JP5697127B2 - Novel growth hormone secretagogue receptor inhibitor peptide - Google Patents

Description

本発明は、成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ）のアンタゴニストとして機能する新規ペプチドに関する。   The present invention relates to a novel peptide that functions as an antagonist of growth hormone secretagogue receptor (GHS-R).

成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ）の内因性リガンドとして、グレリンが同定されている（非特許文献１）。グレリンは、２８アミノ酸からなるペプチドホルモンで、主に胃で産生されるが、視床下部、腸、腎臓、膵臓、心臓などでも少量ながら分泌されている。グレリンの受容体であるＧＨＳ−Ｒも視床下部、心臓、消化管、膵臓、甲状腺、血管などに広く発現している。
グレリンは成長ホルモン分泌促進作用のほかに、強力な摂食促進や脂肪代謝調節、胃酸分泌・胃運動亢進など様々な生理活性をもつことが報告されている。血中のグレリンは主に胃から供給されており、ヒトにおいて血漿グレリン濃度は各食事前に上昇し、食事後に基礎値に戻る（非特許文献２）。また、げっ歯類において絶食時に血漿グレリン濃度が増加し（非特許文献３）、グレリンの末梢投与によって摂食量および体重が増加する（非特許文献３、４、５及び６）。このような、同様の摂食亢進作用がヒトにおいても確認されており（非特許文献４及び７）、グレリンは末梢投与によって摂食亢進作用を示す唯一のホルモンである。 Ghrelin has been identified as an endogenous ligand for growth hormone secretagogue receptor (GHS-R) (Non-patent Document 1). Ghrelin is a peptide hormone consisting of 28 amino acids and is produced mainly in the stomach, but is also secreted in small amounts in the hypothalamus, intestine, kidney, pancreas, heart and the like. GHS-R, a ghrelin receptor, is also widely expressed in the hypothalamus, heart, gastrointestinal tract, pancreas, thyroid gland, blood vessels, and the like.
Ghrelin has been reported to have various physiological activities such as potent feeding promotion, fat metabolism regulation, gastric acid secretion and gastric motility in addition to growth hormone secretion promoting action. Blood ghrelin is mainly supplied from the stomach, and in humans, the plasma ghrelin concentration rises before each meal and returns to the basal value after the meal (Non-patent Document 2). In rodents, plasma ghrelin concentration increases during fasting (Non-patent Document 3), and the amount of food intake and body weight increase by peripheral administration of ghrelin (Non-patent Documents 3, 4, 5, and 6). Such a feeding enhancing action has been confirmed in humans (Non-Patent Documents 4 and 7), and ghrelin is the only hormone that shows a feeding enhancing action by peripheral administration.

従って、ＧＨＳ−Ｒのアンタゴニストは摂食量と体重を減少させ、糖尿病や高血圧、高脂血症等の発症リスクの上昇に関与している肥満症への臨床応用の可能性が期待される。 実際、抗グレリン抗体（非特許文献６）及びグレリン結合性ＲＮＡアプタマー（非特許文献８）の投与によって摂食抑制と体重減少を引き起こすことが報告されており、ペプチド性ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストである［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６のマウス末梢投与が摂食量と体重の減少をもたらすことが報告されている（非特許文献９）。これらのことから、ＧＨＳ−Ｒの働きを阻害することが肥満症の改善につながると見込まれる。
ＧＨＳ−Ｒ アンタゴニストは、合成小分子によるものの開発が進んでいる。モンペリエ大グループによる１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌｅ誘導体（非特許文献１０）、アボット社による２，４−ｄｉａｍｉｎｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ誘導体（非特許文献１１）、ｉｓｏｘａｚｏｌｅ ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ誘導体（非特許文献１２）、ｔｅｔｒａｌｉｎ ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ誘導体（非特許文献１３）、バイエル社によるｑｕｎａｚｏｌｉｎｏｎｅ誘導体（非特許文献１４）等が代表的なものである。各々、グレリンに対するＩＣ_５０は、数ｎＭと強く、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて摂食抑制と体重減少が確認されているもの（非特許文献１０、１１及び１４）もある。特にアボット社による２，４−ｄｉａｍｉｎｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ誘導体とバイエル社によるｑｕｎａｚｏｌｉｎｏｎｅ誘導体は経口投与が可能と報告されている。しかしながら小分子化合物であることから標的特異性の低さによる副作用が懸念される。 Therefore, GHS-R antagonists are expected to have potential for clinical application to obesity, which reduces food intake and body weight, and is associated with an increased risk of developing diabetes, hypertension, hyperlipidemia and the like. In fact, administration of an anti-ghrelin antibody (Non-patent Document 6) and ghrelin-binding RNA aptamer (Non-patent Document 8) has been reported to cause feeding suppression and weight loss, and is a peptide GHS-R antagonist [ It has been reported that peripheral administration of D-Lys-3] -GHRP-6 in mice results in a decrease in food intake and body weight (Non-patent Document 9). From these facts, it is expected that inhibiting the function of GHS-R will lead to improvement of obesity.
Development of GHS-R antagonists based on synthetic small molecules is advancing. 1,2,4-triazole derivative (non-patent document 10) by Montpellier University group, 2,4-diaminopyridine derivative (non-patent document 11) by Abbott, isoxazole carboxamide derivative (non-patent document 12), tetralin carbamide derivative (non-patent document 10) Typical examples include Patent Document 13) and quanzolinone derivatives (Non-Patent Document 14) by Bayer. Each has an IC ₅₀ against ghrelin as strong as several nM, and some have been confirmed to suppress feeding and lose weight in vivo (Non-Patent Documents 10, 11 and 14). In particular, it has been reported that 2,4-diaminopyrimidine derivatives from Abbott and quanzolinone derivatives from Bayer can be administered orally. However, since it is a small molecule compound, there are concerns about side effects due to low target specificity.

一方、ペプチド性のＧＨＳ−Ｒアンタゴニストの報告は非常に少ない。最もよく知られているのは、人工の成長ホルモン放出ペプチドであるＧＨＲＰ−６の１アミノ酸置換体である［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６（非特許文献１５）である。グレリンに対するＩＣ_５０は、数μＭと弱いが、一般的に入手可能なＧＨＳ−Ｒアンタゴニストとして基礎研究分野で広く使われている。また、［Ｄ−Ａｒｇ１，Ｄ−Ｐｈｅ５，Ｄ−Ｔｒｐ７，９，Ｌｅｕ１１］Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐは、ニューロキニン受容体やボンベシン受容体とともにＧＨＳ−Ｒのアンタゴニストとでもあることが知られている。そのグレリンに対するＩＣ_５０は、やはり数μＭと弱いが、アンタゴニストとしての性質の他に、ＧＨＳ−Ｒの強力なインバースアゴニスト（ＥＣ_５０＝５．２ｎＭ）として働くことが報告されている（非特許文献１６）。［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６と［Ｄ−Ａｒｇ１，Ｄ−Ｐｈｅ５，Ｄ−Ｔｒｐ７，９，Ｌｅｕ１１］Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐのマウス末梢投与によって、摂食量の減少を引き起こすことが確認されている（非特許文献９）。グレリンの３番目セリンのオクタノイル化はＧＨＳ−Ｒの活性に必須であるが、３番目のセリンをトリプトファンに置換しても活性が維持することが知られている（非特許文献１７） On the other hand, there are very few reports of peptidic GHS-R antagonists. The most well known is [D-Lys-3] -GHRP-6 (Non-patent Document 15), which is a 1 amino acid substitution product of GHRP-6, which is an artificial growth hormone releasing peptide. The IC ₅₀ for ghrelin is as weak as several μM, but is widely used in the basic research field as a commonly available GHS-R antagonist. [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7, 9, Leu11] Substance P is known to be a GHS-R antagonist together with a neurokinin receptor and a bombesin receptor. Although its IC ₅₀ against ghrelin is still as weak as several μM, in addition to its properties as an antagonist, it has been reported to act as a potent inverse agonist of GHS-R (EC ₅₀ = 5.2 nM) (non-patent literature). 16). It has been confirmed that peripheral administration of [D-Lys-3] -GHRP-6 and [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7, 9, Leu11] Substance P causes a decrease in food intake ( Non-patent document 9). Octanoylation of the third serine of ghrelin is essential for the activity of GHS-R, but it is known that the activity is maintained even if the third serine is replaced with tryptophan (Non-patent Document 17).

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以上の状況に鑑み、本発明は、成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ）に対するアンタゴニスト活性を持つ新規なペプチドの提供を目的とする。
また、本発明は、該ペプチドからなる摂食抑制剤、及び成長ホルモンの分泌過剰に起因する疾患の治療剤の提供を目的とする。
さらに、本発明は、上記ペプチドに対する抗体、当該抗体を用いる当該ペプチドの定量方法、および当該ペプチドの製造方法を提供することを目的とする。 In view of the above situation, an object of the present invention is to provide a novel peptide having antagonist activity against a growth hormone secretagogue receptor (GHS-R).
Another object of the present invention is to provide an antifeedant comprising the peptide and a therapeutic agent for diseases caused by excessive secretion of growth hormone.
Furthermore, an object of the present invention is to provide an antibody against the peptide, a method for quantifying the peptide using the antibody, and a method for producing the peptide.

