect to the specimen. Thereby, a lot of scattered light can be taken in by the additional optical system, and the SN ratio of the image can be increased to improve the observation accuracy.

上記発明において、前記導光部が、光ファイバ束であることとしてもよい。 In the above invention, the light guide section may be an optical fiber bundle .

上記発明において、前記付加光学系が、の前記蛍光取り込み窓が、前記対物光学系を中心とする環状の正レンズであり、該環状の正レンズの前記標本側焦点が前記対物光学系の励起光の集光点と一致し、前記環状の正レンズの標本側と反対側の焦点が前記導光部の前記標本側面と一致することとしてもよい。
付加光学系を正レンズとすることで、集光点からの蛍光を途中で屈折させて、効率よく光検出部に導くことができる。また、付加光学系を対物光学系を中心とする環状に形成することで、対物光学系に入射しなかった標本からの蛍光を効率的に取り込むことができる。 In the above invention, the additional optical system is such that the fluorescence capturing window is an annular positive lens centered on the objective optical system, and the specimen-side focal point of the annular positive lens is the excitation light of the objective optical system The focal point on the opposite side to the specimen side of the annular positive lens may coincide with the specimen side surface of the light guide section .
By making the additional optical system a positive lens, it is possible to refract the fluorescence from the condensing point on the way and efficiently guide it to the light detection unit. Further, by forming the additional optical system in an annular shape centered on the objective optical system, it is possible to efficiently capture fluorescence from the specimen that has not entered the objective optical system.

上記発明において、前記付加光学系の前記標本からの蛍光を入射させる入射面が、前記対物光学系の光軸に略垂直に形成されていることとしてもよい。
このようにすることで、付加光学系の入射面全体を標本表面に密着させることができ、標本表面での散乱を減らして蛍光の検出効率を向上することができる。 In the above invention, an incident surface on which the fluorescence from the specimen of the additional optical system is incident may be formed substantially perpendicular to the optical axis of the objective optical system.
By doing so, the entire incident surface of the additional optical system can be brought into close contact with the sample surface, and scattering on the sample surface can be reduced to improve the fluorescence detection efficiency.

上記発明において、前記入射面に入射させた蛍光を導光する導光部を備え、該導光部の光軸が、前記入射面における蛍光の屈折角と略同じ角度で配置されていることとしてもよい。
集光点で発生した蛍光は、付加光学系の入射面で対物光学系の光軸方向に向けて屈折する。この屈折角に導光部の光軸方向を合わせて配置することで、蛍光の検出効率を向上することができる。この構成は、標本の散乱が比較的小さく、集光点からの非散乱光が多い場合に特に有効である。 In the above invention, a light guide part that guides the fluorescence incident on the incident surface is provided, and the optical axis of the light guide part is arranged at substantially the same angle as the refraction angle of the fluorescence on the incident surface. Also good.
The fluorescence generated at the condensing point is refracted toward the optical axis direction of the objective optical system at the incident surface of the additional optical system. By arranging the refraction angle so that the optical axis direction of the light guide is aligned, the fluorescence detection efficiency can be improved. This configuration is particularly effective when the sample is relatively scattered and there is a large amount of non-scattered light from the focal point.

上記発明において、前記付加光学系が、先端に向かって径が小さくなるように形成されていることとしてもよい。
このようにすることで、標本へのダメージを抑えて、付加光学系を標本内に挿入することができる。これにより、付加光学系を集光点に近づけるができ、付加光学系に取り込む蛍光の光量を増加させ、画像のＳＮ比を向上することができる。 In the above invention, the additional optical system may be formed so that the diameter decreases toward the tip.
By doing so, it is possible to insert the additional optical system into the sample while suppressing damage to the sample. Thereby, the additional optical system can be brought close to the condensing point, the amount of fluorescent light taken into the additional optical system can be increased, and the SN ratio of the image can be improved.

上記発明において、前記付加光学系の出口と略一致する面に、前記対物光学系により集光された蛍光の中間結像面を形成する有限系レンズと、前記中間結像面からの蛍光と前記付加光学系の出口からの蛍光の両方の瞳の共役面を同一の前記光検出部に導くアダプタレンズとを備えることとしてもよい。 In the above invention, a finite system lens that forms an intermediate imaging surface of the fluorescence condensed by the objective optical system on a surface substantially coinciding with the exit of the additional optical system, the fluorescence from the intermediate imaging surface, and the It is good also as providing the adapter lens which guides the conjugate plane of both pupils of the fluorescence from the exit of an addition optical system to the same above-mentioned photodetection part.

このようにすることで、励起光を走査した場合でも、対物光学系および付加光学系により集光された蛍光の両方を常に同一の光検出部に入射させることができる。これにより、光検出部を１つとすることができ、装置および制御を簡易化することができる。
また、対物光学系と付加光学系の蛍光をそれぞれ別々の光検出部で検出する場合と比較して、１つの検出器に入る蛍光の光量が多くなり、ＳＮ比を高めることができる。 By doing in this way, even when excitation light is scanned, both the fluorescence condensed by the objective optical system and the additional optical system can always be incident on the same light detection unit. Thereby, the number of light detection units can be one, and the apparatus and control can be simplified.
Further, compared to the case where the fluorescence of the objective optical system and the additional optical system is detected by separate light detection units, the amount of fluorescent light entering one detector is increased, and the SN ratio can be increased.

上記発明において、前記導光部の前記蛍光を射出する基端部と前記中間結像面が形成される位置との間に設けられ、前記導光部の基端部と共役な面を、前記付加光学系の出口として、前記中間結像面が形成される位置に形成する付加光学系リレーレンズを備えることとしてもよい。 In the above invention, a surface that is provided between a base end portion that emits the fluorescence of the light guide portion and a position where the intermediate imaging plane is formed, and a surface that is conjugate with the base end portion of the light guide portion, As an exit of the additional optical system, an additional optical system relay lens formed at a position where the intermediate imaging plane is formed may be provided .

通常、付加光学系の導光部の基端部のＮＡと有限系レンズの中間結像面側のＮＡが大きく異なるものを使用した場合、光が途中でけられないようにするため、アダプタレンズのＮＡを大きいほうに合わせる必要がある。しかしながら、上記の構成とすることで、付加光学系リレーレンズを使って、導光部の基端部のＮＡを有限系レンズのＮＡに合わせられるので、アダプタレンズのＮＡをどちらかに大きいほうに合わせる必要がなくなる。 In general, an adapter lens is used in order to prevent light from being lost in the middle when the NA of the base end portion of the light guide portion of the additional optical system and the NA of the intermediate imaging plane side of the finite lens are greatly different. It is necessary to adjust the NA to the larger one. However, with the above configuration, the NA of the light guide can be adjusted to the NA of the finite lens by using the additional optical system relay lens. There is no need to match.

上記発明において、前記対物光学系により集光された蛍光と前記付加光学系により取り込まれた蛍光とを合成する光合成手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、対物光学系により集光された蛍光と付加光学系により取り込まれた蛍光とを光合成手段により合成し、合成した光を同一の光検出部により検出することができる。これにより、光検出部を１つとすることができ、装置および制御を簡易化することができる。
また、対物光学系と付加光学系の蛍光をそれぞれ別々の光検出部で検出する場合と比較して、１つの検出器に入る蛍光の光量が多くなり、画像のＳＮ比を高めることができる。 In the above invention, it is possible to provide a light combining means for combining the fluorescence condensed by the objective optical system and the fluorescence taken in by the additional optical system.
By doing in this way, the fluorescence condensed by the objective optical system and the fluorescence taken in by the additional optical system can be synthesized by the photosynthesis means, and the synthesized light can be detected by the same light detection unit. Thereby, the number of light detection units can be one, and the apparatus and control can be simplified.
Further, the amount of fluorescent light entering one detector is increased and the SN ratio of the image can be increased as compared with the case where the fluorescence of the objective optical system and the additional optical system is detected by separate light detection units.

上記発明において、前記光合成手段が、励起光および前記対物光学系により集光された蛍光が通る中心部と、前記付加光学系により取り込まれた蛍光が通る周辺部とで構成され、前記周辺部が、前記導光部の基端部の蛍光を略平行にする形成する付加光学系コリメートレンズと、前記付加光学系コリメートレンズからの光を偏向する偏向素子とを有し、前記付加光学系コリメートレンズの瞳位置が前記対物光学系の瞳と重なるように前記偏光素子が配置されていることとしてもよい。 In the above invention, the light synthesizing means includes a central portion through which excitation light and fluorescence condensed by the objective optical system pass, and a peripheral portion through which fluorescence taken in by the additional optical system passes, and the peripheral portion is , an additional optical system collimating lens to form into substantially parallel fluorescence of the proximal end portion of the light guide section, have a deflection element for deflecting the light from the additional optical system collimating lens, the additional optical system collimating lens The polarizing element may be arranged so that the pupil position of the second lens overlaps the pupil of the objective optical system .

対物光学系により集光された蛍光は、対物光学系でほぼ平行光束になって、光合成手段の中心部を通り、蛍光観察装置本体に入射する。
導光部を通って、導光部の基端側から射出された蛍光は、付加光学系コリメートレンズで屈折され、略平行光束になる。付加光学系コリメートレンズを出た蛍光は、偏向素子によって、対物光学系の光束と同じ方向に偏向され、対物光学系の光束の外側を通って、蛍光観察装置本体に入射する。蛍光観察装置本体に入射した蛍光は、同一の光検出部により検出される。 The fluorescence condensed by the objective optical system becomes a substantially parallel light beam by the objective optical system, passes through the central portion of the light combining means, and enters the fluorescence observation apparatus main body.
Fluorescence emitted from the base end side of the light guide through the light guide is refracted by the additional optical system collimator lens and becomes a substantially parallel light beam. The fluorescence emitted from the additional optical system collimating lens is deflected by the deflection element in the same direction as the light beam of the objective optical system, passes through the outside of the light beam of the objective optical system, and enters the fluorescence observation apparatus main body. Fluorescence incident on the fluorescence observation apparatus main body is detected by the same light detection unit.

これにより、付加光学系を備えていない通常の対物光学系でも、光合成手段を蛍光観察装置本体と対物光学系との間に挿入し、それに付加光学系の先端部を組み合わせて使うことができ、画像のＳＮ比を高めることができる。これにより、標本のより深い部分の観察が可能になる。 As a result, even in a normal objective optical system that does not include an additional optical system, the light combining means can be inserted between the fluorescence observation apparatus main body and the objective optical system, and the tip of the additional optical system can be used in combination with it. The SN ratio of the image can be increased. This makes it possible to observe a deeper part of the specimen.

本発明によれば、蛍光画像のＳＮ比を高めつつ、対物レンズと標本とを近づけて標本の深い部分を観察することができるという効果を奏する。 According to the present invention, there is an effect that a deep part of a specimen can be observed by bringing the objective lens and the specimen close to each other while increasing the SN ratio of the fluorescent image.

本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成図である。1 is an overall configuration diagram of a laser microscope apparatus according to a first embodiment of the present invention. 図１の光ファイバ束の集合前の位置における横断面図である。It is a cross-sectional view in the position before the assembly of the optical fiber bundle of FIG. 図１の光ファイバ束の集合後の位置における横断面図である。It is a cross-sectional view in the position after the assembly of the optical fiber bundle of FIG. 図１の光学系の焦点位置を説明する図である。It is a figure explaining the focus position of the optical system of FIG. 図１の変形例に係る光学系の縦断面図である。It is a longitudinal cross-sectional view of the optical system which concerns on the modification of FIG. 図１の変形例に係る光学系の縦断面図である。It is a longitudinal cross-sectional view of the optical system which concerns on the modification of FIG. 図１の変形例に係る光学系の縦断面図である。It is a longitudinal cross-sectional view of the optical system which concerns on the modification of FIG. 図１の変形例に係る光学系の縦断面図である。It is a longitudinal cross-sectional view of the optical system which concerns on the modification of FIG. 本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成図である。It is a whole block diagram of the laser microscope apparatus which concerns on the 2nd Embodiment of this invention. 図９の光学系の正面図である。FIG. 10 is a front view of the optical system of FIG. 9. 図９の光学系の横断面図である。FIG. 10 is a cross-sectional view of the optical system of FIG. 9. 図９の変形例に係る光学系の正面図である。It is a front view of the optical system which concerns on the modification of FIG. 図９の変形例に係る光学系の正面図である。It is a front view of the optical system which concerns on the modification of FIG. 図９の変形例に係る光学系の縦断面図である。It is a longitudinal cross-sectional view of the optical system which concerns on the modification of FIG. 本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成図である。It is a whole block diagram of the laser microscope apparatus which concerns on the 3rd Embodiment of this invention. 図１５の光学系の中間像面位置における横断面図である。FIG. 16 is a cross-sectional view of the optical system in FIG. 15 at an intermediate image plane position. 図１５のレーザ顕微鏡装置の光路を説明する図である。It is a figure explaining the optical path of the laser microscope apparatus of FIG. 図１５の変形例に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成図である。It is a whole block diagram of the laser microscope apparatus which concerns on the modification of FIG. 図１５の変形例に係る光学系の中間像面位置における横断面図である。FIG. 16 is a transverse cross-sectional view at an intermediate image plane position of an optical system according to a modification example of FIG. 15. 本発明の第４の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成図である。It is a whole block diagram of the laser microscope apparatus which concerns on the 4th Embodiment of this invention. 本発明の第５の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成図である。It is a whole block diagram of the laser microscope apparatus which concerns on the 5th Embodiment of this invention. 図２１の蛍光合成部の横断面図である。FIG. 22 is a cross-sectional view of the fluorescence synthesis unit in FIG. 21. 図２１の蛍光合成部の光ファイバ束接続位置における側面図である。It is a side view in the optical fiber bundle connection position of the fluorescence synthetic | combination part of FIG. 図２１のレーザ顕微鏡装置において、対物光学系の視野外に付加光学系の光を通す場合の光路を説明する図である。In the laser microscope apparatus of FIG. 21, it is a figure explaining the optical path in the case of passing the light of an additional optical system out of the visual field of an objective optical system. 図２４の変形例に係る光路を説明する図である。It is a figure explaining the optical path which concerns on the modification of FIG. 図２４または図２５に示す光路による、光検出部における蛍光の入射位置を示す平面図である。FIG. 26 is a plan view showing the incident position of the fluorescence in the light detection section along the optical path shown in FIG. 24 or FIG. 25. 図２１のレーザ顕微鏡装置において、対物光学系の瞳の外側に付加光学系からの蛍光を通す場合の光路を説明する図である。In the laser microscope apparatus of FIG. 21, it is a figure explaining the optical path in the case of letting the fluorescence from an additional optical system pass outside the pupil of an objective optical system. 図２７に示す光路による、光検出部における蛍光の入射位置を示す平面図である。It is a top view which shows the incident position of the fluorescence in a photon detection part by the optical path shown in FIG.

