JP5703545B2

JP5703545B2 - Fusion protein having photocatalytic activity

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Publication number: JP5703545B2
Application number: JP2009142087A
Authority: JP
Inventors: 井上　敏; 井上　　敏; 由依子佐原; 佐藤　淳一; 淳一佐藤
Original assignee: JNC Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 2009-06-15
Filing date: 2009-06-15
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2029-06-15
Also published as: JP2010284131A

Description

本発明は、２つの発光触媒活性を有する融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途に関する。より詳しくは、本発明は、ガウシアルシフェラーゼとカルシウム結合発光蛋白質の変異体との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途に関する。 The present invention relates to a fusion protein having two luminescent catalytic activities, a gene encoding the same, and uses thereof. More specifically, the present invention relates to a fusion protein of Gaussia luciferase and a calcium-binding photoprotein mutant, a gene encoding the same, and uses thereof.

カルシウム結合発光蛋白質は、アポ蛋白質と、発光基質のペルオキシドとが複合体を形成した状態で存在する発光蛋白質である。カルシウム結合発光蛋白質は、カルシウムイオンと結合すると瞬間的に発光するという性質を有している。 The calcium-binding photoprotein is a photoprotein that exists in a state where an apoprotein and a peroxide of a luminescent substrate form a complex. Calcium-binding photoprotein has the property of emitting light instantaneously when bound to calcium ions.

カルシウム結合発光蛋白質としては、イクオリン、オべリン、クライチィン、マイトロコミン、ミネオプシン、ベルボインなどが知られている。なかでもイクオリンはカルシウム結合発光蛋白質の代表的なものであり、その高次構造および発光メカニズムなどが詳細に報告されている（例えば、非特許文献１：Inouye et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3154−3158、非特許文献２：Head et al. (2000) Nature 405, 372−376など参照）。イクオリンのカルシウムイオンに対する感受性は非常に高いので、微量カルシウムイオンの検出・定量や細胞内カルシウムイオンの濃度変化の測定などに利用されている。 As a calcium-binding photoprotein, aequorin, oberin, criticine, mitrocomin, minneopsin, velvoin and the like are known. Among them, aequorin is a typical calcium-binding photoprotein, and its higher-order structure and luminescence mechanism have been reported in detail (for example, Non-Patent Document 1: Inouye et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3154-3158, Non-Patent Document 2: Head et al. (2000) Nature 405, 372-376, etc.). Since aequorin is very sensitive to calcium ions, it is used for detection and quantification of trace calcium ions and measurement of changes in intracellular calcium ion concentration.

イクオリンは、アポ蛋白質であるアポイクオリンと、発光基質セレンテラジンのペルオキシドとが複合体を形成した状態で存在している。イクオリンにカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示し、セレンテラジンの酸化物であるセレンテラミドと二酸化炭素を生成する。 Aequorin exists in a state in which apoaequorin, which is an apoprotein, and a luminescent substrate coelenterazine peroxide form a complex. When calcium ions bind to aequorin, it emits instantaneous light and produces coelenteramide, which is an oxide of coelenterazine, and carbon dioxide.

一方、ガウシアルシフェラーゼは、カイアシに属するガウシアに由来するルシフェラーゼであり、セレンテラジンを基質とする発光触媒活性を有する。ガウシアルシフェラーゼの遺伝子のアミノ酸配列（195アミノ酸）については、すでに報告されている（例えば、特許文献１：国際公開第99/49019号パンフレット）。また、ガウシアと同一種に含まれ、ガウシアルシフェラーゼと相同性を示すメトリデアルシフェラーゼ遺伝子およびアミノ酸配列（219アミノ酸）も、報告されている（例えば、非特許文献３：Markova, S. V. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 3212−3217）。 On the other hand, Gaussia luciferase is a luciferase derived from Gaussia belonging to copepod, and has a luminescent catalytic activity using coelenterazine as a substrate. The amino acid sequence (195 amino acids) of the gene for Gaussia luciferase has already been reported (for example, Patent Document 1: International Publication No. 99/49019 pamphlet). In addition, a trideluciferase gene and an amino acid sequence (219 amino acids) that are contained in the same species as Gaussia and show homology with Gaussia luciferase have also been reported (for example, Non-Patent Document 3: Markova, SV et al. ( 2004) J. Biol. Chem. 279, 3212-3217).

これらのカルシウム結合発光蛋白質、ルシフェラーゼなどの、発光触媒活性を有する蛋白質は、発光による検出マーカーやレポーター蛋白質などの用途に利用されている。 These calcium-binding photoproteins and luciferases and other proteins having photocatalytic activity are used for applications such as detection markers and reporter proteins by luminescence.

国際公開第99/49019号パンフレットInternational Publication No.99 / 49019 Pamphlet

Inouye et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3154−3158Inouye et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3154-3158 Head et al. (2000) Nature 405, 372−376Head et al. (2000) Nature 405, 372-376 Markova, S. V. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 3212−3217Markova, S. V. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 3212-3217

上記状況において、幅広い用途に利用できる発光触媒活性を有する物質が望まれている。 In the above situation, a substance having a luminescent catalytic activity that can be used in a wide range of applications is desired.

本発明者らは、ガウシアルシフェラーゼと、組換えアポイクオリンとの融合蛋白質を作製し、該融合蛋白質が、ガウシアルシフェラーゼまたはイクオリンを単独で用いる場合よりも、幅広い用途に利用できる発光触媒活性を有する物質であることなどを見出した。これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の融合蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体等を提供する。 The present inventors prepared a fusion protein of Gaussia luciferase and recombinant apoaequorin, and the fusion protein has a luminescent catalytic activity that can be used in a wide range of applications than when Gaussia luciferase or aequorin is used alone. It was found that it is a substance possessed. As a result of further studies based on these findings, the present invention has been completed.
That is, the present invention provides the following fusion proteins, polynucleotides, recombinant vectors, transformants, and the like.

[１] （１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１の領域：
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域、
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域、および、
（ｄ）配列番号：１の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域；と、
（２）以下の（ｅ）および（ｆ）からなる群から選択される第２の領域：
（ｅ）配列番号：４のアミノ酸配列において第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換した配列からなる領域、および、
（ｆ）配列番号：４のアミノ酸配列において、第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換し、該置換したシステインを除く１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；と、
を含有する融合蛋白質。
[２] （１）第１の領域が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群：
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域、
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域、および、
（ｄ）配列番号：１の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域；
から選択され、
（２）第２の領域が、以下の（ｅ）および（ｆ）からなる群：
（ｅ）配列番号：４のアミノ酸配列において第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換した配列からなる領域、および、
（ｆ）配列番号：４のアミノ酸配列において、第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換し、該置換システインを除く１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；
から選択される、上記[１]記載の融合蛋白質。
[３] 第２の領域が、以下の（ｅ）および（ｆ）からなる群：
（ｅ）配列番号：６のアミノ酸配列からなる領域、および、
（ｆ）配列番号：６のアミノ酸配列において、第１３９番目のシステインを除く１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；
から選択される、上記[１]記載の融合蛋白質。
[４] 第２の領域が、以下の（ｅ）および（ｆ）からなる群：
（ｅ）配列番号：６のアミノ酸配列からなる領域、および、
（ｆ）配列番号：６のアミノ酸配列において、第１３９番目のシステインを除く１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；
から選択される、上記[１]記載の融合蛋白質。
[５] （１）配列番号：２で表される第１のアミノ酸配列からなる領域と、
（２）配列番号：６で表される第２のアミノ酸配列からなる領域
とを含有する、上記[１]記載の融合蛋白質。
[６] さらに、翻訳促進のためのアミノ酸配列および／または精製のためのアミノ酸配列を含有する、上記[１]〜[５]のいずれかに記載の融合蛋白質。
[７] 配列番号：８のアミノ酸配列からなる、上記[１]記載の融合蛋白質。
[８] 上記[１]〜[７]のいずれかに記載の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドまたはセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質。
[９] 上記[１]〜[７]のいずれかに記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
[１０] （１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１のコード配列：
（ａ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および、
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；と、
（２）以下の（ｅ）〜（ｇ）からなる群から選択される第２のコード配列：
（ｅ）配列番号：３の塩基配列において第１番目〜第３番目のACA、第４番目〜第６番目のTCA、第１１２番目〜第１１４番目のTCT、第１４２番目〜１４４番目のACA、第２２０〜第２２２番目のACT、第２９８番目〜第３００番目のACG、第４１２番目〜第４１４番目のTCA、第４１５番目〜第４１７番目のTCAおよび第５１４番目〜第５１６番目のACCからなる群から選択される少なくとも１つの塩基がTGCまたはTGTと置換した塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：４のアミノ酸配列において、第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換した配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および、
（ｇ）配列番号：４のアミノ酸配列において、第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換し、該置換システインを除く１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
とを含有するポリヌクレオチド。
[１１] （１）第１のコード配列が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群：
（ａ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および、
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；から選択され、
（２）第２のコード配列が、以下の（ｅ）〜（ｇ）からなる群：
（ｅ）配列番号：３の塩基配列において第１番目〜第３番目のACA、第４番目〜第６番目のTCA、第１１２番目〜第１１４番目のTCT、第１４２番目〜１４４番目のACA、第２２０〜第２２２番目のACT、第２９８番目〜第３００番目のACG、第４１２番目〜第４１４番目のTCA、第４１５番目〜第４１７番目のTCAおよび第５１４番目〜第５１６番目のACCからなる群から選択される少なくとも１つの塩基がTGCまたはTGTと置換した塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：４のアミノ酸配列において第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換した配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および、
（ｇ）配列番号：４のアミノ酸配列において、第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換し、該置換システインを除く１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
から選択される、上記[１０]に記載のポリヌクレオチド。
[１２] 第２のコード配列が、以下の（ｅ）〜（ｇ）からなる群：
（ｅ）配列番号：５の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：６のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および、
（ｇ）配列番号：６のアミノ酸配列において第１３９番目のシステインを除く１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
から選択される、上記[１０]記載のポリヌクレオチド。
[１３] 配列番号：７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
[１４] 上記[９]〜[１３]のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
[１５] 上記[１４]記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
[１６] 上記[１５]記載の形質転換体を培養し、上記[１]〜[７]のいずれかに記載の融合蛋白質を生成させる工程を含む、上記[１]〜上記[７]のいずれかに記載の融合蛋白質の製造方法。
[１７] 上記[１]〜上記[７]のいずれかに記載の融合蛋白質または上記[８]に記載のホロ蛋白質を含むキット。
[１８] 上記[１]〜上記[７]のいずれかに記載の融合蛋白質または上記[８]に記載のホロ蛋白質を含むイムノアッセイ用キット。
[１９] 上記[１]〜上記[７]のいずれかに記載の融合蛋白質または上記[８]に記載のホロ蛋白質を使用してカルシウムイオンを検出または定量する方法。
[２０] 上記[１]〜上記[７]のいずれかに記載の融合蛋白質または上記[８]に記載のホロ蛋白質を用いたイムノアッセイ法。 [1] (1) A first region selected from the group consisting of the following (a) to (d):
(A) a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
(B) a region consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and having a luminescent catalytic activity using luciferin as a substrate;
(C) a region consisting of an amino acid sequence having 70% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a luminescence catalytic activity using luciferin as a substrate; and
(D) Luminescent catalytic activity comprising an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and using luciferin as a substrate A region having; and
(2) A second region selected from the group consisting of the following (e) and (f):
(E) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the first threonine, the second serine, the 38th serine, the 48th threonine, the 74th threonine, the 100th threonine, the 138th A region consisting of a sequence in which at least one amino acid selected from the group consisting of serine, 139th serine, and 172nd threonine is substituted with cysteine, and
(F) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the first threonine, the second serine, the 38th serine, the 48th threonine, the 74th threonine, the 100th threonine, the 138th At least one amino acid selected from the group consisting of the 1st serine, the 139th serine, and the 172nd threonine is substituted with cysteine, and one or more amino acids except the substituted cysteine are deleted or substituted A region having an amino acid sequence inserted and / or added and having a function capable of forming a holoprotein that emits light by the action of calcium ions by binding to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative;
A fusion protein containing
[2] (1) A group in which the first region is composed of the following (a) to (d):
(A) a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
(B) a region consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a luminescence catalytic activity using luciferin as a substrate;
(C) a region consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a luminescent catalytic activity using luciferin as a substrate, and
(D) A luminescent catalyst comprising an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that hybridizes under high stringency conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and using luciferin as a substrate A region having activity;
Selected from
(2) A group in which the second region is composed of the following (e) and (f):
(E) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the first threonine, the second serine, the 38th serine, the 48th threonine, the 74th threonine, the 100th threonine, the 138th A region consisting of a sequence in which at least one amino acid selected from the group consisting of serine, 139th serine, and 172nd threonine is substituted with cysteine, and
(F) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the first threonine, the second serine, the 38th serine, the 48th threonine, the 74th threonine, the 100th threonine, the 138th At least one amino acid selected from the group consisting of the 1st serine, the 139th serine, and the 172nd threonine is substituted with cysteine, and 1 to 10 amino acids except the substituted cysteine are deleted, substituted, A region having an inserted and / or added amino acid sequence and a function capable of forming a holoprotein that emits light by the action of calcium ions by binding to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative;
The fusion protein according to [1] above, selected from
[3] The second region is a group consisting of the following (e) and (f):
(E) a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and
(F) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids except the 139th cysteine are deleted, substituted, inserted and / or added, and a coelenterazine peroxide or coelenterazine derivative A region having a function capable of forming a holoprotein that binds to a peroxide and emits light by the action of calcium ions;
The fusion protein according to [1] above, selected from
[4] The group in which the second region is composed of the following (e) and (f):
(E) a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and
(F) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids excluding the 139th cysteine are deleted, substituted, inserted and / or added, and a coelenterazine peroxide or coelenterazine derivative A region having a function capable of forming a holoprotein that binds to a peroxide and emits light by the action of calcium ions;
The fusion protein according to [1] above, selected from
[5] (1) a region consisting of the first amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(2) The fusion protein according to [1] above, which comprises a region consisting of the second amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
[6] The fusion protein according to any one of [1] to [5] above, further comprising an amino acid sequence for promoting translation and / or an amino acid sequence for purification.
[7] The fusion protein according to [1] above, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
[8] A holoprotein comprising the fusion protein according to any one of [1] to [7] above and a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative.
[9] A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding the fusion protein according to any one of [1] to [7].
[10] (1) A first coding sequence selected from the group consisting of the following (a) to (d):
(A) a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1,
(B) containing a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a region having a luminescence catalytic activity using luciferin as a substrate. A polynucleotide,
(C) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and
(D) a poly which encodes a region having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a luminescent catalytic activity using luciferin as a substrate; A polynucleotide containing nucleotides; and
(2) A second coding sequence selected from the group consisting of the following (e) to (g):
(E) 1st to 3rd ACA, 4th to 6th TCA, 112th to 114th TCT, 142nd to 144th ACA in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 220th to 222nd ACT, 298th to 300th ACG, 412th to 414th TCA, 415th to 417th TCA, and 514th to 516th ACC A polynucleotide comprising a polynucleotide comprising a base sequence in which at least one base selected from the group is substituted with TGC or TGT;
(F) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the first threonine, the second serine, the 38th serine, the 48th threonine, the 74th threonine, the 100th threonine, the 138th A polynucleotide comprising a polynucleotide that encodes a region consisting of a sequence in which at least one amino acid selected from the group consisting of the th serine, the 139 th serine, and the 172 th threonine is substituted with cysteine, and
(G) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the first threonine, the second serine, the 38th serine, the 48th threonine, the 74th threonine, the 100th threonine, the 138th At least one amino acid selected from the group consisting of the first serine, the 139th serine, and the 172nd threonine is substituted with cysteine, and one or more amino acids except the substituted cysteine are deleted, substituted, Contains a polynucleotide that encodes a region consisting of an inserted and / or added amino acid sequence and having a function capable of forming a holoprotein that emits light by the action of calcium ions by binding to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative A polynucleotide to:
A polynucleotide comprising
[11] (1) A group in which the first coding sequence is composed of the following (a) to (d):
(A) a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1,
(B) a polynucleotide that encodes a region having a luminescent catalytic activity that hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under highly stringent conditions and uses luciferin as a substrate; A polynucleotide containing,
(C) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and
(D) a poly which encodes a region consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a luminescent catalytic activity using luciferin as a substrate; A polynucleotide containing nucleotides;
(2) The group in which the second coding sequence is composed of the following (e) to (g):
(E) 1st to 3rd ACA, 4th to 6th TCA, 112th to 114th TCT, 142nd to 144th ACA in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 220th to 222nd ACT, 298th to 300th ACG, 412th to 414th TCA, 415th to 417th TCA, and 514th to 516th ACC A polynucleotide comprising a polynucleotide comprising a base sequence in which at least one base selected from the group is substituted with TGC or TGT;
(F) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the first threonine, the second serine, the 38th serine, the 48th threonine, the 74th threonine, the 100th threonine, the 138th A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a region consisting of a sequence in which at least one amino acid selected from the group consisting of serine, 139th serine, and 172th threonine is substituted with cysteine, and
(G) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the first threonine, the second serine, the 38th serine, the 48th threonine, the 74th threonine, the 100th threonine, the 138th At least one amino acid selected from the group consisting of the first serine, the 139th serine, and the 172nd threonine is substituted with cysteine, and one or more amino acids except the substituted cysteine are deleted, substituted, Contains a polynucleotide that encodes a region consisting of an inserted and / or added amino acid sequence and having a function capable of forming a holoprotein that emits light by the action of calcium ions by binding to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative A polynucleotide to:
The polynucleotide according to [10] above, selected from:
[12] The group consisting of the following coding sequences (e) to (g):
(E) a polynucleotide containing a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 5,
(F) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and
(G) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids except the 139th cysteine are deleted, substituted, inserted and / or added, and a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative A polynucleotide containing a polynucleotide that encodes a region having a function capable of forming a holoprotein that emits light by the action of calcium ions by binding to a calcium ion;
The polynucleotide according to [10] above, selected from:
[13] A polynucleotide comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
[14] A recombinant vector containing the polynucleotide according to any one of [9] to [13].
[15] A transformant into which the recombinant vector according to [14] is introduced.
[16] Any one of [1] to [7] above, comprising culturing the transformant according to [15] and generating the fusion protein according to any one of [1] to [7]. A method for producing the fusion protein according to claim 1.
[17] A kit comprising the fusion protein according to any one of [1] to [7] above or the holoprotein according to [8] above.
[18] An immunoassay kit comprising the fusion protein according to any one of [1] to [7] above or the holoprotein according to [8] above.
[19] A method for detecting or quantifying calcium ions using the fusion protein according to any one of [1] to [7] above or the holoprotein according to [8] above.
[20] An immunoassay method using the fusion protein according to any one of [1] to [7] above or the holoprotein according to [8] above.