本発明者らは、ｃＤＮＡディスプレイ法を用いてＧＨＳ−Ｒに対するアンタゴニストの探索を行った結果、アンタゴニストとしての活性を有する新規なペプチドを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の以下の（１）〜（８）である。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるペプチド。
（ａ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加をもつアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＨＳ−Ｒアンタゴニスト活性を有するペプチド。
（２）上記（１）に記載のペプチドをコードする核酸。
（３）上記（１）に記載のペプチドを有効成分として含有する摂食抑制剤。
（４）上記（１）に記載のペプチドを有効成分として含有する成長ホルモン分泌抑制剤。
（５）上記（１）に記載のペプチドを有効成分として含有する成長ホルモンの分泌過剰に起因する疾患の治療剤。
（６）上記（１）に記載のペプチドに対する抗体。
（７）上記（１）に記載のペプチドを、当該ペプチドに対する抗体を用いて検出することを含む、当該ペプチドの定量方法。
（８）上記（１）のペプチドを遺伝子組み換え技術を用いて製造する方法であって、当該ペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターにより宿主細胞を形質転換すること；及び、
得られた形質転換細胞を培養して培養物から目的のペプチドを採取すること；
を含む方法。 As a result of searching for antagonists to GHS-R using the cDNA display method, the present inventors have found a novel peptide having activity as an antagonist and completed the present invention.
That is, the following (1) to (8) of the present invention.
(1) The peptide shown in the following (a) or (b).
(A) A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12.
(B) A peptide comprising an amino acid sequence having one or several amino acid substitutions, deletions or additions in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, and having a GHS-R antagonist activity.
(2) A nucleic acid encoding the peptide according to (1) above.
(3) An antifeedant containing the peptide according to (1) above as an active ingredient.
(4) A growth hormone secretion inhibitor containing the peptide according to (1) above as an active ingredient.
(5) A therapeutic agent for a disease caused by excessive secretion of growth hormone containing the peptide according to (1) as an active ingredient.
(6) An antibody against the peptide according to (1) above.
(7) A method for quantifying the peptide, comprising detecting the peptide according to (1) above using an antibody against the peptide.
(8) A method for producing the peptide of (1) above using a genetic recombination technique, wherein a host cell is transformed with a vector containing DNA encoding the peptide; and
Culturing the resulting transformed cells and collecting the desired peptide from the culture;
Including methods.

本発明のペプチドは、成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ）アンタゴニスト活性を有し、摂食抑制剤、成長ホルモン分泌抑制剤及び成長ホルモンの分泌過剰に起因する疾患の治療剤として用いることができる。   The peptide of the present invention has a growth hormone secretagogue receptor (GHS-R) antagonist activity, and is used as an antifeedant, a growth hormone secretion inhibitor and a therapeutic agent for diseases caused by excessive secretion of growth hormone. Can do.

本発明のペプチドは、Ｌ−アミノ酸のみで構成した場合にも活性を有しており、特に、アンタゴニスト活性を有するペプチドの場合、従来はＤ−アミノ酸により構成されているものが多いことから、従来のアンタゴニストペプチドよりも調製コストを低減させることが可能である。   The peptide of the present invention has activity even when it is composed only of L-amino acids, and in particular, in the case of peptides having antagonist activity, many of them are conventionally composed of D-amino acids. It is possible to reduce the cost of preparation compared to the antagonist peptides.

また、本発明のペプチドは、Ｌ−アミノ酸のみで構成しても活性を有するため、本発明のペプチドは、バイオリアクターでの大量生産も可能である。   In addition, since the peptide of the present invention is active even if it is composed only of L-amino acids, the peptide of the present invention can be mass-produced in a bioreactor.

さらに、本発明のペプチドは、Ｌ−アミノ酸のみで構成した場合、Ｄ−アミノ酸含有ペプチドに比べて生体内で分解されやすくなるため、薬効持続時間の必要以上の延長による副作用の軽減も可能である。   Furthermore, when the peptide of the present invention is composed only of L-amino acids, it becomes easier to be decomposed in vivo than D-amino acid-containing peptides, and therefore side effects can be reduced by extending the duration of the drug effect more than necessary. .

本発明のペプチドによるグレリン刺激性胃収縮の抑制について検討した結果を示す。The result of having investigated about suppression of ghrelin-stimulated gastric contraction by the peptide of this invention is shown.

本発明の実施態様の一つは、以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるペプチドである。
（ａ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加をもつアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＨＳ−Ｒアンタゴニスト活性を有するペプチド。
ここで、上述の「１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加」との記載中、「１若しくは数個」とは、好ましくは、１〜３個、より好ましくは１又は２個、最も好ましくは１個である。アミノ酸の置換、付加を行う場合、非天然アミノ酸で置換又は付加を行ってもよい。 One embodiment of the present invention is a peptide shown in the following (a) or (b).
(A) A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12.
(B) A peptide comprising an amino acid sequence having one or several amino acid substitutions, deletions or additions in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, and having a GHS-R antagonist activity.
Here, in the above description of “substitution, deletion or addition of one or several amino acids”, “1 or several” is preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2, Most preferably. When amino acid substitution or addition is performed, substitution or addition may be performed with an unnatural amino acid.

本発明のペプチドのＣ末端は、通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）又はカルボキシレート（−ＣＯＯ−）の他、当該カルボキシル基は、アミド（−ＣＯＮＨ_２）やエステル（−ＣＯＯＲ）等に化学修飾されていてもよい。ここで、エステル中のＲとしては、Ｃ１−６アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル）、Ｃ３−８シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル）、Ｃ１−６アリール基（例えば、フェニル、α−ナフチル）、フェニル−Ｃ１−２アルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル）、α−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基（例えば、α−ナフチルメチル）等が挙げられる。その他、経口用エステルとして汎用されているピバロイルオキシメチルエステルとすることも可能である。本発明のペプチドがＣ末端以外にもそのペプチド鎖中にカルボキシル基を有する場合には、当該カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものも本発明のペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては上記の各エステルが挙げられる。同様に、本発明のペプチドのＮ末端は、通常アミノ基（−ＮＨ_２）であるが、当該アミノ基は、ホルミル基、アセチル基等のＣ１−６アシル基等で化学修飾されていてもよい。その他、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したものや、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な官能基（例えば、ホルミル基、アセチル等）で化学修飾されているものや糖鎖の結合しているものも本発明のペプチドに含まれる。
また、本発明のペプチドには、非天然型のペプチド結合、例えば、ケトメチレン、チオアミドなどによって構成されるものも含まれる。 In addition to the carboxyl group (—COOH) or carboxylate (—COO—), the carboxyl group of the peptide of the present invention is usually chemically modified to amide (—CONH ₂ ), ester (—COOR) or the like. May be. Here, R in the ester is a C1-6 alkyl group (for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl), a C3-8 cycloalkyl group (for example, cyclopentyl, cyclohexyl), C1-6. An aryl group (for example, phenyl, α-naphthyl), a phenyl-C1-2 alkyl group (for example, benzyl, phenethyl), an α-naphthyl-C1-2 alkyl group (for example, α-naphthylmethyl) and the like can be mentioned. In addition, pivaloyloxymethyl ester, which is widely used as an oral ester, can be used. When the peptide of the present invention has a carboxyl group in the peptide chain other than the C-terminus, the peptide of the present invention includes those in which the carboxyl group is amidated or esterified. Examples of the ester in this case include the above-mentioned esters. Similarly, the N-terminus of the peptide of the present invention is usually an amino group (—NH ₂ ), but the amino group may be chemically modified with a C 1-6 acyl group such as a formyl group or an acetyl group. . In addition, the glutamyl group produced by cleavage of the N-terminal side in vivo is pyroglutamine oxidized, or a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (for example, —OH, —SH, amino group, imidazole group, indole group) , A guanidino group, etc.) that are chemically modified with an appropriate functional group (for example, formyl group, acetyl, etc.) and those with a sugar chain attached are also included in the peptides of the present invention.
The peptides of the present invention also include those composed of non-natural peptide bonds such as ketomethylene and thioamide.