〔第１の実施形態〕
本発明の第１の実施形態に係る蛍光観察装置１について、図１から図８を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１は、図１に示すように、励起光を射出するとともに標本Ａにおいて発生した蛍光を検出する顕微鏡本体１０と、顕微鏡本体１０とは別個に設けられ、標本Ａからの蛍光を検出する光検出ユニット２０と、顕微鏡本体１０からの励起光および標本Ａからの蛍光を導く光学系３０とを備えている。 [First Embodiment]
A fluorescence observation apparatus 1 according to a first embodiment of the present invention will be described below with reference to FIGS.
As shown in FIG. 1, the fluorescence observation apparatus 1 according to the present embodiment is provided separately from a microscope main body 10 that emits excitation light and detects fluorescence generated in the specimen A, and the specimen A. A light detection unit 20 for detecting fluorescence from the microscope, and an optical system 30 for guiding excitation light from the microscope body 10 and fluorescence from the specimen A.

顕微鏡本体１０は、多光子励起顕微鏡であり、標本Ａに励起光を照射することで、標本Ａ内の蛍光物質を励起させ、発生した蛍光を検出するようになっている。
顕微鏡本体１０は、励起光である短パルスレーザ光を射出するレーザ光源１１と、標本Ａ上において短パルスレーザ光の集光点を光軸に直交する方向に走査する走査ミラー１２と、短パルスレーザ光の瞳をリレーするリレー光学系１３と、励起光と標本Ａからの蛍光とを分離するダイクロイックミラー１４と、標本Ａからの蛍光の瞳をリレーするリレー光学系１６と、ダイクロイックミラー１４とリレー光学系１６との間に設けられた励起光カットフィルタ１５と、標本Ａからの蛍光を検出する、例えば光電子増倍管等の光検出器１７とを備えている。 The microscope main body 10 is a multi-photon excitation microscope, and irradiates the specimen A with excitation light to excite the fluorescent substance in the specimen A and detect the generated fluorescence.
The microscope main body 10 includes a laser light source 11 that emits short pulse laser light that is excitation light, a scanning mirror 12 that scans the focal point of the short pulse laser light on the specimen A in a direction perpendicular to the optical axis, and a short pulse. A relay optical system 13 that relays the pupil of the laser light, a dichroic mirror 14 that separates the excitation light and the fluorescence from the specimen A, a relay optical system 16 that relays the pupil of the fluorescence from the specimen A, and a dichroic mirror 14. An excitation light cut filter 15 provided between the relay optical system 16 and a photodetector 17 such as a photomultiplier tube that detects fluorescence from the specimen A is provided.

光学系３０は、顕微鏡本体１０から射出された励起光を標本Ａに照射する一方、標本Ａからの蛍光を集光する対物光学系４０と、対物光学系４０の径方向外側に配置され、標本Ａからの蛍光を取り込む付加光学系５０とを備えている。 The optical system 30 irradiates the specimen A with the excitation light emitted from the microscope body 10, and is disposed on the radially outer side of the objective optical system 40 and the objective optical system 40 that collects the fluorescence from the specimen A. And an additional optical system 50 for capturing the fluorescence from A.

対物光学系４０は、標本Ａからの蛍光が入射する入射面４１と、入射面４１の後段に配置された対物レンズ４２とを備えている。
入射面４１は、標本Ａ上に載置されたカバーガラス３２に近接または当接され、標本Ａの集光点（ピント位置）３４において発生した蛍光が入射するようになっている。 The objective optical system 40 includes an incident surface 41 on which the fluorescence from the specimen A is incident, and an objective lens 42 disposed at the subsequent stage of the incident surface 41.
The incident surface 41 is brought close to or in contact with the cover glass 32 placed on the specimen A, and the fluorescence generated at the condensing point (focus position) 34 of the specimen A is incident thereon.

対物レンズ４２は、標本Ａの集光点３４に顕微鏡本体１０からの励起光を集光するとともに、標本Ａの集光点３４において発生し、入射面４１に入射した標本Ａからの蛍光を集光するようになっている。対物レンズ４２は、例えば無限遠光学系で設計されており、標本Ａからの蛍光を略平行な光束にして、顕微鏡本体１０へ取り込み、リレー光学系１６で光検出器１７に導くようになっている。 The objective lens 42 condenses the excitation light from the microscope main body 10 at the condensing point 34 of the specimen A and also collects the fluorescence from the specimen A that is generated at the condensing point 34 of the specimen A and enters the incident surface 41. It comes to shine. The objective lens 42 is designed by, for example, an infinite optical system, and the fluorescence from the specimen A is converted into a substantially parallel light beam and taken into the microscope body 10 and guided to the photodetector 17 by the relay optical system 16. Yes.

付加光学系５０は、対物光学系４０の径方向外側に配置され、標本Ａからの蛍光が取り込まれる蛍光取り込み窓（入射面）５１と、蛍光取り込み窓５１に取り込まれた蛍光を導光する光ファイバ束（導光部）５２と、光ファイバ束５２により導光された蛍光を射出する蛍光出口部５３とを備えている。 The additional optical system 50 is arranged on the outer side in the radial direction of the objective optical system 40, and a fluorescence capturing window (incident surface) 51 into which the fluorescence from the specimen A is captured, and light that guides the fluorescence captured in the fluorescence capturing window 51. A fiber bundle (light guide portion) 52 and a fluorescence outlet portion 53 that emits the fluorescence guided by the optical fiber bundle 52 are provided.

蛍光取り込み窓５１は、光軸に沿う方向には、対物光学系４０の先端部（入射面４１）と略同じ高さに設けられており、光軸に直交する方向には、対物光学系４０の先端部（入射面４１）の外側に設けられている。蛍光取り込み窓５１の具体的な形状は、例えば、先端側に凸面を向けた平凸型の正レンズ５４であり、対物光学系４０が配置された中心部分がくり抜かれた円筒形状（円環形状）を有している。 The fluorescence capturing window 51 is provided at substantially the same height as the distal end portion (incident surface 41) of the objective optical system 40 in the direction along the optical axis, and in the direction orthogonal to the optical axis. Is provided outside the front end portion (incident surface 41). The specific shape of the fluorescence capturing window 51 is, for example, a plano-convex positive lens 54 having a convex surface facing the tip side, and a cylindrical shape (annular shape) in which a central portion where the objective optical system 40 is disposed is hollowed out. )have.

光ファイバ束５２は、図１および図２に示すように、蛍光取り込み窓５１の後段において対物光学系４０を取り囲むように配置されている。また、光ファイバ束５２は、図１および図３に示すように、途中位置で一つの束にまとめられ、蛍光出口部５３まで続いている。 As shown in FIGS. 1 and 2, the optical fiber bundle 52 is disposed so as to surround the objective optical system 40 in the subsequent stage of the fluorescence capturing window 51. Further, as shown in FIGS. 1 and 3, the optical fiber bundle 52 is gathered into one bundle at an intermediate position and continues to the fluorescent outlet 53.

光ファイバ束５２は、蛍光取り込み窓５１と蛍光出口部５３との間において、全体として被覆されているが、被覆の中で個々の光ファイバはばらばらになっていて、柔軟性をもたせている。光ファイバ束５２は、高ＮＡ（例えばＮＡ０．６５）で径が小さい（例えば直径３０μｍ）の多成分ガラスの光ファイバを束ねたものである。 The optical fiber bundle 52 is covered as a whole between the fluorescence capturing window 51 and the fluorescent outlet 53, but the individual optical fibers are scattered in the coating, and are flexible. The optical fiber bundle 52 is a bundle of optical fibers made of multicomponent glass having a high NA (for example, NA 0.65) and a small diameter (for example, 30 μm).

蛍光出口部５３と光検出ユニット２０とは光学的に接続されており、付加光学系５０を通った蛍光は光検出ユニット２０に導かれる。
なお、対物レンズ４２および蛍光出口部５３はともに着脱自在になっていて、対物光学系４０および付加光学系５０は交換可能とされている。 The fluorescence outlet 53 and the light detection unit 20 are optically connected, and the fluorescence passing through the additional optical system 50 is guided to the light detection unit 20.
The objective lens 42 and the fluorescence outlet 53 are both detachable, and the objective optical system 40 and the additional optical system 50 can be exchanged.

光検出ユニット２０は、光ファイバ束５２により導光された蛍光の瞳をリレーするリレー光学系２１と、リレー光学系２１によりリレーされた光から励起光をカットする励起光カットフィルタ２２と、標本Ａからの蛍光を検出する、例えば光電子増倍管等の光検出器２３とを備えている。 The light detection unit 20 includes a relay optical system 21 that relays the fluorescent pupil guided by the optical fiber bundle 52, an excitation light cut filter 22 that cuts excitation light from the light relayed by the relay optical system 21, and a specimen. For example, a photo detector 23 such as a photomultiplier tube that detects fluorescence from A is provided.

上記構成を有する蛍光観察装置１の作用について説明する。
レーザ光源１１から励起光として射出された短パルスレーザ光は、走査ミラー１２により偏向された後、リレー光学系１３により瞳がリレーされる。そして、短パルスレーザ光は、ダイクロイックミラー１４により対物光学系４０に向けて反射され、対物光学系４０（対物レンズ４２）により標本Ａ内の集光点３４に集光される。 The operation of the fluorescence observation apparatus 1 having the above configuration will be described.
The short pulse laser beam emitted as the excitation light from the laser light source 11 is deflected by the scanning mirror 12 and then the pupil is relayed by the relay optical system 13. Then, the short pulse laser light is reflected toward the objective optical system 40 by the dichroic mirror 14, and is condensed on the condensing point 34 in the sample A by the objective optical system 40 (objective lens 42).

これにより、標本Ａにおける集光点３４近傍の蛍光物質が励起され、蛍光が発生する。
標本Ａ内で発生した蛍光のうち、対物光学系４０の開口範囲内に入ったもの（直接光および散乱光）は、対物光学系４０（対物レンズ４２）により集光され、ダイクロイックミラー１４を透過する。ダイクロイックミラー１４を透過した蛍光は、励起光カットフィルタ１５により励起光が取り除かれた後、リレー光学系１６を介して光検出器１７により検出され、電気信号に変換される。 As a result, the fluorescent substance in the vicinity of the condensing point 34 in the specimen A is excited and fluorescence is generated.
Among the fluorescence generated in the specimen A, the fluorescence (direct light and scattered light) that falls within the aperture range of the objective optical system 40 is collected by the objective optical system 40 (objective lens 42) and transmitted through the dichroic mirror 14. To do. The fluorescence transmitted through the dichroic mirror 14 is detected by the photodetector 17 via the relay optical system 16 and converted into an electrical signal after the excitation light is removed by the excitation light cut filter 15.

一方、標本Ａ内で発生した蛍光のうち、対物光学系４０の開口範囲内に入らなかった光の一部（直接光および散乱光）は、付加光学系５０（蛍光取り込み窓５１）により取り込まれ、光ファイバ束５２により導光される。光ファイバ束５２により導光された蛍光は、リレー光学系２１によりリレーされ、励起光カットフィルタ２２により励起光が取り除かれた後、光検出器２３により検出され、電気信号に変換される。 On the other hand, of the fluorescence generated in the specimen A, a part of light (direct light and scattered light) that did not enter the aperture range of the objective optical system 40 is captured by the additional optical system 50 (fluorescence capturing window 51). The light is guided by the optical fiber bundle 52. The fluorescence guided by the optical fiber bundle 52 is relayed by the relay optical system 21, and after the excitation light is removed by the excitation light cut filter 22, it is detected by the photodetector 23 and converted into an electrical signal.

