JP5697383B2 - Search method for malodor control agent - Google Patents
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Description
本発明は、悪臭抑制剤を探索する方法に関する。 The present invention relates to a method for searching for malodor control agents.
我々の生活環境には、極性や分子量が異なる多数の悪臭分子が存在する。多様な悪臭分子を消臭するために、これまで様々な消臭方法が開発されてきた。一般的に消臭方法は、生物的方法、化学的方法、物理的方法、感覚的方法に大別される。悪臭分子の中で、極性の高い短鎖脂肪酸やアミン類については、化学的方法、すなわち中和反応による消臭が可能である。またチオールなどの硫黄化合物に関しては、物理的方法、すなわち吸着処理による消臭が可能である。しかし、中鎖・長鎖脂肪酸やスカトールなど、従来の消臭法では対応できない悪臭分子が数多く残されている。 There are many malodorous molecules with different polarities and molecular weights in our living environment. Various deodorizing methods have been developed so far to deodorize various malodorous molecules. In general, deodorization methods are roughly classified into biological methods, chemical methods, physical methods, and sensory methods. Among the malodorous molecules, highly polar short chain fatty acids and amines can be deodorized by a chemical method, that is, neutralization reaction. In addition, sulfur compounds such as thiols can be deodorized by a physical method, that is, adsorption treatment. However, many malodorous molecules such as medium- and long-chain fatty acids and skatole remain that cannot be handled by the conventional deodorization method.
ヒト等の哺乳動物においては、匂いは、鼻腔上部の嗅上皮に存在する嗅神経細胞上の嗅覚受容体に匂い分子が結合し、それに対する受容体の応答が中枢神経系へと伝達されることにより認識されている。ヒトの場合、嗅覚受容体は３８７個存在することが報告されており、これらをコードする遺伝子はヒトの全遺伝子の約３％にあたる。
一般的に、嗅覚受容体と匂い分子は複数対複数の組み合わせで対応付けられている。すなわち、個々の嗅覚受容体は構造の類似した複数の匂い分子を異なる親和性で受容し、一方で、個々の匂い分子は複数の嗅覚受容体によって受容される。さらに、ある嗅覚受容体を活性化する匂い分子が、別の嗅覚受容体の活性化を阻害するアンタゴニストとして働くことも報告されている。これら複数の嗅覚受容体の応答の組み合わせが、個々の匂いの認識をもたらしている。
In mammals such as humans, the smell is bound to the olfactory receptor on the olfactory nerve cell located in the olfactory epithelium in the upper nasal cavity, and the response of the receptor is transmitted to the central nervous system. It is recognized by. In humans, it has been reported that there are 387 olfactory receptors, and the genes encoding them are about 3% of all human genes.
In general, olfactory receptors and odor molecules are associated with each other in a plurality of combinations. That is, each olfactory receptor receives a plurality of odor molecules with similar structures with different affinities, while each odorant receptor is received by a plurality of olfactory receptors. Furthermore, it has been reported that an odor molecule that activates one olfactory receptor acts as an antagonist that inhibits activation of another olfactory receptor. The combination of these multiple olfactory receptor responses has led to the recognition of individual odors.
従って、同じ匂い分子が存在する場合でも、同時に他の匂い分子が存在すると、当該他の匂い分子によって受容体応答が阻害され、最終的に認識される匂いが全く異なることがある。このような仕組みを嗅覚受容体のアンタゴニズムと呼ぶ。この受容体アンタゴニズムによる匂いの変調は、香水や芳香剤等の別の匂いを付加することによる消臭方法と異なり、悪臭の認識を特異的に失くしてしまうことができる。また芳香剤の匂いによる不快感が生じることもない。 Therefore, even when the same odor molecule is present, if another odor molecule is present at the same time, the receptor response is inhibited by the other odor molecule, and the finally recognized odor may be completely different. This mechanism is called olfactory receptor antagonism. Unlike the deodorization method by adding another odor such as a perfume or a fragrance, the odor modulation by this receptor antagonism can specifically lose the recognition of a bad odor. In addition, there is no discomfort due to the smell of the fragrance.
体臭の代表的な原因物質であるノナン酸やヘキサン酸、イソ吉草酸等については、従来、その匂いは、防臭又は消臭剤の使用や香料や芳香剤の使用（特許文献１〜２及び非特許文献１）などの手段により防臭・消臭されていた。しかし、これらの手段は、そもそもの匂い物質の発生を減少させるか又は別の匂いをより強く認識させる方法であって、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングによる消臭とは異なる。また従来の方法では、消臭剤を使用する場合は、匂い物質減少までに時間を要するため即効性に欠ける。芳香剤を使用する場合、芳香剤自体の匂いに対する不快感が生じることがある。あるいは従来の方法では、目的とする悪臭以外の匂いも消されてしまう場合がある。嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングによる消臭であれば、上記の点を解消できる可能性がある。
For nonanoic acid, hexanoic acid, isovaleric acid, and the like, which are representative causative substances of body odor, the odor has been conventionally used as a deodorant or a deodorant, or as a fragrance or a fragrance (
嗅覚受容体アンタゴニズムのためには、個々の悪臭分子に対して有効な嗅覚受容体アンタゴニスト作用を示す物質を探索、同定しなければならないが、そのような探索は容易ではない。従来、匂いの評価は、専門家による官能試験によって行われてきた。しかし、官能試験には、匂いを評価できる専門家の育成が必要なことや、スループット性が低いなどの問題がある。 For olfactory receptor antagonism, it is necessary to search for and identify substances that exhibit an effective olfactory receptor antagonistic action against individual malodorous molecules, but such a search is not easy. Conventionally, odor evaluation has been performed by sensory tests by experts. However, the sensory test has problems such as the need to train experts who can evaluate odors and low throughput.
嗅覚受容体アンタゴニズムによる匂い制御のためには、匂いと嗅覚受容体とを関連付けることは重要であろう。ノナン酸やヘキサン酸を受容する嗅覚受容体に関しては、これまでに、OR2W1がヘキサン酸およびノナン酸に対して応答すること、OR51E1がノナン酸に対して応答すること、及びOR51L1がヘキサン酸に応答することが報告されている（非特許文献２）。またOR51E1がイソ吉草酸に対して応答するという報告もある（非特許文献３）。 For odor control by olfactory receptor antagonism, it is important to associate odors with olfactory receptors. Regarding olfactory receptors that accept nonanoic acid and hexanoic acid, OR2W1 responds to hexanoic acid and nonanoic acid, OR51E1 responds to nonanoic acid, and OR51L1 responds to hexanoic acid. It has been reported (Non-Patent Document 2). There is also a report that OR51E1 responds to isovaleric acid (Non-patent Document 3).
本発明は、嗅覚受容体の活動を指標として悪臭抑制剤を探索する方法を提供する。 The present invention provides a method for searching for malodor inhibitors using olfactory receptor activity as an index.