本発明は、ガウシアルシフェラーゼまたはイクオリンを単独で用いる場合よりも幅広い用途に利用できる発光触媒活性を有する融合蛋白質を提供する。本発明の好ましい態様の融合蛋白質は、例えば、イムノアッセイにおいて標的物質を検出するために使用することができる。 The present invention provides a fusion protein having a luminescent catalytic activity that can be used in a wider range of applications than when Gaussia luciferase or aequorin is used alone. The fusion protein of a preferred embodiment of the present invention can be used for detecting a target substance in, for example, an immunoassay.

図１は、ガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリン−S142C発現ベクター（pCold−GL−AQ−S142C）および発現融合蛋白質を示す図である。図１（ａ）は発現ベクターの概略図であり、図１（ｂ）は発現融合蛋白質のアミノ酸配列の概略図である。FIG. 1 is a diagram showing a Gaussia luciferase-apoiquorin-S142C expression vector (pCold-GL-AQ-S142C) and an expression fusion protein. FIG. 1 (a) is a schematic diagram of an expression vector, and FIG. 1 (b) is a schematic diagram of an amino acid sequence of an expression fusion protein. 図２は、精製ガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリン−S142CのSDS−PAGE分析の結果を示す図である。SDS−PAGE分析は、12％分離ゲルを用いて、95℃にて3分間熱処理後、電気泳動を行うことにより行った。各レーンの試料は次の通りである。レーン１：蛋白質分子量マーカー（テフコ社）としてβ−ガラクトシダーゼ（116,000）、ホスホリパーゼＢ（97,400）、ウシ血清アルブミン（69,000）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（55,000）、乳酸デヒドロゲナーゼ（36,500）、炭酸脱水素酵素（29,000）、トリプシンインヒビター（20,100）、レーン２：ニッケルキレートカラムからの溶出画分（蛋白質1.05μg）。FIG. 2 is a diagram showing the results of SDS-PAGE analysis of purified Gaussia luciferase-apoiquorin-S142C. SDS-PAGE analysis was performed by performing electrophoresis using a 12% separation gel after heat treatment at 95 ° C. for 3 minutes. Samples in each lane are as follows. Lane 1: β-galactosidase (116,000), phospholipase B (97,400), bovine serum albumin (69,000), glutamate dehydrogenase (55,000), lactate dehydrogenase (36,500), carbonic acid dehydrogenase (29,000) as protein molecular weight markers (Tefco) , Trypsin inhibitor (20,100), Lane 2: Elution fraction from a nickel chelate column (1.05 μg protein). ガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142C融合蛋白質の、蛋白質量と発光量の関係を示す図である。It is a figure which shows the relationship between the protein amount and the light-emission quantity of a Gaussia luciferase-aequorin-S142C fusion protein.

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
１．本発明の融合蛋白質
本発明の融合蛋白質とは、
配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域および配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域から選択される第１の領域と、
配列番号：４のアミノ酸配列において第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換した配列からなる第２の領域、または配列番号：４のアミノ酸配列において第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換した配列からなり、かつ配列番号：４のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する第２の領域とを含有する融合蛋白質を意味する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
1. Fusion protein of the present invention The fusion protein of the present invention is
A first region selected from a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a region having substantially the same activity or function as the region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the first threonine, the second serine, the 38th serine, the 48th threonine, the 74th threonine, the 100th threonine, the 138th serine, A second region consisting of a sequence in which at least one amino acid selected from the group consisting of the 139th serine and the 172nd threonine is substituted with cysteine, or the first threonine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 Second serine, 38th serine, 48th threonine, 74th threonine, 100th threonine, 138th serine, 139th serine, and 172th threonine A sequence in which at least one amino acid selected from the group is substituted with cysteine And SEQ ID NO: means fusion protein containing a second region having a region of four amino acid sequence substantially the same activity or function.

本明細書中、配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域および配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域から選択される第１の領域を、「ガウシアルシフェラーゼ」または「ＧＬ」と称することがある。また、配列番号：４のアミノ酸配列において第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換した配列からなる第２の領域、または配列番号：４のアミノ酸配列において第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換した配列からなり、かつ配列番号：４のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する第２の領域を、「組換えアポイクオリン」または「ＡＱ」と称することがある。 In the present specification, a first region selected from a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a region having substantially the same activity or function as the region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is referred to as “Gau It may be referred to as “sialuciferase” or “GL”. In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the first threonine, the second serine, the 38th serine, the 48th threonine, the 74th threonine, the 100th threonine, the 138th A second region consisting of a sequence in which at least one amino acid selected from the group consisting of serine, 139th serine and 172nd threonine is substituted with cysteine, or the first in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 Threonine, 2nd serine, 38th serine, 48th threonine, 74th threonine, 100th threonine, 138th serine, 139th serine, and 172nd A sequence in which at least one amino acid selected from the group consisting of threonine is substituted with cysteine Becomes, and SEQ ID NO: a second region having an area substantially the same activity or function of four of the amino acid sequence, may be referred to as "recombinant apoaequorin" or "AQ".

本発明の融合蛋白質において、第１の領域と第２の領域は、N末端−第１の領域−第２の領域−C末端の順に並んでいても良く、あるいは、N末端−第２の領域−第１の領域−C末端の順に並んでいても良い。好ましくは、N末端−第１の領域−第２の領域−C末端の順である。 In the fusion protein of the present invention, the first region and the second region may be arranged in the order of N-terminal-first region-second region-C-terminal, or N-terminal-second region. -1st area | region-You may arrange in order of C terminal. Preferably, the order is N-terminal-first region-second region-C-terminal.

本発明の融合蛋白質はさらに他のペプチド配列をＮ末端および／またはＣ末端、好ましくはＮ末端に含んでいてもよい。他のペプチド配列としては、例えば、精製のためのペプチド配列、分泌シグナルペプチド配列、抗体認識可能なエピトープ配列などからなる群から選択される少なくとも１つのペプチド配列を挙げることができる。他のペプチド配列は、好ましくは、精製のためのペプチド配列および／または分泌シグナルペプチド配列である。精製のためのペプチド配列としては、当技術分野において用いられているペプチド配列を使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、例えば、ヒスチジン残基が４残基以上、好ましくは６残基以上連続したアミノ酸配列を有するヒスチジンタグ配列、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインのアミノ酸配列またはプロテインＡのアミノ酸配列などが挙げられる。分泌シグナルペプチドとは、当該分泌シグナルペプチドに結合された蛋白質またはポリペプチドを、細胞膜透過させる役割を担うペプチド領域を意味する。このような分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列は、当技術分野において周知であり、報告されている（例えばvon Heijine G (1988) Biochim. Biohys. Acra 947: 307−333、von Heijine G (1990) J. Membr. Biol. 115: 195−201など参照）。分泌シグナルペプチドとしては、より具体的には、例えば、大腸菌の外膜蛋白質Ａ由来の分泌シグナルペプチド（OmpA）（Ghrayeb, J. et al. (1984) EMBO J. 3:2437−2442）、コレラ菌由来コレラトキシン由来の分泌シグナルペプチドなどが挙げられる。 The fusion protein of the present invention may further contain other peptide sequences at the N-terminus and / or C-terminus, preferably at the N-terminus. Examples of the other peptide sequence include at least one peptide sequence selected from the group consisting of a peptide sequence for purification, a secretory signal peptide sequence, an epitope sequence capable of recognizing an antibody, and the like. The other peptide sequence is preferably a peptide sequence for purification and / or a secretory signal peptide sequence. The peptide sequence used in this technical field can be used as the peptide sequence for purification. Examples of the peptide sequence for purification include a histidine tag sequence having an amino acid sequence of 4 or more, preferably 6 or more histidine residues, an amino acid sequence of a binding domain to glutathione of glutathione S-transferase, or Examples include protein A amino acid sequence. The secretory signal peptide means a peptide region that plays a role of allowing a protein or polypeptide bound to the secretory signal peptide to permeate the cell membrane. The amino acid sequences of such secretory signal peptides and the nucleic acid sequences encoding them are well known and reported in the art (eg von Heijine G (1988) Biochim. Biohys. Acra 947: 307-333, von Heijine G (1990) J. Membr. Biol. 115: 195-201). More specifically, examples of the secretion signal peptide include a secretion signal peptide (OmpA) derived from outer membrane protein A of E. coli (Ghrayeb, J. et al. (1984) EMBO J. 3: 2437-2442), cholera. Examples include secretory signal peptides derived from fungal cholera toxin.

本発明の融合蛋白質は、さらに、第１の領域と第２の領域の間を結ぶリンカーを含んでいても良い。リンカーの長さは、第１の領域の機能または活性および第２の領域の機能または活性を阻害しない限り特に制限されないが、例えば、アミノ酸１〜15個程度（例えば、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個）である。ここで、「第１の領域の機能または活性」とは、配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を意味する。また、「第２の領域の機能または活性」とは、配列番号：４のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を意味する。リンカーとしては、具体的には、−Leu−Glu−、-Gln−Phe−Met−、−Ser−Leu−Ser−Thr−Pro−Pro−Thr−Pro−Ser−Pro−Ser−Thr−Pro−Pro−、−Gly−Gly−Gly−Gly−Ser−Gly−Gly−Gly−Gly−Ser−Gly−Gly−Gly−Gly−Ser−などが挙げられる。好ましくは、−Leu−Glu−である。 The fusion protein of the present invention may further contain a linker that connects the first region and the second region. The length of the linker is not particularly limited as long as it does not inhibit the function or activity of the first region and the function or activity of the second region. For example, the length of the linker is about 1 to 15 amino acids (for example, 15, 14, 13 , 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 2 or 1). Here, the “function or activity of the first region” means substantially the same activity or function as the region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The “function or activity of the second region” means substantially the same activity or function as the region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. Specific examples of the linker include -Leu-Glu-, -Gln-Phe-Met-, -Ser-Leu-Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ser-Thr-Pro- Pro-, -Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser- and the like. Preferably, -Leu-Glu-.

本発明の融合蛋白質の取得方法については特に制限はない。本発明の融合蛋白質としては、化学合成により合成した融合蛋白質でもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換え融合蛋白質であってもよい。本発明の融合蛋白質を化学合成する場合には、例えば、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等により合成することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。本発明の融合蛋白質を遺伝子組換え技術により作製する場合には、通常の遺伝子組換え手法により作製することができる。より具体的には、本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛋白質を作製することができる。本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、本発明の融合蛋白質の発現系での発現などについては、後記する。 There is no restriction | limiting in particular about the acquisition method of the fusion protein of this invention. The fusion protein of the present invention may be a fusion protein synthesized by chemical synthesis or a recombinant fusion protein produced by a gene recombination technique. When the fusion protein of the present invention is chemically synthesized, it can be synthesized by, for example, the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), or the like. Chemical synthesis using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, PerkinElmer, Pharmacia, Protein Technology Instruments, Syntheselvega, Perceptive, Shimadzu, etc. You can also. When the fusion protein of the present invention is produced by a gene recombination technique, it can be produced by an ordinary gene recombination technique. More specifically, the fusion protein of the present invention can be prepared by introducing a polynucleotide (eg, DNA) encoding the fusion protein of the present invention into an appropriate expression system. The polynucleotide encoding the fusion protein of the present invention and the expression of the fusion protein of the present invention in the expression system will be described later.

（第１の領域）
第１の領域とは、配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域または配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域を意味する。 (First area)
The first region means a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a region having substantially the same activity or function as the region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能とは、例えば、ルシフェリン（例えば、セレンテラジン類）を基質とする発光触媒活性、すなわち、ルシフェリン（例えば、セレンテラジン類）が酸素分子で酸化されてオキシルシフェリンが励起状態で生成する反応を触媒する活性、を意味する。なお、励起状態で生成したオキシルシフェリンは可視光を発して基底状態となる。 The activity or function substantially the same as the region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is, for example, luminescent catalytic activity using luciferin (eg, coelenterazines) as a substrate, ie, luciferin (eg, coelenterazines) is oxygen It means an activity that catalyzes a reaction that is oxidized by a molecule to produce oxyluciferin in an excited state. Note that oxyluciferin generated in an excited state emits visible light and becomes a ground state.

本発明で用いられるルシフェリンとしては、本発明の融合蛋白質または本発明のホロ蛋白質の基質となりうるルシフェリンであればよい。本発明で用いられるルシフェリンとしては、具体的にはセレンテラジン類があげられる。 The luciferin used in the present invention may be luciferin that can serve as a substrate for the fusion protein of the present invention or the holoprotein of the present invention. Specific examples of luciferin used in the present invention include coelenterazines.

本明細書において、セレンテラジン類とは、セレンテラジンおよびセレンテラジン誘導体を意味する。セレンテラジン誘導体としては、例えば、h-セレンテラジン、hcp-セレンテラジン、cp-セレンテラジン、f-セレンテラジン、fcp-セレンテラジン、n-セレンテラジン、e-セレンテラジン、i-セレンテラジンch-セレンテラジンなどがあげられる。ルシフェリンを基質とする発光触媒活性もしくは機能は、例えば、後述の実施例に記載の方法などに従って測定することができる。尚、この時、第１の領域の発光触媒活性もしくは機能の測定は、第２の領域に由来する発光が生じるのを避けるため、カルシウムイオンと強く結合するキレート剤の存在下で行うのが好ましい。キレート剤の例として、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミノシクロヘキサンＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、又はＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）等を挙げることができる。 In the present specification, coelenterazines mean coelenterazine and coelenterazine derivatives. Examples of the coelenterazine derivative include h-coelenterazine, hcp-coelenterazine, cp-coelenterazine, f-coelenterazine, fcp-coelenterazine, n-coelenterazine, e-coelenterazine, i-coelenterazine, and the like. The luminescence catalytic activity or function using luciferin as a substrate can be measured, for example, according to the method described in the Examples below. At this time, the measurement of the luminescent catalytic activity or function of the first region is preferably performed in the presence of a chelating agent that strongly binds to calcium ions in order to avoid the occurrence of luminescence derived from the second region. . Examples of chelating agents include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ethylene glycol bis (β-aminoethyl ether) N, N, N ′, N′-tetraacetic acid (EGTA), trans-1,2-diaminocyclohexane N, N , N ′, N′-tetraacetic acid (CyDTA), N- (2-hydroxyethyl) iminodiacetic acid (HIDA), and the like.

第１の領域としては、より具体的には、例えば、
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域；
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域；
などが挙げられる。 More specifically, as the first region, for example,
(A) a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(B) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and is substantially the same as the region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. A region having the activity or function of
Etc.

本明細書において、「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列」における「１〜複数個」の範囲は、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。このような領域は、“Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)”、“Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987−1997)”、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。 In the present specification, the range of “1 to plural” in “an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added” is, for example, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6 (1 to several), 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2 One. In general, the smaller the number of amino acids deleted, substituted, inserted or added, the better. Two or more of the amino acid residue deletions, substitutions, insertions and additions may occur simultaneously. Such regions are described in “Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)”, “Ausbel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1- 38, John Wiley and Sons (1987-1997) ”,“ Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982) ”,“ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982) ”,“ Gene , 34, 315 (1985) ”,“ Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985) ”,“ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) ”, etc. It can be obtained using a mutagenesis method.

また、第１の領域としては、例えば、
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域、
も挙げられる。さらに、第１の領域としては、より具体的には、例えば、配列番号：２のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性もしくは機能を有する領域が挙げられる。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)、など参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。 In addition, as the first region, for example,
(C) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and about 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% More than 95%, more than 96%, more than 97%, more than 98%, or more than 99% identity amino acid sequence, and substantially the same activity as the region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Or a functional area,
Also mentioned. Furthermore, as the first region, more specifically, for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and about 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more of an amino acid sequence, and luciferin as a substrate And a region having a luminescent catalytic activity or function. In general, the larger the numerical value of identity, the better. The identity of amino acid sequences and base sequences can be determined using an analysis program such as BLAST (see, for example, Altzshul SF et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)). When using BLAST, the default parameters of each program are used.

さらに、第１の領域には、
（ｄ）配列番号：１の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域、
も含まれる。 Furthermore, the first area includes
(D) consisting of an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1, and from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. A region having substantially the same activity or function as the region
Is also included.

ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは配列番号：１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をいう。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Saline-sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。 Here, the “polynucleotide hybridizing under stringent conditions” refers to a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. A polynucleotide (for example, DNA) obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern hybridization method, or the like using all or part of the probe as a probe. Specifically, hybridization was performed at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 mol / L NaCl using a filter on which a polynucleotide derived from colony or plaque was immobilized, and then 0.1 to 2 Wash the filter at 65 ° C using double-concentration SSC (Saline-sodium citrate) solution (composition of single-concentration SSC solution is 150 mmol / L sodium chloride, 15 mmol / L sodium citrate) Polynucleotides that can be identified by:

ハイブリダイゼーションは、Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)、Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987-1997)、Glover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。 Hybridization is described in Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), Ausbel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley and Sons (1987-1997), Glover DM and Hames BD, DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995), etc. .

本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、42℃の条件である。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。具体的には、例えば、これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
As used herein, the “stringent conditions” may be any of low stringency conditions, moderate stringency conditions, and high stringency conditions. “Low stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% (w / v) SDS, 50% (v / v) formamide, 32 ° C. The “medium stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% (w / v) SDS, 50% (v / v) formamide, 42 ° C. The more stringent the conditions, the higher the complementarity required for duplex formation. Specifically, for example, it can be expected that a polynucleotide (eg, DNA) having high homology as the temperature is increased can be efficiently obtained under these conditions. However, multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered as factors that affect hybridization stringency. Those skilled in the art will select these factors as appropriate. It is possible to achieve similar stringency.

なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。 In addition, when using a commercially available kit for hybridization, Alkphos Direct Labeling Reagents (made by Amersham Pharmacia) can be used, for example. In this case, follow the protocol attached to the kit, incubate with the labeled probe overnight, and then wash the membrane with a primary wash buffer containing 0.1% (w / v) SDS at 55 ° C. , Hybridized DNA can be detected.

これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＢＬＡＳＴ等の解析プログラムにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.3％以上、99.5％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するＤＮＡをあげることができる。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、前述した方法を用いて決定できる。 As other polynucleotides that can be hybridized, a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and about 60% or more and 65% when calculated using the default parameters by an analysis program such as BLAST. 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 92% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.3% or more, Examples thereof include DNA having 99.5% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, or 99.9% or more identity. The identity of amino acid sequences and base sequences can be determined using the method described above.