この際、走査ミラー１２により２軸方向に短パルスレーザ光を偏向させることで、標本Ａ上において集光点３４を水平方向に走査させる。そして、走査ミラー１２の動きに合わせて、光検出器１７および光検出器２３により検出された蛍光の強度を合成してモニター上（図示略）で画像を再構成すると、標本Ａの２次元画像が得られる。さらに、対物レンズ４２と標本Ａとの間隔を変える走査を行うことで、標本Ａの３次元の画像を構築することができる。
なお、走査ミラー１２の走査位置による明るさのムラを少なくするために、光検出器１７の位置は、対物光学系４０の瞳位置と共役な位置近傍にあることが望ましい。 At this time, the condensing point 34 is scanned in the horizontal direction on the specimen A by deflecting the short pulse laser beam in the biaxial direction by the scanning mirror 12. Then, when the intensity of the fluorescence detected by the photodetector 17 and the photodetector 23 is synthesized in accordance with the movement of the scanning mirror 12 and the image is reconstructed on a monitor (not shown), a two-dimensional image of the specimen A Is obtained. Furthermore, by performing scanning that changes the distance between the objective lens 42 and the specimen A, a three-dimensional image of the specimen A can be constructed.
In order to reduce unevenness in brightness due to the scanning position of the scanning mirror 12, it is desirable that the position of the photodetector 17 is in the vicinity of a position conjugate with the pupil position of the objective optical system 40.

以上のように、本実施形態に係る蛍光観察装置１によれば、励起光が標本Ａに照射されることで発生した蛍光を対物光学系４０により集光するとともに、対物光学系４０に入射しなかった標本Ａからの蛍光を付加光学系５０により取り込むことができる。そして、このように対物光学系４０および付加光学系５０により集光された蛍光を光検出器１７および光検出器２３により検出し、これら蛍光を合成して標本Ａの画像を生成することで、画像のＳＮ比を高めることができ、精度の高い観察を行うことができる。 As described above, according to the fluorescence observation apparatus 1 according to the present embodiment, the fluorescence generated by irradiating the specimen A with the excitation light is collected by the objective optical system 40 and is incident on the objective optical system 40. Fluorescence from the specimen A that did not exist can be captured by the additional optical system 50. Then, the fluorescence condensed by the objective optical system 40 and the additional optical system 50 is detected by the photodetector 17 and the photodetector 23, and the fluorescence is synthesized to generate an image of the specimen A. The SN ratio of the image can be increased, and high-precision observation can be performed.

この場合において、付加光学系５０を対物光学系４０の径方向外側に配置することで、対物レンズ先端を標本Ａに近づけた際に、付加光学系５０が邪魔になることはない。そのため、対物光学系４０先端（入射面４１）を標本Ａに近づけて、標本Ａの表面から深い位置に対物光学系４０のピントを合わせることができ、標本Ａの深部の観察精度を向上することができる。 In this case, the additional optical system 50 is not obstructed when the tip of the objective lens is brought close to the specimen A by disposing the additional optical system 50 radially outside the objective optical system 40. Therefore, the tip of the objective optical system 40 (incidence surface 41) can be brought close to the specimen A, and the objective optical system 40 can be focused at a deep position from the surface of the specimen A, and the observation accuracy of the deep part of the specimen A can be improved. Can do.

また、付加光学系５０に正レンズ５４を採用することで、集光点３４からの蛍光を途中で屈折させて、効率よく光検出器２０に導くことができる。また、付加光学系５０を、対物光学系４０を中心とする円筒形状（円環形状）とすることで、対物光学系４０に入射しなかった標本Ａからの蛍光を効率的に取り込むことができる。 Further, by adopting the positive lens 54 in the additional optical system 50, the fluorescence from the condensing point 34 can be refracted in the middle and efficiently guided to the photodetector 20. Further, by making the additional optical system 50 into a cylindrical shape (annular shape) centered on the objective optical system 40, it is possible to efficiently capture fluorescence from the specimen A that has not entered the objective optical system 40. .

なお、蛍光取り込み窓５１を対物光学系４０先端部の外側に配置すると、集光点３４から蛍光取り込み窓５１まで距離が比較的長くなってしまう。しかしながら、蛍光取り込み窓５１を正レンズ５４とすることで、集光点３４からの蛍光を途中で屈折させて、効率よく光ファイバ束５２に導くことができ、効率的に蛍光を検出することができる。
また、対物光学系４０の側面は大きさの制限が無いので、光ファイバ束５２の径を大きくすることで、蛍光の光量を増やすことも可能である。 If the fluorescence capturing window 51 is disposed outside the tip of the objective optical system 40, the distance from the condensing point 34 to the fluorescence capturing window 51 is relatively long. However, by using the fluorescence capturing window 51 as the positive lens 54, the fluorescence from the condensing point 34 can be refracted halfway and efficiently guided to the optical fiber bundle 52, and the fluorescence can be detected efficiently. it can.
In addition, since the size of the side surface of the objective optical system 40 is not limited, it is possible to increase the amount of fluorescent light by increasing the diameter of the optical fiber bundle 52.

また、集光点３４からの蛍光を効率良く取り込むため、図４に示すように、標本Ａ側焦点Ｆｓおよび光ファイバ側の焦点Ｆｆを配置することが望ましい。具体的には、図４に示すように、正レンズ５４の標本Ａ側焦点Ｆｓは、対物光学系４０の光軸上の集光点３４の近傍に配置し、光ファイバ側の焦点Ｆｆは、光軸方向において光ファイバ束５２の端部近傍に配置することが望ましい。 Further, in order to efficiently capture the fluorescence from the condensing point 34, it is desirable to arrange the specimen A side focal point Fs and the optical fiber side focal point Ff as shown in FIG. Specifically, as shown in FIG. 4, the specimen A side focal point Fs of the positive lens 54 is disposed in the vicinity of the condensing point 34 on the optical axis of the objective optical system 40, and the optical fiber side focal point Ff is It is desirable to arrange in the vicinity of the end of the optical fiber bundle 52 in the optical axis direction.

図４において、点線は、集光点３４が対物光学系４０の光軸上にあるときの光線を示しており、実線は、集光点３４が走査によって対物光学系４０の光軸からずれたときの光線を示している。上記条件により、集光点３４が光軸に直交する方向に走査されて対物光学系４０の光軸から外れ、標本Ａ側の焦点位置が焦点Ｆｅとなった場合にも、そこからの蛍光が常に光ファイバ束５２の同じ位置を通過するようになるので、走査による明るさムラを防止することができる。 In FIG. 4, a dotted line indicates a light beam when the condensing point 34 is on the optical axis of the objective optical system 40, and a solid line indicates that the condensing point 34 is shifted from the optical axis of the objective optical system 40 by scanning. Shows the rays of time. Even when the focal point 34 is scanned in the direction orthogonal to the optical axis and deviates from the optical axis of the objective optical system 40 under the above conditions, the focal position on the specimen A side becomes the focal point Fe. Since it always passes through the same position of the optical fiber bundle 52, it is possible to prevent uneven brightness due to scanning.

また、図５に示すように、付加光学系５０の蛍光取り込み窓５１の形状を、光ファイバ束５２側を凸面、標本Ａ側を対物光学系４０の光軸に垂直な平面に形成することとしてもよい。
このような形状とすることで、蛍光取り込み窓５１の先端側（入射面５１）が平面なので、標本Ａと蛍光取り込み窓５１との間にある媒質の屈折率の影響を受けにくくすることができ、対物光学系４０が水浸または油浸タイプの場合に好適である。 Further, as shown in FIG. 5, the shape of the fluorescence capturing window 51 of the additional optical system 50 is formed as a convex surface on the optical fiber bundle 52 side and a plane perpendicular to the optical axis of the objective optical system 40 on the sample A side. Also good.
By adopting such a shape, since the tip side (incident surface 51) of the fluorescence capturing window 51 is flat, it can be made less susceptible to the influence of the refractive index of the medium between the sample A and the fluorescence capturing window 51. It is suitable when the objective optical system 40 is a water immersion or oil immersion type.

また、標本Ａ側の入射面５１が対物光学系４０の光軸に垂直な平面なので、蛍光取り込み窓５１全体を標本Ａの表面に密着させることができ、標本Ａの表面での散乱を減らして蛍光の検出効率を向上することができる。 Further, since the incident surface 51 on the specimen A side is a plane perpendicular to the optical axis of the objective optical system 40, the entire fluorescence capturing window 51 can be brought into close contact with the surface of the specimen A, and scattering on the surface of the specimen A is reduced. The detection efficiency of fluorescence can be improved.

また、図６に示すように、付加光学系５０の正レンズ５４の中心部分（空洞部分）を、先端に近づくに従って内径が小さくなる形状とすることで、対物光学系４０の先端部を、先端に近づくに従って径が小さくなるようなテーパー形状にしてもよい。このような形状とすることで、対物光学系４０に近い部分を通った蛍光も付加光学系５０に取り込むことができるので、蛍光の取得効率を高めて蛍光画像のＳＮ比を向上することができる。 Further, as shown in FIG. 6, the center portion (hollow portion) of the positive lens 54 of the additional optical system 50 is shaped so that the inner diameter becomes smaller as it approaches the tip. You may make it a taper shape that a diameter becomes small as it approaches. By adopting such a shape, fluorescence passing through a portion close to the objective optical system 40 can be taken into the additional optical system 50, so that the fluorescence acquisition efficiency can be increased and the SN ratio of the fluorescence image can be improved. .

また、図７に示すように、付加光学系５０の蛍光取り込み窓５１の光軸方向の位置を、対物光学系４０の先端の位置よりも基端側（図７において上側）に配置してもよい。この場合、対物光学系４０の先端を視認できるので、ユーザが観察したい場所を確認しながら蛍光観察を行うことができる。 Further, as shown in FIG. 7, the position of the fluorescence capturing window 51 of the additional optical system 50 in the optical axis direction may be arranged on the base end side (upper side in FIG. 7) than the position of the distal end of the objective optical system 40. Good. In this case, since the tip of the objective optical system 40 can be visually recognized, fluorescence observation can be performed while confirming a place where the user wants to observe.

また、図８に示すように、図６と同様に対物光学系４０を先端に近づくに従って径が小さくなるようなテーパー形状として、光ファイバ束５２をその周りに沿って、対物光学系４０の光軸に対して傾けて配置することとしてもよい。この場合には、光ファイバ束５２の先端を接着剤で固めた後、その先端面が対物光学系４０の光軸に対して垂直になるように研磨し、これを蛍光取り込み窓５１としてもよい。 Further, as shown in FIG. 8, similarly to FIG. 6, the objective optical system 40 is tapered so that the diameter decreases as it approaches the tip. It is good also as arrange | positioning inclining with respect to an axis | shaft. In this case, after the tip of the optical fiber bundle 52 is hardened with an adhesive, the tip surface is polished so as to be perpendicular to the optical axis of the objective optical system 40, and this may be used as the fluorescence capturing window 51. .

このような形状とすることで、光ファイバ束５２の光軸を集光点３４に向けることができる。
なお、図８に示す例において、光ファイバ束５２の光軸の向きを、蛍光取り込み窓５１における蛍光の屈折角と略同じ角度となるように、光ファイバ束５２を配置することが好適である。 With such a shape, the optical axis of the optical fiber bundle 52 can be directed to the condensing point 34.
In the example shown in FIG. 8, it is preferable to arrange the optical fiber bundle 52 so that the direction of the optical axis of the optical fiber bundle 52 is substantially the same as the refraction angle of the fluorescence in the fluorescence capturing window 51. .

このようにすることで、光ファイバ束５２内において、蛍光取り込み窓５１に取り込まれた蛍光を光ファイバ束５２の光軸に沿う方向に導光することができるので、蛍光の検出効率を向上することができる。
上記の構成は、標本Ａの散乱が比較的小さく、集光点３４からの非散乱光が多い場合に特に有効である。 By doing so, the fluorescence captured in the fluorescence capturing window 51 can be guided in the direction along the optical axis of the optical fiber bundle 52 in the optical fiber bundle 52, thereby improving the fluorescence detection efficiency. be able to.
The above configuration is particularly effective when the sample A is relatively scattered and there is a large amount of non-scattered light from the condensing point 34.

また、導光手段である光ファイバ束５２は、例えば直径１ｍｍ程度の太い石英ファイバを使用してもよいし、あるいは液体ファイバを用いてもよい。
光ファイバ束５２を液体ファイバとした場合、ファイバとファイバとの隙間が無いため、蛍光の取得効率をさらに高め、蛍光画像のＳＮ比を向上することができる。 Moreover, the optical fiber bundle 52 which is a light guide means may use, for example, a thick quartz fiber having a diameter of about 1 mm, or a liquid fiber.
When the optical fiber bundle 52 is a liquid fiber, since there is no gap between the fibers, the fluorescence acquisition efficiency can be further increased and the SN ratio of the fluorescence image can be improved.