本発明者は、ノナン酸、ヘキサン酸、イソ吉草酸臭等の悪臭原因物質に応答する嗅覚受容体を新たに同定することに成功した。さらに本発明者は、当該嗅覚受容体の活動を抑制する物質を、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングにより悪臭を抑制する悪臭抑制剤として用いることができることを見出し、本発明を完成した。 The present inventor succeeded in newly identifying an olfactory receptor that responds to malodor-causing substances such as nonanoic acid, hexanoic acid, and isovaleric acid odor. Furthermore, the present inventors have found that a substance that suppresses the activity of the olfactory receptor can be used as a malodor suppressant that suppresses malodor by masking with olfactory receptor antagonism, and has completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下を提供する。
（１）以下の工程を含む悪臭抑制剤の探索方法：
OR2W1、OR10A6、OR51E1、OR51I2及びOR51L1から選択される嗅覚受容体のいずれか１種に試験物質及び悪臭の原因物質を添加する工程；
当該悪臭の原因物質に対する当該嗅覚受容体の活動を測定する工程；
測定された活動に基づいて当該嗅覚受容体の活動を抑制する試験物質を同定する工程；
当該同定された試験物質を、悪臭抑制剤として選択する工程。
（２）前記悪臭がヘキサン酸の匂いである（１）記載の方法。
（３）前記悪臭がノナン酸の匂いである（１）記載の方法。
（４）前記悪臭がイソ吉草酸の匂いである（１）記載の方法。
（５）前記嗅覚受容体がOR10A6、OR51E1及びOR51I2から選択される（２）記載の方法。
（６）前記嗅覚受容体がOR10A6である（３）記載の方法。
（７）前記嗅覚受容体がOR51I2である（４）記載の方法。
That is, the present invention provides the following.
(1) Search method for malodor control agent including the following steps:
Adding a test substance and a odor-causing substance to any one of olfactory receptors selected from OR2W1, OR10A6, OR51E1, OR51I2, and OR51L1;
Measuring the activity of the olfactory receptor against the causative agent of the malodor;
Identifying a test substance that inhibits the activity of the olfactory receptor based on the measured activity;
A step of selecting the identified test substance as a malodor control agent.
(2) The method according to (1), wherein the malodor is a smell of hexanoic acid.
(3) The method according to (1), wherein the malodor is nonanoic acid.
(4) The method according to (1), wherein the malodor is isovaleric acid.
(5) The method according to (2), wherein the olfactory receptor is selected from OR10A6, OR51E1, and OR51I2.
(6) The method according to (3), wherein the olfactory receptor is OR10A6.
(7) The method according to (4), wherein the olfactory receptor is OR51I2.
本発明によれば、従来の消臭剤や芳香剤を用いる消臭方法において生じていた即効性の低さや芳香剤の匂いに基づく不快感等の問題を生じることがなく、悪臭を特異的に消臭することができる悪臭抑制剤を、効率よく探索することができる。 According to the present invention, there is no problem such as low immediate effect and discomfort based on the odor of the fragrance, which have occurred in the conventional odor eliminating method using the odor eliminating agent or fragrance, and the odor is specifically detected. It is possible to efficiently search for malodor control agents that can be deodorized.
本明細書において、匂いに関する用語「マスキング」とは、目的の匂いを認識させなくするか又は認識を弱めるための手段全般を指す。「マスキング」は、化学的手段、物理的手段、生物的手段、及び感覚的手段を含み得る。例えば、マスキングとしては、目的の匂いの原因となる匂い分子を環境から除去するための任意の手段（例えば、匂い分子の吸着及び化学的分解）、目的の匂いが環境に放出されないようにするための手段(例えば、封じ込め)、香料や芳香剤などの別の匂いを添加して目的の匂いを認識しにくくする方法、等が挙げられる。 In this specification, the term “masking” relating to odor refers to all means for making the target odor unrecognized or weakening recognition. “Masking” may include chemical means, physical means, biological means, and sensory means. For example, as masking, any means for removing odor molecules that cause the target odor from the environment (for example, adsorption and chemical decomposition of odor molecules), to prevent the target odor from being released into the environment. (For example, containment), a method of adding another odor such as a fragrance or a fragrance to make it difficult to recognize the target odor, and the like.
本明細書における「嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキング」とは、上述の広義の「マスキング」の一形態であって、目的の匂いの匂い分子と他の匂い分子をともに適用することにより、当該他の匂い分子によって目的の匂い分子に対する受容体応答を阻害し結果的に個体に認識される匂いを変化させる手段である。嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングは、同様に他の匂い分子を用いる手段であっても、芳香剤等の、目的の匂いを別の強い匂いによって打ち消す手段とは区別される。嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングの一例は、アンタゴニスト（拮抗剤）等の嗅覚受容体の活動を阻害する物質を使用するケースである。特定の匂いをもたらす匂い分子の受容体にその活動を阻害する物質を適用すれば、当該受容体の当該匂い分子に対する応答活動が抑制されるため、最終的に個体に知覚される匂いを変化させることができる。 In the present specification, “masking by olfactory receptor antagonism” is a form of the above-mentioned “masking” in a broad sense, and by applying both an odor molecule of a target odor and another odor molecule, This is a means to inhibit the receptor response to the target odor molecule by the odor molecule of the target and consequently change the odor recognized by the individual. Masking by olfactory receptor antagonism is distinguished from means for canceling the target odor by another strong odor, such as a fragrance, even if the means uses other odor molecules. One example of masking by olfactory receptor antagonism is the case of using a substance that inhibits the activity of the olfactory receptor, such as an antagonist (antagonist). If a substance that inhibits the activity is applied to the receptor of the odor molecule that brings about a specific odor, the response activity of the receptor to the odor molecule is suppressed, so that the odor finally perceived by the individual is changed. be able to.
従って本発明は、悪臭抑制剤の探索方法を提供する。当該方法は、OR2W1、OR10A6、OR51E1、OR51I2及びOR51L1から選択される嗅覚受容体のいずれか１種に試験物質及び悪臭の原因物質を添加する工程；当該嗅覚受容体の活動を測定する工程；測定された活動に基づいて当該嗅覚受容体の活動を抑制する試験物質を同定する工程；及び、当該同定された試験物質を、悪臭抑制剤として選択する工程を含む。 Therefore, this invention provides the search method of a malodor control agent. The method comprises the steps of adding a test substance and a malodor causing substance to any one of olfactory receptors selected from OR2W1, OR10A6, OR51E1, OR51I2 and OR51L1; measuring the activity of the olfactory receptors; Identifying a test substance that suppresses the activity of the olfactory receptor based on the identified activity; and selecting the identified test substance as a malodor suppressant.