（第２の領域）
第２の領域とは、配列番号：４のアミノ酸配列において第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換した配列からなる領域または配列番号：４において第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換した配列からなり、かつ配列番号：４のアミノ酸配列のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域を意味する。 (Second area)
The second region is the first threonine, second serine, 38th serine, 48th threonine, 74th threonine, 100th threonine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. A region consisting of a sequence in which at least one amino acid selected from the group consisting of 138th serine, 139th serine, and 172th threonine is substituted with cysteine, or the first threonine in SEQ ID NO: 4 Second serine, 38th serine, 48th threonine, 74th threonine, 100th threonine, 138th serine, 139th serine, and 172th threonine A sequence in which at least one amino acid selected from the group is substituted with cysteine, and Column number: refers to a region having a region substantially the same activity or function comprising the amino acid sequence of 4 amino acid sequence.

配列番号：４のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能とは、例えば、（i）第２の領域がセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合することができる機能、（ii）第２の領域がセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合して、カルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能、などを意味する。 The activity or function substantially the same as the region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is, for example, (i) a function in which the second region can bind to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative; ) Means that the second region is capable of forming a holoprotein that emits light by the action of calcium ions by binding to the peroxide of coelenterazine or the peroxide of a coelenterazine derivative.

「第２の領域がセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してホロ蛋白質を形成する」とは、（iii）第２の領域が、セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してホロ蛋白質を形成すること、だけではなく（iv）第２の領域が、酸素存在下に、セレンテラジンもしくはその誘導体と接触することにより、蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含有するホロ蛋白質（複合体）を形成すること、をも意味する。 “The second region binds to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative to form a holoprotein” (iii) The second region binds to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative to form a holoprotein (Iv) a holoprotein (composite) containing a protein and a coelenterazine peroxide or a peroxide of a coelenterazine derivative by contacting the second region with coelenterazine or a derivative thereof in the presence of oxygen. To form a body).

なお、発光の測定は、例えば、Shimomura 0.et al (1988) Biochem. J.251,405-410 およびShimomura 0.et al. Biochem. J. (1989)261, 913-920などに記載の方法によって測定することができる。具体的には、例えば、酸素存在下、前記領域にセレンテラジンもしくはセレンテラジン誘導体を結合させ、ホロ蛋白質を形成する。このとき、第１の領域に由来する発光が生じるのを避けるために、第１の領域を不活性型に変換するのが好ましい。不活性型に変換する方法としては、例えば、還元剤（例えば、メルカプトエタノール、ジチオスレイトールなど）を添加する方法などが挙げられる。このようにして形成したホロ蛋白質にカルシウム溶液を加えることにより、第２の領域に由来する発光反応を開始させることができる。さらに、発光測定装置を用いて発光活性または発光パターンを測定することができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えば、AB−2200(アトー社製)、Berthold960（ベルトール社製）などを使用することができる。 The luminescence is measured by the method described in, for example, Shimomura 0. et al (1988) Biochem. J. 251,405-410 and Shimomura 0. et al. Biochem. J. (1989) 261, 913-920. can do. Specifically, for example, coelenterazine or a coelenterazine derivative is bonded to the region in the presence of oxygen to form a holoprotein. At this time, in order to avoid light emission derived from the first region, it is preferable to convert the first region into an inactive type. Examples of the method of converting to an inactive type include a method of adding a reducing agent (for example, mercaptoethanol, dithiothreitol, etc.). By adding a calcium solution to the holoprotein thus formed, the luminescence reaction derived from the second region can be started. Furthermore, the luminescence activity or luminescence pattern can be measured using a luminescence measuring device. As the luminescence measuring device, commercially available devices such as AB-2200 (manufactured by ATTO), Berthold 960 (manufactured by Bertol), and the like can be used.

第２の領域としては、より具体的には、例えば、
（ｅ）配列番号：４のアミノ酸配列において第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換した配列からなる領域；
（ｆ）配列番号：４のアミノ酸配列において、第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換し、該置換したシステインを除く１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：４のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域；
などが挙げられる。 More specifically, as the second region, for example,
(E) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the first threonine, the second serine, the 38th serine, the 48th threonine, the 74th threonine, the 100th threonine, the 138th A region consisting of a sequence in which at least one amino acid selected from the group consisting of serine, 139th serine and 172nd threonine is substituted with cysteine;
(F) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the first threonine, the second serine, the 38th serine, the 48th threonine, the 74th threonine, the 100th threonine, the 138th At least one amino acid selected from the group consisting of the 1st serine, the 139th serine, and the 172nd threonine is substituted with cysteine, and one or more amino acids except the substituted cysteine are deleted or substituted A region consisting of an inserted and / or added amino acid sequence and having substantially the same activity or function as the region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
Etc.

システインと置換する上記「第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸」の例を以下に示す。 The above-mentioned “first threonine, second serine, 38th serine, 48th threonine, 74th threonine, 100th threonine, 138th serine, 139” An example of “at least one amino acid selected from the group consisting of the 1st serine and the 172nd threonine” is shown below.

（１）第１番目のトレオニン；
（２）第２番目のセリン；
（３）第３８番目のセリン；
（４）第４８番目のトレオニン；
（５）第７４番目のトレオニン；
（６）第１００番目のトレオニン；
（７）第１３８番目のセリン；
（８）第１３９番目のセリン；
（９）第１７２番目のトレオニン；
（１０）第７４番目のトレオニンと第１３８番目のセリンの２つのアミノ酸；
（１１）第４８番目のトレオニンと第７４番目のトレオニンと第１３８番目のセリンの３つのアミノ酸；または、
（１２）第４８番目のトレオニンと第７４番目のトレオニンと第１００番目のトレオニンと第１３８番目のセリンの４つのアミノ酸。 (1) the first threonine;
(2) the second serine;
(3) 38th serine;
(4) 48th threonine;
(5) 74th threonine;
(6) 100th threonine;
(7) 138th serine;
(8) The 139th serine;
(9) 172nd threonine;
(10) two amino acids of the 74th threonine and the 138th serine;
(11) three amino acids of the 48th threonine, the 74th threonine and the 138th serine; or
(12) Four amino acids of the 48th threonine, the 74th threonine, the 100th threonine, and the 138th serine.

システインと置換するアミノ酸は、好ましくは、（８）第１３９番目のセリンである。 The amino acid substituted for cysteine is preferably (8) the 139th serine.

本発明のいくつかの態様によれば、上記（ｅ）の領域は、配列番号：６のアミノ酸配列からなる領域である。配列番号：６のアミノ酸配列は、配列番号：４のアミノ酸配列において第１３９番目のセリンがシステインに置換された配列である。 According to some embodiments of the present invention, the region (e) is a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. The amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is a sequence in which the 139th serine is replaced with cysteine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

また、本発明のいくつかの態様によれば、上記（ｆ）の領域は、配列番号：６のアミノ酸配列において、第１３９番目のシステインを除く１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域である。 According to some embodiments of the present invention, in the region (f) above, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, one to a plurality of amino acids excluding the 139th cysteine are deleted, substituted, or inserted. And / or a region having an added amino acid sequence and a function capable of forming a holoprotein that emits light by the action of calcium ions by binding to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative.

上記「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加した」とは、同一配列中の任意かつ1若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じても良い。このような領域は、“Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)”、“Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987−1997)”、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。 The above “one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added” means that one or more amino acid residues are missing at any position in one or more amino acid sequences in the same sequence. It means loss, substitution, insertion and / or addition, and two or more of deletion, substitution, insertion and addition may occur simultaneously. Such regions are described in “Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)”, “Ausbel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1- 38, John Wiley and Sons (1987-1997) ”,“ Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982) ”,“ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982) ”,“ Gene , 34, 315 (1985) ”,“ Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985) ”,“ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) ”, etc. It can be obtained using a mutagenesis method.

以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。 Examples of amino acid residues that can be substituted with each other are shown below. Amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.

A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；
B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸；
C群：アスパラギン、グルタミン；
D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸；
E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン；
F群：セリン、トレオニン、ホモセリン；
G群：フェニルアラニン、チロシン。 Group A: leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine;
Group B: aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid;
Group C: asparagine, glutamine;
Group D: lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid;
Group E: proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline;
Group F: serine, threonine, homoserine;
Group G: phenylalanine, tyrosine.

ここで、「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列」における「１〜複数個」の範囲は、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。 Here, the range of “1 to plural” in “an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added” is, for example, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6 (1 to several), 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 1 It is a piece. In general, the smaller the number of amino acids deleted, substituted, inserted or added, the better.

また、「配列番号：４のアミノ酸配列において、第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換し、該置換したシステインを除く１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列」は、例えば、配列番号：４のアミノ酸配列において、第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換した配列と、約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、アミノ酸配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)、など参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。 “In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the first threonine, the second serine, the 38th serine, the 48th threonine, the 74th threonine, the 100th threonine, the 138th At least one amino acid selected from the group consisting of the 1st serine, the 139th serine, and the 172nd threonine is substituted with cysteine, and one or more amino acids except the substituted cysteine are deleted, substituted, The “inserted and / or added amino acid sequence” means, for example, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the first threonine, the second serine, the 38th serine, the 48th threonine, the 74th Threonine, 100th threonine, 138th serine, 139th serine, 172th threonine A sequence in which at least one amino acid selected from the group consisting of cysteine is substituted with cysteine, and about 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 91% or more, 92% An amino acid sequence having 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more identity. In general, the larger the numerical value of identity, the better. The identity of amino acid sequences can be determined using an analysis program such as BLAST (see, for example, Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)). When using BLAST, the default parameters of each program are used.

（第１の領域と第２の領域の組み合わせ）
本発明の融合蛋白質において、第１の領域と第２の領域の組み合わせの例を以下に示す。 (Combination of the first region and the second region)
In the fusion protein of the present invention, examples of combinations of the first region and the second region are shown below.

（１）第１の領域：上記（ａ）、および第２の領域：上記（ｅ）；
（２）第１の領域：上記（ａ）、および第２の領域：上記（ｆ）；
（３）第１の領域：上記（ｂ）、および第２の領域：上記（ｅ）；
（４）第１の領域：上記（ｂ）、および第２の領域：上記（ｆ）；
（５）第１の領域：上記（ｃ）、および第２の領域：上記（ｅ）；
（６）第１の領域：上記（ｃ）、および第２の領域：上記（ｆ）；
（７）第１の領域：上記（ｄ）、および第２の領域：上記（ｅ）；または、
（８）第１の領域：上記（ｄ）、および第２の領域：上記（ｆ）。 (1) First region: (a) above, and second region: (e) above;
(2) First region: (a) above, and second region: (f) above;
(3) First region: (b) above, and second region: (e) above;
(4) 1st area | region: said (b), and 2nd area | region: said (f);
(5) First region: (c) above, and second region: (e) above;
(6) First region: (c) above, and second region: (f) above;
(7) first region: (d) above and second region: (e) above; or
(8) First region: (d) above, and second region: (f) above.

上記組み合わせのうち、（１）第１の領域：上記（ａ）、および第２の領域：上記（ｅ）の組み合わせが好ましい。 Among the above combinations, the combination of (1) first region: (a) and second region: (e) is preferable.

本発明の融合蛋白質の具体例としては、例えば、配列番号：８のアミノ酸配列からなる融合蛋白質などがあげられる。 Specific examples of the fusion protein of the present invention include, for example, a fusion protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

（第２の領域のシステイン）
本発明の融合蛋白質では、第２の領域の配列番号：４のアミノ酸配列において第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸に対応するアミノ酸が、システインである。これらのシステインは、第２の領域の分子の表面に位置する。本発明の好ましい態様によれば、この分子の表面に位置するシステインのスルフヒドリル基（−SH）を介して、本発明の融合蛋白質を標的物質に結合することができる。本発明の融合蛋白質と標的物質との結合は、前記システインのスルフヒドリル基を介して、直接的な結合でも良く、あるいは、間接的な結合でも良い。本発明の融合蛋白質を標的物質に間接的に結合する場合、結合は、例えば、ビオチン／ビオチン結合蛋白質（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンなど）系、抗体／抗原系、レセプター／リガンド系などを利用して行うことができる。好ましくは、結合は、ビオチン／ビオチン結合蛋白質系、より好ましくは、ビオチン／ストレプトアビジン系を利用するものである。 (Second region of cysteine)
In the fusion protein of the present invention, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in the second region, the first threonine, the second serine, the 38th serine, the 48th threonine, the 74th threonine, The amino acid corresponding to at least one amino acid selected from the group consisting of the 100th threonine, the 138th serine, the 139th serine, and the 172nd threonine is cysteine. These cysteines are located on the surface of the molecule in the second region. According to a preferred embodiment of the present invention, the fusion protein of the present invention can be bound to the target substance via the sulfhydryl group (-SH) of cysteine located on the surface of this molecule. The bond between the fusion protein of the present invention and the target substance may be a direct bond or an indirect bond via the cysteine sulfhydryl group. When the fusion protein of the present invention is indirectly bound to the target substance, for example, biotin / biotin-binding protein (avidin, streptavidin, neutravidin, etc.) system, antibody / antigen system, receptor / ligand system, etc. are used. Can be done. Preferably, the binding utilizes a biotin / biotin binding protein system, more preferably a biotin / streptavidin system.

結合に、ビオチン／ビオチン結合蛋白質系を利用する場合、例えば、本発明の融合蛋白質をビオチンで修飾し、標的物質をビオチン結合蛋白質で修飾し、ビオチン／ビオチン結合蛋白質の複合体を形成させることにより、本発明の融合蛋白質と標的物質を結合することができる。あるいは、本発明の融合蛋白質をビオチンで修飾し、標的物質を認識する抗体をビオチンで修飾し、ビオチン／ビオチン結合物質／ビオチン修飾抗体をリンカーとして、本発明の融合蛋白質と標的物質を結合することもできる。 When a biotin / biotin-binding protein system is used for binding, for example, the fusion protein of the present invention is modified with biotin, the target substance is modified with a biotin-binding protein, and a biotin / biotin-binding protein complex is formed. The target substance can be bound to the fusion protein of the present invention. Alternatively, the fusion protein of the present invention is modified with biotin, the antibody that recognizes the target substance is modified with biotin, and the fusion protein of the present invention is bound to the target substance using a biotin / biotin-binding substance / biotin-modified antibody as a linker. You can also.

結合に、複合体形成による抗体／抗原系を利用する場合、例えば、本発明の融合蛋白質を抗体で修飾し、標的である抗原と複合体を形成させることにより、本発明の融合蛋白質と標的物質を結合することができる。 When an antibody / antigen system by complex formation is used for binding, for example, the fusion protein of the present invention is modified with an antibody to form a complex with the target antigen, whereby the fusion protein of the present invention and the target substance are formed. Can be combined.

結合に、複合体形成によるレセプター／リガンド系を利用する場合、例えば、本発明の融合蛋白質をレセプターまたはリガンドで修飾し、標的であるリがントまたはレセプターと複合体を形成させることにより、本発明の融合蛋白質と標的物質を結合することができる。 When a receptor / ligand system by complex formation is used for binding, for example, the fusion protein of the present invention is modified with a receptor or ligand to form a complex with a target ligand or receptor. The fusion protein and target substance can be bound.

２．本発明のポリヌクレオチド
本発明は、前述した本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明の融合蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、細胞・組織由来のｃＤＮＡ、細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡなどが挙げられる。ライブラリーに使用するベクターは、特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織からtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction（以下、RT-PCR法と略称する）によって増幅することもできる。 2. Polynucleotide of the Present Invention The present invention also provides a polynucleotide encoding the above-described fusion protein of the present invention. The polynucleotide of the present invention may be any polynucleotide as long as it contains the base sequence encoding the fusion protein of the present invention, but is preferably DNA. Examples of DNA include genomic DNA, genomic DNA library, cell / tissue-derived cDNA, cell / tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA. The vector used for the library is not particularly limited and may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Moreover, it can also be directly amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the aforementioned cells / tissues.

本発明のポリヌクレオチドには、
（１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１のコード配列：
（ａ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および、
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；と、
（２）以下の（ｅ）〜（ｊ）からなる群から選択される第２のコード配列：
（ｅ）配列番号：３の塩基配列において第１番目〜第３番目のACA、第４番目〜第６番目のTCA、第１１２番目〜第１１４番目のTCT、第１４２番目〜１４４番目のACA、第２２０〜第２２２番目のACT、第２９８番目〜第３００番目のACG、第４１２番目〜第４１４番目のTCA、第４１５番目〜第４１７番目のTCAおよび第５１４番目〜第５１６番目のACCからなる群から選択される少なくとも１つの塩基がTGCまたはTGTと置換した塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：４のアミノ酸配列において、第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換した配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および、
（ｇ）配列番号：４のアミノ酸配列において、第１番目のトレオニン、第２番目のセリン、第３８番目のセリン、第４８番目のトレオニン、第７４番目のトレオニン、第１００番目のトレオニン、第１３８番目のセリン、第１３９番目のセリン、および第１７２番目のトレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸がシステインと置換し、該置換システインを除く第１３９番目のアミノ酸を除く１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
とを含有するポリヌクレオチドなどが含まれる。 The polynucleotide of the present invention includes
(1) A first coding sequence selected from the group consisting of the following (a) to (d):
(A) a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1,
(B) containing a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a region having a luminescence catalytic activity using luciferin as a substrate. A polynucleotide,
(C) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and
(D) a poly which encodes a region having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a luminescent catalytic activity using luciferin as a substrate; A polynucleotide containing nucleotides; and
(2) A second coding sequence selected from the group consisting of the following (e) to (j):
(E) 1st to 3rd ACA, 4th to 6th TCA, 112th to 114th TCT, 142nd to 144th ACA in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 220th to 222nd ACT, 298th to 300th ACG, 412th to 414th TCA, 415th to 417th TCA, and 514th to 516th ACC A polynucleotide comprising a polynucleotide comprising a base sequence in which at least one base selected from the group is substituted with TGC or TGT;
(F) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the first threonine, the second serine, the 38th serine, the 48th threonine, the 74th threonine, the 100th threonine, the 138th A polynucleotide comprising a polynucleotide that encodes a region consisting of a sequence in which at least one amino acid selected from the group consisting of the th serine, the 139 th serine, and the 172 th threonine is substituted with cysteine, and
(G) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the first threonine, the second serine, the 38th serine, the 48th threonine, the 74th threonine, the 100th threonine, the 138th At least one amino acid selected from the group consisting of the 1st serine, the 139th serine, and the 172nd threonine is substituted with cysteine, and 1 to a plurality of amino acids excluding the 139th amino acid excluding the substituted cysteine A region having an amino acid sequence in which an amino acid is deleted, substituted, inserted and / or added, and having a function capable of forming a holoprotein that emits light by the action of calcium ions by binding to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative. A polynucleotide containing a polynucleotide encoding Reochido;
And the like.