本発明のペプチドは、当該技術分野において周知の方法、例えば、ｃＤＮＡディスプレイ法(後述を参照のこと)など、によって取得されたｃＤＮＡを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける無細胞翻訳系や、生物学的に合成することで調製する他、化学的ペプチド合成法（固相法又は液相法）によって調製することができる。
化学的にペプチドを合成する場合、本発明のペプチドを構成するペプチドの一部もしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。合成反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを単離精製することができる。
さらに、本発明には、本発明のペプチドをコードする核酸が含まれる。ここで核酸とは、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれであってもよく、また、一本鎖及び二本鎖のいずれであってもよい。当該核酸は、本発明のペプチドを合成するために使用することができる。当該核酸からの本発明のペプチドの合成は、当該技術分野において周知の方法などを利用して容易に実施することができる。例えば、当該ペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターにより宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養して培養物から目的のペプチドを採取することにより、本発明のペプチドを得ることができる。 The peptide of the present invention can be obtained by using in vitro cell-free translation systems, biological methods using cDNA obtained by methods well known in the art, such as the cDNA display method (see below). In addition to being prepared by synthesis, it can be prepared by a chemical peptide synthesis method (solid phase method or liquid phase method).
When chemically synthesizing a peptide, the peptide of interest of the present invention is condensed by condensing a part of the peptide or amino acid and the remaining part, and when the product has a protecting group, the protecting group is eliminated. Can be manufactured. After the synthesis reaction, the partial peptide of the present invention can be isolated and purified by combining ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, high performance liquid chromatography, recrystallization and the like.
Furthermore, the present invention includes a nucleic acid encoding the peptide of the present invention. Here, the nucleic acid may be either DNA or RNA, and may be either single-stranded or double-stranded. The nucleic acid can be used to synthesize the peptides of the present invention. The synthesis of the peptide of the present invention from the nucleic acid can be easily carried out using methods well known in the art. For example, the peptide of the present invention can be obtained by transforming a host cell with a vector containing DNA encoding the peptide, culturing the resulting transformed cell and collecting the desired peptide from the culture. it can.

本発明のさらなる実施態様は、本発明のペプチドを有効成分として含有する摂食抑制剤、成長ホルモン分泌抑制剤及び成長ホルモンの分泌過剰に起因する疾患の治療剤である。ここで、成長ホルモンの分泌過剰に起因する疾患には、巨人症及び末端肥大症が含まれる。「治療」には、すでに疾患発症した諸症状を緩和し、完治せしめることの他、疾患の発症が疑われ又は予想される対象において、該疾患の発症を予め阻止する、予防的な治療も含まれる。治療の対象は、哺乳動物であり、この哺乳動物は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。これらの剤は、通常、医薬製剤の形で治療対象に投与することができる。
本発明の医薬製剤の剤型は、特に限定はされず、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、点滴剤、注射剤及び経鼻・経肺による吸入剤等が挙げられるが、点滴剤、注射剤、あるいは、経鼻・経肺による吸入剤の形態が好ましい。場合によっては、高分子などで被覆した徐放製剤を体内・皮下に直接投与することも可能である。
これらの製剤は常法に従って調製される。液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解又は懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水、生理食塩水、あるいは、ブドウ糖溶液等の溶媒に溶解させて調製される、必要に応じて緩衝剤や保存剤を添加してもよい。 Further embodiments of the present invention are an antifeedant, a growth hormone secretion inhibitor and a therapeutic agent for diseases caused by excessive secretion of growth hormone, comprising the peptide of the present invention as an active ingredient. Here, diseases caused by excessive secretion of growth hormone include giantism and acromegaly. “Treatment” includes alleviating and ameliorating various symptoms that have already developed the disease, as well as prophylactic treatment that previously blocks the onset of the disease in subjects suspected or expected to develop the disease. It is. The subject of treatment is a mammal, and this mammal means any animal classified as a mammal, and is not particularly limited. For example, in addition to humans, pet animals such as dogs, cats, rabbits, and cattle , Domestic animals such as pigs, sheep and horses. Particularly preferred “mammals” are humans. These agents can usually be administered to a treatment subject in the form of a pharmaceutical preparation.
The dosage form of the pharmaceutical preparation of the present invention is not particularly limited, and is a tablet, capsule, granule, powder, syrup, suspension, suppository, ointment, cream, gel, patch, inhalant, Examples thereof include instillations, injections, and nasal / pulmonary inhalation, and the like, but drops, injections, and nasal / pulmonary inhalation are preferred. In some cases, a sustained-release preparation coated with a polymer or the like can be directly administered into the body or subcutaneously.
These preparations are prepared according to a conventional method. Liquid preparations may be dissolved or suspended in water or other suitable solvent when used. Tablets and granules may be coated by a known method. In the case of an injection, a buffer or a preservative may be added as necessary, which is prepared by dissolving the peptide of the present invention in a solvent such as water, physiological saline, or a glucose solution.

本発明の医薬製剤の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、又は医薬製剤の製造方法は、製剤の形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機又は有機物質、あるいは、固体又は液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して１重量％から９０重量％の間で配合することができる。具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール等が挙げられる。   A person skilled in the art can appropriately select the type of formulation additive used in the production of the pharmaceutical formulation of the present invention, the ratio of the formulation additive to the active ingredient, or the production method of the pharmaceutical formulation according to the form of the formulation. It is. As an additive for preparation, an inorganic or organic substance, or a solid or liquid substance can be used, and generally it can be blended between 1% by weight and 90% by weight based on the weight of the active ingredient. . Specifically, examples of such substances are lactose, glucose, mannitol, dextrin, cyclodextrin, starch, sucrose, magnesium aluminate metasilicate, synthetic aluminum silicate, sodium carboxymethylcellulose, hydroxypropyl starch, carboxymethylcellulose calcium , Ion exchange resin, methylcellulose, gelatin, gum arabic, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, light anhydrous silicic acid, magnesium stearate, talc, tragacanth, bentonite, bee gum, titanium oxide, sorbitan fatty acid ester, Sodium lauryl sulfate, glycerin, fatty acid glycerin ester, purified lanolin, glycerogelatin, polyso Bate, macrogol, vegetable oils, waxes, liquid paraffin, white petrolatum, fluorocarbons, nonionic surfactants, propylene glycol, and the like.

注射剤（点滴剤などを含む）を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用時溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０ 、ポリオキシエチレン、硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。   In order to produce injections (including infusions, etc.), active ingredients are adjusted to pH, such as hydrochloric acid, sodium hydroxide, lactose, lactic acid, sodium, sodium monohydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, as necessary. Dissolve in distilled water for injection together with isotonic agents such as sodium chloride and glucose, filter aseptically and fill into ampoules, or add mannitol, dextrin, cyclodextrin, gelatin, etc., and freeze-dry in vacuo. It may be a dissolved injection. In addition, reticine, polysorbate 80, polyoxyethylene, hydrogenated castor oil, etc. may be added to the active ingredient and emulsified in water to give an emulsion for injection.

本発明の医薬製剤の投与量及び投与回数は特に限定されず、治療対象疾患の悪化・進展の防止及び／又は治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢などの条件に応じて、医師の判断により適宜選択することが可能である。一般的には、経口投与における成人一日あたりの投与量は０．０１〜１０００ｍｇ（有効成分重量）程度であり、一日１回又は数回に分けて、あるいは数日ごとに投与することができる。注射剤として用いる場合には、成人に対して一日量０．００１〜１００ｍｇ（有効成分重量）を連続投与又は間欠投与することが望ましい。   The dosage and frequency of administration of the pharmaceutical preparation of the present invention are not particularly limited, and depending on conditions such as prevention and / or progression of the disease to be treated and / or the purpose of treatment, type of disease, patient weight and age, etc. It is possible to make an appropriate selection based on the above judgment. In general, the dose per day for an adult in oral administration is about 0.01 to 1000 mg (active ingredient weight), and can be administered once or several times a day or every few days. it can. When used as an injection, daily doses of 0.001 to 100 mg (active ingredient weight) are preferably administered continuously or intermittently to adults.

本発明の医薬製剤は、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。例えば、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬剤的に受容可能な担体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。   The pharmaceutical preparation of the present invention can be prepared as a sustained release preparation such as a delivery system encapsulated in implantable tablets and microcapsules using a carrier that can prevent immediate removal from the body. For example, biodegradable, biocompatible polymers such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid can be used. Such materials can be readily prepared by those skilled in the art. Liposome suspensions can also be used as pharmaceutically acceptable carriers. Useful liposomes are prepared as a lipid composition comprising, but not limited to, phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derivatized phosphatidylethanol (PEG-PE) through a filter of appropriate pore size to obtain a size suitable for use, and reverse phase. Purified by evaporation.