本発明の方法においては、悪臭に応答する嗅覚受容体に、試験物質及び当該悪臭の原因物質が添加される。本発明の方法で使用される嗅覚受容体としては、OR2W1、OR10A6、OR51E1、OR51I2及びOR51L1から選択される嗅覚受容体のいずれか１が挙げられる。
OR2W1、OR10A6、OR51E1、OR51I2及びOR51L1は、ヒト嗅細胞で発現している嗅覚受容体であり、それぞれ、GenBankに GI:169234788、52218835、205277377、284172435、及び52317143として登録されている。
OR10A6は、配列番号１で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
OR2W1は、配列番号３で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
OR51E1は、配列番号５で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
OR51I2は、配列番号７で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
OR51L1は、配列番号９で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
また、本発明の方法に使用される嗅覚受容体としては、上記OR2W1、OR10A6、OR51E1、OR51I2又はOR51L1のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ノナン酸、ヘキサン酸又はイソ吉草酸等の悪臭に対する応答性を有するポリペプチドが挙げられる。本発明の方法では、当該嗅覚受容体のうちのいずれかを単独で使用してもよく、又は複数を組み合わせて使用してもよい。
In the method of the present invention, a test substance and a causative substance of the malodor are added to an olfactory receptor that responds to malodor. The olfactory receptor used in the method of the present invention includes any one of olfactory receptors selected from OR2W1, OR10A6, OR51E1, OR51I2, and OR51L1.
OR2W1, OR10A6, OR51E1, OR51I2, and OR51L1 are olfactory receptors expressed in human olfactory cells, and are registered in GenBank as GI: 169234788, 52188835, 205277377, 284172435, and 52317143, respectively.
OR10A6 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, encoded by a gene having the gene sequence represented by SEQ ID NO: 1.
OR2W1 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 encoded by a gene having the gene sequence represented by SEQ ID NO: 3.
OR51E1 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 encoded by a gene having the gene sequence represented by SEQ ID NO: 5.
OR51I2 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, encoded by a gene having the gene sequence represented by SEQ ID NO: 7.
OR51L1 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, encoded by a gene having the gene sequence represented by SEQ ID NO: 9.
The olfactory receptor used in the method of the present invention is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, with respect to the amino acid sequence of OR2W1, OR10A6, OR51E1, OR51I2 or OR51L1. More preferred is a polypeptide having an amino acid sequence having a sequence identity of 95% or more, more preferably 98% or more, and having a response to malodor such as nonanoic acid, hexanoic acid or isovaleric acid. In the method of the present invention, any one of the olfactory receptors may be used alone, or a plurality may be used in combination.
上記嗅覚受容体は、図１及び２に示すとおり、ノナン酸、ヘキサン酸又はイソ吉草酸に対して応答を示すので、これらの受容体の応答活動を抑制する物質は、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングにより中枢におけるノナン酸臭、ヘキサン酸臭又はイソ吉草酸臭の認識に変化を生じさせ、結果としてノナン酸、ヘキサン酸又はイソ吉草酸による悪臭を抑制することができる。従って、本発明で使用される悪臭の原因物質としては、ノナン酸、ヘキサン酸又はイソ吉草酸が好ましく、また本発明の方法で探索された悪臭抑制剤によって抑制される悪臭としては、ヘキサン酸臭、ノナン酸臭及びイソ吉草酸臭が挙げられる。ヘキサン酸臭、ノナン酸臭及びイソ吉草酸臭は、例えば汗や皮脂を原因とする体臭の匂い（もしくは脂肪酸臭）等として一般的に知られている。 As shown in FIGS. 1 and 2, the olfactory receptor exhibits a response to nonanoic acid, hexanoic acid or isovaleric acid. Therefore, substances that suppress the response activity of these receptors are olfactory receptor antagonism. Based on the masking based, it is possible to change the recognition of nonanoic acid odor, hexanoic acid odor or isovaleric acid odor in the center, and as a result, malodor due to nonanoic acid, hexanoic acid or isovaleric acid can be suppressed. Therefore, nonanoic acid, hexanoic acid or isovaleric acid is preferred as the causative substance of malodor used in the present invention, and the malodor suppressed by the malodor suppressant searched for by the method of the present invention is hexanoic acid odor. Nonanoic acid odor and isovaleric odor. Hexanoic acid odor, nonanoic acid odor and isovaleric odor are generally known as body odor (or fatty acid odor) caused by sweat or sebum, for example.
従って、本発明の方法においてヘキサン酸臭の抑制剤を探索する場合には、使用される嗅覚受容体は、OR2W1、OR10A6、OR51E1、OR51I2及びOR51L1から選択され、好ましくは、OR10A6、OR51E1及びOR51I2から選択され、使用される悪臭の原因物質はヘキサン酸である。また、本発明の方法においてノナン酸臭の抑制剤を探索する場合には、使用される嗅覚受容体は、OR2W1、OR10A6及びOR51E1から選択され、好ましくはOR10A6であり、使用される悪臭の原因物質はノナン酸である。また、本発明の方法においてイソ吉草酸臭の抑制剤を探索する場合には、使用される嗅覚受容体は、OR51I2及びOR51E1から選択され、好ましくはOR51I2であり、使用される悪臭の原因物質はイソ吉草酸である。 Therefore, when searching for an inhibitor of hexanoic acid odor in the method of the present invention, the olfactory receptor used is selected from OR2W1, OR10A6, OR51E1, OR51I2, and OR51L1, preferably from OR10A6, OR51E1 and OR51I2. The causative agent of malodor selected and used is hexanoic acid. Further, when searching for a nonanoic acid odor inhibitor in the method of the present invention, the olfactory receptor used is selected from OR2W1, OR10A6 and OR51E1, preferably OR10A6, and the malodor causing substance used Is nonanoic acid. When searching for an inhibitor of isovaleric acid odor in the method of the present invention, the olfactory receptor to be used is selected from OR51I2 and OR51E1, preferably OR51I2, and the malodor causing substance used is Isovaleric acid.
あるいは、ヘキサン酸臭及びノナン酸臭の両方に応答する嗅覚受容体を用いることによって、当該臭いの両方を抑制する悪臭抑制剤を探索することができる。この場合、使用される嗅覚受容体はOR2W1、OR10A6、及びOR51E1から選択され、好ましくは、OR10A6である。またあるいは、ヘキサン酸臭及びイソ吉草酸臭の両方に応答する嗅覚受容体を用いることによって、当該臭いの両方を抑制する悪臭抑制剤を探索することができる。この場合、使用される嗅覚受容体はOR51I2及びOR51E1から選択され、好ましくは、OR51I2である。またあるいは、ノナン酸臭及びイソ吉草酸臭の両方に応答する嗅覚受容体を用いることによって、当該臭いの両方を抑制する悪臭抑制剤を探索することができる。この場合、使用される嗅覚受容体は、好ましくはOR51E1である。またあるいは、ヘキサン酸臭、ノナン酸臭及びイソ吉草酸臭のいずれにも応答する嗅覚受容体を用いることによって、当該３種類の臭いを抑制する悪臭抑制剤を探索することができる。この場合、使用される嗅覚受容体は、好ましくはOR51E1である。 Alternatively, by using an olfactory receptor that responds to both a hexanoic acid odor and a nonanoic acid odor, it is possible to search for a malodor inhibitor that suppresses both of the odors. In this case, the olfactory receptor used is selected from OR2W1, OR10A6, and OR51E1, preferably OR10A6. Alternatively, by using an olfactory receptor that responds to both a hexanoic acid odor and an isovaleric acid odor, a malodor inhibitor that suppresses both of the odors can be searched. In this case, the olfactory receptor used is selected from OR51I2 and OR51E1, preferably OR51I2. Alternatively, by using an olfactory receptor that responds to both a nonanoic acid odor and an isovaleric acid odor, a malodor inhibitor that suppresses both of the odors can be searched. In this case, the olfactory receptor used is preferably OR51E1. Alternatively, by using an olfactory receptor that responds to any of hexanoic acid odor, nonanoic acid odor, and isovaleric acid odor, a malodor suppressor that suppresses the three kinds of odors can be searched. In this case, the olfactory receptor used is preferably OR51E1.