また、光検出器１７や光検出器２３の前段に、ダイクロイックミラーなどの分光素子などを入れて蛍光の進路を波長帯ごとに分けて、各波長帯の光をそれぞれ別々の光検出素子で検出してもよい。
また、対物光学系４０に対して付加光学系５０の先端部が光軸方向に可動するように構成し、蛍光取り込み窓５１の光軸方向の位置を自由に決められるようにしてもよい。
また、対物光学系４０に有限系の顕微鏡対物レンズを使用してもよい。 In addition, a spectroscopic element such as a dichroic mirror is inserted in front of the light detector 17 and the light detector 23 to divide the course of fluorescence for each wavelength band, and light in each wavelength band is detected by a separate light detecting element. May be.
Further, the tip of the additional optical system 50 may be movable in the optical axis direction with respect to the objective optical system 40, and the position of the fluorescence capturing window 51 in the optical axis direction may be freely determined.
Further, a finite microscope objective lens may be used for the objective optical system 40.

〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係る蛍光観察装置１について、主に図９から図１４を参照して説明する。以下、本実施形態の蛍光観察装置２について、第１の実施形態に係る蛍光観察装置１と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。 [Second Embodiment]
Next, a fluorescence observation apparatus 1 according to the second embodiment of the present invention will be described mainly with reference to FIGS. Hereinafter, with respect to the fluorescence observation apparatus 2 of the present embodiment, description of points that are the same as those of the fluorescence observation apparatus 1 according to the first embodiment will be omitted, and differences will be mainly described.

本実施形態に係る蛍光観察装置２は、標本Ａは生体、特に脳組織等の比較的柔らかいものを観察するのに適した実施形態である。
図９に示すように、対物光学系４０は、標本Ａ内部に損傷を少なく挿入できるように、対物光学系４０が、先端の径が小さく形成された細径先端部４３を有している。具体的には、細径先端部４３の直径は２ｍｍ以下で、より望ましくは１ｍｍ以下が好適である。 In the fluorescence observation apparatus 2 according to this embodiment, the specimen A is an embodiment suitable for observing a living body, particularly a relatively soft object such as brain tissue.
As shown in FIG. 9, the objective optical system 40 has a small-diameter tip portion 43 formed with a small tip diameter so that the object A can be inserted into the specimen A with little damage. Specifically, the diameter of the small diameter tip portion 43 is 2 mm or less, more preferably 1 mm or less.

付加光学系５０は、蛍光取り込み窓５１と、蛍光出口部５３と、これらの間を光学的に接続する光ファイバ束５２とで構成される。
蛍光取り込み窓５１は、図１０に示すように、複数の薄い（例えば厚さ０．３ｍｍ程度）平行平板ガラスが対物光学系４０の細径先端部４３を取り囲むように配置されて形成されている。 The additional optical system 50 includes a fluorescence capturing window 51, a fluorescence outlet 53, and an optical fiber bundle 52 that optically connects these.
As shown in FIG. 10, the fluorescence capturing window 51 is formed by arranging a plurality of thin (for example, a thickness of about 0.3 mm) parallel flat glass so as to surround the thin tip portion 43 of the objective optical system 40. .

蛍光取り込み窓５１の後段には、図１１に示すように、複数の光ファイバ束５２が対物光学系４０を取り囲むように配置されている。
第１の実施形態と同様に、複数の光ファイバ束５２は途中位置で１つの束にまとめられている。複数の光ファイバ束５２は、例えば、外径は５ｍｍ、内径は細径先端部４３の外径よりも少し大きい径である。 As shown in FIG. 11, a plurality of optical fiber bundles 52 are arranged at the subsequent stage of the fluorescence capturing window 51 so as to surround the objective optical system 40.
Similar to the first embodiment, the plurality of optical fiber bundles 52 are combined into one bundle at an intermediate position. The plurality of optical fiber bundles 52 have, for example, an outer diameter of 5 mm and an inner diameter that is slightly larger than the outer diameter of the thin tip portion 43.

光ファイバ束５２は蛍光取り込み窓５１に固定されており、この蛍光取り込み窓５１が、細径先端部４３に対して対物光学系４０の光軸方向に移動可能になっている。さらに、蛍光取り込み窓５１は、対物光学系４０に対して、ネジなどで位置を固定できるようになっている。 The optical fiber bundle 52 is fixed to a fluorescence capturing window 51, and the fluorescence capturing window 51 is movable in the optical axis direction of the objective optical system 40 with respect to the small-diameter tip portion 43. Furthermore, the position of the fluorescence capturing window 51 can be fixed to the objective optical system 40 with a screw or the like.

このように構成することで、対物光学系４０の細径先端部４３を標本Ａの深部まで挿入し、蛍光取り込み窓５１の位置を調整して、蛍光取り込み窓５１と標本Ａ表面を近接させて観察を行うことができる。なお、可能であれば、蛍光取り込み窓５１と標本Ａの表面とを密着させることが望ましい。 With this configuration, the small-diameter tip 43 of the objective optical system 40 is inserted to the deep part of the specimen A, the position of the fluorescence capturing window 51 is adjusted, and the fluorescence capturing window 51 and the specimen A surface are brought close to each other. Observations can be made. If possible, it is desirable to bring the fluorescence capturing window 51 and the surface of the specimen A into close contact.

上記構成を有する蛍光観察装置２によれば、第１の実施形態と同様に、付加光学系５０を対物光学系４０の径方向外側に配置することで、対物レンズ先端を標本Ａに近づけた際に、付加光学系５０が邪魔になることはない。そのため、対物光学系４０の先端部を標本Ａに近づけて、標本Ａの表面から深い位置に対物光学系４０のピントを合わせることができ、標本Ａの深部の観察精度を向上することができる。 According to the fluorescence observation apparatus 2 having the above configuration, when the distal end of the objective lens is brought close to the specimen A by arranging the additional optical system 50 on the radially outer side of the objective optical system 40 as in the first embodiment. In addition, the additional optical system 50 does not get in the way. Therefore, the tip of the objective optical system 40 can be brought close to the sample A, and the focus of the objective optical system 40 can be adjusted to a deep position from the surface of the sample A, and the observation accuracy of the deep part of the sample A can be improved.

さらに、従来の蛍光観察装置は、対物レンズの径が大きいため、標本Ａの内部に挿入することは不可能であった。これに対して、本実施形態に係る蛍光観察装置２によれば、対物光学系４０に細径先端部４３を設けることで、標本Ａの組織の損傷を小さく抑えつつ、対物光学系４０を標本Ａの内部に挿入することができる。標本Ａの深部まで対物光学系４０の細径先端部４３を挿入すると、集光点３４の標本Ａの表面からの深さが従来と同じでも、励起光が標本Ａ内を通る距離が短くなる。これにより、励起光の散乱を少なく抑えることができ、励起光の光密度を高め、励起効率を向上することができる。 Furthermore, the conventional fluorescence observation apparatus cannot be inserted into the specimen A because the diameter of the objective lens is large. On the other hand, according to the fluorescence observation apparatus 2 according to the present embodiment, the objective optical system 40 is provided with the small-diameter tip portion 43 in the objective optical system 40, while suppressing damage to the tissue of the specimen A. It can be inserted inside A. When the small-diameter tip 43 of the objective optical system 40 is inserted to the deep part of the specimen A, the distance through which the excitation light passes through the specimen A is shortened even if the depth of the condensing point 34 from the surface of the specimen A is the same as the conventional one. . Thereby, scattering of excitation light can be suppressed to a low level, the light density of excitation light can be increased, and excitation efficiency can be improved.

また、標本Ａにおいて発生した蛍光についても、標本Ａの内部を通る距離が短くなるため、標本Ａ内における散乱を低減することができ、対物光学系４０の開口の外へ逃げてしまう蛍光の光量を低下させ、蛍光の検出効率を向上することができる。 Further, the fluorescence generated in the specimen A also has a short distance through the specimen A, so that the scattering in the specimen A can be reduced, and the amount of fluorescence that escapes outside the aperture of the objective optical system 40. And the detection efficiency of fluorescence can be improved.

また、標本Ａの深部においては、集光点３４で励起されて発生した蛍光が標本Ａ中を進む距離が、散乱の平均自由行程（散乱で妨害されること無く進むことのできる距離の平均値）を越える場合がある。この場合、散乱されずに標本Ａの表面に直接達する蛍光は非常に少なく、ほとんどの蛍光が標本Ａ内で多重散乱して標本Ａの表面に達する。多重散乱した蛍光は、さまざまな方向の成分を持って標本Ａの表面から射出されるので、標本Ａの表面から付加光学系５０までの距離が離れていると、標本Ａの表面からの出射方向が付加光学系５０から外れてしまい、付加光学系５０に取り込まれる蛍光が急激に減少する。 Further, in the deep part of the sample A, the distance that the fluorescence generated by being excited at the condensing point 34 travels through the sample A is the mean free path of scattering (the average value of the distance that can travel without being disturbed by scattering). ) May be exceeded. In this case, very little fluorescence reaches the surface of the sample A without being scattered, and most of the fluorescence reaches the surface of the sample A by multiple scattering within the sample A. Since the multiple scattered fluorescence is emitted from the surface of the specimen A with components in various directions, if the distance from the surface of the specimen A to the additional optical system 50 is long, the emission direction from the surface of the specimen A Is removed from the additional optical system 50, and the fluorescence taken into the additional optical system 50 rapidly decreases.

したがって、本実施形態に係る蛍光観察装置２のように、付加光学系５０を対物光学系４０の光軸方向に移動可能にすることで、標本Ａに対物光学系４０を挿入した状態で、付加光学系５０（蛍光取り込み窓５１）を標本Ａに近接または密着させることができる。これにより、付加光学系５０により多くの散乱光を取り込むことができ、画像のＳＮ比を高めて観察精度を向上することができる。 Therefore, as in the fluorescence observation apparatus 2 according to the present embodiment, the additional optical system 50 can be moved in the optical axis direction of the objective optical system 40 so that the objective optical system 40 is inserted into the specimen A. The optical system 50 (fluorescence capturing window 51) can be brought close to or in close contact with the specimen A. Thereby, more scattered light can be taken in by the additional optical system 50, and the SN ratio of an image can be raised and observation accuracy can be improved.

なお、多成分ガラスの光ファイバは、曲げ応力が小さく、曲げ半径も小さく柔軟性が高い。そこで、光ファイバ束５２に多成分ガラスの光ファイバを用いることで、付加光学系５０の蛍光取り込み窓５１の位置を容易に調整することができる。 Note that a multicomponent glass optical fiber has a low bending stress, a small bending radius, and high flexibility. Thus, by using a multicomponent glass optical fiber for the optical fiber bundle 52, the position of the fluorescence capturing window 51 of the additional optical system 50 can be easily adjusted.

また、図１２に示すように、蛍光取り込み窓５１を、対物光学系４０の細径先端部４３が通る中心部だけ貫通穴をあけた平行平板ガラスにしても良い。また、平行平板ガラスを取り付けないで、接着剤で光ファイバ束５２を固めても良い。このようにすることで、部品点数を減らすことができ、コストを削減することができる。 In addition, as shown in FIG. 12, the fluorescence capturing window 51 may be a parallel plate glass in which a through hole is formed only in the central portion through which the small-diameter tip portion 43 of the objective optical system 40 passes. Further, the optical fiber bundle 52 may be hardened with an adhesive without attaching the parallel flat glass. By doing in this way, a number of parts can be reduced and cost can be reduced.

また、図１３に示すように、光ファイバ束５２を円環状に配置しても良い。このようにすることで、付加光学系５０の先端部の外径が同じでも、光ファイバ束５２のファイバ本数を増やすことが出来るので、より多くの蛍光を光検出ユニット２０まで導くことができ、高いＳＮ比を実現することができる。 Further, as shown in FIG. 13, the optical fiber bundles 52 may be arranged in an annular shape. By doing in this way, even if the outer diameter of the tip portion of the additional optical system 50 is the same, the number of fibers of the optical fiber bundle 52 can be increased, so that more fluorescence can be guided to the light detection unit 20, A high S / N ratio can be realized.

また、図１４に示すように、対物光学系４０の先端形状を、先端に近づくに従って径が小さくなるようなテーパー形状としてもよい。さらに、付加光学系５０の光ファイバ束５２の先端を融着または接着してから、先端に近づくに従って径が小さくなるようなテーパー形状に研磨して、このテーパー面を蛍光取り込み窓５１としてもよい。 Further, as shown in FIG. 14, the tip shape of the objective optical system 40 may be tapered so that the diameter becomes smaller as it approaches the tip. Further, the tip of the optical fiber bundle 52 of the additional optical system 50 may be fused or bonded, and then polished into a tapered shape such that the diameter decreases as it approaches the tip, and this tapered surface may be used as the fluorescence capturing window 51. .