本発明の医薬製剤は、キットの形態で、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明に係る医薬製剤がキットとして供給される場合、該医薬製剤のうち複数の構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装するのは、活性構成成分の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能にするためである。
キット中に含まれる本発明のペプチドや製剤用添加物は、これらの構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、該容器がアンプルである場合には、窒素ガスのような中性で不反応性ガスと共に構成成分を収納してもよい。アンプルの材質としては、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料などが使用される。アンプル以外でも、製剤の特徴や用途形態によって、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその類似物を使用することができる。本発明のキットには使用説明書を添付してもよい。当該使用説明は、紙などに印刷され、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体に記録されて供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。 The pharmaceutical preparation of the present invention can be included in the form of a kit together with instructions for administration in containers and packs. When the pharmaceutical preparation according to the present invention is supplied as a kit, a plurality of components of the pharmaceutical preparation are packaged in separate containers and mixed immediately before use. The reason why the components are packaged separately in this way is to enable long-term storage without losing the function of the active component.
The peptide or pharmaceutical additive of the present invention contained in the kit may be any kind of container in which these constituents maintain their activity effectively for a long period of time, are not adsorbed by the container material, and do not undergo alteration. Supplied inside. For example, if the container is an ampoule, the components may be housed with a neutral and non-reactive gas such as nitrogen gas. The ampoule material may be glass, polycarbonate, polystyrene or other organic polymer, ceramic, metal, or any other suitable material commonly used to hold reagents. In addition to ampoules, test tubes, vials, flasks, bottles, syringes, or the like can be used depending on the characteristics and application form of the preparation. Instructions for use may be attached to the kit of the present invention. The instructions for use are printed on paper and / or on an electrically or electromagnetically readable medium such as a floppy disk, CD-ROM, DVD-ROM, Zip disk, video tape, audio tape, etc. It may be recorded and supplied. Detailed instructions for use may be actually attached to the kit, or may be posted on a website designated by the manufacturer or distributor of the kit or notified by e-mail or the like.

本発明のさらなる実施態様は、本発明のペプチドに対する抗体である。本発明のペプチドを抗原とする抗体は、公知の方法により取得することができる。本発明の抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれでもよい。また、本発明は、これらの抗体を用いた本発明のペプチドの定量方法である。例えば、被検試料中の抗原量に対応した抗体、抗原もしくは抗体-抗原複合体の量を化学的又は物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法である。   A further embodiment of the invention is an antibody against the peptide of the invention. An antibody having the peptide of the present invention as an antigen can be obtained by a known method. The antibody of the present invention may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. The present invention is also a method for quantifying the peptide of the present invention using these antibodies. For example, a standard prepared by using a standard solution containing a known amount of antigen, detecting the amount of antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen in the test sample by chemical or physical means. This is a measurement method calculated from a curve.

以下に本発明を具体例によって説明するが、本発明の範囲はこれらの例によって限定されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be described by way of specific examples, but the scope of the present invention is not limited by these examples.

１．ピューロマイシンリンカーの作製
１−１．ピューロマイシンリンカーの合成
ピューロマイシンリンカーは、ＥＭＣＳ (N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide)を用いて以下の２つの修飾オリゴヌクレオチドを架橋させることにより合成した。
Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓ；5’-(S)-TC(T-FITC)-(Spc18)-(Spc18)-(Spc18)-(Spc18)-CC-(Puro)-3’
Ｂｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐ；5’-CCCGGTGCAGCTGTTTCATC(T-Biotin)CGGAAACAGCTGCACCCCCCGCCGCCCCCCG(T-NH2)CCT-3’（配列番号１）
ここで、(S)は5’-Thiol-Modifier-C6、(T-FITC)はFluorescein dT、(Puro)はピューロマイシン、(Spc18)はspacer 18、(T-NH2)はAmino-Modifier C6 dT、(T-Biotin)はBiotin-dTを表す。これら修飾ホスホロアミダイト試薬は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から購入した。 1. 1. Preparation of puromycin linker 1-1. Synthesis of puromycin linker The puromycin linker was synthesized by crosslinking the following two modified oligonucleotides using EMCS (N- (6-Maleimidocaproyloxy) succinimide).
Puro-FS; 5 '-(S) -TC (T-FITC)-(Spc18)-(Spc18)-(Spc18)-(Spc18) -CC- (Puro) -3'
Biotin-loop; 5'-CCCGGTGCAGCTGTTTCATC (T-Biotin) CGGAAACAGCTGCACCCCCCGCCGCCCCCCG (T-NH2) CCT-3 '(SEQ ID NO: 1)
Where (S) is 5'-Thiol-Modifier-C6, (T-FITC) is Fluorescein dT, (Puro) is puromycin, (Spc18) is spacer 18, and (T-NH2) is Amino-Modifier C6 dT , (T-Biotin) represents Biotin-dT. These modified phosphoramidite reagents were purchased from Glen Research.

１−２．Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓのチオール基の還元反応
０．７ｍＭ Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓ、０．７ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ９．０）、０．３ｍＭ ＤＴＴの反応組成で室温、１時間反応させた。反応後、ＮＡＰ−５ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア）により２０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．０）を用いて精製物を精製した。
１−３．Ｂｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐのＥＭＣＳ修飾
７０μＭ Ｂｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐ、１４ｍＭ ＥＭＣＳ（同仁化学）、１４０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．０）の反応組成で３７℃、３０分反応させ、生成物をエタノールで沈殿させペレットにした。
１−４．Ｐｕｒｏ−Ｆ−ＳとＢｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐの架橋反応
ＥＭＣＳ修飾されたＢｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐのペレットを還元ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓ溶液に溶解し、４℃で一晩反応させることにより架橋物（ピューロマイシンリンカー）を得た。この溶液に、１００ｍＭのＤＴＴを加え室温で３０分反応させた後、エタノール沈殿により未反応のＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓを除去した。これを、０．１ＭのＴＥＡＡで平衡化したクロマトグラフィーカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ３００ Ｃ１８，４．６×２５０ｍｍ、粒径５μｍ）に負荷し、バッファーＡ：０．１Ｍ ＴＥＡＡ、バッファーＢ：８０％アセトニトリル（バッファーＢ％：初期濃度１５％，終濃度３５％）を用いて流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで３０分間の溶出を行うことにより、未反応のＢｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐを分離した。各分画を尿素変性ポリアクリルアミドゲルで解析し、目的の分画を濃縮遠心機で濃縮した後、エタノール沈殿し、ペレットを水に溶解後、分光光度計で濃度を算出した。 1-2. Reduction reaction of thiol group of Puro-FS The reaction composition of 0.7 mM Puro-FS, 0.7 mM phosphate buffer (pH 9.0), 0.3 mM DTT was allowed to react at room temperature for 1 hour. After the reaction, the purified product was purified with NAP-5 column (GE Healthcare) using 20 mM phosphate buffer (pH 7.0).
1-3. Biotin-loop EMCS modification 70 μM Biotin-loop, 14 mM EMCS (Dojindo Laboratories), 140 mM phosphate buffer (pH 7.0) were reacted at 37 ° C. for 30 minutes, and the product was pelleted with ethanol.
1-4. Cross-linking reaction of Puro-FS and Biotin-loop Dissolve the EMCS-modified Biotin-loop in a reduced puro-FS solution and react at 4 ° C overnight to convert the cross-linked product (puromycin linker). Obtained. To this solution, 100 mM DTT was added and reacted at room temperature for 30 minutes, and then unreacted Puro-FS was removed by ethanol precipitation. This was loaded onto a chromatography column (Waters Symmetry 300 C18, 4.6 × 250 mm, particle size 5 μm) equilibrated with 0.1 M TEAA, buffer A: 0.1 M TEAA, buffer B: 80% acetonitrile (buffer) Unreacted Biotin-loop was separated by elution for 30 minutes at a flow rate of 0.5 ml / min using B%: initial concentration 15%, final concentration 35%). Each fraction was analyzed with a urea-denatured polyacrylamide gel, the target fraction was concentrated with a concentration centrifuge, ethanol precipitated, the pellet was dissolved in water, and the concentration was calculated with a spectrophotometer.