本発明の方法に使用される試験物質は、悪臭抑制剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。 The test substance used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance desired to be used as a malodor control agent. The test substance may be a naturally occurring substance, a substance artificially synthesized by a chemical or biological method, etc., and may be a compound, a composition or a mixture. Good.
本発明の方法において、嗅覚受容体は、受容体の機能を失わない限り、任意の形態で使用され得る。例えば、嗅覚受容体は、生体から単離された嗅覚受容器若しくは嗅細胞等の天然に嗅覚受容体を発現する組織や細胞、又はそれらの培養物；当該嗅覚受容体を担持した嗅細胞の膜；当該嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞又はその培養物；当該組換え細胞の膜；及び、当該嗅覚受容体を有する人工脂質二重膜、等の形態で使用され得る。これらの形態は全て、本発明で使用される嗅覚受容体の範囲に含まれる。 In the method of the present invention, the olfactory receptor can be used in any form as long as the function of the receptor is not lost. For example, an olfactory receptor is a tissue or cell that naturally expresses an olfactory receptor, such as an olfactory receptor or olfactory cell isolated from a living body, or a culture thereof; a membrane of an olfactory cell carrying the olfactory receptor Used in the form of a recombinant cell or culture thereof genetically engineered to express the olfactory receptor; a membrane of the recombinant cell; and an artificial lipid bilayer membrane having the olfactory receptor Can be done. All of these forms fall within the scope of the olfactory receptor used in the present invention.
好ましい態様においては、嗅細胞等の天然に嗅覚受容体を発現する細胞、又は嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞、あるいはそれらの培養物が使用される。当該組換え細胞は、嗅覚受容体をコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。このとき、好適には、嗅覚受容体の細胞膜発現を促進するために、RTP1Sを受容体と共に遺伝子導入する。
上記組換え細胞の作製に使用できるRTP1Sとしては、例えば、ヒトRTP1Sが挙げられる。ヒトRTP1Sは、GenBankにGI:50234917として登録されている。ヒトRTP1Sは、配列番号１１で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。また、ヒトRTP1Sの代わりに、ヒトRTP1Sのアミノ酸配列（配列番号１２）に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトRTP1Sと同様に、嗅覚受容体の膜における発現を促進するポリペプチドを使用してもよい。例えば、マウスRTP1S（上述のZhuang H and Matsunami H）は、配列番号１２で示されるアミノ酸配列と８９％の配列同一性を有し、且つ嗅覚受容体の膜における発現を促進する機能を有し、上記組換え細胞の作製に使用することができる蛋白質である。
In a preferred embodiment, cells that naturally express olfactory receptors such as olfactory cells, recombinant cells genetically engineered to express olfactory receptors, or cultures thereof are used. The recombinant cell can be produced by transforming a cell using a vector incorporating a gene encoding an olfactory receptor. At this time, RTP1S is preferably introduced together with the receptor in order to promote cell membrane expression of the olfactory receptor.
Examples of RTP1S that can be used for the production of the recombinant cell include human RTP1S. Human RTP1S is registered in GenBank as GI: 50234917. Human RTP1S is a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 encoded by a gene having a gene sequence represented by SEQ ID NO: 11. Further, instead of human RTP1S, the amino acid sequence of human RTP1S (SEQ ID NO: 12) is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and still more preferably 98%. A polypeptide that has an amino acid sequence having a sequence identity of at least% and promotes expression in the membrane of the olfactory receptor may be used in the same manner as human RTP1S. For example, mouse RTP1S (Zhuang H and Matsunami H described above) has 89% sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, and has a function of promoting expression in the membrane of the olfactory receptor, It is a protein that can be used to produce the above recombinant cells.
本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の配列同一性は、リップマン−パーソン法（Lipman-Pearson法；Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ｖｅｒ.５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行なうことにより算出される。 In this specification, the sequence identity of a base sequence and an amino acid sequence is calculated by the Lippman-Pearson method (Lipman-Pearson method; Science, 227, 1435, (1985)). Specifically, using the homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win (Ver. 5.1.1; software development), the unit size to compare (ktup) should be set to 2. Is calculated by
本発明の方法によれば、試験物質及び悪臭の原因物質の添加に続いて、当該悪臭の原因物質に対する嗅覚受容体の活動が測定される。測定は嗅覚受容体の活動を測定する方法として当該分野で知られている任意の方法、例えば、カルシウムイメージング法等によって行えばよい。例えば、嗅覚受容体は、匂い分子によって活性化されると、細胞内のＧαｓと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させることが知られている（Mombaerts P. Nat Neurosci. 5. 263-278）。従って、匂い分子添加後の細胞内ｃＡＭＰ量を指標にすることで、嗅覚受容体の活動を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法やレポータージーンアッセイ法等が挙げられる。 According to the method of the present invention, following the addition of the test substance and the odor-causing substance, the activity of the olfactory receptor for the odor-causing substance is measured. The measurement may be performed by any method known in the art as a method for measuring the activity of the olfactory receptor, such as a calcium imaging method. For example, when the olfactory receptor is activated by an odor molecule, it is known to increase the amount of intracellular cAMP by activating adenylate cyclase coupled with intracellular Gαs (Mombaerts P Nat Neurosci. 5. 263-278). Therefore, the activity of the olfactory receptor can be measured by using the amount of intracellular cAMP after addition of the odor molecule as an index. Examples of the method for measuring the amount of cAMP include an ELISA method and a reporter gene assay method.
次いで、測定された嗅覚受容体の活動に基づいて、当該受容体の活動に対する試験物質の抑制効果を評価し、当該活動を抑制する試験物質を同定する。抑制効果の評価は、例えば、異なる濃度の試験物質を添加した場合に測定された悪臭原因物質に対する受容体の活動を比較することによって行うことができる。より具体的な例としては、より高濃度の試験物質添加群とより低濃度の試験物質添加群との間；試験物質添加群と非添加群との間；又は試験物質添加前後で、悪臭原因物質に対する受容体の活動を比較する。試験物質添加により、又はより高濃度の試験物質の添加により嗅覚受容体の活動が抑制される場合、当該試験物質を、当該嗅覚受容体の活動を抑制する物質として同定することができる。例えば、試験物質添加群における受容体活動が対照群と比較して８０％以下、好ましくは５０％以下に抑制されていれば、当該試験物質を、悪臭抑制剤として選択することができる。 Next, based on the measured activity of the olfactory receptor, the inhibitory effect of the test substance on the activity of the receptor is evaluated, and the test substance that suppresses the activity is identified. The inhibitory effect can be evaluated, for example, by comparing the activity of the receptor against the malodor-causing substance measured when different concentrations of the test substance are added. More specific examples are between higher test substance added group and lower test substance added group; between test substance added group and non-added group; or before and after adding test substance. Compare receptor activity for substances. When the activity of the olfactory receptor is suppressed by adding a test substance or by adding a higher concentration of the test substance, the test substance can be identified as a substance that suppresses the activity of the olfactory receptor. For example, if the receptor activity in the test substance addition group is suppressed to 80% or less, preferably 50% or less, compared to the control group, the test substance can be selected as a malodor control agent.