本発明の好ましい態様によれば、上記（ｅ）のコード配列は、配列番号：５の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドである。配列番号：５の塩基配列は、第４１５番目〜第４１７番目のTCAをTGCと置換した塩基配列である。 According to a preferred embodiment of the present invention, the coding sequence of (e) above is a polynucleotide containing a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 5. The base sequence of SEQ ID NO: 5 is a base sequence obtained by replacing the 415th to 417th TCAs with TGC.

本発明の好ましい態様によれば、上記（ｆ）のコード配列は、配列番号：６のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドである。 According to a preferred embodiment of the present invention, the coding sequence (f) is a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.

本発明の好ましい態様によれば、上記（ｇ）のコード配列は、配列番号：６のアミノ酸配列において第１３９番目のシステインを除く１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドである。 According to a preferred embodiment of the present invention, in the coding sequence of (g) above, one to a plurality of amino acids excluding the 139th cysteine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 are deleted, substituted, inserted and / or added. A polynucleotide comprising a region encoding a region having a function of being capable of forming a holoprotein that emits light by the action of calcium ions by binding to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative. .

ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をいう。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Saline-sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。 Here, “a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions” refers to a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. A polynucleotide (for example, DNA) obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern hybridization method, or the like using all or part of the probe as a probe. Specifically, hybridization was performed at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 mol / L NaCl using a filter on which a polynucleotide derived from colony or plaque was immobilized, and then 0.1 to 2 Wash the filter at 65 ° C using double-concentration SSC (Saline-sodium citrate) solution (composition of single-concentration SSC solution is 150 mmol / L sodium chloride, 15 mmol / L sodium citrate) Polynucleotides that can be identified by:

これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、BLAST等の解析プログラムにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.3％以上、99.5％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、前述した方法を用いて決定できる。 As other polynucleotides that can be hybridized, the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is approximately 60% or more and 65% when calculated using the default parameters by an analysis program such as BLAST. 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 92% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.3% or more, Examples include DNA having 99.5% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, and 99.9% or more identity. The identity of amino acid sequences and base sequences can be determined using the method described above.

あるアミノ酸配列に対して、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有する領域をコードするポリヌクレオチドは、部位特異的変異導入法（例えば、Gotoh, T. et al., Gene 152, 271-275 (1995)、Zoller, M.J., and Smith, M., Methods Enzymol. 100, 468-500 (1983)、Kramer, W. et al., Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 (1984)、Kramer W, and Fritz H.J., Methods. Enzymol. 154, 350-367 (1987)、Kunkel,T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492 (1985)、Kunkel, Methods Enzymol. 85, 2763-2766 (1988)、など参照）、アンバー変異を利用する方法（例えば、Gapped duplex法、Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 (1984)、など参照）などを用いることにより得ることができる。 A polynucleotide encoding a region having an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added to a certain amino acid sequence can be obtained by site-directed mutagenesis (see, for example, Gotoh, T. et al. et al., Gene 152, 271-275 (1995), Zoller, MJ, and Smith, M., Methods Enzymol. 100, 468-500 (1983), Kramer, W. et al., Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 (1984), Kramer W, and Fritz HJ, Methods.Enzymol. 154, 350-367 (1987), Kunkel, TA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492 (1985), Kunkel, Methods Enzymol. 85, 2763-2766 (1988), etc.), a method using amber mutation (for example, see Gapped duplex method, Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 (1984), etc.) Can be obtained.

また目的の変異（欠失、付加、置換および／または挿入）を導入した配列をそれぞれの５’端に持つ１組のプライマーを用いたＰＣＲ（例えば、Ho S. N. et al., Gene 77, 51 (1989)、など参照）によっても、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。 PCR (for example, Ho SN et al., Gene 77, 51 (for example, Ho SN et al., Gene 77, 51 ( 1989), etc.) can also introduce mutations into polynucleotides.

本発明のポリヌクレオチドにおいて、第１のコード配列と第２のコード配列の組み合わせの例を以下に示す。
（１）第１のコード配列：上記（ａ）、および第２のコード配列：上記（ｅ）；
（２）第１のコード配列：上記（ａ）、および第２のコード配列：上記（ｆ）；
（３）第１のコード配列：上記（ａ）、および第２のコード配列：上記（ｇ）；
（４）第１のコード配列：上記（ｂ）、および第２のコード配列：上記（ｅ）；
（５）第１のコード配列：上記（ｂ）、および第２のコード配列：上記（ｆ）；
（６）第１のコード配列：上記（ｂ）、および第２のコード配列：上記（ｇ）；
（７）第１のコード配列：上記（ｃ）、および第２のコード配列：上記（ｅ）；
（８）第１のコード配列：上記（ｃ）、および第２のコード配列：上記（ｆ）；
（９）第１のコード配列：上記（ｃ）、および第２のコード配列：上記（ｇ）；
（１０）第１のコード配列：上記（ｄ）、および第２のコード配列：上記（ｅ）；
（１１）第１のコード配列：上記（ｄ）、および第２のコード配列：上記（ｆ）；または、
（１２）第１のコード配列：上記（ｄ）、および第２のコード配列：上記（ｇ）。 In the polynucleotide of the present invention, examples of combinations of the first coding sequence and the second coding sequence are shown below.
(1) First coding sequence: (a) above, and second coding sequence: (e) above;
(2) a first coding sequence: (a) above, and a second coding sequence: (f) above;
(3) First coding sequence: (a) above, and second coding sequence: (g) above;
(4) First coding sequence: (b) above, and second coding sequence: (e) above;
(5) First coding sequence: (b) above, and second coding sequence: (f) above;
(6) First coding sequence: (b) above, and second coding sequence: (g) above;
(7) First coding sequence: (c) above, and second coding sequence: (e) above;
(8) First coding sequence: (c) above, and second coding sequence: (f) above;
(9) First coding sequence: (c) above, and second coding sequence: (g) above;
(10) The first coding sequence: (d) above, and the second coding sequence: (e) above;
(11) the first coding sequence: (d) above, and the second coding sequence: (f) above; or
(12) First coding sequence: (d) above, and second coding sequence: (g) above.

上記組み合わせのうち、（１）第１のコード配列：上記（ａ）、および第２のコード配列：上記（ｅ）の組み合わせが好ましい。 Of the above combinations, the combination of (1) first coding sequence: (a) above and second coding sequence: (e) above is preferred.

本発明のポリヌクレオチドは、翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドおよび／または精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含んでいてもよい。翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、前記したものなどが挙げられる。精製のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、前記したものなどが挙げられる。 The polynucleotide of the present invention may include a polynucleotide containing a base sequence encoding an amino acid sequence for promoting translation and / or a polynucleotide containing a base sequence encoding a peptide sequence for purification. As the polynucleotide containing a base sequence encoding an amino acid sequence for promoting translation, a polynucleotide containing a base sequence encoding an amino acid sequence for promoting translation used in the art may be used. it can. Examples of the amino acid sequence for promoting translation include those described above. As a polynucleotide encoding a peptide sequence for purification, a polynucleotide containing a base sequence encoding a peptide sequence for purification used in the art can be used. Examples of the peptide sequence for purification include those described above.

本発明のポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、配列番号：８のアミノ酸配列からなる融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどがあげられる。配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなる融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどが挙げられる。 Specific examples of the polynucleotide of the present invention include a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a fusion protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. Examples of the polynucleotide containing a polynucleotide encoding a fusion protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 include a polynucleotide containing a polynucleotide consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7. .

３．本発明の組換えベクターおよび形質転換体
さらに、本発明は、上述した本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび形質転換体を提供する。 3. Recombinant vector and transformant of the present invention Furthermore, the present invention provides a recombinant vector and a transformant containing the above-described polynucleotide of the present invention.

（１）組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を連結(挿入)することにより得ることができる。より具体的には、精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入して、ベクターに連結することにより得ることができる。本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、動物ウイルス等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322, pBR325, pUC118, pUC119等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110, pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp24, YCp50等)などがあげられる。バクテリオファージとしては、例えば、λファージなどがあげられる。動物ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルスなど）などがあげられる。 (1) Production of recombinant vector The recombinant vector of the present invention can be obtained by ligating (inserting) the polynucleotide (DNA) of the present invention into an appropriate vector. More specifically, it can be obtained by cleaving a purified polynucleotide (DNA) with a suitable restriction enzyme, inserting it into a restriction enzyme site or a multiple cloning site of a suitable vector, and ligating the vector. The vector for inserting the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and examples thereof include plasmids, bacteriophages, animal viruses and the like. Examples of plasmids include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, etc.), plasmids derived from yeast (eg, YEp13, YEp24, YCp50, etc.), and the like. can give. Examples of the bacteriophage include λ phage. Examples of animal viruses include retroviruses, vaccinia viruses, insect viruses (eg, baculoviruses) and the like.

また、本発明においては、pCold Iベクター、pCold IIベクター、pCold IIIベクター、pCold IVベクター（以上、タカラバイオ社製）なども好適に使用することができる。これらのベクターを使用して、原核細胞を宿主として発現させた場合、本発明の融合蛋白質を宿主細胞の細胞質中に可溶性タンパク質として産生させることができる。 In the present invention, pCold I vector, pCold II vector, pCold III vector, pCold IV vector (manufactured by Takara Bio Inc.) and the like can also be suitably used. When these vectors are used to express a prokaryotic cell as a host, the fusion protein of the present invention can be produced as a soluble protein in the cytoplasm of the host cell.

本発明のポリヌクレオチドは、通常、適当なベクター中のプロモーターの下流に、発現可能なように連結される。用いられるプロモーターとしては、形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。 The polynucleotide of the present invention is usually operably linked downstream of a promoter in an appropriate vector. The promoter used is preferably an SV40-derived promoter, a retrovirus promoter, a metallothionein promoter, a heat shock promoter, a cytomegalovirus promoter, an SRα promoter or the like when the host to be transformed is an animal cell. When the host is Escherichia, a Trp promoter, T7 promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter and the like are preferable. When the host is Bacillus, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter and the like are preferable. When the host is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH1 promoter, GAL promoter, etc. are preferable. When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.

また、低温で発現誘導可能なプロモーターも好適に使用することができる。低温で発現誘導可能なプロモーター配列とは、宿主細胞を増殖させる培養条件から、温度を下げることによって蛋白質の発現を誘導可能なプロモーター配列を意味する。低温で発現誘導可能なプロモーターとしては、例えば、コールドショック遺伝子のプロモーター配列などが挙げられる。コールドショック遺伝子としては、例えば、大腸菌コールドショック遺伝子（例えば、ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、ｃｓｐＧ、ｃｓｐＩ、ｃｓｄＡなど）、Bacillus caldolyticusコールドショック遺伝子（例えば、Ｂｃ−Ｃｓｐなど）、Salmonella entericaコールドショック遺伝子（例えば、ｃｓｐＥなど）、Erwinia carotovoraコールドショック遺伝子（例えば、ｃｓｐＧなど）などが挙げられる。低温で発現誘導可能なプロモーターとしては、なかでも、例えば、ｃｓｐＡプロモーター、ｃｓｐＢプロモーター、ｃｓｐＧプロモーター、ｃｓｐＩプロモーター、ｃｓｄＡプロモーターなどを好適に使用することができる。 A promoter capable of inducing expression at a low temperature can also be suitably used. The promoter sequence capable of inducing expression at a low temperature means a promoter sequence capable of inducing protein expression by lowering the temperature under the culture conditions for growing host cells. Examples of the promoter capable of inducing expression at a low temperature include a promoter sequence of a cold shock gene. Examples of cold shock genes include E. coli cold shock genes (eg, cspA, cspB, cspG, cspI, csdA, etc.), Bacillus caldolyticus cold shock genes (eg, Bc-Csp, etc.), Salmonella enterica cold shock genes (eg, cspE, etc.). Erwinia carotovora cold shock gene (for example, cspG etc.) and the like. Among them, for example, a cspA promoter, a cspB promoter, a cspG promoter, a cspI promoter, a csdA promoter and the like can be suitably used as a promoter capable of inducing expression at a low temperature.

低温で発現誘導可能なプロモーターが蛋白質の発現を誘導しうる温度としては、通常３０℃以下、好ましくは２５℃以下、より好ましくは２０℃以下、特に好ましくは１５℃以下である。ただし、低温にしすぎると発現効率が低下するので、通常は５℃以上、好ましくは１０℃以上、特に好ましくは約１５℃で発現誘導させる。 The temperature at which a promoter capable of inducing expression at a low temperature can induce protein expression is usually 30 ° C. or lower, preferably 25 ° C. or lower, more preferably 20 ° C. or lower, and particularly preferably 15 ° C. or lower. However, since the expression efficiency decreases when the temperature is too low, the expression is usually induced at 5 ° C. or higher, preferably 10 ° C. or higher, particularly preferably about 15 ° C.

低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターを作製する場合、本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターとしては、pCold Iベクター、pCold IIベクター、pCold IIIベクター、pCold IVベクター（以上、タカラバイオ社製）などを好適に使用することができる。これらのベクターを使用して、原核細胞を宿主として発現させた場合、本発明の融合蛋白質を宿主細胞の細胞質中に可溶性蛋白質として産生させることができる。 When preparing an expression vector containing a promoter sequence capable of inducing expression at low temperature, vectors for inserting the polynucleotide of the present invention include pCold I vector, pCold II vector, pCold III vector, pCold IV vector (or more, (Takara Bio Inc.) can be preferably used. When these vectors are used to express prokaryotic cells as a host, the fusion protein of the present invention can be produced as a soluble protein in the cytoplasm of the host cell.

本発明の組換えベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（SD配列）、選択マーカーなどを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などがあげられる。 In addition to the above, the recombinant vector of the present invention may include those containing an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a ribosome binding sequence (SD sequence), a selection marker, and the like as desired. Examples of the selection marker include a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, and the like.

また、本発明の組換えベクターは、翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドおよび／または精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含んでいてもよい。翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、前記したものなどが挙げられる。精製のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、前記したものなどが挙げられる。 In addition, the recombinant vector of the present invention includes a polynucleotide containing a base sequence encoding an amino acid sequence for promoting translation and / or a polynucleotide containing a base sequence encoding a peptide sequence for purification. Also good. As the polynucleotide containing a base sequence encoding an amino acid sequence for promoting translation, a polynucleotide containing a base sequence encoding an amino acid sequence for promoting translation used in the art may be used. it can. Examples of the amino acid sequence for promoting translation include those described above. As a polynucleotide encoding a peptide sequence for purification, a polynucleotide containing a base sequence encoding a peptide sequence for purification used in the art can be used. Examples of the peptide sequence for purification include those described above.

（２）形質転換体の作成
このようにして得られた、本発明のポリヌクレオチド（すなわち、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチド）を含有する組換えベクターを、適当な宿主中に導入することによって、形質転換体を作成することができる。宿主としては、本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を発現できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、シュードモナス属菌、リゾビウム属菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などがあげられる。エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia
coli）などがあげられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などがあげられる。シュードモナス属菌としては、例えば、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)などがあげられる。リゾビウム属菌としては、例えば、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)などがあげられる。酵母としては、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などがあげられる。動物細胞としては、例えば、COS細胞、CHO細胞などがあげられる。昆虫細胞としては、例えば、Sf9、Sf21などがあげられる。 (2) Preparation of transformant The recombinant vector containing the polynucleotide of the present invention (that is, the polynucleotide encoding the protein of the present invention) thus obtained is introduced into a suitable host. Thus, a transformant can be prepared. The host is not particularly limited as long as it can express the polynucleotide (DNA) of the present invention. For example, Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Rhizobium, yeast, animal cells or Insect cells. Examples of the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli (Escherichia
coli). Examples of the genus Bacillus include Bacillus subtilis. Examples of Pseudomonas spp. Include Pseudomonas putida. Examples of the genus Rhizobium include Rhizobium meliloti. Examples of the yeast include Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Examples of animal cells include COS cells and CHO cells. Examples of insect cells include Sf9 and Sf21.

また、低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターを用いる場合、該発現ベクターを導入する宿主としては、原核細胞が好ましく、さらに大腸菌が好ましく、特にBL21株、JM109株が好ましく、なかでもBL21株が好ましい。 Further, when using an expression vector containing a promoter sequence capable of inducing expression at low temperature, the host into which the expression vector is introduced is preferably a prokaryotic cell, more preferably Escherichia coli, particularly BL21 strain and JM109 strain, The BL21 strain is preferred.

組換えベクターの宿主への導入方法およびこれによる形質転換方法は、一般的な各種方法によって行うことができる。組換えベクターの宿主細胞への導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（Virology, 52, 456-457 (1973)）、リポフェクション法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)）、エレクトロポレーション法（EMBO J., 1, 841-845 (1982)）などがあげられる。エシェリヒア属菌の形質転換方法としては、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)、Gene, 17, 107 (1982)などに記載の方法などがあげられる。バチルス属菌の形質転換方法としては、例えば、Molecular ＆ General Genetics，168, 111 (1979)に記載の方法などがあげられる。酵母の形質転換方法としては、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,７５,1929 (1978)に記載の方法などがあげられる。動物細胞の形質転換方法としては、例えば、Virology,52, 456 (1973)に記載の方法などがあげられる。昆虫細胞の形質転換方法としては、例えば、Bio/Technology, 6, 47-55 (1988)に記載の方法などがあげられる。このようにして、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチド（本発明のポリヌクレオチド）を含有する組換えベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。 The introduction method of the recombinant vector into the host and the transformation method thereby can be performed by various general methods. Examples of methods for introducing a recombinant vector into a host cell include the calcium phosphate method (Virology, 52, 456-457 (1973)) and the lipofection method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)). Electroporation method (EMBO J., 1, 841-845 (1982)). Examples of the transformation method of the genus Escherichia include the methods described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982) and the like. Examples of the method for transforming Bacillus include the method described in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979). Examples of yeast transformation methods include the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978). Examples of methods for transforming animal cells include the method described in Virology, 52, 456 (1973). Examples of the method for transforming insect cells include the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988). Thus, a transformant transformed with a recombinant vector containing a polynucleotide encoding the protein of the present invention (polynucleotide of the present invention) can be obtained.

４．本発明の融合蛋白質の製造
また、本発明は、前記形質転換体を培養し、本発明の融合蛋白質を生成させる工程を含む、本発明の融合蛋白質の製造方法を提供する。本発明の融合蛋白質は、前記形質転換体を本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が発現可能な条件下で培養し、本発明の融合蛋白質を生成・蓄積させ、分離・精製することによって製造することができる。 4). Production of fusion protein of the present invention The present invention also provides a method for producing the fusion protein of the present invention, comprising the steps of culturing the transformant to produce the fusion protein of the present invention. The fusion protein of the present invention is obtained by culturing the transformant under conditions capable of expressing a polynucleotide (eg, DNA) encoding the fusion protein of the present invention, producing and accumulating the fusion protein of the present invention, It can be manufactured by purification.