２．ｃＤＮＡ−ディスプレイ用ペプチドライブラリ作製の為のＤＮＡコンストラクトの作製
ＧＨＳ−Ｒの内因性リガンドであるグレリンは脊椎動物間でそのＮ末端７アミノ酸の相同性が高い。また、グレリンのＮ末端５アミノ酸が活性に必須（M. Matsumoto et al. BBRC 284, 655-659 (2001)）で、Ｎ末端1番目もしくは２番目のアミノ酸の置換によってアゴニスト・アンタゴニスト活性が変換する(Kang Cheng et al. Endocrinology 124(6) 2791-2798 (1989), K. Ohinata, et. al., PEPTIDES 27, 1632-1637 (2006))ことから、グレリンのＮ末端がＧＨＳ−Ｒへの結合に関与していると考えられる。また、グレリンからそのＣ末端を除くとin vivoでの活性が減少することから、グレリンのＣ末端はグレリンの安定性に関与していると考えられる。以上のことからグレリンのＮ末端８アミノ酸をランダム化したｃＤＮＡ−ディスプレイ用ペプチドライブラリを作製した。以下その作製法を示す。
Ｔ７プロモーター、タバコモザイクウイルスの翻訳促進配列（ＵＴＲ）、翻訳開始部位、スキャフォールドとしてＰＯＵ ＤＮＡ結合ドメイン（ＰＯＵ）、ヒスチジンタグ、ピューロマイシンリンカーのハイブリ部位を含む２本鎖ＤＮＡ；
5’-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAAGCCACCATGGACCTTGAGGAGCTTGAGCAGTTTGCCAAGACCTTCAAACAAAGACGAATCAAACTTGGATTCACTCAGGGTGATGTTGGGCTCGCTATGGGGAAACTATATGGAAATGACTTCAGCCAAACTACCATCTCTCGATTTGAAGCCTTGAACCTCAGCTTTAAGAACATGTGCAAGTTGAAGCCACTTTTAGAGAAGTGGCTAAATGATGCAGAGGGGGGAGGCAGCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGCAGGACGGGGGGCGGCGGGGAAA-3’, Junichi Yamaguchi, et al. Nucleic Acids Research 37(16):e108 (2009)、配列番号２)
をテンプレートにして、１本鎖ＤＮＡ；
5’- GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATA-3’ （配列番号３）
及び、ヒスチジンタグとＸａプロテアーゼ認識切断部位（Ｘａ）を含む一本鎖ＤＮＡ；5’-CGACCTTCAATGCCGCTTCCTGCGTGATGATGATGATGATGGCTGCCTCCCCC-3’ （配列番号４）
を用いてオーバーラップＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーター、ＵＴＲ、翻訳開始部位、ＰＯＵ、ヒスチジンタグ、Ｘａを含む２本鎖ＤＮＡ；
5’-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAAGCCACCATGGACCTTGAGGAGCTTGAGCAGTTTGCCAAGACCTTCAAACAAAGACGAATCAAACTTGGATTCACTCAGGGTGATGTTGGGCTCGCTATGGGGAAACTATATGGAAATGACTTCAGCCAAACTACCATCTCTCGATTTGAAGCCTTGAACCTCAGCTTTAAGAACATGTGCAAGTTGAAGCCACTTTTAGAGAAGTGGCTAAATGATGCAGAGGGGGGAGGCAGCCATCATCATCATCATCACGCAGGAAGCGGCATTGAAGGTCG?3’；配列番号５)
を作製した。 2. Preparation of DNA construct for preparation of peptide library for cDNA-display Ghrelin, an endogenous ligand of GHS-R, has a high homology of N-terminal 7 amino acids among vertebrates. In addition, the N-terminal 5 amino acids of ghrelin are essential for activity (M. Matsumoto et al. BBRC 284, 655-659 (2001)), and agonist / antagonist activity is converted by substitution of the N-terminal first or second amino acid. (Kang Cheng et al. Endocrinology 124 (6) 2791-2798 (1989), K. Ohinata, et. Al., PEPTIDES 27, 1632-1637 (2006)), the ghrelin N-terminal to GHS-R It is thought to be involved in binding. Moreover, since the in vivo activity decreases when the C-terminal is removed from ghrelin, it is considered that the C-terminal of ghrelin is involved in the stability of ghrelin. From the above, a peptide library for cDNA-display in which the N-terminal 8 amino acids of ghrelin were randomized was prepared. The production method is shown below.
Double-stranded DNA comprising a T7 promoter, tobacco mosaic virus translation facilitating sequence (UTR), translation initiation site, POU DNA binding domain (POU) as scaffold, histidine tag, puromycin linker hybrid site;
. 5'- GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATA GGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAAGCCACCATGGACCTTGAGGAGCTTGAGCAGTTTGCCAAGACCTTCAAACAAAGACGAATCAAACTTGGATTCACTCAGGGTGATGTTGGGCTCGCTATGGGGAAACTATATGGAAATGACTTCAGCCAAACTACCATCTCTCGATTTGAAGCCTTGAACCTCAGCTTTAAGAACATGTGCAAGTTGAAGCCACTTTTAGAGAAGTGGCTAAATGATGCAGAG GGGGGAGGCAGCCATCATCATCATCATCACG GCGGAAGCAGGACGGGGGGCGGCGGGGAAA-3 ', Junichi Yamaguchi, et al Nucleic Acids Research 37 (16): e108 (2009), SEQ ID NO: 2)
As a template, single-stranded DNA;
5'- GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATA- 3 '(SEQ ID NO: 3)
And a single-stranded DNA containing a histidine tag and a Xa protease recognition cleavage site (Xa); 5′-CGACCTTCAATGCCGCTTCCTG CGTGATGATGATGATGATGGCTGCCTCCCCC -3 ′ (SEQ ID NO: 4)
A double-stranded DNA containing T7 promoter, UTR, translation initiation site, POU, histidine tag, Xa;
? 5'-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAAGCCACCATGGACCTTGAGGAGCTTGAGCAGTTTGCCAAGACCTTCAAACAAAGACGAATCAAACTTGGATTCACTCAGGGTGATGTTGGGCTCGCTATGGGGAAACTATATGGAAATGACTTCAGCCAAACTACCATCTCTCGATTTGAAGCCTTGAACCTCAGCTTTAAGAACATGTGCAAGTTGAAGCCACTTTTAGAGAAGTGGCTAAATGATGCAGAGGGGGGAGGCAGCCATCATCATCATCATCACGCAG GAAGCGGCATTGAAGGTCG 3 '; SEQ ID NO: 5)
Was made.

また、Ｘａ、ランダム化グレリンＮ末端領域を含む１本鎖ＤＮＡ；
5’-GAAGCGGCATTGAAGGTCGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKCACCAGAGAGTCCAGCAGAGAAAGGAGTCG-3’,N=A/T/G/C, K=G/T；配列番号６)
及びグレリンＣ末端配列とピューロマイシンリンカーハイブリ部位を含む１本鎖ＤＮＡ；
5’-TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTCCTCGGGGCTGCAGCTTGGCTGGTGGCTTCTTCGACTCCTTTCTCTGCTGGAC-3’（配列番号７）
を用いてオーバーラップＰＣＲを行い、Ｘａ、Ｎ末端８アミノ酸をランダム化したグレリン配列、ピューロマイシンリンカーハイブリ部位を含む２本鎖ＤＮＡ；
5’-GAAGCGGCATTGAAGGTCGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKCACCAGAGAGTCCAGCAGAGAAAGGAGTCGAAGAAGCCACCAGCCAAGCTGCAGCCCCGAGGAGGACGGGGGGCGGCGGGGAAA-3’（配列番号８）
を作製した。 Xa, a single-stranded DNA containing a randomized ghrelin N-terminal region;
5'-GAAGCGGCATTGAAGGTCGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKCACCAGAGA GTCCAGCAGAGAAAGGAGTCG -3 ', N = A / T / G / C, K = G / T; SEQ ID NO: 6)
And a single-stranded DNA comprising a ghrelin C-terminal sequence and a puromycin linker hybrid site;
5'-TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTCCTCGGGGCTGCAGCTTGGCTGGTGGCTTCTT CGACTCCTTTCTCTGCTGGAC -3 '(SEQ ID NO: 7)
A double-stranded DNA containing Xa, a ghrelin sequence in which the N-terminal 8 amino acids are randomized, and a puromycin linker hybrid site;
5'- GAAGCGGCATTGAAGGTCG TNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKCACCAGAGAGTCCAGCAGAGAAAGGAGTCGAAGAAGCCACCAGCCAAGCTGCAGCCCCGAGGAGGACGGGGGGCGGCGGGGAAA-3 '(SEQ ID NO: 8)
Was made.

そして、配列番号５及び配列番号８で示されるＤＮＡを用いてオーバーラップＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーター、ＵＴＲ、翻訳開始部位、ＰＯＵ、ヒスチジンタグ、Ｘａ、Ｎ末端８アミノ酸をランダム化したグレリン配列、ピューロマイシンリンカーハイブリ部位を含む２本鎖ＤＮＡ；
5’-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAAGCCACCATGGACCTTGAGGAGCTTGAGCAGTTTGCCAAGACCTTCAAACAAAGACGAATCAAACTTGGATTCACTCAGGGTGATGTTGGGCTCGCTATGGGGAAACTATATGGAAATGACTTCAGCCAAACTACCATCTCTCGATTTGAAGCCTTGAACCTCAGCTTTAAGAACATGTGCAAGTTGAAGCCACTTTTAGAGAAGTGGCTAAATGATGCAGAGGGGGGAGGCAGCCATCATCATCATCATCACGCAGGAAGCGGCATTGAAGGTCGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKCACCAGAGAGTCCAGCAGAGAAAGGAGTCGAAGAAGCCACCAGCCAAGCTGCAGCCCCGAGGAGGACGGGGGGCGGCGGGGAAA-3’（配列番号９）
を作製し。シリカメンブレンカラム（Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ，ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。 Then, overlap PCR was performed using the DNAs shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 8, and the T7 promoter, UTR, translation start site, POU, histidine tag, Xa, ghrelin sequence in which N-terminal 8 amino acids were randomized, Puro Double-stranded DNA containing a mycin linker hybrid site;
5'-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAAGCCACCATGGACCTTGAGGAGCTTGAGCAGTTTGCCAAGACCTTCAAACAAAGACGAATCAAACTTGGATTCACTCAGGGTGATGTTGGGCTCGCTATGGGGAAACTATATGGAAATGACTTCAGCCAAACTACCATCTCTCGATTTGAAGCCTTGAACCTCAGCTTTAAGAACATGTGCAAGTTGAAGCCACTTTTAGAGAAGTGGCTAAATGATGCAGAGGGGGGAGGCAGCCATCATCATCATCATCACGCAGGAAGCGGCATTGAAGGTCGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKCACCAGAGAGTCCAGCAGAGAAAGGAGTCGAAGAAGCCACCAGCCAAGCTGCAGCCCCGAGGAGGACGGGGGGCGGCGGGGAAA-3 '(SEQ ID NO: 9)
Made. It refine | purified with the silica membrane column (Qiaquick PCR purification column, QIAGEN).