上記の手順で同定された試験物質は、上記手順で使用された悪臭に対する嗅覚受容体の活動を抑制することによって、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングにより中枢における当該悪臭の認識に変化を生じさせ、結果として当該悪臭を個体が認識できないようにすることができる物質である。従って、上記手順で同定された試験物質は、上記手順で使用された悪臭に対する悪臭抑制剤として選択される。 The test substance identified in the above procedure causes a change in the recognition of the malodor in the center by masking based on olfactory receptor antagonism by suppressing the activity of the olfactory receptor against the malodor used in the above procedure. As a result, it is a substance that can prevent the individual from recognizing the malodor. Therefore, the test substance identified by the above procedure is selected as a malodor control agent for the malodor used in the above procedure.
本発明の方法によって選択された悪臭抑制剤は、悪臭に対する嗅覚受容体の活動抑制に基づく嗅覚マスキングによって、当該悪臭を抑制するために使用することができ、また、当該悪臭を抑制するための化合物又は組成物の製造のために使用することができる。当該悪臭抑制用化合物又は組成物は、当該悪臭抑制剤に加えて、他の消臭効果を有する成分、又は消臭剤や防臭剤に使用される任意の成分、例えば、香料、粉末成分、液体油脂、固体油脂、ロウ、炭化水素、植物抽出物、漢方成分、高級アルコール類、低級アルコール類、エステル類、長鎖脂肪酸、界面活性剤（非イオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤等）、ステロール類、多価アルコール類、保湿剤、水溶性高分子化合物、増粘剤、皮膜剤、殺菌剤、防腐剤、紫外線吸収剤、保留剤、冷感剤、温感剤、刺激剤、金属イオン封鎖剤、糖分、アミノ酸類、有機アミン類、合成樹脂エマルジョン、ｐＨ調製剤、酸化防止剤、酸化防止助剤、油分、粉体、カプセル類、キレート剤、無機塩、有機塩色素、増粘剤、殺菌剤、防腐剤、防カビ剤、着色剤、消泡剤、増量剤、変調剤、有機酸、ポリマー、ポリマー分散剤、酵素、酵素安定剤等を、その目的に応じて適宜含有していてもよい。 The malodor suppressor selected by the method of the present invention can be used to suppress the malodor by olfactory masking based on the suppression of the activity of the olfactory receptor against malodor, and a compound for suppressing the malodor Or it can be used for the manufacture of the composition. The malodor control compound or composition includes, in addition to the malodor control agent, other components having a deodorizing effect, or any component used for the deodorant or deodorant, for example, perfume, powder component, liquid Fats and oils, solid fats and oils, waxes, hydrocarbons, plant extracts, Chinese herbal ingredients, higher alcohols, lower alcohols, esters, long chain fatty acids, surfactants (nonionic surfactants, anionic surfactants, cationic surfactants) Agents, amphoteric surfactants, etc.), sterols, polyhydric alcohols, humectants, water-soluble polymer compounds, thickeners, film agents, bactericides, preservatives, UV absorbers, retention agents, cooling sensates, Warming agent, stimulant, sequestering agent, sugar, amino acids, organic amines, synthetic resin emulsion, pH adjuster, antioxidant, antioxidant assistant, oil, powder, capsules, chelating agent, inorganic Salt, organic salt dye, increase Contains appropriate agents, bactericides, antiseptics, fungicides, colorants, antifoaming agents, extenders, modulators, organic acids, polymers, polymer dispersants, enzymes, enzyme stabilizers, etc., depending on the purpose. It may be.
上記悪臭抑制用化合物又は組成物に含有され得る消臭効果を有する他の成分としては、化学的又は物理的な消臭効果を有する公知の消臭剤が何れも使用できるが、例えば、植物の葉、葉柄、実、茎、根、樹皮等の各部位から抽出された消臭有効成分（例えば、緑茶抽出物）；乳酸、グルコン酸、コハク酸、グルタン酸、アジピン酸、リンゴ酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸等の有機酸、各種アミノ酸およびこれらの塩、グリオキサール、酸化剤、フラボノイド類、カテキン類、ポリフェノール類；活性炭、ゼオライトなどの多孔性物質；シクロデキストリン類などの包接剤；光触媒；各種マスキング剤、等が挙げられる。 As other components having a deodorizing effect that can be contained in the malodor control compound or composition, any known deodorant having a chemical or physical deodorizing effect can be used. Deodorant active ingredient extracted from each part such as leaf, petiole, fruit, stem, root, bark (eg, green tea extract); lactic acid, gluconic acid, succinic acid, glutanic acid, adipic acid, malic acid, tartaric acid, Organic acids such as maleic acid, fumaric acid, itaconic acid, citric acid, benzoic acid, salicylic acid, various amino acids and their salts, glyoxal, oxidizing agents, flavonoids, catechins, polyphenols; porous materials such as activated carbon and zeolite Inclusion agents such as cyclodextrins; photocatalysts; various masking agents and the like.
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。 EXAMPLES Hereinafter, an Example is shown and this invention is demonstrated more concretely.
実施例１ ヒト嗅覚受容体遺伝子のクローニング
ヒト嗅覚受容体はGenBankに登録されている配列情報を基に、human genomic DNA female (G1521：Promega)を鋳型としたPCR法によりクローニングした。ＰＣＲ法により増幅した各遺伝子をpENTRベクター（Invitrogen）にマニュアルに従って組込み、pENTRベクター上に存在するNot I、Asc Iサイトを利用して、pME18Sベクター上のFlag-Rhoタグ配列の下流に作成したNot I、Asc Iサイトへと組換えた。
Example 1 Cloning of Human Olfactory Receptor Gene Human olfactory receptor was cloned by PCR using human genomic DNA female (G1521: Promega) as a template based on the sequence information registered in GenBank. Each gene amplified by the PCR method is inserted into the pENTR vector (Invitrogen) according to the manual, and Not I created downstream of the Flag-Rho tag sequence on the pME18S vector using the Not I and Asc I sites present on the pENTR vector. Recombined into I and Asc I sites.
実施例２ pME18S-hRTP1Sベクターの作製
ヒトRTP1Sはhuman RTP1遺伝子（MHS1010-9205862：Open Biosystems）を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲに用いるプライマーには、センス側にEcoR I、アンチセンス側にXho Iサイトを付加した。ＰＣＲ法により増幅したhRTP1S遺伝子をpME18SベクターのEcoR I、Xho Iサイトへ組込んだ。
Example 2 Production of pME18S-hRTP1S Vector Human RTP1S was cloned by PCR using the human RTP1 gene (MHS1010-9205862: Open Biosystems) as a template. The primers used for PCR were EcoR I on the sense side and Xho I site on the antisense side. The hRTP1S gene amplified by the PCR method was incorporated into the EcoR I and Xho I sites of the pME18S vector.