（形質転換体の培養）
本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該培養によって、形質転換体によって本発明の融合蛋白質が生成され、形質転換体内または培養液中などに本発明の融合蛋白質が蓄積される。 (Culture of transformants)
The transformant of the present invention can be cultured according to a usual method used for host culture. By the cultivation, the fusion protein of the present invention is produced by the transformant, and the fusion protein of the present invention is accumulated in the transformant or in the culture solution.

宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する培地としては、該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプンなどの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどが用いられる。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)などを、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)などを培地に添加してもよい。 As a medium for cultivating transformants whose hosts are Escherichia or Bacillus genus, it contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. necessary for the growth of the transformant, so that transformants can be cultured efficiently. Any natural or synthetic medium may be used as long as it can be performed automatically. As the carbon source, carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol are used. As the nitrogen source, ammonia, ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, or other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, corn steep liquor, and the like are used. Examples of inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate. During culture, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as necessary. When cultivating a transformant transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, when cultivating a transformant transformed with an expression vector using the Lac promoter, transformation by transforming isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) with an expression vector using the trp promoter When culturing the body, indoleacrylic acid (IAA) or the like may be added to the medium.

宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加える。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加える。 When the host is an Escherichia bacterium, the culture is usually carried out at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation is added. When the host is a genus Bacillus, the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation is added.

宿主が酵母である形質転換体を培養する培地としては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)）や０.５％(w/v)カザミノ酸を含有するＳＤ培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)）があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。 As a medium for cultivating a transformant whose host is yeast, for example, a Burkholder minimum medium (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)) or 0.5% (w / v ) SD medium containing casamino acid (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)). The pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. Culture is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation are added as necessary.

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する培地としては、たとえば約５〜２０％(v/v)の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Science, 122, 501 (1952)），ＤＭＥＭ培地（Virology, 8, 396 (1959)）などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。 As a medium for culturing a transformant whose host is an animal cell, for example, a MEM medium (Science, 122, 501 (1952)) containing about 5 to 20% (v / v) fetal calf serum, a DMEM medium (Virology) , 8, 396 (1959)). The pH is preferably about 6-8. The culture is usually performed at about 30 ° C. to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.

宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する培地としては、Grace's Insect Medium（Nature,195,788(1962)）に非働化した１０％(v/v)ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。 As a medium for cultivating transformants whose host is an insect cell, an appropriate addition of an additive such as 10% (v / v) bovine serum inactivated in Grace's Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962)) Is used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The culture is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.

また、低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターを用いた場合、該ベクターが導入された形質転換体を細胞増殖させる培養温度は、通常２５〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃である。発現誘導させる温度は、通常４〜２５℃、好ましくは１０〜２０℃、より好ましくは１２〜１８℃、特に好ましくは１５℃である。 When an expression vector containing a promoter sequence capable of inducing expression at a low temperature is used, the culture temperature for cell growth of the transformant introduced with the vector is usually 25 to 40 ° C., preferably 30 to 37 ° C. is there. The temperature for inducing expression is usually 4 to 25 ° C, preferably 10 to 20 ° C, more preferably 12 to 18 ° C, and particularly preferably 15 ° C.

（本発明の融合蛋白質の分離・精製）
上記培養物から、本発明の融合蛋白質を分離・精製することによって、本発明の融合蛋白質を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体もしくは培養細胞、または培養菌体もしくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明の融合蛋白質の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。 (Separation and purification of the fusion protein of the present invention)
The fusion protein of the present invention can be obtained by separating and purifying the fusion protein of the present invention from the culture. Here, the culture means any of a culture solution, cultured cells or cultured cells, or disrupted cultured cells or cultured cells. Separation and purification of the fusion protein of the present invention can be carried out according to ordinary methods.

具体的には、本発明の融合蛋白質が培養菌体内もしくは培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法（例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解など）で菌体もしくは細胞を破砕した後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により本発明の融合蛋白質の粗抽出液を得ることができる。本発明の融合蛋白質がペリプラズムスペース中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば浸透圧ショック法など）により本発明の融合蛋白質を含む抽出液を得ることができる。本発明の融合蛋白質が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により菌体もしくは細胞と培養上清とを分離することにより、本発明の融合蛋白質を含む培養上清を得ることができる。 Specifically, when the fusion protein of the present invention is accumulated in cultured cells or cultured cells, after culturing, the cells or cells are removed by a usual method (for example, ultrasonic, lysozyme, freeze-thaw, etc.). After crushing, a crude extract of the fusion protein of the present invention can be obtained by ordinary methods (eg, centrifugation, filtration, etc.). When the fusion protein of the present invention is accumulated in the periplasmic space, an extract containing the fusion protein of the present invention can be obtained by the usual method (for example, osmotic shock method) after completion of the culture. When the fusion protein of the present invention is accumulated in the culture solution, the cells or cells and the culture supernatant are separated from each other by a conventional method (for example, centrifugation, filtration, etc.) after completion of the culture. A culture supernatant containing the fusion protein of the invention can be obtained.

このようにして得られた抽出液もしくは培養上清中に含まれる本発明の融合蛋白質の精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。本発明の融合蛋白質が上述した精製のためのペプチド配列を含有する場合、これを用いて精製するのが好ましい。具体的には、本発明の融合蛋白質がヒスチジンタグ配列を含有する場合にはニッケルキレートアフィニティークロマト法、Ｓ−トランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインを含有する場合にはグルタチオン結合ゲルによるアフィニティークロマト法、プロテインＡのアミノ酸の配列を含有する場合には抗体アフィニティークロマト法を用いることができる。 Purification of the fusion protein of the present invention contained in the extract or culture supernatant thus obtained can be performed according to a conventional separation / purification method. Separation / purification methods include, for example, ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, dialysis, ultrafiltration, etc., alone or in appropriate combination. be able to. When the fusion protein of the present invention contains the above-described peptide sequence for purification, it is preferably purified using this. Specifically, when the fusion protein of the present invention contains a histidine tag sequence, nickel chelate affinity chromatography, and when it contains a binding domain to glutathione of S-transferase, affinity chromatography using glutathione binding gel, protein When the amino acid sequence of A is contained, antibody affinity chromatography can be used.

５．発光方法
５．１．第１の領域による発光方法
本発明の融合蛋白質の第１の領域による発光方法について、以下に説明する。
第１の領域は、ルシフェリン（例えば、セレンテラジン類）を酸素分子で酸化して励起状態のオキシルシフェリンを生成させる反応を触媒する活性を有する。励起状態のオキシルシフェリンは、基底状態となる際に可視光を発する。すなわち、第１の領域は、ルシフェリンを基質とする発光反応を触媒し、発光を生じさせる活性を有する。 5. Luminescent method 5.1. Luminescence method by the first region The luminescence method by the first region of the fusion protein of the present invention will be described below.
The first region has an activity of catalyzing a reaction in which luciferin (for example, coelenterazines) is oxidized with oxygen molecules to generate excited oxyluciferin. Excited oxyluciferin emits visible light when it reaches the ground state. That is, the first region has an activity of catalyzing a luminescence reaction using luciferin as a substrate and generating luminescence.

第１の領域における、ルシフェリンを基質とする発光反応は、本発明の融合蛋白質とルシフェリンとを接触させることにより行うことができる。反応条件としては、ガウシアルシフェラーゼを用いた発光反応に通常用いられる条件またはそれに準じた条件で行うことができる（例えば、WO99/49019、J. Biol. Chem. 279, 3212-3217 (2004)、およびそれらの引用文献など参照）。 The luminescence reaction using luciferin as a substrate in the first region can be performed by bringing the fusion protein of the present invention into contact with luciferin. As the reaction conditions, it can be carried out under conditions usually used for luminescence reaction using Gaussia luciferase or conditions based thereon (for example, WO99 / 49019, J. Biol. Chem. 279, 3212-3217 (2004), And their references).

具体的には、反応溶媒としては、例えば、Tris−HCl緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液などの緩衝液、水、などが用いられる。 Specifically, as the reaction solvent, for example, a buffer such as a Tris-HCl buffer or a sodium phosphate buffer, water, or the like is used.

反応温度は、通常約１０℃〜約４０℃、好ましくは約２０℃〜約４０℃である。 The reaction temperature is generally about 10 ° C to about 40 ° C, preferably about 20 ° C to about 40 ° C.

反応溶液のｐＨは、通常約５〜約１０、好ましくは約６〜約９、より好ましくは約７〜約８、特に好ましくは約７．５である。 The pH of the reaction solution is usually about 5 to about 10, preferably about 6 to about 9, more preferably about 7 to about 8, and particularly preferably about 7.5.

ルシフェリンとしては、セレンテラジン類が好ましく、特にセレンテラジンが好ましい。 As luciferin, coelenterazines are preferable, and coelenterazine is particularly preferable.

ルシフェリンは、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホオキシド等の極性溶媒や、メタンール、エタノール、ブタノール等のアルコール溶液として反応系に加えてもよい。 Luciferin may be added to the reaction system as a polar solvent such as dimethylformamide or dimethylsulfoxide, or an alcohol solution such as methanol, ethanol or butanol.

尚、第１の領域の発光反応と第２の領域の発光反応が同時に生じるのを避けたい場合には、第１の領域の発光反応を、カルシウムイオンと強く結合するキレート剤の存在下で行うのが好ましい。キレート剤の例として、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミノシクロヘキサンＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、又はＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）等を挙げることができる。このとき反応系に加えるキレート剤の量は、例えば、1 mMから10 mMである。 When it is desired to avoid the light emission reaction in the first region and the light emission reaction in the second region at the same time, the light emission reaction in the first region is performed in the presence of a chelating agent that strongly binds to calcium ions. Is preferred. Examples of chelating agents include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ethylene glycol bis (β-aminoethyl ether) N, N, N ′, N′-tetraacetic acid (EGTA), trans-1,2-diaminocyclohexane N, N , N ′, N′-tetraacetic acid (CyDTA), N- (2-hydroxyethyl) iminodiacetic acid (HIDA), and the like. At this time, the amount of the chelating agent added to the reaction system is, for example, 1 mM to 10 mM.

５．２．第２の領域による発光方法
また、本発明の融合蛋白質の第２の領域による発光方法について、以下に説明する。
本発明の融合蛋白質は、第２の領域により、セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合して、カルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる。 5.2. Luminescence method by the second region The luminescence method by the second region of the fusion protein of the present invention will be described below.
The fusion protein of the present invention can form a holoprotein that emits light by the action of calcium ions by binding to the peroxide of coelenterazine or the peroxide of a coelenterazine derivative in the second region.

本発明のホロ蛋白質は、本発明の融合蛋白質とセレンテラジンまたはその誘導体とから、公知のカルシウム結合発光蛋白質（例えば、イクオリンなど）と同様にして製造することができる。すなわち、本発明のホロ蛋白質は、例えば、Shimomura 0.et al (1988) Biochem. J.251,405-410およびShimomura 0.et al. Biochem. J. (1989)261, 913-920などに記載の方法によって調製できる。より具体的には、例えば、本発明のホロ蛋白質は、精製した本発明の融合蛋白質を、還元剤（たとえばメルカプトエタノール、ジチオスレイトールなど）および酸素の存在下、発光基質であるセレンテラジンもしくはその誘導体と低温でインキュベーションすることにより、カルシウムイオン濃度依存的に発光するホロ蛋白質（発光蛋白質）を調製することができる。還元剤を加えることで、ホロ蛋白質の調製の間に第１の領域に由来する発光が生じるのを避けることができる。 The holoprotein of the present invention can be produced from the fusion protein of the present invention and coelenterazine or a derivative thereof in the same manner as known calcium-binding photoproteins (eg, aequorin). That is, the holoprotein of the present invention can be obtained by, for example, the methods described in Shimomura 0. et al (1988) Biochem. J. 251, 405-410 and Shimomura 0. et al. Biochem. J. (1989) 261, 913-920. Can be prepared. More specifically, for example, the holoprotein of the present invention is obtained by converting the purified fusion protein of the present invention into coelenterazine or a derivative thereof as a luminescent substrate in the presence of a reducing agent (for example, mercaptoethanol, dithiothreitol, etc.) and oxygen. And holoprotein that emits light in a calcium ion concentration-dependent manner (photoprotein) can be prepared. By adding a reducing agent, it is possible to avoid luminescence originating from the first region during the preparation of the holoprotein.

セレンテラジンまたはその誘導体としては、例えば、セレンテラジン、h-セレンテラジン、e-セレンテラジン、i-セレンテラジン、ch-セレンテラジン、hcp-セレンテラジンなどが挙げられ、好ましくは、セレンテラジンである。 Examples of coelenterazine or derivatives thereof include coelenterazine, h-coelenterazine, e-coelenterazine, i-coelenterazine, ch-coelenterazine, hcp-coelenterazine, and preferably coelenterazine.

本発明のホロ蛋白質としては、例えば、本発明の融合蛋白質とh-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とe-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とi-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とch-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とhcp-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質などが挙げられる。 Examples of the holoprotein of the present invention include a holoprotein comprising the fusion protein of the present invention and a peroxide of h-coelenterazine, a holoprotein comprising the fusion protein of the present invention and a peroxide of e-coelenterazine, and the fusion protein of the present invention. Examples include a holoprotein comprising i-coelenterazine peroxide, a holoprotein comprising the fusion protein of the present invention and ch-coelenterazine peroxide, and a holoprotein comprising the fusion protein of the present invention and hcp-coelenterazine peroxide.

本発明のホロ蛋白質にカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示し、セレンテラジンまたはその類縁体の酸化物であるセレンテラミドまたはその類縁体と二酸化炭素を生成する。 When calcium ion binds to the holoprotein of the present invention, it emits light instantaneously and produces coelenteramide or its analog, which is an oxide of coelenterazine or its analog, and carbon dioxide.

カルシウムイオンが結合することにより生じる発光反応は、本発明のホロ蛋白質とカルシウムイオンとを接触させることにより行うことができる。反応条件としては、イクオリンを用いた発光反応に通常用いられる条件またはそれに準じた条件で行うことができる（例えば、文献Shimomura 0.et al (1988) Biochem. J.251,405-410およびShimomura 0.et al. Biochem. J. (1989)261など参照）。 The luminescence reaction caused by the binding of calcium ions can be performed by bringing the holoprotein of the present invention into contact with calcium ions. The reaction can be carried out under the conditions usually used for luminescence reaction using aequorin or conditions based thereon (for example, the literature Shimomura 0. et al (1988) Biochem. J.251,405-410 and Shimomura 0.et). al. Biochem. J. (1989) 261).

反応溶液のｐＨは、通常約6.5〜約9.0、好ましくは約7.0〜約7.5である。 The pH of the reaction solution is usually about 6.5 to about 9.0, preferably about 7.0 to about 7.5.

カルシウムイオンは、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウムなどとして、反応系に加えることができ、特に塩化カルシウムとして反応系に加えるのが好ましい。反応系に加えるカルシウムイオンの量は、例えば、最終濃度が10mM 以上である。 Calcium ions can be added to the reaction system as calcium chloride, calcium carbonate, calcium sulfate, etc., and it is particularly preferable to add calcium ion to the reaction system as calcium chloride. The amount of calcium ions added to the reaction system is, for example, a final concentration of 10 mM or more.

６．本発明の融合蛋白質またはホロ蛋白質の利用
（発光による検出マーカーとしての利用）
本発明の融合蛋白質またはホロ蛋白質（以下、本発明の融合蛋白質等と記載する。）は、発光による検出マーカーとして利用することができる。本発明の検出マーカーは、例えば、イムノアッセイまたはハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用することができる。本発明の融合蛋白質等を化学修飾法など通常用いられる方法により目的物質（例えば、目的蛋白質、目的核酸など）と結合させて使用することができる。この場合、本発明の融合蛋白質が、第１の領域に由来する発光と第２の領域に由来する発光の２つの発光を生じることができることから、次のように利用することができる。イムノアッセイ系において、本発明の融合蛋白質と目的物質との複合体を形成させた後、最初に、瞬間発光する発光蛋白質の発光活性（第２の領域の発光活性）をカルシウム水溶液添加により測定する。発光反応終了後、ルシフェラーゼの発光基質セレンテラジン溶液を添加することにより、ルシフェラーゼ（第１の領域）の発光活性を測定する。このことにより、目的物質を２つの方法で評価測定することができる。また、逆にルシフェラーゼの発光活性を測定した後に発光蛋白質活性を測定することも可能である。イムノアッセイ法において、目的物質を２つの方法で評価測定することにより、１つの方法で評価測定したときと比較して精度の高い測定結果を得ることができるなどといった利点がある。 6). Use of the fusion protein or holoprotein of the present invention (use as a detection marker by luminescence)
The fusion protein or holoprotein of the present invention (hereinafter referred to as the fusion protein of the present invention) can be used as a detection marker by luminescence. The detection marker of the present invention can be used for detecting a target substance in, for example, an immunoassay or a hybridization assay. The fusion protein of the present invention can be used by binding to a target substance (eg, target protein, target nucleic acid, etc.) by a commonly used method such as a chemical modification method. In this case, since the fusion protein of the present invention can generate two luminescences, that is, luminescence derived from the first region and luminescence derived from the second region, it can be used as follows. In the immunoassay system, after the complex of the fusion protein of the present invention and the target substance is formed, first, the luminescence activity of the photoprotein that emits light instantaneously (the luminescence activity of the second region) is measured by adding an aqueous calcium solution. After completion of the luminescence reaction, the luminescence activity of luciferase (first region) is measured by adding a luciferase luminescent substrate coelenterazine solution. Thus, the target substance can be evaluated and measured by two methods. Conversely, the photoprotein activity can be measured after measuring the luminescence activity of luciferase. In the immunoassay method, there is an advantage that a measurement result with higher accuracy can be obtained by evaluating and measuring a target substance by two methods as compared with the case of evaluating and measuring by one method.

また、本発明の検出マーカーは、例えば、本発明の融合蛋白質自身として、または目的蛋白質との複合体を形成可能なリガンドをもつ本発明の融合蛋白質として調製し、調製した融合蛋白質をマイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入することによって、前記目的蛋白質の分布を測定するために利用することもできる。このような目的蛋白質などの分布の測定は、発光イメージング等の検出法などを利用して行うこともできる。なお、本発明の融合蛋白質は、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることもできる。 The detection marker of the present invention is prepared, for example, as the fusion protein of the present invention itself or as the fusion protein of the present invention having a ligand capable of forming a complex with the target protein, and the prepared fusion protein is microinjected. It can also be used to measure the distribution of the target protein by introducing it into the cell by such a method as described above. Such measurement of the distribution of the target protein or the like can also be performed using a detection method such as luminescence imaging. In addition, the fusion protein of the present invention can be expressed in a cell and used in addition to being introduced into a cell by a technique such as a microinjection method.