ＰＣＲ反応は、ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｔａｋａｒａ）を使用し、
９８℃２分−［９８℃１０秒／５５℃５秒／７２℃３０秒］×２０サイクル−７２℃２分− ４℃∞、のプログラムで行った。配列番号３、４、６、及び７は、ホスホロアミダイト法によって化学合成した。各配列の下線部はオーバーラップＰＣＲの原料として用いる際のオーバーラップ領域を示している。 PCR reaction uses prime STAR polymerase (takara),
98 ° C for 2 minutes-[98 ° C for 10 seconds / 55 ° C for 5 seconds / 72 ° C for 30 seconds] x 20 cycles-72 ° C for 2 minutes-4 ° C ∞. SEQ ID NOs: 3, 4, 6, and 7 were chemically synthesized by the phosphoramidite method. The underlined portion of each sequence indicates an overlap region when used as a material for overlap PCR.

３．ＤＮＡコンストラクトの転写
２本鎖ＤＮＡ（配列番号９）をテンプレートにして、ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ ＲＮＡ キャッピングアナログ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）存在下、ＲｉｂｏＭＡＸ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼにより転写反応を行い、ｍＲＮＡを合成した。合成したｍＲＮＡはシリカメンブレンカラムを用いて精製した。 3. Transcription of DNA construct Using a double-stranded DNA (SEQ ID NO: 9) as a template, RiboMAX Large Scale RNA Production System (Promega) in the presence of m ⁷ G (5 ′) ppp (5 ′) G RNA capping analog (invitrogen) A transcription reaction was performed with T7 RNA polymerase to synthesize mRNA. The synthesized mRNA was purified using a silica membrane column.

４．ピューロマイシンリンカーのｍＲＮＡへのライゲーション
ピューロマイシンリンカーとｍＲＮＡを、Ｔ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｔａｋａｒａ）中で、９５℃で熱変性し、１５分かけて２５℃に下げることで、ハイブリ部位でアニーリングさせた。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとＴ４ ＲＮＡリガーゼを加え、２５℃で２時間反応させることにより、ｍＲＮＡとピューロマイシンリンカーをライゲーションさせた。生成したライゲーション産物はシリカメンブレンカラムを用いて精製した。 4). Ligation of puromycin linker to mRNA Puromycin linker and mRNA were heat denatured at 95 ° C. in T4 RNA Ligase buffer (takara) and lowered to 25 ° C. over 15 minutes to anneal at the hybrid site. T4 polynucleotide kinase and T4 RNA ligase were added and reacted at 25 ° C. for 2 hours to ligate mRNA and puromycin linker. The produced ligation product was purified using a silica membrane column.

５．ｃＤＮＡ−ペプチド複合体の形成（ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳）
ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体を、Ｒｅｔｉｃ Ｌｙｓａｔｅ ＩＶＴ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて３０℃で６０分間翻訳した後、７５ｍＭ ＫＣｌ及び２５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２存在下で、３０℃６０分間インキュベートすることにより、ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー−蛋白質の複合体を形成させた。 5. Formation of cDNA-peptide complex (in vitro translation)
The mRNA-puromycin linker complex is translated using Retic Lysate IVT Kit (Ambion) for 60 minutes at 30 ° C., and then incubated in the presence of 75 mM KCl and 250 mM MgCl _{2 for} 60 minutes at 30 ° C. A mycin linker-protein complex was formed.

６．翻訳産物の磁気ビーズへの固定
翻訳過程で生成したＲＮＡ−タンパク質複合体を、ストレプトアビジン磁気ビーズを用いて精製した。
７．逆転写反応
ＳＵＰＥＲ ｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを形成した。
８．制限酵素処理
次に、ピューロマイシンリンカーのステム構造部位を制限酵素ＰｖｕＩＩで消化することにより、ｃＤＮＡ−ピューロマイシンリンカー−蛋白質複合体をストレプトアビジンビーズから離脱させた。
９．Ｎｉ−ＮＴＡ精製
離脱させた複合体をＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズを用いて精製した。
１０．Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ ｐｒｏｔｅａｓｅ 処理
ｆａｃｔｏｒ Ｘａ ｐｒｏｔｅａｓｅでＰＯＵドメイン領域とランダム化グレリン領域の間を切断し、ｃＤＮＡ／ＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー−ランダム化グレリン ライブラリを作製した。 6). Immobilization of translation product on magnetic beads The RNA-protein complex produced in the translation process was purified using streptavidin magnetic beads.
7). Reverse transcription reaction A reverse transcription reaction was performed using SUPER script III (invitrogen) to form a cDNA / RNA hybrid.
8). Restriction enzyme treatment Next, the cDNA-puromycin linker-protein complex was released from the streptavidin beads by digesting the stem structure site of the puromycin linker with the restriction enzyme PvuII .
9. Ni-NTA purification The detached complex was purified using Ni-NTA magnetic beads.
10. Factor Xa protease treatment The region between the POU domain and the randomized ghrelin region was cleaved with the factor Xa protease to prepare a cDNA / RNA-puromycin linker-randomized ghrelin library.

１１．スクリーニング
１ラウンド目は、ＧＨＳ−Ｒ非発現細胞によるプレセレクションを省き、直接ＧＨＳ−Ｒ発現細胞にライブラリーを作用させた。２ラウンド目以降は、ＧＨＳ−Ｒ非発現細胞でプレセレクションした後に、ＧＨＳ−Ｒ発現細胞を用いてセレクションを行った。
１１−１．スクリーニング (1 ラウンド目 )
細胞数２．４Ｅ７のＣＨＯ−ＧＨＳＲ６２細胞をスクリーニングバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ７．４，１３５ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，２．５ｍＭ ＣａＣｌ_２，０．８ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ，０．２％ ＢＳＡ，０．６ ｍＭ ＮａＨＣＯ_３）で２回洗浄したのち、ｃＤＮＡ−ペプチド複合体０．５ｐｍｏｌをスクリーニングバッファー１５ｍｌに溶解し、氷上でＣＨＯ−ＧＨＳＲ６２細胞にかけ、氷上で一時間インキュベートした。 インキュベート後、スクリーニングバッファーで細胞を３ 回洗浄した。その後、細胞に０．１Ｍ ｇｌｙｃｉｎ−ＨＣｌ（ｐＨ３．５）を１５ｍｌかけ、室温で１０分間インキュベーションした後、上清を回収した。回収溶液に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．９を１２０μｌ加えｐＨを中性化した。その後、ブタノールで濃縮し、エタノール沈殿した。 沈殿したペレットを水に溶解後、シリカメンブレンカラムで精製した。そして、精製産物をテンプレートに、
5’-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACA-3’（配列番号１０）
5’-TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTC-3’（配列番号１１）
をプライマーにしてＰＣＲ増幅した。
ＰＣＲ反応は、Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｔａｋａｒａ）を使用し、９５℃ ２ｍｉｎ−［９８℃ １０ｓ／５５℃ １０ｓ／７２℃ ３０ｓ］×４０サイクル−４℃∞、のプログラムで行った。ＰＣＲ産物をＰＡＧＥ確認後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。このＰＣＲ産物を元に、２ラウンド目の［転写］−［ピューロマイシンリンカーライゲーション］−［ｃＤＮＡ−ペプチド複合体の形成］を行った。 11. Screening In the first round, the preselection by the GHS-R non-expressing cells was omitted, and the library was allowed to act directly on the GHS-R expressing cells. From the second round onward, after pre-selection with GHS-R non-expressing cells, selection was performed using GHS-R expressing cells.
11-1. Screening (1st round)
2.4E7 CHO-GHSR62 cells were screened with 10 mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 2.5 mM CaCl ₂ , 0.8 mM MgCl ₂ , 10 mM Glucose, 0.2% BSA, After washing twice with 0.6 mM NaHCO ₃ ), 0.5 pmol of the cDNA-peptide complex was dissolved in 15 ml of screening buffer, applied to CHO-GHSR62 cells on ice, and incubated for 1 hour on ice. After incubation, the cells were washed 3 times with screening buffer. Thereafter, 15 ml of 0.1 M glycin-HCl (pH 3.5) was applied to the cells and incubated at room temperature for 10 minutes, and then the supernatant was collected. 120 μl of 1M Tris-HCl, pH 8.9 was added to the recovered solution to neutralize the pH. Then, it concentrated with butanol and ethanol-precipitated. The precipitated pellet was dissolved in water and purified with a silica membrane column. Then, using the purified product as a template,
5'-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACA-3 '(SEQ ID NO: 10)
5'-TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTC-3 '(SEQ ID NO: 11)
PCR amplification was performed using as a primer.
The PCR reaction was performed using Ex Taq polymerase (takara) with a program of 95 ° C. 2 min- [98 ° C. 10 s / 55 ° C. 10 s / 72 ° C. 30 s] × 40 cycles−4 ° C.∞. After confirming the PAGE, the PCR product was purified by QIAquick PCR purification column (QIAGEN). Based on this PCR product, the second round of [transcription]-[puromycin linker ligation]-[formation of cDNA-peptide complex] was performed.