実施例３ 悪臭に応答する嗅覚受容体の同定
１）嗅覚受容体発現細胞の作製
ヒト嗅覚受容体３５０種をそれぞれ発現させたＨＥＫ２９３細胞を作製した。表１に示す組成の反応液を調製しクリーンベンチ内で１５分静置した後、９６ウェルプレート（ＢＤ）の各ウェルに添加した。次いで、ＨＥＫ２９３細胞（３×１０5細胞／ｃｍ2）を１００μｌずつ各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ2を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。
Example 3 Identification of Olfactory Receptor Responding to Malodor 1) Preparation of Olfactory Receptor-Expressing Cells HEK293 cells each expressing 350 types of human olfactory receptors were prepared. A reaction solution having the composition shown in Table 1 was prepared and allowed to stand in a clean bench for 15 minutes, and then added to each well of a 96-well plate (BD). Next, 100 μl of HEK293 cells (3 × 10 5 cells / cm 2 ) were seeded in each well and cultured for 24 hours in an incubator maintained at 37 ° C. and 5% CO 2 .
２）ルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞に発現させた嗅覚受容体は、細胞内在性のＧαｓと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。本研究での匂い応答測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（fluc2P-CRE-hygro）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＣＭＶプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの（hRluc-CMV）を同時に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。
上記１）で作製した培養物から、培地をピペットマンで取り除き、ＣＤ２９３培地（Invitrogen）で調製した匂い物質（ヘキサン酸１ｍＭ又はノナン酸３００μＭ）を含む溶液を７５μｌ添加した。細胞をＣＯ2インキュベータ内で４時間培養し、ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で十分に発現させた。ルシフェラーゼの活性測定には、Dual-GloTM luciferase assay system（promega）を用い、製品の操作マニュアルに従って測定を行った。匂い物質刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値を、匂い物質刺激を行わない細胞での発光値で割った値をfold increaseとして算出し、応答強度の指標とした。
2) Luciferase assay The olfactory receptor expressed in HEK293 cells increases the amount of intracellular cAMP by coupling with intracellular Gαs and activating adenylate cyclase. For the measurement of odor response in this study, a luciferase reporter gene assay was used to monitor the increase in intracellular cAMP level as a luminescence value derived from the firefly luciferase gene (fluc2P-CRE-hygro). In addition, a renilla luciferase gene fusion (hRluc-CMV) downstream of the CMV promoter was simultaneously introduced, and used as an internal standard for correcting errors in gene transfer efficiency and cell number.
From the culture prepared in 1) above, the medium was removed with Pipetman, and 75 μl of a solution containing an odorant (
３）結果
OR2W1、OR10A6、OR51E1、OR51I2、OR51L1の５種類の嗅覚受容体がヘキサン酸に対して応答を示し、OR2W1、OR10A6、OR51E1の３種類の嗅覚受容体がノナン酸に対して応答を示した（図１）。
3) Results
Five types of olfactory receptors OR2W1, OR10A6, OR51E1, OR51I2 and OR51L1 responded to hexanoic acid, and three types of olfactory receptors OR2W1, OR10A6 and OR51E1 responded to nonanoic acid (Fig. 1).
上記と同様の手順で、嗅覚受容体OR2W1、OR10A6、OR51E1、OR51I2、OR51L1のイソ吉草酸（０、３、１０、３０、１００、３００、及び１０００μＭ）に対する応答を調べた。嗅覚受容体OR51E1及びOR51I2が、イソ吉草酸に対して濃度依存的に応答した（図２）。 The response of the olfactory receptors OR2W1, OR10A6, OR51E1, OR51I2, and OR51L1 to isovaleric acid (0, 3, 10, 30, 100, 300, and 1000 μM) was examined by the same procedure as described above. The olfactory receptors OR51E1 and OR51I2 responded to isovaleric acid in a concentration-dependent manner (FIG. 2).
実施例４ 悪臭抑制剤の同定
実施例３で同定された嗅覚受容体を対象とし、５２種類の試験物質について嗅覚受容体活動に対する阻害活性を調べた。
実施例３と同様の方法でＨＥＫ２９３細胞にOR2W1、OR10A6、OR51E1、OR51I2、OR51L1をそれぞれ発現させ、ルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼアッセイにおいては、匂い物質としてヘキサン酸を用い、且つヘキサン酸とともに試験物質を添加した。ヘキサン酸に対する嗅覚受容体の応答を測定し、試験物質添加による受容体応答活動の低下を評価した。
試験物質による受容体活動の阻害率は、以下のとおり算出した。ヘキサン酸単独での匂い刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値（Ｘ）を、同じ受容体を導入し匂い刺激を行わなかった細胞での発光値（Ｙ）で引き算した。同様に、ヘキサン酸と試験物質の混合物での刺激による発光値（Ｚ）を、匂い刺激を行わない細胞での発光値（Ｙ）で引き算した。以下の計算式により、ヘキサン酸単独刺激による発光値の増加分（Ｘ−Ｙ）を基準に、試験物質による受容体活動阻害活性を算出した。独立した実験を二連で複数回行い、各回の実験の平均値を得た。
阻害率（％）＝｛１−（Ｚ−Ｙ）／（Ｘ−Ｙ）｝×１００
その結果、OR2W1に対しては７種類、OR10A6に対しては３種類、OR51E1に対しては７種類、OR51I2に対しては１０種類、OR51L1に対しては６種類の試験物質が、受容体活動阻害活性を示した（表２）。
さらに、阻害活性を示した試験物質のうちのいくつかに関して、ヘキサン酸応答の濃度依存的応答阻害を調べた。試験物質の濃度は、３、１０、３０、１００、３００μＭを用いた。各試験物質濃度下におけるヘキサン酸１ｍＭに対する受容体の応答について、試験物質濃度０μＭ下での受容体の応答強度を１００％として、相対応答強度を調べた。その結果、阻害活性を示した試験物質の中でもブルゲオナール及びフロルヒドラールが、４つの嗅覚受容体OR2W1、OR51E1、OR51I1、OR51L1のヘキサン酸応答を、いずれも濃度依存的に阻害することが示された（図３）。
Example 4 Identification of Malodor Suppressor The olfactory receptor identified in Example 3 was targeted, and the inhibitory activity on olfactory receptor activity was examined for 52 types of test substances.
In the same manner as in Example 3, OR2W1, OR10A6, OR51E1, OR51I2, and OR51L1 were expressed in HEK293 cells, and luciferase assay was performed. In the luciferase assay, hexanoic acid was used as an odor substance, and a test substance was added together with hexanoic acid. The response of olfactory receptors to hexanoic acid was measured, and the decrease in receptor response activity due to the addition of test substances was evaluated.