この場合、本発明の融合蛋白質が、第１の領域に由来する発光と第２の領域に由来する発光の２つの発光を生じることができることから、例えば、次のように利用することができる。 In this case, since the fusion protein of the present invention can generate two luminescences, that is, luminescence derived from the first region and luminescence derived from the second region, it can be used as follows, for example.

G−蛋白質共役レセプターに対するアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする創薬スクリーニングにおいて、細胞内のカルシウムイオン分布の変化を、細胞内に導入した本発明のホロ蛋白質による瞬間発光を利用することにより検出することができ、さらに、ホロ蛋白質（融合蛋白質）の細胞内分布を、細胞外より発光基質（例えば、セレンテラジン）を添加することによるルシフェラーゼ発光を利用することにより可視化することが可能である。このように、カルシウムイオンの細胞内分布の変化に加え、ホロ蛋白質（融合蛋白質）の細胞内分布も検出することができるので、G−蛋白質共役レセプターに関連する疾患の創薬スクリーニングにおいて、レポーター分子の細胞内の測定部位を特定できるという利点がある。 In drug discovery screening for agonists or antagonists for G-protein coupled receptors, changes in intracellular calcium ion distribution can be detected by using instantaneous luminescence by the holoprotein of the present invention introduced into the cells. Furthermore, the intracellular distribution of the holoprotein (fusion protein) can be visualized by utilizing luciferase luminescence by adding a luminescent substrate (for example, coelenterazine) from the outside of the cell. Thus, in addition to changes in the intracellular distribution of calcium ions, the intracellular distribution of holoproteins (fusion proteins) can also be detected, so reporter molecules can be used in drug discovery screening for diseases associated with G-protein coupled receptors. There is an advantage that the measurement site in the cell can be specified.

一方、目的蛋白質との複合体を形成可能なリガンドが結合をもつ本発明の融合蛋白質も同様に、リガンド結合目的蛋白質（標的レセプター等）の分布を上述の方法にて可視化することができる。本発明の融合蛋白質は、第１の領域に由来する発光と第２の領域に由来する発光の２つの発光を利用して検出することができるので、目的蛋白質の分布の検出において、２つの方法で評価できるという利点がある。 On the other hand, similarly to the fusion protein of the present invention in which a ligand capable of forming a complex with a target protein has a bond, the distribution of the ligand-binding target protein (target receptor and the like) can be visualized by the above-described method. Since the fusion protein of the present invention can be detected by using two luminescences derived from the first region and luminescence derived from the second region, two methods can be used for detecting the distribution of the target protein. There is an advantage that it can be evaluated.

本発明のいくつかの態様では、本発明の融合蛋白質の第１の領域は、ガウシアルシフェラーゼの活性を有する。ガウシアルシフェラーゼは、セレンテラジン誘導体がほとんど発光基質にならない。このガウシアルシフェラーゼの活性を利用して、発光蛋白質（イクオリン）再生の間に第１の領域から発光が生じるのを避けるため、発光蛋白質の再生にはセレンテラジン誘導体（例えば、h-セレンテラジン）を使用する。これにより、発光蛋白質の再生の間に第１の領域に由来する発光が生じるのを避けることができる上に、ガウシアルシフェラーゼ（第１の領域）の発光活性はセレンテラジンを使うことにより測定することができ、再生した発光蛋白質に由来する発光（第２の領域に由来する発光）はカルシウムを使うことに測定することができる。これにより、第１の領域に由来する発光と第２の領域に由来する発光の区別が可能となる。 In some embodiments of the invention, the first region of the fusion protein of the invention has Gaussia luciferase activity. In Gaussia luciferase, coelenterazine derivatives hardly become luminescent substrates. Utilizing this Gaussia luciferase activity, coelenterazine derivatives (eg, h-coelenterazine) are used to regenerate the photoprotein to avoid light emission from the first region during photoprotein (equorin) regeneration. To do. As a result, light emission derived from the first region can be avoided during regeneration of the photoprotein, and the luminescence activity of Gaussia luciferase (first region) should be measured by using coelenterazine. The luminescence derived from the regenerated photoprotein (luminescence derived from the second region) can be measured by using calcium. Thereby, it is possible to distinguish between the light emission derived from the first region and the light emission derived from the second region.

（レポーター蛋白質としての利用）
本発明の融合蛋白質は、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することもできる。本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）を、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列（例えば、エンハンサーなど）に融合したベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、（i）本発明の融合蛋白質の第１の領域に由来する発光を検出することにより、および／または(ii)本発明の融合蛋白質の第２の領域に由来する発光を検出することにより、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列の活性を測定することができる。この場合、本発明の融合蛋白質が、第１の領域に由来する発光と第２の領域に由来する発光の２つの発光を生じることができることから、例えば、次のように利用することができる。 (Use as reporter protein)
The fusion protein of the present invention can also be used as a reporter protein for measuring transcriptional activity of a promoter or the like. A vector is constructed in which a polynucleotide encoding the fusion protein of the present invention (ie, the polynucleotide of the present invention) is fused to a target promoter or other expression control sequence (for example, an enhancer). By introducing the vector into a host cell and (i) detecting luminescence derived from the first region of the fusion protein of the invention and / or (ii) derived from the second region of the fusion protein of the invention. By detecting luminescence, the activity of the target promoter or other expression control sequence can be measured. In this case, since the fusion protein of the present invention can generate two luminescences, that is, luminescence derived from the first region and luminescence derived from the second region, it can be used as follows, for example.

遺伝子発現に関与する転写因子の下流に、本発明の融合蛋白質を挿入し、培養細胞へ導入後、カルシウム添加による発光蛋白質の瞬間発光（第２の領域に由来する発光）と、ルシフェラーゼによるグロー発光（第１の領域に由来する発光）の２つの方法で測定することにより、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列の活性をより正確に測定することができる。 The fusion protein of the present invention is inserted downstream of a transcription factor involved in gene expression, introduced into a cultured cell, and then instantaneous light emission of the photoprotein by addition of calcium (luminescence derived from the second region) and glow emission by luciferase By measuring by the two methods (luminescence derived from the first region), the activity of the target promoter or other expression control sequence can be measured more accurately.

本発明のポリヌクレオチドは、上述のようにして、レポーター遺伝子として利用することができる。 The polynucleotide of the present invention can be used as a reporter gene as described above.

（カルシウムイオンの検出または定量）
上述したように、本発明の融合蛋白質の第２の領域は、セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合して、カルシウムイオンの作用によって発光しうるホロ蛋白質（発光蛋白質）を形成することができる。また、本発明のホロ蛋白質は、酸素存在下、カルシウムイオンの作用によって発光しうる複合体として存在する。よって、本発明の融合蛋白質および本発明のホロ蛋白質は、カルシウムイオンの検出または定量に使用することができる。カルシウムイオンの検出または定量は、カルシウムイオンによる本発明の発光蛋白質の発光を、発光測定装置を用いて測定することにより行うことができる。より具体的には、カルシウムイオンの検出または定量は、例えば、次のように行う。本発明の融合蛋白質にセレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体を添加することにより発光蛋白質を再生させる。発光蛋白質を再生させた後、その発光蛋白質を検体中に添加することにより発光（第２の領域に由来する発光）を生成させ、生成する発光を測定することにより、カルシウムイオンの検出または定量を行うことができる。このとき、第２の領域である発光蛋白質の再生効率をもとめるために、同一分子にある第１の領域のルシフェラーゼ活性を内部標準物質として利用することも出来る。 (Detection or quantification of calcium ions)
As described above, the second region of the fusion protein of the present invention can bind to the peroxide of coelenterazine or the peroxide of a coelenterazine derivative to form a holoprotein (photoprotein) that can emit light by the action of calcium ions. . The holoprotein of the present invention exists as a complex that can emit light by the action of calcium ions in the presence of oxygen. Therefore, the fusion protein of the present invention and the holoprotein of the present invention can be used for detection or quantification of calcium ions. The detection or quantification of calcium ions can be performed by measuring the luminescence of the photoprotein of the present invention by calcium ions using a luminescence measuring device. More specifically, the detection or quantification of calcium ions is performed as follows, for example. The photoprotein is regenerated by adding coelenterazine or a coelenterazine derivative to the fusion protein of the present invention. After regenerating the photoprotein, the photoprotein is added to the sample to generate luminescence (luminescence derived from the second region), and the generated luminescence is measured to detect or quantify calcium ions. It can be carried out. At this time, in order to obtain the regeneration efficiency of the photoprotein that is the second region, the luciferase activity of the first region in the same molecule can be used as an internal standard substance.

発光測定装置としては、市販されている装置、例えば、Centro LB９６０（ベルトール社製）などを使用することができる。カルシウムイオン濃度の定量は、ホロ蛋白質を用いて、既知のカルシウムイオン濃度に対する発光標準曲線を作成することにより、測定可能である。 As the luminescence measuring device, a commercially available device, for example, Centro LB960 (manufactured by Bertor) can be used. Quantification of the calcium ion concentration can be measured by creating a luminescence standard curve with respect to a known calcium ion concentration using holoprotein.

（アミューズメント用品の材料）
本発明の融合蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなる複合体（本発明のホロ蛋白質）は、ルシフェリンを基質として発光することができ、また、カルシウムイオンと結合することでも発光することができる。よって、本発明の融合蛋白質等は、アミューズメント用品の材料の発光基材として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえば、発光シャボン玉、発光アイス、発光飴、発光絵の具等があげられる。本発明のアミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。 (Materials for amusement supplies)
A complex comprising the fusion protein of the present invention and a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative (the holoprotein of the present invention) can emit light using luciferin as a substrate, and also emits light when bound to calcium ions. Can do. Therefore, the fusion protein etc. of this invention can be used conveniently as a luminescent base material of the material of amusement goods. Examples of the amusement goods include a light emitting soap bubble, a light emitting ice, a light emitting bowl, and a light emitting paint. The amusement product of the present invention can be manufactured by a usual method.

７．本発明のキット
本発明は、本発明の蛋白質、本発明のホロ蛋白質、本発明のポリヌクレオチド、本発明の組換えベクターおよび本発明の形質転換体から選択されるいずれかを含むキットも提供する。本発明のキットには、さらにセレンテラジンもしくはその誘導体を含んでいてもよい。本発明のキットは、通常用いられる材料および方法で製造することができる。本発明のキットは、例えば、サンプルチューブ、プレート、キット使用者に対する指示書、溶液、バッファー、試薬、標準化のために好適なサンプルまたは対照サンプルを含んでもよい。 7). Kit of the Present Invention The present invention also provides a kit comprising any one selected from the protein of the present invention, the holoprotein of the present invention, the polynucleotide of the present invention, the recombinant vector of the present invention and the transformant of the present invention. . The kit of the present invention may further contain coelenterazine or a derivative thereof. The kit of the present invention can be produced by commonly used materials and methods. The kits of the invention may include, for example, sample tubes, plates, instructions for kit users, solutions, buffers, reagents, samples suitable for standardization or control samples.

本発明のキットは、上述した検出マーカー、レポーター蛋白質もしくはレポーター遺伝子を用いた測定などに利用することができる。本発明のいくつかの態様では、上記キットは、イムノアッセイ用キットとして、イムノアッセイ法に使用することができる。 The kit of the present invention can be used for the measurement using the detection marker, reporter protein or reporter gene described above. In some embodiments of the present invention, the kit can be used in an immunoassay method as an immunoassay kit.

ここで、実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。 Here, unless otherwise described in the embodiments and examples, J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); FM Ausubel, R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. The method described in the standard protocol collection, or a modified or modified method thereof is used. In addition, when using commercially available reagent kits and measuring devices, unless otherwise explained, protocols attached to them are used.

尚、本明細書に記載した全ての文献及び刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。 It should be noted that all documents and publications described in this specification are incorporated herein by reference in their entirety regardless of their purposes.

また、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。 The objects, features, advantages, and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and those skilled in the art can easily reproduce the present invention from the description of the present specification. it can. The embodiments and specific examples of the invention described below show preferred embodiments of the present invention and are shown for illustration or explanation, and the present invention is not limited to them. It is not limited. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications can be made based on the description of the present specification within the spirit and scope of the present invention disclosed herein.

本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
［配列番号：１］ガウシアルシフェラーゼをコードするDNAの塩基配列を示す。
［配列番号：２］ガウシアルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：３］アポイクオリンの第４番目〜第１８９番目のアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列を示す。
［配列番号：４］アポイクオリンの第４番目〜第１８９番目のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：５］組換えアポイクオリンをコードするDNAの塩基配列を示す。
［配列番号：６］組換えアポイクオリンのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：７］実施例１で作製した発現ベクターpCold-GL-AQ-S142Cに挿入された、ガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリン−S142C融合蛋白質をコードするDNA配列を示す。
［配列番号：８］実施例１で作製した発現ベクターpCold-GL-AQ-S142Cに挿入された、ガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリン−S142C融合蛋白質のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：９］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１０］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１１］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１２］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１３］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１４］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。 The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
[SEQ ID NO: 1] This shows the base sequence of DNA encoding Gaussia luciferase.
[SEQ ID NO: 2] This shows the amino acid sequence of Gaussia luciferase.
[SEQ ID NO: 3] This shows the base sequence of DNA encoding the fourth to 189th amino acid sequence of apoaequorin.
[SEQ ID NO: 4] This shows the 4th to 189th amino acid sequence of apoaequorin.
[SEQ ID NO: 5] This shows the base sequence of DNA encoding recombinant apoaequorin.
[SEQ ID NO: 6] This shows the amino acid sequence of recombinant apoaequorin.
[SEQ ID NO: 7] This shows a DNA sequence encoding Gaussia luciferase-apoiquorin-S142C fusion protein inserted into expression vector pCold-GL-AQ-S142C prepared in Example 1.
[SEQ ID NO: 8] This shows the amino acid sequence of Gaussia luciferase-apoiquorin-S142C fusion protein inserted into expression vector pCold-GL-AQ-S142C prepared in Example 1.
[SEQ ID NO: 9] This shows the base sequence of the primer used in Example 1.
[SEQ ID NO: 10] This shows the base sequence of the primer used in EXAMPLE 1.
[SEQ ID NO: 11] This shows the base sequence of the primer used in EXAMPLE 1.
[SEQ ID NO: 12] This shows the base sequence of the primer used in EXAMPLE 1.
[SEQ ID NO: 13] This shows the base sequence of the primer used in EXAMPLE 1.
[SEQ ID NO: 14] This shows the base sequence of the primer used in EXAMPLE 1.

以下に実施例により本発明を説明するが、実施例は本発明を制限するものではない。 EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples, but the examples are not intended to limit the present invention.

実施例１ガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリン−S142C発現ベクターの構築
ガウシアルシフェラーゼ遺伝子とアポイクオリンの１４２番目のセリン残基をシステイン残基に置換したアポイクオリン−S142C遺伝子を有するガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリン−S142C融合遺伝子発現ベクターの構築は以下の通りである。 Example 1 Construction of Gaussia luciferase-apoaequorin-S142C expression vector Gaussia luciferase-apoaequorin having an apoaequorin-S142C gene in which the serine residue at position 142 of agaus luciferase gene and apoaequorin was replaced with a cysteine residue The construction of the S142C fusion gene expression vector is as follows.

ガウシアルシフェラーゼ遺伝子（hGL遺伝子）は、ガウシアルシフェラーゼ遺伝子を有するpcDNA3-hGL（LUX社製）から、PCR法により調製した。アポイクオリンの１４２番目のセリン残基をシステイン残基に置換したアポイクオリン−S142C遺伝子は、アポイクオリン遺伝子を有するpAQ440（特開昭61-135586号公開公報参照）のHindIII-EcoRI 領域をpUC9のベクターにサブクローニングして得たpAM-HEから、PCR法により調製した。発現ベクターとしては、pCold II（タカラバイオ社）を使用した。 Gaussia luciferase gene (hGL gene) was prepared by PCR method from pcDNA3-hGL (manufactured by LUX) having Gaussia luciferase gene. The apoaequorin-S142C gene, in which the 142nd serine residue of apoaequorin is replaced with a cysteine residue, is a vector of pUC9 from the HindIII-EcoRI region of pAQ440 (see JP-A-61-135586) having the apoaequorin gene It was prepared by PCR from pAM-HE obtained by subcloning. PCold II (Takara Bio Inc.) was used as an expression vector.

アポイクオリンの142番目のセリン残基のシステイン残基への置換は以下の手順で行った。pAM-HEを鋳型として2種類のPCRプライマー：AQ-20N/XhoI（5’ ccg CTC GAG ACA TCA GAC TTC GAC AAC CCA 3’（配列番号：９）；XhoI制限酵素部位はアンダーライン）およびAQ-S142C-R（5’ ATC TTC GCA TGA TTG GAT GAT 3’（配列番号：１０））を用いて、PCRキット（タカラバイオ社製）にてPCR（サイクル条件25サイクル；1分／94℃、1分／50℃、1分／72℃）を実施して、所望のDNA領域を増幅した。同様に2種類のPCRプライマー：AQ-S142C-F（5’ CAA TCA TGC GAA GAT TGC GAG 3’（配列番号：１１））およびAEQ-C-PstI（5’ cgg CTG CAG TTA GGG GAC AGC TCC ACC GTA GAG CTT 3’（配列番号：１２）；PstI制限酵素部位はアンダーライン）を用いて、PCRキット（タカラバイオ社製）にてPCR（サイクル条件25サイクル；1分／94℃、1分／50℃、1分／72℃）を実施して、所望のDNA領域を増幅した。得られた２種類のPCR産物を鋳型として、PCRプライマー：AQ-20N/XhoI（配列番号：９）およびAEQ-C-PstI（配列番号：１２）を用いて、PCRキット（タカラバイオ社製）にてPCR（サイクル条件25サイクル；1分／94℃、1分／50℃、1分／72℃）を実施して、１４２番目のセリン残基をシステイン残基に置換したアポイクオリン遺伝子を得た。得られた断片をPCR精製キット（キアゲン社製）で精製し、常法により制限酵素XhoI／PstIにて消化した後、pBluescript II SK (+)（Straragene社）の制限酵素XhoI／PstI部位に連結することによって、ベクターpBlue-AQ-S142Cを構築した。 Replacement of the 142nd serine residue of apoaequorin with a cysteine residue was carried out by the following procedure. Two types of PCR primers using pAM-HE as a template: AQ-20N / XhoI (5 'ccg CTC GAG ACA TCA GAC TTC GAC AAC CCA 3' (SEQ ID NO: 9); XhoI restriction enzyme site is underlined) and AQ- PCR using S142C-R (5 ′ ATC TTC GCA TGA TTG GAT GAT 3 ′ (SEQ ID NO: 10)) with a PCR kit (manufactured by Takara Bio Inc.) (cycle conditions 25 cycles; 1 minute / 94 ° C., 1 Min / 50 ° C., 1 min / 72 ° C.) to amplify the desired DNA region. Similarly, two types of PCR primers: AQ-S142C-F (5 'CAA TCA TGC GAA GAT TGC GAG 3' (SEQ ID NO: 11)) and AEG-C-PstI (5 'cgg CTG CAG TTA GGG GAC AGC TCC ACC PCR using GTA GAG CTT 3 ′ (SEQ ID NO: 12); PstI restriction enzyme site is underlined and PCR kit (manufactured by Takara Bio Inc.) (cycle conditions 25 cycles; 1 minute / 94 ° C., 1 minute / (50 ° C., 1 minute / 72 ° C.) was performed to amplify the desired DNA region. PCR kit (manufactured by Takara Bio Inc.) using the obtained two kinds of PCR products as templates and using PCR primers: AQ-20N / XhoI (SEQ ID NO: 9) and AEQ-C-PstI (SEQ ID NO: 12) PCR (cycle conditions 25 cycles; 1 min / 94 ° C, 1 min / 50 ° C, 1 min / 72 ° C) to obtain the apoaequorin gene with the 142nd serine residue replaced with a cysteine residue It was. The resulting fragment was purified with a PCR purification kit (Qiagen), digested with restriction enzymes XhoI / PstI by a conventional method, and then ligated to the restriction enzyme XhoI / PstI sites of pBluescript II SK (+) (Straragene). Thus, the vector pBlue-AQ-S142C was constructed.