１１−２．スクリーニング（２ラウンド目以降）
細胞数１．０Ｅ７のＣＨＯ細胞（ＧＨＳ−Ｒ非発現）をスクリーニングバッファーで２回洗浄し、ｃＤＮＡ−ペプチド複合体０．０５ｐｍｏｌをスクリーニングバッファー７．５ｍｌに溶解し、ＣＨＯ細胞にかけ、一時間インキュベーションした。インキュベーション後、その上清を、スクリーニングバッファーで２回洗浄した細胞数１．０Ｅ７のＣＨＯ−ＧＨＳＲ ６２細胞にかけ１時間インキュベーションした。インキュベーション後、スクリーニングバッファーで細胞を３回洗浄し、細胞に０．１Ｍ ｇｌｙｃｉｎ−ＨＣｌ（ｐＨ３．５）を７．５ｍｌかけ、室温で１０ｍｉｎインキュベーションした後、上清を回収した。回収した上清溶液に、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．９を６０μｌ加えｐＨを中性化した。その後、ブタノールで濃縮し、エタノール沈殿した。沈殿したペレットを水に溶解後、シリカメンブレンカラムで精製した。そして、精製産物をテンプレートに、
5’-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACA-3’（前述の配列番号１０に同じ）
5’-TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTC-3’（前述の配列番号１１に同じ）
をプライマーにしてＰＣＲ増幅した。
ＰＣＲ反応は、Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｔａｋａｒａ）を使用し、９５℃ ２ｍｉｎ−［９８℃ １０ｓ／５５ ℃ １０ｓ／７２ ℃ ３０ｓ］×４０サイクル−４℃∞、のプログラムで行った。ＰＣＲ産物をＰＡＧＥ確認後、シリカメンブレンカラムで精製した。このＰＣＲ産物を元に、３ラウンド目以降の［転写］−［ピューロマイシンリンカーライゲーション］−［ｃＤＮＡ−ペプチド複合体の形成］を行った。
上記スクリーニングを５ラウンド行った。なお、ラウンド毎に、投入するｃＤＮＡ−ペプチド複合体の量および、細胞数等の反応スケールを減らした。スクリーニング反応スケールの減少に伴い、［転写］−［ピューロマイシンリンカーライゲーション］−［ｃＤＮＡ−ペプチド複合体の形成］の反応スケールも減らした。また、ラウンド毎に淘汰圧を強めるために、インキュベーション時間を短く、洗浄時間を長く、洗浄回数を多くした。 11-2. Screening (after the second round)
A CHO cell having a cell number of 1.0E7 (GHS-R non-expressing) was washed twice with a screening buffer, 0.05 pmol of the cDNA-peptide complex was dissolved in 7.5 ml of the screening buffer, applied to the CHO cell, and incubated for 1 hour. . After incubation, the supernatant was incubated for 1 hour on CHO-GHSR 62 cells with 1.0E7 cells washed twice with screening buffer. After the incubation, the cells were washed three times with a screening buffer, and 7.5 ml of 0.1 M glycin-HCl (pH 3.5) was applied to the cells. After incubation at room temperature for 10 minutes, the supernatant was collected. 60 μl of 1M Tris-HCl, pH 8.9 was added to the collected supernatant solution to neutralize the pH. Then, it concentrated with butanol and ethanol-precipitated. The precipitated pellet was dissolved in water and purified with a silica membrane column. Then, using the purified product as a template,
5'-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACA-3 '(same as SEQ ID NO: 10 above)
5'-TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTC-3 '(same as SEQ ID NO: 11 above)
PCR amplification was performed using as a primer.
The PCR reaction was performed using Ex Taq polymerase (takara) with a program of 95 ° C. 2 min- [98 ° C. 10 s / 55 ° C. 10 s / 72 ° C. 30 s] × 40 cycles−4 ° C.∞. After confirming the PAGE, the PCR product was purified with a silica membrane column. Based on this PCR product, [transcription]-[puromycin linker ligation]-[formation of cDNA-peptide complex] in the third round and thereafter were performed.
The above screening was performed 5 rounds. In each round, the amount of cDNA-peptide complex to be introduced and the reaction scale such as the number of cells were reduced. As the screening reaction scale decreased, the reaction scale of [transcription]-[puromycin linker ligation]-[formation of cDNA-peptide complex] also decreased. In addition, in order to increase the selection pressure for each round, the incubation time was shortened, the washing time was increased, and the number of washings was increased.

１１−３．配列決定
上記スクリーニングにより得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（ｐｒｏｍｅｇａ）及びＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を用いてクローニングし、ＳＰ６プライマーを用いてシーケンシングを行った。その結果、１４クローンを配列決定したところ、１１クローンが配列番号１２の配列、２クローンが配列番号１３の配列、１クローンが配列番号１４の配列であった。
配列番号１２：FQFLPFMF HQRVQQRKESKKPPAKLQPR
配列番号１３：FQFLPFMS HQRVQQRKESKKPPAKLQPR
配列番号１４：FQFLPVMF HQRVQQRKESKKPPAKLQPR 11-3. Sequencing PCR products obtained by the above screening were transformed into pGEM-T easy vector (promega) and E. coli. Clone using E. coli JM109 and sequencing using SP6 primer. As a result, when 14 clones were sequenced, 11 clones were the sequence of SEQ ID NO: 12, 2 clones were the sequence of SEQ ID NO: 13, and 1 clone was the sequence of SEQ ID NO: 14.
Sequence number 12: FQFLPFMF HQRVQQRKESKKPPAKLQPR
SEQ ID NO: 13: FQFLPFMS HQRVQQRKESKKPPAKLQPR
Sequence number 14: FQFLPVMF HQRVQQRKESKKPPAKLQPR