The inhibition rate of receptor activity by the test substance was calculated as follows. The luminescence value (X) derived from firefly luciferase induced by odor stimulation with hexanoic acid alone was subtracted by the luminescence value (Y) in the cells in which the same receptor was introduced and no odor stimulation was performed. Similarly, the luminescence value (Z) by stimulation with a mixture of hexanoic acid and the test substance was subtracted by the luminescence value (Y) in cells not subjected to odor stimulation. The receptor activity inhibitory activity by the test substance was calculated by the following calculation formula based on the increase in luminescence value due to stimulation with hexanoic acid alone (XY). Independent experiments were performed several times in duplicate, and the average value of each experiment was obtained.
Inhibition rate (%) = {1- (ZY) / (XY)} × 100
As a result, seven test substances for OR2W1, three kinds for OR10A6, seven kinds for OR51E1, ten kinds for OR51I2, and six kinds of test substances for OR51L1 have receptor activity. Inhibitory activity was shown (Table 2).
In addition, several of the test substances that showed inhibitory activity were examined for concentration dependent response inhibition of the hexanoic acid response. The test substance concentrations used were 3, 10, 30, 100, and 300 μM. With respect to the response of the receptor to 1 mM hexanoic acid under each test substance concentration, the relative response intensity was examined by setting the response intensity of the receptor at a test substance concentration of 0 μM as 100%. As a result, it was shown that among the test substances that showed inhibitory activity, burgeonal and florhydral all inhibited the hexanoic acid response of four olfactory receptors OR2W1, OR51E1, OR51I1, and OR51L1 in a concentration-dependent manner (FIG. 3).
実施例５ 試験物質の悪臭抑制能の評価
実施例４で同定した受容体活動阻害活性を有する試験物質の悪臭抑制能を、官能試験によって確認した。
ガラス瓶（柏洋硝子Ｎｏ．１１、容量１１０ｍｌ）に綿球を入れ、悪臭としてプロピレングリコールで１００倍に希釈したヘキサン酸、１０倍に希釈したノナン酸又は１０００倍に希釈したイソ吉草酸、及び試験物質を綿球に２０μｌ滴下した。ガラス瓶を一晩室温で静置し、匂い分子をガラス瓶中に十分揮発させた。官能評価試験はパネラー３名（イソ吉草酸については５名）で行い、悪臭を単独で滴下した場合の匂いの強さを５とし、試験物質を混合した場合の悪臭の強さを０から１０（０．５刻み）として２０段階で評価した。
試験物質は、ヘキサン酸に対してはプロピレングリコールで１００倍に希釈したフロルヒドラール（3-(3-イソプロピル-フェニル)-ブチルアルデヒド：Givaudan社）、ブルゲオナール（3-(4-tert-ブチルフェニル)プロパナール：Givaudan社）、ヒドロキシシトロネラール（3,7-ジメチル-7-ヒドロキシオクタナール：Givaudan社、International Flavors & Fragrances社などより入手可能）、4-イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒド、（4-(2-メトキシフェニル)-2-メチル-2-ブタノール：特開平9-111281号公報）、フロローザ（テトラヒドロ-4-メチル-2-(2-メチルプロピル)-2H-ピラン-4-オール：Givaudan社）、イソシクロシトラール（2,4,6-トリメチル-3-シクロヘキセン-1-カルボキシアルデヒド、3,5,6-トリメチル-3-シクロヘキセン-1-カルボキシアルデヒド（Givaudan社、International Flavors & Fragrances社などより入手可能）、トリプラール（2,4-ジメチル-3-シクロヘキサン-1-カルボキシアルデヒド：International Flavors & Fragrances社）、ポレナールII（2-シクロヘキシルプロパナール:花王株式会社）を、ノナン酸に対しては１０倍に希釈したフロルヒドラールを、イソ吉草酸に対しては１０００倍に希釈したフロルヒドラールを用いた。試験物質の対照物質として、上記嗅覚受容体に対する活動阻害効果のない物質である香料フロラロール（プロピレングリコールで１００倍に希釈）を用い、ヘキサン酸に関して同様の試験を行った。
4-イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒドは、一例として、特開平2-188549号公報に記載の方法により、4-イソプロピルシクロヘキシルメタノール（Mayol）(マイヨール：フィルメニッヒ社) 1554.57gを出発原料として合成することができ、得られる生成物は、例えば下記の通りに同定される。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz, δ ppm): 0.80 (3H, d, 6.8Hz) 0.84 (3H, d, 6.8Hz), 0.97-1.03, 1.19-1.30, 1.37-1.48, 1.51-1.61, 1.81-1.86, 1.95-1.99, 2.10-2.20 (10H, all m), 2.38-2.42 (1H, m), 9.56 (0.5H, s), 9.66 (0.5H,s)
13C-NMR(CDCl3, 100MHz, δ ppm): 19.87, 19.92 (q), 24.79, 26.32, 26.57, 28.63 (t), 32.14, 32.84, 43.31, 43.60 (d), 47.18, 50.68 (d), 204.60, 205.51 (d)
Example 5 Evaluation of Malodor Control Ability of Test Substance The malodor suppression ability of the test substance having receptor activity inhibitory activity identified in Example 4 was confirmed by a sensory test.
Put a cotton ball in a glass bottle (Saiyo Glass No.11, 110ml in volume), and test as a malodor, hexanoic acid diluted 100 times with propylene glycol, 10 times diluted nonanoic acid or 1000 times diluted isovaleric acid, and test 20 μl of the material was dropped onto a cotton ball. The glass bottle was allowed to stand overnight at room temperature, and the odor molecules were sufficiently volatilized in the glass bottle. The sensory evaluation test was conducted by 3 panelists (5 persons for isovaleric acid), the odor intensity when dropping malodor alone was set to 5, and the odor intensity when mixing test substances was 0 to 10 It was evaluated in 20 steps as (0.5 increments).
The test substances were fluorhydral (3- (3-isopropyl-phenyl) -butyraldehyde: Givaudan) diluted 100-fold with propylene glycol for hexanoic acid, burgeonal (3- (4-tert-butylphenyl) pro Panal: Givaudan), hydroxycitronellal (3,7-dimethyl-7-hydroxyoctanal: available from Givaudan, International Flavors & Fragrances, etc.), 4-isopropylcyclohexanecarbaldehyde, (4- (2- Methoxyphenyl) -2-methyl-2-butanol: JP-A-9111281), Florosa (tetrahydro-4-methyl-2- (2-methylpropyl) -2H-pyran-4-ol: Givaudan), Isocyclocitral (2,4,6-trimethyl-3-cyclohexene-1-carboxaldehyde, 3,5,6-trimethyl-3-cyclohexene-1-carboxaldehyde (Givaudan, International Flavors & Fragrances), Tripral (2,4-dimethyl-3-cyclohexane-1-carboxaldehyde: International Flavors & Fragrances), Polenal II (2-cyclohexylpropanal: Kao Corporation), Nonanoic acid Fluorhydral diluted 10-fold was used for the test substance, and fluorhydral diluted 1000-fold was used for the isovaleric acid, and as a control substance for the test substance, a fragrance that has no activity-inhibiting effect on the olfactory receptor. A similar test was performed on hexanoic acid using Floralol (diluted 100 times with propylene glycol).