次いで、ガウシアの遺伝子はpcDNA3-hGL（プロルミ社製）を鋳型として2種類のPCRプライマー：GL-25N/Kpn-EcoRI（5’ ggc GGT ACC GAA TTC AAG CCC ACC GAG AAC AAC 3’（配列番号：１３）；Asp718I制限酵素部位はアンダーライン）およびGL-24N-TAA/XhoI（5’ ccg CTC GAG GTC ACC ACC GGC CCC CTT GAT3’（配列番号：１４）；XhoI制限酵素部位はアンダーライン）を用いて、PCRキット（タカラバイオ社製）にてPCR（サイクル条件25サイクル；1分／94℃、1分／50℃、1分／72℃）を実施して、ガウシア遺伝子を増幅した。 Next, as for the gene of Gausia, pcDNA3-hGL (manufactured by Prolumi) was used as a template, and two kinds of PCR primers: GL-25N / Kpn-EcoRI (5 ′ ggc GGT ACC GAA TTC AAG CCC ACC GAG AAC AAC 3 ′ (SEQ ID NO: 13); Asp718I restriction enzyme site is underlined) and GL-24N-TAA / XhoI (5 'ccg CTC GAG GTC ACC ACC GGC CCC CTT GAT3' (SEQ ID NO: 14); XhoI restriction enzyme site is underlined) Then, PCR (cycle condition 25 cycles; 1 minute / 94 ° C., 1 minute / 50 ° C., 1 minute / 72 ° C.) was performed with a PCR kit (manufactured by Takara Bio Inc.) to amplify the Gaussia gene.

得られた断片をPCR精製キット（キアゲン社製）で精製し、常法により制限酵素Asp718I／XhoIにて消化した後、pBlue-AQ-S142Cの制限酵素Asp718I／XhoI部位に連結することによって、ベクターpBlue-GL-AQ-S142Cを構築した。 The resulting fragment was purified with a PCR purification kit (Qiagen), digested with restriction enzymes Asp718I / XhoI by a conventional method, and then ligated to the restriction enzyme Asp718I / XhoI sites of pBlue-AQ-S142C. pBlue-GL-AQ-S142C was constructed.

このベクターpBlue-GL-AQ-S142Cを常法により制限酵素EcoRI／PstIにて消化した後、pColdIIの制限酵素EcoRI／PstI部位に連結することによって、発現ベクターpCold-GL-AQ-S142Cを構築した（図１）。なお、DNA シークエンサー（ABI社製）により塩基配列を決定することにより、挿入ＤＮＡの確認を行った。 This vector pBlue-GL-AQ-S142C was digested with restriction enzymes EcoRI / PstI by a conventional method and then ligated to the restriction enzyme EcoRI / PstI sites of pColdII to construct an expression vector pCold-GL-AQ-S142C. (FIG. 1). The inserted DNA was confirmed by determining the base sequence with a DNA sequencer (manufactured by ABI).

挿入DNAの塩基配列を、配列番号：７に、挿入DNAがコードする融合蛋白質のアミノ酸配列を、配列番号：８に示す。
また、挿入DNAの塩基配列中、第１のコード配列を、配列番号：１に、第１のコード配列がコードする第１の領域のアミノ酸配列を、配列番号：２に示す。
さらに、挿入DNAの塩基配列中、第２のコード配列の塩基配列を、配列番号：５に、第２のコード配列がコードする第２の領域のアミノ酸配列を、配列番号：６に示す。
尚、本実施例では、アポイクオリンの142番目のセリン残基をシステイン残基へと置換しているが、このシステイン残基は、第２の領域のアミノ酸配列（配列番号：６）では、第139番目のシステイン残基に対応する。 The nucleotide sequence of the inserted DNA is shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence of the fusion protein encoded by the inserted DNA is shown in SEQ ID NO: 8.
In the nucleotide sequence of the inserted DNA, the first coding sequence is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the first region encoded by the first coding sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
Further, in the base sequence of the inserted DNA, the base sequence of the second coding sequence is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of the second region encoded by the second coding sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
In this example, the 142nd serine residue of apoaequorin is substituted with a cysteine residue. This cysteine residue is the second amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) in the second region. Corresponds to the 139th cysteine residue.

実施例２組換えガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142C融合蛋白質の精製法
組換えガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142C融合蛋白質は、以下に示すように、発現ベクター pCold-GL-AQ-S142Cを用いて、大腸菌にて組換えガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリン−S142Cを発現させ、ニッケルキレートカラムクロマトグラフ法にて精製を行い、アポイクオリン部分を再生することで、組換えガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142Cを得た。 Example 2 Method for Purification of Recombinant Gaussia Luciferase-Aequorin-S142C Fusion Protein Recombinant Gaussia luciferase-equorin-S142C fusion protein was obtained using the expression vector pCold-GL-AQ-S142C as shown below. Recombinant Gaussia luciferase-aequorin-S142C was expressed in, purified by nickel chelate column chromatography, and the apoaequorin part was regenerated to obtain recombinant Gaussia luciferase-aequorin-S142C.

１）組換えガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリンS142Cの大腸菌での発現方法
大腸菌において組み換えガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリン−S142Cを発現させるために、ガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリン−S142C遺伝子発現ベクター pCold-GL-AQ-S142Cを用いた。このベクターを常法により大腸菌BL21株に導入し、得られた形質転換株をアンピシリン（50μg／ml）を含有する10mlのLB液体培地（水1リットルあたり、バクトトリプトン10g、イーストイクストラクト5g、塩化ナトリウム5g、pH7.2）に植菌し、37℃で18時間培養を行った。次いで、その培養物を新たなLB液体培地400ml x 5本（総量2L）に添加して37℃で5時間培養した後、氷水上で冷却して、イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（IPTG、和光純薬工業社製）を最終濃度0.2mMになるように培養液に添加し、15℃でさらに17時間培養を行った。培養後、菌体を遠心回収（5,000rpm、5分）し、蛋白質抽出の出発材料とした。 1) Expression method of recombinant Gaussia luciferase-apoaequorin S142C in E. coli To express recombinant Gaussia luciferase-apoaequorin-S142C in E. coli, Gaussia luciferase-apoaequorin-S142C gene expression vector pCold-GL-AQ -S142C was used. This vector was introduced into Escherichia coli BL21 by a conventional method, and the resulting transformant was treated with 10 ml of LB liquid medium containing ampicillin (50 μg / ml) (10 g of bactotryptone, 5 g of yeast extract per liter of water, Sodium chloride (5 g, pH 7.2) was inoculated and cultured at 37 ° C. for 18 hours. Next, the culture was added to 400 ml x 5 new LB liquid medium (total amount: 2 L), cultured at 37 ° C for 5 hours, cooled on ice water, and isopropyl-β-D (-)-thiogalacto. Pyranoside (IPTG, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the culture solution to a final concentration of 0.2 mM, and further cultured at 15 ° C. for 17 hours. After culturing, the cells were collected by centrifugation (5,000 rpm, 5 minutes) and used as a starting material for protein extraction.

２）培養菌体からのガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリン−S142Cの抽出方法
集菌した培養菌体を100mlの50mM Tris-HCl (pH7.6)で懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理（ブランソン社製、Sonifier model cycle 250）を3分間、3回行い、その菌体破砕液を10,000 rpm（12,000×g）で4 ℃、20分間遠心し、不溶性沈殿画分を得た。得られた不溶性沈殿画分を、100mlの6M尿素を含む50mM Tris-HCl (pH7.6)に懸濁し、この懸濁液を氷冷下で超音波破砕処理を行い、10,000 rpm（12,000×g）で4 ℃、10分間遠心した。得られた尿素可溶性画分をガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリン−S142C精製の出発材料とした。 2) Extraction method of Gaussia luciferase-apoiquorin-S142C from cultured cells Suspended cultured cells in 100 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) and sonicated (Branson) under ice-cooling Sonifier model cycle 250) manufactured by the company was performed three times for 3 minutes, and the cell disruption solution was centrifuged at 10,000 rpm (12,000 × g) at 4 ° C. for 20 minutes to obtain an insoluble precipitate fraction. The obtained insoluble precipitate fraction was suspended in 100 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 6 M urea, and this suspension was subjected to ultrasonic crushing treatment under ice cooling to 10,000 rpm (12,000 × g ) At 4 ° C for 10 minutes. The obtained urea-soluble fraction was used as a starting material for purification of Gaussia luciferase-apoiquorin-S142C.

３）尿素可溶性画分からの組換えガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリン−S142Cの精製方法
組換え発現蛋白質は、アミノ末端に6個のヒスチジン配列を有するので、ニッケルキレートゲルによるアフィニティクロマト法により精製が可能である。
まず、6M尿素可溶性画分を、6M尿素を含む50mM Tris-HCl (pH7.6)で平衡化したニッケルキレートカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径2.5×6cm）に供し、ガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリン−S142Cを吸着させた。ガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリン−S142C吸着カラムを、150mlの6M尿素を含む50mM Tris-HCl (pH7.6)で洗浄後、6M尿素と0.1Mイミダゾール（和光純薬工業社製）を含む50mM Tris-HCl (pH7.6)でガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリン−S142Cを溶出した。蛋白量濃度は、Bradford法にもとづく市販のキット（バイオラッド社製）を用い、また、ウシ血清アルブミン（ピアス社製）を標準物質として用いて決定した。2Lの培養菌体より106mgのガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリン−S142Cが得られた。 3) Purification method of recombinant Gaussia luciferase-apoiquorin-S142C from urea-soluble fraction Since the recombinantly expressed protein has 6 histidine sequences at the amino terminus, it can be purified by affinity chromatography using nickel chelate gel. is there.
First, the 6M urea soluble fraction was applied to a nickel chelate column (Amersham Biosciences, column size: diameter 2.5 × 6 cm) equilibrated with 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 6M urea, and Gaussia luciferase − Apoaequorin-S142C was adsorbed. After washing the Gaussia luciferase-apoiquorin-S142C adsorption column with 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 150 ml of 6M urea, 50 mM Tris- containing 6M urea and 0.1M imidazole (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Gaussia luciferase-apoiquorin-S142C was eluted with HCl (pH 7.6). The protein concentration was determined using a commercially available kit (Biorad) based on the Bradford method, and using bovine serum albumin (Pierce) as a standard substance. 106 mg of Gaussia luciferase-apoiquorin-S142C was obtained from 2 L of cultured cells.

４）ガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリン−S142Cからガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142Cへの調製法
ガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリン−S142Cからのガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142Cへの再生は以下に示すように、ガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリン−S142Cを、まず還元剤2−メルカプトエタノールで処理後、発光基質（セレンテラジン）と接触させることによりイクオリンを再生する。その後、透析処理にて還元剤を除去して、ガウシアルシフェラーゼをリフォールディングし活性型に変換させることにより、ガウシアルシフェラーゼ活性およびイクオリン活性を有するガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142C蛋白質を得た。 4) Preparation method from Gaussia luciferase-apoaequorin-S142C to Gaussia luciferase-aequorin-S142C The regeneration from Gaussia luciferase-apoaequorin-S142C to Gaussia luciferase-aequorin-S142C is as follows. Aequorin is regenerated by first treating sialiferase-apoiquorin-S142C with a reducing agent 2-mercaptoethanol and then contacting with a luminescent substrate (coelenterazine). Thereafter, the reducing agent was removed by dialysis, and Gaussia luciferase-aequorin-S142C protein having Gaussia luciferase activity and aequorin activity was obtained by refolding and converting Gaussia luciferase into an active form.

具体的には、0.1M イミダゾールおよび6M尿素によりニッケルキレートカラムより溶出したガウシアルシフェラーゼ−アポイクオリンS142C溶液（50μg／10μl）を10mM EDTAを含む30mM Tris-HCl (pH7.6) 990μl に溶解し、これを2-メルカプトエタノールと最終濃度が0.35％（v/v）になるように混合する。37℃で30分放置した後、ガウシアルシフェラーゼの発光活性が失活した事を確認し、エタノールに溶解した5μg基質セレンテラジン（1μg／μl）を添加して、4℃にて一晩イクオリンの再生反応を行った。次いで、得られたイクオリン再生溶液を４Lの10mM EDTAを含む100mM炭酸アンモニウム溶液(pH8.0)にて4℃で一晩透析を行い、組換えガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142C蛋白質（40μg）を得た。 Specifically, Gaussia luciferase-apoiquorin S142C solution (50 μg / 10 μl) eluted from a nickel chelate column with 0.1 M imidazole and 6 M urea was dissolved in 990 μl of 30 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 10 mM EDTA, This is mixed with 2-mercaptoethanol to a final concentration of 0.35% (v / v). After standing at 37 ° C for 30 minutes, confirm that the luminescence activity of Gaussia luciferase was inactivated, add 5μg substrate coelenterazine (1μg / μl) dissolved in ethanol, and regenerate aequorin at 4 ° C overnight. Reaction was performed. Subsequently, the obtained aequorin regeneration solution was dialyzed overnight at 4 ° C. with 100 mM ammonium carbonate solution (pH 8.0) containing 4 L of 10 mM EDTA to obtain recombinant Gaussia luciferase-equorin-S142C protein (40 μg). It was.

それぞれの精製過程画分について、還元状態で12％ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGE分析を行った。得られた組換えガウシアルシフェラーゼ−イクオリンS142Cのアミノ末端配列は、Met-Asn-His-Lys-より始まり、378個のアミノ酸より構成されており、平均質量計算値は41335である。図2に示すように、精製画分は分子量41kDa蛋白質に相当する単一バンドが検出され、純度95％以上であることが明らかとなった。表1に、2Lの培養菌体からのガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142Cの各精製工程での分析結果をまとめた。 Each purification process fraction was subjected to SDS-PAGE analysis using a 12% polyacrylamide gel in a reduced state. The amino terminal sequence of the obtained recombinant Gaussia luciferase-aequorin S142C starts with Met-Asn-His-Lys-, is composed of 378 amino acids, and the calculated average mass is 41335. As shown in FIG. 2, a single band corresponding to a protein with a molecular weight of 41 kDa was detected in the purified fraction, and it was revealed that the purity was 95% or more. Table 1 summarizes the analysis results in each purification step of Gaussia luciferase-equorin-S142C from 2 L cultured cells.

実施例３発光活性の測定法
ガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142Cの発光活性は、ガウシアルシフェラーゼ活性とイクオリン活性をそれぞれ単独で測定することが可能である。 Example 3 Method for Measuring Luminescent Activity As for the luminescent activity of Gaussia luciferase-equorin-S142C, Gaussia luciferase activity and aequorin activity can be measured independently.

１）ガウシアルシフェラーゼの発光測定
ガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142C 5μlを、0.1mlの0.01% Tween20 (バイオラッド社製)、10 mM EDTAと 137 mM 塩化ナトリウムと2.7mM 塩化カリウムを含む10 mM リン酸緩衝液(pH 7.4)(シグマ社製、以降PBSと表記)、およびエタノールに溶解した基質セレンテラジン(1μg／μl)に混合して発光反応を開始させ、発光測定装置Luminescencer- PSN AB2200（アトー社製）で30秒間発光活性を測定した。発光活性は、最大値（Imax）で示した。 1) Luminescence measurement of Gaussia luciferase 5 μl of Gaussia luciferase-aequorin-S142C, 10 mM phosphoric acid containing 0.1 ml of 0.01% Tween20 (manufactured by Biorad), 10 mM EDTA, 137 mM sodium chloride and 2.7 mM potassium chloride Luminescencer-PSN AB2200 (manufactured by ATTO Corporation) was started by mixing with a buffer solution (pH 7.4) (manufactured by Sigma, hereinafter referred to as PBS) and a substrate coelenterazine (1 μg / μl) dissolved in ethanol to start a luminescence reaction. ) And the luminescence activity was measured for 30 seconds. Luminescent activity was shown as a maximum value (Imax).

２）イクオリンの発光測定
1mlの10 mM EDTAを含む30mM Tris−HCl（ｐＨ7.6）に2-メルカプトエタノール(1μl)、エタノールに溶解した基質セレンテラジン（1μg／μl）を混合した後、ガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142Cを添加し、氷上(4℃)で2時間反応を行い、再生イクオリン溶液を得る。再生イクオリン溶液１μlへ、50mMカルシウム溶液を100μl加えることにより発光反応を開始させ、発光測定装置Luminescencer-PSN AB2200（アトー社製）にて10秒間発光活性を測定した。発光活性は、最大値（Imax）で示した。 2) Aequorin luminescence measurement
Add 2-mercaptoethanol (1 μl) and substrate coelenterazine (1 μg / μl) dissolved in ethanol to 30 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 1 ml of 10 mM EDTA, and then add Gaussia luciferase-aequorin-S142C Then, the reaction is carried out on ice (4 ° C.) for 2 hours to obtain a regenerated aequorin solution. Luminescence reaction was started by adding 100 μl of 50 mM calcium solution to 1 μl of regenerated aequorin solution, and the luminescence activity was measured for 10 seconds with a luminescence measuring device Luminescencer-PSN AB2200 (manufactured by Atto). Luminescent activity was shown as a maximum value (Imax).