上記構成を有する蛍光観察装置２によれば、対物光学系４０および蛍光取り込み窓５１を先端に近づくに従って細径となるテーパー形状とすることで、標本Ａのダメージをより低減させつつ、対物光学系４０および付加光学系５０を標本Ａの内部に挿入できる。これにより、蛍光取り込み窓５１を集光点３４に近づけることができ、蛍光取り込み窓５１に取り込む蛍光量を増加させることができる。その結果、画像のＳＮ比を向上することができ、標本Ａのより深い部分の観察を行うことができる。 According to the fluorescence observation apparatus 2 having the above-described configuration, the objective optical system 40 and the fluorescence capturing window 51 are tapered so that the diameter decreases as they approach the tip, thereby further reducing damage to the specimen A and further reducing the damage to the specimen A. 40 and the additional optical system 50 can be inserted into the specimen A. Thereby, the fluorescence capturing window 51 can be brought close to the condensing point 34, and the amount of fluorescence captured in the fluorescence capturing window 51 can be increased. As a result, the SN ratio of the image can be improved, and a deeper portion of the specimen A can be observed.

〔第３の実施形態〕
次に、本発明の第３の実施形態に係る蛍光観察装置３について、主に図１５から図１９を参照して説明する。以下、本実施形態の蛍光観察装置３について、前述の各実施形態に係る蛍光観察装置と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置３は、図１５に示されるように、対物光学系４０を通った蛍光と付加光学系５０を通った蛍光を同一の光検出器１７で検出できるようにしたものである。 [Third Embodiment]
Next, the fluorescence observation apparatus 3 according to the third embodiment of the present invention will be described mainly with reference to FIGS. 15 to 19. Hereinafter, with respect to the fluorescence observation apparatus 3 of the present embodiment, description of points that are the same as those of the fluorescence observation apparatus according to each of the above-described embodiments will be omitted, and differences will be mainly described.
As shown in FIG. 15, the fluorescence observation apparatus 3 according to the present embodiment can detect the fluorescence passing through the objective optical system 40 and the fluorescence passing through the additional optical system 50 with the same photodetector 17. It is.

対物光学系４０は、先端側に有限系レンズ４５，４６を有しており、有限系レンズ４５，４６の基端側には中間結像面６１が形成されるようになっている。中間結像面６１の近傍には、図１６に示すように、リング状の遮光部材４７が配置されている。この遮光部材４７は、有限系レンズ４５，４６の視野を規定しており、標本Ａ上で励起光が走査される範囲を規定している。 The objective optical system 40 has finite system lenses 45 and 46 on the distal end side, and an intermediate imaging surface 61 is formed on the proximal end side of the finite system lenses 45 and 46. As shown in FIG. 16, a ring-shaped light shielding member 47 is disposed in the vicinity of the intermediate image plane 61. The light shielding member 47 defines the field of view of the finite lenses 45 and 46, and defines the range in which the excitation light is scanned on the specimen A.

付加光学系５０は、蛍光取り込み窓５１と、蛍光出口部５３と、これらの間を光学的に接続する光ファイバ束５２とで構成されている。本実施形態においては、光ファイバ束５２の基端部が蛍光出口部５３となっている。蛍光取り込み窓５１は第１の実施形態と同様である。光ファイバ束５２は、図１６に示すように、例えばＮＡ０．２２で径が比較的大きい（例えば直径１ｍｍ）の石英系の光ファイバ６本が、対物光学系４０の外側を囲うように配置されている。 The additional optical system 50 includes a fluorescence capturing window 51, a fluorescence exit portion 53, and an optical fiber bundle 52 that optically connects them. In the present embodiment, the base end portion of the optical fiber bundle 52 is a fluorescent outlet portion 53. The fluorescence capturing window 51 is the same as that in the first embodiment. As shown in FIG. 16, the optical fiber bundle 52 is arranged so that, for example, six quartz optical fibers having an NA of 0.22 and a relatively large diameter (for example, a diameter of 1 mm) surround the outside of the objective optical system 40. ing.

中間結像面６１と蛍光出口部５３は、対物光学系４０の光軸方向では、略同じ位置に配置されており、光軸に直交する方向では、対物光学系４０の中間結像面６１位置での視野の周辺に蛍光出口部５３が並べて配置されている。
本実施形態では、光ファイバ束５２の基端側（蛍光出口部５３）と有限系レンズ４５，４６の基端側の瞳位置をともに無限大（すなわちテレセントリック）に構成している。 The intermediate imaging plane 61 and the fluorescence exit portion 53 are arranged at substantially the same position in the optical axis direction of the objective optical system 40, and the intermediate imaging plane 61 position of the objective optical system 40 in the direction orthogonal to the optical axis. The fluorescent outlets 53 are arranged side by side around the field of view.
In the present embodiment, the pupil positions on the proximal end side (fluorescent exit portion 53) of the optical fiber bundle 52 and the proximal end sides of the finite system lenses 45 and 46 are both infinite (that is, telecentric).

中間結像面６１と蛍光出口部５３の基端側には、中間結像面６１からの蛍光と蛍光出口部５３からの蛍光の両方を顕微鏡本体１０に導くアダプタレンズ６２が配置されている。アダプタレンズ６２は無限遠光学系の正レンズであり、基端側の焦点が光検出器１７と共役な位置に設定されている。 An adapter lens 62 that guides both the fluorescence from the intermediate imaging surface 61 and the fluorescence from the fluorescence outlet 53 to the microscope main body 10 is disposed on the proximal end side of the intermediate imaging plane 61 and the fluorescence outlet 53. The adapter lens 62 is a positive lens of an infinite optical system, and the focal point on the base end side is set at a position conjugate with the photodetector 17.

上記構成を有する蛍光観察装置３の作用について説明する。
第１の実施形態と同様に顕微鏡本体１０から射出され、平行光束で対物光学系４０に入射した励起光は、アダプタレンズ６２（無限遠系レンズ）によって対物光学系４０内の中間結像面６１上で一旦集光され、有限系レンズ４５，４６によって再び標本Ａ内の集光点３４に集光される。 The operation of the fluorescence observation apparatus 3 having the above configuration will be described.
As in the first embodiment, the excitation light emitted from the microscope body 10 and incident on the objective optical system 40 as a parallel light flux is converted into an intermediate image plane 61 in the objective optical system 40 by an adapter lens 62 (infinity lens). The light is condensed once above, and again condensed at the condensing point 34 in the sample A by the finite lenses 45 and 46.

集光点３４では標本Ａ内の蛍光物質が励起され、蛍光が発生する。この蛍光の光路について図１７を用いて説明する。
図１７において、標本Ａ内の集光点３４で発した蛍光のうち、対物光学系４０の有限系レンズ４５，４６の開口範囲内に入ったもの（直接光および散乱光）は実線で示している。また、標本Ａ内の集光点３４で発した蛍光のうち、付加光学系５０に入ったもの（直接光および散乱光）は点線で示している。なお、図１７は、励起光が走査されて、対物光学系４０の光軸から外れたときの状態を示している。 At the condensing point 34, the fluorescent substance in the sample A is excited and fluorescence is generated. The fluorescence optical path will be described with reference to FIG.
In FIG. 17, among the fluorescence emitted from the condensing point 34 in the specimen A, the ones (direct light and scattered light) that fall within the aperture range of the finite system lenses 45 and 46 of the objective optical system 40 are indicated by solid lines. Yes. In addition, among the fluorescence emitted from the condensing point 34 in the specimen A, the light entering the additional optical system 50 (direct light and scattered light) is indicated by a dotted line. FIG. 17 shows a state when the excitation light is scanned and deviated from the optical axis of the objective optical system 40.

標本Ａにおいて発生した蛍光のうち、対物光学系４０に入射した蛍光は、有限系レンズ４５，４６を通って、アダプタレンズ６２（無限遠系レンズ）により集光され、ダイクロイックミラー１４を透過する。そして、励起光カットフィルタ１５を通過することで励起光がカットされ、リレー光学系１６を介して光検出器１７に入射し、光検出器１７により電気信号に変換される。 Of the fluorescence generated in the specimen A, the fluorescence that has entered the objective optical system 40 passes through the finite lenses 45 and 46, is condensed by the adapter lens 62 (infinity lens), and passes through the dichroic mirror 14. Then, the excitation light is cut by passing through the excitation light cut filter 15, enters the photodetector 17 through the relay optical system 16, and is converted into an electric signal by the photodetector 17.

標本Ａにおいて発生した蛍光のうち、対物光学系４０の有限系レンズ４５，４６の開口範囲内に入らなかった蛍光の一部は、付加光学系５０に入射する。この蛍光は、蛍光取り込み窓５１に入射した後、光ファイバ束５２により導光され、蛍光出口部５３から射出される。そして、アダプタレンズ６２（無限遠系レンズ）により集光され、ダイクロイックミラー１４を透過する。そして、励起光カットフィルタ１５を通過することで励起光がカットされ、リレー光学系１６を介して光検出器１７に入射し、光検出器１７により電気信号に変換される。 Of the fluorescence generated in the specimen A, a part of the fluorescence that does not fall within the aperture range of the finite lenses 45 and 46 of the objective optical system 40 enters the additional optical system 50. The fluorescence enters the fluorescence capturing window 51, is guided by the optical fiber bundle 52, and is emitted from the fluorescence outlet 53. Then, the light is condensed by the adapter lens 62 (infinity lens) and transmitted through the dichroic mirror 14. Then, the excitation light is cut by passing through the excitation light cut filter 15, enters the photodetector 17 through the relay optical system 16, and is converted into an electric signal by the photodetector 17.

上記のように、対物光学系４０の有限系レンズ４５，４６を通った蛍光と付加光学系５０を通った蛍光の両方が同一の光検出器１７で検出される。
以上のように、本実施形態に係る蛍光観察装置３によれば、第１の実施形態と同様に、付加光学系５０を対物光学系４０の径方向外側に配置することで、対物レンズ先端を標本Ａに近づけた際に、付加光学系５０が邪魔になることはない。そのため、対物光学系４０の先端部を標本Ａに近づけて、標本Ａの表面から深い位置に対物光学系４０のピントを合わせることができ、標本Ａの深部の観察精度を向上することができる。 As described above, both the fluorescence passing through the finite lenses 45 and 46 of the objective optical system 40 and the fluorescence passing through the additional optical system 50 are detected by the same photodetector 17.
As described above, according to the fluorescence observation apparatus 3 according to the present embodiment, the distal end of the objective lens is arranged by disposing the additional optical system 50 on the radially outer side of the objective optical system 40 as in the first embodiment. When approaching the specimen A, the additional optical system 50 does not get in the way. Therefore, the tip of the objective optical system 40 can be brought close to the sample A, and the focus of the objective optical system 40 can be adjusted to a deep position from the surface of the sample A, and the observation accuracy of the deep part of the sample A can be improved.

また、本実施形態では、光ファイバ束５２の基端側（蛍光出口部５３）と有限系レンズ４５，４６の基端側の瞳位置をともに無限大（すなわちテレセントリック）にし、さらに、アダプタレンズ６２を無限遠系光学系として、その基端側の焦点と、光検出器１７を共役関係になるように配置している。これにより、励起光を走査したときでも、対物光学系４０の有限系レンズ４５，４６を通った蛍光は、常に光検出器１７に入射させることができ、さらに、付加光学系５０を通った蛍光も同じ光検出器１７に入射するようにできる。 In this embodiment, the pupil positions on the proximal end side (fluorescent exit portion 53) of the optical fiber bundle 52 and the proximal end sides of the finite system lenses 45 and 46 are both infinite (that is, telecentric). Is an infinite optical system, and the base end side focal point and the photodetector 17 are arranged in a conjugate relationship. Thereby, even when the excitation light is scanned, the fluorescence that has passed through the finite lenses 45 and 46 of the objective optical system 40 can always be incident on the photodetector 17, and further the fluorescence that has passed through the additional optical system 50. Can also be incident on the same photodetector 17.

これにより、対物光学系４０と付加光学系５０を別々の光検出器で検出する場合と比較して、光検出器に入る蛍光の光量が多くなるので、画像のＳＮ比を向上させることができる。これにより、標本Ａのより深い部分の観察が可能になる。また、光検出器１７からの情報を１つとすることができ、後に実行される電気的な処理（例えば画質向上のための処理）を簡易的なものとすることができる。 Thereby, compared with the case where the objective optical system 40 and the additional optical system 50 are detected by separate photodetectors, the amount of fluorescent light entering the photodetector is increased, so that the SN ratio of the image can be improved. . Thereby, the deeper part of the specimen A can be observed. Further, the information from the light detector 17 can be made one, and electrical processing (for example, processing for improving image quality) to be executed later can be simplified.

また、付加光学系５０用の光検出器を別途設ける必要が無いので、一般の多光子励起顕微鏡をそのまま使うことができる。
なお、これらの光学系の瞳位置の配置は、上記に限定されるものではなく、対物光学系４０の有限系レンズ４５，４６の基端側の瞳位置と付加光学系５０の基端側の瞳位置が一致するように構成し、これらの瞳がアダプタレンズ６２によって、光検出器１７の位置にリレーされるようにしてあればよい。 Further, since it is not necessary to separately provide a photodetector for the additional optical system 50, a general multiphoton excitation microscope can be used as it is.
The arrangement of the pupil positions of these optical systems is not limited to the above, and the pupil positions on the base end side of the finite system lenses 45 and 46 of the objective optical system 40 and the base end side of the additional optical system 50 are not limited. The pupil positions may be configured to coincide with each other, and these pupils may be relayed to the position of the photodetector 17 by the adapter lens 62.