As an example, 4-isopropylcyclohexanecarbaldehyde can be synthesized from 1554.57 g of 4-isopropylcyclohexylmethanol (Mayol) (Mayol: Firmenich) as a starting material by the method described in JP-A-2-188549. The resulting product is identified, for example, as follows.
1 H-NMR (CDCl 3 , 400 MHz, δ ppm): 0.80 (3H, d, 6.8 Hz) 0.84 (3H, d, 6.8 Hz), 0.97-1.03, 1.19-1.30, 1.37-1.48, 1.51-1.61, 1.81 -1.86, 1.95-1.99, 2.10-2.20 (10H, all m), 2.38-2.42 (1H, m), 9.56 (0.5H, s), 9.66 (0.5H, s)
13 C-NMR (CDCl 3 , 100 MHz, δ ppm): 19.87, 19.92 (q), 24.79, 26.32, 26.57, 28.63 (t), 32.14, 32.84, 43.31, 43.60 (d), 47.18, 50.68 (d), 204.60, 205.51 (d)
OR2W1、OR51E1、OR51I2、OR51L1のヘキサン酸応答を抑制するフロルヒドラール及びブルゲオナールは、ヘキサン酸の匂いを著しく抑制させた（図４）。このヘキサン酸臭の抑制は、対照物質（フロラロール）を混合した場合に比べ顕著であった。またノナン酸及びイソ吉草酸について調べた結果、やはりこれらの試験物質によって匂いが抑制された（図５及び６）。なお、１種類又は複数のヘキサン酸受容体の応答を抑制する他の物質（ヒドロキシシトロネラール、4-イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒド、4-(2-メトキシフェニル)-2-メチル-2-ブタノール、フロローザ、イソシクロシトラール、トリプラール、ポレナールII）についてもヘキサン酸臭の抑制効果を検証したところ、いずれの試験物質もヘキサン酸臭を抑制することが明らかとなった（表３）。 Fluorhydral and burgeonal that suppress the hexanoic acid response of OR2W1, OR51E1, OR51I2, and OR51L1 significantly suppressed the odor of hexanoic acid (FIG. 4). This suppression of hexanoic acid odor was more remarkable than when the control substance (floralol) was mixed. In addition, as a result of examining nonanoic acid and isovaleric acid, the odor was also suppressed by these test substances (FIGS. 5 and 6). Other substances that suppress the response of one or more hexanoic acid receptors (hydroxycitronellal, 4-isopropylcyclohexanecarbaldehyde, 4- (2-methoxyphenyl) -2-methyl-2-butanol, Florosa , Isocyclocitral, tripral, and pollenal II) were also examined for the effect of suppressing the hexanoic odor, and it was found that all the test substances suppress the hexanoic odor (Table 3).
実施例４で同定した受容体活動阻害活性を有する試験物質による悪臭抑制の特異性を調べるため、脂肪酸と構造の異なる悪臭であり、実施例３で同定した嗅覚受容体が応答しない匂い物質であるクレゾールを用いて、同様の官能試験を行った。実験では、悪臭としてプロピレングリコールで１００倍に希釈したクレゾールを用い、試験物質としてプロピレングリコールで１００倍に希釈したフロルヒドラールを用いた。
試験の結果、クレゾールの匂いはフロルヒドラールによって抑制されなかった（図７）。従って、抑制効果は匂い特異的であることが示された。
In order to examine the specificity of malodor control by the test substance having receptor activity inhibitory activity identified in Example 4, it is a malodor different in structure from fatty acid, and the olfactory receptor identified in Example 3 is an odor substance that does not respond A similar sensory test was performed using cresol. In the experiment, cresol diluted 100 times with propylene glycol was used as a bad odor, and fluorhydral diluted 100 times with propylene glycol was used as a test substance.
As a result of the test, the smell of cresol was not suppressed by fluorhydral (FIG. 7). Therefore, the suppression effect was shown to be odor specific.
Claims (8)
OR2W1、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
OR10A6、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び
OR51I2、又は配列番号８で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
から選択される嗅覚受容体のいずれか１種に、試験物質及び当該悪臭の原因物質を添加する工程；
当該悪臭の原因物質に対する当該嗅覚受容体の活動を測定する工程；
測定された活動に基づいて当該嗅覚受容体の活動を抑制する試験物質を同定する工程；
当該同定された試験物質を、悪臭抑制剤として選択する工程、
を含み、当該悪臭がヘキサン酸臭である、方法。 A method for searching malodor control agents , comprising the following steps :
OR2W1, or a polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4,
OR10A6, or a polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and
OR51I2 or a polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 ,
To any one of the olfactory receptor selected from, as engineering the addition of the test substance and causative agent of the malodor;
Measuring the activity of the olfactory receptor against the causative agent of the malodor;
Identifying a test substance that inhibits the activity of the olfactory receptor based on the measured activity;
Selecting the identified test substance as a malodor control agent ;
And the malodor is a hexanoic acid odor .
OR10A6又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである嗅覚受容体に、試験物質及び当該悪臭の原因物質を添加する工程；
当該悪臭の原因物質に対する当該嗅覚受容体の活動を測定する工程；
測定された活動に基づいて当該嗅覚受容体の活動を抑制する試験物質を同定する工程；
当該同定された試験物質を、悪臭抑制剤として選択する工程、
を含み、当該悪臭がノナン酸臭である、方法。 A method for searching malodor control agents, comprising the following steps:
Adding a test substance and a causative substance of the malodor to an olfactory receptor, which is a polypeptide comprising an amino acid sequence of 90% or more of the amino acid sequence represented by OR10A6 or SEQ ID NO: 2;
Measuring the activity of the olfactory receptor against the causative agent of the malodor;
Identifying a test substance that inhibits the activity of the olfactory receptor based on the measured activity;
Selecting the identified test substance as a malodor control agent;
It includes, the malodor is nonanoic acid odor, method.
OR51I2又は配列番号８で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである嗅覚受容体に、試験物質及び当該悪臭の原因物質を添加する工程；
当該悪臭の原因物質に対する当該嗅覚受容体の活動を測定する工程；
測定された活動に基づいて当該嗅覚受容体の活動を抑制する試験物質を同定する工程；
当該同定された試験物質を、悪臭抑制剤として選択する工程、
を含み、当該悪臭がイソ吉草酸臭である、方法。 A method for searching malodor control agents, comprising the following steps:
Adding a test substance and a causative substance of the malodor to an olfactory receptor, which is a polypeptide comprising an amino acid sequence of 90% or more of the amino acid sequence represented by OR51I2 or SEQ ID NO: 8;
Measuring the activity of the olfactory receptor against the causative agent of the malodor;
Identifying a test substance that inhibits the activity of the olfactory receptor based on the measured activity;
Selecting the identified test substance as a malodor control agent;
It includes, the malodor is isovaleric acid smell, method.
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