１２．ペプチド(配列番号１２)によるグレリン刺激依存的胃収縮の抑制
食虫目トガリネズミ科ジネズミ亜科ジャコウネズミ属の小型哺乳類であるスンクスの胃は、マグヌス装置を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において、低濃度のモチリンで処理した後に、グレリンで累加刺激すると、グレリン用量依存的に収縮が起こることが知られている。そこで、この実験系を用いて、ペプチド(配列番号１２)の添加による胃収縮の抑制を確認した。
実験動物および組織の準備
ネパール、カトマンズ自然集団より確立した非近交系カトマンズ系成体スンクス(５−１２週齢、Ｂ．Ｗ４５−７０ｇ）を用いて実験を行った。動物は巣箱となるペットボトルや空き缶を入れたプラスチックケージで２１±２℃、８：００−２０：００の明暗周期、自由摂食及び自由飲水の条件下で飼育した。
実験に使用した個体は胃内容物を取り除くため、胃摘出開始前に暗期５時間、明期５−６時間の計１０±１時間絶食を行った。ただし、絶食時でも飲水は自由に行えるようにした。実験個体はジエチルエーテルによる深麻酔後、断頭にて屠殺した。その後開腹し、噴門部および十二指腸の位置で眼科バサミを用いて組織を摘出し、クレブス緩衝液（ＮａＣｌ，１１８ｍＭ；ＫＣｌ，４．７ｍＭ；ＣａＣｌ_２，１．９ｍＭ；ＭｇＳＯ_４，０．７ｍＭ；ＮａＨ_２ＰＯ_４，１．８ｍＭ；ＮａＨＣＯ_３，１９．６ｍＭ；グルコース，１０ｍＭ，ｐＨ７．２）内にてカミソリ刃により幽門部直上で切り、加えて胃底部に２ｍｍ程度の切り込みを入れ、クレブス緩衝液で胃組織内部を洗浄し、残渣を取り除いた。小型のセルフィンで胃底部頂端中央部と前底部の中央部の二点を、縦走筋方向に固定されるように挟んだ。クレブス緩衝液は３７±０．５℃の条件下で、Ｏ_２ ９５％， ＣＯ_２ ５％のガスで常にバブリングを行い、緩衝液のｐＨの調整は１Ｎ ＨＣｌを用いて行った。組織に対する初期加重は１．０ｇとした。加えて、組織のマグヌス管内への設置後、組織を安定させるために４０分間静置し、それから各薬剤の投与を開始するようにした。 12 Suppression of gastric contraction dependent on ghrelin stimulation by peptide (SEQ ID NO: 12) The stomach of Sunx, a small mammal belonging to the genus Coleoptera, Gynecidae, Muscoe, is a low concentration of motilin in an in vitro experiment using a Magnus device. It is known that when ghrelin is progressively stimulated after treatment with ghrelin, contraction occurs in a ghrelin dose-dependent manner. Therefore, suppression of gastric contraction by adding the peptide (SEQ ID NO: 12) was confirmed using this experimental system.
Preparation of Experimental Animals and Tissues Experiments were conducted using outbred Kathmandu adult sunks (5-12 weeks old, B. W45-70 g) established from the natural population of Kathmandu, Nepal. Animals were reared in plastic cages containing plastic bottles and empty cans as nest boxes under conditions of 21 ± 2 ° C., light / dark cycle of 8: 00-20: 00, free feeding and free drinking.
In order to remove the stomach contents, the individuals used in the experiment were fasted for a total of 10 ± 1 hours, 5 hours dark period and 5-6 hours light period, before starting gastrectomy. However, it was possible to drink water freely even during fasting. The experimental individuals were sacrificed by decapitation after deep anesthesia with diethyl ether. Thereafter, the abdomen was opened, and the tissue was excised using ophthalmic scissors at the position of the cardia and duodenum, and Krebs buffer (NaCl, 118 mM; KCl, 4.7 mM; CaCl ₂ , 1.9 mM; MgSO ₄ , 0.7 mM; NaH ₂ PO ₄ , 1.8 mM; NaHCO ₃ , 19.6 mM; glucose, 10 mM, pH 7.2), cut with a razor blade just above the pylorus, and make a 2 mm incision at the bottom of the stomach, with Krebs buffer The inside of the stomach tissue was washed with a liquid, and the residue was removed. Two points, the center of the gastric fundus at the apex and the center of the anterior floor, were sandwiched with a small serfin so that it was fixed in the longitudinal muscle direction. The Krebs buffer was constantly bubbled with O ₂ 95% and CO ₂ 5% under conditions of 37 ± 0.5 ° C., and the pH of the buffer was adjusted using 1N HCl. The initial weight for the tissue was 1.0 g. In addition, after the tissue was placed in the Magnus tube, it was allowed to stand for 40 minutes to stabilize the tissue, and then administration of each drug was started.

Ｏｒｇａｎ ｂａｔｈ 実験
Ｉｎ ｖｉｔｒｏの消化管収縮測定実験として、マグヌス管を用いたｏｒｇａｎ ｂａｔｈ実験系を用いた。スンクス胃は１０ｍｌクレブス緩衝液の入ったマグヌス管内に吊るした。マグヌス管内は恒温槽から常に送られる温水により３７±０．５℃温度条件に保たれ、Ｏ_２ ９５％， ＣＯ_２ ５％のガスにより常にバブリングを行った。組織の両端を挟んでいるセルフィンのうち下端のものはマグヌス管内のＬ字フックに、上端のものはアイソメトリックトランスデューサーにつないだ。トランスデューサーはアンプを介してＡＤ変換機ＰｉｃｏＬｏｇへと接続した。組織の収縮データのサンプリングは１００ｍｓに１回の割合で行った。
データはＵＳＢケーブルを介してＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）上のＰｉｃｏＬｏｇ Ｒｅｃｏｒｄｅｒソフトに出力した。試薬添加前の１分間の自律収縮の極大値の平均値を基底値としてとり、各濃度の試薬添加後の最大収縮値をそれぞれの試薬の反応値とし、基底値との差を各濃度の試薬の効果として算出した。アセチルコリン（１０μＭ）により引き起こされる収縮を組織の最大の収縮として、薬剤添加開始の前に２回および最後に１回記録し、その平均値に対する試薬の添加による収縮圧の割合をデータとして算出した。
アンプの感度調整は実験ごとに行い、トランスデューサーに１ｇの圧力変化が生じたときに０．１Ｖの電圧として出力されるように調整した。
試薬添加
配列番号１２のペプチド（終濃度１μＭ）と、モチリン（終濃度１００ｐＭ）の混合液を投与した３０秒後に、グレリン（終濃度１０ｐＭ−１００ｎＭ）を累加投与し、ペプチド（配列番号１２）の存在下及び非存在下での用量反応曲線をそれぞれ作成した。 Organ bath experiment As an in vitro digestive tract contraction measurement experiment, an organ bath experiment system using a Magnus tube was used. The Sunks stomach was suspended in a Magnus tube containing 10 ml Krebs buffer. The inside of the Magnus tube was maintained at 37 ± 0.5 ° C. by hot water constantly sent from a thermostatic bath, and was constantly bubbled with O ₂ 95% and CO ₂ 5% gas. The lower end of the cell fins sandwiching both ends of the tissue was connected to the L-shaped hook in the Magnus tube, and the upper end was connected to the isometric transducer. The transducer was connected to an AD converter PicoLog via an amplifier. Sampling of tissue contraction data was performed once every 100 ms.
The data was output to PicoLog Recorder software on Windows (registered trademark) via a USB cable. The average value of the autonomic maximum contraction for 1 minute before the addition of the reagent is taken as the base value, the maximum contraction value after the addition of the reagent at each concentration is taken as the reaction value of each reagent, and the difference from the base value is the reagent at each concentration Calculated as the effect of The contraction caused by acetylcholine (10 μM) was recorded as the maximum contraction of the tissue twice before the start of drug addition and once at the end, and the ratio of the contraction pressure due to the addition of the reagent to the average value was calculated as data.
The sensitivity of the amplifier was adjusted for each experiment, and adjusted so that a voltage of 0.1 V was output when a pressure change of 1 g occurred in the transducer.
Thirty seconds after administration of the reagent-added peptide of SEQ ID NO: 12 (final concentration 1 μM) and motilin (final concentration 100 pM), ghrelin (final concentration 10 pM-100 nM) was administered and the peptide (SEQ ID NO: 12) Dose response curves were created in the presence and absence, respectively.

測定の結果、配列番号１２のペプチド（１μＭ）による前処理によって、グレリン刺激による胃収縮が有意に抑制されることが確認できた（図１）。すなわち、本発明のペプチドは、ＧＨＳ−Ｒアンタゴニスト活性を有し、消化管の機能亢進を抑制することから、該ペプチドは摂食抑制剤及び成長ホルモン分泌抑制剤として有用であることが示された。   As a result of the measurement, it was confirmed that gastric contraction due to ghrelin stimulation was significantly suppressed by pretreatment with the peptide of SEQ ID NO: 12 (1 μM) (FIG. 1). That is, since the peptide of the present invention has GHS-R antagonist activity and suppresses the hyperfunction of the digestive tract, it was shown that the peptide is useful as an antifeedant and a growth hormone secretion inhibitor. .

本発明は、摂食促進ホルモンであるグレリンの作用を阻害するペプチドを提供するものであり、摂食障害、成長ホルモンの分泌過剰に起因する疾患（例えば、巨人症及び末端肥大症など）に対する新たな治療法、あるいは、治療剤の開発に大きく貢献するものである。   The present invention provides a peptide that inhibits the action of ghrelin, a feeding-promoting hormone, and is a novel treatment for diseases caused by eating disorders and excessive secretion of growth hormone (for example, giantism and acromegaly). This greatly contributes to the development of new treatments and therapeutic agents.

Claims (7)

配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。A peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12. 請求項１に記載のペプチドをコードする核酸。   A nucleic acid encoding the peptide according to claim 1. 請求項１に記載のペプチドを有効成分として含有する摂食抑制剤。   An antifeedant containing the peptide according to claim 1 as an active ingredient. 請求項１に記載のペプチドを有効成分として含有する成長ホルモン分泌抑制剤。   A growth hormone secretion inhibitor comprising the peptide according to claim 1 as an active ingredient. 請求項１に記載のペプチドを有効成分として含有する成長ホルモンの分泌過剰に起因する疾患の治療剤。   The therapeutic agent of the disease resulting from the secretion excess of the growth hormone which contains the peptide of Claim 1 as an active ingredient. 請求項１に記載のペプチドを、当該ペプチドに対する抗体を用いて検出することを含む、当該ペプチドの定量方法。   A method for quantifying the peptide, comprising detecting the peptide according to claim 1 using an antibody against the peptide. 請求項１に記載のペプチドを遺伝子組み換え技術を用いて製造する方法であって、当該ペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターにより宿主細胞を形質転換すること；及び、
得られた形質転換細胞を培養して培養物から目的のペプチドを採取すること；
を含む方法。 A method for producing the peptide according to claim 1 using a genetic recombination technique, comprising transforming a host cell with a vector containing DNA encoding the peptide; and
Culturing the resulting transformed cells and collecting the desired peptide from the culture;
Including methods.

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