また、図１８に示すように、対物光学系４０の先端部および付加光学系５０の先端部を、第２の実施形態で示した態様としてもよい。
図１８に示すように、本変形例に係る蛍光観察装置３’は、対物光学系４０の先端に細径先端部４３を有している。また、第２の実施形態と同様に、光ファイバ束５２が蛍光取り込み窓５１に固定されており、蛍光取り込み窓５１が、対物光学系４０の光軸方向に移動可能になっている。 Further, as shown in FIG. 18, the tip of the objective optical system 40 and the tip of the additional optical system 50 may be the modes shown in the second embodiment.
As shown in FIG. 18, the fluorescence observation apparatus 3 ′ according to this modification has a small-diameter tip portion 43 at the tip of the objective optical system 40. As in the second embodiment, the optical fiber bundle 52 is fixed to the fluorescence capturing window 51, and the fluorescence capturing window 51 is movable in the optical axis direction of the objective optical system 40.

光ファイバ束５２は、第２の実施形態と同様に、高ＮＡ（例えばＮＡ０．６５）で径が小さい（例えば直径３０μｍ）の多成分ガラスの光ファイバを束ねたものである。
上記構成を有する蛍光観察装置３’によれば、第２の実施形態と同様に、励起効率や蛍光の検出効率を上げることができ、画像のＳＮ比を向上することができる。 As in the second embodiment, the optical fiber bundle 52 is a bundle of optical fibers made of multicomponent glass having a high NA (for example, NA 0.65) and a small diameter (for example, a diameter of 30 μm).
According to the fluorescence observation apparatus 3 ′ having the above-described configuration, similarly to the second embodiment, the excitation efficiency and the fluorescence detection efficiency can be increased, and the SN ratio of the image can be improved.

なお、励起光の光走査の範囲について、励起光が光ファイバ束５２の基端部に集光して光ファイバ束５２に損傷を与えないようにするため、対物光学系４０のアダプタレンズ６２を通過した後の中間像位置で、付加光学系５０の蛍光出口部５３の有効範囲に励起光が入らないようにすることが望ましい。
具体的には、例えば図１６に示すように、励起光の走査範囲に遮光部材４７を設け、付加光学系５０の蛍光出口部５３を走査範囲の外に配置することが考えられる。 In order to prevent the excitation light from condensing on the proximal end portion of the optical fiber bundle 52 and damaging the optical fiber bundle 52 in the optical scanning range of the excitation light, the adapter lens 62 of the objective optical system 40 is provided. It is desirable to prevent excitation light from entering the effective range of the fluorescence exit 53 of the additional optical system 50 at the intermediate image position after passing.
Specifically, for example, as shown in FIG. 16, it is conceivable to provide a light blocking member 47 in the scanning range of the excitation light, and to arrange the fluorescent outlet 53 of the additional optical system 50 outside the scanning range.

また、励起光の走査範囲が円形では無く、正方形や長方形の場合、図１９に示すように、励起光の走査範囲に合わせて遮光部材４７を正方形や長方形としてもよい。この場合には、光ファイバ束５２を遮光部材４７の側面の周囲に配置し、これらを束ねて蛍光出口部５３とすることで、アダプタレンズ６２の視野数を大きく取らずにすむメリットがある。 If the scanning range of the excitation light is not a circle but a square or a rectangle, the light shielding member 47 may be a square or a rectangle according to the scanning range of the excitation light as shown in FIG. In this case, there is an advantage that the optical fiber bundle 52 is arranged around the side surface of the light blocking member 47 and bundled to form the fluorescent exit portion 53, so that the number of fields of view of the adapter lens 62 is not increased.

なお、対物光学系４０のアダプタレンズ６２を通過した後の中間像位置で、付加光学系５０の蛍光出口部５３の有効範囲に励起光が入らないように走査すれば遮光部材は不要である。
また、光ファイバ束５２（導光手段）は蛍光を蛍光出口部５３まで導けば良く、第１の実施形態と同様に他の導光手段に変更することも可能である。 If scanning is performed so that excitation light does not enter the effective range of the fluorescent exit 53 of the additional optical system 50 at the intermediate image position after passing through the adapter lens 62 of the objective optical system 40, a light shielding member is unnecessary.
Further, the optical fiber bundle 52 (light guide means) may guide the fluorescence to the fluorescence exit portion 53, and can be changed to another light guide means as in the first embodiment.

〔第４の実施形態〕
次に、本発明の第４の実施形態に係る蛍光観察装置４について、主に図２０を参照して説明する。以下、本実施形態の蛍光観察装置４について、前述の各実施形態に係る蛍光観察装置と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置４は、図２０に示されるように、第３の実施形態に係る蛍光観察装置３において、蛍光出口部５３の部分が変形された態様である。 [Fourth Embodiment]
Next, a fluorescence observation apparatus 4 according to the fourth embodiment of the present invention will be described mainly with reference to FIG. Hereinafter, with respect to the fluorescence observation apparatus 4 of the present embodiment, description of points that are common to the fluorescence observation apparatus according to each of the above-described embodiments will be omitted, and different points will be mainly described.
As shown in FIG. 20, the fluorescence observation device 4 according to the present embodiment is a mode in which the portion of the fluorescence outlet portion 53 is modified in the fluorescence observation device 3 according to the third embodiment.

付加光学系５０の先端部４３は、図１８に示される第３の実施形態（変形例）に係る蛍光観察装置３’の先端形状と同様である。
第３の実施形態に係る蛍光観察装置３と異なる点は、有限系レンズ４５，４６の中間像面が、光ファイバ束５２の基端部（蛍光出口部５３）ではなく、光ファイバ束５２の基端部の共役面である中間結像面６１に形成される点である。 The distal end portion 43 of the additional optical system 50 is the same as the distal end shape of the fluorescence observation apparatus 3 ′ according to the third embodiment (modified example) shown in FIG.
The difference from the fluorescence observation apparatus 3 according to the third embodiment is that the intermediate image plane of the finite system lenses 45 and 46 is not the base end portion (fluorescence exit portion 53) of the optical fiber bundle 52 but the optical fiber bundle 52. This is a point formed on the intermediate imaging plane 61 which is a conjugate plane at the base end.

光ファイバ束５２の基端部の共役面は、付加光学系５０に設けられたリレーレンズ（付加光学系リレーレンズ）５５およびミラー５６によって形成される。
付加光学系５０のリレーレンズ５５の基端側（ミラー５６で反射後）の瞳位置は、付加光学系５０からの蛍光が効率よく光検出器１７に入るように、対物光学系４０の光軸方向に有限系レンズ４５，４６と瞳位置を略一致させている。 The conjugate surface of the base end portion of the optical fiber bundle 52 is formed by a relay lens (additional optical system relay lens) 55 and a mirror 56 provided in the additional optical system 50.
The pupil position of the additional optical system 50 on the base end side (after reflection by the mirror 56) of the relay lens 55 is such that the fluorescence from the additional optical system 50 enters the photodetector 17 efficiently. The finite lenses 45 and 46 and the pupil position are substantially coincided with each other in the direction.

本実施形態では、付加光学系５０のリレーレンズ５５は、両テレセントリック光学系（瞳位置が前後ともに無限大）になっており、ミラー５６で付加光学系５０の光軸を直角に曲げて、中間像部分での付加光学系５０の瞳位置も無限大としている。また、有限系レンズ４５，４６の基端側の瞳位置も、これに合わせて無限大（すなわち、テレセントリック）としている。 In the present embodiment, the relay lens 55 of the additional optical system 50 is a bi-telecentric optical system (the pupil position is infinite both in the front and rear directions), and the optical axis of the additional optical system 50 is bent at a right angle by a mirror 56, so The pupil position of the additional optical system 50 in the image portion is also infinite. Further, the pupil position on the base end side of the finite lenses 45 and 46 is also infinite (that is, telecentric) accordingly.

上記構成を有する蛍光観察装置４の作用について説明する。
第３の実施形態において、付加光学系５０の光ファイバ束５２の基端部のＮＡと有限系レンズ４５，４６の中間像側のＮＡが大きく異なるものを使用した場合、光が途中でけられないようにするため、アダプタレンズ６２のＮＡを大きいほうにあわせる必要がある。しかし、本実施形態のように付加光学系５０のリレーレンズ５５を使って、付加光学系５０の中間結像面６１におけるＮＡを有限系レンズ４５，４６のＮＡにあわせることで、アダプタレンズ６２のＮＡをどちらかに大きいほうにあわせる必要がなくなる。 The operation of the fluorescence observation apparatus 4 having the above configuration will be described.
In the third embodiment, when the NA of the proximal end portion of the optical fiber bundle 52 of the additional optical system 50 and the NA of the intermediate image side of the finite system lenses 45 and 46 are greatly different, light is interrupted in the middle. In order to avoid this, it is necessary to adjust the NA of the adapter lens 62 to the larger one. However, by using the relay lens 55 of the additional optical system 50 as in the present embodiment, the NA of the intermediate imaging plane 61 of the additional optical system 50 is matched with the NA of the finite system lenses 45 and 46, so that the adapter lens 62 There is no need to adjust the NA to the larger one.

なお、ミラー５６は、光ファイバ束５２の基端部と、その共役面である中間結像面６１との距離が長いので、光ファイバ束５２およびリレーレンズ５５を付加光学系５０の光軸に対して横方向に逃がすために設けている。 Since the mirror 56 has a long distance between the base end portion of the optical fiber bundle 52 and the intermediate image plane 61 that is a conjugate surface thereof, the optical fiber bundle 52 and the relay lens 55 are used as the optical axis of the additional optical system 50. On the other hand, it is provided to escape laterally.

また、光ファイバ束５２の基端部と付加光学系５０のリレーレンズ５５を着脱自在にして、付加光学系５０を交換できるようにしてもよい。その際、各々の付加光学系５０に対して付加光学系５０のリレーレンズ５５で蛍光出口部５３側のＮＡを調整して有限系レンズ４５，４６に合わせるようにすればよい。
なお、目的に合わせて、付加光学系５０の仕様（光ファイバ束５２の太さやＮＡ，蛍光取り込み窓５１の形状など）を交換しても、有限系レンズ４５，４６やアダプタレンズ６２を変える必要が無い。 Further, the base end portion of the optical fiber bundle 52 and the relay lens 55 of the additional optical system 50 may be detachable so that the additional optical system 50 can be exchanged. At this time, the NA on the fluorescent exit 53 side may be adjusted by the relay lens 55 of the additional optical system 50 for each additional optical system 50 so as to match the finite system lenses 45 and 46.
Even if the specifications of the additional optical system 50 (the thickness of the optical fiber bundle 52, the NA, the shape of the fluorescence capturing window 51, etc.) are changed according to the purpose, it is necessary to change the finite lenses 45 and 46 and the adapter lens 62. There is no.

また、光ファイバ束５２の基端部、付加光学系５０のリレーレンズ５５、およびミラー５６を一体で着脱可能としてもよい。
さらに、光ファイバ束５２が同じＮＡであれば、光ファイバ束５２の基端部から着脱してもよい。 Further, the proximal end portion of the optical fiber bundle 52, the relay lens 55 of the additional optical system 50, and the mirror 56 may be integrally removable.
Further, if the optical fiber bundle 52 has the same NA, the optical fiber bundle 52 may be attached and detached from the base end portion.

〔第５の実施形態〕
次に、本発明の第５の実施形態に係る蛍光観察装置５について、主に図２１から図２８を参照して説明する。以下、本実施形態の蛍光観察装置５について、前述の各実施形態に係る蛍光観察装置と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。 [Fifth Embodiment]
Next, the fluorescence observation apparatus 5 according to the fifth embodiment of the present invention will be described mainly with reference to FIGS. Hereinafter, regarding the fluorescence observation apparatus 5 of the present embodiment, description of points that are common to the fluorescence observation apparatus according to each of the above-described embodiments will be omitted, and different points will be mainly described.

本実施形態に係る蛍光観察装置５は、対物光学系４０を通った蛍光と付加光学系５０を通った蛍光とを同一の光検出器１７で検出するようにするための蛍光合成手段を、前述の第３の実施形態および第４の実施形態とは別の構成で実現するものである。 In the fluorescence observation apparatus 5 according to the present embodiment, the fluorescence synthesizing means for detecting the fluorescence passing through the objective optical system 40 and the fluorescence passing through the additional optical system 50 by the same photodetector 17 is described above. This is realized by a configuration different from the third embodiment and the fourth embodiment.

本実施形態に係る蛍光観察装置５は、図２１に示されるように、顕微鏡本体１０と、対物光学系４０、付加光学系５０と、対物光学系４０基端部と顕微鏡本体１０の間に設けられた蛍光合成部（光合成手段）７０とを備えている。
なお、図２１に示す例では、細径先端部４３を有する対物光学系４０を示しているが、それ以外の対物光学系４０でもよい。 As shown in FIG. 21, the fluorescence observation apparatus 5 according to the present embodiment is provided between the microscope main body 10, the objective optical system 40, the additional optical system 50, and the objective optical system 40 base end and the microscope main body 10. The fluorescence synthesis unit (photosynthesis means) 70 is provided.
In the example shown in FIG. 21, the objective optical system 40 having the small-diameter tip portion 43 is shown, but other objective optical systems 40 may be used.