実施例４ガウシアルシフェラーゼ−イクオリンS142Cの発光活性の蛋白質濃度依存性
再生ガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142C溶液を0.01% Tween20、10 mM EDTA、0.1%牛血清アルブミン（生化学工業社製、以下BSAと記載）を含むPBSにて希釈した。 Example 4 Protein concentration-dependent regeneration activity of Gaussia luciferase-aequorin S142C Regenerated Gaussia luciferase-equorin-S142C solution was prepared by using 0.01% Tween 20, 10 mM EDTA, 0.1% bovine serum albumin (Seikagaku Corporation, hereinafter referred to as BSA). The sample was diluted with PBS containing

１）ガウシアルシフェラーゼ活性の蛋白質量と発光量の直線性
96穴マイクロプレート（Nunc、#236108）に0.01% Tween20、10 mM EDTAを含むPBSを50μl／ウェル分注し、上記のように作製したガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142C希釈溶液を5μl／ウェル添加して、エタノールに溶解した基質セレンテラジン（0.25 ng／μl）を含む0.01% Tween20、10 mM EDTAを含むPBSを50μl／ウェル注入することにより発光反応を開始させ、発光プレートリーダーCentro LB960（ベルトールド社製）にて30秒間発光活性を測定した。 1) Linearity of protein mass and luminescence amount of Gaussia luciferase activity
50 μl / well of PBS containing 0.01% Tween20 and 10 mM EDTA was dispensed into a 96-well microplate (Nunc, # 236108), and 5 μl / well of the diluted Gaussia luciferase-aequorin-S142C solution prepared as described above was added. The luminescence reaction was initiated by injecting 50 μl / well of PBS containing 0.01% Tween20 and 10 mM EDTA containing the substrate coelenterazine (0.25 ng / μl) dissolved in ethanol, and the luminescence plate reader Centro LB960 (Berthold) Luminescent activity was measured at 30 seconds.

２）イクオリン活性の蛋白質量と発光量の直線性
96穴マイクロプレートに、ガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142C希釈溶液を5μl／ウェルに分注して、50mMカルシウム溶液を100μl／ウェル注入することにより発光反応を開始させ、発光プレートリーダーCentro LB960（ベルトールド社製）にて、10秒間発光活性を測定した。 2) Linearity of aequorin activity protein and luminescence
A 96-well microplate was prepared by injecting a diluted solution of Gaussia luciferase-equorin-S142C to 5 μl / well, and injecting 100 μl / well of 50 mM calcium solution. The luminescence plate reader Centro LB960 (Berthold) The luminescence activity was measured for 10 seconds.

それぞれの発光活性の最大値（Imax）を、図３に示すグラフにまとめた。蛋白質濃度と発光活性には、相関があることがわかった。 The maximum value (Imax) of each luminescence activity is summarized in the graph shown in FIG. It was found that there was a correlation between protein concentration and luminescence activity.

実施例５ビオチン化ガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142Cの調製方法
ガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142Cを100μl (430μg、10.4 nmol)取り、Maleimide-PEO-Biotin (1 nmol/ml、ピアス社製)を31.2μl (31.2 nmol)、PBSを68.8μl加え、全量を200μlとし、4℃にて一晩反応させた。反応後、10 mMシステインを10μl (100 nmol)加え、過剰なマレイミド基を除去した。反応液をAmicon Ultra-4 （M.W.=10,000）に移し、更にPBSを2.8 ml加えて、遠心機にて6,000rpm、20分間遠心し、ビオチン化試薬を除去した。ろ過膜状に残った反応液を約180μl回収し、ビオチン化ガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142Cを得た。OD280nmの吸光度より、回収率は78％であった。 Example 5 Preparation method of biotinylated Gaussia luciferase-aequorin-S142C Take 100 μl (430 μg, 10.4 nmol) of Gaussia luciferase-equorin-S142C and 31.2 μl of Maleimide-PEO-Biotin (1 nmol / ml, manufactured by Pierce) (31.2 nmol), 68.8 μl of PBS was added to make a total volume of 200 μl, and the reaction was carried out at 4 ° C. overnight. After the reaction, 10 μl (100 nmol) of 10 mM cysteine was added to remove excess maleimide group. The reaction solution was transferred to Amicon Ultra-4 (MW = 10,000), 2.8 ml of PBS was further added, and centrifuged at 6,000 rpm for 20 minutes in a centrifuge to remove the biotinylation reagent. About 180 μl of the reaction solution remaining in the form of a filtration membrane was recovered to obtain biotinylated Gaussia luciferase-aequorin-S142C. From the absorbance at OD280 nm, the recovery rate was 78%.

実施例６ビオチン化ガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142Cを用いたα−フェトプロテインの検出
１）抗−AFP抗体のコーティング
抗−AFP抗体（日本医学臨床検査研究所製、クローンNo.6D2、サブクラスIgG2a−κ、以下「6D2」と記載）を、0.05%(w/v)アジ化ナトリウムを含む50mM炭酸緩衝液（pH9.6）にて5μg／mlに調製し、96穴マイクロプレート（Nunc社製、#437796）に100μl／ウェル分注し、室温にて一晩静置してコートした。静置後、炭酸緩衝液を除去し、1%牛血清アルブミン（シグマ、以下BSAと記載）、2mM EDTA（EDAT・2Na、同仁化学研究所）、0.05%(w/v)アジ化ナトリウム（和光純薬工業）を含む150mM NaCl（和光純薬工業）、20mM Tris-HCl（和光純薬工業）（以降TBSと記載）（以降ポストコーティング溶液と記載）を200μl／ウェル分注し、4℃にて一晩静置した。 Example 6 Detection of α-fetoprotein using biotinylated Gaussia luciferase-aequorin-S142C 1) Anti-AFP antibody coating Anti-AFP antibody (manufactured by Nippon Medical Laboratory, clone No. 6D2, subclass IgG2a-κ , Hereinafter referred to as “6D2”) was prepared to 5 μg / ml in a 50 mM carbonate buffer (pH 9.6) containing 0.05% (w / v) sodium azide, and a 96-well microplate (Nunc, # 437796) was dispensed at 100 μl / well and allowed to stand overnight at room temperature for coating. After standing, the carbonate buffer was removed, 1% bovine serum albumin (Sigma, hereinafter referred to as BSA), 2 mM EDTA (EDAT · 2Na, Dojindo Laboratories), 0.05% (w / v) sodium azide (Japanese) Dispense 200 μl / well of 150 mM NaCl (Wako Pure Chemical Industries) containing 20 mM Tris-HCl (hereinafter Wako Pure Chemical Industries) (hereinafter referred to as TBS) (hereinafter referred to as post-coating solution) to 4 ° C. Left overnight.

２）ビオチン化ガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142Cの発光測定
静置後、反応液を捨て洗浄した後、0.1% BSA、2mM EDTAを含有したTBSにて、0（Blank）、12.5及び62.5ng／mlに希釈調製したα-フェトプロテイン(Dako社製、以下AFPと記載)を96穴マイクロプレートに50μl／ウェル分注し、さらに74.9ng／mlに希釈調製したビオチン化抗-AFP抗体（日本医学臨床検査研究所製、クローンNo.1D5、サブクラスIgG1−κ、以下1D5と記載）を50μl／ウェル分注し、30℃にて1時間静置した。前記プレートから反応溶液を除去し、よく洗浄した。10%BlockAce（雪印乳業社製）、0.01%Tween20（バイオラッド社製）、10 mM EDTAを含有するPBS（以下PBSE−TBと記載）にて50pmol／mlに希釈調製したストレプトアビジン（以下STAと記載）15μlと、100pmol／mlに希釈調製したビオチン化ガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142C 15μlを混合し、室温にて30分反応させた後、PBSE−TBにて80倍希釈した溶液を前記プレートに100μl／ウェル分注し、30℃にて30分静置した。反応溶液を除去し、洗浄した後、発光プレートリーダーCentro LB960（ベルトール社製）にて、一方は、基質セレンテラジン（0.5 ng／μl）100μlを注入してガウシアルシフェラーゼの発光活性を0.1秒間隔で10秒間測定し、最大発光強度値（I_max）を算出した。他方、別の反応ウェルにおいては、50ｍM 塩化カルシウム溶液100μlを注入してイクオリンの発光活性を0.1秒間隔で５秒間測定し、I_maxを算出した。求めたガウシアルシフェラーゼとイクオリン活性の各AFP濃度に対するI_maxと各AFP濃度に対するI_max値とブランクに対するI_maxの比（S/N比）とを表2に示した。 2) Luminescence measurement of biotinylated Gaussia luciferase-aequorin-S142C After standing, the reaction solution was discarded and washed, and then 0 (Blank), 12.5 and 62.5 ng / ml with TBS containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA. Α-fetoprotein (Dako, hereinafter referred to as “AFP”) diluted 50 μl / well into a 96-well microplate and further diluted to 74.9 ng / ml, biotinylated anti-AFP antibody (Japanese Medical Clinical Laboratory) 50 μl / well of clone No. 1D5, subclass IgG1-κ, hereinafter referred to as 1D5) manufactured by Research Institute, and allowed to stand at 30 ° C. for 1 hour. The reaction solution was removed from the plate and washed thoroughly. Streptavidin (hereinafter referred to as STA) diluted to 50 pmol / ml with PBS containing 10% BlockAce (manufactured by Snow Brand Milk Products), 0.01% Tween20 (manufactured by Bio-Rad), and 10 mM EDTA (hereinafter referred to as PBSE-TB). Description) 15 μl and 15 μl of biotinylated Gaussia luciferase-aequorin-S142C diluted to 100 pmol / ml were mixed, reacted at room temperature for 30 minutes, and then diluted 80-fold with PBSE-TB to the plate. 100 μl / well was dispensed and allowed to stand at 30 ° C. for 30 minutes. After removing the reaction solution and washing, 100 μl of the substrate coelenterazine (0.5 ng / μl) was injected into the luminescence plate reader Centro LB960 (Beltoor) to increase the luminescence activity of Gaussia luciferase at 0.1 second intervals. Measurement was performed for 10 seconds, and the maximum light emission intensity value (I _max ) was calculated. On the other hand, in another reaction well, 100 μl of 50 mM calcium chloride solution was injected, and the luminescence activity of aequorin was measured at 0.1 second intervals for 5 seconds to calculate I _max . The ratio of I _max for I _max value and the blank for each AFP concentration and I _max for each AFP concentration of Gaussia luciferase and aequorin activity was determined with (S / N ratio) shown in Table 2.

ビオチン化ガウシアルシフェラーゼ−イクオリン−S142Cを用いて、ガウシアルシフェラーゼ活性およびイクオリン活性により、イムノアッセイが可能であることが明らかとなった。 Using biotinylated Gaussia luciferase-equorin-S142C, it was revealed that immunoassay is possible by Gaussia luciferase activity and aequorin activity.

本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質などは、カルシウムイオンの検出または測定に好適に利用することができる。また、本発明の融合蛋白質、ホロ蛋白質などは、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することもできる。さらに、本発明の融合蛋白質、ホロ蛋白質などは、検出マーカー、アミューズメント用品の材料などとして利用することもできる。
本発明のポリヌクレオチドは、上述した本発明の融合蛋白質をコードしているので、レポーター遺伝子として利用することができる。
また、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の形質転換体などは、本発明の融合蛋白質の製造に利用することができる。 The fusion protein of the present invention, the holoprotein of the present invention and the like can be suitably used for the detection or measurement of calcium ions. Further, the fusion protein, holoprotein and the like of the present invention can also be used as a reporter protein for measuring transcriptional activity of a promoter and the like. Furthermore, the fusion protein, holoprotein and the like of the present invention can also be used as detection markers, materials for amusement goods, and the like.
Since the polynucleotide of the present invention encodes the above-described fusion protein of the present invention, it can be used as a reporter gene.
Moreover, the polynucleotide of the present invention, the vector of the present invention, the transformant of the present invention, and the like can be used for the production of the fusion protein of the present invention.

Claims

（１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１の領域：
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列において１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域、
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域、および、
（ｄ）配列番号：１の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域；と、
（２）以下の（ｅ）および（ｆ）からなる群から選択される第２の領域：
（ｅ）配列番号：６のアミノ酸配列からなる領域、および、
（ｆ）配列番号：６のアミノ酸配列において、第１３９番目のシステインを除く１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；と、
を含有する融合蛋白質。 (1) A first region selected from the group consisting of the following (a) to (d):
(A) a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
(B) a region consisting of an amino acid sequence in which 1 to 15 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a luminescence catalytic activity using luciferin as a substrate;
(C) a region consisting of an amino acid sequence having 90 % or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and having a luminescent catalytic activity using luciferin as a substrate;
(D) A luminescent catalyst comprising an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that hybridizes under high stringency conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and using luciferin as a substrate A region having activity; and
(2) A second region selected from the group consisting of the following (e) and (f):
(E) a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and
(F) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids excluding the 139th cysteine are deleted, substituted, inserted and / or added, and a coelenterazine peroxide or coelenterazine derivative A region having a function capable of binding to peroxide to form a holoprotein that emits light by the action of calcium ions;
A fusion protein containing

第２の領域が、以下の（ｅ）および（ｆ）からなる群：
（ｅ）配列番号：６のアミノ酸配列からなる領域、および、
（ｆ）配列番号：６のアミノ酸配列において、第１３９番目のシステインを除く１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；
から選択される、請求項１記載の融合蛋白質。 The second region is a group consisting of the following (e) and (f):
(E) a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and
(F) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids excluding the 139th cysteine are deleted, substituted, inserted and / or added, and a coelenterazine peroxide or coelenterazine derivative A region having a function capable of forming a holoprotein that binds to a peroxide and emits light by the action of calcium ions;
The fusion protein of claim 1 selected from

前記第１の領域が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群：
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域、
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域、および、
（ｄ）配列番号：１の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域；
から選択される、請求項１または２に記載の融合蛋白質。 The first region is composed of the following groups (a) to (d):
(A) a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
(B) a region consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a luminescence catalytic activity using luciferin as a substrate;
(C) a region consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a luminescent catalytic activity using luciferin as a substrate, and
(D) A luminescent catalyst comprising an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that hybridizes under high stringency conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and using luciferin as a substrate A region having activity;
The fusion protein according to claim 1 or 2, which is selected from:

（１）配列番号：２で表される第１のアミノ酸配列からなる領域と、
（２）配列番号：６で表される第２のアミノ酸配列からなる領域
とを含有する、請求項１記載の融合蛋白質。 (1) a region consisting of the first amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(2) The fusion protein according to claim 1, comprising a region consisting of the second amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.

さらに、翻訳促進のためのアミノ酸配列および／または精製のためのアミノ酸配列を含有する、請求項１〜４のいずれかに記載の融合蛋白質。 The fusion protein according to any one of claims 1 to 4, further comprising an amino acid sequence for promoting translation and / or an amino acid sequence for purification.

配列番号：８のアミノ酸配列からなる、請求項１記載の融合蛋白質。 The fusion protein according to claim 1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

請求項１〜６のいずれかに記載の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドまたはセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質。 A holoprotein comprising the fusion protein according to claim 1 and a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative.

請求項１〜６のいずれかに記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding the fusion protein according to any one of claims 1 to 6.

（１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１のコード配列：
（ａ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および、
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列において１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；と、
（２）以下の（ｅ）〜（ｇ）からなる群から選択される第２のコード配列：
（ｅ）配列番号：５の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：６のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および、
（ｇ）配列番号：６のアミノ酸配列において第１３９番目のシステインを除く１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
とを含有するポリヌクレオチド。 (1) A first coding sequence selected from the group consisting of the following (a) to (d):
(A) a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1,
(B) a polynucleotide that encodes a region having a luminescent catalytic activity that hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under highly stringent conditions and uses luciferin as a substrate; A polynucleotide containing,
(C) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and
(D) a poly which encodes a region having an amino acid sequence in which 1 to 15 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a luminescence catalytic activity using luciferin as a substrate; A polynucleotide containing nucleotides; and
(2) A second coding sequence selected from the group consisting of the following (e) to (g):
(E) a polynucleotide containing a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 5,
(F) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and
(G) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 15 amino acids excluding the 139th cysteine are deleted, substituted, inserted and / or added, and a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative A polynucleotide containing a polynucleotide that encodes a region having a function capable of forming a holoprotein that emits light by the action of calcium ions by binding to a calcium ion;
A polynucleotide comprising

第１のコード配列が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群：
（ａ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および、
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
から選択される、請求項９に記載のポリヌクレオチド。 The first coding sequence consists of the following groups (a) to (d):
(A) a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1,
(B) a polynucleotide that encodes a region having a luminescent catalytic activity that hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under highly stringent conditions and uses luciferin as a substrate; A polynucleotide containing,
(C) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and
(D) a poly which encodes a region consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a luminescent catalytic activity using luciferin as a substrate; A polynucleotide containing nucleotides;
The polynucleotide of claim 9 selected from.

配列番号：７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 A polynucleotide comprising a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.

請求項８〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。 A recombinant vector containing the polynucleotide according to any one of claims 8 to 11.

請求項１２記載の組換えベクターが導入された形質転換体。 A transformant into which the recombinant vector according to claim 12 has been introduced.

請求項１３記載の形質転換体を培養し、請求項１〜６のいずれかに記載の融合蛋白質を生成させる工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の融合蛋白質の製造方法。 The method for producing a fusion protein according to any one of claims 1 to 6, comprising a step of culturing the transformant according to claim 13 to produce the fusion protein according to any one of claims 1 to 6.

請求項１〜６のいずれかに記載の融合蛋白質または請求項７に記載のホロ蛋白質を含むキット。 A kit comprising the fusion protein according to any one of claims 1 to 6 or the holoprotein according to claim 7.

請求項１〜６のいずれかに記載の融合蛋白質または請求項７に記載のホロ蛋白質を含むイムノアッセイ用キット。 An immunoassay kit comprising the fusion protein according to any one of claims 1 to 6 or the holoprotein according to claim 7.

請求項１〜６のいずれかに記載の融合蛋白質または請求項７に記載のホロ蛋白質を使用してカルシウムイオンを検出または定量する方法。 A method for detecting or quantifying calcium ions using the fusion protein according to any one of claims 1 to 6 or the holoprotein according to claim 7.

請求項１〜６のいずれかに記載の融合蛋白質または請求項７に記載のホロ蛋白質を用いたイムノアッセイ法。
An immunoassay method using the fusion protein according to any one of claims 1 to 6 or the holoprotein according to claim 7.