蛍光合成部７０は、図２２に示すように、励起光および対物光学系４０を通ってきた蛍光が通る中心部７３と、付加光学系５０を通ってきた蛍光が通る周辺部７４で構成されており、これら蛍光を合成するようになっている。
周辺部７４は、光ファイバ束５２の基端部から蛍光が入射するコリメートレンズ（付加光学系コリメートレンズ）７１と、コリメートレンズ７１からの蛍光を偏向するプリズム（偏向素子）７２で構成されている。なお、プリズム７２に代えて、ミラーを配置することとしてもよい。 As shown in FIG. 22, the fluorescence synthesizer 70 includes a central portion 73 through which excitation light and fluorescence that has passed through the objective optical system 40 pass, and a peripheral portion 74 through which fluorescence that has passed through the additional optical system 50 passes. These fluorescences are synthesized.
The peripheral portion 74 includes a collimating lens (additional optical system collimating lens) 71 into which fluorescence enters from the base end portion of the optical fiber bundle 52 and a prism (deflection element) 72 that deflects the fluorescence from the collimating lens 71. . In place of the prism 72, a mirror may be arranged.

光ファイバ束５２の基端部は、蛍光取り込み窓５１に接続された光ファイバ束５２が一旦ばらばらになった後、複数の束にまとめられたもので、蛍光合成部７０の側面に配置されている。 The base end portion of the optical fiber bundle 52 is a bundle of optical fibers 52 connected to the fluorescence capturing window 51 and then bundled into a plurality of bundles. Yes.

上記構成を有する蛍光観察装置５の作用について説明する。
対物光学系４０を通った蛍光は、対物光学系４０で略平行光束になって、蛍光合成部７０の中心部７３を通り、顕微鏡本体１０に入射する。 The operation of the fluorescence observation apparatus 5 having the above configuration will be described.
The fluorescence that has passed through the objective optical system 40 becomes a substantially parallel light beam in the objective optical system 40, passes through the central portion 73 of the fluorescence synthesis unit 70, and enters the microscope body 10.

蛍光取り込み窓５１および光ファイバ束５２を通って、光ファイバ束５２の基端側から射出された蛍光は、コリメートレンズ７１により屈折される。コリメートレンズ７１は、コリメートレンズ７１の焦点と光ファイバ束５２の基端部を略一致させて、光ファイバ束５２の一点から出た光が略平行光束になるように配置されている。実際には、光ファイバ束５２は面積をもっているので、複数の平行光束が角度を持って重なり合った形になる。 The fluorescence emitted from the proximal end side of the optical fiber bundle 52 through the fluorescence capturing window 51 and the optical fiber bundle 52 is refracted by the collimator lens 71. The collimating lens 71 is disposed so that the light emitted from one point of the optical fiber bundle 52 becomes a substantially parallel light beam, with the focal point of the collimating lens 71 and the base end portion of the optical fiber bundle 52 substantially matched. Actually, since the optical fiber bundle 52 has an area, a plurality of parallel light beams are overlapped at an angle.

コリメートレンズ７１を出た蛍光は、プリズム７２により対物光学系４０の光束と同じ方向に偏向され、対物光学系４０の光束の外側に通って、顕微鏡本体１０に入射する。このように、対物光学系４０および付加光学系５０を通った蛍光は、蛍光合成部７０により合成され、顕微鏡本体１０のリレーレンズ１６により同一の光検出器１７に集光され、該光検出器１７により検出される。 The fluorescence emitted from the collimator lens 71 is deflected by the prism 72 in the same direction as the light beam of the objective optical system 40, passes through the outside of the light beam of the objective optical system 40, and enters the microscope body 10. In this way, the fluorescence that has passed through the objective optical system 40 and the additional optical system 50 is synthesized by the fluorescence synthesis unit 70, and condensed by the relay lens 16 of the microscope body 10 onto the same photodetector 17. 17 is detected.

ここで、光ファイバ束５２の基端側の形状は、図２３に示すように、円弧状にするとよい。このような形状にすることで、付加光学系５０を通った蛍光の光束の広がり角が横方向に大きくならないので、顕微鏡本体１０側の視野数を大きくしないで済む。 Here, the shape of the base end side of the optical fiber bundle 52 is preferably an arc as shown in FIG. By adopting such a shape, the spread angle of the fluorescent light flux that has passed through the additional optical system 50 does not increase in the lateral direction, so that the number of fields on the microscope body 10 side need not be increased.

また、蛍光合成部７０における導光方法は、顕微鏡本体１０と対物光学系４０の条件によって、以下の２通りの設定の仕方がある。
１つ目は、顕微鏡本体１０の視野が対物光学系４０の視野と比較して大きい場合であり、この場合には対物光学系４０の視野外に付加光学系５０からの蛍光を通すことが有利である。
２つ目は光検出器１７の検出領域が対物光学系４０で使用する領域よりも大きい場合であり、この場合には対物光学系４０の瞳の外側に付加光学系５０からの蛍光を通すことが有利である。 The light guide method in the fluorescence synthesizer 70 can be set in the following two ways depending on the conditions of the microscope main body 10 and the objective optical system 40.
The first is a case where the field of view of the microscope body 10 is larger than the field of view of the objective optical system 40. In this case, it is advantageous to pass the fluorescence from the additional optical system 50 outside the field of view of the objective optical system 40. It is.
The second case is when the detection area of the photodetector 17 is larger than the area used in the objective optical system 40. In this case, the fluorescence from the additional optical system 50 is passed outside the pupil of the objective optical system 40. Is advantageous.

以下、上記の蛍光合成部７０における導光方法について、それぞれの場合に分けて詳述する。
まず、１つ目の条件のときの蛍光合成部７０での光の条件設定、すなわち対物光学系４０の視野外に付加光学系５０の光を通す場合について説明する。
図２４および図２５は、蛍光の光路を示している。
図２４および図２５においてダイクロイックミラー１４と励起光カットフィルタは省略してある。また、実線は対物光学系４０の最大視野のマージナル光線、点線は付加光学系５０を通る光束を示している。また、符号８１は対物光学系４０の瞳面、符号８２はコリメートレンズ７１の瞳面を示している。 Hereinafter, the light guide method in the fluorescence synthesis unit 70 will be described in detail for each case.
First, the condition setting of the light in the fluorescence synthesizer 70 under the first condition, that is, the case where the light of the additional optical system 50 is passed outside the field of view of the objective optical system 40 will be described.
24 and 25 show the optical path of fluorescence.
24 and 25, the dichroic mirror 14 and the excitation light cut filter are omitted. A solid line indicates a marginal ray in the maximum field of view of the objective optical system 40, and a dotted line indicates a light beam passing through the additional optical system 50. Reference numeral 81 denotes the pupil plane of the objective optical system 40, and reference numeral 82 denotes the pupil plane of the collimating lens 71.

光ファイバ束５２の基端部とコリメートレンズ７１との位置関係は、コリメートレンズ７１の焦点と光ファイバ束５２の基端部を略一致させて、光ファイバの一点から出た光が略平行光束になるようにしてある。実際の光束の形は、光ファイバ束５２は面積をもっているので、複数の平行光束が角度を持って重なり合う形になる。 The positional relationship between the base end portion of the optical fiber bundle 52 and the collimating lens 71 is such that the focal point of the collimating lens 71 and the base end portion of the optical fiber bundle 52 are substantially coincided, and light emitted from one point of the optical fiber is substantially parallel. It is supposed to be. Since the optical fiber bundle 52 has an area, the shape of the actual light beam is a shape in which a plurality of parallel light beams overlap at an angle.

光ファイバ束５２の基端側から射出されて、コリメートレンズ７１で屈折された蛍光は、プリズム７２により、対物光学系４０の光束の外側に通るようになっている。
このときの光束の角度は以下のように設定している。 Fluorescence emitted from the base end side of the optical fiber bundle 52 and refracted by the collimator lens 71 passes through the outside of the light beam of the objective optical system 40 by the prism 72.
The angle of the light beam at this time is set as follows.

付加光学系５０を通る蛍光でコリメートレンズ７１から射出される光の光束のうち、対物光学系４０の光軸に対する角度が最も小さいもの（角度α）が、対物光学系４０の最大視野のマージナル光線の瞳位置での光軸に対する角度（β）よりも大きくなるように、プリズム７２、光ファイバ束５２の形状、コリメートレンズ７１の焦点距離などを設定する。 Among the light beams emitted from the collimating lens 71 by the fluorescence passing through the additional optical system 50, the light beam having the smallest angle with respect to the optical axis of the objective optical system 40 (angle α) is the marginal ray of the maximum field of view of the objective optical system 40. The shape of the prism 72 and the optical fiber bundle 52, the focal length of the collimating lens 71, etc. are set so as to be larger than the angle (β) with respect to the optical axis at the pupil position.

観察時は励起光の走査範囲を角度αより小さくする。例えば、図２４に示す例では、光ファイバ束５２の中心をコリメートレンズ７１に合わせ、コリメートレンズ７１の光軸を対物光学系４０の光軸に直交させ、プリズム７２の角度を対物光学系４０の光軸に対して少し外側に傾けることで、付加光学系５０の光束の角度が上記条件に当てはまるように設定している。 During observation, the scanning range of the excitation light is made smaller than the angle α. For example, in the example shown in FIG. 24, the center of the optical fiber bundle 52 is aligned with the collimating lens 71, the optical axis of the collimating lens 71 is orthogonal to the optical axis of the objective optical system 40, and the angle of the prism 72 is By tilting slightly outward with respect to the optical axis, the angle of the light beam of the additional optical system 50 is set to satisfy the above conditions.

なお、付加光学系５０の光束の角度の設定は、例えば、図２５に示すように、コリメートレンズ７１の光軸に対して光ファイバ束５２の基端部を偏心させる方法や、その他の方法でもよい。 The setting of the angle of the light beam of the additional optical system 50 may be performed by, for example, a method of decentering the proximal end portion of the optical fiber bundle 52 with respect to the optical axis of the collimating lens 71 as shown in FIG. Good.

光ファイバ束５２の基端部およびコリメートレンズ７１の位置は、以下のように設定する。付加光学系５０のコリメートレンズ７１から射出される蛍光の光束は、プリズム７２で反射されているので、対物光学系４０側へ投影して考える。
コリメートレンズ７１の瞳位置の設定は、ミラー７５によって対物光学系４０の光束を遮らない範囲で、対物光学系４０の瞳とできるだけ多く重なるようにするとよい。 The base end portion of the optical fiber bundle 52 and the position of the collimating lens 71 are set as follows. Since the fluorescent light beam emitted from the collimating lens 71 of the additional optical system 50 is reflected by the prism 72, it is considered to be projected onto the objective optical system 40 side.
The pupil position of the collimating lens 71 is preferably set so as to overlap as much as possible with the pupil of the objective optical system 40 within a range where the mirror 75 does not block the light beam of the objective optical system 40.

ここで、図２６は、上記設定をしたときの対物光学系４０および付加光学系５０を通った蛍光の光検出器１７上での分布である。符号７６は対物光学系４０を通った蛍光の投影範囲、符号７７は付加光学系５０を通った蛍光の投影範囲を示している。
上記の設定を行うことで、図２６に示すように、光検出器１７の中心付近に付加光学系５０を通った光を多く導くことができ、蛍光の検出効率を高めることができる。このように、付加光学系５０を通った蛍光を、対物光学系４０の視野外を通して光検出器１７まで到達させることができる。 Here, FIG. 26 shows the distribution of fluorescence on the photodetector 17 that has passed through the objective optical system 40 and the additional optical system 50 when the above settings are made. Reference numeral 76 denotes a projection range of fluorescence passing through the objective optical system 40, and reference numeral 77 denotes a projection range of fluorescence passing through the additional optical system 50.
By performing the above setting, as shown in FIG. 26, a large amount of light that has passed through the additional optical system 50 can be guided near the center of the photodetector 17, and the fluorescence detection efficiency can be increased. Thus, the fluorescence that has passed through the additional optical system 50 can reach the photodetector 17 through the outside of the field of view of the objective optical system 40.

次に、２つ目の条件のときの蛍光合成部７０での光の条件設定、すなわち対物光学系４０の瞳の外側に付加光学系５０の光を通す場合について説明する。
図２７は、光ファイバ束５２の基端部の中心とコリメートレンズ７１の光軸を一致させて、ミラー７５によりコリメートレンズ７１の光軸を顕微鏡本体１０側に直角に曲げている例を示している。また、符号８１は対物光学系４０の瞳面、符号８２はコリメートレンズ７１の瞳面、符号８３はコリメートレンズ７１の瞳相当面を示している。 Next, a description will be given of the light condition setting in the fluorescence synthesizer 70 under the second condition, that is, the case where the light of the additional optical system 50 is passed outside the pupil of the objective optical system 40.
FIG. 27 shows an example in which the center of the base end portion of the optical fiber bundle 52 and the optical axis of the collimating lens 71 are aligned, and the optical axis of the collimating lens 71 is bent at right angles to the microscope main body 10 side by the mirror 75. Yes. Reference numeral 81 denotes the pupil plane of the objective optical system 40, reference numeral 82 denotes the pupil plane of the collimating lens 71, and reference numeral 83 denotes the pupil equivalent plane of the collimating lens 71.

図２４および図２５との違いは、光ファイバ束５２の基端部、コリメートレンズ７１、ミラー７５の配置を変えて、コリメートレンズ７１から射出される蛍光（付加光学系５０を通る蛍光）の光束が対物光学系４０の光軸と平行になる成分を含むようにしている点である。 24 and 25 is different in the arrangement of the base end portion of the optical fiber bundle 52, the collimating lens 71, and the mirror 75, and the luminous flux emitted from the collimating lens 71 (fluorescence passing through the additional optical system 50). Includes a component that is parallel to the optical axis of the objective optical system 40.

まず、光ファイバ束５２の基端部およびコリメートレンズ７１の位置設定について説明する。
本実施形態では、コリメートレンズ７１の基端側の瞳位置（ミラー７５より先端側にある場合は瞳に相当する位置）を、光軸方向で対物光学系４０の瞳位置の近傍に配置している。また、横方向は、ミラー７５が対物光学系４０の最大視野の光束を遮らない範囲で、できるだけ光軸に近いところに互いの瞳が重ならないようにずらして配置している。 First, the position setting of the base end part of the optical fiber bundle 52 and the collimating lens 71 will be described.
In the present embodiment, the pupil position on the base end side of the collimating lens 71 (position corresponding to the pupil when it is on the front end side from the mirror 75) is arranged in the vicinity of the pupil position of the objective optical system 40 in the optical axis direction. Yes. Further, in the lateral direction, the mirrors 75 are arranged so as not to overlap each other as close to the optical axis as possible, as long as the mirror 75 does not block the light flux in the maximum field of view of the objective optical system 40.

図２８は、以上の設定をしたときの対物光学系４０および付加光学系５０を通った蛍光の光検出器１７上での分布である。光検出器１７上では、対物光学系４０と通った蛍光の周辺に付加光学系５０を通った蛍光が分布する形になる。ここで、符号７６は対物光学系４０を通った蛍光の投影範囲、符号７７は付加光学系５０を通った蛍光の投影範囲を示している。 FIG. 28 shows the distribution of fluorescence on the photodetector 17 that has passed through the objective optical system 40 and the additional optical system 50 when the above settings are made. On the photodetector 17, the fluorescence passing through the additional optical system 50 is distributed around the fluorescence passing through the objective optical system 40. Here, reference numeral 76 denotes a projection range of fluorescence passing through the objective optical system 40, and reference numeral 77 denotes a projection range of fluorescence passing through the additional optical system 50.

また、励起光が付加光学系５０に入らないように、すなわち励起光が光ファイバ束５２の基端部に達しないようにするため、コリメートレンズ７１とミラー７５との間に励起光カットフィルタ７８を設けることが望ましい。また、励起カットフィルタ７８の代わりに、ミラー７５を、励起光を透過させる一方で、多光子励起によって発生した蛍光を反射する特性にしてもよい。あるいは、励起光の瞳径を対物光学系４０の瞳径にできるだけ合わせて小さくして、付加光学系５０の瞳に入らないようにしてもよい。
上記の設定を行うことで、付加光学系５０を通った蛍光を、対物光学系４０の瞳の外側を通して光検出器１７まで到達させることができる。 Further, in order to prevent the excitation light from entering the additional optical system 50, that is, to prevent the excitation light from reaching the base end portion of the optical fiber bundle 52, the excitation light cut filter 78 is provided between the collimating lens 71 and the mirror 75. It is desirable to provide Further, instead of the excitation cut filter 78, the mirror 75 may transmit the excitation light while reflecting the fluorescence generated by the multiphoton excitation. Alternatively, the pupil diameter of the excitation light may be made as small as possible according to the pupil diameter of the objective optical system 40 so that it does not enter the pupil of the additional optical system 50.
By performing the above setting, the fluorescence that has passed through the additional optical system 50 can reach the photodetector 17 through the outside of the pupil of the objective optical system 40.

以上のように、本実施形態に係る蛍光観察装置５によれば、付加光学系５０を有していない蛍光観察装置でも、蛍光合成部７０を顕微鏡本体１０と対物光学系４０との間に挿入し、付加光学系５０の先端部を組み合わせて使うことで、画像のＳＮ比を向上することができる。これにより、標本Ａのより深い部分の観察が可能になる。 As described above, according to the fluorescence observation apparatus 5 according to the present embodiment, the fluorescence synthesis unit 70 is inserted between the microscope main body 10 and the objective optical system 40 even in the fluorescence observation apparatus that does not have the additional optical system 50. In addition, by using the tip portion of the additional optical system 50 in combination, the SN ratio of the image can be improved. Thereby, the deeper part of the specimen A can be observed.

また、対物光学系４０と付加光学系５０を別々の光検出器で検出する場合と比較して、光検出器に入る蛍光の光量が多くなるので、画像のＳＮ比を向上させることができる。これにより、標本Ａのより深い部分の観察が可能になる。また、光検出器１７からの情報を１つとすることができ、後に実行される電気的な処理（例えば画質向上のための処理）を簡易的なものとすることができる。 In addition, since the amount of fluorescent light entering the photodetector is increased compared to the case where the objective optical system 40 and the additional optical system 50 are detected by separate photodetectors, the SN ratio of the image can be improved. Thereby, the deeper part of the specimen A can be observed. Further, the information from the light detector 17 can be made one, and electrical processing (for example, processing for improving image quality) to be executed later can be simplified.

Ａ標本
１，２，３，３’，４，５蛍光観察装置
１０顕微鏡本体
１１レーザ光源
１２走査ミラー
１３リレー光学系
１４ダイクロイックミラー
１５励起光カットフィルタ
１６リレー光学系
１７光検出器（光検出部）
２０光検出ユニット
２１リレー光学系
２２励起光カットフィルタ
２３光検出器（光検出部）
３０光学系
３４集光点（ピント位置）
４０対物光学系
４１入射面
４２対物レンズ
４３細径先端部
４５有限系レンズ
４６有限系レンズ
５０付加光学系
５１蛍光取り込み窓（入射面）
５２光ファイバ束（導光部）
５３蛍光出口部
５４正レンズ
５５リレーレンズ（付加光学系リレーレンズ）
５６ミラー
６１中間結像面
６２アダプタレンズ
７０蛍光合成部（光合成手段）
７１コリメートレンズ（付加光学系コリメートレンズ）
７２プリズム（偏向素子）
７３中心部
７４周辺部
７５ミラー（偏向素子） A Specimen 1, 2, 3, 3 ′, 4, 5 Fluorescence observation apparatus 10 Microscope main body 11 Laser light source 12 Scanning mirror 13 Relay optical system 14 Dichroic mirror 15 Excitation light cut filter 16 Relay optical system 17 Photodetector (photodetection unit) )
20 Photodetector unit 21 Relay optical system 22 Excitation light cut filter 23 Photodetector (photodetector)
30 Optical system 34 Condensing point (focus position)
40 Objective optical system 41 Incident surface 42 Objective lens 43 Small diameter tip 45 Finite lens 46 Finite lens 50 Additional optical system 51 Fluorescence capturing window (incident surface)
52 Optical fiber bundle (light guide)
53 Fluorescent Exit Portion 54 Positive Lens 55 Relay Lens (Additional Optical System Relay Lens)
56 Mirror 61 Intermediate imaging plane 62 Adapter lens 70 Fluorescence synthesis unit (photosynthesis means)
71 Collimating lens (additional optical system collimating lens)
72 Prism (deflection element)
73 Center part 74 Peripheral part 75 Mirror (deflection element)

Claims

励起光を標本に照射する一方、前記標本からの蛍光を集光する対物光学系と、
該対物光学系の径方向外側に配置され、前記標本からの蛍光を取り込む付加光学系と、
前記対物光学系および前記付加光学系により集光された前記標本からの蛍光を検出する光検出部とを備え、
前記付加光学系が、前記標本からの蛍光の入射面である蛍光取り込み窓と、該蛍光取り込み窓に入射した蛍光を導光する導光部とを有し、
前記蛍光取り込み窓が、前記対物光学系の光軸に略垂直に形成され、前記対物光学系の先端の位置よりも該対物光学系の基端側に位置する蛍光観察装置。 An objective optical system that irradiates the sample with excitation light while condensing fluorescence from the sample;
An additional optical system that is arranged radially outside the objective optical system and captures fluorescence from the specimen;
A light detection unit that detects fluorescence from the specimen collected by the objective optical system and the additional optical system;
The additional optical system has a fluorescence capturing window that is an incident surface of fluorescence from the specimen, and a light guide unit that guides the fluorescence incident on the fluorescence capturing window,
The fluorescence observation apparatus, wherein the fluorescence capturing window is formed substantially perpendicular to the optical axis of the objective optical system, and is located closer to the base end side of the objective optical system than the position of the distal end of the objective optical system.

前記付加光学系の前記蛍光取り込み窓が、前記対物光学系の光軸方向に移動可能に設けられた請求項１に記載の蛍光観察装置。 The fluorescence observation apparatus according to claim 1, wherein the fluorescence capturing window of the additional optical system is provided so as to be movable in an optical axis direction of the objective optical system.

前記導光部が、光ファイバ束である請求項１又は請求項２に記載の蛍光観察装置。 The fluorescence observation apparatus according to claim 1, wherein the light guide unit is an optical fiber bundle.

前記付加光学系の前記蛍光取り込み窓が、前記対物光学系を中心とする環状の正レンズであり、
該環状の正レンズの前記標本側焦点が前記対物光学系の励起光の集光点と一致し、前記環状の正レンズの標本側と反対側の焦点が前記導光部の前記標本側面と一致する請求項１に記載の蛍光観察装置。 The fluorescence capturing window of the additional optical system is an annular positive lens centered on the objective optical system;
The specimen-side focal point of the annular positive lens coincides with the focal point of the excitation light of the objective optical system, and the focal point opposite to the specimen side of the annular positive lens coincides with the specimen side surface of the light guide unit. The fluorescence observation apparatus according to claim 1.

前記付加光学系の出口と略一致する面に、前記対物光学系により集光された蛍光の中間結像面を形成する有限系レンズと、
前記中間結像面からの蛍光と前記付加光学系の出口からの蛍光の両方の瞳の共役面を同一の前記光検出部に導くアダプタレンズとを備える請求項１に記載の蛍光観察装置。 A finite system lens that forms an intermediate image plane of fluorescence condensed by the objective optical system on a surface substantially coincident with the exit of the additional optical system;
The fluorescence observation apparatus according to claim 1, further comprising: an adapter lens that guides a conjugate plane of both pupils of the fluorescence from the intermediate imaging plane and the fluorescence from the exit of the additional optical system to the same light detection unit.

前記導光部の前記蛍光を射出する基端部と前記中間結像面が形成される位置との間に設けられ、前記導光部の基端部と共役な面を、前記付加光学系の出口として、前記中間結像面が形成される位置に形成する付加光学系リレーレンズを備える請求項５に記載の蛍光観察装置。 A surface that is provided between a base end portion that emits the fluorescence of the light guide portion and a position where the intermediate imaging plane is formed, and a surface that is conjugated with the base end portion of the light guide portion is disposed on the additional optical system. The fluorescence observation apparatus according to claim 5 , further comprising an additional optical system relay lens formed as an exit at a position where the intermediate imaging plane is formed.

前記対物光学系により集光された蛍光と前記付加光学系により取り込まれた蛍光とを合成する光合成手段を備え、
前記光合成手段が、励起光および前記対物光学系により集光された蛍光が通る中心部と、前記付加光学系により取り込まれた蛍光が通る周辺部とで構成され、
前記周辺部が、
前記導光部の前記蛍光を射出する基端部の蛍光を略平行にする形成する付加光学系コリメートレンズと、前記付加光学系コリメートレンズからの光を偏向する偏向素子とを有し、
前記付加光学系コリメートレンズの瞳位置が前記対物光学系の瞳と重なるように前記偏光素子が配置されている請求項１に記載の蛍光観察装置。 Comprising photosynthesis means for synthesizing the fluorescence condensed by the objective optical system and the fluorescence taken in by the additional optical system;
The photosynthesis means is composed of a central portion through which excitation light and fluorescence collected by the objective optical system pass, and a peripheral portion through which fluorescence taken in by the additional optical system passes,
The periphery is
An additional optical system collimating lens that forms the fluorescence of the base end portion that emits the fluorescence of the light guide portion to be substantially parallel; and a deflection element that deflects light from the additional optical system collimating lens,
The fluorescence observation apparatus according to claim 1, wherein the polarizing element is arranged so that a pupil position of the additional optical system collimating lens overlaps a pupil of the objective optical system.